Вирус мозаики коровьего гороха как вектор для получения рекомбинантных антигенов вирусов гепатита B и гриппа A в растениях тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Мещерякова, Юлия Александровна

• Мещерякова, Юлия Александровна
• кандидат биологических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Мещерякова, Юлия Александровна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Типы вирусных векторов для экспрессии пептидов и полипептидов в 8 растениях

1.2. Системы презентации эпитопов

1.2.1.Системы презентации эпитопов на основе палочковидных вирусов

1.2.2.Снстемы презентации эпитопов на основе сферических вирусов 16 1.3 Системы экспрессии полипептидов

1.3.1.Вектора, сконструированные по принципу «замена гена»

1.3.2.Вектора, сконструированные по принципу «дополнительный ген»

1.3.2.1.Системы экспрессии полипептидов на основе палочковидных вирусов

1.3.2.2.Системы экспрессии полипептидов на основе сферических вирусов

1.4. Получение вирусоподобных частиц (ВПЧ) в растениях с помощью вирусных векторов

1.5. Стратегии «full virus» и «deconstructed virus»

1.6. Векторная система на основе делеционного варианта РНК-2 CPMV

1.7. Системы презентации внеклеточного домена М2 белка вируса гриппа А

1.8. Нуклеокапсид вируса гепатита В (HBcAg) человека как система презентации эпитопов и полипептидов

1.9. Вирусы растений и нанотехнологии 59 1.10 Заключение ^

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Растения и бактериальные штаммы

2.2. Животные

2.3. Штамм вируса гриппа

2.4. Питательные среды и антибиотики

2.5. Ферменты и коммерческие наборы

2.6. Реактивы и буфера

2.7. Синтетические олигопуклеотиды

2.8. Конструирование векторов экспрессии

2.9. Секвенирование ДНК

2.10. Приготовление компетентных клеток A.tumefaciens для электропорации

2.11. Трансформация A. tumefaci$ns и агроннфильтрация растений N. benthamiana и

V. шщшыйМа

2.12. Приготовление глицеринового стока культур АЛите/асгет

2.13. Приготовление грубого экстракта из листьев У.и

§шси1а1а для заражения здоровых растений

2.14. Выделение вирусных частиц СРМУ

2.15. Выделение РНК из вирусных частиц СРМУ для ОТ-ПЦР анализа

2.16. Частичная очистка ВПЧ НВс

§

2.17. Вестерн-блот анализ экспрессии белка нуклеокапсида в растениях Ы.ЬеШЬапиапа и 1т<^И1ск1а1а

2.18. Получение очищенных препаратов ВПЧ НВс

§

2.19. Иммуно-сорбентная электронная микроскопия (ШЕМ)

2.20. Трансмиссивная электронная микроскопия (ТЕМ)

2.21. Иммунологическое мечение золотом

2.22. Исследование нммуногеппых и протективных свойств химерных вирусных частиц СРМУ/М2е

2.22.1.Способ введения препарата, получение эмульсии, дозы и схема 71 иммунизации

2.22.2.Метод анализа специфических антител

2.22.3.Электронная микроскопия

2.22.4.Масс-спектрометрия

2.22.5.Статистический анализ

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Получение ВПЧ НВс

§ в растениях с помощью векторов на основе Х-ВК и полноразмерной РНК-2 СРМУ

3.1.¡.Конструирование векторов экспрессии НВс

§ на основе Х-ВК и СРМУ 74 3.1.2.Заражение растений Ы.ЬепШатйта и V.ип£шси1а1а и характер развития симптомов вирусной инфекции

ЗЛ.З.Исследование экспрессии белка нуклеокапсида НВУ в растениях

3.1 ^.Идентификация ВПЧ НВс

§ методом 1БЕМ

3.2. Получение ВПЧ НВс

§ с помощью векторной системы на основе делеционного варианта РНК-2 СРМУ

3.2.1.А.Конструирование вектора экспрессии НВс

§ на основе делеционного варианта РНК-2 СРМУ 84 З.2.1.Б. Конструирование вектора экспрессии НВс

§/М2е на основе делеционного варианта РНК-2 СРМУ

3.2.2.Агроинфильтрация растений N.benthamiana векторными конструкциями pBinP/Acore и pBinP/AcoreM2e и анализ экспрессии вариантов HBcAg

3.2.3.Электронно-микроскопическое исследование препаратов ВПЧ HBcAg

3.2.4.Исследование свойств ВПЧ HBcAg методом иммунологического мечения золотом 90 3.3. Система презентации внеклеточного домена М2-белка вируса гриппа А

М2е-эпитопа) человека и птиц на основе CPMV

3.3.1.Конструирование векторов экспрессии внеклеточного домена

М2-белка вируса гриппа А человека и птиц на основе CPMV

3.3.2.3аражение растений V. unguiculata и характер развития вирусной инфекции

3.3.3.Анализ генетической стабильности рекомбинантных вирусов

3.3.4.Выделение и анализ рекомбинантных вирусных частиц

3.3.5.Иммунизацияия мышей химерными вирусными частицами CPMV/M2eH и CPMV/M2eA

3.3.6.Изучение протективного действия препарата CPMV/M2eH на модели летальной гриппозной инфекции 101 ВЫВОДЫ 104 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 105 БЛАГОДАРНОСТИ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

РНК - рибонуклеиновая кислота

HBcAg - нуклеокапсид (кор-антиген)

ВПЧ - вирусоподобные частицы

БО - белок оболочки

ОРС - открытая рамка считывания

А.к.о.- аминокислотный остаток

ВИЧ-1-вирус иммунодефицита человека тип pi - изоэлектрическая точка

ВОЗ - Всемирная Организация Здравоохранения

НТО - нетранслируемая область

Трис - трис(оксиметил)аминометан

PBS - фосфатный солевой буфер

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

ДСН - додецилсульфат натрия

ПААГ - полиакриламидный гель

ПЭГ - полиэтиленгликоль п.н.- пар нуклеотидов

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ОП - оптическая плотность

LD- летальная доза

ИФА - иммуноферментный анализ

ЭТС-эмбриональная телячья сыворотка

ТМБ-тетраметилбензидин

ГМО-генно-модифицированный организм

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Вирус мозаики коровьего гороха как вектор для получения рекомбинантных антигенов вирусов гепатита B и гриппа A в растениях»

Технология рекомбинантных ДНК открыла широкие возможности для создания систем экспрессии белков как для фундаментальных исследований, так и для практического применения в современной медицине, для получения вакцин, антител, гормонов для заместительной терапии, факторов роста и т.д. Большинство белков в процессе синтеза подвергаются посттрансляционным модификациям, таким как гликозилирование, отщепление сигнальных пептидов, образование дисульфидных связей и, как следствие, в активном состоянии могуг быть получены только в эукариотических системах экспрессии.

Первые эукариотические системы экспрессии были основаны на технологии "клеточных биореакторов" с использованием культур клеток млекопитающих[1], насекомых [2], дрожжей [3]. Однако стоимость рекомбинантных белков, получаемых с помощью данных систем, достаточно высока, а в случае использования клеток животных существует риск наличия в них вирусных патогенов, опасных для человека.

Наиболее перспективными являются системы экспрессии на основе высших живых организмов-трансгенных животных и растений. Если использование трансгенных животных не снимает проблем безопасности, связанных с риском заражения патогенами, то системы экспрессии на основе растений являются привлекательной альтернативой по ряду причин.

Во-первых, системы экспрессии на основе растений дают возможность получить значительные количества биомассы без сравнительно больших энергетических и денежных затрат и специального оборудования для ферментации.

Во-вторых, исключена возможность заражения патогенами, опасными для человека и животных. В-третьих, системы посттрансляционной модификации в растениях обеспечивают синтез функционально активных белков.

В настоящее время существует три основных метода получения рекомбинантных белков в растениях: стабильная генетическая трансформация ядерного генома, генетическая трансформация генома хлоропластов и использование векторов экспрессии на основе вирусов растений.

Генетическая трансформация подразумевает стабильную интеграцию целевого гена в хромосому растения, либо методом агробактериальной трансформации [4], либо с помощью биолистической трансформации [5]. Основным преимуществом данного подхода является то, что интегрированная последовательность стабильно наследуется. Однако, процесс регенерации трансформированных растений довольно длительный и сложный, может занимать от 6 недель до 1 года, в зависимости от вида растения. Экспрессия трансгена подвержена влиянию таких факторов, как число копий трансгена, эффект положения, сайленсинг. Основным же недостатком трансгенных растений в качестве источника рекомбинантных белков является низкий уровень экспрессии.

Трансформация генома хлоропластов позволяет значительно повысить уровень экспрессии целевого белка, в некоторых случаях до 46% от общего количества растворимого белка [6]. Этот метод позволяет избежать таких негативных явлений, как эффект положения и сайленсинг, и кроме того, исключает попадание трансгена в окружающую среду с пыльцой, т.к. хлоропласты у большинства растений наследуются только по материнской линии. Основным недостатком данного метода является отсутствие системы гликозилирования белков в хлоропластах, что значительно ограничивает его использование.

Несмотря на то, что трансгенные растения, полученные с помощью вышеописанных методов, успешно использовались для получения различных белков, длительное время, необходимое для их получения и анализа, является основным недостатком таких систем, особенно в случае, когда необходимо одновременно протестировать несколько различных кассет экспрессии.

Альтернативой генетической трансформации является использование векторов экспрессии на основе вирусов растений. Одним из главных преимуществ данного метода является то, что вирус размножается внутри инфицированной клетки, и, следовательно, ген целевого белка в составе вирусного генома амплифицируется в большом количестве копий, что в сочетании со способностью многих вирусных векторов вызывать системную инфекцию, обеспечивает высокий уровень экспрессии в сравнительно короткий промежуток времени. Генно-инженерные манипуляции с геномами растительных вирусов относительно просты в силу небольшого размера их геномов.

За редким исключением, большинство вирусов растений не интегрирует в геном клетки-хозяина. Таким образом, ген целевого белка не наследуется и не передается через семена. Это с одной стороны является недостатком данной системы экспрессии, но с другой стороны экспрессия не подвержена эффекту положения.

Данная система экспрессии, как и любая другая, не лишена определенных недостатков.

Существуют ограничения по размеру и сложности последовательностей, которые могут экспресспроваться в составе вирусных векторов без нарушения способности вируса к репликации, сборке и транспорту. Основная проблема, связанная с использованием вирусных векторов-проблема генетической стабильности. РНК-содержащие вирусы растений, на основе которых создано большинство существующих векторов экспрессии, мутируют с высокой частотой из-за ошибок, возникающих в процессе синтеза РНК с участием РНК-иолимеразы, вследствие чего ннсерция обычно модифицируется и нередко делегируется в процессе вирусной инфекции. Тем не менее, несмотря на все перечисленные недостатки, системы экспрессии с использованием вирусных векторов являются более предпочтительными в случаях, когда необходимо быстро протестировать большое количество векторных конструкций, получить белок для исследований в максимально короткие сроки, исследовать возможное токсичное воздействие экспрессии белка интереса на рост и развитие растения. Т.к. многие вирусы растений способны инфицировать широкий круг хозяев, одна и та же векторная конструкция может быть использована для изучения влняния эффекта хозяина на экспрессию целевого белка.

К настоящему моменту создано множество различных векторных систем на основе вирусов растений, которые успешно используются как для получения пептидов и полипептидов в растениях, так и в фундаментальных исследованиях для изучения механизмов экспрессии генов. В то же время, до сих пор отсутствуют четкие критерии выбора оптимальной векторной системы для экспрессии того или иного целевого белка. В этой связи, интересным является сравнение эффективности различных векторных систем для экспрессии одного и того же полипептида, а также изучение влияния инсерции гена целевого белка на характер развития вирусной инфекции.

Целью настоящей работы являлось создание векторных систем на основе вируса мозаики коровьего гороха (СРМУ) и Х-Вируса Картофеля (Х-ВК) для получения в растениях важных диагностических и протективных антигенов вирусов гепатита В человека (НВУ) и вируса гриппа человека и птиц типа А и исследование их сравнительной эффективности. Для этого в работе решались следующие задачи:

1. Конструирование и сравнительный анализ эффективности векторов экспрессии белка нуклеокапсида (НВсА§) в растениях на основе СРМУ и Х-ВК.

2. Исследование характера развития инфекции, а также способности к самосборке IIBcAg в тканях растений при его синтезе СРМУ или Х-ВК векторов.

3. Исследование возможности использования новой векторной системы на основе делеционного варианта РНК-2 СРМУ для оптимизации процедур выделения чистых препаратов ВПЧ НВсА§.

4. Создание системы презентации эпитопов внеклеточного домена М2 белка вируса гриппа А человека и птиц на основе СРМУ.

5. Исследование иммуногенных и протективных свойств внеклеточного домена М2 белка вируса гриппа А человека в составе частиц СРМУ при иммунизации мышей препаратами химерных вирусных частиц.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Мещерякова, Юлия Александровна

ВЫВОДЫ:

1. Впервые показана принципиальная возможность использования фитовирусных векторов для получения вирусоподобных частиц нуклеокапсида (HBcAg) вируса гепатита В в растениях N. ЬеМИатгапа и V. иг^шси1Ша, а также разработан метод выделения таких частиц из растений с помощью дифференциального центрифугирования.

2. Создана эффективная и генетически безопасная система экспрессии и очистки HBcAg на основе делеционного варианта РНК-2 вируса мозаики коровьего гороха для получения в растениях препаратов вирусоподобных частиц нуклеокапсида.

3. Разработана система презентации внеклеточного домена М2е-белка вируса гриппа А человека и птиц на основе вируса мозаики коровьего гороха.

4. Инсерция последовательностей М2е эпитопов в область РВ-(ЗС петли малого белка оболочки СРМУ оказывает негативное влияние на генетическую стабильность, репликацию и транспорт химерных вирусов СРМУ/М2е.

5. Химерные частицы СРМУ, несущие М2е эпитопы вируса гриппа, способны индуцировать образование специфических анти-М2е антител и вызывать частичную защиту лабораторных животных от инфекции низкими дозами вируса гриппа.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Мещерякова, Юлия Александровна, 2009 год

1. Hesse, F., Wagner, R. 2000. Developments and improvemenrs in the manufacturing of human therapeutics with mammalian cell cultures.Trends Biotechnol. 18(4): 173-80.

2. Kost, T.A, Condreay, J.P. 1999. Recombinant baculoviruses as expression vectors for insect and mammalian cells. Curr Opin Biotechnol. 10(5):428-33.

3. Eckart, M.R., Bussineau, C.M.1996. Quality and authenticity of heterologous proteins synthesized in yeast. Curr. Opin. Biotechnol. 7(5):525-30.

4. Horsh, R.B., Fry, J.E., Hoffmann, N.L., Eichholtz, D., Rogers, S.G., and Fraley, R.T., 1985. A simple and general method for transferring genes into plants. Science. 227: 1229-1231.

5. Christou, P. 1995. Particle bombardment. Methods cell biol. 50:375-82.

6. De Cosa, B., Moar, W., Lee, S.B., Miller, M., Daniell, H. 2001. Overexpression ofthe Bt cry2A2 operon in chloroplasts leads to formation insecticidal crystals. Nat. Biotechnol. 19(1):71-74.

7. Szeto, W.W, Hamer, D.H, Carlson, P.S, Thomas, C.A Jr. 1977.Cloning of Cauliflower Mosaic Virus (CaMV) DNA in E. coli. Science. 8:196(4286):210-2.

8. Hull, R. 1978. The possible use of of plant viral DNAs in genetic manipulation in plants. Trends in Biochemical Sciences. 3: 254-256.

9. Porta, C. and G.P.Lomonossoff. 2002. Viruses as vectors for the expression of foreign sequences in plants. Biotechnol. Genet. Eng Rev. 19: 245-291.

10. Siegel, A. 1985. Plant virus-based vectors for gene transfer may be of considerable use despite a presumed high error frequency during RNA synthesis. Plant Molecular Biology. 4: 327-329.

11. Ahlquist, P, and Janda, M. 1984. cDNA cloning and in vitro transcription of the complete brome mosaic virus genome. Molecular and Cellular Biology. 4:2876-2882.'

12. Lomonossoff, G.P. and Johnson, J.E. 1996. Use of macro molecular assemblies as expression systems for peptides and synthetic vaccines. Curr. Opin. Struct. Biol. 6: 176-182.

13. Dawson, W.O., Lewandowsky, D.J., Hilf, M.E., Bubrick, P., Raffo, A.J., Shaw, J.J., Grantham, G.L., and Desjardins, P.R. 1989. A tobacco mosaic virus-hybrid expresses and loses an added gene. Virology. 172:285-292.

14. Pogue, G.P., Lindbo, J.A., Garger, S.J., and Fitzmaurice W.P. 2002. Making an ally from an Enemy: plant virology and new agriculture. Annu.Rev.Phytopathol. 40:45-74.

15. Takamatsu, N., Watanabe, Y., Yanagi, H., Meshi, T., Shiba, T., and Okada, Y. 1990. Production of enkephalin in tobacco protoplasts using tobacco mosaic virus RNA vector. FEBS Lett. 269:73-76.

16. Turpen, T.H., Reinl, S.J., Charoenvit, Y., Hoffman, S.L., Fallarme, V., and Grill, L.K. 1995. Malarial epitopes expressed on the surface of recombinant tobacco mosaic virus. Biotechnology (NY). 13:53-57.

17. Fitchen, J., Beachy, R.N., and Hein., M.B. 1995. Plant virus expressing hybrid coat protein with added murine epitope elicits autoantibody response. F«ccme.l3:1051-1057.

18. Beachy, R.N., Fitchen, J.H., and Hein, M.B. 1996. Use of plant viruses for delivery of vaccine epitopes. Ann.N. Y. AcadSci. 792:43-49.

19. Bendahmane, M., Koo, M., Karrcr, E., and Beachy, R.N. 1999. Display of epitopes on the surface of tobacco mosaic virus:impact of charge and isoelectric point of the epitope on virus-host interactions. J.Mol.Biol. 290:9-20.

20. Jaspars, E.M. 1985. Interaction of alfalfa virus nucleic acids and protein. In "Molecular Plant Virology", vol.1. (J.W. Davies, Ed.) pp.151-221, CRC Press, Boca raton, Florida.

21. Modelska, A., Dietzschold, B., Sleysh , N., Fu, Z. F., Steplewski, K., Hooper, D.C., Koprowski, H., and Yusibov, V. 1998. Immunization against rabies with plant-derived antigen. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95:2481-2485.

22. Smith,G.P. 1985. Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science. 228: 1315-1317.

23. Jungbauer,A. and R.Hahn. 2004. Engineering protein A affinity chromatography. Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 7: 248-256.

24. Werner, S., S.Marillonnet, G.Hause, V.Klimyuk, and Y.Gleba. 2006. Immunoabsorbent nanoparticles based on a tobamovirus displaying protein A. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 103: 17678-17683.

25. Fernandez-Fernandez, M.R., Martinez-Torrecuadrada, J.L., Casal, J.I., and Garcia, J.A. 1998. Development of an antigen presentation system based on plum pox potyvirus. FEBS lett. 427:229235.

26. Fernandez-Fernandez, M.R., J.L.Martinez-Torrecuadrada, F.Roncal, E.Dominguez, and J.A.Garcia. 2002. Identification of immunogenic hot spots within plum pox potyvirus capsid protein for efficient antigen presentation. J. Virol. 16: 12646-12653.

27. Huisman, M.J., Linthorst, H.J., bol, J.F., Cornelissen, J.C.1988. The complete nucleotide sequence of potato virus X and its homologies at the amino acid level with various plus-stranded RNA viruses. J. Gen. Virol.69:1789-98.

28. Chapman, S., Kavanagh, T., and Baulcombe, D. 1992. Potato virus X as a vector for gene expression in plants. Plant Journal. 2: 549-557.

29. Baulcombe, D., Chapman, S., and Santa Cruz, S. 1995. Jellyfish green fluorescent protein as a reporter for virus infections. Plant Journal. 7: 1045-1053.

30. Santa Cruz, S., Chapman, S., Roberts, A.G., Roberts, I.M., Prior, D.A.M., and Oparka, K.J., 1996. Assembly and movement of a plant virus carrying a green fluorescent protein overcoat. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93: 6286-6290.

31. Koenig, R. and Torrance, L. 1986. Antigenic analysis of potato virus X by means of monoclonal antibodies./. Gen. Virol. 67:2145-2151.

32. Santa Crus, S., Roberts, A.G., Prior, D.A.M., Chapman, S. and Oparka, K.J. 1998. Cell-to-cell and phloem-mediated transport of potato virus X: the role of virions. Plant Cell. 10: 495-510.

33. Lee, A.G. 2003. Lipid-protein interactions in biological membranes:a structural perspective. Biochim. Biophys. Acta 1612:1-40.

34. Scholthof, H.B., K.B.Scholthof, and A.O.Jackson. 1996. Plant virus gene vectors for transient expression of foreign proteins in plants. Annu. Rev. Phytopathol. 34: 299-323.

35. Hsu, H.T., Hsu, Y.H., Bi, I.P., Lin, N.S. and Chang. B.Y. 2004. Biological functions of the cytoplasmic TGBp 1 inclusions of bamboo mosaic potexvirus. Arch. Virol. 149: 1027-1035.

36. Yang, C.D., J.T.Liao, C.Y.Lai, M.H.Jong, C.M.Liang, Y.L.Lin, N.S.Lin, Y.H.Hsu, and S.M.Liang. 2007. Induction of protective immunity in swine by recombinant bamboo mosaic virus expressing foot-and-mouth disease virus epitopes. BMC. Biotechnol. 7: 62.

37. Russo, R., Burgyan, J., and Martelli, G.P., 1994. Molecular biology of tombusviridae. In "Advances in virus research", vol.44 (K. Maramorosch et al., eds.), pp. 381-428. Academic Press, New York.

38. Harrison, S.C. 1980. Protein interfaces and intersubunit bonding. The case of tomato bushy stunt virus. Biophys. J. 32: 139-153.

39. Olson, A.J., G.Bricogne, and S.C.Harrison. 1983. Structure of tomato busy stunt virus IV. The virus particle at 2.9 A resolution. J. Mol. Biol. 171: 61-93.

40. Scholthof, H.B., Monis, T .J., and Jackson, A.O., 1993. The capsid protein gene of tomato bushy stunt virus is dispensable for systemic movement and can be replaced for localized expression of foreign genes. Mol. Plant Microbe Interact. 6: 309-322.

41. Joelson, T., L.Akerblom, P.Oxelfelt, B.Strandberg, K.Tomenius, and T.J.Morris. 1997. Presentation of a foreign peptide on the surface of tomato bushy stunt virus. J. Gen. Virol. 78 ( Pt 6): 1213-1217.

42. Usha, R., J.B.Rohll, V.E.Spall, M.Shanks, A.J.Maule, J.E.Johnson, and G.P.Lomonossoff. 1993. Expression of an animal virus antigenic site on the surface of a plant virus particle. Virology 197: 366-374.

43. Porta, C., V.E.Spall, J.Loveland, J.E.Johnson, P.J.Barker, and G.P.Lomonossoff. 1994. Development of cowpea mosaic virus as a high-yielding system for the presentation of foreign peptides. Virology 202: 949-955.

44. Porta, C., V.E.Spall, T.Lin, J.E.Johnson, and G.P.Lomonossoff. 1996. The development of cowpca mosaic virus as a potential source of novel vaccines. Intervirology 39: 79-84.

45. Vos, P., Verver, J., van Wezenbeek, P., van Kämmen, A., Goldbach, R.1984.Study of genetic organization of a plant viral RNA genome by in vitro expression of a full-length DNA copy. EMBOJ. 3(13):3049-53.

46. Lomonossoff, G.P. and J.E.Johnson. 1996. Use of macromolecular assemblies as expression systems for peptides and synthetic vaccines. Curr. Opin. Struct. Biol. 6: 176-182.

47. Lin, T., C.Porta, G.Lomonossoff, and J.E.Johnson. 1996. Structure-based design of peptide presentation on a viral surface: the crystal structure of a plant/animal virus chimera at 2.8 A resolution. Fold. Des 1: 179-187.

48. Taylor, K.M., Lin, T., Porta, C., A.G.Mosser, H.A.Giesing, G.P.Lomonossoff, and J.E.Johnson. 2000. Influence of three-dimensional structure on the immunogenicity of a peptide expressed on the surface of a plant virus. J. Mol. Recognit. 13: 71-82.

49. Porta, C., V.E.Spall, J.Loveland, J.E.Johnson, P.J.Barker, and G.P.Lomonossoff. 1994. Development of cowpea mosaic virus as a high-yielding system for the presentation of foreign peptides. Virology. 202: 949-955.

50. Taylor, K.M., C.Porta, T.Lin, J.E.Johnson, P.J.Barker, and G.P.Lomonossoff. 1999. Position-dependent processing of peptides presented on the surface of cowpea mosaic virus. Biol. Chem. 380: 387-392.

51. Cleveland, S.M., T.D.Jones, and N.J.Dimmock. 2000. Properties of a neutralizing antibody that recognizes a conformational form of epitope ERDRD in the gp41 C-terminal tail of human immunodeficiency virus type I. J. Gen. Virol. 81: 1251-1260.

52. Rennermalm, A., Y.II.Li, L.Bohaufs, C.Jarstrand, A.Brauner, F.R.Brennan, and J.I.Flock. 2001. Antibodies against a truncated Staphylococcus aureus fibronectin-binding protein protect against dissemination of infection in the rat. Vaccine 19: 3376-3383.

53. French, R., M.Janda, and P.Ahlquist. 1986. Bacterial Gene Inserted in an Engineered RNA virus: Efficient Expression in Monocotyledonous Plant Cells. Science 231: 1294-1297.

54. Mori, M., G.H.Zhang, M.Kaido, T.Okuno, and I.Furusawa. 1993. Efficient production of human gamma interferon in tobacco protoplasts by genetically engineered brome mosaic virus RNAs. J. Gen. Virol. 74 ( Pt 7): 1255-1260.

55. Sacher, R., R.French, and P.Ahlquist. 1988. Hybrid brome mosaic virus RNAs express and are packaged in tobacco mosaic virus coat protein in vivo. Virology 167: 15-24.

56. Takamatsu, N., M.Ishikawa, T.Meshi, and Y.Okada. 1987. Expression of bacterial chloramphenicol acetyltransferase gene in tobacco plants mediated by TMV-RNA. EMBOJ. 6: 307-311.

57. Dorokhov, Y.L., A.A.Sheveleva, O.Y.Frolova, T.V.Komarova, A.S.Zvereva, P.A.Ivanov, and J.G.Atabekov. 2007. Superexprcssion of tuberculosis antigens in plant leaves. Tuberculosis. (Edinb.) 87: 218-224.

58. Dawson, W.O., D.J.Lewandowski, M.E.Hilf, P.Bubrick, A.J.Raffo, J.J.Shaw, G.L.Grantham, and P.R.Desjardins. 1989. A tobacco mosaic virus-hybrid expresses and loses an added gene. Virology 172: 285-292.

59. Donson, J., C.M.Kearney, M.E.Hilf, and W.O.Dawson. 1991. Systemic expression of a bacterial gene by a tobacco mosaic virus-based vector. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 88: 72047208.

60. Shivprasad, S., Pogue, G., Lewandowski, D. J., Hidalgo, J., Donson, J., Grill, L. K., and Dawson, W. O. 1999. Heterologous sequences greatly affect foreign gene expression in tobacco mosaic vims-based vectors. Virology. 255, 312-323.

61. Verch, T., V.Yusibov, and H.Koprowski. 1998. Expression and assembly of a full-length monoclonal antibody in plants using a plant virus vector. J. Immunol. Methods 220: 69-75.

62. Kumagai, M.H., J.Donson, G.la-Cioppa, and L.K.Grill. 2000. Rapid, high-level expression of glycosylated rice alpha-amylase in transfected plants by an RNA viral vector. Gene 245: 169-174.

63. Yusibov, V., S.Shivprasad, T.H.Turpen, W.Dawson, and H.Koprowski. 1999. Plant viral vectors based on tobamoviruses. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 240: 81-94.

64. Grimsley, N., B.Hohn, T.Hohn, and R.Walden. 1986. "Agroinfection," an alternative route for viral infection of plants by using the Ti plasmid. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A S3: 3282-3286.

65. Grimsley, N. 1995. Agroinfection. Methods Mol. Biol 44: 325-342.

66. Marillonnet, S., C.Thoeringer, R.Kandzia, V.Klimyuk, and Y.Gleba. 2005. Systemic Agrobacterium tumefaciens-mediated transfection of viral replicons for efficient transient expression in plants. Nat. Biotechnol. 23: 718-723.

67. Gleba, Y., V.Klimyuk, and S.Marillonnet. 2005. Magnifection-a new platform for expressing recombinant vaccines in plants. Vaccine 23: 2042-2048.

68. Lindbo, J.A. 2007. TRBO: a high-efficiency tobacco mosaic virus RNA-based overexpression vector. Plant Physiol 145: 1232-1240.

69. Chiba, M., J.C.Reed, A.I.Prokhnevsky, E.J.Chapman, M.Mawassi, E.V.Koonin, J.C.Carrington, and V.V.Dolja. 2006. Diverse suppressors of RNA silencing enhance agroinfection by a viral replicon. Virology 346: 7-14.

70. Toth, R.L., G.P.Pogue, and S.Chapman. 2002. Improvement of the movement and host properties of a plant virus vector through DNA shuffling. Plant J. 30: 593-600.

71. Baulcombe, D. 2004. RNA silencing in plants. Nature 431: 356-363.

72. Baulcombe, D.C. 2006. Short silencing RNA: the dark matter of genetics? Cold Sprirz-^ Harb Symp. Quant. Biol. 71: 13-20. ^

73. Baulcombe, D.C. and A.Molnar. 2004. Crystal structure of pl9-a universal suppressor of RNA silencing. Trends Biochem. Sci. 29: 279-281.

74. Hendy, S., Z.C.Chen, H.Barker, C.S.Santa, S.Chapman, L.Torrance, W.Cockburn, and G.C.Whitelam, 1999. Rapid production of single-chain Fv fragments in plants using a potato virus X episomal vector. J. Immunol. Methods 231: 137-146.

75. Franconi, R., Roggero, P., Arias, F.J., Desidero, A. 1999. Functional expression in bacteria and plants of an scFV antibody fragment against tospoviruses. Immunotechnology. 4: 189-20 1

76. O'Brien, G. J., Bryant, C. J., Voogd, C., Greenberg, H. B., Gardner, R C., and Bellamy, A. R 2000. Rotavirus VP6 expressed by PVX vectors in Nicotiana benthamiana coats PVX rocls and also assembles into viruslike particles. Virology. 270: 444-453.

77. Saitoh, H., Kiba, A., Nishihara, M., Yamamura, S., Suzuki, K., Terauchi, R. 2001. Production of antimicrobial defensin in Nicotiana benthamiana with potato virus X vector. Mol. Plarit Microbe Interact. 14:111-115.

78. Smolenska, L., Roberts, I. M., Learmonth, D., Porter, A. J., Harris, W. J., Wilson, T. lyi. and Santa, C. S. 1998. Production of a functional single chain antibody attached to the surface of a plant virus. FEBS lett. 441: 379-382.

79. Scholthof, H.B., Scholthof, K.B.G., and Jackson, A.O. 1995. Identification of tomato bushy stunt virus host-specific symptom determinants by expression of individual genes from a potato virus X vector. Plant Cell. 7: 1157-1172.

80. Sonoda, S., Koiwa, H., Kanda, K., kato, H, Shimono, M., and Nishiguchi, M.2000. The helper component proteinase of sweet potato feathery mottle virus facilitates systemic spread of potato virus X in Ipomoea nil. Phytopathology. 90: 944-50.

81. English, J.J., Mueller, E., and Baulcombe, D. 1996. Suppression of virus accumulation in transgenic plants exhibiting silencing of nuclear genes. Plant cell. 8: 179-188.

82. Brigneti, G., Voinnet, O., Li, W.x., Ji, L.H., Ding, S.W., and baulcombe, D. 1998. Viral pathogenicity determinants are suppressors of transgene silencing in Nicotiana benthamiana EMBO Journal. 17: 6739-6746.

83. Burton, R.A., Gibeaut, D.M., Bacic, A., Findlay, K., Roberts, K., Hamilton., A., Baulcombe D.C. and Fincher, G.B. 2000. Virus-induced silencing of a plant cellulose synthase gene. Piant Cell. 12, 691-705.

84. Jones, L., Hamilton, A.J., Voinnet, O., Thomas, C.L., Maule, A.J., Baulcombe, D.C. 1999 RNA-DNA interactions and DNA methylation in post-transcriptioan gene silencing. Plant Cell 11:2291-2301.

85. Wagner, B., Fuchs, H, Adhami, F., Ma, Y., Scheiner, O., and Breiteneder, H. 2004. Plant virus expression systems for transient production of recombinant allergens in Nicotiana benthamiana. Methods. 32:227-234.

86. Guo, H.S., J.J.Lopcz-Moya, and J.A.Garcia. 1998. Susceptibility to recombination rearrangements of a chimeric plum pox potyvirus genome after insertion of a foreign gene. Vims Res. 57 : 183-195.

87. Folimonov, A.S., S.Y.Folimonova, M.Bar-Joseph, and W.O.Dawson. 2007. A stable RNA virus-based vector for citrus trees. Virology 368: 205-216.

88. Karasev, A.V., V.P.Boyko, S.Gowda, O.V.Nikolaeva, M.E.Hilf, E.V.Koonin, C.L.Niblett, K.Cline, D.J.Gumpf, R.F.Lee, and . 1995. Complete sequence of the citrus tristeza virus RNA genome. Virology 208: 511-520.

89. Hilf, M.E., A.V.Karasev, H.R.Pappu, D.J.Gumpf, C.L.Niblett, and S.M.Garnsey. 1995. Characterization of citrus tristeza virus subgenomic RNAs in infected tissue. Virology 208: 576582.

90. Alzhanova, D.V., A.J.Napuli, R.Creamer, and V.V.Dolja. 2001. Cell-to-cell movement and assembly of a plant closterovirus: roles for the capsid proteins and Hsp70 homolog. EMBOJ. 20: 6997-7007.

91. Rohll, J.B., Holness, C.L Lomonossoff, G.P.and Maule, A.J. 1993. 3'-terminal nucleotide sequences important for the accumulation of cowpea mosaic virus M-RNA. Virology 193: 672-679.

92. Dessens, J.T. and G.P.Lomonossoff. 1993. Cauliflower mosaic virus 35S promoter-controlled DNA copies of cowpea mosaic virus RNAs are infectious on plants. J. Gen. Virol. 74 ( Pt 5): 889892.

93. Liu, L. and G.Lomonossoff. 2002. Agroinfection as a rapid method for propagating Cowpea mosaic virus-based constructs. J. Virol. Methods 105: 343-348.

94. Liu, L., M.C.Cañizares, W.Monger, Y.Perrin, E.Tsakiris, C.Porta, N.Shariat, L.Nicholson, and G.P.Lomonossoff. 2005. Cowpea mosaic virus-based systems for the production of antigens and antibodies in plants. Vaccine 23: 1788-1792.

95. Zhang, C., Ghabrial, S.A. 2006. Development of bean pod mottle virus-based vectors for stable protein expression and sequence-specific virus-induced gene silencing in soybean. Virology. 344 (2):401-11.

96. Walmsley, A. M. and Arntzen, C. J. 2000. Plants for delivery of edible vaccines. Curr. Opin.Biotechnol. 11: 126-129.

97. McAleer, W.J., Buynak, E.B., Maigetter, R.Z., Wampler., D.E,. Miller, W.J., Hilleman, M.R. 1984. Human hepatitis B vaccine from recombinant yeast. Afa/i¿n?.307:178-180.

98. Harper, D.M., Franco, E.L., et al. 2004. Efficacy of a bivalent LI virus-like particle vaccine in prevention of infection with human papillomavirus types 16 and 18 in young women: a randimized control trial. Lancet. 364:1757-1765.

99. Kimchy-Sarfaty, C., Arora, M., et al. 2003. High capacity of packaged SV 40 vectors with no SV 40 virus sequences. Human Gene therapy. 14: 167-177.

100. Touze, A., Coursaget. 1998. In vitro gene transfer using human papillomavirus virus-like particlcs. Nucleic Acids res. 26: 1317-1323.

101. Yamada, T., Iwasaki, Y., et al., 2003. Nanoparticles for the delivery of genes and drugs to human hepatocytes. Nat.Biotechnol. 21:885-890.

102. Lee, I.H., Kim, C.II.,Ryu, W.S. 1996. Presentation of the hydrophilic domains of hepatitis C viral E2 envelope glycoprotein on hepatitis B surface antigen particles./.Med. Virol.50:145-151.

103. Schlienger, K., Manchini, M., et al., 1992. Human immunodeficiency virus type 1 major neutralizing determinant exposed on hepatitis B surface antigen particles is highly immunogenic in primates .J. Virol 66:2570-2576.

104. Natilla, A., R.W.Hammond, and L.G.Nemchinov. 2006. Epitope presentation system based on cucumber mosaic virus coat protein expressed from a potato virus X-based vector. Arch. Virol. 151: 1373-1386.

105. Smith, T.J., Chase, E., Schmidt, T, Perry, K.L. 2000. The structure of cucumber mosaic virus and comparison to cowpea chlorotic mottle virus. J. Virol 74: 7578-7586.

106. Palukaitis, P., Roossinck, M.J., Dietzgen, R.G., Francki, R.I.B., 1992. Cucumber Mosaic Virus. Adv. Vims. ites.41:281-348.

107. Zhao, Y. and R.W.Hammond. 2005. Development of a candidate vaccine for Newcastle disease vims by epitope display in the Cucumber mosaic vims capsid protein. Biotechnol. Lett. 27: 375-382.

108. Lot, H., Marrou, J., Quuiot, J.B., Esvan, C., 1972. A contribution to the study on cucumber mosaic vims (CMV). II. Quick method of purification. Ann Phytopath. 4: 25-38.

109. He, X., Liu, S., Perry, K.L., 1998. Identification of epitopes in cucumber mosaic vims using a phage-displayed random peptide library. J. Gen. Virol. 79:3145-3153.

110. Bowman, V.D., Chase, E.s., Franz, A.W., Chipman, P.R., Zhang, X., Perry, K.L., Baker, T.S., Smith, T.J. 2002. An Antibody to the putative aphid recognition site on cucumber mosaic vims recognizes pentons but not hexons. J.Virol. 76:12250-12258.

111. Warzecha, H., Mason, H.S., Lane, C., Tryggvesson, A., Rybicki, E., Williamson, A.L., Clements, J.D., Rose, R.C. 2003. Oral immunogenicity of human papillomavirus-like particles expressed in potato. J. Virol. 77:8702-8711.

112. Varsani, A., A.L.Williamson, D.Stewart, and E.P.Rybicki. 2006. Transient expression of Human papillomavirus type 16 LI protein in Nicotiana benthamiana using an infectious tobamovirus vector. Virus Res. 120: 91-96.

113. Fligge, C., Giroglou, T., Streeck, R.E., Sapp, M. 2001. induction of type specific neutralizing antibodies by capsomeres of human papillomavirus type 33. Virology. 283: 353-357.

114. Giroglou, T., Sapp, M., Lane, C., Fligge, C., Christensen, N.D., Streeck. R.E., Rose, R.C. 2001. Immunological analysis of human papillomavirus capsids. Vaccine. 19: 1783-1793.

115. Labbe, M., Charpilienne, A., Crawford, S.E., Estes., M.K., Cohen, J. 1991. J. Virol. 65(6): 2946-52.

116. Crawford, S.E., Labbe, M., Cohen, J, Burroughs, M.H., Zhou, Y.J., Estes, M.K.1994.Characterization of vims-like particles produced by the expression of rotavirus capsid proteins in insect cells.J F/ro/.68(9):5945-52.

117. Burns, J.W., Siadat-Pajouh, M., Krishnaney, A.A., and Greenberg, H.B., 1996. Protective effect of rotavirus VP6- specific IgA monoclonal antibodies that lack neutralizing activity. Science. 272. 104-107.k

118. Huang, Z., L.Santi, K.LePore, J.Kilbourne, C.J.Arntzen, and H.S.Mason. 2006. Rapid, highlevel production of hepatitis B core antigen in plant leaf and its immunogenicity in mice. Vaccine 24: 2506-2513.

119. Marillonnet, S., Giritch, A., Gils, M., kandzia, R., Klimyuk, V., and Gleba, Y. 2004. In planta engineering of viral RNA replicons; efficient assembly by recombination of DNA modules delivered by Agrobacterium. PNAS. 101(18):6852-6857.

120. Glcba Y, Marillonnet S, Klimyuk V.2004. Engineering viral expression vectors for plants: the "full" virus and the "deconstructed" virus strategies. Curr Opin Plant Biol. 7(2): 182-188.

121. Mallory, A.c., Parks, G., Endress, M.W., Baulcombe, D., Bowman, L.H., Prusss, G.J., Vance, V.B.2002. The amplicon-plus system for high-level expression of transgene in plants. Nat. biotechnology. 20: 622-625.

122. Holt C.A. Beachy, R.N., 1991. In vivo complementation of infectious transcripts from mutant tobacco'mosaic virus c DNA in transgenic plants. Virology. 181: 109-117.

123. Werner, S., S.Marillonnet, G.Hause, V.Klimyuk, and Y.Gleba. 2006. Immunoabsorbent nanoparticles based on a tobamovirus displaying protein A. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 103: 17678-17683.

124. Komarova TV, Skulachev MV, Zvereva AS, Schwartz AM, Dorokhov YL, Atabekov JG.2006. New viral vector for efficient production of target proteins in plants. Biochemistry (Mosc). 71(8):846-50.

125. Vergunst, AC, Jansen, LE, Hooykaas, PJ. 1998. Site-specific integration of agrobacterium T-DNA in Arabidopsis thaliana mediated by Crc recombinase.Afac/e/c Acids Res. 26(ll):2729-34.

126. Becker, G.W., Hsiung, H.M., 1986. Expression, secretion and folding of human growth hormone in E.coli. purification and cjaracterization. FEBS lett. 204 (1): 145-150.

127. Gils, M., R.Kandzia, S.Marillonnet, V.Klimyuk, and Y.Gleba. 2005. High-yield production of authentic human growth hormone using a plant virus-based expression system. Plant Biotechjiol. J. 3: 613-620.

128. Canizares, M.C., L.Liu, Y.Perrin, E.Tsakiris, and G.P.Lomonossoff. 2006. A bipartite system for the constitutive and inducible expression of high levels of foreign proteins in plants. Plant Biotechnol J. 4: 183-193.

129. Liu, L., J.Grainger, M.C.Canizares, S.M.Angell, and G.P.Lomonossoff. 2004. Cowpea mosaic virus RNA-1 acts as an amplicon whose effects can be counteracted by a RNA-2-encoded suppressor of silencing. Virology 323: 37-48.

130. Canizares, M.C., K.M.Taylor, and G.P.Lomonossoff. 2004. Surface-exposed C-terminal amino acids of the small coat protein of Cowpea mosaic virus are required for suppression of silencing. J. Gen. Virol. 85: 3431-3435.

131. Verch, T., V.Yusibov, and H.Koprowski. 1998. Expression and assembly of a iull-length monoclonal antibody in plants using a plant virus vector. J. Immunol Methods 220: 69-75.

132. Dietrich, C., Mais, E. 2003. Fluorescent labeling reveals spatial separation of potyvirus population in mixed infected Nicotiana benthamiana plants. J. Gen. Virol. 84(ptl0):2871-6.

133. Giritch A, Marillonnet S, Engler C, van Eldik G, Botterman J, Klimyuk V, Gleba Y.2006.Rapid high-level expression of full-size IgG antibodies in plants coinfected with noncompeting viral vectoi s.Proc Natl Acad Sci U S A. 103(40): 14701-6.

134. Sainsbury, F. and G.P.Lomonossoff. 2008. Extremely High-Level and Rapid Transient Protein Production in Plants without the Use of Viral Replication. Plant Physiol 148: 1212-1218.

135. Johnson, N.P., Mueller, J. 2002. Updating the accounts: global mortality of the 1918-1920 "Spanish" influenza pandemic. Bull Hist Med. 6: 105-115.

136. Gerdill, C. 2003. The annual production cycle for influenza vaccine. Vaccine. 21: 1776-1779.

137. Cox, N.J., Subbarao, K., 1999. Influenza. Lancet. 354: 1277-82.

138. Zebedee, S.L., and Lamb, R.A., 1989. Nucleotide sequences of influenza A virus RNA segment 7: a comparison of five isolates. Nucleic Acid res. 17: 2870.

139. Ito, T., Corman, O.T., Kawaoka, Y., Bean, W.J., and Webster, R.G. 1991. Evolutionary analysis of the influenza A virus M-gene with comparison of the Ml and M2 proteins. J. Virol. 65: 5492-5498.

140. Sugrue, R.J., and Hay, A. J. 1991. Structural Characteristics of the m2 protein of influenza A viruses: evidence that it forms a tetrameric channel. Virology. 180: 617-624.

141. Zebedee, S.L., and Lamb, R.A., 1988. Influenza virus A M2 protein: monoclonal antibody restriction of virus growth and detection of M2 in virions. J. Virol. 62: 2762-2772.

142. Treanor, J. J., Tierney, E.L., Zebedee, S.L., Lamb, R.A., and Murphy, B.R. 1990. Passively transferred monoclonal antibodies to the M2 protein inhibits influenza A virus replication in mice. J.Virol. 64: 1375-1377.

143. Black, R.A., Rota, P.A., Gorodkova, N., Klenk, H.D., and Kendal, A.P., Antibody response to the M2 protein of influenza A virus expressed in insect cells. J. Gen. Virol. 74: 143-146.

144. Slepushkin, V.A. et al. 1995. Protection of mice against influenza A virus challenge by vavaccination with baculovirus-expressed M2 protein. Vaccine. 13: 1399-1402.

145. Neirynck, S., Deroo, T., Saelens X., Vanlandschoot, P., Jou, W.M., Fiers W.,1999. A universal influenza A vaccine based on the extracellular domain of the M2 protein. Nat Med. 5:1157-63.

146. Wingfield PT, Stahl SJ, Williams RW, Steven AC.1995. Hepatits core antigen produced in E.coli: subunit composition, conformational analysis, and in vitro capsid assQvs^o\y.Biochemistjy. 34(15):4919-32.

147. Zheng, J., Schodel, F., Peterson, D.L., 1992. The structure of hepadnaviral core antigens. Identification of free thiols and determination of the disulfide bonding pattern. J. Biol.Chem. 267: 9422-94-29.

148. De Filette M, Min Jou W, Birkett A, Lyons K, Schultz B, Tonkyro A, Resch S, Fiers W. 2005. Universal influenza A vaccine: optimization of M2e-based constructs. Virology. 337(1): 149-61.

149. Nemchinov, L.G. and A.Natilla. 2007. Transient expression of the ectodomain of matrix protein 2 (M2e) of avian influenza A virus in plants. Protein Expr. Purif. 56: 153-159.

150. Pumpens, P. and E.Grens. 1999. Hepatitis B core particles as a universal display model: a structure-function basis for development. FEBS lett. 442: 1-6.

151. Scaglioni, P.P., M.Melegari, and J.R. Wands. 1997. Posttranscriptional regulation of hepatitis B virus replication by the precore protein. J. Virol. 71: 345-353.

152. Zhou, S. and D.N.Standring. 1992. Hepatitis B virus capsid particles are assembled from core-protein dimer precursors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89: 10046-10050.

153. Wynne, S.A., R.A.Crowther, and A.G.Leslie. 1999. The crystal structure of the human hepatitis B virus capsid. Mo/. Cell 3: 771-780.

154. Kratz, P.A., B.Bottcher, and M.Nassal. 1999. Native display of complete foreign protein domains on the surface of hepatitis B virus capsids. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 96: 1915-1920.

155. Bottcher, B., S.A.Wynne, and R.A.Crowther. 1997. Determination of the fold of the core protein of hepatitis B virus by electron cryomicroscopy. Nature 386: 88-91.

156. Milich, D.R., D.L.Peterson, F.Sehodel, J.E.Jones, and J.L.Hughes. 1995. Preferential recognition of hepatitis B nucleocapsid antigens by Thl or Th2 cells is epitope and major histocompatibility complex dependent. J. Virol. 69: 2776-2785.

157. Chen, J.Y. and F.Li. 2006. Development of hepatitis C virus vaccine using hepatitis B core antigen as immuno-carrier. World J. Gastroenterol. 12: 7774-7778.

158. Touze, A., N.Enogat, Y.Buisson, and P.Coursaget. 1999. Baculovirus expression of chimeric hepatitis B virus core particles with hepatitis E virus epitopes and their use in a hepatitis E immunoassay./. Clin. Microbiol. 37: 438-441.

159. Tsuda, S., K.Yoshioka, T.Tanaka, A.Iwata, A.Yoshilcawa, Y.Watanabe, and Y.Okada. 1998. Application of the human hepatitis B virus core antigen from transgenic tobacco plants for serological diagnosis. Vox Sang. 74: 148-155.

160. Wizemann, H., F.Weiland, E.Pfaff, and B.A.von. 2000. Polyhistidine-tagged hepatitis B core particles as carriers of HIV-l/gpl20 epitopes of different HIV-1 subtypes. Biol. Chem. 381: 231243.

161. Burrell, C.J., P.Mackay, P.J.Greenaway, P.H.Hofschneider, and K.Murray. 1979. Expression in Escherichia coli of hepatitis B virus DNA sequences cloned in plasmid pBR322. Nature 279: 4347.

162. Hilditch, C.M., L.J.Rogers, and D.H.Bishop. 1990. Physicochemical analysis ofthe hepatitis B virus core antigen produced by a baculovirus expression vector. J. Gen. Virol. 71 (Pt 11): 27552759.

163. Zhou, S., S.Q.Yang, and D.N.Standring. 1992. Characterization of hepatitis B virus capsid particle assembly in Xenopus oocytes. .7. Virol. 66: 3086-3092.

164. Stcinmetz, N.F., and Evans, D.J.2007. Utilization of plant viruses in bionanotechnology. Org. Biomol. Chem. 5: 2891-2902.

165. Wu, L., L.Jiang, Z.Zhou, J.Fan, Q.Zhang, H.Zhu, Q.Han, and Z.Xu. 2003. Expression of foot-and-mouth disease virus epitopes in tobacco by a tobacco mosaic virus-based vector. Vaccine 21: 4390-4398.

166. Mechtcheriakova, I.A., M.A.Eldarov, L.Nicholson, M.Shanks, K.G.Skryabin, and G.P.Lomonossoff. 2006. The use of viral vectors to produce hepatitis B virus core particles in plants. J. Virol. Methods 131: 10-15.

167. McCormick, A.A., T.A.Corbo, S.Wykoff-Clary, L.V.Nguyen, M.L.Smith, K.E.Palmer, and G.P.Pogue. 2006. TMV-peptide fusion vaccines induce cell-mediated immune responses and tumor protection in two murine models. Vaccine 24: 6414-6423.

168. Kapusta, J., Modelska, A., Figlerowicz, M., Pniewski, T., Letellier, M., Lisowa, O., Yusibov, Koprowski, H., Plucienniczak, A., and Legocki, A.B. 1999. A plant-derived edible vaccine against hepatitis B virus. FASEB J. 13: 1796-1799.

169. Mason, H. S., Ball, J. M., Shi, J. J., Jiang, X., Estes, M. K., and Amtzen, C. J. 1996. Expression of Norwalk virus capsid protein in transgenic tobacco and potato and its oral immunogenicity in mice. Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 93: 5335-5340.

170. Mason, H.S., Lam, D.M.K., and Arntzen, C.J. 1992. Expression of hepatitis B surface antigen in transgenic plants. Proc. Natl. aced. Sci.USA. 89:11745-11749.

171. Richter, L.J., Thanavala, Y., Arntzen, C.J., and mason, H.S. 2000. Production oh hepatitis B surface antigen in transgenic plants for oral immunization. Nature Biotechnology. 18: 1167-1171.

172. Smith., M.L., Richter, L., Arntzen, C.J., Shulcr, M.L., and mason, H.S. 2003. Structural characterization of plant-derived hepatitis B surface antigen employed in oral immunization studies. Vaccine.HAQ 11-4021.

173. Ehsani, P., Khabiri, A., and Domansky, N.N. 1997. Polypeptides of hepatitis B surface antigen in transgenic plants. Proc. Natl. Acad. Sei. 190:107-111.

174. Huang, Z., G.Elkin, B.J.Maloney, N.Beuhner, C.J.Arntzen, Y.Thanavala, and H.S.Mason. 2005. Virus-like particle expression and assembly in plants: hepatitis B and Norwalk viruses. Vaccine 23: 1851-1858.

175. Crowther J.R. 2001. The Elisa Guidebook, Methods in Molecular Biology. 149, Clifton, NJ.: Humana Press.

176. Lomonossoff,G.P., and W.D.Hamilton. 1999. Cowpea mosaic virus-based vaccines. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 240: 177-189.

177. McLain,L., C.Porta, G.P.Lomonossoff, Z.Durrani, and N.J.Dimmock. 1995. Human immunodeficiency virus type 1-neutralizing antibodies raised to a glycoprotein 41 peptide expressed on the surface of a plant virus. AIDS Res. Hum. Retroviruses 11: 327-334.

178. Pogue, G.P., Lindbo, J.A., Garger, S.J., and Fitzmaurice W.P. 2002. Making an Ally from an Enemy: plant virology and new agriculture. Annu.Rev.Phytopathol.40:45-74.

179. Tonks, A. 2007. A spoonful of antigen. BMJ. 335:180-182.

180. Thanavala, Y., Mahoney, M., Pal, S., Scott, A., Richter, L., Natarajan, N., Goodvin, P., Arntzen, C., and masom, H.S.2005. Immunogenicity in humans of an edible vaccine for hepatitis B. PNAS, 102: 9.3378-3382.

181. Bichko, V. Pushko, P., Dreilina, D., Pumpen, P., Gren, E. 1985. Subtype aywvariant of hepatits B vims DNA primary structure analysis.FEBSlett. 185:208-212.

182. Wellink, J., van Kämmen, A. 1989. Cell-to-cell transport of cowpea mosaic virus requires both the 58/48 K proteins and the capsid proteins. J.Gen. Virol. 70:2279-2286.

183. Ma, S-W., Zhao, D.L., Yin, Z.Q., Mukherjee, R., Singh, B., Qin, H.Y., Stiller, C.R., and jevnikar, A.M. 1997. Transgenic plants expressing autoantigens fed to mice to induce oral immune tolerance. Nature Medicine. 3: 793-796.

184. Nicholson, L., Canizares, C.M., and Lomonossoff, G.P. 2006. Production of vaccines in GM plants. Plant Biotechnology. Edited by Nigel Halford. 164-192.

185. Hershberg, R.M., and Mayer, l.F. 2000. Antigen processing and presentation by intestinal epithelial cells-polarity and complexity. Immunology today.21:123-128.

186. Masuta, C., Yamana, T., Tacahashi, Y.2000. Development of clover yellow vein virus as an efficient, stable gene-expression system for legume species. Plant J. 23: 539-46.

187. MacFarlane, S.A., Popovich, A.H. 2000. Efficient expression of foreign proteins in roots from tobravirus vectors. Virology. 267: 29-35.

188. Choi, I.R., Stenger, D.C., Morris, T.J., French, R. 2000. A plant virus vector for systemic expression of foreign genes in cereals. Plant J. 23: 547-55.

189. Fiers, W. 2006. A universal vaccine against influenza. Bull. Med. Acad. R. Med. Belg. 161, 237-239.

190. Jegerlehner A., Schmitz N., Storni T., Bachmann M.F. 2004. Influenza A vaccine based on the extracellular domain of M2: weak protection mediated via antibody-dependent NK cell activity. J. Immunol. 172, 5598-3605.

191. Silva, M.S., Wellink, J., Goldbach, R.W., van Lent, J.W. 2002. Phloem loading and unloading of cowpea mosaic virus in Vigna unguiculata. J. Gen. Virol. 83:1493-504.

192. Fiers, W., De Filette, M., Birkett, A., Neirynck, S., Min Jou, W. 2004. A "universal" human influenza vaccine. Virus Res. 103 (1-2): 173-6.

193. Hellens, R., Mullineaux, P., Klee, H. 2000. Technical focus: a guide to Agrobacterium binary Ti vectors. Trends Plant Sci. 5(10):446-51.1. БЛАГОДАРНОСТИ: