Технология биологически активных добавок к пище на основе ферментативного гидролиза гонад гидробионтов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 05.18.07, кандидат технических наук Позднякова, Юлия Михайловна

• Позднякова, Юлия Михайловна
• кандидат технических наук
• 2003

Оглавление диссертации кандидат технических наук Позднякова, Юлия Михайловна

Список сокращений

Введение

1 Обзор литературы

1.1 Характеристика состава и свойств нуклеопротеидов, входящих в состав гонад гидробионтов

1.2 Биологическая активность компонентов нуклеопротеидов

1.3 Характеристика эндогенных ферментов в мужских гонадах гидробионтов

4 1.4 Способы получения белковых гидролизатов

1.5 Ферментные комплексы, используемые для получения гидролизатов

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2. Объекты, материалы и методы исследований

2.1 Объекты и материалы исследований

2.2 Методы исследований 49 3 Результаты и их обсуждение

3.1 Характеристика сырья по содержанию ДНК, активности эндогенных ферментов 60 3.1.1 Оценка сырья по содержанию ДНК

3.1.2 Исследование активности протеолитических ферментов в гонадах гидробионтов

3.1.3 Исследование активности дезоксирибонуклеаз в гонадах гидробионтов

3.1.4 Кинетические параметры действия щелочных и кислых дезоксирибонуклеаз в гонадах гидробионтов

3.2 Подбор оптимальных параметров для ферментативного гидролиза нуклеопротеидных комплексов гон£д гидробионтов

3.2.1 Исследование параметров протеолиза исходного сырья

3.2.2 Исследование кинетики гидролиза нуклеиновых кислот

3.3 Характеристика химического состава гидролизатов из гонад гидробионтов

3.3.1 Белково-пептидный и аминокислотный состав 79 3.3.2 Сравнительная характеристика состава олигонуклеотидов в препаратах из молок рыб

3.3.2.1 Сравнение состава нуклеопротеидных комплексов и гидролизатов из молок рыб

3.3.2.2 Сравнительный состав гидролизатов, полученных с применением различных ферментных препаратов

3.3.2.3 Сравнение состава олигонуклеотидов гидролизатов молок различных видов рыб

3.3.2.4 Фракционный состав низкомолекулярных нуклеиновых кислот в препаратах из гонад различных видов гидробионтов

3.4 Технологическая схема получения БАД «Нуклеатин»

3.4.1 Условия ферментативного гидролиза

3.4.2 Разделение олигонуклеотидов методом ультрафильтрации

3.4.3 Обоснование возможности применения разработанного метода для гонад различных видов гидробионтов 96 3.5 Исследование медико-биологической активности препаратов из гонад гидробионтов

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Технология биологически активных добавок к пище на основе ферментативного гидролиза гонад гидробионтов»

Актуальность работы. В настоящее время ДНК и ее низкомолекулярные производные являются перспективными лекарственными средствами и биологически активными пищевыми добавками (БАД). Для получения препаратов ДНК используют различные сырьевые источники: бактериальные клетки, эритроциты цыплят, тимус телят, селезенка и печень мышей и крыс, молоки сельди, карпа, осетровых и других видов рыб (Пашук и др., 1995). Препараты ДНК из молок лососевых и осетровых обладают наиболее эффективным фармакологическим действием (Патент РФ № 915446; Каплина, 2000).

Анализируя известные литературные данные, можно сделать заключение о том, что область применения ДНК зависит от ее молекулярной массы. Например, ДНК со сравнительно низкой молекулярной массой применяется в кардиологии при лечении ишемической болезни сердца (Патент РФ № 95103961), в онкологии при профилактике и лечении рака (А.С. 1804852 SU), для профилактики инфекционных заболеваний (Патент РФ № 2063228). Олигонуклеотиды, нуклеозиды и производные тимидина могут использоваться при лечении ВИЧ-инфекции (Хаитов, Игнатьева, 1992).

Основным источником получения БАД на основе ДНК являются молоки лососевых и осетровых. Известно несколько способов получения ДНК, которые основаны на солевой экстракции молок и последующем спиртовом осаждении. Однако ДНК, получаемая таким способом и используемая в качестве БАД, характеризуется высокой молекулярной массой и слабой растворимостью в воде, что ограничивает сферу ее применения.

Актуальность проблемы, поставленной в данной работе, определяется необходимостью создания биодоступных препаратов ДНК из распространенных видов сырья. Использование для этой цели ферментативного гидролиза позволит регулировать не только физико-химические свойства (растворимость и вязкость, молекулярный состав) (Mahmoud, 1994), но и, возможно, биологическую активность получаемых БАД.

При ферментативном воздействии на ткань гонад гидробионтов важны определение активности и специфичности ферментов, участвующих в гидролизе нуклеопротеидов (экзогенных, входящих в состав комплексных ферментных препаратов, и эндогенных, содержащихся в молоках).

Известно, что в панкреатической ткани большинства видов животных, в том числе ракообразных, имеется широкий набор ДНКаз (Вакорина и др., 1997). Наиболее полно изученным и широко используемым ферментом этой группы является ДНКаза I (КФ 3.1.4.5), выделенная из панкреаса быка. Основной ее функцией является деградация ДНК. Имеется ряд работ по исследованию ДНКаз, выделенных из гепатопанкреаса краба (Вакорина и др., 1997; Мензорова и др., 1993; Мензорова и др., 1994), криля (Chou and Liao, 1990). ДНКазы панкреатических органов рыб являются мало изученными (Rasskazov et al., 1975).

В гонадах гидробионтов обнаружен ряд гидролитических ферментов, выполняющих различные функции клеточного метаболизма. Например, из молок чавычи (Yamomoto, 1971), скумбрии (Cordonnier and Bernardi, 1968), кеты, минтая (Галкин и др., 1991) выделены кислые ДНКазы, различающиеся между собой по свойствам. Спермии морского ежа S. Intermedius содержат три разные ДНКазы: кислую и две щелочные металлозависимые (Сибирцев и др., 2001). Как полагают многие исследователи, роль этих ферментов -участие в апоптозе - программируемой клеточной гибели. Однако сведений о протеолитических ферментах а также ДНКазах особенно щелочных, содержащихся в гонадах рыб, моллюсков, иглокожих в литературе недостаточно для выявления механизма их действия и роли в процессах деградации ДНК.

Сравнительное изучение ферментов эндогенного и экзогенного происхождения необходимо для обоснования технологии получения препаратов ДНК из данного вида сырья, определения взаимосвязи между свойствами ферментов, составом нуклеиновых кислот и биологической активностью получаемых препаратов.

Цель исследований заключалась в разработке технологии БАД из гонад гидробионтов на основе воздействия ферментов эндогенного и экзогенного происхождения, а также в исследовании состава, свойств и биологической активности полученных БАД.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие основные задачи:

- провести скрининг объектов по содержанию ДНК, активности эндогенных протеаз и нуклеаз в гонадах гидробионтов;

- осуществить подбор рациональных параметров ферментативного гидролиза нуклеопротеидов гонад рыб и беспозвоночных;

- исследовать состав и физико-химические свойства препаратов, полученных в результате ферментативного гидролиза из гонад различных видов гидробионтов;

- разработать способ получения БАД из гонад гидробионтов;

- разработать НД на БАД из гонад гидробионтов;

- провести оценку безопасности, исследовать биологическую активность, провести клинические испытания полученных препаратов.

Научная новизна: Разработана и научно обоснована технология получения БАД из гонад гидробионтов.

Впервые проведено сравнительное исследование протео- и нуклеолитических ферментов в мужских гонадах 13 видов гидробионтов.

Проведены сравнительные кинетические исследования микробиальных, а также содержащихся в панкреатической ткани рыб, крабов ДНКаз.

Исследован состав нуклеиновых компонентов препаратов из гонад гидробионтов, полученных разными способами: ферментативным («Нуклеатин» и низкомолекулярная ДНК) и методом спиртового осаждения нуклеопротеидный комплекс).

Показано, что эндогенные ферменты являются инициаторами ферментативной деструкции нуклеиновых кислот, влияющими на конечный состав препаратов. Установлено, что при отсутствии или следовой активности ферментов эндогенного происхождения степень гидролиза нуклеопротеидов с участием экзогенных ферментов низка.

Практическая значимость. Разработан эффективный способ получения БАД, в основу которого положен ферментативный гидролиз гонад гидробионтов и фракционирование олигонуклеотидов с помощью ультрафильтрации.

Способ получения ферментативного гидролизата из молок рыб защищен патентом №2171066 от 22.03.2000: «Продукт, обогащенный аминокислотами и способ его получения».

По результатам экспертной оценки и санитарно-химических исследований в федеральном центре Госсанэпиднадзора РФ «Нуклеатин» соответствует требованиям СанПиН 2.3.2.1078-01, МУК 2.3.2.- 21-98 и зарегистрирован как БАД (Per. удостоверение № 77.99.02.928.Б.000258.08.03).

Разработана и утверждена нормативная документация на БАД «Нуклеатин» ТУ № 9283-026-00038155-02 , ТИ№ 36-215-02.

Выпущена опытно-промышленная партия «Нуклеатина».

Проведены медико-биологические испытания «Нуклеатина» и показано, что он может быть использован в качестве БАД в кардиологии, офтальмологии, при лечении острых вирусных заболеваний, а также в качестве радиопротекторного средства.

Апробация работы: основные положения были представлены и доложены на научно-практической конференции «Состояние здоровья населения Дальнего Востока. Новые медицинские технологии с использованием биоресурсов» (Владивосток, 1999); Международном симпозиуме «Пищевые биотехнологии: проблемы и перспективы в XXI веке» (Владивосток, 2000); межрегиональной научно-практической конференции «Вакцинопрофилактика. Проблемы настоящего и будущего» (Владивосток, 2000); Международной научно-практической конференции «Прибрежное рыболовство - XXI век» (г. Южно-Сахалинск, 2001); Всероссийской конференции молодых ученых «Рыбохозяйственная наука на пути в XXI век» (Владивосток, 2001); Международной конференции «Морские прибрежные экосистемы: водоросли, беспозвоночные и продукты их переработки» (Москва, Голицино, 2002), Всероссийской конференции молодых ученых (Мурманск, 2002).

Положения, выносимые на защиту: сравнительная характеристика субстратной специфичности ферментов панкреатических органов лососевых рыб, млекопитающих, беспозвоночных, а также микроорганизмов; влияние эндогенных ферментов (протеаз и нуклеаз) гонад гидробионтов, являющихся инициаторами гидролиза нуклеопротеидов, на молекулярный состав олигонуклеотидов; способ получения олигонуклеотидов из гонад гидробионтов включающий ферментативный гидролиз и разделение компонентов по молекулярным массам; состав препаратов, получаемых методом ферментативного гидролиза из гонад гидробионтов, характеристика биологической активности.

Публикации: по теме диссертации опубликовано 18 работ.

Структура и объем работы. Диссертация включает введение, обзор литературы, экспериментальную часть, заключение, выводы, список литературы, содержащий 100 источников (в том числе 41 зарубежный). Работа изложена на 160 страницах, содержит 11 таблиц, 15 рисунков и 8 приложений.

Заключение диссертации по теме «Биотехнология пищевых продуктов (по отраслям)», Позднякова, Юлия Михайловна

Выводы

1. Разработана технология получения БАД из гонад гидробионтов на основе ферментативного гидролиза белков и нуклеиновых кислот.

2. При сравнительном исследовании состава ферментов эндогенного происхождения в гонадах 13 видов гидробионтов обнаружено: преобладание кислых ДНКаз в большинстве объектов (кроме лемонемы), следовая активность щелочных Са, Mg-зависимых ДНКаз у минтая, гребешка, осьминога и отсутствие протеолитической активности в гонадах гребешка, акулы-катрана и осьминога.

3. На основании исследования кинетических параметров ферментативного гидролиза нуклеиновых кислот установлена целесообразность применения ферментных препаратов, выделенных из панкреатических органов рыб и крабов, как наиболее эффективных и специфичных для получения растворимых олигонуклеотидов.

4. Показано влияние активности протеаз и ДНКаз эндогенного происхождения гонад гидробионтов на состав олигонуклеотидов при получении БАД.

В составе ферментных гидролизатов, полученных из гонад с высокой активностью протеаз и ДНКаз, обнаружены и олигонуклеотиды, и низкомолекулярные нуклеиновые кислоты, в гидролизатах, полученных из гонад с низкой активностью ферментов и/или ее отсутствием, преобладают высокомолекулярные нуклеиновые компоненты.

5. Предложена модель механизма влияния эндогенных ферментов на процесс деструкции ДНК из гонад гидробионтов, которая основана на активации эндогенных ДНКаз протеазами, существенно увеличивающий доступность субстрата для экзогенных ферментных препаратов, используемых в технологическом процессе.

6. Показано, что БАДы из гонад гидробионтов обладают широким спектром биологической активности, выражающейся в стимуляции синтетических процессов на примере метаболизма одноклеточных тест-объектов Т. pyriformis и высших животных, а также в антиоксидантном и радиопротекторном действии.

7. Утверждена нормативно-техническая документация на БАД «Нуклеатин», выпущена опытно-промышленная партия.

Заключение

Полученные результаты позволили разработать новые БАД, содержащие водорастворимую форму ДНК, набор свободных аминокислот, в том числе незаменимых, и пептидов и обладающие широким спектром лечебно-профилактических и общеукрепляющих для организма человека свойств. В работе был использован метод ферментативного гидролиза гонад гидробионтов и осуществлен поиск его оптимальных параметров. Проведено сравнение как протеолитических, так и нуклеазных активностей эндогенных и экзогенных ферментов.

С целью выяснения структурных особенностей того или иного вида сырья, способности к ферментативной деструкции, а также для выявления новых источников получения БАД, из гонад различных видов гидробионтов были приготовлены ферментативные гидролизаты. По накоплению низкомолекулярных продуктов оценивали перспективность использования молок различных видов рыб и беспозвоночных для выделения водорастворимой ДНК.

В гонадах рыб и беспозвоночных выявлены протеолитические и нуклеазные ферменты, оказывающие значительное влияние на состав препаратов, получаемых ферментативным способом. Значения скорости гидролиза белков и нуклеиновых кислот зависели от вида объектов, рН среды, концентрации ткани в реакционной смеси. Во всех исследуемых объектах преобладающей явилась активность кислых дезоксирибонуклеаз.

Наибольшее значение активности кислых ДНКаз наблюдалось в молоках горбуши, показатели активности щелочных ДНКаз самые высокие в молоках сельди.

При исследовании дезоксирибонуклеазной активности используемых ферментных препаратов были рассмотрены кинетические закономерности. На основании кинетических характеристик пары фермент - субстрат определены приоритеты по применению ферментных препаратов. Если для гидролиза белков могут быть использованы все исследуемые в работе препараты, то для того, чтобы добиться высокой степени гидролиза нуклеиновых кислот, целесообразнее применять пилорин и гепатопанкреатин. Дезоксирибонуклеазы, выделенные из пилорических придатков лососей обладали наибольшим сродством к ДНК молок рыб этого вида при самой высокой скорости гидролиза.

Состав препаратов, получаемых из гонад различных видов гидробионтов с помощью ферментативного гидролиза, определялся активностью эндогенных протеолитических и нуклеазных ферментов. Эндогенные нуклеазы и протеазы молок гидробионтов инициировали процесс гидролиза нуклеиновых кислот и облегчали доступность субстрата для экзогенных ферментных препаратов. Таким образом, показана взаимосвязь активности эндогенных нуклеаз в молоках гидробионтов, молекулярной массы продуктов ферментативного гидролиза нуклеиновых кислот и биологической активности препаратов на их основе.

На основании проведенных исследований разработана технология получения водорастворимой формы ДНК из гонад гидробионтов «Нуклеатин», в которую была включена стадия фракционирования олигонуклеотидов посредством ультрафильтрации. Данная стадия позволила получить более очищенные препараты, на основе которых можно будет в дальнейшем проводить разработки новых лекарственных форм. Разработанный метод выгодно отличается от известного метода (спиртового осаждения) получения нуклеопротеидного комплекса из молок лососевых по многим параметрам: во-первых, для производства не требуется применение органических растворителей, во-вторых, получаемый препарат обладает хорошей растворимостью в широком диапазоне рН, что расширяет сферу его применения, в-третьих, за счет комплексного состава «Нуклеатина» проявляются новые биологические свойства. Кроме того, для производства можно использовать не только молоки лососевых, но и другие распространенные виды сырья. По результатам исследований разработаны рекомендации по применению препаратов, полученных из гонад разных видов гидробионтов.

Медико-биологические испытания БАД «Нуклеатин» показали ее безопасность. Были исследованы следующие показатели биологической активности: антиокислительная и влияние на физическую работоспособность. Кроме того, было исследовано влияние препаратов на рост и развитие инфузорий Tetrahymena pyriformis. Добавка препаратов к основному субстрату в низких дозах стимулировала усвоение его питательных составляющих, что совпадает с биологической активностью компонентов препарата.

Таким образом, «Нуклеатин» можно рекомендовать как общеукрепляющее средство, обеспечивающее интенсификацию внутриклеточного метаболизма как отдельных систем, так и всего организма в целом, и активно влияющее на общие и местные механизмы его регуляции.

Список литературы диссертационного исследования кандидат технических наук Позднякова, Юлия Михайловна, 2003 год

1. Абрамова Ж.И., Оксенгендлер Г.И. Человек и противоокислительные вещества. Л.: Наука, 1985. - 229 с.

2. А.С. 1804852 SU. Способ лечения лимфогрануломатоза: / Ильяшенко В.В., Сусулева Н.А., Махонова Л.Н., Вайнберг Ю.П., Шагалов Л.Д., Фетисова Н.И.- Заявл. 13.05.94. Опубл. 10.03.96. Бюл. № 7.

3. Белоус A.M., Годин В.П., Панков Е.Я. Экзогенные нуклеиновые кислоты и восстановительные процессы. М.: Медицина. - 1974. - 200 с.

4. Бердышев Г.Д. Нуклеазы. Биологическая роль и практическое использование. Киев: Наукова Думка. - 129 с.

5. Беседнова Н.Н., Эпштейн Л.М. ДНК. Владивосток: ТИНРО-центр. -2002. 39 с.

6. Буш Г. Гистоны и другие ядерные белки. М.: Мир. - 1967.- 286 с.

7. Вакорина Т.И., Мензорова Н.И., Рассказов В.А. Исследование конформационной стабильности ДНКазы гепатопанкреаса краба // Биохимия. 1997. - Т. 62. - № 12. - С. 1642-1647.

8. Газиев А.И., Малахова Л.В., Куцый М.П. Пострадиационная активацияпротеиназ, ассоциированных с ядерным матриксом гепатоцитов крыс // Радиобиология. 1987. - т. 27. - С. 166-170.

9. Гафуров Ю.М. Дезоксирибонуклеазы, Владивосток: Дальнаука. 1999.230 с.

10. Гафуров Ю.М., Терентьев JI.JL, Рассказов В.А. Выделение и некоторые свойства АТФ-зависимой ДНКазы из эмбрионов морского ежа Strongylocentrotus intermedius. II Биохимия. 1979. - Т. 44. - № 6. - С.996 -1004.

11. Государственная фармокопея СССР. М.: Медицина .- 1987. XI издание, вып. 2, стр. 182.

12. Грачева И.М., Грачев Ю.П., Мосичев М.С., Борисенко Е.Г., Богатков С.В., Гернет М.В. Лабораторный практикум по технологии ферментных препаратов. М.: Легкая и пищевая промышленность. 1982. - 239 с.

13. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты. -М.:Мир. 1982: В 3 т./Т. 2. - 805 с.

14. Дэвидсон Дж. Биохимия нуклеиновых кислот. М.: Мир. - 1968. - 333 с.

15. Заленский А.О., Буххольц П., Ибрагимов Р.Х. Сравнительное исследование протаминов лососевых рыб // Цитология. 1980. - Т. 22. - №6.1. С. 727-729.

16. Земскова A.M. Рибонуклеиновая кислота. М.: Наука. - 1997. - 251 с,

17. Зенгер В. Принципы структурной организации нуклеиновых кислот. -М.: Мир. 1987. - 584 с.

18. Игнатьев А.Д., Исаев М.К., Долгов В.А., Шабий В.Я., Нелюбин В.П. Модификация метода биологической оценки пищевых продуктов с помощью реснитчатой инфузории тетрахимена пириформис // Вопросы питания. -1980.-№ 1,-С. 70-71.

19. Исаева И.В., Ковалева С.В., Патрики Е.В., Сеничева Н.А., Плетень А.П., Прохоров Б.С., Плохой В.И. Физико-химические свойства и антигепариновая активность протаминов лососевых и осетровых рыб // Хим. Фарм. Журн. -1989.-Т. 23.-№6.-С. 686-691.

20. Каверзнева Е.Д. Стандартный метод определения протеолитической активности для комплексных препаратов протеаз // Прикладная биохимия и микробиология. 1971. Т. 7. - № 2. -С. 225-228.

21. Каплина Э.Н. Некоторые итоги клинического применения препарата Деринат с 1976 по 2000 г. // Использование препарата Деринат в различных областях медицины: Тез. докл. I Всероссийской конф. Москва. -2000 г. С. 3 - 6.

22. Карклиня В.А., Бирска И.А., Лимаренко Ю.А Количественное определение нуклеиновых кислот в молоках лососевых различными методами // Химия природных соединений. 1989. - Т. 1. - С. 122-126.

23. Касьяненко Ю.И., Ковалева Ю.В., Эпштейн Л.М., АртюковА.А. Получение и свойства производных ДНК из молок лососевых // Изв. ТИНРО-центра. -1997. -Т. 120. -С. 37 43.

24. Касьяненко Ю.И., Пивненко Т.Н. Сравнительные физико-химические характеристики низкомолекулярной дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) из морских гидробионтов // Изв. ТИНРО-центра. -1999.- Т. 125. -С.152-164.

25. Колодзейская М.В., Пивненко Т.Н. Трипсин-, химотрипсиноподобные протеиназы рыб // Укр. биохим. журн. 1988. - Т. 60,. - №. 4. - С. 103-117.

26. Корниш-Боуден. Основы ферментативной кинетики. М.: Мир.,.- 1979.280 с.

27. Кошланд Д.Е. Регуляция ферментативной активности и путей метаболизма // В кн.: Перспективы биохимических исследований. М.: Мир. - 1987.-С. 82-91.

28. Куцый М.П., Кузнецова Е.А., Газиев А.И. Участие протеаз в апоптозе // Биохимия.- 1999. Т. 64. - № 2. - С. 149-163.

29. Лебедева Л.Г., Александрова С.С., Банаскьян А.Г., Вотрин И.И. Характеристика ядерных эндо- ДНКаз печени крыс по молекулярной массе икатионной зависимости // Биохимия. -1995. -Т. 60. № 5. - С. 798 - 804.

30. Лобарева Л.С., Денисов Л.Н., Якушева О.Е. Витамины антиоксидантного действия и ревматические заболевания // Вопр. Питания. -1995. №4.- С. 24-29.

31. Машковский М.Д. Лекарственные средства: Пособие для врачей: В 2 т./ 13-е издание, новое Харьков: Торсинг. - 1997. - Т.2 . - 590 с.

32. Мензорова Н.И., Маркова А.В., Рассказов В.А. Высокостабильная Са, Mg-зависимая ДНКаза из гепатопанкреаса краба // Биохимия. Т.59. - 1994. -№ 3. - С.449-456.

33. Мензорова Н. И., Зинатулин Р.Ф., Фаворов В. В., Рассказов В.А. Выделение и исследование свойств Са, Mg-зависимой эндонуклеазы из гепатопанкреаса краба Paralithodes camtschatica. // Биохимия. Т. 58. - 1993. -№5.-С. 681 - 691.

34. Мецлер Д. Биохимия. М.: «Мир». - 1980: В 3 т./ Т. 2. - 606 с.

35. Неклюдов А.Д., Иванкин А.Н., Бердутина А.В. Получение и очистка белковых гидролизатов // Прикл. биохим. и микробиол.-2000. Т.36. - № 4. -С. 371 -379.

36. Нечаевский Ю.В., Иванов В.А. ДНК-аза II в сперматозоидах вьюнов (Misgurnus fossilis L.) // Биохимия. 1999. - Т. 64. - № 5. - С. 587-593.

37. Номенклатура ферментов. Рекомендации (1972 г) Международного биохимического Союза по номенклатуре и классификации ферментов, а также по единицам ферментов и символам кинетики ферментативныхреакций. / Под. ред. Браунштейна А.Е. М: Наука. 1979.

38. Оруджев Я.С., Ростовщиков В.В. Применение медиаторных аминокислот (таурин) во внебольничной геронтологической практике // Социальная и клиническая психиатрия. 1998. - № 3. - С. 78-81.

39. Остерман JI.A. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез и ультрацентрифугирование. М.: Наука. 1981. - 286 с.

40. Патент РФ № 2005724. Способ производства натриевой соли ДНК из животного сырья и установка для его осуществления / Вайнберг Ю.П., Каплина Э.Н., Каплин В.Ю., Ладыгин А.Е. Заявл. 29.04.93. - Опубл. 15.01.94.

41. Патент СССР № 915446 Способ получения ДНК из молок рыб / Гаймула М.А., Кална В.Х., Микстайс У.Я., Эпштейн Л.М. Заявл. 10.10.80; Опубл. 01.07.91.

42. Патент РФ № 2034028. Способ получения протеолитического комплекса / Пивненко Т.Н., Жданюк В.М., Эпштейн Л.М. 1992. - БИ № м.

43. Патент РФ № 2055482. Способ получения белково-нуклеинового гидролизата / Гафуров Ю.М., Козловская Э.П., Рассказов В.А., Галкин В.В., Артюков А.А., Козловский А.С., Арзамасцев Е.В.- Заявл. 13.05.94. Опубл. 10.03.96.

44. Патент РФ № 2063228. Способ лечения гемопоэза / Вайнберг Ю.П., Каплина Э.Н. Опубл. 04.02.93.

45. Пат. РФ № 2072855. Способ получения натриевой соли ДНК из молокрыб: / Урманов И.Х., Серпинский О.И., Татьков С.И., Сиволобова Г.Ф., Кочнева Г.В., Гражданцева А.А., Иваницкий B.JL, Иваницкий С.Б. Заявл. 21.09.95.-Опубл. 10.02.97.

46. Патент РФ № 95103961. Лечение хронической ишемической болезни сердца / Литасова Е.Е., Караськов A.M., Семенов И.И., Горбатых Ю.Н.-Опубл. 20.03.95.

47. Пашук Л.К., Апрышко Г.Н., Трещалина Е.М. Препараты ДНК как потенциальные терапевтические средства // Хим.- фармац. ж. 1995. - Т.29. -№ 6. - С. 61-64.

48. Пивненко Т.Н., Позднякова Ю.М., Давидович В.В. Получение и характеристика белковых гидролизатов с использованием ферментных препаратов различной специфичности // Изв. ТИНРО. Т. 120. 1997. С. 2331.

49. Пивненко Т.Н Трипсиноподобные протеазы дальневосточных лососей // Дис. .канд. биол. наук Киев. - Инст. Биохимии им. Палладина. -1986. -176 с.

50. Пивненко Т.Н., Эпштейн Л.М., Колодзейская М.В., Кудинов С.А. Получение и свойства трипсина из пилорических придатков тихоокеанского лосося // Прикладная биохимия и микробиология. 1989. - Т. 25, №. 4. - С. 490 - 497.

51. Рыбин В.К., Григорова Л.В., Матросович Т.Ю., Величко Т.И., Макаров Н.В. Использование красителя кумасси G-250 для определенияантигепариновой активности протаминов (стелинов А и В) in vitro // Хим. Фарм. Журн. № 10. - 1997.

52. Рыкова Е.Ю., Лактионов П.П., Власов В.В. Активирующее влияние ДНК на иммунную систему // Успехи современной биологии. Т. 121. № 2. -2001. - С. 160-171.

53. Сахаров И.Ю., Литвин Ф.Е. Субстратная специфичность коллагенолитических протеаз из гепатопанкреаса камчатского краба // Биохимия. 1992. - Т. 57. -№ 1. - С. 61-67.

54. Сибирцев Ю.Т., Мензорова Н.И., Шастина В.В., Рассказов В.А. Множественность ДНКаз в спермиях морского ежа Strongylocentrotus intermedius // Доклады академии наук. 2001. - Т. 376, № 1. - С. 117-119.

55. Сибирцев Ю.Т., Рассказов В.А. Влияние ионной силы на оптимум рН, специфичность и механизм действия кислой ДНК-азы из зрелых яйцеклкеток морского ежа Strongylocentrotus intermedius. // Биохимия. 2000 - Т. 65. - № 8.- С. 1121-1129.

56. Соколова И.А., Ходарев Н.Н., Александрова С.С., Вотрин И.И. Выделение и исследование Ca/Mg-зависимой эндонуклеазы из клеточных ядер лимфоцитов селезенки человека // Биохимия. Т. 53. 1988. - № 7. - С. 1163-1173.

57. Солдатенков В.А., Денисенко М.Ф., Алферова Т.М., Филлипович И.В. Деградация хроматина при гибели лимфоцитов тимуса, индуцированной радиацией или дексаметазоном: необходимость этапа предварительногопротеолиза//Радиобиология. Т. 31. - 1991. - С. 180-187.

58. Торкунов П.А., Сапронов Н.С. Кардиопротекторное действие таурина // Экспериментальная и клиническая фармакология. 1997. - Т. 60. - №5. - С. 72-77.

59. ТУ № 00479942-002-94. Протомегатерин (металлопротеиназа). Технические условия на опытную партию.

60. Фершт Э. Структура и механизм действия ферментов. М.: Мир 1980.432 с.

61. Филатов М.В., Варфоломеева Е.Ю. Изучение упаковки хроматина в ядрах клеток млекопитающих методом прочной цитометрии. // Цитология. -Т. 32. 1990. - № 4. - С. 343-350.

62. Филимонова М.Н, Губская В.П., Нуретдинов И.А., Бенедик М.Дж., Богомольная Л.М., Андреева М.А., Лещинская И.Б. Изоформы нуклеазы Serratia marcescens. Роль ионов Mg в механизме гидролиза. // Биохимия. -1997.-Т.62,№9.-С. 1148-1154.

63. Хаитов P.M., Игнатьева Г.А. СПИД. М.: Народная академия культуры и общечеловеческих ценностей. - 1992. - 243 с.

64. Шапиро Д.К. Практикум по биологической химии. Минск: Высшая школа, 1976. 285 с.

65. Эпштейн J1.M., Пивненко Т.Н., Позднякова Ю.М., Гуляков М.Б. Новые направления в технологии переработки гидробионтов // Перспективы развития рыбохозяйственного комплекса России XXI век: Тез. научно-практической конференции. - Москва. - июнь. - 2002.

66. Bendigs S., Salzer U., Lipford G.B., Wagner H., Heeg K. Induction of NK Activity in Murine and Human cells by CpG Motifs in oligodeoxynucleotides and Bacterial DNA // Europ. J. Immonol. 1999. V. 29. № 4. P. 1209.

67. Bendjennat M., Blanchard A., Loutfi M., Montagnier L., Bahraoui E. Purification and Characterization of Mycoplasma penetrans Ca2+, Mg2+-dependent Endonuclease 11 Journal of Bacteriology. - 1997. № 4- P. 2210-2220.

68. Bonner J., T'so P.O.P. The Nucleohistones. San Francisco. Holden Hay. -1964.

69. Branden C., Tooze J. Introduction to protein structure. New York, London; Garland Publ. Inc. - 1991.

70. Cordonnier C., Bernardi Giorgio. A comparative study of acid deoxyribonucleases extracted from different tissues and species. // Canadian Journal of biochemistry. V. 46. - 1968. - P. 989 - 995.

71. Chou M.-Y., Liao T.-H. Shrimp hepatopancreatic deoxyribonuclease -purification and characterization as well as comparison with bovine pancreatic deoxyribonuclease // Biochim. Biophys. Acta, 1990. V.1036, № 2, P. 95-100.

72. Felix К., Fischer H., Krekels A. Protamines and nucleoprotamines. // Progr. Boiphys. Chem. 1956. - V. 6.- № 2.

73. Folch J., Less M., Sloane-Stanley G.H. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues // J. Biol. Chem. 1957. - V. 226. -№ 1. - P. 497-509.

74. Hashida Т., Tanaka Y., Matsunami N., Yoshihara K., Kamiya Т., Tanigawa Y., Koide S.S. Purification and properties of bull seminal plasma Ca, Mg -dependent endonuclease. // The Journal of Biological Chemistry. 1982. -V. 257. -№21. -P. 13114-13119.

75. Hummel B.C.W. A modified spectrophotometric determination of chymotrypsin, trypsin and trombine // Can. J. Biochem. Physiol. 1959. - V. 37. -№ 12. - P. 1393-1399.

76. Johnson P. H., Laskowski M. Sr. Mung Bean Nuclease I // J. Biol. Chem. -1970. -V.245. № 4.- P. 891.

77. Kartha G.,Bdlo J., Harker D. Tertiary Structure of Ribonuclease // Nature1.ndon). 1967,- V.213.- № 5079. - P. 862.

78. Koshland D.E., Goldbeter A., Stock J.B. Amplification and adaptation in regulatory and sensory systems // Science. 1982. - V. 217. - № 4556. - P. 220225.

79. Mahmoud M. Physicochemical and functional properties of protein hidrolysates in nutritional product // Food Technol. 1994. V. 48. № 10. - P. 8995.

80. Mcllwain H. Poiybasic and polyacidic substances or aggregates and the excitability of cerebral tissues, electrically stimulated in vitro. // Biochem. J. -1963. -V. 90. P. 442-448.

81. Muggleton P., MacLaren J.G., Dyke W.J.C. Effect of protamine sulfate on experimental tumours in mice. // Lancet. 1964. - № 1. - P. 409-410.

82. Nakamura M., Sakaki Y., Watanabe N., Takagi Y. Purification and characterization of the Ca, Mg- dependent endodeoxyribonuclease from calf thymus chromatin. // J. Biochem. V. 89. - 1981. - P 143 -152.

83. Rasskazov V.A., Anisimov M.M., Berdyshev G. D. Some properties and specificity of acid doexyribonuclease from plaice liver // Сотр.Biochem. Physiol. 1968. -V. 26.-P. 639-649.

84. Rasskazov V.A., Anisimov M.M., Berdyshev G. D. Some properties and specificity of deoxyribonucleases from marine invertebrates and fishes // Comp.Biochem. Physiol.- 1975. -V. 51.- P. 343-347.

85. Shwert G. W. and Takenaka Y. A spectrophotometric determination of trypsin and chymotrypsin // Biochem. Biophys. Acta. 1955. - V. 16. № 4. - P. 570-575.

86. Stollar B.D. // CRC Crit. Rev. Biochem. 1986. V. 20. № 1. P. 1.

87. Tomlinson R.V., Tener G.M. The use of urea to eliminate the secondary binding forces in ion exchange chromatography of polynucleotides // J. Amer. Chem. Soc. -1962. -V. 84. -№ 15.- P. 2644-2645.

88. Yamamoto M. Purification and some properties of an acid deoxyribonuclease from testes of Chinook salmon ONCORHYNCHUS TSHA WYTSCHA //Biochimica et Biophysica Acta.-V. 228. 1971. - P. 95-104

89. Zhang D., Pasternack M.S., Beresford P.J., Wagner L., Greenberg A.H., Lieberman J. Induction of Rapid Histone Degradation by the Cytotoxic T1.mphocyte Protease Granzyme A // J.Biol.Chem. 2001, 276, № 5, P. 36833690