Т-клеточная клональность в диагностике лимфопролиферативных заболеваний тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.29, кандидат медицинских наук Сидорова, Юлия Владимировна

• Сидорова, Юлия Владимировна
• кандидат медицинских наук
• 2004

Оглавление диссертации кандидат медицинских наук Сидорова, Юлия Владимировна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Строение Т-клеточных рецепторов и их генов. Этапы развития Т-клеток, перестройки генов Т-клеточных рецепторов. Субпопуляции Т-клеток.

1.2. Основные методы диагностики Т-клеточной клональности.

1.2.1. Определение Т-клеточной клональности методом ПЦР.

1.2.2. ПЦР диагностика Т-клеточной клональности по реарранжировкам у-цепи Т клеточного рецептора. Электрофоретические методы.'.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Чувствительность метода.

3.2. Критерии интерпретации результатов РСЫ^СР-ТСКу.

3.3. Секвенирование ПЦР продуктов.

3.4. Частота использования V генов 1, 2, 3 и 4 семейства в клональных перестройках генов Т-клеточного рецептора.

3.5. Здоровые доноры. Определение Т-клеточной клональности методом РСЯ-88СР-ТСБ1у.

3.6. Т-клеточные линии. Определение Т-клеточной клональности методом РСЯ-88СР-ТСЯу.

3.7. Выявляемость Т-клеточной клональности методом РСЫ-88СР-ТСК.у при Т-клеточных лимфомах и лейкозах.

3.8. Зависит ли выявление клональной реарранжировки TCRy при Т-лимфобластных лейкозах/лимфомах от степени зрелости опухолевых Т-клеток?.

3.9. Какой клинический материал надо исследовать.

3.10. Определение эффективности терапии, контроль ремиссии методом PCR-SSCP-TCRy при Т-клеточных лимфомах и лимфосаркомах.

3.11. Нелегитимные (cross-lineage) перестройки генов Т-клеточного рецептора. Определение клональности при В- клеточных опухолях.

3.12. Определение Т-клеточной клональности методом PCR-SSCP-TCRy при лимфогранулематозе.

3.13. Определение Т-клеточной клональности методом PCR-SSCP-TCRy при реактивных (неопухолевых) процессах и гематологических синдромах.

3.14. Определение Т-клеточной клональности при острых инфекционных процессах методом PCR-SSCP-TCRy.

3.15. Характерные черты опухолевых и реактивных клонов, выявленных методом PCR-SSCP-TCRy.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Т-клеточная клональность в диагностике лимфопролиферативных заболеваний»

Актуальность проблемы

Во многих случаях классические методы цитологии, гистологии и иммуногистохимии не позволяют провести дифференциальный диагноз между опухолевой и реактивной Т-клеточной пролиферацией. Т-клеточные опухоли часто протекают в виде микропролиферативных процессов и при небольшой массе опухоли и скорости роста могут проходить под маской апластических синдромов, могут быть причиной упорных цитопений, гиперэозинофилии, ревматоидных синдромов. В дерматологической практике введен термин псевдолимфома кожи, - это группа реактивных дерматозов, характеризующаяся клиническим, гистологическим, часто иммуногистохимическим сходством с Т-клеточной лимфомой кожи, но отличающейся доброкачественным течением с тенденцией к спонтанному регрессу. Иммунофенотипически можно выявить патологическую популяцию Т-клеток только, если опухолевые Т-клетки имеют аберрантный фенотип, т.е. утрату одного или нескольких из общих Т-клеточных маркеров, а также в случаях, когда фенотип опухолевых Т-клеток соответствует ранним, внутритимическим стадиям дифференцировки. Одним из вспомогательных методов, подтверждающих наличие опухоли, является определение клональности. В-клеточная клональность традиционно оценивается по рестрикции легкой цепи, то есть по преобладанию в испытуемой популяции клеток, экспрессирующих каппа или лямбда цепь иммуноглобулина. В случае Т-клеточных опухолей такого иммунофенотипического маркера клональности нет, и Т-клеточную клональность можно оценить только с помощью молекулярных методов. Методы молекулярной диагностики Т-клеточной клональности основаны на наличии одинаково перестроенных генов вариабельного региона Т-клеточных рецепторов (ТСЯ) в опухолевых Т-лимфоцитах. В норме в каждом Т-лимфоците гены ТСЫ перестроены уникально, а появление клона Т-лимфоцитов при опухоли сопровождается появлением популяции клеток с одинаковой перестройкой генов ТСЫ. Однако наличие клональности не обязательно означает наличие опухоли. В ходе нормального иммунного ответа появляется множество клонов Т-клеток, но размеры этих клонов, как правило, не велики и не достигают пределов чувствительности традиционных молекулярных методов. Исключения из этого правила возможны. Так, показано, что в острой фазе инфекционного мононуклеоза до 10% СБ8+ клеток могут быть моноклональны. Однако эта пролиферация не имеет ничего общего с опухолью.

Т-клеточная клональность традиционно оценивается с помощью двух методов — Саузерн-блоттинга и полимеразной цепной реакции. Саузерн-блоттинг - трудоемкий метод, требующий большого количества геномной ДНК высокого качества и радиоактивной метки. В связи с этим Саузерн-блоттинг редко применяется для рутинной диагностики и в настоящее время чаще используется как контрольный метод при отработке других молекулярных методов. Наибольшее распространение для оценки Т-клеточной клональности получила полимеразная цепная реакция (ПЦР), которая широко используется в клинической практике с начала 90-х годов. Ранее в нашей стране молекулярные методы определения Т-клеточной клональности не использовались для диагностики зрелоклеточных лимфопролиферативных заболеваний. Актуальность данной работы обусловлена распространенностью заболеваний, требующих дифференциального диагноза с Т-клеточными лимфомами, востребованностью в клинике метода определения Т-клеточной клональности, и при этом отсутствием опыта его применения и диагностических результатов.

Цель

Оценить возможности метода определения Т-клеточной клональности при помощи ПЦР в диагностике Т-клеточных опухолей.

Задачи

1) Определить чувствительность метода, т.е. минимальную примесь моноклональных клеток, при которой выявляется Т-клеточная клональность методом РС11-88СР-ТСКу.

2) Провести исследование Т-клеточной клональности методом РСЯ-88СР-ТСЯу при Т-клеточных лимфомах, В-клеточных лимфомах и прочих гемобластозах, при различных неопухолевых заболеваниях и гематологических синдромах. Определить специфичность метода и ограничения в его использовании.

3) Сформулировать показания и практические рекомендации для врачей к определению Т-клеточной клональности методом ПНР.

Научная новизна и практическая ценность исследования

Доказана эффективность молекулярно-генетического метода определения Т-клеточной клональности, выявлены оптимальные условия проведения метода, ограничения в его использовании, сформулированы критерии интерпретации результатов и практические рекомендации для врачей. Метод апробирован на большом количестве материала, в работу включены не только пациенты с опухолевыми лимфопролиферативными заболеваниями Т- и В- клеточной природы, но также обширная группа сравнения - пациенты с реактивными (неопухолевыми) заболеваниями и гематологическими синдромами, здоровые люди. Показана возможность использования метода полимеразной цепной реакции для проведения дифференциального диагноза между реактивными и опухолевыми Т-клеточными лимфопролиферациями, определения принадлежности опухолевых клеток к В- и Т-клеточной линии, диагностики лимфобластных лейкозов, контроля ремиссии Т-клеточных опухолей. Полученные данные свидетельствуют о необходимости включения метода определения Т-клеточной клональности в протоколы обследования пациентов с лимфопролиферативными заболеваниями. Внедрение в практику

Метод определения Т-клеточной клональности при помощи полимеразной цепной реакции внедрен в практику и вошел в протоколы обследования больных в Гематологическом Научном Центре РАМН (ГНЦ РАМН). Метод был также востребован в других клиниках г. Москвы.

Материалы работы изложены на декаднике Гематологического Научного Центра РАМН 26.04.2002.

По теме диссертации опубликовано 2 статьи в центральных журналах, и 1 статья готовится к публикации. Объем и структура работы

Материалы диссертации изложены на 95 страницах машинописного текста. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и их обсуждения, заключения, практических рекомендаций для врачей, выводов и списка цитируемой литературы. Список цитируемой литературы содержит 133 наименования. Диссертация иллюстрирована 17 рисунками и содержит 17 таблиц.

Заключение диссертации по теме «Гематология и переливание крови», Сидорова, Юлия Владимировна

выводы

1. Метод полимеразной цепной реакции, основанный на перестройках гамма-цепи Т-клеточного рецептора, выявляет моноклональность в 88% доказанных Т-клеточных лимфом и лейкозов.

2. ' Минимальная примесь моноклональных клеток, при которой возможно достоверное определение клональности данным методом, составляет 10-15% от общего количества Т-лимфоцитов.

3. Определение Т-клеточной клональности при помощи ПЦР позволяет с высокой точностью (90%) провести дифференциальный диагноз между реактивными и опухолевыми Т-клеточными лимфопролиферациями.

4. Наличие нелегитимных клональных реарранжировок ТСЛу снижает ценность метода РО^^СР-ТСЛу при определении принадлежности опухолевых клеток к В- и Т-клеточным линиям.

5. На опухолевую природу Т-клеточного клона, выявленного методом РСК-88СР-ТСЯу, указывает размер более 20% от общего количества Т-лимфоцитов и обнаружение его в нескольких тканях.

6. Клональные перестройки Т-клеточного рецептора следует интерпретировать с учетом данных клиники, морфологии и иммунофенотипирования.

Благодарности

- сотрудникам лаборатории Молекулярной Гематологии ГНЦ РАМН за помощь и поддержку в трудную минуту

- всем врачам ГиИТ и других отделений ГНЦ РАМН

- сотрудникам 1 Инфекционной Клинической больницы г. Москвы

Огромная признательность: Самойловой P.C., Пивнику A.B., Виноградовой Ю.Э, Воробьеву И.А., Воробьеву А.И.

Список публикаций по теме диссертации

1) Сидорова Ю.В., Никитин Е.А., Пекло М., Власик Т.Н., Самойлова Р.С., Кравченко С.К., Меликян A.JL, Виноградова Ю.Е., Пивник А.В., Судариков А.Б. Опыт использования ПЦР для определения Т-клеточной клональности. Терапевтический архив 2003; №7: 48-52

2) Олисова О.Ю., Сидорова Ю.В., Судариков А.Б. Истинная псевдолимфома кожи. Гематология и трансфузиология 2002; №6: 25-29

3) Сидорова Ю.В., Никитин Е.А, Меликян А.Л., Пивник А.В., Судариков А.Б. Определение Т-клеточной клональности при инфекционном мононуклеозе методом PCR-SSCP-TCRy. Гематология и трансфузиология. Готовится к публикации.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ ВРАЧЕЙ

Рекомендовано внедрение метода определения Т-клеточной клональности при помощи полимеразной цепной реакции в протоколы обследования пациентов с лимфопролиферативными заболеваниями.

Показания к определению Т-клеточной клональности методом ПЦР:

1) Дифференциальный диагноз реактивной и опухолевой Тклеточной лимфопролиферации:

- если по данным морфологического и иммунофенотипического исследования биоптата лимфоузла/органа не удалось разграничить реактивную и опухолевую пролиферацию,

- при дифференциальной диагностике длительных цитопений и апластических синдромов,

- при длительном лимфоцитозе, нейтропении, спленомегалии, лимфаденопатии, лимфоидной инфильтрации и гиперэозинофилии кожи неясного генеза

2) Определение принадлежности опухоли к Т- и В-клеточным линиям,

3) Контроль ремиссии Т-клеточной опухоли и диагностика рецидивов.

При интерпретации результатов метода необходимо учитывать следующие возможности:

1) отрицательные- результаты на начальных стадиях Т-клеточной опухоли, когда количество опухолевых клеток в образце невелико (менее 10-15% от общего количества Т-лимфоцитов);

2) отсутствие Т-клеточной клональности при наличии Т-клеточной опухоли (количество ложноотрицательных результатов при Т-клеточных лимфомах и лейкозах составляет 12%);

3) ложноположительные результаты при реактивных (неопухолевых) процессах воспалительного, инфекционного или аутоиммунного генеза (в 8,5% случаев);

4) выявление Т-клеточной клональности при В-клеточных опухолях (наличие нелегитимных клональных реарранжировок ТСЯу в 15% случаев).

Интерпретировать клональные перестройки Т-клеточного рецептора (положительный результат) следует с учетом данных клиники, морфологии и иммунофенотипирования.

Список литературы диссертационного исследования кандидат медицинских наук Сидорова, Юлия Владимировна, 2004 год

1. Воробьев АИ. Руководство по гематологии в 3-х т., М: Ньюдиамед. 2003, Т.2: 113-131; 186-190

2. Никитин ЕА, Левина ЕА, Судариков АБ. Роль молекулярных методов в диагностике и мониторинге лимфопролиферативных заболеваний. Гематология и трансфузиология 2001; 3: 19-26

3. Adriaansen HJ, Soeting PW, Wolvers-Tettero IL, van Dongen JJ. Immunoglobulin and T-cell receptor gene rearrangements in acute non-lymphocytic leukemias. Analysis of 54 cases and a review of the literature. Leukemia. 1991; 5(9): 744-751

4. Ahnhudt C, Muche JM, Dijkstal K, Sterry W, Lukowsky A. An approach to the sensitivity of temperature-gradient gel electrophoresis in the detection of clonally expanded T-cells in cutaneous T-cell lymphoma. Electrophoresis 2001; 22: 33-38

5. Ainsworth PJ, Rodenhiser DI. A Nonradioactive Method for the detection of Single-Strand Conformational Polymorphisms. Methods in Molecular Biology 1994; 31:205-210

6. Alatrakchi N, Farace F, Frau E, Carde P, Munck JN, Triebel F. T-cell clonal expansion in patients with B-cell lymphoproliferative disorders. J Immunother 1998; 21(5): 363-370

7. Arber DA, Braziel RM, Bagg A, Bijwaard KE. Evaluation of T Cell Receptor Testing in Limphoid Neoplasms. Results of a Multicenter Study of 29 Extracted DNA and Paraffin-Embedded Samples. J Mol Diagn 2001; 3 (4): 133-140

8. Arber DA. Molecular diagnostic approach to non-Hodgkin's lymphoma. J Mol Diagn 2000; 2 (4): 178-190

9. Asou N, Matsuoka M, Hattori T, Kawano F, Maeda S, Shimada K, Takatsuki K. T cell gamma gene rearrangements in hematologic neoplasms. Blood 1987; 69(3): 968-970

10. Assaf C, Hummel M, Dippel E et al. High detection rate of T-cell receptor beta chain rearrangements in T-cell lymphoproliferations by family specific PCR in combination with the GeneScan technique and DNA sequencing. Blood 2000; 96(2): 640-646

11. Babusikova O, Tomova A. Hairy cell leukemia: early immunophenotypical detection and quantitative analysis by flow cytometry. Neoplasma. 2003; 50(5): 350-356.

12. Behar SM, Roy C, Lederer J, Fraser P, Brenner MB. Clonally expanded Valphal2+ (AV12S1), CD8+ T cells from a patient with rheumatoid arthritis are autoreactive. Arthritis Rheum 1998; 41(3): 498-506

13. Bene MC, Bernier M, Castoldi G et al. Impact of immunophenotyping on management of acute leukemias. Haematologica 2002; 84: 1024-1034

14. Benveniste O, Cherin P, Maisonobe T, Merat R, Chosidow O, Mouthon L, Guillevin L, Flahault A, Burland, MC, Klatzmann D, Herson S, Boyer O.

15. Severe Perturbations of the Blood T Cell Repertoire in Polymyositis, But Not Dermatomyositis Patients. The Journal Immunol 2001; 167: 3521-3529

16. Bertrand FE III, Billips LG, Burrows PD et al. Ig D(H) gene segment transcription and rearrangement before surface expression of pan-B-cell marker CD 19 in normal human bone marrow CD34+cells. Blood 1997; 184:2217

17. Bertrand FE III, Billips LG, Gartland GL et al. The J chain gene transcribed during B fhd T lymphopoesis in humans. J Immunol 1996; 156: 4240

18. Blom B, Verschuren M CM, Heemsherk M HM, Bakker AQ et al. TCR Gene Rearrangements and Expression of the Pre-T cell Receptor Complex During Human T-cell Differentiation. Blood 1999; 93 (9): 3033-3043

19. Boeckx N, Willemse MJ, Szczepanski T et al. Fusion gene transcripts and Ig/TCR gene rearrangements are complementary but infrequent targets for PCR-based detection of minimal residual disease in AML. Leukemia 2002; 16 (3): 368-375

20. Boehm TL, Werle A, Drahovsky D. Immunoglobulin heavy chain and T-cell receptor gamma and beta chain gene rearrangements in acute myeloid leukemias. Mol Biol Med 1987; 4(1): 51-62.

21. Breit TM, Verschuren MCM, Wolvers-Tettero LM et al. Human T cell leukemias with continuous V(D)J recombinase activity for TCR-delta gene deletion. J Immunol 1997; 159: 4341

22. Breit TM, Wolvers-Tettero LM, Beishuizen A et al. Southern Blot Patterns, Frequencies, and Junctional Diversity of T-cell Receptor-8 Gene Rearrangements in Acute Lymphoblastic Leukemia. Blood 1993; 82(10): 3063-3074

23. Cabras AD, Kremer M, Schulz S, Werner M, Hummel M, Komminoth P, Hofler G, Hofler H. Quality assessment in diagnostic molecular pathology: experience from a German-Austrian-Swiss multicenter trial. Virchows Arch 2000; 437(1): 46-51

24. Callan MF, Steven N, Krausa P, Wilson JD, Moss PA, Gillespie GM, Bell JI, Rickinson AB, McMichael AJ. Large clonal expansions of CD8+ T cells in acute infectious mononucleosis. Nat Med 1996; 2(8): 906-911

25. Callan MF, Tan L, Annels N et al. Direct visualization of antigen-specific CD8+ T cells during the primary immune response to Epstein-Ban- virus in vivo. J Exp Med 1998; 187: 1395-1402

26. Christensson B, Braconier JH, Winqvist I, Relander T, Dictor M. Fulminant course of infectious mononucleosis with virus-associated hemophagocytic syndrome. Scand J Infect Dis 1987; 19: 373-379

27. Cook JE, Beverley PC. Analysis of lymphocyte diversity in the elderly: heteroduplex analysis and alternative techniques. Exp Gerontol 2001; 36(3): 583-589

28. Cossman J, Zehnbauer B, Garrett CT, Smith LJ, Williams M, Jaffe ES, Hanson LO, Love J. Gene rearrangement in the diagnosis of lymphoma/leukemia: guidelines for use based on a multi-institutional study. Am J Clin Pathol 1991,95:347-354

29. Delfau-Larue MH, Laroche L, Wechsler J et al. Diagnostic value of dominant T-cell clones in peripheral blood in 363 patients presenting consecutively with a clinical suspicion of cutaneous lymphoma. Blood 2000; 96(9): 2987-2992

30. Dippel E, Assaf C, Hummel M, et al. Clonal T-cell receptor gamma-chain gene rearrangement by PCR-based GeneScan analysis in advanced cutaneous T-cell lymphoma: a critical evaluation. J Pathol 1999; 188: 146

31. Dippel E, Klemke D, Hummel M, et al. T-cell clonality of undetermined significance. Blood 2001; 98 (1): 247-248

32. Dyer MJ. T-cell receptor delta/alpha rearrangements in lymphoid neoplasms. Blood 1989;74(3): 1073-1083.

33. Felix CA, Poplack DG. Characterization of acute lymphoblastic leukemia of childhood by immunoglobulin and T-cell receptor gene patterns. Leukemia 1991; 5:1015

34. Felix CA, Wright JJ, Poplack DG, et al. T cell receptor a- and y-gene rearrangements in T-cell and pre-B cell acute lymphoblastic leukemia. J Clin Invest 1987; 17: 545

35. Fitzgerald JE, Ricalton NS, Meyer AC, West SG, Kaplan H, Behrendt C, Kotzin BL. Analysis of clonal CD8+ T cell expansions in normal individuals and patients with rheumatoid arthritis. J Immunol 1995; 154(7): 3538-3547

36. Fodinger M, Winkler K, Mannhalter C, Chott A. Combined Polymerase Chain Reaction Approach for Clonality Detection in Lymphoid Neoplasms. DiagnMol Pathol 1999; 8(2): 80-91

37. Furley AJW, Chan LC, Mizutani S, et al. Lineage specificity of rearrangement and expression of genes encoding the T cell receptor-T3 complex and immunoglobulin heavy chain in leukemia. Leukemia 1987; 1: 644-652

38. Gaillard F, Mechinaud-Lacroix F, Papin S, et al. Primary Epstein-Barr virus infection with clonal T-cell lymphoproliferation. Am J Clin Pathol 1992; 98(3): 324-333

39. Gamero P, Mortuza FY, Hoffbrand AV, Foroni L. Minimal residual disease monitoring in adult T-ALL: a molecular based approach using T-cell receptor y and 5 gene rearrangements. Haematologica 2002; 87: 1126-1134

40. Gherardi RK, Farcet JP, Creange A, Claudepierre P, Malapert D, Authier FJ, Delfau-Larue MH. Dominant T-cell clones of unknown significance in patients with idiopathic sensory neuropathies. Neurology 1998; 51(2): 384389

41. Greaves MF, Chan LC, Furley AJ, et al. Lineage promiscuity in hemopoietic differentiation and leukemia. Blood 1986; 67: 1

42. Greiner TC. Advances in molecular hematopathology: T-cell receptor y and bcl-2 genes. Am J Pathol 1999; 154 (1): 7-10

43. Hall FC, Thomson K, Procter J, McMichael AJ, Wordsworth BP. TCRbeta spectratyping in RA: evidence of clonal expansions in peripheral blood lymphocytes. Ann Rheum Dis 1998; 57: 319-322

44. Hara J, Benedict SH, Champagne E, Mak TW, Minden M, Gelfand EW. Comparison of T cell receptor alpha, beta, and gamma gene rearrangement and expression in T cell acute lymphoblastic leukemia. J Clin Invest 1988; 81(4): 989-996.

45. Harris NL, Jaffe ES, Diebold J, Flandrin G, et al. WHO Classification of Neoplasms of the Hematopoietic and lymphoid Tissues; Airlie House, Virginia, 1997. Hematol J. 2000; l(l):53-66.

46. Haynes BF, Heinly CS. Early human T cell development: analysis of the human thymus at the time of initial entry of hematopoietic stem cells into the fetal thymus microenvironment. J Exp Med 1995; 182(4): 1445-1458

47. Janeway CA, Travers P, Walport M, Shlomchik MJ. Immunobiology. 5-th edition. USA. Garland Publishing 2001: 105-119, 137-141, 230-254

48. Janossy G, Coustan-Smith T, Campana D. The reliability of cytoplasmic CD3 and CD22 antigen expression in immunodiagnosis of acute leukemias. Clin Chemistry 2000; 46: 1252-1259

49. Katevas P, Kapsimali V, Psarra K, et al. Immunophenotypic analysis of bone marrow blast cells in adult patients with acute lymphoid leukemia. Haema 2001; 4(2): 108-116

50. Kneba M, Bolz I, Linke B, Bertram J, Rothaupt D, Hiddemann W. Characterization of clone-specific rearrangement T-cell receptor gamma-chain genes in lymphomas and leukemias by the polymerase chain reaction and DNA sequencing. Blood 1994; 84(2): 574-581

51. Knecht H, Sarraj A, Delacretaz F, Bachmann E, Clement F. Genotypic and phenotypic evidence of T-cell leukemia in a patient successfully treated by interferon-alpha for typical hairy cell leukemia. Leukemia 1991; 5(12): 10311036.

52. Koetz K, Bryl E, Spickschen K, O'Fallon WM, Goronzy JJ, Weyand CM. T cell homeostasis in patients with rheumatoid arthritis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2000; 97 (16): 9203-9208

53. Kornstein MJ, Weber J, Luck JB, Massey GV, Strom S, McWilliams NB. Epstein-Barr virus-associated lymphoproliferative disorder: applications of immunoperoxidase and molecular biologic techniques. Arch Pathol Lab Med 1989, 113:481-484

54. Krafft AE, Taubenberger JK, Sheng ZM, Bijwaard KE, Abbondanzo SL, Aguilera NS, Lichy JH. Enhanced sensitivity with a novel TCRgamma PCR assay for clonality studies in 569 formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) cases. Mol Diagn 1999; 4(2): 119-133

55. Kuppers R, Raejewsky K. The origin of Hodgkin and Reed-Sternberg cells in Hodgkin's disease. Annu Rev Immunol 1998; 16: 471-493

56. Langerak AW, Szczepanski T, van der Burg M, Wolvers-Tettero IL, van Dongen JJ. Heteroduplex PCR analysis of rearranged T cell receptor genes for clonality assessment in suspect T cell proliferations. Leukemia. 1997; 11(12): 2192-2199.

57. Langerak AW, Wolvers-Tettero ILM, van Dongen JJM. Detection of T cell receptor beta (TCRB) gene rearrangement pattern in T-cell malignancies by Southern blot analysis. Leukemia 1999; 13: 965-974

58. Lauria F, Rondelli D, Raspadori D, Benfenati D, Tura S. Rapid restoration of natural killer activity following treatment with 2-chlorodeoxyadenosine in 22 patients with hairy-cell leukemia. Eur J Haematol 1994; 52(1): 16-20

59. Lee SC, Berg KD, Racke FK et al. Pseudo-Spikes Are Common in Histologically Benign Lymphoid Tissues. J Mol Diagn 2000; 2(3): 145-152

60. Lefranc M-P and Lefranc G. The T cell receptor Facts Book. London; Academic Press; 2001

61. LeMaoult J, Messaoudi I, Manavalan JS, Potvin H, Dyall R, Szabo P, Weksler M E. Age-Related Dysregulation in CD8 T Cell Homeostasis: Kinetics of a Diversity Loss. The Journal Immunol 2000; 165: 2367-2373

62. Lima M, Teixeira MA, Queiros ML et al. Immunophenotype and TCR-Vbeta repertoire of peripheral blood T-cells in acute infectious mononucleosis. Blood Cells Mol Dis 2003; 30(1): 1-12

63. Lynas C, Howe D. Simple, reliable detection of T cell clones by PCR-LIS-SSCP analysis of TCRy rearrangement. Molecular and Cellular Probes 1998; 12:41-48

64. Maini MK, Gudgeon N, Wedderburn LR, Rickinson AB,Beverley PCL. Clonal Expansion in Acute EBV Infection are Detectable in the CD8 and not the CD4 Subset and Persist with a Variable CD45 Phenotype. The Jornal of Immunology 2000; 165: 5729-5737

65. Maini MK, Casorati G, Dellabona P, Wack A, Beverley PC. T-cell clonality in immune responses. Immunol Today 1999; 20(6): 262-266

66. Malik UR, Oleksowicz L, Dutcher JP, Ratech H, Borowitz MJ, Wie PH. Atypical clonal T-cell proliferation in infectious mononucleosis. Med Oncol 1996; 13(4): 207-213

67. Mato T, Masuko K, Misaki Y, Hirose N, Ito K, Takemoto Y, Izawa K, Yamamori S, Kato T, Nishioka K, Yamamoto K. Correlation of clonal T cell expansion with disease activity in systemic lupus erythematosus. Int Immunol 1997; 9(4): 547-554

68. McCarty KP, Sloane JP, Kabarowski JHS, Matutes E, Wiedemann LM. The Rapid Detection of Clonal T-cell Proliferation in Patients with Lymphoid Disorders. Am J Pathol 1991; 138(4): 821-828

69. Meggetto F, al Saati T, Rubin B, Delsol G. Lack of restricted T-cell receptor beta-chain variable region (V beta) usage of reactive T-lymphocytes in Hodgkin's disease. Br J Haematol 1994; 86: 524-532

70. Meier VS, Rufle A, Gudat F. Simutaneous Evaluation of T-and B-cell clonality, t(ll;14) and t(14;18) by a Four-Color Multiplex PCR assay and

71. Automated High-resolution Fragment Analysis. Am J Pathol 2001; 159 (6): 2031-2043

72. Moreau EJ, Langerak AW, van Gastel-Mol, et al. Easy detection of all TCRG gene rearrangements by Southern blot analysis: recommendations for optimal results. Leukemia 1999; 13: 1620-1626

73. Muche JM, Lukowsky A, Asadullah K, Gellrich S, Sterry W. Demonstration of Frequent Occurrence of clonal T cells in the peripheral blood of patients with primary cutaneous T-cell lymphoma. Blood 1997; 90(4): 1636-1642

74. Muche JM, Lukowsky A, Heim J, Friedrich M, Audring H, Sterry W. Demonstration of frequent occurrence of clonal T cells in the peripheral blood but not in the skin of patients with small plaque parapsoriasis. Blood. 1999; 94(4): 1409-1417

75. Nanki T, Kohsaka H, Mizushima N, Oilier WER, Carson DA, Miyasaka N. Genetic Control of T Cell Receptor BJ Gene Expression in Peripheral Lymphocytes of Normal and Rheumatoid Arthritis Monozygotic Twins. J Clin Invest 1996; 98: 1594-1601

76. Nuss R, Kitchingman GR, Cross A, et al. T-cell receptor gene rearrangements in B-precursor acute lymphoblastic leukemia correlate with age and the stage of B-cell differentiation. Leukemia 1988; 2: 722

77. Okubo M, Kurokawa M, Ohto H, Nishimaki T, Nishioka K, Kasukawa R, Yamamoto K. Clonotype analysis of peripheral blood T cells and autoantigen-reactive T cells from patients with mixed connective tissue disease. J Immunol 1994; 153(8): 3784-3790

78. Orita M, Iwahana H, Kanazawa H, et al. Detection of polymorphism by human DNA by gel electrophoresis as single-strand conformation polymorphism. Proc Natl Acad Sci USA 1989; 86 (8): 2766-2770

79. Paolini R, Poletti A, Ramazzina E, Menin C, Santacatterina M, Montagna M, Bonaldi L, Del Mistro A, Zamboni S, D'Andrea. Co-existence of cutaneous T-cell lymphoma and B hairy cell leukemia. E. Am J Hematol. 2000; 64(3): 197-202.

80. Pilozzi E, Muller-Hermelink HK, Falini B, de Wolf-Peeters C, Fidler C, Gatter K, Wainscoat J. Gene rearrangements in T-cell lymphoblastic lymphoma. J Pathol 1999; 188(3): 267-270.

81. Plumbley JA, Fan H, Eagan PA, et al. Lymphoid Tissues from Patients with Infectious Mononucleosis Lack Monoclonal B and T cells. J Mol Diagn 2002; 4(1): 37-43

82. Posnett DN, Sinha R, Kabak S, Russo C. Clonal populations of T cells in normal elderly humans: the T cell equivalent to "benign monoclonal gammapathy". J Exp Med 1994; 179(2): 609-618

83. Pui CH. Childhood leukemias. N Engl J Med 1995; 332: 1618-1630

84. Quintanilla-Martinez L, Kumar S, Fend F, et al. Fulminant EBV+ T-cell lymphoproliferative disorder following acute/chronic EBV infection: a distinct clinicopathologic syndrome. Blood 2000; 96(2): 443-451

85. Roitt IM, Brostoff J, Male DK. Immunology. 2001: 15-42; 87-91; 167-190

86. Raspadori D, Rondelli D, Birtolo S, Lenoci M, Nardi G, Scalia G, Sestigiani C, Tozzi M, Marotta G, Lauria F. Long-lasting decrease of CD4+/CD45RA+ T cells in HCL patients after 2-chlorodeoxyadenosine (2-CdA) treatment. Leukemia 1999; 13(8): 1254-1257.

87. Rezuke WN, Abernathy EC, Tsongalis GJ. Molecular diagnosis of B- and T-cell lymphomas: fundamental principles and clinical applications. Clinical Chemistry 1997; 43 (10): 1814-1823

88. Rezvany MR, Jeddi-Tehrani M, Osterborg A, Kimby E, Wigzell H, Mellstedt H. Oligoclonal TCRBV Gene Usage in B-Cell Chronic Lymphocytic Leukemia: Major Perturbations Are Preferentially Seen Within the CD4 T-Cell Subset. Blood 1999; 94: 1063-1069

89. Schirmer M, Hilbe W, Geisen F, Thaler J, Konwalinka G. T cells and natural killer cells after treatment of hairy cell leukaemia with 2-chlorodeoxyadenosine. Acta Haematol 1997; 97(3): 180-183

90. Schmidt CA, Oettle H, Neubauer A, Seeger K, Thiel E, Huhn D, Siegert W, -Ludwig WD. Rearrangements of T-cell receptor delta, gamma and beta genesin acute myeloid leukemia coexpressing T-lymphoid features. Leukemia 1992; 6(12): 1263-1267

91. Schmidt D, Goronzy JJ, Weyand CM. CD4+ CD7- CD28- T Cells Are Expanded in Rheumatoid Arthritis and Are Characterized by Autoreactivity. J. Clin. Invest 1996; 97: 2027-2037

92. Schwab R, Szabo P, Manavalan JS3 Weksler ME, Posnett DN, Pannetier C, Kourilsky P, Even J. Expanded CD4+ and CD8+ T cell clones in elderly humans. J Immunol 1997; 158(9): 4493-4499

93. Short MA, Evans PAS, Shiach CR, et al. 32P-incorporation PCR for the detection of rearrangements in TCR-y locus. Diagn Mol Pathol 1996; 5: 26-32

94. Southern E. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J Mol Biol 1975; 98: 503-517

95. Strickler JG, Movehad LA, Gajl-Peczalska KJ. Oligoclonal T cell receptor rearrangements in blood lymphocytes of patients with acute EBV-induced infectious mononucleosis. J Clin Invest 1990; 86: 1358-1363

96. Szczepanski T, Beishuizen A, Pongers-Willemse MJ. Cross-lineage T-cell receptor gene rearrangements occur in more than ninety percent of childhood precursor-B-acute lymphoblastic leukemias. Leukemia 1999; 13:196

97. Tawa A, Benedict SH, Hara J, Hozumi N, Gelfand EW. Rearrangement of the T cell receptor gamma-chain gene in childhood acute lymphoblastic leukemia. Blood 1987; 70(6): 1933-1939.

98. Theodorou I, Delfau Larue MH, Bigorgne C, et al. Cutaneous T-cell infiltrates: analysis of T-cell receptor gamma gene rearrangement by polymerase chain reaction and denaturing gradient gel electrophoresis. Blood 1995;86:305-310

99. Theodorou I, Raphael M, Bigorgne C, Fourcade C, Lahet C, Cochet G, Lefranc MP, Gaulard P, Farcet JP. Recombination pattern of the TCR gamma locus in human peripheral-T-cell lymphomas. J Pathol 1994; 174(4): 233242

100. Theriault C, Galoin S, Valmary S et al. PCR Analysis of Immunoglobulin Heavy Chain (IgH) and TcR-gamma Chain Gene Rearrangements in the

101. Diagnosis of Lymphoproliferative Disorders: Results of a Study of 525 Cases. Mod Pathol 2000; 13(12): 1269-1279

102. Van Dongen JJM, Commans-Bitter WM, Wolvers-Tetero ILM, Borst J. Development of Human T-lymphocytes and their thymus-dependency. Thymus 1990; 16: 207

103. Van Dongen JJM, Quertermous T, Bartram CR, et al. Tcell receptor-CD3 complex during early T cell differentiation. J Immunol 1987; 138: 1260

104. Van Dongen JJM, Wolvers-Tetero ILM. Analysis of immunoglobulin and T cell receptor genes. Clin Chim Acta 1991; 198: l(Part I), 198 (Part II)

105. Wagner UG, Koetz K, Weyand CM, Goronzy JJ. Perturbation of the T cell repertoire in rheumatoid arthritis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1998; 95: 14447-14452

106. Wick MJ, Woronzoff-Dashkoff KP, McGlennen RC. The molecular characterization of fatal infectious mononucleosis. Am J Clin Pathol 2002; 118(5): 805-806

107. Wickham CL, Lynas C, Ellard S. Detection of clonal T cell populations by high resolution PCR using fluorescently labelled nucleotides, evaluation using conventional LIS-SSCP. J Clin Mol Pathol 2000; 53: 150-154

108. Willenbrock, Roers A, Blohbaum B, Raejewsky K, Hansmann ML. CD8+ T-cells in Hodgkin's disease Tumor Tissue are a polyclonal population with limited clonal expansion but little evidence of selection by antigen. Am J Pathol 2000; 157(1): 171-175

109. Witzens M, Mohler T, Willhauck M. Detection of clonally rearranged T-cell receptor gamma chain genes from T-cell malignancies and acute inflammatory rheumatic disease using PCR amplification, PAGE, and automated analysis. Ann Hematol 1997; 74: 123-130

110. Xie XY, Sorbara L, Kreitman RJ, Fukushima PI, Kingma DW, StetlerStevenson M. Development of lymphoproliferative disorder of granular lymphocytes in association with hairy cell leukemia. Leuk Lymphoma 2000; 37(1-2): 97-104.

111. Yamamoto K Significance of antigen-specific T cell clones in collagen diseases: analyses with a novel T cell clonality evaluation system. Intern Med 1997; 36(4): 242-247

112. Yancopoulos GD, Blackwell TK, Suh H, et al. Introduced T cell receptor variable region gene segments recombine in pre-B cells: Evidence that B and T cells use a common recombinase. Cell 1986; 44:251

113. Yrbano-Ispizua A, Matutes E, Villamor N et al. Clinical significance of the presence of myeloid associated antigens in acute lymphoblastic leukemia. Br J Haematol 1990; 75: 202-207

114. Yu RC, Alaibac M. A Rapid Polymerase Chain Reaction-based Technique for Detecting Clonal T-cell Receptor Gene Rearrangements in Cutaneus T-cell Lymphomas of both ap and yS Varieties. Diagn Mol Pathol 1996; 5(2): 121

115. Zemlin M, Hummel M, Anagnostopoulos I, Stein H. Improved Polymerase Chain Reaction Detection of Clonally Rearranged T-cell Receptor p Chain126

116. Genes. Diagn Mol Pathol 1998; 7(3): 138-145