Устойчивость и адаптация к тепловому шоку культур клеток Arabidopsis thaliana и Thellungiella salsuginea при действии фторида натрия тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.05, кандидат биологических наук Пуляевская, Мария Александровна

• Пуляевская, Мария Александровна
• кандидат биологических наук
• 2011

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Пуляевская, Мария Александровна

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Антропогенное загрязнение окружающей среды фтором

1.1.2. Естественные источники поступления фтора в окружающую среду

1.1.3. Антропогенное поступление фтора в окружающую среду

1.1.4. Влияние фтора на окружающую среду

1.1.4.1. Атмосферное загрязнение

1.1.4.2. Загрязнение водных объектов

1.1.4.3. Загрязнение почв

1.2. Экологические последствия загрязнения фтором

1.2.1. Влияние фтора на здоровье человека

1.2.2. Экологические последствия влияния фтора на растения

1.3. Механизмы токсичного действия фтора на растения

1.3.1. Проникновение фтора в растение и его аккумуляция

1.3.1.1. Проникновение фтора из атмосферы

1.3.1.2. Поступление фтора из почвы

1.3.1.3. Аккумуляция фтора растениями

1.3.2. Поступление и накопление фтора в клетке

1.3.3. Основы токсичности фтора

1.4. Влияние фтора на растения

1.4.1. Влияние фтора на рост растений

1.4.2. Влияние фтора на жизнеспособность растений

1.4.3. Видимые повреждения, вызываемые действием фтора

1.4.4. Клеточные и структурные изменения при действии фтора

1.4.5. Влияние фтора на ферментативную активность

1.4.6. Влияние фтора на фотосинтез

1.4.7. Влияние фтора на дыхание

1.4.8. Влияние фтора на другие процессы

1.4.10. Программированная клеточная смерть

1.4.9. Влияние фтора на восприятие растениями действия биотических и абиотических факторов

1.4.9.1. Свет

1.4.9.3. Дефицит воды

1.4.9.4. Другие элементы и токсиканты

1.4.9.5. Биотические взаимодействия

1.4.9.2. Температура

1.5. Стрессовые белки и адаптация к действию высоких температур

1.5.1. Явление индуцированной термотолерантности

1.5.2. Белки теплового шока

1.5.2.1. Семейство БТШ 100 (С1р/№р100)

1.5.2.2. Регуляция экспрессии БТШ

1.5.3. Роль митохондрий в синтезе БТШ

1.6. Обоснование выбора объекта исследования

1.6.1. Лгаб/с/орзгя &аНапа

1.6.2. Тке11и^ие11а ваЬщтеа

1.7. Выводы из обзора литературы

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Объект исследования

2.2. Температурные обработки

2.3. Обработка клеток фторидом натрия, ингибиторами и разобщителями ЭТЦ

2.4. Оценка ростовой активности культур клеток

2.5. Определение жизнеспособности клеток

2.6. Изучение развития индуцированной термотолерантности

2.7. Выделение тотального белка

2.8. Электрофорез в ПААГе с ДДС-Ыа

2.9. Вестерн-блоттинг

2.10. Использованные антитела

2.11. ОТ-ПЦР-анализ

2.11.1. Выделение РНК

2.11.2. Денатурирующий РНК электрофорез

2.11.3. Синтез кДНК

2.12. Определение дыхательной активности

2.13. Микроскопические методы (флуоресцентная и световая микроскопия)

2.14. Статистическая обработка данных

3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1. Влияние хлорида натрия на рост культур А. ЛаНапа и Т. заЬщтеа

3.2. Влияние обработки фторидом натрия нарост культур клеток А ЛаИапа и Т. яа1$щ1пеа

3.3. Влияние фторида натрия на жизнеспособность культур клеток ЛаЫапа и Т. $аЫи%теа и проростков А. МаИапа

3.3.1. Влияние фторида натрия на жизнеспособность культур клеток А. ЛаНапа и Т. 8аЬщ1пеа

3.3.2. Влияние фторида натрия на жизнеспособность проростков А. 1каИапа

3.4. Изучение параметров развития гибели культур клеток при обработке фторидом натрия

3.5. Влияние фторида натрия на индуцированную термотолерантность и экспрессию БТШ в культурах клеток А ЛаНапа и Т. заЬщгпеа при мягком тепловом стрессе

3.5.1. Влияние кратковременной обработки фторидом натрия на жизнеспособность культур клеток

3.5.2. Влияние фторида натрия на развитие индуцированной термотолерантности

3.5.3. Влияние фторида натрия на синтез БТШ

3.5.4. Действие фторида натрия на экспрессию генов БТШ при мягком тепловом стрессе культуры клеток А. ЛаНапа

3.6. Влияние фторида натрия на функции митохондрий культур клеток А гкаНапа и Т. БаЬщтеа

3.6. Влияние фторида натрия на функции митохондрий культур клеток А ЛаЫапа и Т. закщгпеа

3.6.1 Изменение интенсивности поглощения кислорода в присутствии фторида

натрия

3.6.2. Влияние фторида натрия на изменение потенциала внутренней митохондриальной мембраны культуры клеток А гкаИапа при мягком тепловом стрессе

3.7. Влияние конститутивной экспрессии ШР101 на устойчивость культуры клеток А ЛаЫапа к действию фторида натрия

4. ОБСУЖДЕНИЕ

4.1. Культура клеток Т. яак^гпеа не отличается от культуры клеток А МаНапа по устойчивости к хлориду натрия и фториду натрия

4.2. Сравнение влияния фторида натрия на рост и жизнеспособность культур клеток Т. яаЬщтеа и А. гкаИапа и проростков А ЖаИапа

4.3. Параметры гибели культур клеток при обработке фторидом натрия

4.4. Фторид натрия ингибирует развитие индуцированной термотолерантности и

синтез БТШ в клеточных культурах при мягком тепловом стрессе

4.1.5. Влияние конститутивной экспрессии НБРЮ! на устойчивость к фториду натрия

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АА - антимицин А

АО - альтернативная оксидаза

АФК - активные формы кислорода

БТШ - белки теплового шока

ДДС-Na - додецилсульфат натрия

ИУК - индолилуксусная кислота

нмБТШ - низкомолекулярные белки теплового шока

ОТ-ПЦР - полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией

ПААГ - полиакриламидный гель

ПДК - предельно допустимая концентрация

ПКС - программируемая клеточная смерть

СГК - салицилгидроксамовая кислота

СК - салициловая кислота

ТТХ - 2,3,5-трифенилтетразолий хлорид

ЭТЦ - электронтранспортная цепь

СССР - карбонил-цианид ш-хлорфенилгидрозон

JC-1 - 5,5',6,6'-тетрахлор-1,1 ',2,2'-тетраэтилбензимидазоло-карбоцианин HSE - цис-элемент теплового шока (от англ. heat shock element) Hsfs - транскрипционные факторы теплового шока (от англ. heat shock transcription factors)

Hsp - белок теплового шока (от англ. heat shock protein) FDA - флуоресцеин диацетат

MAP - протеникиназы, активирующиеся при митозе (от англ. mitogen activated protein)

МС - метакаспаза

MOPS - морфолинпропансульфокислота

mtA\|/ - потенциал на внутренней митохондриальной мембране

PI - пропидий йодид

Sb - буфер для образца (от англ. sample-buffer)

WIPK - протеинкиназа, индуцируемая поранением (от англ. wound-induced protein kinase)

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Устойчивость и адаптация к тепловому шоку культур клеток Arabidopsis thaliana и Thellungiella salsuginea при действии фторида натрия»

ВВЕДЕНИЕ

Фтор является одним из основных компонентов атмосферных выбросов промышленных предприятий. На расстоянии 200 м от промышленных предприятий уровень фтора в листьях пшеницы может составлять 500 частей на миллион в расчете на сухую массу или около 3 мМ в расчете на сырую. При этом его концентрация в цитоплазме может превышать 75 мМ. Газообразный фтор в виде HF, как правило, проникает в растения через устьица. По мере их контакта с HF накопление фтора идет почти с линейной скоростью. HF при физиологических значениях рН находится в диссоциированной и недиссоциированной форме. Диссоциированные в водной фазе ионы фтора посредством транспирационных токов транспортируются по апопласту мезофильных клеток в верхушку и края листа (Miller, 1993). Поэтому поражения фтором часто характеризируются появлением апикальных некрозов (Михайлова и др., 2006). С другой стороны, HF лучше проникает через липидные мембраны, чем ионы фтора, и подвергается диссоциации в клеточных компартмен-тах, где наблюдается градиент рН. Поэтому F" в клетке, как правило, концентрируется в митохондриях и хлоропластах, где значение рН составляет соответственно 7.8 и 8.0 (Miller, 1993). Фтор может подавлять рост, не вызывая видимых симптомов повреждения. Подавление роста фтором может достигаться за счет его воздействия на различные физиологические процессы, такие как: фотосинтез, дыхание, метаболизм углеводородов и липидов (Miller, 1993) и водный транспорт (Kamalud-din, Zwiazek, 2003). В результате растительность, подверженная влиянию фторсо-держащих выбросов, характеризуется снижением темпов роста, урожайности, мор-фоструктурными изменениями ассимилирующей фитомассы, в том числе уменьшением массы, длины, объема и поверхности побегов, увеличением дефолиации крон деревьев и развитием апикальных некрозов (Михайлова и др., 2006).

Показано, что атмосферное загрязнение фтором может приводить к повышению чувствительности растений к повышенной температуре (Wiebe, Poovaiah, 1973). Механизм такого действия фтора остается неизвестным.

В ответ на постепенное повышение температуры, а также другие абиотические и биотические воздействия в клетках растений синтезируются белки теплового шока (БТШ) (Kotak et al., 2007; Maimbo et al., 2007). Искусственное изменение уровня БТШ влияет на устойчивость растений не только к повреждающему тепловому шоку, но и к засолению и осмотическому стрессу (Ogawa et al., 2007), а также к инфекции патогенными микроорганизмами (Kanzaki et al., 2003). Вероятно, в регуляции экспрессии БТШ существенную роль играет функциональное состояние митохондрий. Ранее было показано, что тепловая обработка при 37°С клеток Arabidopsis thaliana вызывает повышение потенциала на внутренней митохондри-альной мембране (mtA\|/) (Rikhvanov et al., 2007). Гиперполяризация сопровождалась активацией синтеза HsplOl и Hspl7.6 и развитием индуцированной термотолерантности к жесткому тепловому шоку при 50°С, а присутствие митохондриаль-ных ингибиторов и разобщителей, способных подавлять повышение mtA\|/, блокировало синтез БТШ и снижало развитие индуцированной термотолерантности. Это дает основание предполагать, что митохондрии, посредством изменения mtAi|/, участвуют в регуляции экспрессии БТШ (Rikhvanov et al., 2007).

Поскольку отрицательное действие фтора заключается в том числе, и в его способности влиять на энергетический метаболизм растений (Miller, 1993), представляет интерес выяснить, как фтор может повлиять на способность растений синтезировать стрессовые белки и адаптироваться к экстремальным изменениям температуры.

Удобной моделью для изучения механизмов действия абиотических факторов на растения является культура клеток Arabidopsis thaliana (Hunter, Bomblies, 2010; Bomblies, Weigel, 2010). Во-первых, A. thaliana является наиболее изученным растительным объектом. Геном A. thaliana полностью рашифрован, разработаны молекулярно-биологические, генетические и биохимические методы для анализа экспрессии генов и физиологических реакций на внешнее воздействие. Во-вторых, использование культуры клеток позволяет получить в короткий срок относительно

гомогенную биомассу клеток, что исключительно важно для воспроизводимости экспериментов. Однако, А. thaliana, как объект исследования, относительно чувствителен к внешнему воздействию, хотя широко используются генетические способы повышения его устойчивости. Близким родственником А. thaliana является Thel-lungiella salsuginea. Не смотря на высокую степень идентичности геномов (Inan et al., 2004), Т. salsuginea отличается гораздо большей устойчивостью к засолению и ряду других стрессовых воздействий (Amtmann, 2009). Приняв во внимание высокую степень родства двух видов А. thaliana и Т. salsuginea и повышенную устойчивость рода Thellungiella к стрессовым факторам, предполагалось, что имеющаяся в нашем распоряжении культура клеток Т. salsuginea будет отличаться по устойчивости к фтору в сравнении с А. thaliana.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Антропогенное загрязнение окружающей среды фтором 1.1.2. Естественные источники поступления фтора в окружающую среду Фтор широко распространен в природе. На его долю приходится 0,095 % от общей массы земной коры. Первым крупным природным источником неорганических фторидов является выветривание из фторсодержащих минералов (Camargo, 2003; Weinstein, Davison, 2004). Наиболее богатыми фтором из них являются криолит и флюорит, менее - фторапатит, биотит, мусковит (Власюк, 1969; Кабата-Пендиас, Пендиас, 1989). На втором месте источником поступления в окружающую среду природного фтора стоят фторсодержащие комплексы, преимущественно HF и SiF2, выносимые из материнской породы в атмосферу вулканическими газами, и содержащими до 2,5 % фтора (цит. по Шелепова, Потатуева, 2003; Symonds et al., 1988, цит. по Camargo, 2003). Вынос фтора в океан осуществляется речными стоками (цит. по Шелепова, Потатуева, 2003) Свою роль в поступлении фтора на поверхность земли играют наводнения (цит. по Weinstein, Davison, 2004). Из почв, водоемов и атмосферного воздуха часть фтора также захватывается биомассой за счет деятельности микроорганизмов, растений и животных. Массовая доля фтора в ней оценивается равной 1,4-10"4 % (Добровольский, 1983, цит. по Гладушко, 1991). 1.1.3. Антропогенное поступление фтора в окружающую среду На ускорение миграции и накопления фтора в окружающей среде существенное влияние оказывает хозяйственная и промышленная деятельность человека. Так, доля природных источников фтора составляет 38,5 %, а техногенных - 61,5 %. поступающего в глобальный цикл фтора (Гладушко, 1991). Основным источником пополнения запасов фтора являются промышленные предприятия по производству алюминия, эмалей, стекла, различных химикатов, стали, кирпича, керамики, фосфорных удобрений. Фосфорные удобрения являются наиболее распространенным поставщиком фтора. С фосфорными удобрениями в почвы попадает от 9 до 430 тыс. т фтора (цит. по Шелепова, Потатуева, 2003). Фтористые соединения в коли-

честве 0,36-1,08 т/ сутки поступают в атмосферу от суперфосфатных заводов. Количество фторидов в атмосфере также увеличивается вследствие сжигания фторсо-держащего топлива - угля, дерева, нефти, торфа за счет содержания в них фторидов от 4 до 30 мг/кг (ВОЗ, 1989). За счет деятельности заводов по производству алюминия в атмосферу выбрасывается 20 - 40 кг фтора при производстве одной тонны алюминия. Выбросы алюминиевых заводов представлены твердыми фторидами (фторид натрия, фторид кальция, фторид алюминия, криолит) и газообразными соединениями (четырехфтористый кремний, четырехфтористый углерод, фтористый водород) (Михайлова и др., 2006). Хотя соотношение выделяемых газообразных и твердых фторидов приблизительно равно, наибольшую долю среди них составляет фтористый водород (Рожков, Михайлова, 1989).

На территории Иркутской области функционируют алюминиевые заводы в городах Шелехов ОАО «ИркАЗ-СУАЛ» и Братск ОАО «РУСАЛ-Братск». По оценке состояния окружающей среды, выбросы фторидов в атмосферу Иркутской области сокращаются ежегодно. В 2007г в атмосферу поступило 1911,129 тонн фтористых соединений, в 2008г - 1874,272 тонн, в 2009г - 1748,361 тонн (Государственный доклад, 2009). Несмотря на это, среднегодовые концентрации фтора от «ИркАЗ-СУАЛ» и «РУСАЛ-Братск» превышают допустимые нормы в 1,2-3,8 раз. На протяжении многих лет города Шелехов и Братск относятся к городам с неблагополучной экологической обстановкой (Государственный доклад, 2008; Государственный доклад, 2009).

1.1.4. Влияние фтора на окружающую среду 1.1.4.1. Атмосферное загрязнение Содержание фтора и его производных в атмосфере различно по земному шару. Так, концентрации фтора в атмосферном воздухе Пекина составляют 0,61 мг/м , в населенных пунктах США от 0,02 до 2,0 мкг/м3 (цит. по Feng et al., 2003). ПДК для газообразного фтора в воздухе населенных мест России составляет 0,02 мг/м

(Гигиенические нормативы, 2006). Концентрации фторида водорода, зарегистриро-

Ю

ванные в 2009 г по Иркутской области, составили 1,2 ПДК с максимальными выбросами 3,9 ПДК, что соответственно может достигать концентрации фтора до 0,08 мг/м3 (Государственный доклад, 2009).

Основным источником загрязнения атмосферы фтором является алюминиевая промышленность. Современные системы очистки выбросов алюминиевых заводов позволяют улавливать до 98 % фтора, однако в действительности этот коэффициент очистки значительно ниже и составляет 30 - 75 %. Около 50 % фтористых соединений уходит в атмосферу без очистки через аэрационные фонари на алюминиевых заводах, оборудованных электролизерами открытого типа (цит. по Шалина, Васильева, 2009).

Попадая в атмосферу, фториды рассредотачиваются в воздухе, и с расстоянием содержание фторидов в воздухе снижается. Так по данным Sidhu (1979) на расстоянии 0,7 и 12 км от завода по производству фосфорных удобрений в Ньюфаундленде еженедельная средняя концентрация газообразного фторида составляла 5,14 мг/м3 и 0,15 мг/м3, соответственно.

В атмосферный воздух соединения фтора поступают в виде сложной смеси, состоящей в основном из газообразных соединений и пылевых частиц. Less et al. (1975) указывают, что среднее соотношение между газообразными и твердыми частицами близко к 1. Однако, это соотношение увеличивается с расстоянием в связи с быстрым осаждением крупных частиц. Таким образом, газообразный фтор распространяется на большие расстояния от алюминиевых заводов, а твердые частицы осаждаются в непосредственной близости. (Weinstein, Davison, 2004).

1.1.4.2. Загрязнение водных объектов

Содержание фтора в природных водах значительно варьирует по всему земному шару от 0,05 мг/л до 15 мг/л, что обусловлено климатогеографическими, гидрогеологическими и другими условиями. Многие поверхностные воды считаются обедненными по содержанию в них фтора, если его концентрация составляет менее 0,1 мг/л.

Содержание фтора в поверхностных водах варьирует в зависимости от расположения и близости к промышленным источникам выбросов. В сточных водах алюминиевых заводов содержание фтора колеблется от 10 до 190 мг/л. Skjelkavle (1994) обнаружил, что водные потоки, расположенные вблизи алюминиевых заводов Норвегии содержат фторида более чем в 10 раз превышающие естественный уровень. Аналогичные результаты были получены Warrington (1992) для алюминиевых заводов, расположенных на реках Канады. В приуроченных к алюминиевым заводам водохранилищам Иркутской области содержание фтора в воде составляет 1,8 мг/л, что превышает ПДК в 1,2 р, (Государственный доклад, 2008). Поскольку выбросов фторидов в сточные воды от алюминиевых заводов Иркутской области не производится (Госдоклад,2009), то превышение ПДК в водных объектах может быть объяснено осаждением фтористых соединений из атмосферы. Аналогичные Иркутской области концентрации фтора (1,5-2 мг/л) отмечены в водах Китая и Вьетнама, и считаются достаточно высокими (цит. по Шалина, Васильева, 2009).

1.1.4.3. Загрязнение почв Среднее по земному шару содержание фтора в почвах составляет 320 мг/ кг (цит.по Шелепова, Потатуева, 2003). Допустимым уровнем содержания фтора в почвах считается 500 мг/кг, критическим - до 1000 мг/кг, недопустимым - выше 1000 мг/кг (Кабата-Пендиас, Пендиас, 1989). Однако, вблизи промышленных предприятий, рассеивающих соединения фтора, по некоторым данным, его содержание может достигать 1300 - 1500 мг/кг и больше (Гладушко, 1991). Самые высокие концентрации фтора в почве зарегистрированы в США и Аргентине - 3650 и 1220 мг/кг, соответственно (Cronin et al, 2000). Содержание водорастворимых фторидов вблизи ИркАЗа превышало ПДК в 6-7 раз, в 2 км - в 2.5-3 раза, в 4-5 км - в 1.5-2 раза. Причем наиболее высокий уровень загрязнения отмечен в пахотных слоях (Помазкина, Лубнина, 2002). В 2005 г отмечено общее содержание фтора в серых лесных почвах в 4 км от ИркАЗа 585 мг/кг, из них 15 мг/кг составляли водорастворимые фториды. При таких значениях почвы являются сильнозагрязненными (По-

мазкина и др., 2005) Наибольшее загрязнение почвы соединениями фтора наблюдалось вокруг ОАО «ИркАЗ-СУАЛ» в радиусе 1 км и составляло от 11 ПДК до 31 ПДК (Государственный доклад, 2009). Анализ многолетних наблюдений свидетельствует о сохранении высокого загрязнения фторидами почвы данного региона на протяжении 20 лет. (Государственный доклад, 2009).

Согласно литературным данным, ответственными за фиксацию фтора в почве являются ионы алюминия и кремния, с котороми фтор образует прочные комплексы (Тарчевский, 1964; Конарбаева, 2008; Weinstein, Davison, 2004). Сорбция фтора почвой контролируется pH почвы. Она максимальна при pH 6, при повышении и понижении pH отмечается понижение накопления фтора. (Cronin et al, 2000). Способность удерживать фтор зависит и от гранулометрического состава почвы. Наименьшие концентрации фтора зафиксированы в песчаных почвах, наибольшие в тяжелых глинистых почвах (цит. по Шелепова, Потатуева, 2003; Конарбаева, 2008). Степень подвижности фтора в почвах определяется количеством его водорастворимых форм. Растворимость фтора более вероятна при значениях pH почвы ниже 5.5 и свыше 6.5. Увеличение содержания водорастворимых форм фтора в пахотных горизонтах определяется длительным систематическим примененим фосфорных удобрений (цит. по Шелепова, Потатуева, 2003; Конарбаева, 2008). На подвижность фтора в почвенных слоях оказывает значительное влияние мелиорация земель, выщелачивание. Выделяется еще одна причина мобильности фтора -десорбирование его корнями растений и вовлечение в круговорот веществ (Weinstein, Davison, 2004).

Итак, территория Иркутской области характеризуется повышенным содержанием в окружающей среде фтора и его производных. Большинство предприятий области размещены на достаточно близком расстоянии друг к другу, что способствует перекрыванию эмиссий, формированию обширного ареала техногенного загрязнения. Специфйческие природные условия региона затрудняют рассеивание полютантов в атмосфере. Вследствие указанных фактов, загрязнение Иркутской

территории фторидами и другими выбросами считается повышенным, при этом 7 городов области стоят в списке наиболее загрязненных городов России (Государственный доклад, 2009).

1.2. Экологические последствия загрязнения фтором 1.2.1. Влияние фтора на здоровье человека Токсической дозой для человека считается поступление в организм 20 мг фтора (Калетина, 2009). Такое острое отравление может привести к раздражению слизистых оболочек и бронхов, развитию конъюнктивита, бронхита и пневмонии. Возможны поражения кожных покровов (цит. по Шалина, Васильева, 2009). Поступление же фтора свыше 2 г может привести к летальному исходу (Калетина, 2009). Гораздо чаще токсическое воздействие фторидов наблюдается при длительном хроническом воздействии, вызванном повышенным их содержанием в питьевой воде и вдыханием с воздухом в виде пыли. В результате подобного отравления наблюдается торможение обмена жиров и углеводов, флюороз эмали зубов, замедление роста и деформация скелета, слабость и рвота, разрушение зубной эмали. Существенно увеличивается хрупкость костей, что создает предпосылки для их переломов. Имеются указания на то, что повышенное содержание фторидов в воде и воздухе способствует развитию зоба. Также, если фтор находится в избытке, возможно учащение дыхания, возникновение судорог, снижение артериального давления, иногда происходит поражение почек (цит. по Шалина, Васильева, 2009).

Токсикологическое значение для человека из фторсодержащих соединений имеют, главным образом, натриевая соль фтористоводородной кислоты и натриевая соль кремнефтористоводородной кислоты (Калетина, 2009).

1.2.2. Экологические последствия влияния фтора на растения На основании результатов исследований действия загрязнителей техногенного происхождения на растительность доказано, что устойчивость к ним является видовым признаком растений и значительно варьирует между представителями различных таксонов. Стабильность этого признака у растений, по-видимому, обуславливается устойчивым сохранением видовых различий интенсивности газообмена и других физиологических процессов (роста, развития, длительности вегетации, сроков прохождения и длительности цветения и др.) (Бельчинская, 2000).

Фторсодержащие эмиссии, оказывая токсическое действие, вызывают ослабление древостоев. Многолетний мониторинг хвойных лесов Предбайкалья показал, что фториды распространяются на обширные территории, вызывая различные степени угнетения деревьев — от слабого до весьма сильного. Процесс ослабления, развития болезни и отмирания дерева протекает у разных видов хвойных по-разному (Михайлова и др., 2005).

Лиственные породы древесных более устойчивы к промышленным загрязнителям, чем хвойные. Так, если резистентность к фтору кизильника черноплодного (Со1опеа&1еЫ те1апосагрж ЬоЬЬ.) оценить в 10 условных баллов, то устойчивость березы плосколистной (ВеЫ1а р1а1урЫ11а 8икасг.) составит 4-5 баллов, а устойчивость всех хвойных будет находиться в пределах 0.1-0.6 баллов (Рожков, Михайлова, 1989). У хвойных выраженные симптомы повреждения хвои наблюдались при накоплении в них фтора в концентрации 2,3 - 4,5 мкМ. У лиственных видов подобные симптомы в тех же условиях наблюдались при содержании в листьях более чем 4,5 - 8 мкМ фтора (У1ке, НаЬ]ог§, 1995).

Злаковые растения имеют ряд симптомов вызываемых действием фторидов в высоких концентрациях. Кончики листьев могут приобретать бледно-коричневый или даже белый цвет, хлоротические точки и полосы расположенные вдоль листа жилки по краю и направлению к кончику листа. Часто хлоротическая узкая полоса отделяет некротическую мертвую ткань от здоровой (Антонов, Градобоева,1996). Техногенное загрязнение почв Иркутской области водорастворимыми фторидами нарушало минеральное питание яровой пшеницы (Котова и др., 2002). Имеются сообщения о том, что даже наличие очень высоких концентраций фтора в листьях, еще не означает, что эти листья станут обязательно поврежденными (Орлова и др., 1988; Морошин, Гапонюк, 1993). Передерий и Микевич (1991) приводят данные, что содержание в луговой траве 60-71 мг/кг фторидов не сопровождается видимыми признаками поражения, хотя ПДК по содержанию фтора в траве составляет 1,5 мг/кг.

Десслер (1981), наоборот, утверждает, что местные растения отрицательно

реагируют на наличие в воздухе токсических веществ даже в малых дозах, в зави-

16

симости от длительности экспозиции, это приводит к многочисленным нарушениям физиологических функций, угнетению и отмиранию отдельных групп клеток, участков тканей, что нередко приводит к гибели растений. Некоторые растения настолько восприимчивы к загрязнению воздуха и почвы, что поражаются при концентрации фторидов незначительно превышающей фоновую. Ранее показано повышение уровня дефолиации крон хвойных деревьев (до 70 %), образование апикальных некрозов хвои, снижение массы и длины хвои, уменьшение длины, объема и поверхности побегов у сосны обыкновенной, произрастающей в услових аэро-промвыбросов алюминиевого завода (Михайлова, 2006).

Таким образом, действие фторсодержащих эмиссий на растения заключается в их ослабевании, замедлении роста, сильных повреждениях растительного покрова. На обширных территориях отмечается гибель как отдельных растений, так и целых экосистем, что приводит к возникновению промышленных пустынь. Можно предположить, что подавление фтором фотосинтетической активности со временем может привести к необратимым экологическим последствиям - пониженному накоплению биомассы, нарушению соотношения 02/С02 в атмосфере.

1.3. Механизмы токсичного действия фтора на растения

В научной литературе накопилось большое количество данных по влиянию фтора на растения. Однако, этих данных не достаточно для осознания влияния фтора на метаболические процессы. В первую очередь это связано с использованием различных объектов. Также, для исследований используются различные уровни организации - клетки, ткани, органы и целые растения. Кроме того, практически нет исследований по действию на клеточные стенки и плазматические мембраны, как самые первые компартменты, подвергающиеся «атаке» фтора. Опубликованные данные дают изолированные представления о механизмах действия фтора, часто противоречащие между собой. Результатом этого являются перепутанные данные, которые не могут быть использованы для создания полной картины последовательности событий, когда растение подвергается избытку фтора в экологически реальных концентрациях. Тем не менее, попытаемся обобщить имеющиеся данные.

Фтор и его действие на физиологию и метаболизм растений является объектом многих исследований. Он является широко распространенным токсикантом для большинства растений, действие которого обширно и ведет к значительным, порой необратимым нарушениям. Прежде чем перейти к обсуждению воздействия фтора на активность ферментов, фотосинтез и дыхание, видимые симптомы, рост и жизнеспособность, биотические и абиотические взаимодействия со средой, рассмотрим механизм поступления фтора в растение и клетки, его аккумуляцию и физиологические основы токсичности.

1.3.1. Проникновение фтора в растение и его аккумуляция

Несмотря на отсутствие явной необходимости фтора для растительного организма растения поглощают фтор более эффективно, чем любую другую загрязняющую примесь, что определяется его хорошей растворимостью в воде и высокой реакционной способностью (Смит, 1988). Проникновение в растение фторидов осуществляется через устьица листьев при атмосферном загрязнении и через корневую систему из почв. В случае одновременного загрязнения воздуха и почвы со-

единениями фтора более активно растениями осуществляется поглощение его из воздуха (Кабата-Пендиас, Пендиас, 1989). Рассмотрим более подробно каждый из путей поступления фтора в растение.

1.3.1.1. Проникновение фтора из атмосферы На листовую пластинку растений из атмосферы осаждается как газообразный фтор (HF), так и твердые частицы. Кутикула растений в ходе эволюции приобрела низкую проницаемость для воды и множества молекул. Соответственно анионы фтора не способны проникнуть через гидрофильные отрицательно заряженные поры кутикулы. Хотя имеются свидетельства о проникновении фторидов к клеточным стенкам эпидермиса в случаях образования кислых пленок на поверхности листа и после активности насекомых - вредителей (Weinstein, Davison, 2004). По сообщению других авторов, растворенные в воде ионы фтора способны легко проникать через кутикулу к эпидермису, и далее передвигаьтся по свободному пространству к соседним клеткам мезофилла и проводящим сосудам (Илькун и др., 1983). По литературным источникам, большая роль в проникновении фтора в растение из атмосферы отдается устьицам. Как известно, достаточно меньшие количества фтора аккумулируются в растении при закрытых устьицах. Влажный стресс, перенесенный до обработки фторидом или во время нее, снизил повреждения фтором сои, поскольку закрытые устьица препятствовали проникновению его ионов (Wiebe, Poovaiah, 1973). Итак, прежде всего, происходит адсорбция газа поверхностью листа. Появившиеся в воздухе молекулы газов адсорбируются вместе с молекулами воды на адсорбционных центрах. Когда устанавливается динамическое равновесие между концентрацией газов в воздухе и на поверхности листа, процесс адсорбции прекращается (Илькун и др., 1983). Адсорбированные газы, поступив в устьичную впадину, разлагаются в воде (Miller, 1993). Далее ионные формы двигаются через апопластное пространство клеточных стенок мезофилла с транспира-ционным током к верхушкам и краям листа и к проводящим сосудам, по которым разносятся в другие органы и ткани.

1.3.1.2. Поступление фтора из почвы

Поступление фтора в растение осуществляется и через корневую систему. В норме для растений доступна небольшая часть из имеющихся в почве фторидов. В листьях растений, произрастающих на почвах с содержанием фтора до 600-800 мг / кг, указанный токсикант содержится в количестве от 2 до 20 мг / кг (Weinstein, Davison, 2004). Это объясняется способностью фтора образовывать нерастворимые соли с алюминием, кальцием и кремнием (Тарчевский, 1964). Тем не менее, в почвенных слоях имеются и доступные для растений формы фтора, такие как F", A1F2+, HF и др. Согласно литературным данным, фторсодержащие соединения техногенного происхождения более подвижны и легкодоступны для растений, в отличие от природных форм фтора. Так, накопление фтора лиственницей сибирской (Larix si-birica Ledeb.) в условиях влияния алюминиевого завода увеличивается на фоне накопления лиственницей Гмелина (L. gmelinii (Rupr.) в районе флюоритового месторождения, в почвах которого содержание фтора выше в 1,5-5 раз в зависимости от почвенного горизонта (цит. по Шмаков, 2005). По другим данным, зависимость между поглощением фтора растениями и содержанием его водорастворимых форм в почвах незначительна. Как сообщается Шелеповой и Потатуевой (2003), фтор обладает низкой биологической доступностью.

Проникновение фтора в корни, вероятнее всего, происходит пассивно при поглощении почвенного раствора. Далее фтор транспортируется с потоком вверх по ксилеме к вегетативным органам, главным образом в листья (цит. по Шелепова, Потатуева, 2003; Klumpp et al., 1996; Davison, Weinstein, 2004). Хотя имеются данные о содержании в корнях более высоких концентраций фтора, чем в вегетативных органах. Обработка 10 мМ NaF Amygdalis communis в течение 14 дней способствовал накоплению фтора 1767 мг/г сухой массы в корнях и лишь 189 мг/г сухой массы в листьях (Elloumi et al., 2005). Исходя из того, что 95 % фтора могут быть легко извлечены промыванием корней водой, предполагается, что большинство поглощенного фтора сохраняется в корне (Weinstein, Davison, 2004). Аналогичного мнения придерживаются и Божков и др. (2009). Они полагают, что «в интервале

концентраций NaF 1-10 мМ функционирует система «удерживания» ионов фтора в свободном простанстве корня». Считается, что своего рода барьером для фтора является эндодерма (Weinstein, Davison, 2004). Кроме того, возможно ограничение подвижности фтора в результате хелатирования при проникновении в корень. Так же, свободному передвижению фтора по тканям корня могут препятствовать клетки пояска Каспари, ограничивающего апопластный транспорт до симпластного (Михайлова и др, 2006). Поскольку, фтор все же проникает вверх к тканям и органам, вероятно, существует механизм, позволяющий ему транспортироваться по симпласту. Существует модель пассивного поглощения фтора, основанная на действии протонных насосов в клеточных мембранах. Она заключается в формировании HF комплекса, диффузии его через мембраны и дальнейшей диссоциации на Н+ и F" (Weinstein, Davison, 2004).

1.3.1.3. Аккумуляция фтора растениями Поступившие в растение ионы фтора имеют свойство аккумулироваться в его тканях и органах. Первые исследования по накоплению фтора растениями показали, что наиболее богатыми фтором являются листья свеклы, петрушки и чая (несколько сот миллиграммов на 1 кг сухого веса). Так же обнаружено большое содержание фтора в зерновых продуктах (0,2 - 0,7 мг/кг сырого веса) (Власюк, 1969). Более поздние работы показывают повышенное содержание ионов фтора в ассимилирующих тканях и органах растений. По сообщению Беляковой (1997), в культурных растениях фтор в основном накапливается в листьях и стеблях, меньше в плодах. Но имеются и другие данные о наибольшем накоплении фтора другими органами. Потатуева, Копаева (1978) указывают на то, что большая часть фтора в злаковых растениях накапливается в корнях, чуть меньше его в вегетативной массе (солома, листья, стебли) и менее всего фтора содержится в зерне. Аналогичные данные показывают Elloumi et al. (2005). Корни миндаля содержат в 10 раз больше фтора, чем листья. По литературным данным, у лиственных и хвойных деревьев отмечается перемещение фтора из листьев в стебли и корни и перераспределение

его в листьях разного возраста. По мнению Рожкова и Михайловой (1989), перемещение фтора из метаболически активных тканей осуществляется для его деток-сикации.

При определении содержания фтора в растениях важное значение имеет его присутсвие в почве. В своей работе Безикова (1997) прослеживает прямую связь между уровнем фтора в почве и накоплением его в соломе. При содержании фтора в почве 60,6 мг/кг в соломе его накапливалось 43, 7 мг/кг, при 17,6 мг/кг - 35,8, при 1,8 мг/кг - только 28,6 мг/кг.

Важную роль в накоплении фтора играют кислотность почв и расположение вблизи крупных промышленных центров. Увеличение кислотности глинистой почвы способствовало накоплению фтора в листьях томата и гречихи в 38 и 28 раз соответственно (Власюк, 1969). Показано увеличение содержания фтора в хвое сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.) в районе действия аэропромвыбросов Иркутского алюминиевого завода в 1.3-8.7 раз по сравнению с фоновыми значениями (Михайлова и др, 2006). При проведении сравнительного анализа различных видов растений, произрастающих в зоне влияния завода и вне ее, обнаружено, что содержание фтора в органах растений может увеличиваться на три порядка (Томас, 1962). Miller (1993) отмечает, что при постоянном действии фтора на растение, рост его концентраций в тканях листа происходит с почти линейной скоростью. Причем, листовые верхушки и края аккумулируют наивысшие концентрации фторида и являются местом начального видимого повреждения.

1.3.2. Поступление и накопление фтора в клетке

Проникая в растение через устьица или корневую систему, фтор распределяется по всем его органам и тканям. Не ограничиваясь межклеточным простанством, ионы фтора находят пути поступления в клетки растения, преодолевая плазмалем-му. Имеется несколько механизмов транспорта ионов фтора, зависимых от градиента pH. В первом случае происходит перенос фторида в форме HF диффузией. HF

является легко проникающим веществом с коэффициентом проникания, близким к

22

водному. Нейтральные молекулы HF проникают через клеточные мембраны быстрее, чем диссоциированные ионы фтора, в 5-7 раз (Whitford et al., 1994). Вторым механизмом является пересечение фтором мембраны с помощью F~-H+ котранспор-тера или F-OH обменника в присутствии обратно направленного протонного градиента клетки (Gutknecht, Walter, 1981). Далее, поглощенный фтор образует нерастворимые комплексы с катионами, такими как кальций, магний и алюминий (Whitford et al, 1997). Фтор вместе с кальцием образует кальциевые ионосферы, которые легко проницаемы через клеточные мембраны (Sireli, Bulbul, 2004). Однако количество внеклеточного кальция может заблокировать как поступление фтора в клетку через кальциевые каналы, так и его непосредственное влияние внутри клетки. Посредством образования прочных комплексов фтора с катионами - активаторами многих ферментных систем объясняются его некоторые биохимические и клеточные эффекты.

Фтор, проникая в клетку в виде HF и F", способен аккумулироваться в ее ор-ганеллах (митохондриях, хлоропластах и вакуолях). При этом, HF, пройдя через мембрану клетки, диссоциируется внутри на FT и F", где наблюдается градиент рН. Затем ионы фтора проникают в органеллы клетки и накапливаются в них в значительно больших концентрациях. Аккумуляция органеллами клетки фтора также носит рН - зависимый характер. При рН окружающей среды 5.8 и рН цитоплазмы 7.2, основное количество фтора накапливается в митохондриях и хлоропластах, которым соответствуют значения рН 7.8 и 8.0 (Miller, 1993). Как ранее было показано, при концентрации фтора в окружающей среде 3 мМ, он может накапливаться в цитоплазме в концентрациях, превышающих 75 мМ (Miller, 1993). С учетом градиента рН цитоплазмы и органелл и кислотно-зависимых условий накопления фтора, можно предположить, что в митохондриях и хлоропластах его значение будет превышать концентрацию в цитоплазме и окружающей клетку среде. Так, Miller (1993) приводит данные, что если 1,9 ррт (частей на миллион) фторида было в апопласте,

то 47, 298 и 190 ppm было найдено в цитоплазме, хлоропластах и митохондриях, соответственно.

1.3.3. Основы токсичности фтора Многие из видимых последствий действия фтора и метаболические отклонения могут быть объяснены взаимодействиями фтора с кальцием и магнием, и, в меньшей степени, с другими катионами (Miller, 1993; Weinstein, Davison, 2004). В клетке растения кальций строго локализован в определенных ее компартментах с наивысшими концентрациями в клеточной стенке, плазматических мембранах вакуолей, митохондрий и пластид. Кальций, связанный с плазматической мембраной помогает поддерживать стабильность переноса фосфата и карбоксилатных групп. Путем связывания с кальцием, фтор нарушает структуру мембраны и создает вероятность ее разрушения. С другой стороны, кальций способен удерживать фтор и понижать скорость его переноса в транспирационный поток (Weinstein, Davison, 2004).Магний также присутствует в клеточных стенках, вакуолях и цитозоле. Но большая его часть расположена в хлоропластах. Функции магния связаны с его способностю реагировать с лигандами, и заключаются в образовании комплексов между молекулами в качестве соединяющего моста. Самое главное, он является центральным атомом в порфириновой "голове" молекул хлорофилла и активатором деятельности многих ферментов. Образование комплекса магний-фтор возможно только при накоплении фтора в цитоплазме и хлоропластах клетки (Weinstein, Davison, 2004).

1.4. Влияние фтора на растения

1.4.1. Влияние фтора на рост растений Реакция растений на загрязнение фтором, еще до появления симптомов токсичности, в первую очередь проявляется в ослаблении темпов роста. При этом отмечается высокая специфичность различных видов растений к действию фтора. Обработка 10 мМ NaF проростков осины в течение 5 недель ингибировала рост листьев на 67 % (Kamaluddin, Zwiazek, 2003). При изучении действия фтора на томаты и овес оказалось, что рост томатов подавлялся, если концентрация ионов F" в растворе превышала 1,5 мМ, тогда как, для подавления роста овса требовалась более высокая концентрация фтора - 5,1 мМ (Stevens et al., 1998). Другими авторами показано, что обработка NaF в концентрации 50-100 мМ проростков галофита Salicor nia brachiata Roxb не только не вызывала задержки роста, но даже его стимулировала. Только повышение концентрации NaF до 150 мМ несколько ингибировало накопление сырой биомассы S. brachiata (Reddy, Kaur, 2008). Weinstein и Davison (2004) приводят ранее опубликованные данные о том, что непрерывная обработка

о

растений фасоли в открытых камерах HF в концентрации 0,6 мг/m в течение 43 и 99 дней не изменяло вегетативного роста растений. Обработка Phaseolus vulgaris

•5

HF в концентрациях 2 и 4 мг/м в течение 10 недель не снижала сухой массы листьев и стеблей, а в первые три недели даже значительно стимулировала прирост (Reynolds, Laurence, 1988). Некоторые работы посвещены описанию влияния фтора на ростовые процессы отдельных органов растений. Внесение 1 мМ NaF в среду культивирования пшеницы Triticum aestivum. L. не влияло на скорость роста корня. Однако, повышение концентрации до 20 мМ сопровождалось «нарушением структуры стели и коры корня однодневных проростков, редукцией боковой поверхности корневого чехлика» (Божков и др., 2009). Выбросы алюминиевого производства Иркутской области приводили к снижению массы и длины хвои, уменьшению длины, объема и поверхности побегов хвойных пород деревьев (Михайлова, 2006). Добавление 2,5 мМ NaF в среду культивирования каллусных штаммов лиственниц L. sibirica и L. gmelinii вызывало остановку роста, однако при этом была отмечена высокая вариабельность относительного прироста по отдельным каллусным культурам (Матяшенко и др., 2005). Рост суспензионной культуры клеток табака

25

(Nicotiana tabacum L.) замедлялся при концентрации KF ОД мМ. В присутствии 4 мМ KF рост культуры практически полностью подавлялся (Еникеев и др., 2010). Больше данных по влиянию фтора на рост культуры клеток нами не найдено.

1.4.2. Влияние фтора на жизнеспособность растений

Влияние фтора на жизнеспособность растений различается в зависимости от вида растения. Содержание фтора в соломе от 28,6 до 43, 7 мг/кг не оказывало никакого влияния на урожайность зерна (Безикова, 1997). При обработке 10 мМ NaF проростков осины в течение 5 недель жизнеспособность, измеряемая по выходу электролитов, снижалась на 30 %, а содержание хлорофилла, используемый как показатель жизнеспособности, наоборот повышался. При этом был значительно подавлен рост листьев (67 %) (Kamaluddin, Zwiazek, 2003). Использование NaF в диапазоне концентраций от 1 до 10 мМ после первого дня обработки снижало скорость дыхания, фотосинтеза, содержание воды и количество углеводов у проростков сосны. Однако на седьмой день обработки ряд физиологических параметров восстанавливался до контрольного уровня. За время проведения исследований отмечено подавление роста проростков (Zwiazek, Shay, 1988). По другим данным, нео

прерывное действие 0,6 мг/m фтора на фасоль (Phaseolus vulgaris) приводило к значительному сокращению числа и массы бобов, снижения вегетативного роста при этом не отмечалось (Weinstein, Davison, 2004).

Подобная картина наблюдалась при обработке фтором водорослей и водных растений. В то время, когда рост численности Rhodomonas. lens стимулировался на 20-30 % при концентрациях фтора от 25 до 100 мг/л воды, темпы роста Pavlova lu-theri, Amphidinium carteri и Nitzschia angularis var. affinis были ингибированы на 2530 % при концентрации фторидов 100 мг/л. Причем, тормозящее рост водорослей действие фтора не сопровождалось признаками лизиса клеток. Там же указаны данные о том, что листья ряски Spirodela polyrrhiza могут содержать большое количество фтора с максимумом 918 мкг/г сухого веса после воздействия 20 мг/л фтора в течение 7 дней. При этом существенных изменений в содержании хлорофилла и белка не отмечалось. Макрофит Hydrilla verticillata в тех же условиях мо-

жет содержать фтора до 1892 мкг/г сухого веса, однако содержание хлорофилла и белков у него сокращается (Camargo, 2003).

Как видно, влияние фтора на рост растений не коррелирует с действием его на жизнеспособность. Причем, различные виды растений достаточно специфично реагируют на действие полютанта.

1.4.3. Видимые повреждения, вызываемые действием фтора Токсическое действие фтора на растения проявлятся в повышении уровня дефолиации крон (до 70 %), визуальных морфоструктурных изменениях фотосинтетических органов (массы, длины, объема и поверхности побегов).

Видимые поражения листьев появляются при концентрации фтора в воздухе менее 0,1 мг/м3 (Томас, 1962). Характер и глубина воздействия фтора на растения зависят от количества и химических свойств вещества, а также от определяемой генотипом и условиями среды устойчивости растений (Илькун, 1978).

К видимым повреждениям растений фтором отностятся и развитие хлорозов и некрозов. Некроз - это пассивная форма гибели клеток. Более подробное описание некрозов будет проведено ниже. Некроз наблюдается, как правило, в присутствии относительно высоких концентраций фтора, либо при длительном воздействии. Длительное воздействие фторсодержащих эмиссий алюминиевого производства характеризовалось развитием апикальных некрозов на хвое сосны обыкновенной (Р. sylvestris L.) (Михайлова и др., 2006).

1.4.4. Клеточные и структурные изменения при действии фтора Несмотря на очевидную способность фтора влиять на функционирование плазматических мембран, имеется очень мало исследований этого важного аспекта токсичности фтора. В проростках белой сосны (Pinns strobus L.), обработанных в течение 2 дней 0.4- 1.6 мг/м3 HF, отношения свободных стеринов к фосфолипидам и белкам плазмалеммы, а так же активность АТР-синтазы плазматической мембраны были выше, чем в контроле. Авторы считают, что изменение состава плазматической мембраны является первым проявлением действия фтора (Rakowski, Zwiazek, 1992; Rakowski et al., 1995).

Гистохимические исследования поврежденных фтором растений показали, что изменения, во-первых, происходят в губчатом мезофилле и нижнем эпидермисе, за которыми следует деформация и разрыв хлоропластов в палисадных клетках. Верхний эпидермис проявляет только деформацию или коллапс (Lovelace, Miller, 1967). Показана незначительная дезорганизация клеток мезофилла у сои спустя 3 дня после обработки HF при концентрации 40 ppb (частей на миллиард). Позже разрушалось незначительное число клеток губчатого мезофилла и нижних эпидер-мальных клеток. Спустя 6 дней клеточная организация нарушалась, хлоропласты нельзя было различить (Wei, 1972). Miller (1993) показал, что первое заметное клеточное изменение при обработке HF состояло в расширении и агрегировании эндо-плазматического ретикулума. На второй день фумигации в цитоплазме формировались слабые маленькие вакуоли, а хлоропластах аккумулировался фитоферритин. При дальнейшей фумигации липидные капли аккумулировались в цитоплазме; ми-тохондриальные мембраны характеризовались легким набуханием. В это время то-нопласт распадался на везикулы, множество мультивезикулярных телец появлялось в цитоплазме. Позднее начинали дегенерировать митохондрии, но хлоропласты оставались незатронутыми после пяти дней фумигации.

1.4.5. Влияние фтора на ферментативную активность Фтор оказывает действие на широкий спектр ферментов, связанных с гликолизом, дыханием, фотосинтезом и другими метаболическими реакциями. Пожалуй, самым известным примером является подавление фтором активности энолазы, катализатора превращения 2-фосфоглицериновой кислоты в фосфоенолпируват. Для

2+

активации энолазы необходимо присутствие свободного Mg , а связывание этого катиона с фтором нарушает этот процесс. В отсутсвие свободного магния, активация энолазы может происходить в присутствие Мп2+, Со2+, и Zn2+, однако их действие является малоэффективным (Miller, 1993; Weinstein, Davison, 2004). Имеются данные о том, что NaF подавляет активность энолазы у Pisum в концентрациях 0,110 мМ (Weinstein, Davison, 2004).

Впрочем, действие фтора на энолазу характеризуется не только ее подавлением, но и стимулированием. Так, обработка растений Phaseolus, Glycine и Sorghum

•5 л

газообразным фтором в концентрациях 1.7-2.6 мкг/м в течение 10 дней, 8.2 мкг/м

о

за 24-144 ч и 5 мкг/м в течение 11 дней, соответственно, стимулировала активность фермента (Weinstein, Davison, 2004). Действительно, фтор способен стимулировать активность многих ферментов, хотя в большинстве случаев проявляет ин-гибирующее действие. Причем многое зависит и от типа фермента (Adamek et al., 2005). Фтор в микромолярных уровнях считается эффективным анаболическим агентом, поскольку способствует пролиферации клеток, в то время как в миллимо-лярных концентрациях ингибирует несколько ферментов, в том числе фосфатазы (Mendoza-Schulz et al., 2009).

Механизм торможения фторидом фосфоглюкомутазы, также основан на связывании магния с фтором. Ингибирование фермента отмечается при использовал

нии 25 мкг/м газообразного фтора в течение 3-5 дней для Glycine и при 10 мМ NaF у Avena за 1 час (Weinstein, Davison, 2004).

Ингибирование фтором остальных ферментов, вероятнее всего, основано на таком же принципе - связывании иона, активатора ферментативной активности. В случае, гемсодержащих ферментов, таких как цитохромоксидаза, каталаза и перок-сидаза, фтор ингибирует их активность, образуя комплекс с железом. Со многими другими металл-активируемыми ферментами фтор реагирует слабо. Так, цинксо-держащий фермент, карбоангидраза, молибденсодержащие ферменты, нитратре-дуктазы и другие не очень чувствительны к фтору (Weinstein, Davison, 2004).

Чувствительны к низким концентрациям фторида и мембранные АТФ синта-зы. Показано, что Н+-АТФ-синтаза ингибируется как фтором, так и фторалюминие-вым комплексом в концентрациях до 2 мМ (Facanha, Meis, 1995; Murphy, Hoover, 1992). Активность некоторых ферментов, такие как глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа, каталаза и пероксидаза, усиливается в присутсвии фтора в условиях in vitro (Miller, 1993).

1.4.6. Влияние фтора на фотосинтез Литературные данные о действии фтора на фотосинтез достаточно противоречивы. По некоторым данным, даже при высоких концентрациях фтора ингибиро-

•з

вания фотосинтеза не происходит. HF в концентрации 2-3 мг/м в течение 100 дней

29

не влиял на фотосинтез (Weinstein, Davison, 2004). Несмотря на это, большинство работ указывают важную роль фтора при «затуханиии» фотосинтеза. Отрицательное влияние фтора на фотосинтетический аппарат растений связано с ингибирова-нием ранних стадий синтеза пигментов, распадом хлорофилла и каратиноидов, а также с деструкцией хлоропластов (Илькун, 1978). В работах по обработке HF хвойных видов деревьев показано, что сильно поврежденные образцы содержали хлорофилла на 30 % меньше, чем в контроле. На ранних этапах обработки действия фтора на количество хлорофиллов не отмечалось. Содержание каратиноидов подвергалось меньшим изменениям при тех же условиях (Рожков, Михайлова, 1989). Weinstein и Davison (2004) выделяют несколько вероятных изменений в структуре хлоропластов при действии фтора: грануляция стромы и кристаллических включений, растяжение оболочек хлоропласт, отек тилакоидов иа расширение их мембран, накопление электронно-плотных пластоглобул, неполная дифференциация пластид.

1.4.7. Влияние фтора на дыхание

Фтор относится к ингибиторам дыхания, вызывая серьезные последствия. Тем не менее, множество опубликованных работ сообщают об увеличении дыхания при обработке фтором. Такие данные зафиксированы в случае использования ин-тактных растений, а также тканей, подверженных фумигации HF при наличии или отсутствии поражений листвы (Miller, Miller, 1974; Weinstein, Davison, 2004). Некоторые исследователи показали, что при низких концентрациях или кратковременном воздействии фтора происходит стимулирование поглощения 02, но при увеличении концентрации и времени действия скорость поглощения замедляется (McLaughlin, Barnes, 1975). Yu и Miller (1967) сообщают о способности фтора в низких концентрациях усиливать потребление 02. Это действие фтора схоже с действием 2,4-динитрофенола. Вероятно, фтор проявляет разобщающее действие на электрон-транспортную цепь.

Существует мнение, что подавление фтором дыхания зависит от возраста растений и тканей, состава и статуса питательных веществ. Связь между торможе-

нием дыхания и возрастом ткани может быть объяснена переходом от гликолити-ческого к пентозофосфатному пути окисления глюкозы, который происходит по мере старения клеток (Weinstein, Davison, 2004).

По большей части, ингибирование фтором дыхания обосновано чувствительностью некоторых гликолитических ферментов к фтору.

1.4.8. Влияние фтора на другие процессы

Поддержание равновесия окислительно-восстановительных процессов имеет особое значение при действии поллютантов, поскольку они способны вызывать свиг внутриклеточной среды в кислую сторону, и, следовательно, провоцировать активацию гидролитических ферментов. Это может привести к развитию в клетках оксилительного стресса. Одним из сильных антиоксидантов является аскорбиновая кислота. Недостаток аскорбиновой кислоты может привести к серьезныму окислительному стрессу клетки. Как показано, с самого начала действия HF у хвойных пород происходит быстрое окисление аскорбиновой кислоты. Впрочем, при дальнейшем поступлении токсиканта в клетку наблюдается тенденция к возрастанию количества аскорбата и одновременная активация антиоксидантных ферментов (пероксидазы) (Рожков, Михайлова, 1989).

Kamaluddin и Zwiazek (2003) сообщают об ингибировании фтором водного транспорта растений. Повышенное содержание газообразных и твердых фторидов в атмосфере и почве отрицательно сказываеся на транспирации и поступлении воды еще до появления видимых повреждений. В присутствии HF повышение интенсивности общей транспирации сопровождается постепенным увеличением кутику-лярной и снижением устьичной транспирации уже при низких концентрациях токсиканта (0,2 нМ) (Patalakh, Grishko, 2000). Помимо нарушения процессов транспирации у обработанных фтором растений отмечено постепенное ослабление поглощения воды корнями, которое проявляется тем сильнее, чем выше действующая концентрация газа (Илькун, 1971). Снижение ассимилирующей деятельности деревьев приводит к снижению поступления фотоассимилятов в корни, тем самым замедляется скорость ксилемного тока. Снижение интенсивности восходящего тока сопровождается снижением влажности растения, и, затем, к обводненности. Потеря

воды хвоей деревьев происходит параллельно процессу ее повреждения и накопления фторидов (Рожков, Михайлова, 1989).

Фтор способен нарушать азотный обмен. Азот в организме растений входит в состав белковых молекул. При действии фтора на растения наблюдается повышенное содержание небелкового азота. Так, у лиственницы при слабом повреждении фтором количество небелковлого азато повысилось до 46 % относительно контроля, у ели - до 68 %, а у сосны - до 53 %, но лишь при сильном повреждении (Рожков, Михайлова, 1989).

Среди эффектов фтора на организм растений немаловажным является его влияние на мутационный процесс. Так, фумигация растений лука (Allium сера L.), томатов (Lycopersicon esculentum Mill.) и кукурузы (Zea mays L.) фтороводородом в концентрации, не вызывающей морфологических изменений (0,003 мг/м3), или обработка их 0,1 M раствором фторида натрия приводит к появлению наследственных изменений на уровне митотических хромосом, проявляющихся в заержке и мультиполярности анафаз, появлении мостов, тетраплоидии ядер (Mochamed, 1970). Кроме того, предполагается, что фтор инактивирует ферменты, ответственные за репарацию поврежденной ДНК и, тем самым, способен нарушать постреп-ликационную репарацию (Никифорова, 1982). Также, фтор способен разрушать сруктуру молекул ДНК и РНК (Barbier et al., 2010; Weinstein, Davison, 2004; KamaluddiT, Zwiazek, 2003).

Атмосферные загрязнения, включая соединения фтора, также вызывают изменения в мужской и женской генеративной сфере растений, степень которых зависит от концентрации выбросов (Осколков, Воронин, 2003).

1.4.10. Программированная клеточная смерть ПКС (англ. "programmed cell death", PCD) - это «форма гибели клетки, являющаяся результатом реализации ее генетической программы или ответом на внешние силы и требующая затрат энергии и синтеза макромолекул de novo» (цит. по Ярилин, 2003). Принципиальное отличие ПКС от пассивной или случайной гибели клеток, часто ассоциируемой с термином «некроз», заключено в самом её названии. ПКС - это активный, высокоупорядоченный, генетически обусловленный и

жёстко регулируемый процесс. Ещё одной отличительной чертой ПГК является то, что гибель клетки до самых последних стадий происходит при сохранении целостности и поддержании барьерных свойств цитоплазматической мембраны. В настоящее время многие ассоциируют ПКС с термином «апоптоз».

Апоптоз - это «форма гибели клетки, проявляющаяся в уменьшении её размера, конденсации и фрагментации хроматина, уплотнении наружной и цитоплазматической мембран без выхода содержимого клетки в окружающую среду» (цит. по Ярилин, 2003). Вне зависимости от происхождения клеток наиболее принципиальными для идентификации ПКС эукариот являются активация специфических эндонуклеаз и последующая фрагментация генетического материала (часто сопровождается фрагментацией ядра), участие специфических цистеиновых протеаз (каспаз) запускающих и амплифицирующих каскад реакций приводящих к гибели, развитие процесса во времени, его обособленность от внешнего пространства (сохранение целостности и барьерных свойств плазматической мембраны), зависимость от содержания АТФ, часто синтеза молекул de novo. Другими, по всей видимости, неспецифическим маркерами ПКС являются повышение продукции активных форм кислорода (АФК), появление фосфатидилсерина в наружном бис-лое цитоплазматической мембраны, высвобождение из межмембранного пространства митохондрий сигнальных молекул, таких как цитохром с (Skulachev, 2006).

Некроз - это пассивная форма гибели клеток., проявляющийся в виде набухания клетки и разрыва мембраны вследствие повышения ее проницаемости и выходом содержимого клетки в среду. Для некроза характерно нарушение целостности плазматической мембраны на ранних этапах процесса и отсутствие выраженной закономерности в морфологии клетки. Часто некротической гибели подвергаются сразу большие группы клеток (Kerr et al., 1972). Некроз наблюдается как первичный механизм гибели клеток растений в присутствии относительно высоких концентраций фтора. Хлорозы и некрозы проявляются одними из первых видимых поражений фтором. Эти симптомы возникают при действии растворимых соединений фтора. Обработка 5.26-10"3 М NaF в течение 24 ч снижала содержание в побегах Phaseolus vulgaris и Glycine max хлорофиллов а и b, протохлорофиллов и кара-

тиноидов. Последующая обработка приводила к дальнейшему сокращению в уровне содержания пигментов. Так же отмечена корреляция между сокращением количества свободного магния и развитием хлорозов с одновременным разрушением хлоропластов. Хотя при этом трансформация протохлорофилла в хлорофилл не нарушалась (McNulty, Newman, 1961). Длительное воздействие фторсодержащих эмиссий алюминиевого производства так же характеризовалось развитием апикальных некрозов на хвое сосны обыкновенной (Михайлова, 2006).

Многими исследователями показано развитие апоптоза при действии фтора у животных и человека (Anuradha et al., 2001; Otsuki et al., 2005). Апоптоз клеток животных, вызванный действием фтора сопровождается: 1) выходом цитохрома С из митохондрий в цитозоль (Anuradha et al., 2001; Adamek et al., 2005); 2) активацией каспазного каскада (с повышенной активностью каспазы-3, -8 и -9) (Holme et al., 2003; Lee, 2008); 3) продукцией активных форм кислорода (АФК) (Barbier et al., 2010; Izquierdo-Vega , 2008; Garcia-Montalvo et al., 2009); 4) потерей митохондрией мембранного потенциала (Garcia-Montalvo et al., 2009); 5) экспрессией и регуляцией про- и антиапоптозных генов (Barbier, 2010); 6) расщеплением Poly (АДФ-рибозной) - полимеразы и экспрессией анионных каналов (Lee, 2008).

Не смотря на множество работ по развитию апоптоза и ПКС в целом в клетках животных и человека, вызванных действием фтора, нет сообщений о развитии этих механизмов или их отсутствии в клетках растений. В связи с этим этот вопрос до сих пор остается открытым и требующим изучения.

1.4.9. Влияние фтора на восприятие растениями действия биотических и

абиотических факторов 1.4.9.1. Свет

Предполагается, что свет оказывает влияние на действие фтора, поскольку он играет важную роль в определении устьичной проводимости. Как сообщается, растения подвергаются меньшему воздействию фтора в темное время суток. При этом накопление фтора листьями в темноте снизилось в 2 раза, чем при солнечном освещении. Однако, повышение концентрации фтора в темноте все же вызывало развитие повреждений (Weinstein, Davison, 2004). Рожков и Михайлова (1989) так

же приходят к мнению о большей поражаемости растений на свету. При солнечном освещении отмечалась высокая степень повреждения фтором даже у относительно газоустойчивых растений (тополя, ивы). При затемненных условиях степень ожогов, вызванных действием фтора, была пониженной. По другим данным, люцерна при обработке HF в темноте накопила в листьях такое же количество фтора, что и на свету (Benedict et al., 1965). Хотя, вполне возможно, что устьичная проводимость была не очень высокой во время светового периода и что устьица могли остаться частично открытыми на ночь.

1.4.9.3. Дефицит воды Дефицит воды обычно приводит к сокращению устьичной проводимости и газообмена, поэтому не удивительно, что при недостатке влаги влияние газообразного фтора на растения будет снижено. Экспериментально показано, что растения, выращенные в условиях водного стресса, как правило, более устойчивы к воздействию фтора, чем растения, которые получали достаточное количество воды. С другой стороны, в полевых условиях растения, без достаточного водоснабжения проявляют большие повреждения фтором, чем на соседних орошаемых территориях (Weinstein, Davison, 2004). Это противоречие может быть объяснено тем, что растения полузасушливых мест обитания могут накапливать высокие концентрации фтора.

1.4.9.4. Другие элементы и токсиканты Фторсодержащие соединения обладают высокой реакционной способностью, легко взаимодействуют с другими компонентами выбросов, что может приводить к усилению их поступления и действия (синергический эффект) или снижению поступления других элементов (антагонистический эффект) в живые организмы (Михайлова, 2006). Ранее показано, что наибольшее количество фтора в листьях томата отмечается при средних уровнях азота и кальция и высоких уровнях фосфора в питательном растворе (Власюк, 1969). Очень высокие концентрации Са2+ предотвращали повреждения фтором растений томата (Weinstein, Davison, 2004). Rozhkov, Mikhailova (1993) выявили усиление поражения растений в десятки раз в присутст-

вие в атмосфере фтористого водорода в сочетании с диоксидом серы, окислами азота и углерода. Существует доказательство того, что хронические повреждения фтором связаны с низким содержанием в листьях цитрусовых Мп2+ и Mg2+. Многие повреждения фтором широколиственных пород напоминают дефицит Mn2+, Zn2+ и Mg2+. По этой причине предполагается, что хроническое действие фтора связано дефицитом определенных питательных элементов (Weinstein, Davison, 2004). В угнетенные фторсодержащими выбросами Шелеховского промцентра древостоях сосны обыкновенной (Р. sylvestris L.) выявлено увеличение содержания азота на 45 %, натрия - 43 %, кальция - 40 %. Содержание серы при этом возрастало в 2-3 раза, по сравнению с подверженными загрязнению растениями. Так же в хвое отмечен повышенный уровень кремния, свинца, кадмия, алюминия, ртути. Концентрация калия и фосфора в хвое загрязняемых деревьев снижается на 25 и 34 %, соответственно (Михайлова, 2006).

Отдельного внимания заслуживает совместное действие фтора с другими токсикантами. Так, деревья лиственницы сибирской, обработанные фторидом водорода в комбинации с хлором и сернистым ангидридом, проявляют повышенное повреждение даже за более короткие сроки воздействия (Рожков, Михайлова, 1989). Эти данные согласуются с ранее проведенными исследованиями на сельскохозяйственных культурах (TenHouten, 1974). Кроме синергического эффекта, Рожков и Михайлова (1989) показали доминирующее токсическое действие фторида водорода и множественный синергический эффект с еще большим ускорением гибели деревьев.

1.4.9.5. Биотические взаимодействия

Хорошо известно, что вызываемые патогенными микроорганизмами заболевания, могут быть изменены при подвергании растения-хозяина некоторым загрязнителям (Heagle, 1973; Hughes, 1985). В литературе существует значительное количество доказательств того, что изменения в частоте и тяжести болезней растений связано с загрязнением воздуха. Данных по действию фтора на развитие патоген-индуцированных заболеваний в литературе нет. Все публикации по исследованию

фтора являются лабораторными исследованиями, направленными, в основном, на изучение влияния фтора на патоген. Известно отсутствие прямого воздействия 0,2 М NaF на рост гриба Verticillium lecanii. Дальнейшее повышение концентрации фтора снизило его рост. Рост гриба Pythium debaryanum также подавлялся при концентрации NaF всего 5 мкМ. Однако рост гриба Colletotrichum lindemuthianum наоборот стимулировался 1 мМ NaF (Weinstein, Davison, 2004). Способность фтора подавлять рост почвенной биоты позволяет преположить о косвенном угнетении растений в случае симбионтных взаимоотношений.

В зависимости от степени нарушения физиологических процессов под действием фтора возникающие изменения носят либо защитный характер, либо свидетельствуют о необратимом ослаблении растения. Смолистые вещества являются основным средством защиты хвойных деревьев от насекомых-фитофагов. При уменьшении общего содержания смол у сосны до 5 % и ниже происходит переход дерева из категории ослабленных, но еще резистентных к заселению ксилофагов, в категорию легко доступных для заселения. У ели и лиственницы этот показатель несколько выше (Рожков, Михайлова, 1989). Существует обратная связь между накоплением фтора в тканях деревьев и содержанием в них защитных веществ. Так, максимальному насыщению фтором соответствует более сильное угнетение синтеза смолистых веществ. При повышении насыщения хвои лиственницы и ели фтором в 4.5 раза в условиях действия алюминиевых заводов, количество смол сокращается на 50 %. В случае сосны - на 30 % (Рожков, Массель 1982). Таким образом, нападение стволовых вредителей на деревья становится более вероятным. Ослабление фтором растения, вероятно, может создать благоприятные условия и для атаки микроорганизмов.

1.4.9.2. Температура

Имеется сравнительно не много информации о взаимосвязи температуры и ответом растения на фтор. Считается, что негативное действие фтора на растение проявляется с повышением температуры. Так растения сои выращиваемые при

температуре 32°С днем n 23°С ночью после воздействия HF имели более тяжелые повреждения, чем растения, выращиваемые при 23 и 16°С днем и ночью, соответственно (Weinstein, Davison, 2004). Кроме того, показано, что атмосферное загрязнение фтором может приводить к повышению чувствительности растений к повышенной температуре. Если повышение дневной/ ночной температуры до 43/ 30°С не вызывало повреждений листьев сои (Glycine max (L) Merr.) в контроле, то предварительная их обработка фтором привела к развитию визуальных повреждений после действия указанных температур в 1.5-2 раза, в сравнение с повреждениями от самого фтора. (Wiebe, Poovaiah, 1973). Механизм такого действия фтора еще не показан.

1.5. Стрессовые белки и адаптация к действию высоких температур

Общим для всех видов растений ответом на действие стрессора является и индукция синтеза стрессовых белков. Присутствие таких белков в клетке носит временный характер и, обычно, зависит от продолжительности, интенсивности, диапазона и других параметров стрессового воздействия (Блехман, 1988; Косаков-ская, 2008). На сегодняшний день достаточно детально изучена реакция растений на тепловой стресс. Обратимые изменения белковых молекул клеток дрозофилы при 37°С были зарегистрированы Ф. Ритоза еще в середине 20-го века. Позднее это явление было объяснено синтезом белков de novo, получившими название «белки теплового шока» (БТШ) (Ritossa, 1962, цит по Ashburner, Bonner, 1979). Дальнейшее изучение БТШ различных видов растений расширило рамки познания функционирования белковой системы в ответ на тепловой стресс (Войников и др. 1984, 1986; Kimpel, Key, 1985). На данный момент известно, что мягкий тепловой стресс индуцирует синтез БТШ и одновременно способствует развитию адаптационного механизма - индуцированной термотолерантности (Howarth, 1991; Piper, 1993; Kregel, 2002).

1.5.1. Явление индуцированной термотолерантности В основе адаптации растений к высокой температуре лежит их термотолерантность (Vierling, 1991). Способность выдерживать повышенные температуры является генетически наследуемой, или базовой (Larkindale et al., 2005). Также имеются данные о устойчивости организмов к температурам выше оптимальных, развивающейся после предварительного воздействия мягкого теплового стресса. Так, непродолжительное воздействие повышенной температуры (на 10-12°С выше оптимальной) не только не повреждает клетки, но и способствует их большей устойчивости к действию летальных температур. В этом случае речь идет о приобретенной, или индуцированной термотолерантности (Saidi et al., 2011; Richter et al., 2010). Индуцированная термотолерантность была описана более 40 лет назад (цит.

по Vierling, 1991; Larkindale et al., 2005). Тепловые обработки, при которых проис-

39

ходит развитие индуцированной термотолерантности, специфичны для различных организмов. Для Arabidopsis thaliana такой температурой является 37°С (Hong et al., 2003), для дрожжей Saccharomyces cerevisiae - 37-39°С (Рихванов, Войников, 2005), а для термофильной бактерии Sulfolobus sp. 88°С, при обычной для нее температуре роста 70°С (Trent et al., 1990).

На молекулярном уровне механизм индуцированной термотолерантности включает как минимум три типа ответных реакций: реакции, связанные с предотвращением денатурации белков; реакции, связанные с ответом антиоксидантной системы (поскольку тепловой стресс индуцирует генерацию АФК); и реакции, направленные на снижение количества легко повреждаемых молекул и процессов. Кроме того, на уровень термотолерантности растительной клетки большое влияние оказывает степень насыщенности жирных кислот (Sung et al., 2003) и содержание глицинбетаина (Alia et al., 1998) и пролина (Колупаев и др, 2005). Относительно мало известно о сигнальных путях, контролирующих базовую и индуцированную термотолерантность, хотя, предполагается, что в этом могут участвовать гормоны, кальций и окислительно-восстановительные сигналы (Larkindale, Knight, 2002).

1.5.2. Белки теплового шока

Процесс развития индуцированной термотолерантности сопровождается синтезом молекулярных шаперонов или БТШ во время мягкого теплового стресса (Vierling, 1991; Sung et al., 2003). По результатам применения радиоактивно меченой аминокислоты для регистрации синтеза белков de novo и их анализом методом электрофореза сложилась классификация БТШ на высокомолекулярные (110-60 кД) и низкомолекулярные (ниже 42 кД) (Lindquist, 1986; Lindquist, Craig, 1988; Vierling, 1991). Однако, такая классификация не отражает функций БТШ и к сегодняшнему моменту уже почти не применяется для названия новых белков. Но, за многими белками, впервые идентифицированными как БТШ, сохраняется это наименование. Названия «низкомолекулярные БТШ» (нмБТШ), Hsp90, Hsp70 и т.д.

остаются общеупотребляемыми и используются, главным образом, в отношении

40

РОССИЙСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ БИБЛИОТЕКА

шаперонов, синтез которых резко увеличивается при тепловом стрессе. Белки уби-квитин и металлотионины также принадлежат к семейству БТШ (Yaagoubi et al., 1997).

Экспрессия синтеза БТШ начинается уже через 15 минут от начала стресса, достигая максимума на 2,5 ч, и заканчивается через 6-8 ч. Особенностью растительных клеток является синтез нмБТШ с молекулярной массой 15-18 кД. Высокомолекулярные БТШ растений менее разнообразны, чем у других организмов. За биосинтез БТШ отвечают и ядерная, и цитоплазматическая генетические системы, однако, локализация их осуществляется преимущественно в цитоплазме с образованием гранул теплового шока (Косаковская, 2008).

Шапероны функционируют во многих клеточных компартментах, и их локализация зависит от окружающих условий. Взаимодействие их между собой приводит к образованию мультишаперонных комплексов. Подобные взаимодействия обеспечивают эффективный биогенез клеточных белков как в условиях стресса, так и при оптимальных условиях (Stirling et al., 2003).

По способу взаимодействия с субстратными белками, шапероны можно разделить на несколько групп. «Холдазы» (англ. "holdases") - шапероны, предотвращающие неспецифическую агрегацию развернутых полипептидов не зависимо от АТФ. Однако для реактивации субстратного белка требуется присутствие АТФ-зависимых шаперонов (нмБТШ и ко-шаперонов семейства Hsp40) (Wegrzyn et al., 2001; Haslbeck et al., 2005). Некоторые АТФ-зависимые шапероны принимают участие в фолдинге полипептидов, поэтому получили название «фолдазы» (англ. "fol-dases"). Фолдазы, как правило, имеют АТФ-связывающий домен и, посредством изменения его термодинамических характеристик, способствуют продуктивному фолдингу денатурированных белков.

Показано, что протекторное действие БТШ не огранивается устойчивостью

только к тепловому стрессу. У животных индукция БТШ сопровождалась

повышенной устойчивостью к хемотерапевтическим агентам, ультрафиолетовому

излучению, фактору некроза опухолей (Beere, 2004). У цианобактерий

41

окислительный стресс индуцировал синтез некоторых БТШ (Mittler, Tel-Or, 1991). У растений БТШ способствуют повышенной устойчивости к действию патогенов, окислитеному и холодовому стрессам (Banzet et al., 1998). Часто, действие одного стрессового фактора способствует развитию устойчивости организма к другим стрессорам. Это явление известно в литературе как «перекрестная устойчивость» или «кросс-резистентность» (Медведев, 2004). Вероятно, этим механизмом объясняется и разносторонне направленное действие БТШ. Кроме того показано, что функции БТШ не ограничиваются восстановлением повреждённого фолдинга, они ещё могут выполнять антиапоптозную роль (Parcellier et al., 2003).

Для развития индуцированной термотолерантности у растений, дрожжей и бактерий особенно важна роль белков семейства БТШ 100 (Hong, Vierling, 2000; Lee et al., 2007).

1.5.2.1. Семейство БТШ 100 (Clp/HsplOO) Белки HsplOO принадлежат к семейству ААА+-белков (англ. "ATPases associated with various cellular activities"). Особенностью HsplOO шаперонов является АТФ-зависимая способность диссоциировать агрегированные белки (цит. по Мельников, Ротанова,2010; Parsell et al., 1994). Белки этого семейства широко распространены среди прокариот и эукариот (Katiyar-Agarwal et al., 2001). Впервые члены этого семейства были описаны как компоненты системы С1р-протеаз. Большая субъединица ClpA представляет собой АТФ-зависимую «анфолдазу», а маленькая субъединица - ClpP является протеазой (Schirmer et al., 1996). Общее количество членов семейства насчитывает более 70 белков, их размер варьирует от 84 до 104 кД. Структура представляет собой два кольца, расположенных одно под другим (додекамер) (Schirmer et al., 1996). Иногда межсубъединичные взаимодействия ААА+-модулей приводят к образованию гептамерных структур (цит. по Мельников, Ротанова,2010)

Показано, что наибольшее влияние на развитие индуцированной термотолерантности A. thaliana оказывает белок HsplOl. У дрожжей был найден его гомолог, ScHspl04, на 43 % идентичный AtHsplOl (Schirmer et al., 1994). Гены

гомологичные AtHSPlOl обнаружены и в других растениях, но не обнаружены у млекопитающих и насекомых (Agarwal et al., 2003). Делеция, мутации или ингибирование экспрессии гена AtHSPlOl, значительно снижают способность клеток A. thaliana выдерживать летальный тепловой стресс после мягкой тепловой предобработки (Hong, Vierling, 2000; Queitsch et al., 2000). Белки семейства HsplOO экспрессируются в процессе нормального развития, а также при различных стрессах (тепловом, низкотемпературном, повышении содержания солей и тяжелых металлов) (Vierling, 1991; Schirmer et al., 1996).

Наличие белка ^HsplOl не является обязательным условием для жизнедеятельности клетки в отсутствии повреждающего теплового стресса. Также не наблюдается фенотипических отличий у проростков A. thaliana с мутацией hotl-1, Т-ДНК инсерцией в этом же гене AtHSPlOl (Hong, Vierling, 2000) или в случае экспрессии гена AtHSPlOl в антисмысловой ориентации (Queitsch et al., 2000).

В геноме A. thaliana идентифицировано несколько генов, гомологичных AtHSPlOl и относящихся к семейству (Clp/Hspl01). Белок С1рВ-р локализуется в пластидах, а белок ClpB-m - в митохондриях. Мутанты по этим генам не отличались от дикого типа по способности индуцировать термотолерантность в проростках арабидопсиса (Lee et al., 2007). В то же время, антисмысловое РНК-ингибирование экспрессии гена, кодирующего С1рВ-р в растениях томата, приводило к подавлению способности растений выдерживать жесткий тепловой стресс после умеренного теплового воздействия (Yang et al., 2006). Хотя другие авторы показали, что мутанты арабидопсиса по генам С1рВ-р и ClpB-т не отличались от проростков дикого типа по развитию индуцированной термотолерантности. Более того, мутация по гену ClpB-т является летальной, так как мутантные проростки не могли накапливать хлорофилл (Lee et al., 2007), поэтому С1рВ-р, возможно, имеет и другие функции (Yang et al., 2006).

Предложено две модели работы ScHspl04/AtHspl01. Согласно первой модели (теория лома) АТФ-связывающие домены, расположенные по периметру шапе-

рона, служат сайтами связывания для агрегированных полипептидов. В ответ на связывание и гидролиз АТФ происходят конформационные изменения в этих доменах, что обеспечивает механическую силу для разрушения белковых агрегатов (Bosl et al., 2006; Мельников, Ротанова, 2010).

Вторая модель (теория решета) предполагает, что полипептидная цепь извлекается из агрегата в результате транслокации через канал шаперона посредством развертывания и перетаскивания (Bosl et al., 2006). В литературе имеются данные, подтверждающие обе эти теории. Таким образом, AtHsplOl может разбивать большие агрегаты на мелкие с помощью MR доменов, имеющих пропеллеровид-ную структуру (теория лома), а более мелкие протягивать сквозь аксиальный канал (теория решета) (Weibezahn et al., 2005).

Было показано, что, выполняя свои функции в индуцированной термотолерантности, HsplOO взаимодействуют с Hsp70 (Мельников, Ротанова, 2010) и sHsps (Hspl7.6 I и II класса) (Lee et al., 2005). В целом становится понятным, что шаперо-ны взаимодействуют между собой, образуя сложную сеть для восстановления поврежденных нагреванием белков (Мельников, Ротанова, 2010).

1.5.2.2. Регуляция экспрессии БТШ Ответ на тепловой стресс является высоко консервативным и характеризуется быстрой индукцией БТШ, основная функция которых -способствовать поддержанию и коррекции многих клеточных белков при высокой температуре. Показано, что у всех эукариот ответ на тепловой стресс регулируется транскрипционными факторами теплового шока (Hsf - от англ heat shock factor). Hsf присоединяются к консервативному цис-элементу теплового шока (HSE), палиндромному мотиву nGAAnnTCCn в промоторе целевых генов (Miller, Mittler, 2006). Ключевой шаг активации Hsf в ответ на различные стрессовые воздействия - образование олигоме-ров с высоким сродством к HSE (Hahn et al., 2004).

Растения обладают сложной системой Hsf: от 18 генов у томата до 34 - у сои (Baniwal et al., 2004). И это еще не окончательное их количество. До сих пор обна-

руживают новые Hsf. Арабидопенс имеет 21 ген Hsf и несколько генов, кодирующих Hsf-подобные белки. Такое разнообразие Hsf растений может объясняться необходимостью высоко адаптированного и эффективного ответа на изменения окружающей среды из-за невозможности растений избежать их (Nover et al., 2001).

По структурным особенностям растительные гены Hsf делятся на 3 класса А, В и С (Nover et al., 2001). Hsf класса А составляют большинство и имеют на С-конце домен активации, что предполагает их участие в активации транскрипции (Baniwal et al., 2004). Все Hsf имеют ДНК-связывающий домен, домен олигомери-зации, последовательность ядерной локализации и, в большинстве случаев, последовательность экспорта в ядро (Nover et al., 2001).

Наиболее изучена система Hsf у томатов (Ly coper sicon peruvianum L.). HsfAl томата - конститутивно синтезирующийся транскрипционный фактор теплового шока, который является основным регулятором ответа на тепловой стресс и необходимым для развития термотолерантности (Baniwal et al., 2004). Растения с подавленным синтезом HsfAl не могут выдержать тепловой шок, что говорит о его незаменимости другими Hsf (Baniwal et al., 2004). LpHsfAl контролирует активацию синтеза LpHsfA2, накапливающегося при тепловом шоке (Baniwal et al., 2004). У арабидопсиса ситуация обстоит несколько иначе: AtHsfAl не требуется для синтеза AtHsfA2 (Busch et al., 2005). Также у арабидопсиса не было найдено главного Hsf, подобного HsfAl томата. Мутанты арабидопсиса по генам AtHSFAla и AtHSFAlb по отдельности не влияли на термоустойчивость растений, только двойной мутант по этим генам снижал экспрессию генов БТШ, однако не полностью (Busch et al.,

2005). Это означает, что для устойчивости к тепловому шоку арабидопсису необходим целый набор многочисленных Hsf (Miller, Mittler, 2006).

Сложность работы Hsf растений подтверждается многими фактами. Предполагается, что Hsf могут участвовать в ответах на окислительный, солевой и холодо-вой стресс, интоксикацию тяжелыми металлами (Hahn et al., 2004; Miller, Mittler,

2006). Активация синтеза некоторых шаперонов может приводить к инактивации

некоторых Hsf-кодирующих генов. Это делает сеть Hsf избыточной, что способствует быстрому формированию у растения ответа на стресс (Miller, Mittler, 2006).

Изменения на транскрипционном уровне у арабидопсиса во время теплового шока были изучены многими исследователями (Busch et al., 2005; Lim et al., 2006). В этих работах было зарегистрировано увеличение экспрессии транскрипционных факторов семейства DREB (DREB2A и DREB2C). DREB - это семейство транскрипционных факторов, которые взаимодействуют с промоторными элементами DRE (CCGAC) и регулируют ответы на обезвоживание, засоление и холодовой стресс (Gilmour et al., 2001; Kotak et al., 2007; Lim et al., 2007). Так же У растений экспрессию БТШ регулируют транскрипционные факторы WRKY25 (Li et al., 2009) В свою очередь, способность Hsf присоединяться к HSE может регулироваться перекисью водорода и Ca (Miller, Mittler, 2006). Важным источником образования АФК и депо кальция при стрессе являются митохондрии (Logan, Knight, 2003). Во время теплового стресса происходит генерация АФК и поглощение ми-

94-

тохондрией цитозольного Ca (Biswas et al., 2005). Мягкий тепловой стресс также вызывает повышение потенциала на внутренней митохондриальной мембране (mtA\|/) (Rikhvanov et al., 2005, 2007). Возможно, поглощение Са2+ митохондриями идет в ответ на изменение mtA. Уровень АФК является также пЦДу-зависимым (Pozniakovsky et al., 2005; Skulachev, 2006), поэтому изменение mtAi|/ может быть сигналом, определяющим тепло-индуцируемую экспрессию генов БТШ (Rikhvanov et al., 2007).

1.5.3. Роль митохондрий в синтезе БТШ Функции митохондрий в клетке не ограничиваются лишь производством энергии. Показано, что митохондрии могут выполнять регуляторные функции при развитии ПКС у растений и животных (Yao et al., 2004). Предполагается, что митохондрии также участвуют в развитии защитной программы, и существует связь между функционированием растительных митохондрий и синтезом БТШ (Rikhvanov et al., 2005).

У мутантов кукурузы с нарушенными митохондриальными функциями наблюдалась повышенная экспрессия некоторых генов БТШ, таких как HsplOl и нмБТШ I и II класса (Kuzmin et al., 2004). У арабидопсиса с конститутивной экспрессией гена митохондриального нмБТШ кукурузы ZmHSP22 наблюдалось изменение экспрессии других генов БТШ (Rhoads et al., 2005). Эти данные говорят о важной роли митохондрий в синтезе БТШ.

Показано, что при тепловом шоке происходит нарушение митохондриальных функций, что приводит к индукции окислительного взрыва (Larkindale, Knight, 2002).

Ранее на дрожжах было показано (Rikhvanov et al., 2005; Рихванов и др., 2006), что при тепловом шоке происходит повышение поляризации внутренней митохондриальной мембраны (mtA\|/). Добавление митохондриальных ингибиторов и разобщителей во время мягкого теплового стресса снижало mtA\[/ и подавляло тепло-индуцируемый синтез Hspl04 дрожжей (Rikhvanov et al., 2005) и HsplOl наряду с Hspl7.6 (I и II) арабидопсиса (Rikhvanov et al., 2007) и, как следствие, развитие индуцируемой термотолерантности. С другой стороны показано, что обработка митохондриальными ингибиторами при обычной температуре повышала экспрессию некоторых БТШ (Sweetlove et al., 2002). По данным анализа с использованием ДНК-микрочипов у клеток арабидопсиса, обработанных митохондриальным ингибитором I комплекса ЭТЦ ротеноном, наблюдалось повышение экспрессии генов HSP60, HSP10 и некоторых других (Lister et al., 2004). Также с помощью ДНК-микрочипов показано, что у дрожжей некоторые БТШ активировались антимици-ном А (АА) (Sakaki et al., 2003). В ответ на обработку азидом натрия и СССР при нормальной температуре наблюдалось небольшое увеличение экспрессии гена HSP17.6. Однако, в то же время при мягком тепловом стрессе все митохондриаль-ные ингибиторы подавляли развитие индуцированной термотолерантности и экспрессию БТШ. Такое кажущееся противоречие, возможно, объясняется тем, что различное при нормальной температуре и мягком тепловом стрессе функциональ-

ное состояние митохондрий определяет активацию, либо, наоборот, подавление синтеза БТШ (ШЫтуапоу ег а1., 2007).

Существует предположение, что растительные митохондрии играют существенную роль в передаче стрессового сигнала к ядру, с последующим изменением экспрессии защитных генов (ШкЬуапоу ег а1., 2007).

1.6. Обоснование выбора объекта исследования 1.6.1. Arabidopsis thaliana Arabidopsis thaliana является модельным организмом для изучения генетики и молекулярной биологии растений. A. thaliana имеет маленький размер генома, короткий жизненный цикл, отсутствие перекрестного опыления. В связи с расшифровкой генома A. thaliana его использование в исследованиях позволяет выявить связь между генетическими детерминантами и физиологическими процессами растений (Hunter, Bomblies, 2010; Bomblies, Weigel, 2010). Однако A. thaliana не обладает высокой устойчивостью к абиотическим стрессам, хотя некоторые генетические модификации меняют ее. В связи с этим необходим поиск новых модельных объектов, обладающих повышенной устойчивостью к стрессовым факторам.

1.6.2. Thellunguella salsuginea Растения Thellungiella из семейства Brassica являются близким родственником А. thaliana. Кроме того, Thellungiella способна расти и размножаться в условиях экстремального холода, засухи и засоления. Это делает растения Thellungiella популярным объектом для генетических и молекулярных исследований (Bressan et al., 2001; Zhu, 2001; Griffith et al., 2007; Kant et al., 2008; Volkov et al., 2004)

Насколько нам известно, сравнение устойчивости T. salsuginea и A. thaliana к действию фторида натрия не проводилось, но можно было бы предполагать, что если T. salsuginea устойчива к засолению и другим видам стрессов, то она будет устойчива и к действию фтора.

1.7. Выводы из обзора литературы Фтор является одним из элементов, влияние которых на растения сказывается крайне негативно. В «природных источниках» фтор содержится в высоких концентрациях, но, при этом, в связанных, труднорастворимых формах. Хозяйственная и промышленная деятельность человека оказывает значительное влияние на ускорение миграции и накопление фтора в окружающей среде. Не значительная часть фторидов поступает в среду со сточными водами промышленных предприятий. На накопление фтора в почвенных горизонтах и поверхностных водах значительную роль играют выбросы газообразных и твердых форм фторидов в атмосферу и их последующее осаждение на поверхность земли. Именно атмосферное загрязнение фторидами приносит наибольшие повреждения растительному покрову в связи с повышенной способностью фтора поступать в растения через устьица. Через корневую систему в растения поступают значительно меньшие количества фтора. Поступление фтора в растение сопровождается его транслокацией и аккумуляцией в органах и тканях. В высоких концентрациях фтор содержится в ассимиляционных органах, стеблях, а также в плодах и семенах растений. Накопление фтора растением сопровождается его аккумуляцией в клетках и клеточных компартментах. Причем, наивысших концентраций фтор достигает в митохондриях и хлоропластах, где наблюдается градиент рН. Действие фтора в клетке характеризуется подавлением фотосинтеза, метаболизма углеводородов и липидов, ингибированием дыхания, нарушением структуры и целостности мембран, развитием окислительного стресса, изменением осмотического давления. Также фтор способен повреждать и разрушать ДНК и РНК, способствовать развитию мутационных процессов. В основе нарушения фтором физиологических процессов лежит его способность инактивиро-вать ряд ферментов (энолаза, кислая фосфатаза, АТФ-аза и др.) за счет связывания магния, кальция и других катионов. Клеточные и молекулярные нарушения фтора сказываются и на целом растении. В зависимости от концентрации и времени действия фтора, наблюдается снижение или подавление роста, продуктивности растений, всхожести семян, изменения водного транспорта. Часто поражения растений фтором сопровождаются видимыми симптомами - развитием апикальных некрозов, хлорозов, уменьшением массы и объема фотосинтетических тканей. Длитель-

50

ное воздействие фторсодержащих эмиссий может приводить ослаблению и усыха-нию растительности, в большей степени хвойных древостоев, гибели отдельных организмов и нарушению целых экосистем. Помимо прямого действия, фтор способен влиять на биотические и абиотические взаимоотношения растений. Имеется сообщение о повышении чувствительности растений к высоким температурам при атмосферном загрязнении фтором.

Постепенное повышение температуры приводит к синтезу в клетках растений белков теплового шока (БТШ). Аккумуляция растениями БТШ во многом определяет развитие индуцированной термотолерантности. Структура и функции БТШ, регуляция их транскрипции факторами теплового шока (Hsf, WRKY25, DREB2A и DREB2C) на сегодняшний день достаточно подробно изучены. Недавно была показана роль митохондрий в участии развития ответов на различные стрессовые факторы, в частности, на тепловой стресс. Предполагается, что изменение состояния митохондрий в условиях теплового стресса может определять индукцию синтеза БТШ, или, наоборот, развитие ПКС. По литературным данным, фтор изменяет энергетичекие возможности клетки, ингибируя дыхание. Однако этих сведений очень мало и не достаточно для полного понимания происходящих в митохондриях процессов в присутствии фтора. В связи с этим, особый интерес представляет выяснение, как антропогенное загрязнение фтором может повлиять на способность растений синтезировать стрессовые белки и адаптироваться к экстремальным условиям обитания. Также ничего не известно о действии фтора на развитие ПКС у растений, в отличие от достаточно хорошо изученного апоптоза у клеток животных. Кроме того, подавляющее число работ, посвященнных токсичности фтора, проведено на целых расстениях, отдельных органах или даже экосистемах, что затрудняет понимание физиолого-биохимических процессов действия фтора. С учетом этого, значительную актуальность для разрешения поставленной проблемы приобретает использование культур клеток in vitro.

Поэтому целью настоящей работы являлось изучение влияния фторида натрия на развитие адаптивной реакции к тепловому шоку в культурах клеток A. tha-

Папа и Т. яаЬщтеа в зависимости от его способности модулировать функции митохондрий.

Для достижения данной цели нами были поставлены следующие задачи:

1. Сравнить устойчивость культур клеток А. ШаНапа и Т. заЬщгпеат действию фторида натрия и хлорида натрия;

2. Изучить влияние фторида натрия на дыхательную активность и изменение потенциала на внутренней митохондриальной мембране при тепловом стрессе;

3. Изучить влияние фторида натрия на индукцию синтеза БТШ и развитие индуцированной термотолерантности после теплового стресса;

4. Определить влияние конститутивной экспрессии НБР101 на устойчивость культуры клеток А ЛаНапа к действию фторида натрия.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 2.1. Объект исследования

В работе использовали культуры клеток Arabidopsis thaliana (L.) Heyn (раса Columbia). Культуры получали из 14-ти дневных проростков при 26 °С на МС-среде (Murashige, Skoog, 1962), содержащей 3 % сахарозы, 0.5 мг/мл тиамина - HCl и 0.1 мг/л 2.4Д, далее пересевали каждые 14 дней с разведением свежей средой в 10 раз (Rikhvanov et al., 2007). Для экспериментов использовали 8-ми дневную культуру, выращенную при 26°С в роторном шейкере при 130 об/мин в темноте, что соответствовало второй половине логарифмической фазы роста, которая характеризуется наибольшей физиологической активностью клеток и наименьшим конститутивным уровнем синтеза БТШ (Александров, Кислюк, 1994). Также использовали трансгенные по синтезу белка HsplOl линии Arabidopsis расы Nössern: с конститутивным синтезом HsplOl {sense) и синтезом HsplOl в анитисмысловой ориентации (antisense), любезно предоставленные Е. Vierling (University of Arizona, США). В этих линиях кДНК последовательность гена HSP101 Arabidopsis расы Columbia была помещена под контроль конститутивного 35S промотора вируса мозаики цветной капусты в смысловой и антисмысловой ориентации (Queitsch et al., 2000). Так же в работе использовали 8-ми дневные проростки A. thaliana (раса Columbia), выращенные на MC-среде, разведенной вдвое без добавления сахарозы, тиамина, 2,4Д и Fe-хелата в растильной комнате при 22 °С.

Вторым объектом работы был экотип Thellungiella salsuginea, произрастающий в Западной Сибири. Из полученных в 2006 г семян была получена культура клеток. Для этого семена стерилизовали и проращивали на MC-среде, содержащей 1 % сахарозы и 0,7 % агара. Затем проростки переносили на среду для индукции образования каллуса с 2,4Д, сахарозой, тиамином, кинетином и ИУК. После перенесения каллусов на жидкую среду и культивации на роторном шейкере при 130 об/мин в темноте была получена мелкоагрегированная суспензионная культура желтого цвета. Культуру клеток выращивали на MC-среде с 3 % сахарозы, 0,5 мг/л

тиамин хлорида и 0.3 мг/л 2,4Д. В экспериментах использовали 8-ми дневную культуру.

2.2. Температурные обработки

Для создания теплового стресса суспензионные культуры клеток в зависимости от задач и условий эксперимента подвергались температурным обработкам при 37 °С и 50 °С на водяном термошейкере Elpan 357 (Польша), либо на минитермо-шейкере TS-100 ("BioSan", Латвия).

Для изучения развития индуцируемой термотолерантности использовали обработку 37 °С в течение 120 мин и 50 °С 10 мин после периода восстановления 120 мин при 26°С на водяном термошейкере.

Для выделения общего белка и РНК 10 мл культуры клеток инкубировали в колбах объемом 50 мл на водяном термошейкере при 37 °С. Для микроскопических исследований культуру по 100 мкл помещали в микропробирки типа Эппендорф объемом 2 мл и инкубировали на минитермошейкере TS-100 ("BioSan", Латвия).

Для флуоресцентного изучения потенциала внутренней митохондриальной мембраны использовали обработку при 26 °С или 37 °С с продолжительностью 120 мин.

2.3. Обработка клеток фторидом натрия, ингибиторами и разобщителями ЭТЦ

Фторид натрия и хлорид натрия ("Реахим", Россия) растворяли в воде в различных соотношениях, в зависимости от используемой концентрации. Антимицин A ("Sigma", США) растворяли в этаноле. СССР ("Sigma", США) растворяли в ДМСО и этаноле в соотношении 1:9. Азид натрия ("Реахим", Россия) растворяли в воде. СГК растворяли в этаноле и воде в соотношении 1:1. Обработку культур клеток производили в стерильных условиях добавлением в среду культивации концентрированных растворов указанных веществ в необходимых для постановки экспериментов концентрациях.

2.4. Оценка ростовой активности культур клеток

Для сравнения устойчивости к фториду и хлориду натрия по росту культуры клеток по 10 мл рассевались в конические колбы объемом 50 мл, обрабатывались необходимыми концентрациями агентов и инкубировались при 26 °С 10 суток. Результаты оценивались по сырой массе культуры клеток.

2.5. Определение жизнеспособности клеток

Жизнеспособность клеток суспензионных культур определяли по восстановлению 2,3,5-трифенилтетразолий хлорида (ТТХ) (Еникеев и др., 1995). Образовавшийся формазан извлекали из клеток этанолом при 65 °С в течение 15 мин. Спиртовой раствор формазана колориметрировали при 490 нм на фотоэлектроколориметре ФЭК-46 и экстинкцию рассчитывали на 1 мг сырого веса.

Для определения числа живых и мертвых клеток использовали флуорис-центные красители флуоресцеин диацетат (FDA) и пропидий йодид (PI), соответственно. FDA - бесцветное вещество, связанное с двумя ацетатными радикалами. В живых клетках свободные и мембраносвязанные ферменты отщепляют эти радикалы от флуоресцеина и он начинает светиться при 490 нм (Adam, Duncan, 2001) PI считается ядерным красителем. Он связывается с разрушенными остатками ДНК и РНК. После связывания красителя с нуклеиновыми кислотами его флуоресценция усиливается 10-ти кратно, их максимум возбуждения сдвинут примерно на 30-40 нм к красному спектру (Riccardi, Nicoletti, 2006).

2.6. Изучение развития индуцированной термотолерантности

Для изучения влияния NaF на развитие индуцированной термотолерантности 8-дневную культуру клеток рассевали по 5 мл в конические колбы объемом 50 мл и инкубировали при 26 или 37 °С 2 ч в присутствии или отсутствии NaF и азида натрия (NaN3). Затем клетки несколько раз в течение 1-3 мин промывали разведенной вдвое культуральной средой для удаления агентов. Далее клетки ресуспенди-ровали в свежей среде и инкубировали при 26 °С в течение 120 мин. После этого клетки подвергали или не подвергали действию повреждающего теплового шока (50 °С, 10 мин). Выживаемость клеток суспензионной культуры определяли после

48 ч инкубации при 26 °С по восстановлению 2,3,5-трифенилтетразолий хлорида (ТТХ) (Еникеев и др., 1995). Образовавшийся формазан извлекали из клеток этанолом при 65°С в течение 15 мин. Спиртовой раствор формазана колориметрировали при 490 нм на фотоэлектроколориметре ФЭК-46 и экстинкцию рассчитывали на 1 мг сырого веса.

2.7. Выделение тотального белка

Для выделения суммарного белка суспензионные культуры фильтровали, промывали дистиллированной водой и отвешивали по 0,5 г. Затем образцы замораживали в жидком азоте и хранили при температуре -70°С до выделения. Перед выделением клетки размораживали, ресуспендировали в буфере для выделения белка (0,1 М Трис-НС1, 0,003 М ДДС-Na, 0,001 М ß-меркаптоэтанол, pH 7,4-7,6), в соотношении 1:4, добавляли 0,5 - 1 мМ фенилметилсульфонилфторида (ФМСФ) для ингибирования протеаз, замораживали жидким азотом и тщательно растирали с кварцевым песком в ступке. Грубые клеточные компоненты удаляли центрифугированием при 15000g в течение 15 мин на центрифуге К-24 (ГДР). Белок из супер-натанта осаждали трехкратным объемом охлажденного ацетона. Осадок белка растворяли в буфере для образца Sb (0,625 М Трис-НС1, 0,008 М ДДС-Na, 0,1 М ß-меркаптоэтанол, 10 % глицерин pH 6,8), инкубировали 5 мин при 100 °С, центрифугировали 15 мин при 5000g. Растворённую надосадочную фракцию белков переносили в чистые микропробирки, определяли концентрацию по методу Лоури (Lowry et al., 1957), разводили в Sb с бромфеноловым синим (0,625 М Трис-НС1, 0,008 М ДДС-Na, 10 % глицерин, 0,001 % бромфеноловый синий, pH 6,8) и использовали для электрофореза в концентрации от 10 до 70 мкг белка на трек (Побежи-мова и др., 2004).

2.8. Электрофорез в ПААГе с ДДС-Na

Электрофорез проводили в блоках полиакриламидного геля размером 70x80x1 мм по модифицированной системе Лэммли (Laemmli, 1970), используя прибор для электрофореза Mini-PROTEAN III Electrophoretic Cell ("BIO-RAD", США) по прилагаемой инструкции.

Стеклянные пластины, одна из которых несколько длиннее другой, (83x102 и 73x102 мм) вставляли в устройство для заливки геля, прилагаемое к прибору для электрофореза Mini-PROTEAN III. В просвет между стеклянными пластинами заливали раствор 15 %-ного разделяющего полиакриламидного геля, приготовленного в 0,375 М Трис-HCl буфере, pH 8,8, содержащем 0,1 % ДДС-Na и 10 мкл TEMED. Для создания ровной верхней границы разделяющего геля на него наслаивали изобутанол, насыщенный водой. После его полимеризации, заливали концентрирующий 5 %-ный гель, приготовленный в 0,0625 М Трис-HCl буфере, pH 6,8, содержащем 0,1 % ДДС-Na и 3 мкл TEMED. В концентрирующий гель погружали гребенку для формирования карманов для нанесения белковых проб. Белковые пробы наносили на гель, предварительно выровняв их концентрации по методу JIo-ури, в зависимости от ситуации от 10 до 50 мкг белка на трек.

Верхним и нижним электродными буферами служил трис-глицин, pH 8,3 (0,025 М Трис-HCl и 0,192 М глицин), содержащий 0,1 % ДДС-Na.

Устанавливали напряжение 50 В 30 мин, далее 180 В до выхода бромфено-лового синего в раствор. После окончания электрофореза гель помещали в камеру для окрашивания в водном растворе, содержащем 0,1 % Кумасси R-250 ("Sigma", США), 25 % изопропанол, 10 % уксусную кислоту, либо использовали для переноса на нитроцеллюлозную мембрану и последующего иммуноблоттинга. Для обесцвечивания фона гели переносили в раствор, содержащий 7 % уксусную кислоту и 12,5 % изопропанол, и отмывали до тех пор, пока разделение белков не станет отчетливым (Побежимова и др., 2004).

2.9. Вестерн-блоттинг

Перенос белков на нитроцеллюлозную мембрану ("Sigma", США) проводили в соответствии с рекомендациями фирмы-изготовителя, в Towbin - буфере (0,025 М Трис-HCl, 0,192 М глицин, 10 % метанол, pH 9,2) в специальном приборе для блот-тинга ("BIO-RAD", США). Перенос проводили в холодной комнате в течение 2,5 ч. Первые 30 мин давалось напряжение 200 В, затем следующие 2ч- 400 В. После переноса белков на нитроцеллюлозную мембрану буфер сливали, мембрану помещали в раствор 0,5 % красителя Понсо примерно на 20 с, после чего тщательно

промывали дистиллированной водой. После этого нитроцеллюлозную мембрану помещали в блокирующий раствор, содержащий 2 %-ное сухое обезжиренное молоко, 10 мМ Трис-HCl (pH 7.4) и 150 мМ NaCl (трис-солевой буфер - TBS), и оставляли на ночь при температуре 0-4°С. Далее мембрану инкубировали в растворе первичных антител в TBS на минирокере MR-1 ("Biosan", Латвия). Время инкубации подбирали экспериментально от 10 мин до 4 ч, в зависимости от используемых антител. После инкубации мембрану отмывали от несвязавшихся антител в TBS, содержащим 0,05 % Твин-20 (TTBS). Затем мембрану помещали в раствор вторичных антител, конъюгированных со щелочной фосфатазой. Время инкубации подбирали экспериментально. После инкубации мембрану вновь отмывали в TTBS от непрореагировавших антител, помещали в раствор, содержащий 100 мМ Трис-HCl (pH 9,5), 100 мМ NaCl, 5 мМ MgCl2, 0,17 мг/мл 5-бромо-4-хлоро-3-индолил фосфата ("Sigma", США), 0,33 мг/мл нитротетразолия синего ("Sigma", США), и инкубировали до проявления окраски.

2.10. Использованные антитела

В работе использовали антитела, полученные против HsplOl и Hspl7,6 (любезно предоставленные Agrisera, Швеция), Hsp60 (SPA-807, "StressGen", США). Антитела были приготовлены на блокирующем растворе, содержащем 2 %-ное сухое обезжиренное молоко, 10 мМ Трис-HCl (pH 7,4), 150 мМ NaCl и 20 мкМ азид натрия.

2.11. ОТ-ПЦР-анализ 2.11.1. Выделение РНК Тотальную РНК выделяли из культуры клеток арабидопсиса с помощью набора SV Total RNA Isolation System ("Promega", USA), следуя инструкциям протокола. Качество препаратов РНК контролировали денатурирующим РНК электрофорезом и по спектрофотометрической характеристике: отношением оптической плотности пробы при длине волны 260 нм к оптической плотности при 280 нм. Концентрацию препаратов РНК определяли спектрофотометрически при длине волны 260 нм.

2.11.2. Денатурирующий РНК электрофорез В электрофоретическую камеру в стерильных условиях заливали 1,2 %-ную агарозу, приготовленную в буфере MOPS (0,2 MOPS, pH 7,0, 50 мМ ацетат натрия, 1 мМ ЭДТА, pH 8,0), содержащем 17,5 % раствора формалина,. Буфером камеры служил стерильный MOPS. После того, как гель в камере застыл, его, начиная от карманов, покрывали полиэтиленовой пленкой для повышения стерильности.

Для денатурации РНК в пробы добавляли буфер в соотношении 1:1,7. Буфер содержал 0,02 М MOPS, 70 % формамида ("ISN"), 20 % формалина, 0,5 % бромистого этидия. Далее смесь инкубировали в течение 15 мин при 65°С. Пробы охлаждали во льду в течение 3-5 мин, добавляли буфер с красителем (БФС с глицерином) и вносили образцы в карманы геля. Электрофорез проводили при +4°С в стандартных условиях 70 В 140 мА в течение 3-4 ч. Электрофорез останавливали, когда БФС проходил 4/5 геля. Документировали с помощью УФ-трансиллюминатора ("Bio-Rad", USA).

2.11.3. Синтез кДНК Для синтеза первой цепи кДНК было использовано выравненное количество тотальной РНК (1 мкг), праймер oligo(dT)18 (20 рМ) и набор REVERTA ("Ампли-Сенс", Москва). Полу количественный ОТ-ПЦР-анализ был выполнен при использовании кДНК в качестве матрицы (50 нг) и геноспецифичных праймеров (10 рМ каждого). Последовательности праймеров (Приложение I) были выбраны с помощью програмы VectorNTI на основе кДНК последовательностей целевых генов (www.arabidopsis.org).

Амплификацию проводили по схеме: 95°С - 40 с, 58°С - 60 с, 72 °С - 90 с с предварительным прогревом 3 мин при 95°С и конечным - 10 мин при 72°С с использованием амплификатора Mastercycler gradient thermocycler ("Eppendorf'). Количество циклов предварительно подбиралось, учитывая результаты амплификации кДНК каждого из генов для определения линейной области увеличения концентрации ПЦР-продукта. Равный объем ПЦР-продуктов разделяли в 1,5 % агароз-ном геле.

2.12. Определение дыхательной активности

Поглощение кислорода клетками регистрировали полярографически с платиновым электродом закрытого типа (электрод Кларка) в ячейке объемом 1,4 мл на полярографе ОН-105 (Венгрия). Для определения скорости поглощения кислорода культуры клеток вносили в полярографическую ячейку, термостатируемую при 26°С. Температуру в ячейке поддерживали с помощью ультратермостата U10 (ГДР). Скорость поглощения кислорода выражали в нмолях поглощенного кислорода в мин на г сырого веса с учетом растворимости кислорода в воде.

2.13. Микроскопические методы (флуоресцентная и световая

микроскопия)

Микроскопический анализ клеток проводили с использованием инвертированного флуоресцентного микроскопа AxioObserver Z1 (Германия) с цифровой монохромной камерой AxioCam MRm3 и пакетом программного обеспечения для захвата и анализа изображений "AxioVision Rel.4.6". В работе были использованы следующие фильтры: Filter set 15 (EX BP 546/12, BS FT 580, EM LP 590) и Filter set 10 (EX BP 450-490, ВS FT 510, EM BP 565).

Для качественной визуализации величины потенциала на внутренней мито-хондриальной мембране использовали 5 мкМ потенциал-зависимого катионного красителя 5,5',6,6'-тетрахлор-1,1',2,2'-тетраэтилбензимидазоло-карбоцианина (JC-1). Клетки суспензионной культуры переносили в буфер окрашивания (25 мМ MES, 2 % глицерин, рН 5,5), инкубировали в течение 10 мин при различной температуре с 10 мкМ JC-1 и исследовали с помощью флуоресцентного микроскопа.

2.14. Статистическая обработка данных

В каждом варианте опыта использовалось по 2-4 колбы с 5-10 мл суспензий. Биологическая повторность экспериментов была 3-16 кратная. Результаты повтор-ностей совпадали. Представлены данные одного характерного эксперимента. Полученные данные обработаны статистически: рассчитаны средние арифметические значения и их стандартные отклонения (Лакин, 1973).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1. Влияние хлорида натрия на рост культур A. thaliana и Т. salsuginea

Известно, что ионы фтора ингибирует поступление в изолированные везикулы сахарной свеклы {Beta vulgaris L) ионов хлора (Giannini et al. 1987). И наоборот, обработка NaCl проростков черной ели {Picea mañana) и белой ели {Picea glauca) подавляет поступление в эти растения ионов фтора (Calvo-Polanco, 2009). Это позволило предположить, что поступление ионов фтора в растения может происходить через хлор-анионные каналы. Если это предположение верно, то растения устойчивые к действию NaCl должны быть устойчивы и к действию NaF. Другими авторами было показано, что галофит Salicornia brachiata сохранял способность поддерживать рост в присутствии очень высоких (50-100 мМ) концентраций NaF (Reddy, Kaur, 2008).

Известно, что два экотипа Т. salsuginea, Yukon и Shandong, изолированные, соответственно, на Аляске и в Китае, отличаются повышенной устойчивостью к засолению (Amtmann et al., 2009). Поскольку в нашем распоряжении оказались семена Т. salsuginea, собранные в Западной Сибири, было проведено сравнение устойчивости к действию NaCl культуры клеток A. thaliana и Т. salsuginea. Для этого, культуры клеток выращивали в присутствии разных концентраций NaCl (10, 25, 50, 100 и 200 мМ) в течение 10 суток. Затем определяли влияния засоления на рост обеих культур, определяя сырой вес клеток. Согласно данным, продемонстрированным на рис. 1, добавление NaCl подавляло рост обеих культур. Наибольшая степень ингибирования роста (более 80 %) наблюдалась при концентрации агента 200 мМ. Какого-либо превосходства культуры клеток Т. salsuginea перед культурой клеток A. thaliana выявлено не было. Наоборот, низкие концентрации NaCl (10-50 мМ) сильнее подавляли рост культуры клеток Т. salsuginea, чем A. thaliana. Аналогичные результаты были получены при определении сухой массы (Приложение 2). Таким образом, очевидно, что по способности расти в присутствии NaCl, использо-

61

ванная нами культура клеток Т. яакщтеа не превосходит культуру клеток А. гЪа-Напа. Следовательно, либо экотип Т. заЬщтеа, из которого была получена культура клеток, не является галофитом, либо устойчивость к засолению проявляется только на уровне целого растения. Поскольку способность расти в стрессовых условиях прямо не коррелирует с способностью выдерживать летальное воздействие стрессового фактора (Рихванов и др., 2003), нельзя исключать, что использованная нами культура клеток Т. эакщтеа, может терять способность расти в присутствии ИаО, но сохранять при этом жизнеспособность.

140

« К

I 120

и

§

Н

О

Заключение диссертации по теме «Физиология и биохимия растений», Пуляевская, Мария Александровна

выводы

1. Использованная в работе культура клеток Т. яаЬщтеа не обладает повышенной устойчивостью к засолению, по сравнению с культурой клеток А. МаИапа.

2. Фторид натрия в концентрации 10 мМ полностью подавляет рост культур клеток А. ЛаИапа и Т. БаЬи&пеа.

3. Фторид натрия в концентрации 20 мМ вызывает гибель культур клеток А. th.alia.na и Т. заЬщтеа и проростков А. ЖаИапа. Гибель суспензионных культур клеток не развивается во времени и не сопровождается активацией генов метакаспаз.

4. Фторид натрия подавляет адаптивную реакцию культуры клеток на повреждающий тепловой шок, что выражается в ингибировании повышения потенциала на внутренней митохондриальной мембране, синтеза белков теплового шока и развития индуцированной термотолерантности.

5. Конститутивная экспрессия ШРЮ! повышает устойчивость культуры клеток А. ЛаИапа к действию фторида натрия.

6. Негативное действие фторида натрия проявляется не только в непосредственном угнетении роста и жизнеспособности, но и в подавлении адаптивного механизма к тепловому шоку.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Пуляевская, Мария Александровна, 2011 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Александров В.Я., Кислюк И.М. (1994) Реакция клетки на тепловой шок:

Физиологический аспект. Цитология, 1, 5-59.

2. Антонов И.С., Градобоева H.A. (1996) Фтор в почве и сопредельных средах в зоне влияния Саянского Алюминиевого завода (результаты наблюдений за 1989-1995 гг. в таблицах и пояснениях). Абакан: ГСАС «Хакасская», 67-70.

3. Безикова O.A. (1997) Выяснение уровней водорастворимого фтора в почве на урожай и качество пшеницы. Химия в сельском хозяйстве, 2, 32-33.

4. Бельчинская Л.И. (2000) Биоиндикация промышленных токсикантов древесными растениями. - Воронеж: Из-во Воронежской государственной лесотехнической академии. 93 с.

5. Белякова Т.И. (1997) Фтор в почвах и растениях в связи с эндомическим флюрозом. Почвоведение, 8, 55-63.

6. Божков А. И., Кузнецова Ю. А., Мензянова Н. Г. (2009) Влияние фтористого натрия на пограничные клетки корневого апекса однодневных проростков пшеницы. Физиология растений, 4, 530-538.

7. Блехман Г.И. (1988) Синтез белка в условиях стресса. Успехи совр. биол., 103, 340-353.

8. Варакина H.H. (1971) Дыхание растущих и стареющих колеоптилей кукурузы. Дисс. канд. биол. наук, Иркутск, 187 с.

9. Власюк П.А. (1969) Биологические элементы в жизнедеятельности растений. Киев: Наукова думка, 516 с.

10. ВОЗ (1989) Фтор и фториды. Гигиенические критерии состояния окружающей среды. Женева, 114 с.

П.Войников В.К., Иванова Г.Г., Гудиковский A.B. (1984) Белки теплового шока растений. Физиология растений, 31, 970-979.

12.Войников В.К., Иванова Г.Г., Корытов М.В. (1986) Синтез белков в растениях при действии низких температур. Физиология и биохимия культурных растений, 18, 211-222.

13. Гигиенические нормативы 2.1.5.1315 (2003) «Предельно допустимые концентрации (ПДК) химических веществ в воде водных объектов хозяйственно-

питьевого и культурно-бытового водопользования». Минздрав России, Москва.

14. Гигиенические нормативы 2.2.5.2100 (2006) «Гигиенические нормативы. Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны (дополнение №2 к ГН 2.2.5.1313-03)». Минздрав России, Москва.

15.Гладушко В.И. (1991) Техногенное рассеивание фтора в окружающей среде и его последствия. Агрохимия, 11, 84-87.

^.Государственный доклад (2000) О состоянии окружающей природной среды Иркутской области в 1999 году. Иркутск: Министерство природных ресурсов и экологии Иркутской области, 320 с.

17. Государственный доклад (2009) Об охране окружающей среды в Иркутской области в 2008 г. Иркутск: Министерство природных ресурсов и экологии Иркутской области, 411с.

^.Государственный доклад (2010) О состоянии и об охране окружающей среды Иркутской области в 2009 году. Иркутск: Министерство природных ресурсов и экологии Иркутской области, 410 с.

19.Еникеев А.Г., Высоцкая Е.Ф., Леонова Л.А., Гамбург К.З. (1995) Об использовании 2,3,5-трифенилтетразолий хлорида для оценки жизнеспособности культур растительных клеток. Физиология растений, 42, 423-426.

20. Еникеев А. Г., Копытина Т. В., Семёнова Л. А., Шафикова Т. Н., Гаманец Л. В., Волкова О. Д., Швецов С. Г., Русалёва Т.М. (2010) Культуры клеток табака, трансформированные геном Ьвр 101, обладают повышенной устойчивостью к фториду калия. Доклады Академии наук, 1, 137-138.

21.Илькун Г.М. (1971) Газоустойчивость растений. - Киев: Наукова думка, 135 с.

22.Илькун Г.М. (1978) Загрязненность атмосферы и растения. Киев: Наукова думка, 247 с.

23.Илькун Г.М., Юдин Ю.Н., Кустовский С.Е. (1983) Сорбция полярных газов листьями древесных растений. Физиология и биохимия древесных растений, 15,482-487.

24. Кабата-Пендиас А., Пендиас X. (1989) Микроэлементы в почвах и растениях. М.: Мир, 439 с.

25.Калетина Н.И. (2009) Токсикологическая химия. Метаболизм и анализ токсикантов. М.: ГЭОТАР - Медиа, 907-911.

26. Колупаев Ю.Е., Карпец Ю.В., Акинина Г.Е. Влияние салициловой кислоты и перекиси водорода на содержание пролина в колеоптилях пшеницы при тепловом и солевом стрессах (2005) Bich. Харкгв. нацюн. аграрн. ун-ту. Сер. Бюлог1я, 6, 51-56.

27. Конарбаева Г.А. (2008) Галогены в природных объектах юга Западной Сибири: Автореф. дисс. докт. биол. наук, Новосибирск, 33 с.

28. Косаковская И.В. (2008) Стрессовые белки растений. Киев: Институт ботаники, 154 с.

29.Котова Л.Г., Помазкина Л.В., Репина О.В., Прокофьев А.Ю. (2002) Минеральное питание и продуктивность яровой пшеницы на серых лесныхпочвах, загрязненных фторидами. Агрохимия, 12, 31-36

30. Лакин, Г.Ф. (1973) Биометрия. М.: Высшая школа, 343 с.

31.Матяшенко Г.В., Шмаков В.Н., Константинов Ю.М., Белоголова Г.А. (2005) Влияние экологических факторов на накопление фтора лиственницами (Larix gmelinii (Rupr.) Rupr. и L. sibirica Ledeb.) в Восточной Сибири. Экология, 6, 434-437.

32. Медведев С.С. (2004) Физиология растений. СПб.: Изд-во С.-Петерб. Ун-та, 336 с.

33.Меденцев А.Г., Аринбасарова А.Ю., Акименко В.К. (1999) Регуляция и физиологическая роль цианидрезистентной оксидазы у грибов и растений. Биохимия, 64, 1457-1472.

34. Мельников Э.Э., Ротанова Т.В. (2010) Молекулярные шапероны. Биоорганическая химия, 1, 5-14.

35.Михайлова Т.А., Бережная Н.С., Игнатьева О.В. (2006) Элементный состав хвои и морфофизиологические параметры сосны обыкновенной в условиях техногенного загрязнения. Иркутск: Изд-во Института географии СО РАН, 134 с.

36. Михайлова Т.А., Бережная Н.С., Афанасьева JI.B., Игнатьева О.В., Шер-гина О.В. (2005) Воздействие фторсодержащих соединений на состояние хвойных лесов Предбайкалья. Лесоведение, 2, 38-45.

37. Никифорова В.Я. (1982) К механизму мутагенного действия фтора. Цитология и генетика, 6, 40-41.

38. Носов A.B., Таранов В.В., Баранова E.H., Шугаев А.Г., Бабаков A.B. (2010) Суспензионные культуры клеток близких видов растений Thellungiella salsuginea и Arabidopsis thaliana по-разному отвечают на солевой стресс. Тезисы докладов, Всероссийский симпозиум «Растение и стресс», Москва. 255256.

39. Осколков В.А., Воронин В.И. (2003) Репродуктивный процесс сосны обыкновенной в Верхнем Приангарье при техногенном загрязнении. - Иркутск: Изд-во Иркутского Госуниверситета. 137 с.

40. Павлова E.JI. (2010) Роль салициловой кислоты в регуляции стрессовых ответов в культуре клеток Arabidopsis thaliana. Дисс. канд. биол. наук, Иркутск, 152 с.

41.Передерий О.Г., Микевич Н.В. (1991) Охрана окружающей среды на предприятиях цветной металлургии. М.: Металлургия, 32-47.

42.Побежимова Т.П., Колесничеико A.B., Грабельных О.И. (2004) Методы изучения митохондрий растений. Полярография и электрофорез. Методическое пособие. М.: "НПК "Промэкобезопасность", 98 с.

43.Помазкина JI.B., Лубнина Е.В. (2002) Мониторинг загрязнения пахотных почв и полевых культур в зоне выбросов Иркутского алюминиевого завода. Агрорхимия, 2, 59-65.

44.Помазкина JI.B., Зорина С.Ю., Засухина Т.В., Петрова И.Г. (2005) Качественный состав гумуса серых лесных пахотных загрязненных фторидами почв Прибайкалья. Почвоведеьнъе, 5, 550-555.

45.Потатуева Ю.А., Копаева М.Н. (1978) Поступление фтора из удобрений в растения и влияние его на урожай. Химия в сельском хозяйстве, 9, 40-42.

46.Рихванов Е.Г, Варакина H.H., Русалева Т.М., Раченко Е.И., Войников В.К. (2003) Отсутствие прямой зависимости между способностью дрожжей

расти при повышении температуры и их выживаемостью после летального теплового шока. Микробиология, 4, 1-6.

47.Рихванов Е.Г., Войников В.К. (2005) Функции Hspl04 в развитии индуцированной термотолерантности и прионном наследовании у дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Успехи современной биологии, 1, 115-128.

48.Рихванов Е.Г., Лукина Е.А., Варакина H.H., Русалева Т.М., Гамбург К. 3., Кнорре Д.А., Боровский Г.Б., Войников В.К. (2006) Митохондрии, как критическое звено в развитии ответа на тепловой шок у дрожжей с различным типом энергетического метаболизма. Физиология растений, 53, 695-702.

49. Рожков A.C., Массель Г.И. (1982) Смолистые вещества хвойных и насеко-мые-ксилофаги. Новосибирск: Наука, 148 с.

50. Рожков A.C., Михайлова Т.А. (1989) Действие фторсодержащих эмиссий на хвойные деревья. Новосибирск: Наука, 159 с.

51. Смит У.Х. (1988) Поглощение загрязняющих веществ растениями. Загрязнение воздуха и жизнь растений. Л.: Гидрометеоиздат, 461-499.

52.Стеценко Л. А., Шевякова Н. И., Ракитин В. Ю., Кузнецов Вл. В. (2011) Пролин защищает растения Atropa belladonna от токсического действия солей никеля. Физиология растений, 2, 275-282

53.Тарчевский В.В. (1964) Влияние дымо-газовых выделений промышленных предприятий Урала на растительность. Растения и промышленная среда. -Свердловск, С. 5-69.

54. Томас М.Д. (1962) Влияние загрязнения атмосферного воздуха на растения. Загрязнение атмосферного воздуха. Женева. 251-306.

55. Федосеева И.В., Гамбург К.З., Варакина H.H., Русалева Т.М., Таусон Е.Л., Ступникова И.В., Боровский Г.Б., Степанов A.B., Давыденко Е.А., Рихванов Е.Г., Войников В.К. (2008) Влияние азида натрия и 2,4-динитрофенола на развитие индуцированной термотолерантности и индукцию синтеза hsplOl в культуре клеток Arabidopsis thaliana. Физиология растений, 55, 245-252.

56. Шалина Т.Н., Васильева Л.С. (2009) Общие вопросы токсического действия фтора. Сибирский медицинский журнал, 5, 5-9.

57. Шелепова О.В., Потатуева Ю.А. (2003) Агроэкологическое значение фтора. Агрохимия, 9, 78-87.

58. Шмаков В.Н. (2005) Изучение меж- и внутривидовых различий по устойчивости к действию фтора у сибирских видов лиственниц методом культуры in vitro. Дисс. канд. биол. наук, Иркутск, 172 с.

59.Ярилин, А.А. (2003) Апоптоз и его роль в целостном организме. Глаукома, 2, 46-54.

60. Adam G., Duncan Н. (2001) Development of a sensitive and rapid method for the measurement of total microbial activity using fluorescein diacetate (FDA) in a range of soils. Soil Biology and Biochemistry, 33, 943-951.

61. Adamek E., Pawlowska-Goral K., Bober K. (2005) In vitro and in vivo effects of fluoride ions on enzyme activity. Annales Academiae Medicae Stetinensis, 51, 6985.

62. Agarwal M., Katiyar-Agarwal S., Grover A. (2002) Plant HSP100 proteins: structure, function and regulation. Plant Science, 163, 397-405.

63. Agarwal M., Sahi C., Katiyar-Agarwal S. et al. (2003) Molecular characterization of rice hsplOl: complementation of yeast hspl04 mutation by disaggregation of protein granules and differential expression in indica and japónica rice types. Plant Mol. Biol, 4, 543-553.

64. Agarwal R., Mumtaz H., Ali N. (2009) Role of inositol polyphosphates in programmed cell death. Mol Cell Biochem., 328, 155-65.

65. Alia H., Hayashi A., Sakamoto (1998). Enhancement of the tolerance of Arabi-dopsis to high temperatures by genetic engineering of the synthesis of glycinebe-tainq. Plant J., 16, 155-161.

66. Amtmann A. (2009) Learning from evolution: Thellungiella generates new knowledge on essential and critical components of abiotic stress tolerance in plants. Molecular Plant., 2, 3-12.

67. Anuradha C.D., Kanno S., Hirano S. (2001) Oxidative damage to mitochondria is a preliminary step to caspase-3 activation in fluoride-induced apoptosis in HL-60 cells. Free Radie. Biol. Med., 31, 367-373.

68. Ashburner M., Bonner J.J. (1979) The induction of gene activity in Drosophilla by heat shock. Cell, 17, 241-251.

69.Balogh G., Horvath I., Nagy E., Hoyk Z., Benko S., Bensaude O., Vigh, L. (2005) The hyperfluidization of mammalian cell membranes acts as a signal to initiate the heat shock protein response. FEBSJ., 272, 6077-6086.

70.BaniwaI S.K., Bharti K., Chan K.Y., Fauth M., Ganguli A., Kotak S. et al. (2004) Heat stress response in plants: a complex game with chaperones and more than twenty heat stress transcription factors. Journal of Biosciences, 29, 471-487.

71.Banzet N. Richaud C, Deveaux Y. (1998) Accumulation of small heat shock proteins, including mitochondrial Hsp 22, induced by oxidative stress and adaptive response in tomato cells. Plant J., 13, 519-527.

72.Barbier O., Arreola-Mendoza L., Del Razo L.M. (2010) Molecular mechanisms of fluoride toxicity. Chemico-Biological Interactions, 188, 319-333.

73. Barrett M.J., Alones V., Wang K.X., Phan L., Swerdlow R.H. (2004) Mitochondria-derived oxidative stress induces a heat shock protein response. JNeurosci Res, 78, 420^139.

74. Beere H. (2004) 'The stress of dying': the role of heat shock proteins in the regulation of apoptosis. J Cell Sci., 117,2641-2651.

75. Benedict H.M., Ross J.M. and Wade R.W. (1965) Some responses of vegetation to atmospheric fluorides. Journal of the Air Pollution Control Association, 15, 253-255.

76. Biswas G., Guha M., Avadhani N.G. (2005) Mitochondria-to-nucleus stress signaling in mammalian cells: nature of nuclear gene targets, transcription regulation, and induced resistance to apoptosis. Gene, 18, 132-139.

77.Bomblies K., Weigel D. (2010). Arabidopsis and relatives as models for the study of genetic and genomic incompatibilities. Phil. Trans. R. Soc. B., 365, 1815-1823.

78. Bonneau L., Ge Y., Drury G.E., Gallois P. (2008) What happened to plant cas-pases? Journal of Experimental Botany, 59, 491 -499.

79.Bosl B., Grimminger V., Walter S. (2006) The molecular chaperone Hspl04-A molecular machine for protein disaggregation. J. Struct. Biol., 156,139-148.

80. Bressan R.A., Zhang C., Zhang H., Hasegawa P.M., Bohnert H.J., Zhu J.K.

(2001) Learning from the Arabidopsis experience: the next gene search paradigm. Plant Physiol, 127, 1354-1360.

81.Breusegem V.F., Dat J.F. (2006) Reactive oxygen species in plant cell death. Plant Physiol, 141, 384-90.

82.Bultmann H. (1986) Induction of a heat shock puff by hypoxia in polytene foot pad chromosomes of Sarcophaga bullata. Chromosoma, 93, 358-66.

83.Busch W., Wunderlich M., Schoffl F. (2005) Identification of novel heat shock factor-dependent genes and biochemical pathways in Arabidopsis thaliana. Plant Journal, 41, 1-14.

84. Calvo-Polanco M., Zwiazek J.J., Jones M.D., MacKinnon M.D. (2009) Effects of NaCl on responses of ectomycorrhizal black spruce (Picea mariana), white spruce (Picea glauca) and jack pine (Pinus banksiana) to fluoride. Physiologia Plantarum, 135, 51-61.

85.Camargo A.J. (2003) Fluoride toxicity to aquatic organisms: a review. Chemosphere, 50, 251-264

86. Campbell J.L., Klueva N.Y., Zheng H.G., Nieto-Sotelo J., Ho T.D., Nguyen H.T. (2001) Cloning of new members of heat shock protein HSP101 gene family in wheat (Triticum aestivum (L.) Moench) inducible by heat, dehydration, and ABA (1). Biochim. Biophys. Acta., 1517, 270-277.

87. Cheng T.J., Chen T.M., Chen C.H., Lai Y.K. (1998) Induction of stress response and differential expression of 70 kDa stress proteins by sodium fluoride in HeLa and rat brain tumor 9L cells. J Cell Biochem., 69, 221 -31.

88. Chichkova N.V., Kim S.H., Titova E.S., Kalkum M., Morozov V.S., Rubtsov Y.P., Kalinina N.O., Taliansky M.E., Vartapetian A.B. (2004) A Plant Caspase-Like Protease Activated during the Hypersensitive Response. Plant Cell, 16, 157171.

89.Coffeen W.C., Wolpert T.J., (2004). Purification and characterization of serine proteases that exhibit caspase-like activity and are associated with programmed cell death in Avena sativa. Plant Cell, 16, 857-873.

90. Cronin S.J., Manoharan V., Hedley M.J., Loganathan P. (2000) Fluoride: A review of its fate, bioavailability, and risks of fluorosis in grazed-pasture systems in New Zealand. New Zealand Journal of Agricultural Research, 43, 295-321.

91. Davison A., Weinstein L.W. (1998) The effects of fluorides on plants. Earth Island J., 13, 257-64.

92. Desikan R., A-H-Mackerness S., Hancock J.T., Neill S.J. (2001) Regulation of the Arabidopsis transcriptome by oxidative stress. Plant Physiol, 127, 159-172.

93. Doley D., Hill R. J., Riese R.H. (2004) Environmental Fluoride in Australasia: Ecological Effects, Regulation and Management. Clean Air and Environmental Quality, 38, 35-55.

94. Dorta D.J., Pigoso A.A., Mingatto F.E., Rodrigues T., Pestana C.R., Uyemura S.A., Santos A.C., Curti C. (2008) Antioxidant activity of flavonoids in isolated mitochondria. Phytother Res., 22, 1213-8.

95. Elloumi N., Abdallah F.B., Mezghani I., Rhouma A., Boukhris M., Tunisia S.

(2005) Effect of fluoride on almond seedling in culture solution. Fluoride, 38, 193198.

96. Fa?anha A.R., Meis L. (1995) Inhibition of Maize Root H+-ATPase by Fluoride and Fluoroaluminate Complexes. Plant Physiology, 108, 241-246.

97. Feng Y.W., Ogura N., Feng Z.W., Zhang F.Z., Shimizu H. (2003) The concentrations and sources of fluoride in atmospheric depositions in Beijing, China. Water, Air, and Soil Pollution, 145, 95-107.

98. Garcia-Montalvo E.A., Reyes-Perez H., Del Razo L.M. (2009) Fluoride exposure impairs glucose tolerance via decreased insulin expression and oxidative stress. Toxicology, 263, 75-83.

99. Giannini J.L., Pushnik J.C., Briskin D.P., Miller G.W. (1987) Fluoride effects on the plasma membrane ATPase of sugarbeet. Plant Set, 53, 39-44.

100. Gilmour S.J., Sebolt A.M., Salazar M.P., Everard J.D., Thomashow M.F. (2001) Overexpression of the Arabidopsis CBF3 transcriptional activator mimics multiple biochemical changes associated with cold acclimation. Plant Physiol., 24, 1854-1865.

101. Graier W.F., Frieden M., Malli R. (2007) Mitochondria and Ca2+ signaling: old guests, new functions. Pflugers Archiv European Journal of Physiology, 3, 375396.

102. Griffith M., Timonin M., Wong A.C.E., Gray G.R., Akhter S.R., Saldanha M., Rogers M.A., Weretilnyk E.A., Moffatt B. (2007) Thellungiella: an Arabidopsis-related model plant adapted to cold temperatures. Plant Cell Env., 30, 529538.

103. Gutknecht J., Walter A. (1981) A hydrofluoric and nitric acid transport through lipid bilayer membranes, Biochimica et Biophysica Acta., 644, 153-156.

104. Hahn J.S., Hu Z., Thiele D.J., Iyer V.R. (2004) Genome-wide analysis of the biology of stress responses through heat shock transcription factor. Molecular and Cellular Biology, 24, 5249-5256.

105. Haslbeck M., Miess A., Stromer T. (2005) Disassembling protein aggregates in the yeast cytosol: The cooperation of Hsp26 with Ssal and Hspl04. J. Biol. Chem., 280, 23861-23868.

106. Heagle, A.S. (1973) Interactions between air pollutants and plant parasites. Annual Review of Phytopathology, 11, 365-388.

107. He L.F., Chen J.G. (2006) DNA damage, apoptosis and cell cycle changes induced by fluoride in rat oral mucosal cells and hepatocytes. World J Gastroenterol., 12, 1144-1148.

108. He R., Drury G.E., Rotari V.I., Gordon A., Wilier M., Farzaneh T., Wolter-ing E.J., Gallois P. (2008) Metacaspase-8 Modulates Programmed Cell Death Induced by Ultraviolet Light and H202 in Arabidopsis. J. Biol. Chem., 283, 774-783.

109. Holme J.A., Morrison E., Samuelsen J.T., Wiger R., Lag M., Schwarze P.E., Bernhoft A., Refsnes M. (2003) Mechanisms involved in the induction of apoptosis by T-2 and HT-2 toxins in HL-60 human promyelocytic leukemia cells. Cell Biology and Toxicology, 1, 53-68.

110. Hong S.W., Vierling E. (2000) Mutants of Arabidopsis thaliana defective in the acquisition of tolerance to high temperature stress. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 4392-4397.

111.Hong S.W., U. Lee, Vierling E. (2003) Arabidopsis hot mutants define multiple functions required for acclimation to high temperatures. Plant Physiol., 132, 757767.

112. Hughes P.R., Weinstein L.H., Johnson L.M., Braun A.R. (1985) Fluoride transfer in the environment: accumulation and effects on cabbage looper Trichop-lusia ni of fluoride from water soluble salts and hydrogen fluoride-fumigated leaves. Environmental Pollution Series A, 37, 175-192.

113. Hunter B., Bomblies K. (2010) Progress and Promise in Using Arabidopsis to Study Adaptation, Divergence, and Speciation. The Arabidopsis Book 8: eO 138. (in print), http^/www.bioone.org/doi/abs/l 0.1199/tab.013 8

114. Howarth C.J. (1991) Molecular responses of plants to an increased incidence of heat shock. Plant Cell Environ., 14, 831-841.

115. Huang B., Xu C. (2008) Identification and characterization of proteins associated with plant tolerance to heat stress. J. Integr. Plant. Biol., 50, 1230-1237.

116. Inan G., Zhang Q., Li P.H., Wang Z.L., Cao Z.Y., Zhang H., Zhang C.Q., Quist T.M., Goodwin S.M., Zhu J.H. (2004) Salt cress: a halophyte and cryo-phyte Arabidopsis relative model system and its applicability to molecular genetic analyses of growth and development of extremophiles. Plant Physiol., 135, 17181737.

117. Izquierdo-Vega J.A., Sanchez-Gutierrez M., Del Razo L.M. (2008) Decreased in vitro fertility in male rats exposed to fluoride-induced oxidative stress damage and mitochondrial transmembrane potential lloss. Toxicol. Appl. Pharmacol., 230, 352-357.

118. Kamaluddin M., Zwiazek J.J. (2003) Fluoride inhibits root water transport and affects leaf expansion and gas exchange in aspen (Populus tremuloides) seedlings. Physiol Plant., 117, 368-375.

119. Kant S., Bi Y.M., Weretilnyk E., Barak S., Rothstein S.J. (2008). The Arabidopsis halophytic relative Thellungiella halophila tolerates nitrogen-limiting conditions by maintaining growth, nitrogen uptake, and assimilation. Plant Physiol., 147, 1168-1180.

120. Kanzaki H., Saitoh H., Ito A., Fujisawa S., Kamoun S., Katou S., Yoshioka H., Terauchi R. (2003) Cytosolic HSP90 and HSP70 are Essential Components of INFI-mediated Hypersensitive Response and Non-Host Resistance to Pseudomonas cichorii in Nicotiana benthamiana. Mol. Plant Pathol, 4, 383-391.

121. Karube H., Nishitai G., Inageda K., Kurosu H., Matsuoka M. (2009) NaF activates MAPKs and induces apoptosis in odontoblast-like cells. J Dent Res., 88, 461-465.

122. Katiyar-Agarwal S., Agarwal M., Gallie D.R., Grover A. (2001) Search for the cellular functions of plant Hspl00/Clp family proteins. Crit Rev Plant Sei., 20, 277-295.

123. Kerr, J.F., Wyllie A.H., Currie A.R. (1972) Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. Br. J. Cancer, 26, 239257.

124. Kimpel J.A., Key J.L. (1985) Heat shock in plants. Trends in Biochem. Sei., 10, 353-357.

125.Klumpp A., Klumpp G., Domingos M., Silva M.D. (1996) Fluoride impact on native tree species of the Atlantic Forest near Cubatao, Brazil. Water Air Soil Poll, 78, 57-71.

126. Kotak S., Larkindale J., Lee U., von Koskull-Döring P., Vierling E., Scharf

K.D. (2007) Complexity of the Heat Stress Response in Plants. Curr. Opin. Plant Biol, 10,310-316.

127. Kregel K.C. (2002) Heat shock proteins: modifying factors in physiological stress responses and acquired thermotolerance. J. Appl. Physiol. 92. 2177-2186.

128. Kumar S. (2007) Caspase function in programmed cell death. Cell Death Differ., 14, 32-43.

129. Kumar M., Busch W., Birke H., Kemmerling B., Nürnberger T., Schöffl F.

(2009) Heat Shock Factors HsfBl and HsfB2b Are Involved in the Regulation of Pdf 1.2 Expression and Pathogen Resistance in Arabidopsis. Molecular Plant, 1, 152-165.

130.Kuroyanagi M., Yamada K., Hatsugai N., Kondo M., Nishimura M., Hara-Nishimura I. (2005) Vacuolar processing enzyme is essential for mycotoxin-induced cell death in Arabidopsis thaliana. J Biol Chem., 280, 32914-32920.

131. Kuzmin E.V., Karpova O.V., Elthon T.E., Newton K.J. (2004) Mitochondrial respiratory deficiencies signal up-regulation of genes for heat shock proteins. J. Biol. Chem., 279, 20672-20677.

132. Laemmli U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assemble of the head bacteriophage T4. Nature, 5259, 680-685.

133. Larkindale, J., Knight M.R. (2002) Protection against heat stress-induced oxidative damage in Arabidopsis involves calcium, abscisic acid, ethylene, and salicylic acid. Plant Physiol, 128, 682-695.

134. Larkindale J., Hall J.D., Knight M.R., Vierling E. (2005) Heat stress pheno-types of Arabidopsis mutants implicate multiple signaling pathways in the acquisition of thermotolerance. Plant Physiol., 138, 882-897.

135.Lee U., Wie C., Escobar M.et al. (2005) Genetic analysis reveals domain interactions of Arabidopsis HsplOO/ClpB and cooperation with the small heat shock protein chaperone system. Plant Cell, 2, 559-571.

136. Lee U., Rioflorido I., Hong S.W., Larkindale J., Waters E.R., Vierling E. (2007) The Arabidopsis ClpB/HsplOO family of proteins: chaperones for stress and chloroplast development. Plant J., 49, 115-127.

137. Lee J.H., Jung J.Y., Jeong Y.J., Park J.H., Yang K.H., Choi N.K., Kim S.H., Kim W.J. (2008) Involvement of both mitochondrial- and death receptor-dependent apoptotic pathways regulated by Bcl-2 family in sodium fluoride-induced apoptosis of the human gingival fibroblasts. Toxicology, 243, 340-347.

138. Leo S., Bianchi K., Brini M., Rizzuto R. (2005) Mitochondrial calcium signalling in cell death. FEBS J., 272, 4013-22.

139. Less L.N., McGregor A., Jones L.H.P., Cowling D.W., Leafe E.L. (1975) Fluoride uptake by gas from aluminium smelter fume. International Journal of Environmental Studies, 7, 153-160.

140.Li S., Fu Q., Huang W., Yu D. (2009) Functional Analysis of an Arabidopsis Transcription Factor WRKY25 in Heat Stress. Plant Cell Rep., 28, 683-693.

141. Lim C.J., Hwang J.E., Chen H., Hong J.K., Yang K.A., Choi M.S., Lee K.O., Chung W.S., Lee S.Y., Lim C.O. (2007) Over-Expression of the Arabidopsis DRE/CRT-Binding Transcription Factor DREB2C Enhances Thermotolerance. Biochem. Biophys. Res. Commun., 362, 431-436.

142. Lim C.J., Yang K.A., Hong J.K., Choi J.S., Yun D.J., Hong J.C., Chung W.S., Lee S.Y., Cho M.J., Lim C.O. (2006) Gene expression profiles during heat acclimation in Arabidopsis thaliana suspension-culture cells. Plant Res., 119, 373383.

143. Lindquist S. (1986) The heat shock response. Annu. Rev. Biochem., 45, 39-72.

144. Lindquist S., Craig E.A. (1988) The heat shock proteins. Annu. Rev. Genet., 22, 631-677.

145. Lister R., Chew O., Lee M.N., Heazlewood J.L., Clifton R., Parker K.L., Millar A.H., Whelan J. (2004) A transcriptomic and proteomic characterization of the Arabidopsis mitochondrial protein import apparatus and its response to mitochondrial dysfunction. Plant Physiol., 134, 777-789.

146. Logan D., Knight M. (2003) Mitochondrial and cytosolic calcium dynamics are differentially regulated in plants. Plant Physiol., 133, 21-24.

147. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L. et al. (1957) Protein measurement with the folin phenol reagent. J. Biol. Chem., 193, 265-275.

148. Lugli E., Troiano L., Ferraresi R., Roat E., Prada N., Nasi M., Pinti M., Cooper E.L., Cossarizza A. (2005) Characterization of cells with different mitochondrial membrane potential during apoptosis. Cytometry A., 68, 28-35.

149.Madeo F., Fröhlich E., Ligr M., Grey M., Sigrist S.J., Wolf D.H., Fröhlich K.U. (1999) Oxygen stress: a regulator of apoptosis in yeast. J Cell Biol, 145, 757767.

150. Maimbo M., Ohnishi K., Hikichi Y., Yoshioka H., Kiba A. (2007) Induction of a Small Heat Shock Protein and its Functional Roles in Nicotiana Plants in the Defense Response Against Ralstonia solanacearum. Plant Physiol, 145, 1588-99.

151. Mayer M.P. (2010) Gymnastics of molecular chaperones. Mol Cell, 3, 321-331.

152. McCabe P.F., Leaver C.J. (2000) Programmed cell death in cell cultures. Plant Mol Biol, 44, 359-68.

153. McLaughlin S.B., Barnes R.L. (1975) Effects of fluoride on photosynthesis and respiration of some south-east American forest trees. Environmental Pollution, 8, 93-96.

154. McNulty B., Newman D.W. (1961) Mechanism(s) of fluoride induced chlorosis. Plant physiology, 36, 385 - 388.

155. Mendoza-Schulz A., Solano-Agama C., Arreola-Mendoza L., Reyes-Marquez B., Barbier O., Del Razo L.M., Mendoza-Garrido M.E. (2009) The effects of fluoride on cell migration, cell proliferation, and cell metabolism in GH4C1 pituitary tumour cells. Toxicol. Lett., 190, 179-186.

156. Miller GW. (1993) The Effect of Fluoride on Higher Plants with Special Emphasis on Early Physiological and Biochemical Disorders. Fluoride, 26, 3-22.

157. Miller J.E., Miller G.W. (1974) Effects of fluoride in fluoride on mitochondrial activity in higher plants. Physiologia Plantarum, 32, 115-121.

158. Miller G., Mittler R. (2006) Could Heat Shock Transcription Factors Function as Hydrogen Peroxide Sensors in Plants? Ann Bot., 98, 279-288.

159. Mittler R., Tel-Or E. (1991) Oxidative stress responses and shock proteins in the unicellular cyanobacterium Synechococcus R2 (PCC-7942). Arch Microbiol., 155, 125-130.

160. Milleron R.S., Bratton S.B. (2006) Heat shock induces apoptosis independently of any known initiator caspase-activating complex. J Biol Chem., 25, 16991-7000.

161.Mochamed A.N. (1970) Chromosomal changes in maize induced by hydrogen fluoride gas. Can. J. Genet. Cytology, 12, 241-244.

162. Murashige T., Skoog F. (1962) A revised medium for rapid growth and bioas-says with tobacco tissue cultures. Physiol. Plantarum, 15, 473-479.

163. Murphy A.J., Hoover J.C. (1992) Ingibition of the Na, K-ATPase by Fluoride. The Journal of Biological Chemistry, 24, 16995-17000.

164. Nover L., Bharti K., Doring P., Mishra S.K., Ganguli A., Scharf K.D. (2001) Arabidopsis and the heat stress transcription factor world: how many heat stress transcription factors do we need? Cell Stress Chaperones, 6, 177-189.

165. Ogawa D., Yamaguchi K., Nishiuchi T. (2007) High-Level Overexpression of the Arabidopsis HsfA2 Gene Confers not Only Increased Themotolerance but Also

Salt/Osmotic Stress Tolerance and Enhanced Callus Growth. J. Exp. Bot, 58, 33733383.

166. Otsuki S., Morshed S.R., Chowdhury S.A., Takayama F., Satoh Т., Hashimoto K., Sugiyama K., Amano O., Yasui Т., Yokote Y., Akahane K., Sakagami

H. (2005) Possible link between glycolysis and apoptosis induced by sodium fluoride. J Dent Res., 84, 919-23.

167. Pallepati P., Averill-Bates D. (2010) Mild thermotolerance induced at 40 degrees С increases antioxidants and protects HeLa cells against mitochondrial apoptosis induced by hydrogen peroxide: Role of p53. Arch Biochem Biophys., 495, 97-111.

168. Pant S., Pant P., Bhiravamurthy P.V. (2008) Effects of fluoride on early root and shoot growth of typical crop plants of India. Research report Fluoride, 1, 5760.

169. Parcellier A., Schmitt E., Gurbuhani S. (2003) Hsp27 is a ubiquitin-binding protein involved in I-kappaBalpha proteasomal degradation. Mol. Cell Biol., 23, 5790-5802.

170. Parsell D.A., Kowal A.S., Singer M.A. (1994) Protein disaggregation mediated by heat-shock protein Hspl04. Nature, 372, 475-478.

171. Patalakh I.I., Grishko V.N. (2000) Estimation of plant cuticle water retention in ecotoxicological analysis. Доп. Нац. АН Украши, 9, 185-190.

172. Piper P.W. (1993) Molecular events associated with acquisition of heat tolerance by the yeast Saccharomyces cerevisiae. FEMSMicrobiol. Rev., 11, 339-355.

173. Powers M.V., Workman P. (2007) Inhibitors of the heat shock response: biology and pharmacology. FEBSLett., 581, 3758-69.

174. Pozniakovsky A.I., Knorre D.A., Markova O.V. et al. (2005) Role of mitochondria in the pheromone- and amiodarone-induced programmed death of yeast. J. Cell Biol, 168, 257-269.

175. Queitsch C., Hong E., Vierling S. (2000) Lindquist Heat shock protein 101 plays a crucial role in thermotolerance in Arabidopsis. Plant Cell, 12, 479-492.

176. Rakowski K.J., Zwiazek J.J. (1992) Early effects of hydrogen fluoride on water relations, photosynthesis and membrane integrity in eastern white pine (Pinus stro-bus) seedlings. Environmental and Experimental Botany, 33, 377-382.

177. Rakowski K.J., Zwiazek J.J., Sumner M.J. (1995) Hydrogen fluoride effects on plasma membrane composition, ATPase activity and cell structure in needles of eastern white pine (Pinus strobus) seedlings. Trees, 9, 190-194.

178. Reape T.J., McCabe P.F. (2008) Apoptotic-like programmed cell death in plants. New Phytol., 180, 13-26.

179.Reape T.J., Molony E.M., McCabe P.F. (2008) Programmed cell death in plants: distinguishing between different modes. Journal of Experimental Botany, 3,435-444.

180. Reape T.J., McCabe P.F. (2010) Apoptotic-like regulation of programmed cell death in plants. Apoptosis, 15, 249-56.

181. Reddy M.P., Kaur M. (2008) Sodium Fluoride Induced Growth and Metabolic Changes in Salicornia brachiata roxb. Water Air and Soil Pollution, 188, 171-179.

182. Reynolds K. L., Laurence J. A. (1988) Effects of Hydrogen Fluoride on Growth, Common Blight Development, and the Accumulation of Fluoride in Field-Grown Red Kidney Beans. Phytopathology, 78, 1168-1173.

183. Rhoads D.M., White S.J., Zhou Y., Muralidharan M., Elthon T.E. (2005) Altered gene expression in plants with constitutive expression of a mitochondrial small heat shock protein suggests the involvement of retrograde regulation in the heat stress response. Physiol. Plant., 123, 435-444.

184. Riccardi C., Nicoletti I. (2006) Analysis of apoptosis by propidium iodide staining and flow cytometry. Nature Protocols, 1, 1458 - 1461.

185. Richter K., Haslbeck M., Buchner J. (2010) The heat shock response: life on the verge of death. Molecular Cell, 2, 253-266.

186. Rikhvanov E.G., Varakina N.N., Rusaleva T.M., Rachenko E.I., Knorre D.A., Voinikov V.K. (2005) Do Mitochondria Regulate the Heat-Shock Response in Saccharomyces cerevisiae? Curr. Genet., 48, 44-59.

187. Rikhvanov E.G., Gamburg K.Z., Varakina N.N., Rusaleva T.M., Fedoseeva I.V., Tauson E.L., Stupnikova I.V., Stepanov A.V., Borovskii G.B., Voinikov V.K. (2007) Nuclear-mitochondrial cross-talk during heat shock in Arabidopsis cell culture. Plant J, 52, 763-778.

188. Ritossa F. (1962) A new puffing pattern induced by heat shock and DNP in Dro-sophila. Experientia, 18, 571-573.

189. Rizhsky L., Davletova S., Liang H., Mittler R. (2004) The zinc finger protein Zatl2 is required for cytosolic ascorbate peroxidase 1 expression during oxidative stress in Arabidopsis. Journal of Biological Chemistry, 279, 11736-11743.

190.Rozhkov A.S., Mikhailova T.A. (1993) The effects of fluorine-containing emissions on conifers. Berlin, Heidelberg: Springer- Verlag, 143 p.

191.Saidi Y., Finka A., Goloubinoff P. (2011) Heat perception and signalling in plants: a tortuous path to thermotolerance. New Phytologist, 3, 556-565.

192. Sakaki K., Tashiro K., Kuhara S., Mihara K. (2003) Response of genes associated with mitochondrial function to mild heat stress in yeast Saccharomyces ce-revisiae. J. Biochem., 134, 373-384.

193. Salvioli S., Ardizzoni A., Franceschi C. et al. (1997) JC-1, but not DiOC6(3) or rhodamine 123, is a reliable fluorescent probe to assess Ai|/ changes in intact cells: implications fer studies on mitochondrial functionality during apoptosis. FEBS Lett, 411, 77-82.

194. Sanmartin M., Jaroszewski L., Raikhel N.V., Rojo E. (2005) Caspases. Regulating death since the origin of life. Plant Physiol., 137, 841- 847.

195. Schirmer E.C., Lindquist S., Vierling E. (1994) An Arabidopsis heat shock protein complements a thermotolerance defect in yeast. Plant Cell, 12, 1899-1909.

196. Schirmer E.C., Glover J.R., Singer M.A. (1996) HSPlOO/Clp proteins: a common mechanism explains diverse functions. Trends Biochem. Sci., 8, 289-296.

197. Shabala S. (2009) Salinity and programmed cell death: unravelling mechanisms for ion specific signalling. J Exp Bot., 60, 709-712.

198. Sidhu S.S. (1979) Fluoride levels in air, vegetation and soil in the vicinity of a phosphorus plant. Journal of the Air Pollution Control Association, 29, 1069-1072.

199. Sireli M., Bulbul A. (2004) The effect of acute fluoride poisoning on nitric oxide and methemoglobin formation in the Guinea pig. Turkish Journal of Veterinary and Animal Sciences, 28, 591-595.

200. Siripornadulsil S., Traina S., Verma D.P., Sayre R.T. (2002) Molecular mechanisms of proline-mediated tolerance to toxic heavy metals in transgenic micro-algae. Plant Cell., 14, 2837-2847.

201. Skjelkvale, B.L. (1994) Water chemistry in areas with high deposition of fluoride. Sci. Total Environ. 152, 105-112.

202. Skulachev V.P. (2006) Bioenergetic aspects of apoptosis, necrosis and mitopto-sis. Apoptosis, 11, 473-485.

203. Stevens D. P.; McLaughlin M. J.; Aston A. M. (1998) Phytotoxicity of Fluoride Ion and its Uptake from Solution Culture by Avena sativa and Lycopersicon escu-lentum. Plant and Soil, 200, 119-129.

204. Stirling P.S., Lundin V.F., Leroux M.R. (2003) Getting a grip on non-native proteins. EMBORep., 4, 565-570.

205. Sung D.Y., Kaplan F., Lee K.J., Guy C.L. (2003) Acquired Tolerance to Temperature Extremes. Trends Plant Sci., 8, 179-187.

206. Sun Z.Y., Zhang X. J., Li F.Z. (2007) Phylogenetic relationship between Arabi-dopsis and Thellungiella (Cruciferae): evidence from leaf epidermal features and chloroplast sequence analysis. Botanica Yunnanica. 29. 632-638.

207. Sweetlove L.J., Heazlewood J.L., Herald V., Holtzapffel R., Day D.A., Leaver C. J., Millar A.H. (2002) The impact of oxidative stress on Arabidopsis mitochondria. Plant J., 32, 891-904.

208. Swidzinski J.A., Sweetlove L.J.,. Leaver C.J. (2002) A custom microarray analysis of gene expression during programmed cell death in Arabidopsis thaliana. Plant J., 30, 431-446.

209. Taji T., Seki M., Satou M., Sakurai T., Kobayashi M., Ishiyama K., Narusa-ka Y., Narusaka M., Zhu J.K., Shinozaki K. (2004) Comparative genomics in salt tolerance between Arabidopsis and Arabidopsis-related halophyte salt cress using Arabidopsis microarray. Plant Physiol., 135, 1697-1709.

210. Takagi H., Sakai K., Morida K., Nakamori S. (2000) Proline accumulation by mutation or disruption of the proline oxidase gene improves resistance to freezing and desiccation stresses in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Microbiol Lett, 184, 103-108.

211. Tang Y. Z., Dobbs F. C. (2007) Green autofluorescence in dinoflagellates, diatoms, and other microalgae and its implications for vital staining and morphological studies. Appl. Environ. Microbiol., 73, 2306-2313.

212. TenHouten J.G. (1974) Air pollution and horticulture. Proc. XIX Internat. Horticultural Congr., 2, 57-71.

213. Trent J.D., Osipiuk J., Pinkau T. (1990) Acquired thermotolerance and heat shock in the extremely thermophilic archaebacterium Sulfolobus sp. strain B12. J. Bacteriol., 172, 1478-1484.

214. Uren A.G., O'Rourke K., Aravind L.A., Pisabarro M.T., Seshagiri S., Koonin E.V., Dixit V.M. (2000) Identification of paracaspases and metacaspases: two ancient families of caspaselike proteins, one of which plays a key role in MALT lymphoma. Molecular Cell., 6, 961-967.

215. Vacca R.A., de Pinto M.C., Valenti D., Passarella S„ Marra E., De Gara L. (2004) Production of reactive oxygen species, alteration of cytosolic ascorbate peroxidase, and impairment of mitochondrial metabolism are early events in heat shock-induced programmed cell death in tobacco Bright-Yellow 2 cells. Plant Physiol., 134, 1100-1112.

216. Van Norman J.M., Benfey P.N. (2009) Arabidopsis thaliana as a Model Organism in Systems Biology. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med., 1, 372-379.

217. Vanlerberghe G.C., Mcintosh L. (1997) Alternative oxidase: from gene to function. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48, 703-734.

218. Vercammen D., Declercq W., Vandenabeele P., Van Breusegem F. (2007) Are metacaspases caspases? The Journal of Cell Biology, 179, 375-380.

219. Vierling E. (1991) The roles of heat shock proteins in plants. Plant Mol. Biol., 42, 579-620.

220. Vike E., Habjorg A. (1995) Variation in fluoride content and leaf injury on plants associated with three fluoride smelters in Norway. The Science of the Total Environment, 163, 25-34.

221. Voet D., Voet J.G. (1995) Glycolytic reaction, I. Enolase. In: Biochemistry. 2nd ed. Hoboken, NJ, USA: Chapter, 16.

222. Volkov V., Wang B., Dominy P.J., Fricke W., Amtmann A. (2004) Thellun-giella halophila, a salt-tolerant relative of Arabidopsis thaliana, possesses effective mechanisms to discriminate between potassium and sodium. Plant Cell Env., 27, 1-14.

223. Wahid A., Gelani S., Ashraf M., Foolad M.R. (2007) Heat tolerance in plants: An overview. Environmental and Experimental Botany, 61, 199-223.

224.Wang P.C., Du Y.Y., An G.Y, Zhou Y., Miao C., Song C.P. (2006) Analysis of Global Expression Profiles of Arabidopsis Genes Under Abscisic Acid and H202 Applications. Journal of Integrative Plant Biology, 48, 62-74.

225. Warrington P.D. (1992) Lower Kitimat River and Kitimat Arm: water quality assessment and objectives. Ministry of Environment and Parks, BC, Canada.

226. Watanabe N., Lam E. (2005) Two Arabidopsis metacaspases AtMCPlb and AtMCP2b are arginine/lysine-specific cysteine proteases and activate apoptosis-like cell death in yeast. Journal of Biological Chemistry, 280, 14691-14699.

227. Wegrzyn, R.D., Bapat K., Newnam G.P. (2001) Mechanism of prion loss after Hspl04 inactivation in yeast. Mol. Cell Biol, 21, 4656-4669.

228. Wei L.L. (1972) Effect of hydrogen fluoride on ultrastructure of soybean leaf cells. Dissertation, Utah State University, p. 166.

229. Weibezahn J., Schlieker C., Tessarz P. (2005) Novel insights into the mechanism of chaperone-assisted protein disaggregation. Biol Chem., 386, 739-744.

230. Weinstein L.H., Davison A. (2004) Fluorides in the Environment. Effects on Plants and Animals. CAB International, Wallingford. P. 287

231. Whitford G.M., Bawden J.W., Bowen W.H., Brown L.J., Ciardi J.E., Clark-son T.W., Imrey P.B., Kleerekoper M., Marthaler T.M., McGuire S., Ophaug R.H., Robinson C., Schultz J.S., Stookey G.K., Tochman M.S., Venkateswarlu P., Zero D.T. (1994) Report for Working Group I: strategies for improving the assessment of fluoride accumulation in body fluids and tissues. Advances in dental research, 8, 113-115.

232. Whitford G.M., Pashley D.H., Garman R.H. (1997) Effects of fluoride on structure and function of canine gastric mucosa, Dig. Dis. Sci., 42, 2146-2155.

233. Wiebe H.H., Poovaiah B.W. (1973) Influence of Moisture, Heat, and Light Stress on Hydrogen Fluoride Fumigation Injury to Soybeans. Plant Physiol, 52, 542-545.

234. Woltering E.J., van der Bent A., Hoeberichts F.A. (2002) Do plant caspases exist? Plant Physiol, 130, 1764-1769.

235. Warrington P.D. (1992) Lower Kitimat River and Kitimat Arm: water quality assessment and objectives. Ministry of Environment and Parks, BC, Canada.

236. Yaagoubi A.E., Mariethoz E., Jacquier-Sarlin M.R., Polla B.S. (1997) Redox regulation of heat shock protein expression and protective effects against oxidative stress. In: Oxidative stress in cancer, AIDS, and neurodegenerative diseases. New York, 113-125.

237. Yang J.Y., Sun Y., Sun A.Q. (2006) The involvement of chloroplast HSPlOO/ClpB in the acquired thermotolerance in tomato. Plant Mol. Biol., 62, 385395.

238. Yao N., Eisfelder B.J., Marvin J. et al. (2004) The mitochondrion - an organelle commonly involved in programmed cell death in Arabidopsis thaliana. Plant J., 40, 596-610.

239. Yu M.-H., Miller G.W. (1967) Effect of fluoride on the respiration of leaves from higher plants. Plant Cell Physiology, 8, 483-493.

240. Zhu J.K. (2001) Plant salt tolerance. Trends Plant Sci., 6, 66-71.

241. Zwiazek J.J., Shay J.M. (1988) The effects of sodium fluoride on cytoplasmic leakage and the lipid and fatty acid composition of jack pine (Pinus banksiana) seedlings. CanJBot., 66, 535-541.

Использованные ПЦР - праймеры

Название гена AGI л о кус Длина ожидаемых ПЦР-продуктов, п.H. Последоватальности ПЦР-праймеров

HSP101 at3g74310 1497 F 5' - GAATGCAGGACATGCTCAAT - 3'

КЬ'-СААСЫ I 1 IUGIGAGCAICA-3'

HSP60 at3g23990 890 F 5' - AGGGTGTTGAAGATCTTGCTG -3'

R 5' - ATTC ATG CCA AG CTCGTCTGT - 3'

HSP17.6CI atlg53540 652 F 5' - AAAACAGAGCAAACGCAAAG - 3'

R 5' - CACGAGACAAAGCACACTCTT - 3'

HSP17.6 Cil at5gl2020 325 F 5' - GTGCTTGTGGTGAGTGGAGA - 3'

R 5' - ACACCATATCCCTCACGCAT - 3'

MCI atlg02170 378 F 5' - CTCCTCCG С A ACCTTCCT - 3'

R 5' - CATCAACTTCATCACCGTTGT - 3'

МС2 at4g25110 682 F 5' - ACATTAGCGGATAAGCTTAAAGTCG- 3'

R 5' - CATAAGAATGCAAGATTCAGGGAAT - 3'

МСЗ at5g64240 1000 F 5' - AAAACCAAAACAAAGCTCAA - 3'

R 5' - ATAAGTC ATG G CTCCTGTGT - 3'

МС4 atlg79340 814 F 5' - GAGAACATCACCGTTCTCAT - 3'

R 5' - TAGCGGGTTTCACATAGTCT - 3'

МС7 atlg79310 550 F 5' -TAAGGAACAGATCGGAGAGA - 3'

R 5' - GACATCCACTCAACAGAA - 3'

МС9 at5g04200 978 F 5' - ATGGATCAACAAGGGATGGTC - 3'

R 5' - TCAAGGTTGAGAAAGGAACGTC - 3'

АСТ2 at3gl8780 420 F 5' - TTCCTCATGCCATCCTCCGTCTT - 3'

R 5' - CAGCGATACCTGAGAACATAGTGG - 3'

Влияние №С1 на сухую массу культур клеток А. ФаНапа и Т. яакщтеа

Культура Концентрация ИаС!, мМ

клеток 0 10 25 50 100 200

А. Сухая 70 75 71 64 38 11

гкаИапа масса, мг 66 83 68 69 39 7

80 85 75 71 49 10

Среднее 179,6 165,3 141,3 111,5 54,5 22

значение

%от 100 90,7 78,6 62,1 30,3 13,6

контроля

Т. Сухая 248 185 153 114 99 29

масса, мг 200 166 143 116 115 40

187 155 107 155 107 33

Среднее 211,6 168,6 134,3 128,3 107 34

значение

%от 100 79,6 63,5 60,6 50,5 16,1

контроля

Влияние на сухую массу культур клеток А. ИгаИапа и Т. заЬщтеа

Культура Концентрация ЫаР, мМ

клеток 0 1 2,5 5 7,5 10

А. Сухая 72 60 52 44 29 10

1каНапа масса, 76 65 50 34 27 14

мг 91 63 54 34 26 22

Среднее значение 79,6 62,6 52 39 28 15,3

%от

контроля 100 78,4 65,3 48,9 35,1 15,1

Т. Сухая 181 161 144 115 58 29

БаЬщтеа масса, 175 165 141 108 51 20

мг 183 170 139 93 55 17

Среднее значение 179,6 165,3 141,3 111,5 54,5 22

%от

контроля 100 90,7 78,6 62,1 30,3 13,6

л

Благодарности

Автор выражает благодарность всем, кто помогал, и без чьей помощи данная работа не вышла бы в свет.

В первую очередь хочется поблагодарить своих родственников за поддержку и заботу, своего научного руководителя Е.Г. Рихванова за постоянное внимание к работе, помощь в подготовке рукописи. Особую благодарность хочется выразить К.З. Гамбургу за ценные советы, постоянное консультирование по практическим и теоретическим вопросам, а также неоценимую помощь в обучении.

Автор выражает огромную благодарность Н.Н Варакиной, Т.М. Русалевой за помощь в постановке и проведении экспериментов, постоянную моральную поддержку и отзывчивость, а также A.B. Степанову, E.JI. Павловой за большую помощь в проведении экспериментов, ценные советы и замечания.

Отдельную благодарность автор выражает всему коллективу лаборатории фитоиммунологии за помощь в редакционной правке рукописи диссертации, ценные замечания и постоянный интерес к работе, а также за теплое отношение.

Хочется также поблагодарить коллектив лаборатории физиологической генетики за дружелюбное отношение и отзывчивость.

Также отдельное спасибо тем людям, кто проверял данную работу за ценные советы, внимательное прочтение и объективную критику.

Пуляевская Мария

/ ?