Влияние базального уровня экспрессии генов эндонуклеаз Serratia marcescens и Anabaena sp. на свойства рекомбинантных штаммов Escherichia coli тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.03, кандидат биологических наук Крякунова, Елена Вячеславовна

• Крякунова, Елена Вячеславовна
• кандидат биологических наук
• 2011

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Крякунова, Елена Вячеславовна

УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ И СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 12 1.1.Нуклеазы

1.1.1. Нуклеаза Serratia marees cens

1.1.2. Нуклеаза Anabaena sp. 19 , 1.2. Ферменты, участвующие в структурной организации ДНК топоизомеразы)

• 1.2.1. ДНК-гираза

1.3. Клонирование генов

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Материалы исследования

2.2. Получение компетентных клеток

2.3. Трансформация компетентных клеток методом теплового шока

2.4. Выделение плазмидной ДНК

2.5. Электрофорез в агарозном геле

2.6. Индукция экспрессии генов исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз NucSma и Nue А

2.7. Жб'-электрофорез в полиакриламидном геле

2.8. Определение активности исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз NucSma и NucA с помощью индикаторного агара

2.9. Определение динамики роста рекомбинантных штаммов

E.coli LK111A и E.coli TGE

2.10. Конструирование референс-плазмиды рЕТсосоАтрСт Al

2.11. Реакция рестрикции

2.12. ДНК-лигазная реакция

2.13. Амплификация фрагментов гена bla с помощью ПНР

2.14. Определение минимальной ингибирующей концентрации антибиотика '

2.15. Определение количества ß-лактамазы

2.16. Определение частоты спонтанной элиминации плазмид

2.17. Статистическая обработка результатов

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Получение рекомбинантных штаммов Е. coli LK111À и Е. coli TGE

3.2. Индукция экспрессии генов исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз S.marcescens и Anabaena sp.

3.3. Определение активности исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз S.marcescens и Anabaena sp. с помощью индикаторного агара

3.4. Влияние базального уровня экспрессии генов исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз Serratia marcescens и Anabaena sp. на выживаемость рекомбинантных штаммов

Е. coli LK11IX и Е. coli TGE

3.5. Определение уровня устойчивости к ампициллину для рекомбинантных штаммов Е. coli LK111Ä и Е. coli TGE

3.6. Получение референс-плазмидырЕТсосоАтрСт

3.6.1. Конструирование референс-плазмиды рЕТсосоАтрСт на основе плазмиды рЕТсосоСт

3.6.2. Определение дозы гена Ыа в рекомбинантном штамме

Е. coli DH5a рЕТсосоАтрСт

ЪП. Определение количества генов Ыа в рекомбинантных штаммах

E.coli LK111Á и E.coli TGE

3.8. Определение стабильности наследования плазмид pHisNucSma и pHisNucA в рекомбинантных штаммах

Е. coli LK1 ИХ и Е. coli TGE

3.9. Определение устойчивости рекомбинантных штаммов E.coli LK11IX и Е. coli TGE900 к антибиотикам — ингибиторам репликации ДНК

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Влияние базального уровня экспрессии генов эндонуклеаз Serratia marcescens и Anabaena sp. на свойства рекомбинантных штаммов Escherichia coli»

Актуальность проблемы. В настоящее время методы генетической инженерии применяются для решения широкого круга задач в области микробиологии, биохимии, молекулярной биологии и биотехнологии [Глик и др., 2002]. Одной из таких задач является создание на основе технологии реком-бинантной ДНК штаммов, обладающих способностью синтезировать в большом количестве необходимый белок. Такой сверхсинтез может осуществляться как в результате повышения количества копий гена в клетке, так и в результате повышения интенсивности его транскрипции [Щелкунов, 2004].

Введение клонированного гена в составе вектора в бактериальную клетку может оказывать как положительное, так и отрицательное влияние на ее физиологические процессы. С одной стороны, векторная ДНК сообщает клетке-хозяину новые свойства, дающие ей селективные преимущества. С другой стороны, сверхсинтез продукта чужеродного гена, а также сам продукт могут оказывать негативное влияние на скорость роста и деления клеток [Su et al., 1990]. Поэтому необходимо контролировать процесс транскрипции для того, чтобы клонированный ген экспрессировался только на определенной стадии жизненного цикла клетки-хозяина и в определенный промежуток времени [Herman-Antosiewicz et al., 2001].

Для регуляции транскрипции клонированных генов часто применяют сильные промоторы, такие, как триптофановый [Стручкова И.В. и др., 2010], лактозный [Kalodimos et al., 2002], промоторы бактериофагов X [Valdez-Gruz et al., 2010], T7 [Du et al., 2009] для грамотрицательных, промоторы SPAC [Chen X. et al., 2009] и degQ [Nishito et al., 2010] для грамположительных микроорганизмов. Контроль за работой таких промоторов осуществляется с помощью специфических белков-репрессоров [Palomares et al., 2004], которые в случае trp- и /яс-оперонов действуют в операторном участке. Однако большинство используемых в настоящее время промоторов, транскрипция которых контролируется с помощью репрессора, допускают слабую экспрессию клонированного гена даже в присутствии репрессора в клетке, в результате чего происходит синтез репрессируемого белка в небольших количествах — так называемый базальный уровень экспрессии гена [Herman-Antosiewicz et al.,,2001; Bahar et al., 2011].

В последние годы эндонуклеазы Serratia marcescens {NucSma) и Anabaena sp. (NucA) находят широкое применение в биохимии, молекулярной биологии, медицине и сельском хозяйстве [Аликин и др., 1998]. Эти ферменты принадлежат к одному семейству родственных эндонуклеаз, активные сайты которых имеют одинаковую высококонсервативную аминокислотную последовательность, так называемый DRGH-мотив [Pingoud et al., 1999; Ghosh et al., 2007]. Для некоторых представителей семейства родственных нуклеаз показано участие в процессах, включающих размножение прай-меров для репликации митохондриальной ДНК в случае бычьей нуклеазы EndoG [Ruiz-Carillo et al., 1993], репарации и рекомбинации ДНК в случае Nucl [Dake et al., 1988; Rangarajan et al., 2001]. Для других представителей этого семейства и внеклеточных эндонуклеаз NucSma и NucA показана трофическая функция.

К настоящему времени гены эндонуклеаз NucSma и NucA проклонирова-ны в клетках Escherichia coli [Ball et al., 1987; Гимадутдинов и др., 1993; Meiss et al., 1998], но до сих пор не имеется достаточно данных о влиянии этих эндонуклеаз на клетки-хозяев и о влиянии клеток-реципиентов на свойства плазмид, содержащих эти гены. Ранее было показано, что экзогенные ДНКаза 1 и эндонуклеаза NucSma в малых дозах усиливают пролиферативные процессы в микробной клетке, а именно синтез ДНК, рост и деление клеток [Куприянова-Ашина, 1991], но до настоящего времени мало что известно о влиянии эндонуклеаз NucSma и NucA на гетерологичные клетки, в которых они экспрессируются на базальном уровне.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы - определить влияние базального уровня экспрессии генов исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз Serratia marcescens (NucSma) и Anabaena sp. {NucA) на свойства рекомбинантных штаммов Escherichia coli.

В соответствие с данной целью были поставлены следующие задачи:

1. Определить наличие базального уровня экспрессии генов исходных и му-тантных вариантов эндонуклеаз Serratia marcescens и Anabaena sp. в ре-комбинантных штаммах Е. coli LK11IX и Е. coli TGE900.

2. Сконструировать референс-плазмиду с известным числом копий для косвенного определения количества содержащихся в рекомбинантных штаммах Е. coli LK11IX и Е. coli TGE900 генов Ыа по количеству синтезируемой клетками ß-лактамазы.

3. Установить зависимость между количеством генов Ыа в плазмидах, количеством синтезируемой ß-лактамазы, уровнем устойчивости к ампициллину и активностью исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз Serratia marcescens и Anabaena sp. при базальном уровне экспрессии их генов в рекомбинантных штаммах Е. coli LK11IX и Е. coli TGE900.

4. Изучить влияние базального уровня экспрессии генов исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз NucSma и NucA на выживаемость рекомбинантных штаммов Е. coli LK11IX и Е. coli TGE900.

5. Установить влияние базального уровня экспрессии генов исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз Serratia marcescens и Anabaena sp. на стабильность наследования плазмид pHisNucSma и pHisNucA в рекомбинантных штаммах Е. coli LK11IX и Е. coli TGE900.

6. Установить зависимость уровня устойчивости рекомбинантных штаммов Е. coli LK111X и Е. coli TGE900 к ингибиторам репликации ДНК от активности исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз Serratia marcescens и Anabaena sp. при базальном уровне экспрессии их генов.

Положения, выносимые на защиту:

1. Увеличение активности исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз NucSma и NucA при базальном уровне экспрессии их генов повышает устойчивость рекомбинантных штаммов Е. coli LK111X и Е. coli TGE900 к ампициллину.

2. С увеличением активности исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз NucSma и NucA при базальном уровне экспрессии их генов увеличивается количество плазмид pHisNucSma и pHisNucA в клетках рекомбинантных штаммов Е. coli LK111X и Е. coli TGE900.

3. Экспрессия генов исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз NucSma и NucA на базальном уровне оказывает положительное влияние на выживаемость рекомбинантных штаммов Е. coli LK11IX и Е. coli TGE900.

4. С увеличением активности исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз NucSma и NucA при базальном уровне экспрессии их генов,в рекомбинантных штаммах Е. coli LK111X и Е. coli TGE900 плазмиды pHisNucSma и pHisNucA наследуются более стабильно.

5. Увеличение активности исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз NucSma и NucA при базальном уровне экспрессии их генов повышает устойчивость рекомбинантных штаммов Е. coli LK11IX и Е. coli TGE900 к налидиксовой кислоте.

Научная новизна. Впервые показано, что величина базального уровня экспрессии генов исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз NucSma и NucA зависит как от клетки-хозяина, так и от плазмиды. Установлено, что ба-зальный уровень экспрессии генов исходных и мутантных вариантов NucSma и NucA оказывает положительное воздействие на выживаемость бактерий. Получена референс-плазмида рЕТсосоАтрСт для косвенного определения количества генов Ыа по количеству синтезируемой бактериальной клеткой ß-лактамазы. Установлено, что в клетках рекомбинантных штаммов Е. coli LK111X и Е. coli TGE900 количество генов Ыа в плазмидах pHisNucSma и pHisNucA зависит от активности исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз NucSma и NucA при базальном уровне экспрессии их генов. Впервые показана возможность участия эндонуклеаз NucSma и NucA в репликации плаз-мидной ДНК в рекомбинантных штаммах Е. coli.

Научно-теоретическая и практическая значимость работы. Полученные в работе результаты вносят вклад в понимание способов регуляции экспрессии клонируемого гена в гетерологичной клетке и возможностей достижения сверхсинтеза его продукта. Полученные данные можно использовать для дальнейших исследований в области промышленной микробиологии для оптимизации синтеза эндонуклеаз NucSma и Nue Л рекомбинантными штаммами. Встраивание под сильный промотор гена клонируемого белка в одну плазмиду с геном исходного варианта эндонуклеазы NucSma в результате их совместной транскрипции в рекомбинантном штамме E.coli TGE900 даст возможность получать данный белок в промышленных масштабах.

Сконструированная в данной работе референс-плазмида может использо

• 1 ваться для косвенного определения количества генов Ыа в клетках микроорганизмов, а, следовательно, и количества копий плазмид, содержащих эти гены. Результаты исследования и примененные в работе методические приемы можно использовать при проведении практических и лекционных занятий по микробиологии и генетике микроорганизмов для студентов-биологов.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были представлены на XII Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2007); II Международной научно-практической конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии» (Казань, 2008); First Inteuniversity Conference on Modern Biology «Building the Future in Biology «Bio-News»» (Kazan, 2008); II Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз Россия 2009» (Пермь, 2009); V съезде вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2009); научно-практической конференции «Становление и достижения биохимической школы Казанского университета» (Казань, 2009); 2-ой Московской международной конференции «Молекулярная филогенетика MolPhy-2» (Москва, 2010); конференции «Наука в информационном пространстве» (Днепропетровск, 2010).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 научных работ, в том числе 4 статьи, из которых 2 - в журналах, рекомендованных ВАК.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Нуклеазы

Нуклеазы представляют собой обширную группу ферментов, расщепляющих фосфодиэфирные связи в молекулах нуклеиновых кислот и обладающих определенной специфичностью к химической природе оснований, углеводному компоненту и вторичной структуре субстрата. Нуклеиновые кислоты являются крайне устойчивыми к гидролизу биополимерами и при оптимальных для большинства клеток температурах (30°-40°С) гидролизуются крайне медленно, тогда как нуклеазы позволяют ускорить эту реакцию на величину порядка 1016 [Кнорре и др., 2000].

Нуклеазы принимают участие в различных процессах, происходящих в клетке, например, репликации, рекомбинации, репарации и деградации нитей ДНК. Различают несколько типов нуклеаз в зависимости от их специфичности: экзонуклеазы и эндонуклеазы, рибонуклеазы и дезоксирибонуклеазы, рестриктазы и так далее. Нуклеазы, гидролизующие нуклеотиды на концах молекулы ДНК называются экзонуклеазами, тогда как эндонуклеазы разрезают ДНК внутри цепи [Березов и др., 1998]. Нуклеазы, одинаково хорошо гидролизующие как ДНК, так и РНК-субстраты, называют сахаронеспеци-фичными [Rangarajan et al., 2001]. Основными биологическими функциями, которые выполняют нуклеазы в живой клетке, являются [Bickle et al., 1993]:

1. гидролиз нуклеиновых кислот (трофическая функция);

2. удаление чужеродных нуклеиновых кислот (защитная функция);

3. регуляция синтеза и распада нуклеиновых кислот в клетках.

Часто ферменты представляют собой димеры, состоящие из одинаковых субъединиц, каждая из которых содержит один активный сайт [Franke et al., 1999]. Так и сахаронеспецифичная эндонуклеаза S. marcescens (NucSma) имеет два каталитических центра, которые за один каталитический цикл разрезают две нити ДНК [Filimonova et al., 1981; Friedhoff et al., 1994b; Miller et al., 1996; Chen С. et al., 2009], в то время как эндонуклеаза Anabaena sp. (NucA) является мономерным ферментом и единовременно может разрезать только одну нить ДНК [Meiss et al., 1998].

Эндонуклеазы NucSma и NucÄ относятся к одной группе родственных сахаронеспецифических нуклеаз, представители которой были обнаружены во многих прокариотических и эукариотических организмах, таких как Streptococcus pneumoniae, цианобактериях, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccha-romyces pombe, Syncephalostrum racemosum, Bos taurus, Trypanosoma brucei, Caenorhabditis elegans, Borrelia burgdorferi, Mus musculus и Homo sapiens [Franke et al., 1999; Ghosh et al., 2007; Chen C. et al., 2009]. Поскольку эндонуклеазы NucSma и NucÄ являются наиболее типичными представителями данного семейства, то именно они и стали объектами данного исследования по изучению влияния гетерологичных эндонуклеаз на свойства рекомби-нантных штаммов.

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Крякунова, Елена Вячеславовна

ВЫВОДЫ:

1. Рекомбинантные штаммы Е. coli LK111X и Е. coli TGE900 обладают способностью к экспрессии генов исходных и мутантных вариантов эндонук-леаз NucSma и NucA на базальном уровне.

2. Получена референс-плазмида рЕТсосоАтрСт со строгим контролем количества копий, которая может использоваться для определения количества копий плазмид, содержащих ген Ыа.

3. Установлена зависимость между количеством плазмид pHisNucSma и pHisNucA в рекомбинантных штаммах Е. coli LK111X и Е. coli TGE900, количеством синтезируемой ß-лактамазы, уровнем устойчивости к ампициллину и активностью исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз NucSma и NucA при базальном уровне экспрессии их генов.

4. Показано, что базальный уровень экспрессии генов эндонуклеаз NucSma и NucA (за исключением токсичной эндонуклеазы NucA дикого типа) оказывает положительное воздействие на выживаемость рекомбинантных штаммов Е. coli LK11IX и Е. coli TGE900.

5. Установлена обратная зависимость между активностью исходного и мутантных вариантов эндонуклеазы NucSma при базальном уровне экспрессии их генов и стабильностью наследования плазмид pHisNucSma. Среди плазмид pHisNucA наиболее стабильно наследуются плазмиды, содержащие гены мутантных вариантов эндонуклеазы NucA с 1% и 10% нуклеаз-ными активностями.

6. Установлена зависимость между уровнем устойчивости рекомбинантных штаммов Е. coli LK11IX и Е. coli TGE900 к налидиксовой кислоте и активностью исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз NucSma и NucA при базальном уровне экспрессии их генов. Статистически значимых отличий в уровне устойчивости рекомбинантных штаммов Е. coli LK11IX и Е. coli TGE900 к новобиоцину в зависимости от активности эндонуклеаз NucSma и NucA при базальном уровне экспрессии их генов не было выявлено.

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Основным результатом данной работы является установление влияния базального уровня экспрессии генов исходных и мутантных вариантов NucSma и NucA на свойства рекомбинантных штаммов Escherichia coli.

Посредством температурной индукции рекомбинантных штаммов Е. coli TGE900, содержащих температурочувствительный белок-репрессор С1$57? было установлено, что гетерологичные клетки E.coli подходят для экспрессии на базальном уровне находящихся в плазмидах генов исходных и мутантных вариантов NucSma и NucA.

Как известно, большинство используемых в настоящее время генетических систем контролируемой транскрипции допускают слабую (базальную) экспрессию клонированного гена даже в присутствии белка-репрессора [Herman-Antosiewicz et al., 2001; Bahar et al., 2011]. Предположив существование экспрессии находящихся в плазмидах генов исходных и мутантных вариантов NucSma и NucA даже в присутствии белка-репрессора, выполнение экспериментов было начато с определения базального уровня экспрессии генов данных нуклеаз в рекомбинантных штаммах Е. coli LK111X и Е. coli TGE900. Для этого сначала определяли нуклеазную активность не подвергшихся температурной индукции рекомбинантных штаммов Е. coli LK11IX и Е. coli TGE900 с использованием метода индикаторных сред [Meiss et al., 2001]. Выбор этого метода основывался на его высокой чувствительности и относительной простоте выполнения. Проведенные эксперименты показали наличие нуклеазной активности в исследуемых штаммах, то есть результаты этих экспериментов указывают на экспрессию генов исходных и мутантных вариантов NucSma и NucA в рекомбинантных штаммах Е. coli LK111X и Е. coli TGE900 даже в присутствии белка-репрессора из-за неполного ингибиро-вания белком-репрессором промоторов этих генов. Полученные результаты по определению нуклеазной активности рекомбинантных штаммов вполне согласуются с литературными данными [Franke et al., 1999; Friedhoff et al., 1994b; Friedhoff et al., 1996; Meiss et al., 1998].

Известно, что векторная ДНК сообщает клетке-хозяину новые свойства, дающие ей селективные преимущества, но сверхсинтез продукта чужеродного гена, а также сам продукт, могут оказывать негативное влияние на скорость роста и деление клеток [Goldwin et al., 1979]. Поэтому необходимо было изучить влияние плазмид pHisNucSma и pHisNucA, содержащих гены исходных и мутантных вариантов NucSma и NucA, на выживаемость рекомби-нантных штаммов E.coli LK11IX и E.coli TGE900. В результате проведенных экспериментов было установлено, что экспрессия клетками рекомбинантных штаммов E.coli LK11IX и E.coli TGE900 ферментативно активных вариантов NucSma и NucA (за исключением чрезвычайно токсичной NucA дикого типа) обладает положительным эффектом на выживаемость рекомбинантных штаммов. Таким образом, было сделано предположение, что данные нуклеа-зы стимулируют деление клеток рекомбинантных штаммов, что, скорее всего, связано с возможным участием эндонуклеаз NucSma и NucA в репликации ДНК в бактериальной клетке.

Цикл экспериментов по выяснению характера взаимодействия плазмид, содержащих гены исходных и мутантных вариантов NucSma и NucA, и клеток штаммов-хозяев был начат с определения уровня устойчивости к ампициллину — агенту, селектирующему используемые в данной работе плазмиды. Для этого применяли метод градиентного агара, содержащего различные концентрации ампициллина [Barth et al., 1978]. Результаты экспериментов показали, что существуют различия в устойчивости к ампициллину в зависимости от активности исходных и мутантных вариантов NucSma и NucA, гены которых экспрессируются в данных штаммах на базальном уровне. Учитывая имеющиеся в литературе данные о существовании прямой зависимости между дозой (количеством копий) гена Ыа, обуславливающего устойчивость к ампициллину, и количеством синтезируемого фермента ß-лактамазы [Uhlin et al., 1977; Бергквист с соав., 1989], было выдвинуто предположение, что выявленные различия в уровнях устойчивости к ампициллину у рекомбинантных штаммов Е. coli LK11IX и Е. coli TGE900 могут служить косвенным доказательством изменения количества кодирующих эту устойчивость генов bla.

Для проверки этого предположения, используя метод йодометрического титрования [Perret, 1954], провели измерение количества синтезируемой ре-комбинантными штаммами Е. coli LK11IX и Е. coli TGE900 ß-лактамазы, по количеству которой косвенно судили о количестве содержащихся в клетках плазмид. В качестве референс-плазмиды с известным числом копий использовали сконструированную в данной работе плазмиду рЕТсосоАтрСт. Анализируя результаты данных исследований в сравнении с имеющимися данными о существовании прямой зависимости между количеством копий плазмид, содержащих ген bla, и уровнем устойчивости к ампициллину [Ely et al., 1981], можно заключить, что увеличение количества генов bla в клетках ре-комбинантных штаммов Е. coli LK11IX и Е. coli TGE900 происходит из-за увеличения количества плазмид, в которых находятся эти гены, и зависит от активности исходных и мутантных вариантов NucSma и NucA при базальном уровне экспрессии их генов. Обсуждая возможные причины существования подобной зависимости между активностью нуклеаз и количеством плазмид-ных копий, мы склонны считать, что такое изменение количества копий гена bla, возможно, связано с участием NucSma и NucA в увеличении количества копий плазмид в ходе репликации в бактериальных клетках, то есть, находясь в гетерологичных клетках Е. coli, NucSma и NucA при базальном уровне экспрессии их генов сменили свою биологическую функцию, и вместо трофической функции [Franke et al., 1999] стали принимать участие в репликации. Возможность изменения биологической функции нуклеазы в гетерологичной системе клетки уже была отмечена в некоторых работах [Куприянова-Ашина, 1991; Xiao et al., 2007; Balasundaram et al., 2009].

Как уже было сказано выше, введение клонированного гена в составе вектора в бактериальную клетку оказывает негативное влияние на ее физиологические и метаболические процессы и генетический материал, не нужный для ее размножения, в ходе деления клетки неминуемо утрачивается. По этой причине было необходимо провести исследования стабильности наследования плазмид pHisNucSma и pHisNucA в ряду клеточных поколений. Проведенное для выполнения этой задачи изучение спонтанной элиминации вышеперечисленных плазмид показало увеличение стабильности их наследования в клетках Е. coli LK11IX и Е. coli TGE900 с повышением активности исходных и мутантных вариантов NucSma и Nue А, гены которых находятся в этих плазмидах. Обнаруженная в ходе выполнения работы зависимость между активностью экспрессирующихся на базальном уровне исходных и мутантных вариантов NucSma и NucA также хорошо согласуется с ранее выдвинутым предположением о возможном влиянии данных нуклеаз на репликацию плазмидной ДНК. Следует повториться, что высокий негативный эффект, оказываемый токсичным белком на жизненно важные функции клетки-хозяина, приводит к удалению нежелательного генетического материала из клетки [Goldwin et al., 1979]. Исходя из этого факта, обнаруженная нами низкая стабильность наследования плазмиды с геном NucA дикого типа, вероятнее всего, связана с высоким токсическим эффектом, который данная нуклеа-за оказывает на клетку-хозяина [Meiss et al., 1998].

Исходя из ранее выдвинутого предположения о возможном влиянии

NucSma и NucA на репликацию ДНК в гетерологичной клетке Е. coli, в заt ключительных экспериментах было изучено действие ингибиторов репликации ДНК на рекомбинантные штаммы Е. coli LK11IX и Е. coli TGE900. Для решения данной задачи использовали налидиксовую кислоту и новобиоцин, которые действуют на разные субъединицы ДНК-гиразы - фермента, изменяющего топологию ДНК в процессе ее репликации [Льюин, 1987]. Действительно, если NucSma и NucA каким-то образом участвуют в репликации ДНК, то с увеличением активности синтезируемых клетками рекомбинантных штаммов эндонуклеаз будет наблюдаться увеличение устойчивости к агенту, ингибирующему репликацию ДНК. Использование метода градиентного агара с различными концентрациями антибиотиков [Barth et al., 1978], как мы и предполагали, позволило выявить зависимость между активностью исходных и мутантных вариантов NucSma и NucA и устойчивостью клеток рекомби-нантных штаммов Е. coli LK111X и Е. coli TGE900 к налидиксовой кислоте. Известно, что налидиксовая кислота связывает А-субъединицу ДНК-гиразы, которая ответственна за образование разрывов и связывание фермента с ДНК с образованием тройного комплекса «налидиксовая кислота-ДНК-гираза-ДНК», блокирующего продвижение репликационной вилки [Fong et al, 2008]. Образование тройного комплекса происходит до появления разрыва в ДНК, создаваемого ДНК-гиразой, и последний для комплексообразования не требуется [Hooper, 1999]. Известно, что при прикреплении фермента, в частности топоизомеразы, к ДНК ее локальная конформация соответствует А-форме ДНК [Lipps et al, 1983], которую предпочтительнее распознают эндо-нуклеазы NucSma и NucA [Meiss et al, 1995]. Вероятно, при ингибировании топоизомеразной активности ДНК-гиразы эндонуклеазы NucSma и NucA инициируют в области ori образование «ников» неподалеку от тройного комплекса, что ведет к его удалению и восстановлению репликации.

В отличие от этого, выявленное в ходе выполнение работы отсутствие статистически значимых различий в устойчивости рекомбинантных штаммов Е. coli LK11IX и Е. coli TGE900 к новобиоцину свидетельствует о невозможности NucSma и NucA компенсировать функцию 5-субъедимицы ДНК-гиразы по восстановлению нативной структуры фермента после одного раунда репликации.

Заключая обсуждение полученных результатов, следует еще раз отметить, что увеличение количества генов Ыа в клетках рекомбинантных штаммов, по-видимому, происходит за счет увеличения количества рекомбинантных плазмид, в которых содержатся данные гены, и зависит от активности исходных и мутантных вариантов NucSma и NucA при базальном уровне экспрессии их генов. Таким образом, полученные в данной работе данные демонстрируют возможность участия NucSma и NucA в репликации ДНК в рекомбинантных штаммах.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Крякунова, Елена Вячеславовна, 2011 год

1. Аликин, Ю.С. Развитие технологий получения и перспективы использования эндонуклеазы Serratia marcescens текст. / Ю.С. Аликин, Л.П. Серженко, В.П. Клименко //11 Всероссийской конференции «Ферменты микроорганизмов»: Сб. Докл. Казань, 1998.-е. 152-163.

2. Бейли, Дж. Основы биохимической инженерии Текст. / Дж. Бейли, Д. Оллис // М.: Мир, 1989. 586 с.

3. Белов, И.С. Мутационный анализ бактерий. Методические указания для лабораторных работ по генетике микроорганизмов Текст. // Казань, изд-во Казанского государственного университета, 1985. 26 с.

4. Белоусов, Ю.Б. Клиническая фармакология и фармакотерапия Текст. / Ю.Б. Белоусов, B.C. Моисеев, В.К. Лепахин // Изд.: Универсум Пабли-шинг, 1997.-531 с.

5. Беляева, М.И. Нуклеиновые кислоты, используемые в качестве основного источника питания бактерий Текст. / М.И. Беляева, М.Н. Капранова, М.И. Витол, И.А. Голубенко, И.Б. Лещинская // Микробиология. -1976.-№45.-с. 420-424.

6. Бергквист, П. Плазмиды. Методы Текст. / П. Бергквист, К. Харди, Б. Оудега, Н. Панайотатос, Э. Пагсли, К. Томас, Ф. Янгмен // М.: Мир, 1989.-267 с.

7. Березов, Т.Т. Биологическая химия Текст. / Т.Т. Березов, Б.Ф. Коров-кин // М.: Медицина, 1998. 704 с.

8. Гимадутдинов, O.A. Синтез внеклеточной эндонуклеазы Serratia marcescens рекомбинантными штаммами Escherichia coli Текст. / O.A. Гимадутдинов, Л.М. Анцилевич // Биотехнология. 1993. — № 5. — с. 15-18.

9. Глик, Б. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Пер. с англ. Текст. / Б. Глик, Дж. Пастернак // М.: Мир, 2002. 589 с.

10. Гловер, Д. (ред.) Клонирование ДНК. Методы Текст. М.: Мир, 1988. -538 с.

11. Громов, Б.В. Цианобактерии в биосфере Текст. // Соровский образовательный журнал. 1996. - № 9. - с. 33-39.

12. Гусев, М.В. Микробиология: Учебник для студ. биол. специальностей вузов Текст. / М.В. Гусев, JI.A. Минеева // М.:Издательский центр «Академия», 2003. 464 с.

13. Кнорре, Д.Г. Биологическая химия Текст. / Д.Г. Кнорре, С.Д. Мызина // М.: Высш. шк., 2000. 479 с.

14. Куприянова-Ашина, Ф.Г. Влияние экзогенных дезоксирибонуклеаз на синтез ДНК, рост и деление клеток микроорганизмов: автореф. дис. на соиск. уч. степ, доктора биол. наук: 03.00.07 Текст. / Куприянова-Ашина Флера Гарифовна. Москва, 1991. - 46 с.

15. Лещниская, И.Б. Нуклеазы Serratia marcescens Текст. / И.Б. Лещин-ская, З.Ф. Богаутдинов // Микробиология. — 1963. — Т. 32, вып. 34. — с. 413-415.

16. Лещинская, И.Б. Сравнительное изучение бактериальных фосфомоно-и фосфодиэстераз, гидролизующих нуклеиновые кислоты и нуклеотиды Текст. / И.Б. Лещинская, М.И. Беляева, К.З. Гильфанова // Микробиология. 1968. - Т. 37. - с. 979-983.

17. Лещинская, И.Б. Методы определения нуклеаз и родственных ферментов Текст. / И.Б. Лещинская, Н.П. Балабан, М.Н. Капранова, И.А. Голу-бенко // в кн. «Современные методы изучения нуклеиновых кислот и нуклеаз микроорганизмов». Казань, 1980. - с. 53-60.

18. Лещинская, И.Б. Нуклеазы бактерий Текст. / И.Б. Лещинская, В.П. Варламов, Б.М. Куриненко // Издательство Казанского университета. -1991.-232 с.

19. Льюин, Б. Гены. Пер. с англ. Текст. -М.: Мир, 1987. 544 е., ил.

20. Миллер, Дж. Эксперименты в молекулярной генетике Текст. М.: Мир. - 1976.-440 с.

21. Рыбчин, В.Н. Основы генетической инженерии Текст., 2-е изд., пере-раб. доп.: Учебник для вузов СПб: Изд-во СПб ГТУ, 2002. - 522 с.

22. Сазыкин, Ю.О. Антибиотики и оболочка бактериальной клетки Текст. / Ю.О. Сазыкин, П.С. Навашин // Итоги науки и техники. М: ВИНИТИ. -1991.-№31.-с. 111-127.

23. Сидоренко, C.B. Практическое руководство по антиинфекционной химиотерапии Текст. Изд-во НИНАХ СГМА, 2002. - 294 с.

24. Сингер, М. Гены и геномы. Т. 1. Текст. / М. Сингер и П. Берг // Дрофа, 1998.-373с.

25. Стручкова, И.В. Регуляция биосинтеза белка. Учебно-методическое пособие Текст. / И.В. Стручкова, A.A. Брилкина, А.П. Веселов // Нижний Новгород, 2010.- 100 с.

26. Филимонова, М.Н. Получение нуклеазы Serratia marcescens в гомогенном состоянии и изучение физико-химических свойств фермента Текст. / М.Н. Филимонова, Н.П. Балабан, Ф.Р. Шарипова и И.Б. Лещинская // Биохимия. 1980. - Т. 45, вып. 11.-е. 2096-2104.

27. Филимонова, М.Н. Выделение и характеристика изоформ внеклеточной нуклеазы Serratia marcescens Текст. / М.Н. Филимонова, A.A. Дементьева, И.Б. Лещинская, Г.Л. Бакулина, C.B. Шляпников // Биохимия. -1991. Т. 56, вып. 3. - с. 508-520.

28. Филимонова, М.Н. Изоформы нуклеазы Serratia marcescens. Сравнительный анализ субстратной специфичности Текст. / М.Н. Филимонова, A.B. Гарусов, Т.А. Сметанина и др. / Биохимия. 1996. - Т. 61, выл. 10. -с. 1800-1806.

29. Филимонова, М.Н. Эндонуклеазы Serratia marcescens. Определение димеров Текст. / М.Н. Филимонова, Н.Г. Уразов // XI Всероссийская конференция «Ферменты микроорганизмов». — Казань, 1998. — с. 89-93.

30. Филимонова, М.Н. Полидисперность нуклеазы Serratia marcescens при оптимальном значении pH Текст. / М.Н. Филимонова, М.Дж. Бенедик, Н.Г. Уразов и И.Б. Лещинская // Приклад, биохим. микробиол. 1999. -Т. 35, № 1.-е. 20-24.

31. Щелкунов, С.Н. Генетическая инженерия Текст., 2-е изд., испр. идоп.: Учебно-справочное пособие Новосибирск: Сиб. унив. изд-во, 2004.-496 с.

32. Юсупова, Д.В. Индукция синтеза внеклеточной эндонуклеазы Serratia marcescens агентами, подавляющими репликацию ДНК Текст. / Д.В. Юсупова, Р.Б. Соколова, О.В. Порфирьева и А.З. Пономарева // Микробиология. 1991. - Т. 60, вып. 2. - с. 279-284.

33. Юсупова, Д.В. Влияние налидиксовой кислоты и митомицина С на рост и биосинтез внеклеточных белков Serratia marcescens Текст. / Д.В. Юсупова, Р.Б. Соколова, Е.В. Петухова // Антибиотики и химиотер. — 1993. Т. 3 8, № 8-9. - с. 16-21.

34. Adams, D.E. Cre-lox recombination in Escherichia coli cells. Mechanistic differences from the in vitro reaction Текст. / D.E. Adams, J.B. Bliska and N.R. Cozzarelli //J. Mol. Biol. 1992a. - Vol. 226. - p. 661-673.

35. Ali, J.A. The 43 kDa N-terminal fragment of the gyrase В protein hydrolyses ATP and binds coumarin drugs Текст. / J.A. Ali, A.P. Jackson, A.J. Howells and A. Maxwell // Biochemistry. 1993. - Vol. 32. - p. 2717-2724.

36. Aucken, H.M. Identification of capsular antigens in Serratia marcescens Текст. / H.M. Aucken, S.G. Wilkinson, T.L. Pitt // J. Clin. Microbiol. -1997.-Vol. 35.-p. 59-63.

37. Bahar, B. Bovaine lactoferrin (LTF) gene promoter haplotypes have different basal transcriptional activities Текст. / В. Bahar, F. O'Halloran, M.J. Calla-nan, S. McParland, L. Giblin, T. Sweeney // Anim. Genet. 2011. - Vol. 42. -p. 270-279.

38. Balasundaram, B. Step change in the efficiency of centrifugation through cell engineering: co-expression of Staphylococcal nuclease to reduce the viscosity of the bioprocess feedstock Текст. / В. Balasundaram, D. Nesbeth,

39. J.M. Ward, E. Keshavara-Moore, D.G. Bracewell // Biotechnol. Bioeng. -2009.-Vol. 104.-p. 134-142.

40. Ball, Т.К. The extracellular nuclease gene of Serratia marcescens and its secretion from Escherichia coli Текст. / Т.К. Ball, P.N. Saurugger, M. Benedik // Gene. 1987. - Vol. 57. - p. 183-192.

41. Ball, Т.К. Expression of Serratia marcescens extracellular proteins requires RecA Текст. / Т.К. Ball, C.R. Wasmuth, S.C. Braunagel and M.J. Benedik // J. Bacterid. 1990. - Vol. 172. - p. 342-349.

42. Ball, Т.К. Disulfide bonds are required for Serratia marcescens nuclease activity Текст. / Т.К. Ball, Y. Suh and M.J. Benedik // Nucleic. Acids Res. -1992. Vol. 20. - p. 4971-4974.

43. Barth, P.T. Copy number of coexisting plasmids in Escherichia coli K-12 Текст. / P.T. Barth, H. Richards, N. Datta // J. Bacteriol. 1978. - Vol. 135. -p. 760-765.

44. Bentley, R. Biosynthesis of vitamin К (menaquinone) in bacteria Текст. / R. Bentley, R. Meganathan // Microbiol. Rev. 1982. - Vol. 46. - p. 241-280.

45. Bickle, T. Biology of DNA restriction Текст. / T. Bickle, D. Krüger // Microbiol. Rev. 1993. - Vol. 57. - p. 434-450.

46. Bradford, P.A. Extended-spectrum ß-lactamases in the 21st century: characterization, epidemiology, and detection of this important resistance threat Текст. // Clin. Microbiol. Rev. 2001. - Vol. 14. - p. 933-951.

47. Bustos, S.A. Functional domains of the AraC protein Текст. / S.A. Bustos, R.F. Schleif// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. - Vol. 90. - p. 5638-5642.

48. Caballero, I. Evaluation of the Serratia marcescens nuclease (NucA) as a transgenic cell ablation system in porcine Текст. /1. Caballero, J.A. Piedrahi-ta // Animal Biotechnology. 2009. - Vol. 20. - p. 177-185.

49. Caron, P. Alignment of primary sequences of DNA topoisomerases Текст. / P. Caron and J.C. Wang // Adv. Pharmacol. 1994. - Vol. 29A. - p. 271-297.

50. Chen, C. Solvent participation in Serratia marcescens endonuclease complexes Текст. // С. Chen, B.W. Beck, K. Krause, B.M. Pettitt // Proteins: Structure, Function and Bioinformatics. 2006. - Vol. 62. - p. 982-995.

51. Chen, C. Advantage of being a dimer for Serratia marcescens endonuclease? Текст. / С. Chen, К. Krause, B.M. Pettitt // J. Phys. Chem B. 2009. - Vol. 113.-p. 511-521.

52. Chen, X. Novel expression vector for secretion of cecropin AD in Bacillus subtilis with enhanced antimicrobial activity Текст. / X. Chen, F. Zhu, Y. Cao, S. Qiao // Antimicrob. Agents Chemother. 2009. - Vol. 53. - p. 36833689.

53. Conner, B.N. The molecular structure of d(ICpCpGpG), a fragment-of right-handed double helical A-DNA Текст. / B.N. Conner, T. Takano, S. Tanaka, K. Itakura, and R.E. Dickerson // Nature. 1982. - Vol. 295. - p. 294-299.

54. Conte, M.R. Conformational properties and thermodynamics of the RNA duplex r(CGCAAAUUUGCG)2: comparison with the DNA analogue d(CGCAAATTTGCG)2 Текст. / M.R. Conte, G.L. Conn, T. Brown, A.N. Lane // Nucl. Acids Res. 1997. - Vol. 25. - p. 2627-2643.

55. Corbett, K.D. The structural basis for substrate specificity in DNA topoiso-merase IV Текст. / K.D. Corbett, A.J. Schoeffler, N.D. Thomsen and J.M. Berger // J. Mol. Biol. 2005. - Vol. 351. - p. 545-561.

56. Crisona, N.J. Alteration of Escherichia coli topoisomerase TV conformation upon enzyme binding to positively supercoiled DNA Текст. / N.J. Crisona and N.R. Cozzarelli // J. Biol. Chem. 2006. - Vol. 281. - p. 18927-18932.

57. Dake, E. Purification and properties of the major nuclease from mitohondria of Saccharomyces cerevisiae Текст. / E. Dake, T. Hoffman // Biol. Chem. -1988. Vol. 263.-p. 7691-7702.

58. DeBoy II, J.M. Hemolytic activity in enterotoxigenic and nonenterotoxigenic strains of Escherichia coli Текст. / J.M. DeBoy II, I.K. Wachsmuth and B.R. Davis // J. Clin. Microbiol.- 1980.-Vol. 12.-p. 193-198.

59. DiGate, R.J. Identification of a potent decatenating enzyme from Escherichia coli Текст. / R.J. DiGate and K.J. Marians // J. Biol. Chem. 1988. - Vol. 263.-p. 13366-13373.

60. Drlica, K. Quinolone-mediated bacterial death Текст. / К. Drlica, M. Malik, R.J. Kerns and X. Zhao // Antimicrob. Agents Chemother. 2008. - Vol. 52. -p. 385-392.

61. Du, L. Engineering multigene expression in vitro and in vivo with small terminators for T7 RNA polymerase Текст. / L. Du, R. Gao, A.C. Foster // Bio-technol. Bioeng. 2009. - Vol. 104. - p. 1189-1196.

62. Ely, S. Regulation of plasmid DNA synthesis: isolation and characterization of copy number mutant of mini RG-5 and mini F plasmids Текст. / S. Ely, W.L. Staudenbaner//Mol. Gen. Genet. 1981. - Vol. 181. - p. 29-35.

63. Ferrero, L. Analysis of gyrA and grlA mutations in stepwise-selected ciprof-loxacin-resistant mutant of Staphylococcus aureus Текст. / L. Ferrero, B. Cameron and J. Crouzet // Antimicrob. Agents Chemother. 1995. - Vol. 39. -p. 1554-1558.

64. Filimonova, M.N. Serratia marcescens endonuclease. Properties of the enzyme Текст. / M.N. Filimonova, L.A. Baratova, N.D. Vospel'nikova, A.O. Zheltova and I.B. Leshchinskaia // Biokhimiia. 1981. - Vol. 46. - p. 16601666.

65. Filimonova, M. Action of hexaaminecobalt on the activity of Serratia mar-cescens nuclease Текст. / M. Filimonova, V. Gubskaya, I. Nuretdinov, I. Leshchinskaya // BioMetals. 2003. - Vol. 16. - p. 447-453.

66. Fong, W. Antimicrobial Resistance and Implications for the Twenty-First Century. Chapter 4: Resistance of Gram-Negative Bacilli to Antimicrobials Текст. / W. Fong and K. Drlica (eds.) // Springer. 2008. - p. 97-159.

67. Foster, T.J. Plasmid-determined resistance to antimicrobial drugs and toxic metal ions in bacteria Текст. // Microbiol. Rev. 1983. - Vol. 47. - p. 361409.

68. Fotadar, U. Growth of Escherichia coli at elevated temperatures Текст. / U. Fotadar, P. Zaveloff, L. Terracio // J. Basic Microbiol. 2005. - Vol. 45. - p. 403-404.

69. Franke, I. On the Advantage of Being a Dimer, a Case Study Using the Di-meric Serratia Nuclease and the Monomeric Nuclease from Anabaena sp. Strain PCC 7120 Текст. / I. Franke, G. Meiss and A. Pingoud // J. Biol. Chem. 1999. - Vol. 274. - p. 825-832.

70. Friedhoff, P. Analysis of the mechanism of the Serratia nuclease using site-directed mutagenesis Текст. / P. Friedhoff, B. Kolmes, O. Gimadutdinow, W. Wende, K.L. Krause and A. Pingoud // Nucleic. Acids Res. 1996. - Vol. 24. - p. 2632-2639.

71. Friehs, K. Plasmid copy number and plasmid stability Текст. // Adv. Bio-chem. Engin. Biotechnol. 2004. - Vol. 86. - p. 47-82.

72. Fuller, W. A molecular model for the interaction of ethidium bromide with deoxyribonuclein acid Текст. / W. Fuller, M. Waring // Phys. Chem. 1964. -Vol. 68.-p. 805-809.

73. Gellert, M. Novobiocin and coumermycin inhibit DNA supercoiling catalyzed by DNA gyrase Текст. / M. Gellert, M.H. O'Dea, T. Itoh and J.-I. To-mizawa // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1976. - Vol. 73. - p. 4474-4478.

74. Gellert, M. Nalidixic acid resistance. A second genetic character involved in DNA gyrase activity Текст. / M. Gellert, K. Mizuuchi, M.H. O'Dea, T. Itoh and J.-I. Tomizawa // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977. - Vol. 74. - p. 4772-4776.

75. Ghosh, M. Structural insights into the mechanism of nuclease A, a 3|3a metal nuclease from Anabaena [Текст. / M. Ghosh, G. Meiss, A. Pingoud, R.E. London, L.C. Pedersen // J. Biol. Chem. 2005. - Vol. 280. - p. 2799027997.

76. Ghosh, M. The nuclease A inhibitor complex is characterized by a novel metal ion bridge Текст. / M. Ghosh, G. Meiss, A. Pingoud, R.E. London, L.C. Pedersen // J. Biol. Chem. - 2007. - Vol. 282. - p. 5682-5690.

77. Ghuysen, J.M. Serine P-lactamases and penicillin-binding proteins,Текст. / L.N. Ornston, А. В allows and E.P. Greenberg (eds.) // Ann. Rev. Microb. -1991.-Vol. 45.-p. 37-67.

78. Gibert, I. Distribution of insertion sequence IS200 in Salmonella and Shigella Текст. / I. Gibert, J. Barbe, J. Casadesus // J. Gen. Microbiol. 1990. - Vol. 136.-p. 2555-2560.

79. Gilbert, E.J. The 24 kDa N-terminal sub-domain of the DNA gyrase В protein binds coumarin drugs Текст. / E.J. Gilbert and A. Maxwell // Mol. Microbiol. 1994. - Vol. 12. - p. 365-373.

80. Goldwin, D. The influence of the grouth on the syability of a drug resistance plasmid in Escherichia coli K-12 Текст. / D. Goldwin, J.N. Stater // J. Gen. Microbiol. 1979. - Vol. 111. - p. 201-209.

81. Gootz, T.D. Chemistry and mechanism of action of the quinolone antibacte-rials Текст. / T.D. Gootz, K.E. Brightg // The Quinolones. Academic Press. San Diego, London, Boston, New York, Sydney, Tokyo, Toronto. 1998. -Ed. 2.-p. 29-80.

82. Gore, J. Mechanochemical analysis of DNA gyrase using rotor bead tracking Текст. // J. Gore, Z. Bryant, M.D. Stone, M. Nollmann, N.R. Cozzarelli and C. Bustamante / Nature. 2006. - Vol. 439. - p. 100-104.

83. Hacker, J. Pathogenicty islands and the evolution of Microbes Текст. / J. Hacker, J.B. Kaper // Annu. Rev. Microbiol. 2000. - Vol. 54. - p. 641-679.

84. Hane, M.W. Escherichia coli K-12 mutants resistant to nalidixic acid: genetic mapping and dominance studies Текст. / M.W. Hane and Т.Н. Wood // J. Bacteriol. 1969. - Vol. 99. - p. 23 8-241.

85. Hejazi, A. Serratia marcescens Текст. / A. Hejazi, F.R. Falkiner // J. Med. Microbiol. 1997. - Vol. 46. - p. 903-912.

86. Herman-Antosiewicz, A. A plasmid cloning vector with precisely regulatable copy number in Escherichia coli Текст. / A. Herman-Antosiewicz, M. Obu-chowski and G. Wegrzyn // Mol. Biotechnol. 2001. - Vol. 17. - p. 193-199.

87. Hiasa, H. DNA strand cleavage is required for replication fork arrest by a frozen topoisomerase-quinolone-DNA ternary complex Текст. / H. Hiasa, D.O. Yousef, and K.J. Marians // J. Biol. Chem. 1996. - Vol. 271. - p. 2642426429.

88. Hooper, D.C. Mode of action of fluoroquinolones Текст. // Drugs. 1999. -Vol. 58.-p. 6-10.

89. Jones, K.L. Construction and characterization of F plasmid-based expression vectors Текст. / K.L. Jones, J.D. Keasling // Biotechnol. Bioeng. 1998. -Vol. 59.-p. 659-665.

90. Kirby, T.W. The nuclease A inhibitor represents a new variation of the rare PR-1 fold Текст. / T.W. Kirby, G.A. Mueller, E.F. DeRose, M.S. Lebetkin, G. Meiss, A. Pingoud, R.E. London // J. Mol. Biol. 2002. - Vol. 320. - p. 771-782.

91. Konieczny, I. Role of TrfA and DnaA proteins in origin opening during initiation of DNA replication of the broad host range plasmid RK2 Текст. / Т. Konieczny, K.S. Doran, D.R. Helinski, A. Blasina // J. Biol. Chem. 1997. -Vol. 272. - p. 20173-201787.

92. Kubitschek, H.E. Cell volume increase in Escherichia coli after shifts to richer media Текст. // J. Bacteriol. 1990. - Vol. 172. - p. 94-101.

93. LaemmIy, U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 Текст. // Nature. 1970. - Vol. 227. - p. 680-685.

94. Liu, L.F. DNA-DNA gyrase complex: the wrapping of the DNA duplex outside the enzyme Текст. / L.F. Liu and J.C. Wang // Cell. 1978. - Vol. 15. -p. 979-984.

95. Livermore, D.M. Mechanisms of resistance to (3-lactam antibiotics Текст. // Scand. J. Infect. Dis. 1991. - Vol. 78. - p. 7-16.

96. Mayers, D.L. (ed.) Antimicrobial drug resistance. Chapter 16. Fluoroquinolone resistance in bacteria Текст. // Humana Press, a part of Springer Science+Business Media, LLC. 2009. - p. 195-205.

97. McEvoy, J.L. Molecular cloning and characterization of an Erwinia caroto-vora subsp. carotovora pectin lyase gene that responds to DNA-damaging agents Текст. / J.L. McEvoy, H. Murata, A.K. Chatterjee // J. Bacteriol. -1990. Vol. 172. - p. 3284-3289.

98. Meiss, G. Sequence preferences in cleavage of ssDNA by the extracellular Serratia marcescens endonuclease Текст. / G. Meiss, P. Friedhoff, O. Gima-dutdinow et al. // Biochemistry. 1995. - Vol. 34. - p. 11979-11998.

99. Meiss, G. Biochemical characterization of Anabaena sp. strain PCC 7120 non-specific nuclease NucA and its inhibitor NuiA Текст. / G. Meiss, I. Franke, O. Gimadutdinow, C. Urbanke and A. Pingoud // Eur. J. Biochem. -1998. Vol. 251. - p. 924-934.

100. Meiss, G. The DNA/RNA non-specific Serratia nuclease prefers double-stranded A-form nucleic Acids as Substrates Текст. / G. Meiss, F.U. Gast, A. Pingoud // J. Mol. Biol. 1999. - Vol. 288. - p. 377-390.

101. Meiss, G. Mechanism of DNA cleavage by the DNA-RNA-non-specific Ana-baena sp. PCC 7120 endonuclease NucA and its inhibition by NuiA Текст. / G. Meiss, O. Gimadutdiniw, B. Haberland, A. Pingoud // J. Mol. Biol. 2000. -Vol. 297.-p. 521-534.

102. Meiss, G. Microtiter-plate assay and related assays for nonspecific endonuc-leases. Review. No abstract available Текст. / G. Meiss, O. Gimadutdinow, P. Friedhoff, A. Pingoud // Methods Mol. Biol. 2001. - Vol. 160. - p. 37-48.

103. Mikesell, P. Evidence for plasmid-mediated toxin production in Bacillus anthracis Текст. / P. Mikesell, B.E. Ivins, J.D. Ristroph, T.M. Dreier // Infect. Immun. 1983. - Vol. 39. - p. 371-376.

104. Miller, M.D. Identification of the Serratia endonuclease dimer: structural basis and implications for catalysis Текст. / M.D. Miller and K.L. Krause // Protein Sci. 1996. - Vol. 5. - p. 24-33.

105. Muro-Pastor, A.M. The mi i A gene from Anabaena sp. encoding an inhibitor of the NucA sugar-non-specific nuclease Текст. / A.M. Muro-Pastor, A. Herrero and E. Flores // J. Mol. Biol. 1997. - Vol. 268. - p. 589-598.

106. Nikaido, H. Molecular basis of bacterial outer membrane permeability revisited Текст. // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2003. - Vol. 67. - p. 593-656.

107. N611mann, M. Thirty years of Escherichia coli DNA gyrase: from in vivo function to single-molecule mechanism Текст. / M. Nollmann, N.J. Crisona and P.B. Arimondo // Biochimie. 2007. - Vol. 89. - p. 490-499.

108. Nordstrom, K. Plasmids in bacteria Текст. / Nordstrom K., Helinski, D. R.,

109. Cohen S. N., Clewell D. В., Jackson D. A., Hollaender A., et al. // Pleum Press, New York. 1985. - p. 119.

110. Nordstrom, K. Copy-number control of the Escherichia coli chromosome: a plasmidologist's view Текст. / К. Nordstrom, S. Dasgupta // EMBO reports. 2006. - Vol. 7. - p. 484-489.

111. Novy, R. Coexpression of multiple target proteins in E. coli Текст. / R. Novy, K. Yaeger, D. Held, R. Mierendorf // inNovations. 2002. - Vol. 15. -p. 2-6.

112. Palomares, L.A. Production of recombinant proteins: challenges and solutions Текст. / L.A. Palomares, S. Estrada-Mondaca, O.T. Ramirez // Methods Mol. Biol. 2004. - Vol. 267. - p. 15-52.

113. Perret, C.J. Iodometric assay of penicillinase Текст. // Nature (London). -1954.-Vol. 174.-p. 1012-1013.

114. Rangarajan, E.S. Sugar non-specific endonucleases Текст. / E.S. Rangara-jan, V. Shankar // FEMS Microbiol. Rev. 2001. - Vol. 25. - p. 583-613.

115. Remaut, E. Plasmid vectors for high-efficiently expression controlled by the PL promoter of coliphage lambda Текст. / E. Remaut, P. Stanssens, W. Fiers //Gene. -1981. -Vol. 15.-p. 81.

116. Rich, A. Right-handed and left-handed DNA: Conformational information in genetic material Текст. // Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 1983. -Vol. 47.-p. 1-12.

117. Roca, J. DNA transport by a type II DNA topoisomerase: evidence in favor of a two-gate mechanism Текст. / J. Roca and J.C. Wang //Cell. 1994.-Vol. 77.-p. 609-616.

118. Ruiz-Carillo, A. Primers for mitochondrial DNA replication generated by en-donuclease G Текст. / A. Ruiz-Carillo, J. Côté // Science. 1993. - Vol. 261. -p. 765-769.

119. Saïda, F. Expression of highly toxic genes in E. colv. special strategies and genetic tools Текст. // F. Saïda, M. Uzan, В. Odaert, F. Bontems // Current Protein and Peptide Science. 2006. - Vol. 7. - p. 47-56.

120. Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual / J. Sambrook, E.F. Fitsch, T. Maniatis Текст. // Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989.-560 p.

121. Schatz, P.J. Genetic analysis of protein export in Escherichia coli i P.J. Schatz and J. Backwith Текст. // Annu. Rev. Genet. 1990. - Vol. 24. - p. 215-248.

122. Schoeffler, A.J. DNA topoisomerases: harnessing and constraining energy to govern chromosome topology Текст. / A.J. Schoeffler and J.M. Berger // Quart. Rev. Biophys. 2008. - Vol. 41. - p. 41-101.

123. Seabold, R.R. Apo-AraC actively seens to loop Текст. / R.R. Seabold, R.F. Schleif // J. Mol. Biol. 1998. - Vol. 278. - p. 529-538.

124. Sektas, M. Novel single-copy pETcoco™ vector with dual controls for amplification and expression Текст. / M. Sektas, W. Szybalski // inNovations. -2002.-Vol. 14.-p. 6-8.

125. Seising, E. Two contiguous conformations in a nucleic acid duplex Текст. / E. Seising, R.D. Wells, T.A. Early and D.R. Kearns // Nature. 1978. - Vol. 21.-p. 249-250.

126. Shea, M.E. Interactions between DNA helicases and frozen topoisomerase IV-quinolone-DNA ternary complexes Текст. / M.E. Shea and H. Hiasa // J. Biol. Chem. 1999. - Vol. 274. - p. 22747-22754.

127. Sleigh, J.D. Antibiotic resistance in Serratia marcescens Текст. // Br. Med. J. 1983.-Vol/287.-p. 1651-1653.

128. Smarda, J. Плазмиды и клетки-хозяева Текст. // Acta virol. 1982. - Vol. 26. — p. 193-206.

129. Smith, D.H. Mode of action of novobiocin in Escherichia coli Текст. / D.H. Smith and B.D. Davis // J. Bacteriol. 1967. - Vol. 93. - p. 71-79.

130. Spratt, B.G. Penicillin-binding proteins of gram-negative bacteria Текст. / B.G. Spratt and K.D. Cromie // Rev. Infect. Dis. 1988. - Vol. 10. - p. 699711.

131. Su, T.Z. A novel phosphate-regulated expression vector in Escherichia coli Текст. / T.Z. Su, H. Schweizer, D.L. Oxender // Gene. 1990. - Vol. 90. -p. 29-33.

132. Sugino, A. Energy coupling in DNA gyrase and the mechanism of action of novobiocin Текст. / A. Sugino, N.P. Higgins, P.O. Brown, C.L. Peebles and N.R. Cozzarelli // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1978. - Vol. 75. - p. 48384842.

133. Suh, Y. Two-Step secretion of the Serratia marcescens extracellular nuclease Текст. // Y. Suh, S. Jin, Т.К. Ball and M.J. Benedik // J. Bacteriol. 1996. -Vol. 178.-No. 3.-p. 3771-3778.

134. Thayer, H.H. Contraindication for use of Serratia marcescens as tracer organisms in research Текст. // J. dent. Res. 1966. - Vol. 45. - p. 853-855.

135. Tomas, M. A simple and rapid method for the elimination of R plasmids from enteric bacteria Текст. / M. Tomas, W. Kay // Current Microb. 1984. -Vol. 11.-p. 155-158.

136. Uhlin, B. R-plasmid gene dosage effects in Escherichia coli K-12, copy mutants of the R-plasmid RI drd-19 Текст. / В. Uhlin, К. Nordstrom // Plasmid. 1977.-Vol. l.-p. 1-7.

137. Vieira, J. The pUC and M13 mp7 derived system for insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers Текст. / J. Vieira and J. Messing // Gene. 1982. - Vol. 19. - p. 259-268.

138. Vogt, R.L. Escherichia coli 0157:H7 outbreak associated with consumption of ground beef, June-July 2002 Текст. / R.L. Vogt, L. Dippold // Public Health Rep.-2005.-Vol. 120.-p. 174-178.

139. Von Hippel, P.H. From "simple" DNA-protein interactions to the macromo-lecular machines of gene expression Текст. // Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct.-2007.-Vol. 36.-p. 79-105.

140. Walsh, C. Molecular mechanisms that confer antibacterial drug resistance Текст. // Nature. 2000. - Vol. 406. - p. 775-781.

141. Wandersman, C. Secretion across the bacterial outer membrane Текст. // Trends Genet. 1992. - Vol. 8. - p. 317-322.

142. Wang, J.C. DNA topoisomerases Текст. // Annu. Rev. Biochem. 1985. -Vol. 54. p. 665-697.

143. Wanga, Z. Classification of plasmid vectors using replication origin, selection marker and promoter as criteria Текст. / Z. Wanga, L. Jin, Z. Yuan, G. We'grzyn, A. We'grzyn // Plasmid. 2009. - Vol. 61. - p. 47-51.

144. Watson, J.D. Molecular biology of the gene Текст. / J.D. Watson, T.A. Baker, S.P. Bell, A.G. Michael, L.R. Losick // Pearson. 2004. - 5ed. - 7121. P

145. Watt, P.M. Structure and function of type II DNA topoisomerases Текст. / P.M. Watt and I.D. Hickson // Biochem. J. 1994. - Vol. 303. - p. 681-695.

146. Wigley, D.B. Crystal structure of the N-terminal domain of the DNA gyrase В protein Текст. / D.B. Wigley, G.J. Davies, E.J. Dodson, A. Maxwell and G. Dodson // Nature. 1991. - Vol. 351. - p. 624-629.

147. Wild, J. Copy-control tightly regulated expression vectors based on pBAC/oriV Текст. / J. Wild, W. Szybalski // Methods Mol. Biol. 2004. -Vol. 267.-p. 155-167.

148. Williamson, N.R. The biosynthesis and regulation of bacterial prodiginines Текст. / N.R. Williamson, P.C. Fineran, F.J. Leeper and G.P. Salmond // Nat. Rev. Microbiol. 2006. - Vol. 4. - p. 887-899.

149. Willmott, C.J. The complex of DNA gyrase and quinolone drugs with DNAforms a barrier to transcription by RNA polymerase Текст. / С J. Willmott, S.E. Critchlow, I.C. Eperon and A. Maxwell // J. Mol. Biol. 1994. - Vol. 242.-p. 351-363.

150. Xiao, F. Engineered apoptotic nucleases for chromatin research / F. Xiao, P. Widlak, W.T. Garrard // Nucleic Acids Res. 2007. - Vol. 35. - p. 93-99.

151. Yanagida, N. Specific excretion of Serratia marcescens protease through the membrane of Escherichia coli Текст. / N. Yanagida, T. Uozumi, T. Berru // J. Bacteriol. 1986. - Vol. 166. - p. 937-944.

152. Zechiedrich, E.L. Eukaryotic topoisomerases recognize nucleic acid topology by preferentially interacting with DNA crossovers Текст. / E.L. Zechie-drich and N. Osheroff// EMBO J. 1990. - Vol. 9. - p. 4555-4562.

153. Zzaman, S. Oligomeric initiator protein-mediated DNA looping negatively regulates plasmid replication in vitro by preventing origin melting Текст. / S. Zzaman, D. Bastia // Molecular Cell. 2005. - Vol. 20. - p. 833-843.