Технология фармацевтической композиции с модифицированной пероксидазой тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.04.01, кандидат наук Серкова, Анастасия Никитична

• Серкова, Анастасия Никитична
• кандидат наук
• 2015

Оглавление диссертации кандидат наук Серкова, Анастасия Никитична

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Пероксидаза из растительного сырья: структура, свойства и применение.Л2

1.1.1 Строение и механизм действия пероксидаз

1.1.2 Влияние кальция в структуре на активность пероксидаз

1.1.3 Свойства и области применения пероксидаз

1.1.4 Источники и технологии получения растительных пероксидаз

1.2 Получение ферментов

1.2.1 Селективные сорбенты для выделения белков

1.2.2 Методы выделения и очистки белков

1.2.3 Хроматографические методы

1.3 Современные подходы к созданию модифицированных форм ферментов .29 1.3.1 Носители для иммобилизации

Глава 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Материалы исследования

2.1.1 Растительная пероксидаза

2.1.2 Физико-химические характеристики применяемых сорбентов

2.1.3 Носители для иммобилизации

2.1.4 Свойства хлоргексидина биглюконата

2.1.5 Структура и свойства гентамицина и азитромицина

2.1.6 Структура и свойства нипагина

2.1.7 Структура и свойства нипазола

2.1.8 Свойства альгината натрия

2.1.9 Свойства карбопола

2.1.10 Устройство и технические характеристики установки Vivaflow 200 фирмы Sartorius Stedim Biotech для ультрафильтрации в тангенциальном режиме

2.2 Методы исследования

2.2.1 Определение концентрации белка по методу Лоури

2.2.2 Метод определения ферментативной активности пероксидазы по пирогаллолу

2.2.3 Определение концентрации гентамицина

2.2.4 Подготовка сорбентов к работе

2.2.5 Гельхроматографический метод определения молекулярной массы белков

2.2.6 Методика постановки опытов по изучению кинетики диффузии через пористые мембраны

2.2.7 Методы работы с ультрафильтрационной мембранной установкой У1уаПо\у 200

2.2.8 Методика определения активности пероксидазы в геле

2.2.9 Определение цветности раствора

2.2.10 Подготовка растительного сырья

2.2.11 Методика проведения процесса экстрагирования

2.2.12 Деминерализация экстрактов

2.2.13 Депигментация экстрактов

2.2.14 Определение рН оптимум сорбции в статических условиях

2.2.15 Изучение специфичности пероксидазы из корнеплодов редьки черной

2.2.16 Изучение влияния носителей и эксципиентов на активность пероксидазы

2.2.17 Изучение влияния носителей на активность пероксидазы в комплексе с антибиотиком

2.2.18 Микробиологические методы исследования

2.2.19 Математические методы обработки результатов

Глава 3 УСЛОВИЯ СОРБЦИОННО-ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ ПЕРОКСИДАЗЫ ИЗ ЭКСТРАКТОВ С ПОСЛЕДУЮЩИМ КОНЦЕНТРИРОВАНИЕМ ПОЛУЧЕННЫХ ЭЛЮАТОВ НА МЕМБРАННЫХ МОДУЛЯХ

3.1 Исследование экстрактов из корней хрена и корнеплодов редьки черной,

содержащих пероксидазу

3.1.1 Подбор условий экстрагирования пероксидазы из растительного сырья

3.1.2 Кинетика стабильности пероксидазы в экстрактах

3.1.3 Исследование зависимости активности пероксидазы от рН и температуры

3.1.4 Гельхроматографический анализ исходного экстракта

3.2 Изучение процесса депигментации экстракта на различных анионитах в динамических условиях

3.2.1 Гельхроматографический анализ депигментированного экстракта

3.3 Исследование рН оптимум сорбции в статических условиях

3.4 Исследование процесса сорбции пероксидазы на различных сорбентах в статических условиях

3.5 Подбор условий выделения и очистки пероксидазы из экстрактов в динамических условиях

3.6 Гельхроматографический анализ элюата, полученного после процесса десорбции

3.7 Подбор мембран для концентрирования элюата, содержащего пероксидазу

3.8 Изучение специфичности пероксидазы из корнеплодов редьки черной

3.9 Сравнительная характеристика физико-химических свойств пероксидаз из

различного растительного сырья

Глава 4 РАЗРАБОТКА ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЙ КОМПОЗИЦИИ С

МОДИФИЦИРОВАННОЙ ПЕРОКСИДАЗОЙ

4.1 Исследование активности пероксидазы из корнеплодов редьки черной при модификации различными носителями

4.1.1 Влияние антибиотиков гентамицина, азитромицина и антисептика хлоргексидина биглюконата на активность пероксидазы

4.1.2 Изучение влияния а, р и у циклодекстринов на активность пероксидазы из корнеплодов редьки черной

4.1.3 Изучение влияния ß - циклодекетринов на активность пероксидазы в

комплексе с антибиотиком

4.1.4 Изучение процесса связывания фермента с антибиотиком и

циклодекстринами

4.2 Разработка состава фармацевтической композиции в виде геля

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЯ

ПРИЛОЖЕНИЕ А

Акты апробации и внедрения результатов

ПРИЛОЖЕНИЕ Б

Протокол валидации

Методики количественного определения пероксидазы в фармацевтической

композиции гель с пероксидазой

ПРИЛОЖЕНИЕ В

Технологическая схема

и изложение процесса производства геля

ПРИЛОЖЕНИЕ Г

Фармакопейная статья (проект)

на гель с пероксидазой

ПРИЛОЖЕНИЕ Д

Отчет об экспериментальном доклиническом изучении общей токсичности и раздражающих свойств фармацевтической композиции с пероксидазой в виде геля

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Технология фармацевтической композиции с модифицированной пероксидазой»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования. Важным аспектом фармацевтической промышленности в настоящее время является расширение спектра комплексных лекарственных форм, включающих ферменты.

Производство лекарственных форм ферментов из животного сырья ограничено недостатком их ассортимента и высокой стоимостью конечной продукции. Возможность использования ферментов из более дешёвого растительного сырья ограничена отсутствием производственной базы и покупкой дорогостоящих зарубежных аналогов. Кроме того, ряд ферментов из растительного сырья, пользующихся большим спросом, вообще не производится в России в промышленном масштабе. Один из таких ферментов пероксидаза (КФ 1.1.11.7).

Пероксидаза является основным реагентом в медицинских диагностических тест-системах, широко использующихся для выявления целого ряда вирусных, бактериальных и онкологических заболеваний. Этот фермент обладает так же лечебными свойствами, среди которых наиболее ярко выраженными и значимыми являются: антибактериальные, антиоксидантные и иммуномодулирующие. В настоящее время на фармацевтическом рынке присутствуют биологически активные добавки и средства космецевтики с указанными свойствами, однако практически отсутствуют лекарственные препараты. Известны средства космецевтики производства КНР, обладающие антиоксидантными свойствами за счет присутствия пероксидазы алое вера (гели алое Lucklife и Fohow), биологически активная добавка (БАД) японского производства, являющаяся иммуномодулятором и антиоксидантом, содержащим растительную пероксидазу (пакеты с гелем Bio Rex), БАД в виде водно-спиртового раствора биоантиоксидантного комплекса из клеток биомассы женьшеня (Неовитин). Анализ рынка показал, что в настоящее время на российском рынке отсутствуют лекарственные препараты с пероксидазой.

Известно, что нативные ферменты являются лабильными веществами, которые могут терять активность как при воздействии различных внешних факторов, так и при хранении. Проблема сохранения активности ферментов может решаться их направленной модификацией с применением различных методов иммобилизации - химических и физических. Физические методы являются более мягкими и не вызывают сильных изменений в структуре фермента. Модифицированные ферменты могут быть включены в различные лекарственные формы (капли, пасты, гели, крема, аэрозоли и др.).

В связи с этим актуальна разработка состава фармацевтической композиции с модифицированной пероксидазой как основы для геля.

Цель диссертационной работы - создание фармацевтической композиции, включающей модифицированную пероксидазу из растительного сырья.

Для достижения поставленной цели решали следующие задачи:

1. Подбор условий экстрагирования пероксидазы из растительного сырья, исследование процесса сорбции фермента на различных сорбентах из растительных экстрактов. Выбор оптимального сорбента по данным изотерм сорбции;

2. Проведение хроматографической очистки пероксидаз из растительных экстрактов на макропористых сорбентах, подбор ультрафильтрационных модулей для концентрирования и обессоливания элюатов;

3. Разработка технологической схемы выделения и очистки пероксидазы из экстракта с получением лиофилизата;

4. Модификация пероксидазы и подбор состава фармацевтической композиции;

5. Разработка технологической схемы получения фармацевтической композиции в виде геля для наружного применения, включающей модифицированную растительную пероксидазу;

6. Исследование стабильности пероксидазы и гентамицина в составе геля, его биологической безвредности. Разработка проекта ФС на гель с пероксидазой.

Методы исследовании. В работе использовали физико-химические (спектрофотометрия, динамическое рассеяние света, электронная микроскопия, хроматография) и биохимические методы. Обобщенный анализ полученных результатов основывался на математической статистике. Обработку данных проводили с помощью электронных таблиц Microsoft Excel 2003 и программы Mathcad. Оценку случайных погрешностей проводили методом математической статистики с использованием критерия Стыодента при доверительной вероятности Р = 0,95.

Научная новизна. В ходе диссертации впервые:

1. Проведена сорбционная очистка пероксидаз из растительных экстрактов на макропористом сорбенте

2. Разработана технологическая схема выделения, очистки и модификации пероксидазы из корнеплодов редьки черной

3. Разработана фармацевтическая композиция на основе модифицированной пероксидазы из корнеплодов редьки черной в комплексе с антибиотиком из группы аминогликозидов

4. Получен гель, активной составляющей которого является фармацевтическая композиция, включающая пероксидазу из корнеплодов редьки черной, гентамицин и ß-циклодекстрины.

Достоверность и обоснованность научных результатов. Обеспечивается использованием методов исследований, соответствующих предмету, цели и задачам работы; аттестованных и поверенных приборов и оборудования; однородной и представительной выборкой результатов экспериментов, позволяющей судить о сходимости и воспроизводимости представленных данных; представлением и обсуждением результатов работы на конференциях различного уровня.

Практическая ценность работы.

В результате проведенных исследований:

1. Предложена схема выделения и очистки пероксидазы из корнеплодов редьки черной, которая сокращает продолжительность технологического

процесса и увеличивает выход фермента в сравнении с известными технологиями

2. Подобран состав и получен опытный образец геля, активной составляющей которого является фармацевтическая композиция, включающая модифицированную пероксидазу из корнеплодов редьки черной в комплексе с гентамицином

Реализация результатов работы.

1. Апробация предложенной сорбционной схемы выделения и очистки пероксидазы из корнеплодов редьки черной проведена на предприятии ООО «Самсон-Мед» (Санкт-Петербург, акт от 02 октября 2014 года)

2. Внедрение в учебный процесс ГБОУ ВПО СПХФА Минздрава России при подготовке специалистов по направлению 03.01.06 «Биотехнология» (акт от 18 июня 2013 года).

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены: на международной научно-методической конференции «Сандеровские чтения», посвященной памяти выдающегося отечественного учёного в области технологии лекарств Юрия Карловича Сандера, состоявшейся на базе ГБОУ ВПО СПХФА в г. Санкт-Петербург 03-04 февраля 2012 г.; на Конкурсе молодых учёных на лучшую научно-исследовательскую работу в рамках VII международного конгресса "Биотехнология: состояние и перспективы развития", который состоялся 20-22 марта 2012 г. в Москве, награждена дипломом и медалью; на городском семинаре Менделеевского общества «Хроматография, ионный обмен, альтернативные методы», проводимого на базе Химического факультета СПбГУ 09 апреля 2012 года; на мероприятии по программе «Участник молодёжного научно-инновационного конкурса» («У.М.Н.И.К.») в мае 2012 года. Программа проводится Фондом содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере. Серкова А.Н. является победителем программы «У.М.Н.И.К.» 2012 года. Номер Госконтракта: № 10483р/16906 от 08.06.12. Номер проекта 16906. Переведена на второй год 13 мая 2013 года; на финале XIV конкурса научно-исследовательских проектов под девизом

«Молодые, дерзкие, перспективные», проходившего в рамках Международного инновационного форума в ОЛО «Ленэкспо» в г. Санкт-Петербург 25 сентября 2012 г., награждена сертификатом; на XVIII Международном съезде «РНУТОРНА1Ш 2014», состоявшемся на базе ГБОУ ВПО СПХФЛ в г. Санкт-Петербург 03-05 июля 2014 г. Серкова А.Н. является победителем конкурсного отбора на предоставление в 2013 году субсидий молодым ученым, молодым кандидатам наук вузов, отраслевых и академических институтов, расположенных на территории Санкт-Петербурга по теме «Модификация ферментов и конструирование наноструктур на их основе», размер субсидии составил 100 000 рублей.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена по плану научных исследований ГБОУ ВПО Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии Минздрава России. Номер государственной регистрации темы НИР «Разработка технологий производства, методов анализа, стандартизации и фармакологической оценки лекарственных растений, новых или модифицированных фармацевтических субстанций и препаратов» № 01201252028.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности.

Исследования диссертационной работы соответствуют паспорту специальности 14.04.01 - технология получения лекарств, а именно: пункту 3 - «Разработка технологий получения субстанции и готовых лекарственных форм»; пункту 4 -«Исследования по изучению особенностей технологии получения готовых лекарственных форм из различных видов субстанций, сырья и вспомогательных веществ».

Публикации и вклад автора в разработку работы. По теме диссертационной работы опубликовано 19 работ, в том числе 3 статьи в рецензируемых научных журналах, входящих в перечень ВАК. Все результаты, составляющие содержание диссертации, получены автором самостоятельно.

Научные результаты. На защиту выносятся следующие научные результаты:

1. Содержание активных и примесных белковых компонентов в экстрактах из корней хрена и корнеплодов редьки черной;

2. Оптимальный сорбент для хроматографической очистки и мембранный модуль для концентрирования пероксидаз из экстрактов;

3. Модификация пероксидазы с подбором оптимального носителя;

4. Разработка метода выделения и очистки пероксидазы из растительного сырья;

5. Технология геля, активной составляющей которого является фармацевтическая композиция с модифицированной растительной пероксидазой.

Глава 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Пероксидаза из растительного сырья: структура, свойства и применение

Пероксидаза (КФ 1 Л. 11.7) — один из распространенных ферментных белков, интерес к изучению которого с годами возрастает, что отмечено в книге Андреевой В.А. [1]. Интерес к растительным пероксидазам вызван большим набором изоэнзимов (от 3 до 42), высокой специфичностью в отношении перекиси водорода (при проявлении пероксидазной активности), возможным участием в защитных реакциях [1].

1.1.1 Строение и механизм действия нероксидаз

Андреева В.А. [1] описывает пероксидазу как двухкомпонентный фермент, состоящий из активного центра (коричнево-красный железопротопорфирин IX -гем) и белковой части (неокрашенный гликопротеин), усиливающей каталитическое действие активного центра. Полагают, что все известные пероксидазы и их изоформы содержат этот гем, поскольку небольшие молекулы цианида и азида образуют неактивные шести-координационные комплексы с атомом железа гема на дистальном сайте пероксидазы [1, 2, 3, 4, 131].

В дисталыюм и проксимальном положениях сетью водородных связей с гемом связаны два кальций связывающих участка (рисунок 1.1). Потеря кальция приводит к уменьшению активности фермента и термической стабильности [3, 4, 131, 132].

Газарян И.Г. [2] указывает, что гем - содержащие пероксидазы подразделяются на два суперсемейства: пероксидазы растений и пероксидазы животных (лактопероксидаза, миелопероксидаза, тироидная и др.). Пероксидазы растений включают в себя три класса (1). Класс I содержит бактериальные пероксидазы и пероксидазы из митохондрий и хлоропластов растений, класс II -внеклеточные пероксидазы грибов, класс III - секреторные пероксидазы растений (в большом количестве содержатся в корнях хрена, сельдерее, редисе, редьке, соевых бобах и арахисе) [2,4, 133, 134, 135].

Рисунок 1.1- Трехмерное представление рентгеновской кристаллической структуры изофермента С пероксидазы из корней хрена (HRP С) (Brookhaven accession code 1Н5А). Группа гема (красного цвета) расположена между дистальной и проксимальной областями, каждая из которых содержит один атом кальция (показаны как синие сферы), а-спиральные и ß-листовые области фермента отображены фиолетовым и желтым цветом, соответственно [131]. Пероксидазы катализируют окисление субстратов по схеме: Е + Н202 —> Еь к] Е,+АН2^Е2 +АН;к2 Е2+ АН2 Е + АН-; к3

Е, Е), Е2 — соответственно исходная пероксидаза и ее окисленные формы; АН2, АН- — соответственно исходный субстрат и его окисленная форма; к-константа скорости реакции [2, 4, 5, 131].

В качестве субстратов используют большинство фенолов (пирокатехин, пирогаллол, гидрохинон, резорцин, гваякол), бензидин, адреналин, анилин, к-толуидин, ароматические кислоты (бензойную, салициловую, галловую), аскорбиновую кислоту, нитриты и ряд других соединений [1, 5]. А. Н. Бах и Р. Шода установили, что скорость образования пурпурогаллина при окислении пирогаллола пропорциональна концентрации фермента. Этот метод используют биохимики и в настоящее время для оценки активности как растительных, так и животных пероксидаз [1], поэтому он был выбран в данной работе.

1.1.2 Влияние кальции в структуре на активность нсроксидаз

Ионы кальция, располагающиеся в дистальной и проксимальной областях фермента, по-разному влияют на активность пероксидазы. Проксимальный кальций важен для поддержания общей структуры фермента и седлообразной конформации гема. Потеря дистального кальция приводит к высокой подвижности дистальной области фермента и, как следствие, инактивации пероксидазы при хранении или при экстремальных значениях рН (присутствие в растворе кальция предохраняет пероксидазу из корней хрена от инактивации) [2, 4, 6, 133, 136].

В качестве подтверждения Газарян И.Г. [2] отмечает в своей статье аналогичные явления для других пероксидаз. Са2+ необходим для стабилизации даже концентрированных препаратов катионной пероксидазы арахиса. Кристаллы неактивной формы пероксидазы ячменя содержали по одному иону Са2+ на молекулу фермента. У грибных пероксидаз потеря иона кальция приводит к сильным структурным изменениям и полной потере активности [2, 6].

Очень актуальным является дальнейшее изучение регуляторной роли ионов кальция для других видов растительного сырья (в частности, для корнеплодов редьки чёрной), в виду высокой индивидуальной специфичности этой роли в каждом случае [6].

1.1.3 Свойства н области применения пероксидаз

Стрессовые состояния, вирусное или микробное инфицирование организма оказывают сильное влияние на активность пероксидаз [1, 7]. А. А. Аверьянов и В. П. Лапикова установили, что пероксидазная активность и фунгитоксичность поражённых листьев риса выше, чем у здоровых (согласуется с известными бактерицидными свойствами пероксидазы) [8]. Активность пероксидазы проявляется, когда листья хрена повреждены [131]. Перекисное повреждение клеточных стенок и ферментативное удаление Н202 контролируется активностью антиоксидантной системы фермента пероксидазы [9].

Ряд авторов связывают качество растительного сырья (привкус), созревание фруктов, ферментативное потемнение (совместно с иолифенол оксидазной активностью) с активностью пероксидазы [137].

Ввиду высокой чувствительности пероксидазу широко используют для клинической диагностики и микроаналитических иммунологических обследований (диагностика острых, хронических бактериальных и вирусных (в том числе СПИД), инфекционных, аллергических, аутоиммунных, эндокринологических заболеваний и злокачественных новообразований) [5, 8, 137, 10].

В конце 80-х - начале 90-х годов прошлого века фирма Амершам (Amersham, Великобритания) внедрила хемилюминесцентный анализ с использованием пероксидазы из корней хрена, пользующийся исключительной популярностью. В настоящее время на основе рекомбинантных пероксидаз разрабатываются высокочувствительные биосенсоры [2, 11].

Перспективно применение пероксидаз для селективного окисления органических соединений, для глубокой очистки сточных вод от ароматических соединений, [1, 5, 7, 10, 12].

Новые сферы применения пероксидазы были предложены в лекарственной, химической и пищевой промышленности [13, 14].

Этот фермент обладает так же лечебными свойствами, среди которых наиболее ярко выраженными и значимыми являются: антибактериальные, антиоксидантные и иммуномодулирующие [15]. В настоящее время на фармацевтическом рынке присутствуют биологически активные добавки и средства космецевтики с указанными свойствами, однако практически отсутствуют лекарственные препараты (рисунок 1.2). Известны средства космецевтики производства КНР, обладающие антиоксидантными свойствами за счет присутствия пероксидазы алое вера (гели алое «Lucklife» и «Fohow») [16, 17], биологически активная добавка (БАД) японского производства, являющаяся иммуномодулятором и антиоксидантом, содержащим растительную пероксидазу (пакеты с гелем «Bio Rex») [18], БАД в виде водно-спиртового раствора

биоантиоксидантного комплекса из клеток биомассы женьшеня («Неовитин») [19].

БАД

20%

Космецевтика 20%

Диагностические тестгсистемы 60%

Производитель: КНР Производитель: N88 Со, ЬТЭ ЬискЖе, Ро1кт (Япония)

Производитель: Россия

Производитель: ООО «Vita V», Россия

Производитель: КНР, компания «Викола»

Рисунок 1.2 - Фармацевтические композиции с пероксидазой на рынке России

Анализ рынка показал, что в настоящее время на российском рынке отсутствуют лекарственные препараты с пероксидазой.

Известная технология получения пероксидазы трудоемка, связана с использованием сезонного сырья, дорогостоящих импортных хроматографических сорбентов. Это определяет высокую стоимость фермента: от 200 до 500 долларов за 1 грамм (зависит от степени чистоты) [3, 6, 20].

Важным показателем любой технологии является выход целевого продукта на единицу массы сырья, а в случае растительного биологически активного вещества (БАВ) дополнительную роль играют урожайность, стоимость уборки и переработки.

Широкий спектр применения, высокая стоимость чистого препарата служат мощным стимулом к поиску новых источников получения фермента пероксидазы и методов ее выделения [8, 13, 132].

1.1.4 Источники и технологии получения растительных нероксидаз

К настоящему времени изучены пероксидазы хрена, сои, дыни, картофеля, брюссельской капусты, ячменя, брюквы, апельсина, полыни, плодов перца, моркови, табака, люцерны, ростков пшеницы, огурца, зелёной груши, плодов папайя, верблюжьей колючки, редиса, шпината, мякоти кокоса, риса, хлопка, арахиса, томата, клубники и пальмы [2, 9, 21, 22]. При этом единственным промышленным источником выделения пероксидазы является корень хрена.

Компания «ВВ1 Enzymes» - один из крупнейших мировых производителей природных ферментов, полученных из растительных и животных тканей (компания расположена в Кейптауне, Южной Африке). Ежегодно «ВВ1 Enzymes» продает более 10 миллиардов единиц пероксидазы из корней хрена (метод измерения по гваяколу). Пероксидазу из корней хрена впервые извлекли и очистили в Лабораториях «Seravac» (сегодня «ВВ1 Enzymes») в 1958 году. С тех пор компания «ВВ1 Enzymes» являлась массовым производителем пероксидазы из корней хрена в течение 53 лет [138].

Существующая технология производства пероксидазы из корней хрена компанией «ВВ1 Enzymes» и возможная оптимизация методов выделения и очистки представлены в работе Almero Barnard [138]. Оригинальный метод производства пероксидазы из корней хрена в компании «ВВ1 Enzymes» разделяют на первичные и вторичные процессы. Первичные процессы включают размачивание корней хрена и извлечение фермента из растительного сырья. Отработанное сырье отделяют центрифугированием, супернатант очищают, используя кизельгур. Очищенный экстракт концентрируют ультрафильтрацией на мембране с отсекающей молекулярной массой 10 кДа [138].

Вторичные процессы начинают с солевого фракционирования, снижающего концентрацию балластных белков. Ионную силу полученного раствора уменьшают диализом. Раствор пероксидазы из корней хрена очищают сериями ионнообменной и гидрофобной хроматографии. Конечный продукт -обессоленный лиофилизированный порошок [138].

«BBI Enzymes» сотрудничает с производителями хрена и в Северном, и в Южных полушариях, дающих непревзойденную круглогодичную поставку специально отобранных и культурных корней. Завод в Южной Африке обрабатывает по две тонны корней в день, позволяя производить мульти -килограммовые партии пероксидазы из корней хрена сорта клинической химии и мульти - стограммовые партии иммунохимического сорта [139].

В течение многих десятилетий компания «Sigma-Aldrich» производит пероксидазу мультикилограммовыми партиями. За этот промежуток времени они непосредственно сотрудничали с производителями специально отобранных и культурных корней хрена и непрерывно осуществляли совершенствование процесса, что гарантирует качество [140].

Пероксидаза компании «Sigma-Aldrich» признана во всем мире промышленным стандартом для диагностического производства и применения в исследованиях лабораторного масштаба. «Sigma-Aldrich» предлагает разнообразие продуктов, основанных на чистоте, содержании изоформ и ковалентных модификациях [140].

В настоящее время актуальным является поиск альтернативного источника получения пероксидазы в промышленных условиях [23,24, 141].

В качестве промышленного объекта интерес представляет пероксидаза сои ввиду высокой термостабильности, стабильности при низких значениях pH и высокой реакционной способности. В своей статье Федулов A.JL, Спиридович Е.В. и Рахманько Е.М. представили результаты по разработке возможной методики получения пероксидазы из оболочек семени сои [25]. Предложенная методика включает в себя водную экстракцию, обработку спирто-хлоформной смесью, постадийное фракционирование сульфатом аммония и этиловым спиртом. В результате получен лиофильно высушенный порошок пероксидазы сои с активностью 276 ЕД/мг (по ABTS) и RZ 0,9 [25].

На ряду с пероксидазой сои высокой термостабильностыо обладают пероксидазы пальм, выделенные И.Ю. Сахаровым [21, 26, 141].

В диссертационной работе Алпеева Инна Сергеевна разработала метод выделения и очистки пероксидазы из кожуры клубней батата, включающий в себя экстрагирование, депигментацию, гидрофобную хроматографию на колонке с Сефарозой, ионообменную хроматографию на ДЭАЭ-тоеперле; провела сравнительный анализ пероксидаз из батата, сои и пальмы [27].

Сотрудниками института ботаники АН Казахстана разработан метод выделения пероксидазы из листьев полыни [8]. Описано получение пероксидазы чайного листа [28].

Процесс экстрагирования пероксидазы из корнеплодов редьки черной и механизм сорбции на подложках различной природы в своих работах исследует Вяткина О.В. [24, 29].

На основании проведенного анализа литературных источников и патентных технологий [30, 31, 32] составили типовую технологическую схему получения пероксидазы. Типовая технологическая схема (рисунок 1.3) получения пероксидазы из промышленного источника - корней хрена состоит из стадий измельчения, экстракции, ультрафильтрации, осаждения, гель-фильтрации, гидрофобной хроматографии, диализа и лиофилизации. Недостатками подобных технологий являются длительность процесса (от 3 до 11 суток), связанная с многостадийностыо, низкий выход фермента (менее 3 г с 1 кг сырья). Недостатком представленной схемы также является использование смол на основе Сефарозы/целлюлозы, что непрактично в крупномасштабном производстве фермента из-за низкой пропускной способности, стоимости матрицы, низкой рН-стабильности и их относительно короткого жизненного цикла, который может быть всего 20-30 производственных циклов.

тпл Измельчение и гомогенизация сырья

1

ТП.2 Экстракция

1

тп.з Ультрафилырация

4

ТП.4 Осаждение сульфатом аммония

1

ТП.5 Гель-фильтрация

*

ТИ.6 Гидрофобная хроматография на сорбентах -производных целлюлозы/сефарозы

▼

ТП.7 Геяь-фильтрация

ТП.8 Диализ

*

ТП.9 Тиофилизация

г

Готовый продукт

Рисунок 1.3 - Типовая технологическая схема выделения и очистки пероксидазы из корней хрена (т - 3-11 суток; А ~ 1200 ЕД/мг) Проведенный анализ литературных источников подтверждает актуальность выбранной темы исследования и необходимость данных по разработке технологии получения пероксидазы из альтернативного сырья в промышленных масштабах.

1.2 Получение ферментов

1.2.1 Селективные сорбенты для выделения белков

Высокоэффективные сорбенты, применяемые при получении белковых молекул, должны обладать устойчивостью при экстремальных значениях рН и к микробной контаминации; механической устойчивостью; высокой

проницаемостью гранул и доступностью сорбционных центров; объем гранул при изменении рН или ионной силы должен меняться незначительно; отсутствием вредного влияния на белки, особенно, ферменты; возможностью осуществления селективной элюции целевых компонентов и получения высококонцентрированных элюатов; легкостью регенерации и возможностью реализации многократно повторяющихся хроматографических процессов [33, 34, 35].

Сорбентами называют трехмерные сетчатые структуры, получаемые сополимеризацией мономеров, образующих цепи, и сшивающего агента (кросс-агента), образующего мостик между ними.

Одной из наиболее употребляемых является классификация сорбентов по типу сорбционных взаимодействий: молекулярные, ионообменные, специфические сорбенты (для хроматографии) и носители (сефадексы, гели на основе сефарозы, биогели и наноносители).

По пористости в сухом состоянии сорбенты классифицируют на гелевые и пористые. Гелевые сорбенты не содержат поры в сухом состоянии. При их набухании образуются каналы, размер которых зависит от количества и длины сшивающего агента. Чем больше сшивающего агента, тем более жесткий каркас, тем меньше набухаемость и размер каналов. Гелевые сорбенты с длинноцепочечным сшивающим агентом - макросетчатые [36]. Пористые сорбенты подразделяют на микропористые (с1пор менее 1,6 нм), мезопористые (поры одинакового размера) и макропористые (с1пор более 100 нм). Они содержат поры даже в сухом состоянии. При синтезе пористых сорбентов в реакционную среду вводят инертный растворитель, который после окончания реакции сополимеризации удаляют.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Серкова, Анастасия Никитична, 2015 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Андреева, В. А. Фермент пероксидаза. Участие в защитном механизме растений / В. А. Андреева.- М.: Наука, 1988. - 128 с.

2. Газарян, И. Г. Особенности структуры и механизма действия пероксидаз растений / И. Г. Газарян, Д. М. Хушпульян, В. И. Тишков // Успехи биологической химии.- М., 2006. - т. 46. - С. 303-330.

3. Серкова, А.Н. Выделение пероксидазы из растительного сырья / А.Н. Серкова, Н.В. Глазова // Научно-практическая конференция, посвященная 65-летшо факультета промышленной технологии лекарств: сборник научных трудов. - Часть I. - СПб.: Изд-во СПХФА, 2010. - С. 158-162.

4. Захарова, Г. С. Пероксидаза из корней хрена: модулирование свойств химической модификацией белковой глобулы и гема / Г. С. Захарова, И. В. Упоров, В. И. Тишков // Успехи биологической химии. - Т. 51. - 2011. - С. 37-64.

5. Рогожин, В. Пероксидаза растений. Строение, механизм действия, активный центр, использование пероксидазы / В. Рогожин. - Книга по требованию, 2010. -212 с.

6. Серкова, А.Н. Влияние ионов кальция при разработке сорбционно-хроматографического метода выделения пероксидазы из экстракта / А.Н. Серкова, Н.В. Глазова // Сорбционные и хроматографические процессы. -Воронеж: Воронежский государственный университет, кафедра аналитической химии, 2013. - Т. 13, Вып. 3. - С. 377-384.

7. Угарова, Н. Н. Структура и функции пероксидазы из хрена / Н. Н. Угарова, О. В. Лебедева//Биохимия. - 1978.-Т. 43. - Вып. 10. - С. 1731-1742.

8. Давыдова, Г. Ф. Лекарственные препараты из растительного сырья. Пероксидаза / Г. Ф. Давыдова, О. А. Ермаков, А. И. Панасенко, А. М. Тищенко // Химия растительного сырья,- 1998.- № 1.- С. 15-18.

9. Лапина, Г. П. Физико-химические и ферментативные свойства пероксидаз растительного происхождения / Г. П. Лапина, Н. С. Шарилина, М. П. Малыщик // Успехи современного естествознания. - 2007. - № 10. - С. 105-106.

10. Рогожин, В. В. Пероксидаза как компонент антиоксидантной системы живых организмов / В. В. Рогожин. — СПб.: ГИОРД, 2004. — 240 с.

11. Преснова, Г. В. Электрохимические биосенсоры на основе пероксидазы хрена / Г. В. Преснова, М. Ю. Рубцова, А. М. Егоров // Рос. хим. ж. (Ж. Рос. хим. об-ва им. Д. И. Менделеева). - 2008. - т. LII. - № 2,- С.60-65.

12. Поляков, А. Е. Пероксидазы хрена и сои для определения фенольных и эндопероксидных соединений в водных, водно-органических средах и гидрофильных ионных жидкостях: автореф. дис. на соиск. учен. степ. к. х. н.: 02.00.02 / Поляков Алексей Евгеньевич. - Москва: 2011. - 26 с.

13. Серкова, А.Н. Выделение, изучение, модификация растительных пероксидаз / А.Н. Серкова, Н.В. Глазова// Фармация. - М.: Изд-во «Русский врач», 2014.-6.-С. 18-21.

14. Стаценко, А. П. Растительные пероксидазы - маркеры химического загрязнения природных сред / А. П. Стаценко, JI. И. Тужилова, А. А. Вьюговский //Вестник ОГУ. - № 10 (92).-2008.-С. 188-191.

15. Курбанов, А. И. Антиоксидантные ферменты микроорганизмов: патогенетическая значимость и перспективы использования в медицине / А. И. Курбанов // Международный медицинский журнал. - Баку, 2008. - № 2. - С. 105109.

16. Гель алоэ Lucklife [Электронный ресурс]. - Электрон, дан. - Режим доступа: http://lucklife.umi.ru/http_lucklife umi ru laklaif internet-magazin/gelialoelucklife/.- Загл. с экрана.

17. Гель алоэ Феникс [Электронный ресурс]. - Электрон, дан. - Режим доступа: http://feniks-tugulim.nethouse.ru/products/235410.- Загл. с экрана.

18. Био Рекс / Bio Rex [Электронный ресурс]. - Электрон, дан. - Режим доступа: http://www.panacea-fito.ru/bio_rex.htm.- Загл. с экрана.

19. Неовитин - биоантиоксидантный комплекс энзимов и гликозидов [Электронный ресурс]. - Электрон. дан. - Режим доступа: http://spbparfumer.narod.ru/pages/Vita/bad.htm.- Загл. с экрана.

20. Отечественная пероксидаза: качество выше, стоимость ниже [Электронный ресурс]. - Электрон, дан. - Режим доступа: http://rcc.ru/article/otechestvennaya-регок51да2а-касЬе51уо-уу5Ье-51о1то51-Ш211е-1684.- Загл. с экрана.

21. Сахаров, И. 10. Биохимия / И. Ю. Сахаров.- М., 2004.- С. 1013-1020.

22. Орлова, М. А. Радиоэнзимология - метод исследования свойств и структуры ферментов / М. А. Орлова. - М., 2002. - С. 285.

23. Шугалей, Н. А. Поиск промышленных источников выделения растительных пероксидаз, области практического использования полученного фермента / Н. А. Шугалей, А. Б. Власова, А. Т. Федорова, А. Л. Федулов, Е. В. Спиридович // Труды БГУ. - 2010. - Т. 5, часть 2. - С. 53-62.

24. Вяткина, О. В. Проблемы выделения и очистки растительных пероксидаз / О.В. Вяткина // Ученые записки Таврического национального университета им. В.И. Вернадского. Серия «Биология, химия». - Т. 25 (64). - 2012. - № 3. - С. 271276.

25. Федулов, А. Л. Выделение пероксидазы из оболочек семени сои / А. Л. Федулов, Е. В. Спиридович, Е. М. Рахманько // Труды БГУ. - 2006. - Т.1. - С. 212-220.

26. Сахаров, И. Ю. Субстратная специфичность пероксидазы африканской масличной пальмы / И. Ю. Сахаров [и др.] // Биохимия. - 2002. - Т.67, №9. - С. 1259-1264.

27. Алпеева, И. С. Анионные пероксидазы и их применение в биоанализе: автореф. дис. на соиск. учен. степ. к. х. н.: 02.00.02 / Алпеева Инна Сергеевна. -Москва: 2007. - 28 с.

28. Пруидзе, Г. Н. Очистка и свойства пероксидазы чайного листа / Г. Н. Пруидзе, Г. 3. Григорашвили, Л. Ш. Чачуа, М. В. Тохадзе // Биохимия. - 1976. -41.-10.-С. 1819-1828.

29. Вяткина, О. В. Влияние природы подложки на механизм сорбции пероксидазы редьки черной / О. В. Вяткина // Ученые записки Таврического национального университета им. В.И. Вернадского. Серия «Биология, химия». -Т. 25 (64). - 2012. - № 4. - С. 239-247.

30. Пат. 2353652 Российская Федерация, МПК8 С 12 N 9/02. Способ получения фермента пероксидазы из корней хрена / заявители и патентообладатели Бочков Д. В., Толстикова Т. Г., Брызгалов Л. О., Хвостов М. В.. - № 2007135916/13; заявл. 27.09.07; опубл. 27.04.09, Бюл. № 12. - 11 е.: ил.

31. Пат. 2486240 Российская Федерация, МПК8 С 12 N 9/08. Способ получения пероксидазы из корней хрена / Полозников А. А., Хушпульян Д. М., Захарянц А.

A., Тишков В.И.; патентообладатель Общество с ограниченной ответственностью "Пероксо". - № 2012102779/10; заявл. 27.01.12; опубл. 27.06.13, Бюл. № 18. - 6 е.: ил.

32. Пат. 2388819 Российская Федерация, МПК8 С 12 N 9/08. Способ получения пероксидазы хрена / Суровцев В. И., Борзенков В. М., Детушев К. В.; патентообладатель Федеральное государственное учреждение науки Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии (ФГУН ГНЦ ПМБ). - № 2008125459/13; заявл. 25.06.08; опубл. 10.05.10, Бюл. № 13. - 6 е.: ил.

33. Хроматографические материалы для научных исследований: каталог / РАН, Главное управление материально-технического обеспечения. - М.: Наука, 1992.-63 с.

34. Черкасов, А. Н. Мембраны и сорбенты в биотехнологии / А. Н. Черкасов,

B. А. Пасечник. - Л.: Химия, 1991.-240 с.

35. Лейкин, Ю. А. Физико-химические основы синтеза полимерных сорбентов: учебное пособие / Ю. А. Лейкин. - М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2014. - 413 с.

36. Сакодынский, К. И. Полимерные сорбенты для молекулярной хроматографии / К. И. Сакодынский, Л. И. Панина.- М.: Наука, 1977.- С. 150-173.

37. Самсонов, Г. В. Синтез и свойства ионообменных материалов / Г. В. Самсонов, Л. В. Дмитриенко, В. С. Юрченко,- М., 1968,- С. 169-172.

38. Салдадзе, К. М. Ионообменные высокомолекулярные соединения / К. М Салдадзе, А. В. Пашков, В. С. Титов.- М.: Госхимиздат. - 1988. - 232 с.

39. Шатаева, JT. К. Карбоксильные катиониты в биологии / Л. К. Шатаева, Н. П. Кузнецова, Г. Э. Елькин. - Л.: Наука, 1979. - 229 с.

40. Шатаева, Л. К. Использование пористых карбоксильных катионитов для разделения белков / Л. К. Шатаева, Г. В. Самсонов // Хим.-фарм. журнал. - 1977. -№4. - С. 78-90.

41. Даванков, В. А. Сверхсшитые полистирольные сорбенты. Структура, свойства, применение / В. А. Даванков, М. П. Цюрупа. - Palmarium Academic Publishing, 2012.-76 с.

42. Николаев, В. Г. Гемосорбция на активированных углях / В. Г. Николаев, В. В. Стрелко. - Киев: Наук, думка, 1979. - 288 с.

43. Лопухин, Ю. М. Гемосорбция / Ю. М. Лопухин, М. Н. Молоденков. - М.: Медицина, 1985.-288 с.

44. Кокотов, Ю. А. Теоретические основы ионного обмена. Сложные ионообменные системы / Ю. А. Кокотов, П. П. Золоторев, Г. Э. Елькин. - Л.: Химия, 1986.-280 с.

45. Мухин, В. М. Активные угли России / В. М. Мухин, А. В. Тарасова, В. Н. Клушин. - М.: Металлургия, 2000. - 352 с.

46. Диксон, М. Ферменты / М. Диксон, Э. Уэбб. - М.: Изд-во иностранной литры, 1961.-728 с.

47. Плакунов, В. К. Основы энзимологии / В. К. Плакунов. - М.: Логос, 2001. -128 с.

48. Грачева, И. М. Технология ферментных препаратов / И. М. Грачева. - М.: Агропромиздат, 1987.-335с.

49. Наметкин, Н. С. Фракционирование полимеров / Н. С. Наметкин, Л. Д. Литманович. - М.: Мир, 1971. - 444 с.

50. Северин, Е. С. Биохимия: учебник для вузов / Е. С. Северин. - М.: ГЭОТАР-МЕД, 2003. - 779 с.

51. Биссвангер, X. Практическая энзимология / X. Биссвангер. - М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2011. - 328 с.

52. Квеситадзе, Г. И. Введение в биотехнологию / Г. И. Квеситадзе, А. М. Безбородов. - М.: Наука, 2002. - 284 с.

53. Самсонов, Г. В. Новые принципы ионообменной препаративной хроматографии и их применение для выделения, очистки и суперочистки антибиотиков / Г. В. Самсонов, О. А. Писарев // Прикладная химия и микробиология, 1992. -Т.28, №1. - С. 5-18.

54. Самсонов Г. В. Ионный обмен. Сорбция органических веществ / Г. В. Самсонов, Е. Б. Тростянская, Г. Э. Елькин. - JI.: Наука, 1969. - 333 с.

55. Демин, А. А. Ионообменная сорбция биологически активных веществ / А. А. Демин, И. А. Чернова, JI. К. Шатаева. - СПб.: Изд-во С.-Петерб. Ун-та, 2008. -154 с.

56. Рябчиков, Д. И. Ионообменные смолы и их применение / Д. И. Рябчиков, И. К. Цитович. - Л.: Изд-во Акад. наук СССР, 1962. - 188 с.

57. Новикова, С. А. Оптимизация процесса сорбции ДНК-азы и Цитохрома С из их смеси / С. А. Новикова, II. В. Глазова // Сорбционные и хроматографические процессы. - Воронеж, 2011. - том 11. - выпуск 6. - С. 820827.

58. Царенко, О. В. Хроматографические разделения БАВ в кинетически селективных режимах динамики сорбции / О. В. Царенко, О. А. Писарев, И. В. Кручина-Богданов, Н. В. Глазова // ЖФХ, 1999. - Т.73, № 9. - С. 750-754.

59. Царенко, О. В. Изучение равновесия и кинетики сорбции панкреатических ферментов сверхсшитыми полистирольными сорбентами Стиросорб / О. В. Царенко, О. А. Писарев, Н. В. Глазова // Тезисы Всероссийского симпозиума по химии поверхности, адсорбции и хроматографии. - Москва, 1999. - С. 189.

60. Рудометова, Н. В. Сорбционные методы выделения и очистки панкреатических ферментов: рибонуклеазы, дезоксирибонуклеазы, трипсина и химотрипсина: диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук: 03.00.23: защищена 21.09.94 / Рудометова Наталья Викторовна. - СПб., 1994. - 136 с.

61. Савельев, Е. А. Термодинамика и кинетика молекулярной сорбции ß-лактамных и тетрациклиновых антибиотиков на гидрофобные сорбенты / Е. А. Савельев, JI. Д. Лосева, А. Н. Пушков // В кн.: Препаративная масштабируемая хроматография биологически активных веществ и альтернативные методы. - Л., 1991.-С. 18-25.

62. Биотехнология [Электронный ресурс]. - Электрон, дан.- М., [1995-2013].-Режим доступа: http:/Av\v\v.biotechnolog.ru/prombt/prombt5_6.htm, свободный. -Загл. с экрана.

63. Серкова, А. Н. Использование наносистем в качестве перспективы создания новых лекарственных форм / А. Н. Серкова, Н. В. Глазова // Сб. VII междунар. науч. - практич. конфер. Наука и технологии: шаг в будущее — 2011.— Praha, Publishing House «Education and Science» s.r.o., 2011. - V.3. - С. 29-35.

64. Макаров, К. А. Иммобилизованные биопрепараты в медицине / К. А. Макаров, С. А. Кибардин. -М.: Медицина, 1980. - 126 с.

65. Иммобилизованные ферменты, методы иммобилизации [Электронный ресурс]. - Электрон, дан. - Режим доступа: http://biofile.ru/bio/16210.html. - Загл. с экрана.

66. Платэ, Н. А. Физиологически активные полимеры / II. А. Платэ, А. Е. Васильев. - М.: Химия, 1986. - 294 с.

67. Можаев, В. В. Иммобилизация ферментов как новый подход к решению функциональных проблем энзимологии / В. В. Можаев // Успехи биологической химии. - 1983. - т.24. - С. 99-134.

68. Кочетов, Г. А. Практическое руководство по энзимологии / Г. А. Кочетов. - М.: Высшая школа, 1980. - 224 с.

69. Коршак, В. В. Полимеры в процессах иммобилизации и модификации природных соединений / В. В. Коршак, М. И. Штильман. - М.: Наука, 1984. - 261 с.

70. Тривен, М. Иммобилизованные ферменты / М. Тривен. - М.: Мир, 1983. -213 с.

71. Андреева, И. II. Иммобилизация ферментов и других биологически активных веществ: учеб. пособие / И. II. Андреева, А. В. Пантюхин, Б. Б. Сысуев. - Пятигорск: Пятигорская государственная фармацевтическая академия, 2001. -340 с.

72. Солдатова, JI. С. Повышение каталитической активности и стабильности химотрипсина за счет ковалентной иммобилизации на магнитных наночастицах Fe304 / Л. С. Солдатова, О. О. Бабич // Техника и технология пищевых производств.- 2010.- №1,- С. 69-72.

73. Чубатова, С. А. Возможности оригинальной технологии микрокапсулирования биологически активных веществ / С. А. Чубатова, В. С. Тульский, С. К. Пашошин, Г. В. Кузнецова, А. С. Голубков // International Jornal on Immunorehabilitation. - 1999. -№ 12. - С. 12.

74. Каплун, А. П. Липосомы и другие наночастицы как средство доставки лекарственных веществ / А. П. Каплун, Ле Банг Шон, Ю. М. Краснопольский // Вопросы мед. химии - 1999. - № 1. - С. 42-48.

75. Васьковский, В. В. Липиды / В. В. Васьковский // Соросовский Образовательный Журнал. - 1997. - № 3,- С. 32-37.

76. Краснопольский, Ю. М. Некоторые аспекты технологии получения липосомальных форм лекарственных препаратов / Ю. М. Краснопольский, А. Е. Степанов, В. И. Швец // Хим.-Фарм. Ж. - М, 1999. - Т.ЗЗ, №10.- С. 20-23.

77. Швец, В. И. От липосом семидесятых к нанобиотехнологии XXI века / В. И. Швец, А. П. Каплун, Ю. М. Краснопольский, А. Е. Степанов, В. П. Чехонин // Российские нанотехнологии. - 2008. - том 3. - № 11-12. - С. 52-66.

78. Носенко, М. А. Совершенствование биотехнологии конструирования липосомальных лечебно-профилактических косметических средств / М. А. Носенко // Материалы семинара-презентации инновационных научно-техническихпроектов «Биотехнология - 2003». - Пущино, 2003.- С. 29-31.

79. Безруков, Д. А. Технологии получения комбинированных липосомальных препаратов доксорубицина: автореф. дис. на соискание ученой степени канд. хим. наук: 03.00.23 / Безруков Денис Алексеевич. - М., 2007. - 26 с.

80. Таран, Т. В. Биотехнология получения лекарственных и иммуногенных липосомальных композиции, используемых в лечении экспериментальных особо опасных инфекций и получении сырья для производства медицинских иммунобиологических препаратов: автореф. дис. на соиск. учен. степ, д.м.н.: 03.00.23, 03.00.07 / Таран Татьяна Викторовна. - Ставрополь, 2004. - 36 с.

81. Абелян, В. А. Циклодекстрины: Получение и применение / В. А. Абелян. — Ереван: Изд. Дом «Ван-Арьян», 2001. — 519 с.

82. Абелян, В. А. Особенности получения циклодекстринов с помощью циклодекстринглюканотрансфераз различных групп микроорганизмов / В. А. Абелян, А. М. Балаян, Л. С. Манукян // Прикладная биохимия и микробиология, 2002. — т. 38. — № 6. — С. 616-624.

83. Иванова, Л. А. Ферментные системы и технологии получения циклодекстринов / Л. А. Иванова, Н. Г. Усанов, В. Варламов // В мире науки, 2006. —№11, —С. 37-41.

84. Естественные циклодекстрины Сауашах [Электронный ресурс]. -Электрон, дан. - Режим доступа: http://www.ashland.com/Ashland/Static/ ОоситеЩ8/А81/РС_11642-RU_CavamaxSheet.pdf. - Загл. с экрана.

85. Элям Блуэ. Нативные и модифицированные циклодекстрины КЬЕРТОЗЕ®: многофункциональные вспомогательные вещества для молекулярной инкапсуляции / Элям Блуэ // Фармацевтическая отрасль. - 2011.-№ 6 (29). - С. 46^19.

86. Федорова, П. Ю. Сравнение кинетических свойств различных циклодекстринглюканотрансфераз / П. Ю. Федорова, Е. А. Гильванова, Н. Г. Усанов // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. -2011.-Т. 13, №5(3).-С. 203-206.

87. Терехова, И. В. Комплексообразование циклодекстринов с некоторыми биологически активными соединениями в водных растворах: автореф. дис. на соиск. учен. степ, д.х.н.: 02.00.04 / Терехова Ирина Владимировна. - Иваново, 2013.-37 с.

88. Соколов, В. Технологии инкапсуляции в пищевой промышленности [Электронный ресурс] / В. Соколов. - 2011. - Режим доступа: http://foodinnovation.ru/articles/3388.html.

89. Влияние 2-гидроксипропил-Р-циклодекстрина на тепловую инактивацию, денатурацию и агрегацию креатинкиназы и глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы из скелетных мышц кролика: дипломная работа / Малолеткина О.И. - Москва: Московский Государственный Университет им. М. В. Ломоносова, 2008. - 58 с.

90. Казачинская, Е. П. Молекулярное моделирования комплексообразования молекул Р-циклодекстрина и витамина К3 / Е. П. Казачинская, И. И. Баскин, П. А. Мамонов, В. Н. Матвеенко // Вестн. Моск. Ун-та. - Сер. 2. - Химия. - Т. 47. - № 4. -2006.-С. 278-283.

91. НаноДерм: организация производства линейки косметических средств на основе нанокомплексов «уроновая кислота - бета-циклодекстрин» [Электронный ресурс]. - Электрон. дан. - Режим доступа: http://www.rusnanonet.ru/products/64706/. - Загл. с экрана.

92. Грачева, И. М. Биотехнология биологически активных веществ / И. М. Грачева, Л. А. Иванова, Г. Н. Румянцева и др. — М.: НПО «Элевар», 2006. — С. 89-120.

93. Гендриксон, О. Д. Молекулярно импринтированные полимеры и их применение в биохимическом анализе / О. Д. Гендриксон, А. В. Жердев, Б. Б. Дзантиев // Успехи биологической химии. -2006. - т. 46. - С. 149-192.

94. Лисичкин, Г. В. Материалы с молекулярными отпечатками: синтез, свойства, применение / Г. В. Лисичкин, Ю. А. Крутяков // Успехи химии. - 2006. -Т.75.-№ 10.-С. 998- 1017.

95. Погорелова, С. П. Сенсоры на основе молекулярно-импринтированных полимеров: автореф. дис. на соиск. учен. степ, к.х.н.: 02.00.02 / Погорелова Светлана Петровна. - Москва, 2007. - 19 с.

96. Балаж, А. Биология опухолей, сомнения и надежды / А. Балаж. - М.: Мир, 1987.-214 с.

97. Долгоносов, А. М. Ионный обмен и ионная хроматография / А. М. Долгоносов, М. М. Сенявин, И. И. Волощик. -М.: Наука, 1993.-222 с.

98. Зубакова, Л. Б. Синтетические ионообменные материалы / Л. Б. Зубакова, А. С. Тевлина, А. Б. Даванков. - М.: Химия, 1978. - 184 с.

99. Тощевикова, А. Ю. Структура и свойства полифункциональных сорбентов для ионно-гидрофобной хроматографии биологически активных веществ / А. Ю. Тощевикова, О. А. Писарев, II. М. Ежова // Сорбционные и хроматографические процессы.-2001.-Т 1.-№5.-С. 833-837.

100. Очищенное производное циклодекстрина, клатратный комплекс очищенного производного циклодекстрина с лекарственным средством, фармацевтическая композиция [Электронный ресурс]. - Электрон, дан. - Режим доступа: И11р.7/п{ро.сош/ра1еп15_ше£11с1'пе/шес11с1пе_6/ше(11с1пе_504.8Ь1гп1. - Загл. с экрана.

101. Справочник Машковского. Лекарственные средства [Электронный ресурс].

- Электрон. дан. - Режим доступа: http://mashkovsky.ru/tiki-index.php?page:=Xлopгeкcидин. - Загл. с экрана.

102. Хлоргексидина биглюконат [Электронный ресурс]: Справочник лекарственных средств. - Электрон. дан. - Режим доступа: http://w\vлv.vidal.ru/drugs/chlorhexidine_bigluconate_13714. - Загл. с экрана.

103. Навашин, С. М. Антибиотики группы аминогликозидов / С. М. Навашин, И. П. Фомина, Ю. О. Сазыкин. - М.: Медицина, 1977. - 273 с.

104. Овчинникова, Л. К. Школа фармаколога: эффективность и безопасность аминогликозидов / Л. К. Овчинникова, Р. И. Ягудина, Е. А. Овчинникова // Российские аптеки. - 2008. - №11. - С. 24-27.

105. Практическое руководство по антиинфекционной химиотерапии / под ред. Л. С. Страчунского, Ю. Б. Белоусова, С. И. Козлова. - Смоленск: НИИАХ СГМА, 2007.-418 с.

106. Азитромицин [Электронный ресурс]: Справочник лекарственных средств.

- Электрон. дан. - Режим доступа: http://w\v\v.vidal.ru/drugs/azithromycin_20200.- Загл. с экрана.

107. Парабены в косметике [Электронный ресурс]. - Электрон, дан.- Режим доступа: http://allseason.ru/publics/single/4538/5241.- Загл. с экрана.

108. Хотимченко, Ю. С. Физико-химические свойства, физиологическая активность и применение альгинатов - полисахаридов бурых водорослей / Ю. С. Хотимченко, В. В. Ковалев, О. В. Савченко, О. Л. Зиганшина // Биология моря. -2001.-Т. 22.-№3.-С. 151-162.

109. Альгинаты в косметологии [Электронный ресурс]. - Электрон, дан.- Режим доступа: http://cosmar.com.ua/articles/1560/.- Загл. с экрана.

110. Карбопол [Электронный ресурс]. - Электрон, дан. - Режим доступа: http://cosmetic.rebion.ru/Karbopol. - Загл. с экрана.

111. Скоупс, Р. Методы очистки белков: пер. с англ. / Р. Скоупс.- М.: Мир, 1985.- С. 341-342.

112. Рабинович, В. А. Краткий химический справочник: Справ, изд. / В. А. Рабинович, 3. Я. Хавин // Под. Ред. А. А. Потехина и А. И. Ефимова.-4-e изд., стереотипное. - СПб.: Химия, 1994,- 432 с.

113. Беликов, В. Г. Фармацевтическая химия: учебн. пособие: в 2 ч. / В. Г. Беликов. — 3-е изд. — М.: МЕДпресс - информ, 2009. — 616 с.

114. Царенко, О. В. Хроматографическая очистка гидролитических ферментов из поджелудочной железы: дис. на соиск. учён. степ. канд. биол. наук: 03.00.23 / Царенко Ольга Викторовна. - СПб., 2000. - 124 с.

115. Климова, М. А. Очистка ферментов и методы исследования их каталитических свойств: учебно-методическое пособие для вузов (практикум) / М. А. Климова, А. Т. Епринцев. - Воронеж: Издательско-полиграфический центр Воронежского государственного университета, 2008. - 36 с.

116. Государственная Фармакопея Российской Федерации, XII издание, Часть 1. - Издательство: Научный центр экспертизы средств медицинского применения, 2007.-696 с.

117. Александрова, Е. Ю. Изучение пероксидазной активности в экстрактах из корневища и корней хрена и ее стабильности к различным воздействиям / Е. Ю.

Александрова, М. А. Орлова, П. J1. Нейман // Вести. Моск. Ун-та. - Сер. 2. Химия. - 2006. - Т. 47. - № 5. - С. 350-352.

118. Серкова, А. Н. Выделение, сорбционно-хроматографическая очистка и изучение свойств пероксидазы из редьки чёрной / А. Н. Серкова, Н. В. Глазова // Тезисы докладов Всероссийской научной конференции студентов и аспирантов с международным участием «Молодая фармация - потенциал будущего», Санкт-Петербург, 18-19 апреля 2012 г. Ч. III. - СПб.: Изд-во СПХФА, 2012. - С. 42-44.

119. Серкова, А. II. Выделение, сорбционная очистка и изучение свойств пероксидазы из различного сырья. Каталог XV конкурса бизнес-идей, научно-технических разработок и научно-исследовательских проектов «Молодые, дерзкие, перспективные» (Санкт-Петербург, 25 сентября 2012 г.) СПб.: Изд-во «Лема», 2012. - С. 186-187.

120. Глазова, Н. В. Технология выделения и очистки биологически активных веществ: методическое пособие к лабораторным работам для студентов 5 курса факультета промышленной технологии лекарств / Н. В. Глазова, Н. В. Котова, Е. П. Яковлева, О. В. Топкова. - в 2-х частях. Часть 1. - СПб.: Издательство СПХФА, 2006. - 48 с.

121. Пчелин, В. А. Гидрофобные взаимодействия в дисперсных системах / В. А. Пчелин. - М.: Знание, 1976. - 563 с.

122. Новикова, С. А. Кинетика сорбции цитохрома С на макропористых сульфокатионитах / С. А. Новикова, II. В. Глазова // Естественные и технические науки. - Москва, 2008. - №6(38). - С. 130-132.

123. Березин, И. В. Основы физической химии ферментативного катализа / И.

B. Березин, К. Мартинек. - М.: Высшая школа, 1977. - 280 с.

124. Гордон, К. В. Иммуноферментный анализ аминогликозидных антибиотиков: дис. на соиск. учен. степ. к. б. н.: 03.00.23 / Гордон Кира Валериановна. - Санкт - Петербург: 1998. - 128 е.: 61 00-3/136-7.

125. Серкова, А. П. Получение лекарственных субстанций природного происхождения с использованием нанотехнологии / А. Н. Серкова, Н. В. Глазова,

C. А. Новикова // Международная научно-методическая конференция

«Сандеровские чтения», посвященная памяти выдающегося отечественного учёного в области технологии лекарств Юрия Карловича Сандера, 03-04 февраля 2012 года: сборник научных трудов. - СПб.: Изд-во СПХФА, 2012.-С. 30-33.

126. Серкова, А. II. Нанотехнологии в разработке ферментных препаратов / А. Н. Серкова, Н. В. Глазова, В. Н. Иванов, Е. П. Яковлева, А. А. Шенгер // Нанотехнологии в фармации и медицине: Материалы международной научно-практической конференции (13-14 октября 2011 г., г. Харьков, Украина). - X., 2011.-С. 69-73.

127. Серкова, А. Н. Создание и изучение наноструктур, включающих пероксидазу редьки чёрной /А. Н. Серкова, Н. В. Глазова // Материалы международной науч.-практич. конф. «Фармацевтические и медицинские биотехнологии», 20-22 марта 2012 г., Москва. - М.:ЗАО «Экспо-био-химтехнологии», РХТУ им. Д.И. Менделеева, 2012. - С. 257-258.

128. Гаврилов, А. С. Фармацевтическая технология. Изготовление лекарственных препаратов / А. С. Гаврилов. - М.: ГОЭТАР- Медиа, 2010. - 512 с.

129. Семкина, О. А. Вспомогательные вещества, используемые в технологии мягких лекарственных форм / О. А. Семкина, М. А. Джавахян, Т. А. Левчук, Л. И. Гагулашвили, В. Ф. Охотникова // Химико- фармацевтический журнал. - 2005.

- №9. - С. 45-48

130. Марченко, Л. Г. Технология мягких лекарственных форм. Учебное пособие / Л. Г. Марченко, А. В. Русак, И. Е. Смехова. — СПб.: СпецЛит, 2004. — 172 с.

131. Veitch, N. С. Horseradish peroxidase: a modern view of a classic enzyme / N. C. Veitch // Phytochemistry. - 2004. - 65. - P. 249-259.

132. Regalado, С. Biotechnological applications of peroxidases / C. Regalado, В. E. García-Almendárez, M. A. Duarte-Vázquez // Phytochem. Rev. - 2004. - Vol. 3, № 12. - P. 243-256.

133. Howes, Barry D. The Critical Role of the Proximal Calcium Ion in the Structural Properties of Horseradish Peroxidase / Barry D. Howes, Alessandro Feis, Laura Raimondi, Chiara Indiani, Giulietta Smulevich // The Journal of Biological Chemistry.

- 2001. - Vol. 276, No. 44. - P. 40704-40711.

134. Wclinder, К. G. Superfamily of plant, fungal and bacterial peroxidases / K. G. Welinder // Curr. Opin. Structural Biol. - Volume 2, Issue 3. - 1992. - P. 388-393.

135. Gazaryan, I. G. // Recent Research Development in Biophysical Chemistry. -2000,- 1.-P. 73.

136. M. A. Orlova, O. A. Gribkov, I. G. Gazaryan, A. V. Dubrovsky, V. A. Egorov, N. N. Troshina // Appl. Biochem. Biotechnol. - 2000. - 88. - P. 321.

137. §i§ecioglu, Melda Purification and characterization of peroxidase from Turkish black radish (Raphanus sativus L.) / Melda $i§ecioglu, ilhami Giilfin, Murat £ankaya, Ali Atasever, M. Hilal §ehitoglu, Habibe Budak Kaya and Hasan Özdemir // Journal of Medicinal Plants Research.- Vol. 4(12). - 18 June, 2010. - pp. 1187-1196.

138. The optimization of the extraction and purification of horseradish peroxidase from horseradish roots. Electron version of dissertation. Almero Barnard. Stellenbosch University [Электронный ресурс]. - September 2012. - Режим доступа: http://scholar.sun.ac.za/bitstream/handle/10019.1/71784/barnard_optimization_2012.p df.íxt?sequence=3.- Загл. с экрана.

139. Horseradish Peroxidase [Электронный ресурс]. - Электрон, дан. - Режим доступа: http://vvww.bbisolutions.com/support/featured-products/horseradish-peroxidase/.- Загл. с экрана.

140. Horseradish Peroxidase [Электронный ресурс]. - Электрон, дан. - Режим доступа: http://www.sigmaaldrich.com/life-science/metabolomics/enzyme-explorer/analytical-enzymes/peroxidase-enzymes.- Загл. с экрана.

141. Sakharov, I. Yu. Peroxidase from leaves of royal palm tree Roystonea regia: purification and some properties/ I. Yu. Sakharov [et al.] // Plant Science. - 2001. -Vol. 161, №5.-P. 853-860.

142. Guerreiro, Antonio. Influence of Surface-Imprinted Nanoparticles on Trypsin Activity / Antonio Guerreiro, Alessandro Poma, Kai Karim, Ewa Moczko, Jessica Takarada, Isabel Perez de Vargas-Sansalvador, Nicholas Turner, Elena Piletska, Cristiana Schmidt de Magalhäes, Natalia Glazova, Anastasia Serkova, Aleksandra Omelianova and Sergey Piletsky // Advanced healthcare materials, Germany, 2014. -P. 11-15.-DOI: 10.1002/adhm.201300634.

143. Paul, А. В. Bioscparations: Downstream processing for biotechnology / A. B. Paul, E. L. Cussler. -N.Y. etc.: Wiley and Sons, 1988. - XVI. - 368 p.

144. Atkinson, B. Biochemical Engineering and Biotechnology Handbook / B. Atkinson, F. Mavituna. - UK.: Macmilan Publishes Ltd., 1991. - 1271 p.

145. Eric S. Allen Partial Purification and Characterization of Peroxidase / Eric S. Allen. - U.S.A. - Unpublished Results. - Vol. 1, No. 4. - 2003.

146. Dennison, C. A Guide to Protein Isolation / C. Dennison. - Kluwer Academic Publishers, 2002. — 195 p.

147. Shayne, Cox Gad Handbook of Pharmaceutical Biotechnology / Cox Gad Shayne. - John Wiley & Sons, Inc., 2007. — 1659 p.

148. Garcia-Padilla, Sandra Immunoaffinity chromatography scheme for plant peroxidase purification / Sandra Garcia-Padilla, M. A. Duarte Vazques, В. E. Garsia-Almendarez, C. Regalado // EJEAFChe, 2008. - 7 (7). - P. 3134-3145.

149. Aranyl, P. Sorption equilibria between proteins and cation exchengers / P. Aranyl, B. Laszlo // J. Chromatogr., 1974. - V.89. - P. 239-250.

150. Ruckenstein, E. Sorption by solids with bidisperse pore structures / E. Ruckenstein, A. S. Vaidyanathan, G. R. Youngquist // Chem.Eng.Sci. - 1997. - V. 26. - № 9. - P. 1305-1318.

151. Shaheen, S. M. Liposome as a carrier for advanced drug delivery / S. M. Shaheen, F. R. Shakil Ahmed, M. N. Hossen, M. Ahmed, M. S. Amran, M. A. UlIslam // Рак J Biol Sci. - 2006. - 9(6). - P. 1181-1191.

152. Himanshu, A. Liposomes as drug carriers / A. Himanshu, P. Sitasharan, A. K. Singhai // IJPLS. - 2011. - 2(7). - P. 945-951.

153. Kataria, S. Stealth liposomes: a review / S. Kataria, P. Sandhu, A. Bilandi, M. Akanksha, B. Kapoor, G. L. Seth, S. D. Bihani // IJRAP. - 2011. - 2(5). - P. 15341538.

154. Mozafari, M. R. Liposomes: an overview of manufacturing techniques / M. R. Mozafari // Cell Mol Biol Lett. - 2005. - 10(4). - P. 711-719.

155. Abolfazl Akbarzadeh Liposome: classification, preparation, and applications [Электронный ресурс] / Abolfazl Akbarzadeh, Rogaie Rezaei-Sadabady, Soodabeh

Davaran, Sang Woo Joo, Nosratollah Zarghami,Younes Hanifehpour, Mohammad Samiei, Mohammad Kouhi, Kazem Ncjati-Koshki // Nanoscalc Research Letters. -2013. - 8:102.-Режим доступа: http://w\v\v.nanoscalereslett.com/content/8/l/102.

156. Glycospheres. Delivery System Protection and Stability of Actives [Электронный ресурс]. - Technical Literature ref Gs-001. - 2014. - Режим доступа: http://www.koboproductsinc.com/Downloads/Kobo-Glycospheres.pdf. - Загл. с экрана.

157. Zia, V. Effect of cyclodextrin charge on complexation of neutral and charged substrates: comparison of (SBE)7M-P-CD to HP-P-CD / V. Zia, R. A. Rajewski, V. J. Stella // Pharm. Res. - 18. - 2001. - P. 667 - 673.

158. Sergeyeva, T. A. Molecularly imprinted polymers as synthetic mimics of biorteceptors. 1. General principles of molecular imprinting / T. A. Sergeyeva // Biopolymers and cell. - 2009. - vol. 25. - N 4. - P. 253-265.

159. Kryscio, D. R. Critical review and perspective of macromolecularly imprinted polymers / D. R. Kryscio, N. A. Peppas // Acta Biomaterialia -2012.-8 (2). - P. 461473.

160. Verheyen, E. Challenges for the effective molecular imptinting of proteins / E. Verheyen, J. P. Schillemans, M. van Wijk, M.-A. Demeniex, W. E. Hennink, C. F. van Nostrum // Biomaterials. - 2011. - 32 (11). - P. 3008-3020.

161. Hoshino, Y. Peptide imprinted polymer nanoparticles: A plastic antibody / Y. Hoshino, T. Kodama, Y. Okahata, K. J. Shea // J. Am. Chem. Soc. - 2008. - 130. - P. 15242-15243.

162. Castilho, T. J. Amperometric biosensor based on horseradish peroxidase for biogenic amine determinations in biological samples / T. J. Castilho, M. Pilar, T. Sotomayor, L. T. Kubota // J. Pharm. and Biomed. Anal. - 2005. - Vol. 37. - № 4. - P. 785-791.

163. Purolite [Электронный ресурс]. - Электрон, дан. - Режим доступа: http://www.purolite.com/RelId/33637/ISvars/default/Home.htm.- Загл. с экрана.

164. Poma, A. Automatic Synthesis of Molecularly Imprinted Polymer Nanoparticles - "Plastic Antibodies" / A. Poma, A. Guerreiro, M. J. Whitcombe, E. V. Piletska, A. P.

F. Turner, S. A. Piletsky// Advanced Functional Materials. -2013. - 23 (4). - online.

165. Vlatakis, G. Drug assay using antibody mimics made by molecular imprinting /

G. Vlatakis, L. I. Andersson, R. Muller, K. Mosbach // Nature. - 1993. - 361. - P. 645-647.

166. Poma, A. Advances in the manufacture of MIP nanoparticles / A. Poma, A. P. F. Turner, S. A. Piletsky // Trends in Biotechnology. - 2010. - 28. - P. 629-637.

167. Haupt, K. Molecularly imprinted polymers: the next generation / K. Haupt // Anal. Chem. -2003. -75. - P. 376A-383A.

168. Wulff, G. Soluble Single-Molecule Nanogels of Controlled Structure as a Matrix for Efficient Artificial Enzymes / G. Wulff, Byong-Oh Chong, U. Kolb // Angewandte Chemie. International Edition. -2006. -45. - P. 2955-2958.

169. Isoherranen, N. Determination of gentamicins Cb Cia, and C2 in plasma and urine by HPLC / N. Isoherranen, S. Soback // Clinical Chemistry. - 2000. - 46:6. - P. 837-842.

170. Sartorius [Электронный ресурс]. - Электрон, дан. - Режим доступа: http://www.sartorius.ru/ru/produkty/laboratorija/ultrafiltracija/tangencialnyeperetochny e-koncentratory/. — Загл. с экрана.

171. Assay Procedure (Ref. No. FGAP026) [Электронный ресурс]. - Электрон, дан,- Режим доступа: http://www.faizyme.com/assaperp.htm.- Загл. с экрана.

172. Serkova, А. N. Development of gel with black radish peroxidase / A. N. Serkova, N. V. Glazova // Obzory po kliniceskoi farmacologii I lekarstvennoi terapii. The 18th international congress Phytopharm 2014, Saint-Petersburg, Russia, 3-5 July 2014. - SPb.: Publishing company "The Publishing LTD. N-L", 2014. - 12. - C. 5858.