Трансформация цианопиридинов свободными и иммобилизованными клетками нитрилутилизирующих бактерий тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.03, кандидат наук Васильев, Дмитрий Михайлович

• Васильев, Дмитрий Михайлович
• кандидат наук
• 2014

Оглавление диссертации кандидат наук Васильев, Дмитрий Михайлович

ОГЛАВЛЕНИЕ

Обзор литературы

Глава 1 Трансформация ароматических нитрилов ферментативными системами микроорганизмов

1.1 .Метаболические пути конверсии нитрилов

1.2 Ферменты гидролиза нитрилов у микроорганизмов

1.3 Практическая значимость ароматических карбоновых кислот

1.4. Способы получения карбоновых кислот - производных ароматических нитрилов

1.4.1 Химический синтез ароматических карбоновых кислот из нитрилов

1.4.2 Биокаталитический синтез ароматических карбоновых кислот из

нитрилов

1.5 Гетерогенные биокатализаторы. Способы иммобилизации клеток микроорганизмов

1.5.1 Связывание клеток микроорганизмов на поверхности нерастворимого носителя

1.5.2 Включение клеток микроорганизмов в структуру полимерного носителя

1.5.3 Иммобилизация клеток микроорганизмов с использованием

мембранных технологий

Экспериментальная часть

Глава 2. Объекты и методы исследования

2.1. Бактериальные штаммы

2.2. Выделение и идентификация нитрилутилизирующих бактерий

2.3. Среды культивирования

2.4. Условия культивирования и определение ростовых характеристик

2.5. Определение активности нитригидратазы, амидазы и нитрилазы

2.6. Иммобилизация

2.7. Определение величины адсорбции субстратов и продуктов реакции трансформации ароматических нитрилов

2.8. Выделение ДНК и полимеразная цепная реакция

2.10. Секвенирование ДНК

2.11. Сравнительный анализ последовательностей ДНК

2.12. Определение параметров, характеризующих процессы роста бактериальных штаммов

2.13. Статистическая обработка

Глава 3. Биоразнообразие цианопиридин - утилизирующих бактерий активного ила и осадков биологических очистных сооружений

3.1. Видовое разнообразие грамотрицательных цианопиридин -утилизирующих бактерий активного ила и осадков БОС

3.2. Поиск генов, кодирующих нитрилгидролизующие ферменты

3.3 Активность ферментов метаболизма нитрилов штаммов, выделенных из активного ила и осадков БОС г. Перми

3.4 Оптимизация условий культивирования новых штаммов

нитрилутилизирующих бактерий

Глава 4. Трансформация цианопиридинов нитрилутилизирующими бактериями

4.1. Трансформация 3-цианопиридина свободными и иммобилизованными

клетками нитрилутилизирующих бактерий

4.1.1 .Трансформация 3-цианопиридина свободными клетками R. ruber gtl

4.1.2. Скрининг носителей для иммобилизации клеток R. ruber gtl с целью использования в гетерогенном биокатализе ароматических нитрилов

4.1.3. Синтез концентрированного раствора никотинамида свободными и иммобилизованными клетками R. ruber gtl

4.1.4.Получение концентрированного раствора никотинамида при помощи клеток Rhodococcus sp. АО

4.2. Трансформация 2-цианопиридина свободными и иммобилизованными клетками R. ruber gtl и P. fluorescens С2

4.3. Трансформация 4-цианопиридина свободными и иммобилизованными клетками R. ruber gtl и P. fluor escens С2

4.3.1. Совместная конверсия 4-цианопиридина клетками R. ruber gtl, содержащими нитрилгидратазу, и R. erythropolis 11-2, обладающими

амидазной активностью

Заключение

Выводы

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Трансформация цианопиридинов свободными и иммобилизованными клетками нитрилутилизирующих бактерий»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

В настоящее время большое внимание уделяется разработке и внедрению биотехнологических методов синтеза разнообразных химических соединений. Способность ферментов трансформировать органические вещества в более мягких по сравнению с химическими процессами условиях (невысокие температура и давление) позволяет выделить биокаталитические технологии в число приоритетных направлений [69, 44, 39]. В биотехнологических производствах чаще всего используют целые микробные клетки, т.к. в этом случае не требуется проведение дорогостоящего процесса выделения и очистки фермента [38].

Цианопиридины - это ароматические нитрилы, в составе которых цианогруппа связана с пиридиновым кольцом. В результате гидролиза цианопиридинов образуются пиридинзамещенные амиды и карбоновые кислоты, которые являются витаминами, предшественниками фармацевтических препаратов и различных химических соединений.

Витамины группы РР (никотинамид и никотиновая кислота) являются необходимым элементом питания и распространенным лекарственным средством. Изоникотиновая кислота - промежуточный продукт в синтезе ряда противотуберкулезных препаратов группы гидразида изоникотиновой кислоты (изониазид, фтивазид, метазид и др.), антидепрессантов - ингибиторов моноаминооксидазы, хинуклидиновых лекарственных средств (фенкарол, оксилидин, ацеклидин); пиколиновая кислота - предшественник 6-метилпиколиновой кислоты, промежуточного продукта синтеза димеколина [13].

Основным природным источником пиридиновых соединений являются продукты коксования каменного угля. В химико-фармацевтическом производстве (З-пиколиновую фракцию (предшественник никотинамида и никотиновой кислоты), содержащуюся в коксовом газе, подвергают конденсации в жестких условиях под давлением с формалином. Присутствующую в ней у-пиколиновую

фракцию (предшественник изоникотиновой кислоты) отделяют формалином с последующей отгонкой и окислением азотной кислотой [29]. Также возможно прямое окисление ß-пиколина кислородом воздуха на ванадий-титановом катализаторе в температурном диапазоне 250-480°С, при этом в настоящее время чаще используют синтетический ß-пиколин [50, 30]. Известен также химический гидролиз цианопиридинов, который инициируется повышенной температурой и характеризуется неконтролируемой экзотермичностью [29,36]. Кроме того, никотиновую кислоту получают химическим синтезом, включающим стадию окисления 2-метил-5-этилпиридина, или гидролизом 3-цианопиридина при высоких температурах (330°С) и давлении (290 атм.) [41]. Биологический способ получения ароматических амидов и карбоновых кислот из соответствующих нитрилов, основанный на ферментативном гидролизе, выгодно отличается от химического мягкими условиями проведения процесса, экологической безопасностью и высокой степенью конверсии.

Ферментативный гидролиз цианопиридинов до соответствующих амидов и карбоновых кислот осуществляется ферментами нитрилгидратазно-амидазной и нитрилазной систем микроорганизмов. Способность к трансформации ароматических нитрилов встречается как у представителей родов бактерий Rhodococcus, Nocardia, Arthrobacter, Agrobacterium, Microbacterium, Alcaligenes, Comamonas, Klebsiella, Bacillus, Pseudomonas, Acinetobacter [41,72,88,13], так и среди грибов родов Fusarium, Giberella, Aspergillus, Pinicillum, Talaromyces и др. [50,73]. Известны биотехнологические процессы, основанные на гидролизе алифатических нитрилов. Так, компанией «Биоамид» (г. Саратов, Россия) был внедрен процесс, заключающийся в биокаталитическом производстве акрилата аммония из нитрила акриловой кислоты штаммом Alcaligenes denitrificans С-32 -продуцентом нитрил азы (КФ 3.5.5.1) [37]. Крупнотоннажное производство акриламида основано на гидратации акрилонитрила клетками штамма R. rhodochrous J1 (Япония) [45] и штамма Rhodococcus rhodochrous М8 (Россия) [2], обладающими высокой нитрилгидратазной активностью. Промышленно

значимый штамм Я. гксхЛоскгот Л также применяется в биокаталитическом производстве никотинамида, тогда как в научной литературе не содержится сведений о биокаталитическом синтезе изоникотиновой и пиколиновой кислот с выходом на промышленный уровень.

Использование иммобилизованных нерастущих каталитически активных клеток бактерий обеспечивает возможность перехода к гетерогенному биотехнологическому процессу. Преимущество гетерогенного биокатализа заключается в стабилизации активности ферментов, упрощении технологической схемы синтеза, более легком отделении и очистке образующихся продуктов, а также в возможности многократного или непрерывного использования биокатализатора в колоночном биореакторе, что позволит удешевить производство и снизить количество отходов. В связи с этим остается актуальным как поиск и изучение биологических свойств новых штаммов бактерий, осуществляющих трансформацию цианопиридинов, так и разработка гетерогенного процесса получения коммерчески значимых пиридинзамещенных амидов и карбоновых кислот.

Состояние вопроса

В последние десятилетия наблюдается неуклонное возрастание интереса к изучению свойств нитрилутилизирующих бактерий, что связано с их успешным применением в промышленных процессах получения акриламида и акрилатов, а также с большим потенциалом использования ферментативных систем этих микроорганизмов для трансформации нитрильных соединений в соответствующие амиды и карбоновые кислоты с высокой степенью хемо-, регио-и энантиоселективности [9].

Конверсия ароматических нитрилов в соответствующие амиды и карбоновые кислоты представляет большой практический интерес. Никотинамид и никотиновая кислота, образующиеся при конверсии 3-цианопиридина, входят в состав витамина РР, а амиды и карбоновые кислоты, образующиеся при

гидролизе 2- и 4-цианопиридина, являются промежуточными соединениями в процессах получения ряда фармацевтических препаратов.

Нитрильные соединения широко распространены в природе, главным образом, присутствуют в растениях в виде цианогликозидов, а также цианолипидов, цианоалкалоидов, рицина, фенилацетонитрила и др. Более 2000 видов растений накапливают цианогликозиды в семенах, корнях и листьях, а также секретируют нитрильные метаболиты в виде основного компонента экссудата ризосферы корней. Вероятно, этот процесс влияет на эволюцию и распространение микроорганизмов, способных к ассимиляции нитрилов [84]. Ряд работ посвящен биологическому разнообразию нитрилутилизирующих бактерий почвенной среды [10,3,23]. Имеющиеся сведения о распространенности нитрилутилизирующих бактерий в природе не затрагивают такую важную часть водной экосистемы, образующуюся на стыке хозяйственной деятельности человека и природной среды, как аэробный активный ил, который, как известно, является резервуаром штаммов микроорганизмов с большим биодеградативным потенциалом.

Микроорганизмы, утилизирующие нитрилы, были обнаружены среди представителей разных систематических групп, в частности, способность к гидролизу ароматических нитрилов встречается у представителей родов актино- и протеобактерий Rhodococcus, Nocardia, Agrobacterium, Microbacterium, Arthrobacter, Alcaligenes, Comamonas, Klebsiella, Bacillus, Pseudomonas, Acinetobacter и др. [41, 13] , а также грибов Fusarium, Aspergillus, Giberella, Pinicillum [73].

Трансформация нитрилов микроорганизмами может происходить двумя различными ферментативными путями: 1) одностадийный гидролиз нитрилов до соответствующих карбоновых кислот и аммония с помощью фермента нитрилазы (КФ 3.5.5.1); 2) двустадийный катаболизм нитрилов, заключающийся в том, что нитрилы гидратируются до амидов нитрилгидратазой (КФ 4.2.1.84) и затем трансформируются до карбоновых кислот и аммония амидазой (КФ 3.5.1.4) [76].

На данный момент выделено большое количество штаммов бактерий, обладающих способностью к трансформации ароматических нитрилов и имеющих высокую специфичность к данным субстратам. Исследованы процессы трансформации 3-цианопиридина. В 1988 году был впервые исследован штамм R. rhodochrous J1, содержащий нитрилгидратазу и нитрилазу [85, 87]. М. Cantarella с соавторами опубликовали цикл работ, посвященных трансформации 3-цанопиридина при помощи нитрилутилизирующих ферментов клеток Microbacterium imperiale CBS 498-74 [55, 89, 43]. В 2006 г. S. Prasad с соавторами показали возможность конверсии 3-цианопиридина с помощью покоящихся клеток R. rhodochrous РА-34, содержащих нитрилгидратазу [94]. В 2006 г. N.N. Sharma и др. показали возможность получения никотиновой кислоты путем конверсии 3-цианопиридина нитрилазой из Nocardia globerula NHB-2 в одну стадию без образования никотинамида [89]. В 1999 г A. Qadreyah и др. показали возможность трансформации 3-цианопиридина до никотиновой кислоты термостабильной нитрилазой клеток Bacillus pallidus Dac521 [41].

Встречаются данные о конверсии 4-цианопиридинов. Так, в 2009 г М. Cantarella с соавторами изучили возможность получения изоникотинамида и изоникотиновой кислоты при биотрансформации 4-цианопиридина с помощью нитрилгидролизующих ферментов из Aspergillus niger К10 и Fusarium solani Ol [62].

В 2012 году N.N. Sharma с соавторами показали возможность получения изоникотиновой кислоты путем гидролиза 4-цианопиридина нитрилазой N. globerula NHB-2 [100].

Также М. Cantarella изучены процессы конверсии 3- и 4- цианопиридина в мембранном реакторе. Для проведения многостадийных режимов конверсии, применялись каскадные схемы с применением данных реакторов [62, 55, 43, 89].

Известны работы по трансформации цианопиридинов иммобилизованными клетками бактерий, причем в подавляющем большинстве случаев использован метод включения в структуру гелей.

Проведена трансформация 3-цианопиридина иммобилизованными клетками бактерий R. equi A4 в структуре сополимера поливинилового спирта и полиэтиленгликоля [52]. Также была изучена возможность трансформации бензонитрила инкапсулированными в альгинате клетками R. rhodochrous [105]. В 2006 году О. Kaplan с соавторами показали возможность гидролиза 3- и 4-цианопиридина при помощи иммобилизованной нитрилазы гриба А. niger К10 [96]. Также изучена трансформация 4-цианопиридина при помощи целых клеток штамма N. globerula NHB-2, включенных в структура агара [50].

Тем не менее, практически не содержится сведений о разработке гетерогенного биокатализатора гидролиза цианопиридинов, основанного на адсорбционно иммобилизованных клетках бактерий, хотя адгезия является естественным процессом, не оказывающим отрицательного влияния на жизнеспособность и ферментативную активность клеток.

Цель настоящего исследования - изучение процесса трансформации цианопиридинов свободными и адгезированными клетками нитрилгидролизующих бактерий и оценка биотехнологического потенциала грамотрицательных цианопиридин-утилизирующих бактерий активного ила биологических очистных сооружений.

Основные задачи исследования:

1) Из активного ила биологических очистных сооружений (БОС) г. Перми выделить и идентифицировать микроорганизмы, способные метаболизировать цианопиридины.

2) Провести ПЦР-анализ и секвенирование генов ферментов метаболизма нитрилов (амидаз, нитрилаз).

3) Оптимизировать среды и условия культивирования выделенных изолятов, проявляющих наибольшую нитрилгидролизующую активность.

4) Изучить динамику трансформации ароматических нитрилов свободными и адгезированными клетками родококков и псевдомонад.

5) Провести скрининг носителей для адсорбционной иммобилизации цианопиридин-трансформирующих бактерий с целью создания эффективного гетерогенного биокатализатора гидролиза ароматических нитрилов.

Научная новизна.

Впервые изучено биоразнообразие нитрилутилизирующих

грамотрицательных бактерий активного ила и осадков биологических очистных сооружений. На основании параметров, характеризующих процессы роста, оптимизирована среда культивирования наиболее активного изолята A. faecal is. Секвенированы гены нитрилаз изолятов грамотрицательных бактерий, способных к утилизации цианопиридинов. Оптимизированы условия реакции трансформации цианопиридинов штаммами родококков и псевдомонад, обладающими высокой нитрилгидролизующей активностью. Проведена совместная трансформация 4-цианопиридина до изоникотиновой кислоты разными видами родококков, проявляющими нитрилгидратазную и амидазную активности. Выявлены основные особенности носителей для адсорбционной иммобилизации клеток, позволяющие получить гетерогенный биокатализатор для эффективного гидролиза ароматических нитрилов.

Теоретическое и практическое значение работы.

Полученные экспериментальные данные расширяют представления о процессах трансформации цианопиридинов у бактерий. Изучено биоразнообразие грамотрицательных бактерий активного ила и осадков БОС, использующих цианопиридины как единственный источник углерода и азота. Секвенированы гены нитрилаз новых штаммов нитрилутилизирующих бактерий, выделенных из активного ила и осадков БОС. Проведено их сравнение с ранее известными гомологичными генами, на основании этого сравнения выделены гены нитрилаз двух типов. Обоснована предпочтительность использования неактивированных носителей для создания гетерогенных биокатализаторов гидролиза ароматических нитрилов.

Показана возможность получения никотинамида, никотиновой,

изоникотиновой и пиколиновой кислот при конверсии соответствующих цианопиридинов целыми клетками родококков и псевдомонад, обладающими нитрилгидролизующей активностью. Получены гетерогенные биокатализаторы гидролиза цианопиридинов на основе клеток R. ruber g tl и P. fluorescens C2, адгезированных на неактивированных носителях. Оптимизирована среда культивирования наиболее активного изолята A. faecalis, выделенного из активного ила БОС, с целью дальнейшего использования в качестве биокатализатора гидролиза ароматических амидов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Грамотрицательные бактерии активного ила и осадков БОС, выделенные на 3-цианопиридине как единственном источнике углерода и азота, содержат гены нитрилаз двух типов и обладают амидазной активностью по отношению к ароматическим амидам.

2. Оптимальной средой культивирования выделенного из проб активного ила изолята A. faecalis является синтетическая минеральная среда с ацетамидом в концентрации 5,9 г/л как единственным источником углерода и азота. При этом наблюдается максимальный урожай, равный 1,56 мг сухих клеток/мл и экономический коэффициент использования субстрата 26,54%.

3. Наиболее эффективный гидролиз цианопиридинов осуществляется свободными и адгезированными клетками родококков и псевдомонад при концентрации субстрата 200 мМ. В качестве носителей для создания гетерогенного биокатализатора гидролиза ароматических нитрилов предпочтительно использование неактивированных адсорбентов.

Апробация работы и публикации

Основные результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз Россия 2011» (Воронеж. 2011), 1-ой Всероссийской с международным участием школе-конференции молодых учёных «Современные проблемы микробиологии, иммунологии и биотехнологии» (Пермь, 2011),

Международной научной Интернет - конференции: "Биотехнология. Взгляд в будущее" (Казань, 2012), Всероссийском конкурсе научно-исследовательских работ студентов и аспирантов в области биологических наук (Ульяновск, 2012), Международной конференции «Биология - наука XXI века» (Москва, 2012), VIII Молодежной школе-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва. 2012), V Всероссийском с международным участием медико-биологическом Конгрессе "Симбиоз-Россия 2012" (Тверь, 2012), VI Всероссийском с международным участием Конгрессе молодых учёных-биологов «Симбиоз-Россия 2013» (Иркутск, 2013), V Конгрессе европейских микробиологов «FEMS 2013» (Лейпциг, 2013).

По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, в том числе 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ, и 8 тезисов.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 111 страницах машинописного текста, содержит 25 рисунков и 9 таблиц, состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов, двух глав результатов собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы, включающего 108 наименований, в том числе 39 на русском и 69 на английском языках.

Связь работы с научными программами и собственный вклад автора.

Работа выполнена на базе кафедры микробиологии и иммунологии биологического факультета Пермского государственного национального исследовательского университета и Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом НИР Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН и является частью исследований, проводимых по теме «Биохимические и генетические системы трансформации органических соединений у бактерий, перспективных для биотехнологий» (номер госрегистрации 0120.0406511), а также в рамках Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология».

Научные положения и выводы диссертации полностью базируются на результатах собственных исследований автора.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1 ТРАНСФОРМАЦИЯ АРОМАТИЧЕСКИХ НИТРИЛОВ ФЕРМЕНТАТИВНЫМИ СИСТЕМАМИ МИКРООРГАНИЗМОВ.

1.1.Метаболические пути конверсии нитрилов

Способность к ферментативной трансформации нитрилов встречается у представителей различных царств живой природы: трех семейств растений {Gramineae, Cruciferae, Musaceae, Candida [106, 91, 81]), некоторых грибов (Fusarium [63, 108, 97, 98, 51] , Aspergillus [69, 51], Pénicillium) и чаще всего у прокариот (Acinetobacter, Corynebacterium, Arthrobacter, Pseudomonas, Klebsiella, Nocardia, Rhodococcus и др.) [91, 7 4, 58 ]. Часто бактерии могут использовать нитрилы в качестве единственного источника, как азота, так и углерода [47, 54].

В настоящее время известно несколько путей, отвечающих за метаболизм нитрилов. Метаболизм нитрилов осуществляется при помощи ферментов, относящихся к трем группам: гидролазы (нитрилгидратаза, амидаза, нитрилаза), оксидазы (оксигеназа) [70] и редуктазы (нитрогеназа) [47, 82].

В растениях ферменты метаболизма нитрилов участвуют в трансформациях питательных веществ, в особенности глюкозинолатов, а также в синтезе индол уксусной кислоты. У некоторых высших растений ферменты нитрильного метаболизма участвуют в детоксикации цианидов. Они образуют комплекс, который контролирует образование и деградацию цианогенных гликозидов и смежных с ними соединений. Альдоксимы являются основными промежуточными соединениями, из которых средствами нитрилутилизирующего комплекса (альдоксимдегидратазы) [74] образуются нитрилы, которые затем подвергаются дальнейшей трансформации. В настоящее время роль ферментов нитрильного метаболизма бактерий еще не определена в полной мере [47].

Дальнейшая утилизация нитрилов может идти по трем направлениям:

1. При помощи фермента нитрогеназы нитрилы деградируются до соответствующих углеводородов и аммиака [82].

2. При помощи оксигиназы нитрилы переходят в циангидрины, которые далее трансформируются в альдегиды и гидроцианиды. Далее гидроцианиды переводятся при помощи цианазы в углекислый газ и аммиак, а при помощи цианидгидратазы - в формамид. Цианиддигидратаза переводит гидроцианиды в муравьиную кислоту и аммиак [70].

3. Нитрилы посредством нитрилгидратазно-амидазной / нитрилазной системы трансформируются в соответствующие амиды и карбоновые кислоты [47, 44, 69, 83].

Первый тип утилизации нитрилов характерен для азотфиксирующих организмов, второй встречается у растений и некоторых насекомых, но почти не известен у бактерий. Третий тип наиболее характерен для микроорганизмов и наиболее приемлем в биотехнологическом плане [47].

1.2 Ферменты гидролиза нитрилов у микроорганизмов.

Как было сказано выше, для бактерий характерен гидролиз нитрилов с использованием трех ферментов: нитрилгидратазы (КФ 4.2.1.84), амидазы (КФ 3.5.1.4) и нитрилазы (КФ 3.5.5.1). Эти ферменты объединяются в два пути гиролиза нитрилов: двустадийный и одностадийный (Рис.1) [9, 95].

Первый характеризуется последовательным действием двух ферментов: нитрилгидратазы и амидазы. Нитрилгидратаза гидратирует нитрил до амида, амидаза гидролизует амид до соответствующей карбоновой кислоты и аммония.

Второй путь протекает под действием фермента нитрилазы. Последняя присоединяет к нитрилу две молекулы воды, трансформируя нитрил до соответствующей кислоты и аммония [9, 83].

2-цианопиридин пиколинамид пиколиновая к-та

2-цианопиридин пиколиновая к-та

Рис. 1. Бактериальный гидролиз цианопиридинов.

Нитрилгидратаза является одним из ключевых ферментов метаболизма нитрилов, который наиболее часто встречается у бактерий. Данный фермент катализирует реакцию гидролиза нитрила до соответствующего амида. Впервые нитрилгидратаза была обнаружена в 1980 г. в клетках бактерий К гкос1ос}1гош 1-1. Наиболее распространены нитрилгидратазы у прокариотических организмов, в особенности у бактерий рода Ююс1ососси8 [9, 95].

Нитрилгидратазы относятся к группе металлоферментов, т.е. содержат в активном центре какой-либо ион металла. В основном встречаются нитрилгидратазы с негемовым железом (Ре ) или кобальтом (Со ) в активном центре. В зависимости от иона металла, входящего в активный центр, нитрилгидратазы относят к типу железосодержащих (Бе - тип), или к типу кобальтсодержащих нитрилаз (Со - тип). Несмотря на различия в активности и субстратной специфичности, нитрилгидратазы имеют большое сходство в строении активных центров. Нитрилгидратазы состоят из а и (3 субъединиц с молекулярными массами около 22 Ша и 28 Ша соответственно. Димеры часто могут образовывать тетромеры и олигомеры.

Известны случаи, когда в активных центрах нитрилгидратаз содержатся другие металлы - Ъп или Си, но их роль в утилизации нитрилов не доказана [9].

На сегодняшний день нитрилгидратазы представляют серьезный интерес для биотехнологии. Клетки микроорганизмов, содержащие этот фермент, применяются для получения таких веществ, как акрил амид, никотинамид, 5-циановалерьяновый амид [95, 77, 56, 107].

Амидазы - это ферменты способные гидролизовать амиды карбоновых кислот до соответствующих кислот и аммония [104,53,32] На основе различий аминокислотного состава и пространственной структуры амидазы объединяют в две группы: алифатические амидазы нитрилазной суперсемьи и амидазы AS -семьи (Amidase signature) [9] .

Выявлены факты того, что амидаза может обладать нитрилгидратазной активностью, но она в тысячи раз ниже по сравнению с исходной [9]. Амидазы обладают высокой стереоспецифичностью. Чаще гидролизу подвергаются S — изомеры [48, 64, 65]. Амидазы обнаружены у многих видов организмов: бактерии, грибы, растения и животные [96, 53, 104].

Нитрилаза - это фермент, относящийся к суперсемейству нитрилаз, способный гидролизовать нитрилы до соответствующих кислот и аммония. По четвертичной структуре нитрилазы представляют собой гомоолигомеры. Большая часть нитрилаз в растворе присутствует в виде неактивных димеров, которые могут образовывать активные олигомеры. Также некоторые нитрилазы образуют спиральные гомоолигомерные структуры. Их роль на сегодняшний день не известна, но они представляют высокий интерес для биотехнологии, так как имеют высокую плотность каталитических центров [9, 65, 103, 91].

В некоторых случаях нирилазы способны работать как нитрилгидратазы, с образованием амида. Для некоторых субстратов амид - главный продукт реакции. Причем гидролиз нитрилов при помощи нитрилгидратаз не является энантиоселективным, тогда как образование амидов при помощи нитрилаз энантиоселективно [9].

Согласно субстратной специфичности нитрилазы делят на 3 группы:

1. Ароматические нитрилазы, гидролизующие ароматические нитрилы.

2. Алифатические нитрилазы, гидролизующие алифатические нитрилы.

3. Нитрилазы, гидролизующие арилацетонитрилы.

Нитрилазы были обнаружены практически у всех организмов: бактерий, грибов, архей, растений и млекопитающих [9].

1.3 Практическая значимость ароматических карбоновых кислот.

Пиридинзамещенные амиды и карбоновые кислоты - предшественники ряда фармацевтических препаратов и различных востребованных в народном хозяйстве химических соединений.

Некоторые производные пиколиновой кислоты, такие как 6-метилпиколиновая кислота являются промежуточными продуктами в синтезе фармацевтических препаратов, например димеколина [36, 19].

Никотиновая кислота или ниацин имеет большое значение для пищевой, сельскохозяйственной, фармацевтической промышленности и других сфер народного хозяйства [44, 94, 60, 79]. Никотиновая кислота также известна как витамин ВЗ или витамин РР. Витамин ВЗ также может включать в себя и никотинамид [67] Как никотинамид, так и никотиновая кислота в питательном плане эквивалентны [86]. Витамин ВЗ участвует в формировании НАД и НАДФ, которые играют ключевую роль в окислительно-восстановительных реакциях [86, 9, 60, 79]. Ниацин используют в качестве питательной добавки при обогощенни пищи витамином ВЗ. Авитаминоз по витамину ВЗ вызывает пеллагру, а умеренный дефицит - замедление обмена веществ [44]. Изменениям подвергается кожа, желудочно-кишечный тракт и нервная система. Пеллагра характеризуется следующими симптомами: дерматиты, покраснение языка, рвота, диарея, головная боль, апатия, депрессия, дезориентация и потеря памяти [94, 79].

Повышенные дозы никотиновой кислоты блокирует распад жира в жировой ткани и применяется при лечении гиперлипидемии [86]. Сложноэфирные и амидные производные никотиновой кислоты применяются как антигиперлипидемические (препараты, снижающие уровень холестерина и жиров

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Васильев, Дмитрий Михайлович, 2014 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. А. с. 123155 СССР, Класс 12p, l0i. Способ получения изоникотиновой кислоты / Б.В. Суворов, С.Р. Рафиков, B.C. Кудинова, Б.А. Жубанова. - № 604629/23; заявл. 22.07.58; опубл. 1959, Бюл. № 20.

2. Астаурова, О.Б. Ассимиляция аммония у продуцента акриламида Rhodococcus rhodochrous М8 / О.Б. Астаурова, Г.А. Ларикова, И.Н.Полякова, A.C. Яненко // Микробиология. - 1993. - № 11-12. - С. 6-8.

3. Биологическое разнообразие нитрилметаболизирующих бактерий антропогенно-измененных почв Пермского края / В.А. Демаков [и др.]// Экология. -2007. -№ 3. - С. 1-6.

4. Бирюков, В.В. Основы промышленной биотехнологии / В.В. Бирюков. -М.: Колос, 2004.-296 с.

5. Воронин, A.M. Академик Георгий Константинович Скрябин / А. М. Воронин // Микробиология. - 1999. - Т. 68, № 6. - С. 809-815.

6. Влияние нитрилов и амидов на рост и нитрилгидратазную активность штамма Rhodococcus sp. gt 1 / А.Ю. Максимов [и. др] // Прикладная биохимия и микробиология. - 2003. - Т.39. - №1. - С.63-68.

7. Гидролиз акрилонитрила клетками нитрилконвертирующих бактерий, иммобилизованными на волокнистых углеродных адсорбентах / Ю.Г. Максимова [и др.]// Биотехнология. - 2010. - № 4. - С. 51-58.

8. Гловера, Д. Клонирование ДНК. Методы / Д. Гловера. - М.: Мир, 1988.-538 с.

9. Дебабов, В. Г. Биокаталитический гидролиз нитрилов / В. Г. Дебабов, А. С. Яненко // Обзорный журнал по химии. - 2011. - Т. 1. - №4. - С. 376 - 394.

10. Демаков, В.А. ПНР-анализ генов ферментов гидролиза нитрилов карбоновых кислот / В.А. Демаков, А.Ю. Максимов, М.В. Кузнецова, C.B. Козлов // Весник Пермского государственного универститета. Серия биология. — 2009. — №10.-С. 73-78.

11. Ефременко, E.H. Гетерогенные биокатализаторы на основе иммобилизованных клеток микроорганизмов: фундаментальные и прикладные аспекты: автореф. дис. д. биол. наук: 03.00.02, 03.00.23 -М., 2009. - 60 с.

12. Ждан-Пушкина, С. М. Основы роста культур микроорганизмов: учебное пособие / С. М. Ждан-Пушкина, В. П. Гончарова; под ред. С.М. Ждан-Пушкина. -JI. Изд. Лен. ун-т. 1983. - 188 с.

13. Забазная, Е.В. Отбор штаммов, трансформирующих акрилонитрил и акриламид в акриловую кислоту / Е.В. Забазная, C.B. Козулин, С.П. Воронин // Прикладная биохимия и микробиология. — 1998. - Т. 34. - № 4. - С. 337-381.

14. Иммобилизация на углеродных сорбентах клеток штамма Rhodococcus ruber gtl, обладающего нитрилгидратазной активностью / А.Ю. Максимов [и др.] // Прикладная биохимия и микробиология. - 2007. - Т.43. - №2. - С. 193-198.

15. Иммобилизованные клетки и ферменты. Методы. / под. общ. ред. Д. Вудворда; - М.: Мир, 1988. - 215 с.

16. Кощеенко, К.А. Живые иммобилизованные клетки как биоктализатор процессов трансформации и биосинтеза органических соединений / К.А. Кощеенко // Прикл. биохим. микробиол. - 1981. - Т. 17. - вып. 4. — С. 477-493.

17. Лакин, Г.Ф. Биометрия: 4-е изд., перер. и доп./ Г.Ф. Лакин. — М.: В. Ш., 1990.-352 с.

18. Максимова, Ю.Г. Биокаталитический синтез акриловой кислоты клетками Pseudomonas fl uorescens С2, иммобилизованными на каолине / Ю.Г. Максимова, В.А. Демаков, Г.В. Овечкина // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю.А. Овчинникова. -2011.-Т. 7. - № 2. - С. 5-10.

19. Обзор рынка гербицидов в СНГ // Сайт исследовательской группы Инфомайн. [Электронный ресурс]. URL: http://www.infomine.ru/files/catalog/97/file 97.pdf (дата обращения: 11.12.2013).

20. Определитель бактерий Берджи. В 2-х т. Т2 / под ред. Дж. Хоулт, [и др.] - М.: Мир, 1997. - 368 с.

21. Определитель бактерий Берджи. В 2-х т. Т.2 / под ред. Дж. Хоулт [и др.] - М.: Мир, 1997. - 432 с.

22. Определитель нетривиальных патогенных грамотрицательных бактерий / Р. Вейант [и др.] - М.: Мир, 1999. - 304 с.

23. Павлова, Ю.А. Симбиотические почвенные бактерии, трансформирующие нитрилы и амиды карбоновых кислот / Ю.А. Павлова, А.Н. Неустроева // Вестник Оренбургского государственного университета. - 2011. -№16.-С. 177-179.

24. Пат. 111193 СССР, Класс 12р, 1110. Способ получения изоникотиновой кислоты. / Ю.И. Чумаков, П.П. Гангрский, Е.В. Швецова, Е.Г. Чвырева. - № 580694; заявл. 17.07.57.

25. Пат. 1288183 СССР, МКП С 07 Б 213 / 79, 213 / 803. Способ получения изоникотиновой кислоты / Б.В. Суворов, В.А. Серазетдинова, С.Б. -№3867642/31 - 04; заявл. 11.03.85; опубл. 07.02.87. Бюл. 5.

26. Пат. 1553530 СССР, МКП С 07 В 213/81, А 01 Т 43/40. Способ получения пиридин-2-карбоксамида: патент / Б.В. Суворов, В.А. Серазетдинова, С.Б. Бакирова. - №4376777/31 - 04. заявл. 10.02.88; опубл. 30.03.90. Бюл. 12.

27. Пат. 1553531 СССР, МКП С 07 В 213/81, А 01 N 43/40. Способ получения пиридин-4-карбоксамида: Б.В. Суворов, В.А. Серазетдинова, С.Б. Бакирова. -№4376777/31-04; заявл. 10.02.88; опубл. 30.03.90. Бюл. 12.

28. Пат. 2049089 Российская Федерация, МПК С07Б213/803. Способ получения никотиновой кислоты / Е.М. Алькаева, Т.В. Андрушкевич, Г.А. Зенковец, М.Г. Макаренко; заявитель и патентообладатель Институт катализа им. Г.К. Борескова СО РАН. - № 94003019/04. заявл. 26.01.94; опубл. 27.11.95.

29. Пат. 2175968 Российская Федерация, МПК С07Э213/79, С07Б213/80, С07Б213/803, С070213/81, С07Б213/82. Непрерывные способы гидролиза цианопиридинов в адиабатических условиях. В. Као, Р.А. Каттау, Дж. Крейлис; заявитель и патентообладатель Рейли Индастрилс, Инк. (и8). 98116899/04; заявл. 04.02.97; опубл. 20.11.01.

30. Пат. 2371247 Российская Федерация, МПК B01J23/22, C07D213/80, B01J21/06, B01J23/16. Катализатор и способ получения никотиновой кислоты / В.Н. Кашкин, Б. С. Бальжинимаев, В.Б. Накрохин, Е. В. Овчинникова, И. А. Золотарский, Т. В. Андрушкевич.; заявитель и патентообладатель Институт катализа им. Г.К. Борескова Сибирского отделения РАН. - 2008123715/04; заявл. 10.06.08; опубл. 27.10.09.

31. Пат. 97408 СССР. Класс 12р, 101. Способ получения изоникотиновой кислоты. / М.В. Рубцов, Е.Е. Михлина, В.Я. Фуртатова. - № 102/13-7-16/447044; заявл. 08.11.52; опубл. 1945, Бюл. №3.

32. Перцович, С.И. Алифатическая амидаза Rhodococcus rhodochrous -представитель семейства нитрилаз/цианидгидратаз / С.И. Перцович [и др.]// Биохимия.-2005.-Т. 70.-№ 11.-С. 1556-1565.

33. Полтавская, C.B. Разработка и внедрение биокаталитического способа получения акриловой кислоты. I выделение штамма Alcaligenes denitrifîcans, трансформирующего акрилонитрил в акрилат аммония. Оптимизация среды культивирования. / C.B. Полтавская, Т.Н. Козулина, И.Н. Сингирцев, C.B. Козулин // Биотехнология. - 2004. - № 1. - С .62-70.

34. Промышленная микробиология: уч. пособие бля вузов / под общ. ред. Н.С. Егорова. -M.: В. Ш, 1989. - 688 с.

35. Синицын, А.П. Иммобилизованные клетки микроорганизмов / А.П. Синицын, Е.И. Райнина, В.И. Лозинский, С.Д. Спасов. - M : Изд-во МГУ, 1994. -288 с.

36. Синтетические лекарственные средства / под. ред. А.Г. Натрадзе. -М.: Медицина, 1983. - 272 с.

37. Сравнительный анализ штаммов, используемых в процессе получения акрилата аммония / С. А. Глинский [и др.]// Биотехнология. - 2010. - №1. - С. 1724.

38. Халгаш, Я. Биокатализаторы в органическом синтезе: монография. -М.: Мир, 1991.-204 с.

39. Яненко, А.С. Биосинтез мономеров для полимерной химии / А.С. Яненко // В мире науки. 2006. № 8. С. 78-80.

40. 5-Cyanovaleramide production using immobilized Pseudomonas chlororaphis B23 / E.C. Hann [et al.] II Bioorganic and medicinal chemistry - 1999. -V. 7(10) : 2239-45.

41. Almatawah, Q.A. Thermostable nitrilase catalysed production of nicotinic acid from 3-cyanopyridine / Q.A. Almatawah, D.A. Covan // Enzyme and Microbial Technology. - 1999. - V. 25. - P. 718-724.

42. Alonso, F. О. M. Enantiomerically Pure D-Phenylglycine Production using Immobilized Pseudomonas aeruginosa 10145 in Calcium Alginate Beads / F. О. M. Alonso, О. A. C. Antunes, E. G.Oestreicher // Journal of the Brazilian Chemical Society - 2007. - V. 18.-P. 566-571.

43. Amidase-catalyzed production of nicotinic acid in batch and continuous stirred membrane reactors / M. Cantarella [et al.] // Enzyme and Microbial Technology. - 2008. - V. 42. - P. 222-229.

44. Application of continuous stirred membrane reactor to 3-cyanopyridine bioconversion using the nitrile hydratase-amidase cascade system of M imperiale CBS 498-74 / L. Cantarella [et al.] II Enzyme and Microbial Technology. - 2010. - V. 47. -P. 64-70.

45. Asano, Y. Overview of screening for new microbial catalysts and their uses in organic synthesis - selection and optimization of biocatalysts / Y. Asano // Journal of Biotechnology. - 2002. - V. 94. - P. 65-72.

46. Banerjee, A. Enhancing the catalytic potential of nitrilase from Pseudomonas putida for stereoselective nitrile hydrolysis / A. Banerjee, P. Kaul, U.C. Banerjee // Applied Microbiology and Biotechnology. - 2006. - V. 72. -P. 77-87.

47. Banerjee, A, The nitrile-degrading enzymes: current status and future prospects / A Banerjee, R. Sharma, U.C. Banerjee // Appl Microbiol Biotechnology. -2002.-V. 60.-P. 33-44.

48. Beard, T.M. Enantioselective biotransformations using Rhodococci / T.M. Beard, M. Page // Antonie Van Leeuwenhoek. - 1998. - V.74. - P.199-206.

49. Behrman, E. J. The bacterial oxidation of nicotinic acid / E. J. Behrman, R. Y. Stanier // Journal of Biological Chemistry. — BHKHne^HH. - 1957. - V. 228. - P. 923-945.

50. Bhalla, T. C. Production of isonicotinic acid using agar entrapped whole cells of N. globerula NHB-2 / T. C. Bhalla, P.K. Mehta, N.N. Sharma, S.K. Bhatia // XVIIth International Conference on Bioencapsulation, Groningen, Netherlands. - 2009. - Poster P40. - P. 1-4.

51. Biocatalytic application of nitrilases from Fusarium solani Ol and Aspergillus niger K10 / M. Winkler [et al.] // Journal of molecular catalysis b enzymatic. - 2009. - V. 59(4). - P. 243-247.

52. Biotransformation of nitriles by Rhodococcus equi A4 immobilized in LentiKats / D. Kuba [et al.] // Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. - 2006. -V. 39.-P. 59-61.

53. Bray, H.G. The fate of certain organic acids and amides in the rabbit. Further observations on the hydrolysis of amides by tissue extracts / H.G. Bray, S.P. James, W.V. Thorpe // Biochemical Journal. - 1950. - V. 3. - P. 294-299.

54. Bunch, A.W. Biotransformation of nitriles by rhodococci / A.W. Bunch // Antonie van Leeuwenhoek. - 1998. - V. 74. - P. 89-97.

55. Cantarella, M., Use of a UF-membrane reactor for controlling selectively the nitrile hydratase-amidase system in Microbacterium imperial CBS 498-74 resting cells Case study: Benzonitrile conversion / M. Cantarella, L. Cantarella, A. Gallifuoco, A.Spera // Enzyme and Microbial Technology - 2006. - V. 38. - P. 126-134.

56. Catalytic mechanism of nitrile hydratase proposed by time-resolved X-ray crystallography using a novel substrate, tert-butylisonitrile / K. Hashimoto [et al.] II Journal of Biological Chemistry. - 2008 - V. 283(52). - P. 36617-36623.

57. Chen, J. Biosynthesis of p-methoxyphenylacetic acid from p-methoxyphenylacetonitrile by immobilized Bacillus subtilis ZJB-063 / J. Chen, Y.

Zheng, Y. Shen // Biotechnology and applied biochemistry. - 2008. - V. 50. -P. 147-153.

58. Chen, J. Microbial transformation of nitriles to high-value acids or amides / J. Chen, R.C. Zheng, Y.G. Zheng, Y.C. Shen // Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. - 2009. - V. 113. - P. 33-77.

59. Chibata, I. Immobilized aspartase-containing microbial cells: preparation and enzymatic properties /1. Chibata, T. Tosa, T. Sato // Appl Microbiol Biotechnology. - 1974. - V. 27. - P. 878-885.

60. Chuck, R. Technology development in nicotinate production / R. Chuck // Applied Catalysis A: General. - 2005. - V. 280. - P. 75-82.

61. Colby, J. Immobilization of Rhodococcus AJ270 and use of entrapped biocatalyst for the production of acrylic acid / J. Colby, D. Snell, G.W. Black // Monatshefte für Chemie. - 2000. - V. 131.-P. 655-666.

62. Continuous hydrolysis of 4-cyanopyridine by nitrilases from Fusarium solani Ol and Aspergillus niger K10 / A. Malandra [et al.] // Applied Microbiology and Biotechnology - 2009. - V. 85(2). - P. 277-284.

63. Enhancing nitrilase production from Fusarium proliferatum using response surface methodology / F. Yusuf [et al.] // Springer Plus -2013.-2 :290.

64. Fournand, D. Acyl Transfer Activity of an Amidase from Rhodococcus sp. Strain R312: Formation of a Wide Range of Hydroxamic Acids / D. Fournand, F. Bigey, A. Arnaud // Applied and Environmental Microbiology. - 1998. - V. 64. - P. 2844-2852.

65. Hirrlinger, B. Purification and properties of an amidase from Rhodococcus erythropolis MP50 which enantioselectively hydrolyses 2-aryl-propionamides / B. Hirrlinger, A. Stolz, H.-J. Knackmuss // Journal of Bacteriology. - 1996. - V. 178. - P. 3501-3507.

66. Hughes, D. E. 6-Hydroxynicotinic acid as an intermediate in the oxidation of nicotinic acid by Pseudomonas fluorescens / D. E. Hughes // Biochemical Journal. -1955.-V. 60.-P. 303 -310.

67. Identification and characterization of a novel nitrilase from Pseudomonas fluorescens Pf-5 / JS. Kim [et al.] // Applied Microbiology and Biotechnology. - 2009. -V. 83.-P. 273-283.

68. Immobilization of Enzymes. From: Methods in Biotechnology / Ed. By J.M. Guisan // Humana Press Inc., Totowa, NJ. - 2006. - 449 p.

69. Immobilization of fungal nitrilase and bacterial amidase - two enzymes working in accord / V. Vejvoda [et al.] // Biocatalysis and Biotransformation. - 2006. -V. 24.-P. 414-418.

70. Johnson, D.V. Oxynitrilases for asymmetric C-C bond formation / D.V. Johnson, A.A. Zabelinskaja-Mackova, H. Griengl // Current Opinion in Chemical Biology. - 2000. - V. 4(1). - P. 103-109.

71. Kabaivanova, L. Immobilization of cells with nitrilase activity from a thermophilic bacterial strain / L. Kabaivanova, E. Dobreva, P. Dimitrov, E. Emanuilova // Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. - 2005. - V. 32. -P. 7-11.

72. Kamble, A. Optimization of Crucial Reaction Conditions for the Production of Nicotinamide by Nitrile Hydratase Using Response Surface Methodology / A. Kamble, U.C. Banerjee // Applied Biochemistry and Biotechnology - 2008. - V. 151.-P. 143-150.

73. Kaplan, O. Hydrolysis of nitriles and amides by filamentous fungi / O. Kaplan, K. Nikolaou, A. Pisvejcova, L. Martinkova // Enzyme and Microbial Technology. - 2006. - V. 38. - P. 260-264.

74. Kato, Y. Distribution of aldoxime dehydratase in microorganisms / Y. Kato, R. Ooi, Y. Asano, // Applied and environmental microbiology. - 2000 - V. 66(6) - P. 2290-2296.

75. Kim, B. Production of acrylamide using immobilized cells of Rhodococcus rhodochrous M33 / B. Kim, H. Hyun // Biotechnology and Bioprocess Engineering -2002.-V. 7.-P. 194-200.

76. Kobayashi, M. Enzymatic synthesis of acrylamide: a success story not yet over / M. Kobayashi, T. Nagasawa, H. Yamada // Trends in Biotechnology. - 1992. -V. 10.-P. 402-408.

77. Kobayashi, M. Metalloenzyme nitrile hydratase: Structure, regulation, and application to biotechnology / M. Kobayashi, S. Shimizu // Nature Biotechnology. -1998.-V. 16.-P. 733-736.

78. Kobayashi, M. Nitrile hydralases / M. Kobayashi, S. Shimizu // Current Opinion in Chemical Biology - 2000. - V. 4. - P. 95-102.

79. Kumar, N. Synthesis of cyanopyridine and pyrimidine analogues as newanti-inflammatory and antimicrobial agents / N. Kumar, A. Chauhan, S. Drabu // Biomed Pharmacother. - 2011. - V.65 (5). - P. 375-380.

80. Kumar, S. Process Intensification of Nicotinic Acid Production via Enzymatic Conversion using Reactive Extraction / S. Kumar, B.V. Babu // Chemical and Biochemical Engineering. - 2009. - V. 23 (3). - P. 367-376.

81. Linardi, V.R. Utilization of acetonitrile and other aliphatic nitriles by a Candida famata strain / V.R. Linardi, J.C. Dias, C.A, Rosa // FEMS Microbiology Letters. - 1996.-V. 144(1).-P. 67-71.

82. Liu, J.K. The role of nitrogenase in a cyanide-degrading Klebsiella oxytoca strain / J.K. Liu, C.H.Liu, C.S. Lin // Proceedings of the National Science Council, Republic of China. Part B. 1997. V. 21(2). P. 37-42.

83. Martinkova, L. Nitrile- and amide-converting microbial enzymes: stereo-, regio- and chemoselectivity / L. Martinkova, V. Kren // Biocatalysis and Biotransformation. - 2002. - V. 20. - P. 73-93.

84. Mascharak, P.K. Structural and functional models of nitrile hydratase / P.K. Mascharak // Coordination Chemistry Reviews. - 2002. - V. 225. - P. 201-214

85. Mathew, C. D. Nitrilase-Catalyzed Production of Nicotinic Acid from 3-Cyanopyridine in Rhodococcus rhodochrous JI / C. D. Mathew, T. Nagasawa, M. Kobayashi, H. Yamada // Applied and Environmental Microbiology. - 1988. - V. 54. -P. 1030-1032.

86. Meyers, C. D. Nicotinic acid induces secretion of prostaglandin D2 in human macrophages: an in vitro model of the niacin flush / C. D. Meyers, P. Liu, V. S. Kamanna, M. L. Kashyap // Atherosclerosis. - 2007. - V. 192. - P. 253-258.

87. Nagasawa, T. Nitrile Hydratase-Catalyzed Production of Nicotinamide from 3-Cyanopyridine in Rhodococcus rhodochrous J1 / T. Nagasawa, C. D. Mathew, J. Mauger, H. Yamada // Applied and Environmental Microbiology. -1988. - V 54(7). - P. 1766-1769.

88. Nicotinic acid bio-production by Microbacterium imperiale CBS 489-74: effect of 3-cyanopyridine and temperature on amidase activity / M. Cantarella [et al.] II Process Biochemistry. - 2012. - V. 47. - P. 1192-1196.

89. Nicotinic acid bioproduction in UF-membrane reactor via nitrile hydratase-amidase catalyzed reactions / M. Cantarella [et al.] II Chemical engineering transactions. - 2008. - V. 14. - P. 323 - 328.

90. Nitrilase from Pseudomonas fluorescens EBC191: cloning and heterologous expression of the gene and biochemical characterization of the recombinant enzyme / C. Kiziak [et al.] // Microbiology. - 2005. - V. 151. - P. 36393648.

91. Nitrilases in nitrile biocatalysis: recent progress and forthcoming research / J.S Gong [et al.] 11 Microbial Cell Factories. - 2012. - 11 : 142.

92. Pace, H. C. The nitrilase superfamily: classification, structure and function / H. C. Pace, C. Brenner // Genome Biology. 2001. V. 2 (1) : R 0001.1 - 0001.9.

93. Pinsiky, A. The oxidation of nicotinic acid by Pseudomonas fluorescens / A. Pinsiky, M. Michaelis // Biochemical Journal - 1952. - V. 52. - P. 33 - 38.

94. Prasad, S. Bench scale conversion of 3-cyanopyidine to nicotinamide using resting cells of Rhodococcus rhodochrous PA-34. / S. Prasad, J. Raj, T. C. Bhalla // Indian Journal of Microbiology. - 2007. - V. 47. - P. 34-41.

95. Prasad, S. Nitrile hydratases (NHases): At the interface of academia and industry / S. Prasad, T. C. Bhalla // Biotechnology Advances. - 2010. - V. 28 (6). -P.725-741.

96. Purification and characterization of a nitrilase from Aspergillus niger K10 / O. Kaplan [et al.] // Applied Microbiology and Biotechnology - 2007. - V. 73(3). - P. 567-75.

97. Purification and characterization of a nitrilase from Fusarium solani Ol / V. Vejvoda [et al.]// Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. - 2008. - V. 50. - P. 99-106.

98. Purification and Characterization of Nitrilase from Fusarium solani IMI196840 / V. Vejvoda [et al.] // Process Biochemisty. - 2010. - V.45. - P. 11151120.

99. Qadreyah, A. A. Thermostable nitrilase catalysed production of nicotinic acid from 3-cyanopyridine / A. A. Qadreyah, A. C. Don // Enzyme and Microbial Technology. - 1999. - V. 25. - P. 718-724.

lOO.Sharma, N. N. Nocardia globerula NHB-2 nitrilase catalysed biotransformation of 4-cyanopyridine to isonicotinic acid / N. N. Sharma, M. Sharma, T.C. Bhalla // AMB Express. - 2012. - V. 2(1) : 25.

101. Sharma, N. N. Nocardia globerula NHB-2: Bench scale production of nicotinic acid / N. N. Sharma, M. Sharma, H. Kumar, T. C. Bhalla // Process Biochemistry. - 2006. - V 41. - P. 2078-2081.

102. Sharma, N.N. An improved nitrilase-mediated bioprocess for synthesis of nicotinic acid from 3-cyanopyridine with hyperinduced Nocardia globerula NHB-2 / N.N. Sharma, M. Sharma, T.C. Bhalla // Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology-2011 -V. 38(9).-P. 1235-1243.

103. Singh, R. Nitrilase and its application as a «Green» catalyst / R. Singh, R. Sharma, N. Tewari, Geetanjali, D.S. Rawat // Chemistry and Biodiversity. - 2006. - V. 3(12).-P. 1279-1287.

104.Syed, M. Purification and characterization of amidase from acrylamide-degrading bacterium Burkholderia sp. strain DR.Y27 / M. Syed S. Ahmad, N. Kusnin, M.Shukor I I African Journal of Biotechnology. - 2011. - V. 11(2). - P. 329-336.

105.The effect of whole cell immobilisation on the biotransformation of benzonitrile and the use of direct electric current for enhanced product removal / R Mustacchi [et al.] // Biotechnology and Bioengineering. - 2005. - V. 91 (4). - P. 436440.

106.Thimann, K. Nitrilase II, its substrate specificity and possible mode of action / K. Thimann, S. Mahadevan // Archives of Biochemistry and Biophysics - 1964. -V. 107.-P. 62-68.

107.Yamada, H. Nitrile hydratase and its application to industrial production of acrylamide / H. Yamada, M. Kobayashi // Bioscience Biotechnology and Biochemistry. - 1996. -V. 60(9). - P. 1391-400.

108. Yusuf, F. A new isolate from Fusarium proliferatum (AUF-2) for efficient nitrilase production / F. Yusuf, A. Chaubey, U. Jamwal, R. Parshad // Applied biochemistry and biotechnology.-2013.-V. 171 (4).-P. 1022-1031.