Влияние эндотелиальных клеток на процессы остеогенной индукции в мезенхимных стволовых клетках тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Переплетчикова Дарья Александровна

• Переплетчикова Дарья Александровна
• кандидат наук
• 2025

Оглавление диссертации кандидат наук Переплетчикова Дарья Александровна

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования

Цель и задачи исследования

Основные положения, выносимые на защиту

Научная новизна

Теоретическая и практическая значимость работы

Финансовая поддержка диссертации

Личный вклад автора

Объем и структура диссертации

Апробация работы

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Эндотелий как многофункциональный орган

1.2 Роль кровеносных сосудов в формировании костной ткани

1.2.1 Эндохондральное окостенение

1.2.2 Внутримембранное окостенение

1.3 Неоднородность эндотелиальных клеток в костной ткани

1.4 Роль кровеносных сосудов в регенерации костной ткани

1.4.1 Первый этап остеорегенерации: воспаление

1.4.2 Второй этап остеорегенерации: ангио-мезенхимная фаза

1.4.3 Третий этап остеорегенерации: костное ремоделирование

1.5 Сигнальные молекулы в ангиогенезе и остеогенезе: взаимная регуляция и ключевые факторы

1.6 Сигнальный путь Notch

1.6.1 Устройство сигнального пути Notch

1.6.2 Роль сигнального пути Notch в остеогенезе

1.6.3 Роль сигнального пути Notch при перекрестных взаимодействиях

1.7 Патологическая кальцификация

1.7.1 Механизмы патологической кальцификации

1.7.2 Роль эндотелиальных клеток при патологической кальцификации

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Клеточные культуры

2.1.1 Остеобласты человека

2.1.2 Эндотелиальные клетки пуповинной вены человека

2.1.3 Интерстициальные и эндотелиальные клетки аортального клапана человека

2.1.4 Мезенхимные клетки различного происхождения

2.1.5 Постоянные клеточные линии

2.1.6. Биоэтика

2.2 Остеогенная дифференцировка

2.3 Контактное и бесконтактное сокультивирование

2.3.1 Контактное сокультивирование

2.3.2 Бесконтактное сокультивирование

2.4 Магнитное разделение CD31-позитивных клеток

2.5 Окраска ализариновым красным

2.6 Иммуноцитохимическое окрашивание клеток

2.7 Анализ экспрессии генов

2.7.1 Выделение РНК

2.7.2 Обратная транскрипция

2.7.3 ПЦР в реальном времени

2.8 Лентивирусные конструкции

2.8.1 Плазмидные конструкции и их амплификация в бактериальных культурах

2.8.2 Сборка лентивирусных частиц

2.8.3 Лентивирусная трансдукция клеток

2.8.4 Сокультивирование остеобластов с трансдуцированными эндотелиальными клетками

2.9 Протеомика дробовика

2.9.1 Протеомный анализ

2.9.2 Статистический анализ протеомных данных

2.10 РНК-секвенирование

2.10.1 Транскриптомный анализ

2.10.2 Статистический анализ транскриптомных данных

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1 Влияние эндотелиальных клеток на остеогенную дифференцировку остеобластов при прямом и непрямом сокультивировании

3.2 Анализ протеомного и транскриптомного профилей эндотелиальных клеток и остеобластов при различных условиях сокультивирования

3.2.1 Молекулярный профиль остеобластов при различных условиях сокультивирования с эндотелиальными клетками

3.2.2 Молекулярный профиль эндотелиальных клеток при непрямом сокультивировании с остеобластами

3.2.3 Молекулярный профиль эндотелиальных клеток при прямом сокультивировании с остеобластами

3.3 Исследование роли оксида азота в остеогенной дифференцировке остеобластов

3.4 Сокультивирование эндотелиальных клеток с остеобластами стимулирует экспрессию компонентов TGF-ß/BMP сигнального пути

3.5 Роль сигнального пути Notch при сокультивировании эндотелиальных клеток с остеобластами

3.5.1 Анализ экспрессии компонентов сигнального пути Notch в эндотелиальных клетках и остеобластах

3.5.2 Влияние модуляции компонентов сигнального пути Notch в эндотелиальных клетках на остеогенную дифференцировку остеобластов в условиях прямого сокультивирования

3.5.3 Влияние активации/инактивации Notch на транскриптомный профиль эндотелиальных клеток

3.6 Влияние эндотелиальных клеток на остеогенную дифференцировку мезенхимных клеток различного происхождения

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

БЛАГОДАРНОСТИ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

РНК - рибонуклеиновая кислота МСК - мезенхимные стволовые клетки

VEGF (Vascular endothelial growth factor) - фактора роста эндотелия сосудов

MMP (Matrix metalloproteinase) - матриксные металлопротеиназы

TNF-a (Tumor necrosis factor-a) - фактор некроза опухоли-a

PDGF (Platelet-Derived Growth Factor) - фактор роста тромбоцитов

FGF (Fibroblast Growth Factor) - фактор роста фибробластов

TGF-в (Transforming growth factor-beta) - трансформирующий фактор роста в

BMP (Bone morphogenetic proteins) - костные морфогенетические белки

CAVD (Calcific aortic valve disease) - кальцинирующая болезнь аортального

клапана

NICD - внутриклеточный домен Notch ЭК - эндотелиальные клетки ОБ - остеобласты

ИКК - интерстициальные клетки аортального клапана кЭК - эндотелиальные клетки аортального клапана человека ЭндМП - эндотелиально-мезенхимный переход

DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) - питательная среда Игла в модификации Дюльбекко

HEK (Human Embryonic Kidney) - клеточная линия эмбриональной почки человека

FBS (Fetal Bovine Serum) - бычья эмбриональная сыворотка

PBS (Phosphate-Buffered Saline) - фосфатно-солевой буфер

BSA (Bovine Serum Albumin) - бычий сывороточный альбумин

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

кДНК - комплементарная ДНК, продукт обратной транскрипции мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота РВ-ПЦР - полимеразная цепная реакция в реальном времени shRNA - малые шпилечные РНК

GFP (Green Fluorescent Protein) - зеленый флуоресцентный белок

HEK (Human Embryonic Kidney) - клеточная линия эмбриональной почки человека

DAPI - 4',6-диамидино-2-фенилиндол дигидрохлорид

PCA (Principal component analysis) - анализ главных компонент

NO (Nitric oxide) - оксид азота

ДЭГ- дифференциально экспрессируемые гены

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования

Функциональная целостность костной системы основана на выполнении ряда важных событий: образования новой костной ткани и ее ремоделирования, поддержания популяции костеобразующих клеток - мезенхимных стволовых клеток и остеобластов, и костерезорбирующих клеток - остеокластов, а также строгой регуляции их дифференцировки [1]. Функционирование этих процессов в значительной степени связано с поддерживающим микроокружением, которое формируется благодаря непосредственной близости кровеносных сосудов, осуществляющих транспорт кислорода и питательных веществ [2,3]. Эндотелиальные клетки, выстилающие внутреннюю поверхность кровеносных сосудов, при этом оказывают глубокое влияние на функционирование клеток костной ткани посредством прямых межклеточных взаимодействий и секреции различных паракринных факторов, цитокинов, факторов роста и других регуляторных молекул [4,5]. Помимо того, что эндотелиальные клетки через различные механизмы взаимодействия способны регулировать поведение клеток костной ткани, участвующих в процессах минерализации, они и сами способны преобразовывать и корректировать свое поведение в ответ на изменения в окружающей среде [6]. Так, эндотелиальные клетки могут проявлять значительную пластичность и изменять свои фенотипических и функциональные характеристики путем эндотелиально-мезенхимного перехода [7]. При эндотелиально-мезенхимном переходе происходит ингибирование экспрессии генов, характерных для эндотелиальных клеток, и активируется каскад процессов, которые способствуют тому, что эндотелиальные клетки могут переходить в мезенхимные клетки, которые, в свою очередь, обладают потенциалом дифференцироваться в остеобласты, что способствует образованию костной ткани [8,9].

Принято считать, что основной механизм взаимодействия между

эндотелиальными клетками и клетками костной ткани связан с паракринной

сигнализацией, которая включает в себя секрецию ангиогенных и ангиокринных

8

факторов, обеспечивающих функциональные реакции в обоих типах клеток [5]. Однако появляются данные, которые свидетельствуют о том, что помимо паракринной сигнализации, основанной на секреции ангиогенных и ангиокринных факторов, существуют и другие механизмы взаимодействия между эндотелиальными клетками и клетками костной ткани, которые могут играть решающую роль в регуляции процессов ангио- и остеогенеза [10-12]. Одним из таких механизмов является передача сигнала посредством внеклеточных везикул, содержащих различные РНК, микроРНК и белки [12,13]. Кроме того, особое внимание уделяют юкстакринному сигналингу, так как, по-видимому, эндотелиальные клетки могут взаимодействовать с клетками костной ткани напрямую. Юкстакринная сигнализация подразумевает под собой межклеточные взаимодействия через различные белковые молекулы, находящиеся на поверхности клеток. В контексте ангио-остеогенеза эти взаимодействия могут реализовываться следующими способами: через клеточные молекулы адгезии - кадгерины и интегрины, связывающиеся с белками внеклеточного матрикса [14]; через молекулы щелевых контактов - коннексины [15] и через лиганд-рецепторное взаимодействие, а именно через сигнальный путь Notch [10,16].

Современные научные работы неизменно подчеркивают критическую значимость сложной взаимосвязи ангио и остеогенеза [2,17-19]. Однако, несмотря на значительный прогресс в понимании этих процессов, детальные механизмы и отличительный вклад разнообразных межклеточных взаимодействий, основанных на паракринной и юкстакринной сигнализации, в общую динамику кальцификации и минерализации остается до сих пор слабо изученным. Диссертационная работа направлена на поиск паракринных и юкстакринных механизмов, участвующих в перекрестных взаимодействиях между эндотелиальными клетками и остеобластами в контексте остеогенной дифференцировки клеток in vitro. Раскрытие сложных регуляторных механизмов, определяющих роль эндотелиальных клеток в остеогенной дифференцировке, является важным шагом

в понимании баланса костного гомеостаза и аномальных процессов минерализации.

Цель и задачи исследования

Цель работы: определить клеточные и молекулярные механизмы влияния эндотелиальных клеток на клетки мезенхимного происхождения при индукции остеогенной дифференцировки в условиях in vitro.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Сравнить влияние эндотелиальных клеток на остеогенную дифференцировку остеобластов при условиях контактного и бесконтактного сокультивирования;

2. Провести сравнительный анализ дифференциальной экспрессии генов и белков в эндотелиальных клетках и остеобластах при контактном и бесконтактном сокультивировании относительно монокультур;

3. Установить ключевые сигнальные пути, участвующие в регуляции остеогенной дифференцировки при контактном и бесконтактном сокультивировании, и определить роль сигнального пути Notch;

4. Оценить возможность управления остеогенной дифференцировкой остеобластов посредством модификации сигнального пути Notch в эндотелиальных клетках;

5. Оценить влияние эндотелиальных клеток на остеогенную дифференцировку мезенхимных клеток различного происхождения.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Эндотелиальные клетки оказывают двойственное влияние на остеогенную дифференцировку и, в зависимости от условий сокультивирования с остеобластами, могут проявлять остеоиндуктивные или остеосупрессивные свойства.

2. Остеоиндуктивные свойства эндотелиальных клеток реализуются только при

наличии физического контакта с остеобластами и опосредованы сигнальным

10

путем Notch, в то время как их остеосупрессивные свойства связаны с действием паракринных факторов. 3. Инактивация NOTCH1 и NOTCH3 в эндотелиальных клетках приводит к подавлению остеогенной дифференцировки остеобластов при контактном взаимодействии, тогда как активация внутриклеточных доменов NICD1 и NICD3 значительно усиливает остеогенную дифференцировку.

Научная новизна

Данная диссертационная работа представляет собой комплексное исследование влияния эндотелиальных клеток на остеогенную дифференцировку клеток мезенхимного происхождения - остеобластов. В ходе исследования было установлено, что эндотелиальные клетки в зависимости от наличия или отсутствия прямого контакта с остеобластами могут проявлять остеоиндуктивные или остеосупрессивные свойства. В рамках данной работы впервые были показаны изменения как протеомного, так и транскриптомного профиля эндотелиальных клеток и остеобластов при различных условиях сокультивирования и определены ключевые сигнальные пути, вовлеченные в регуляцию остеогенной дифференцировки. Получены данные, свидетельствующие о ключевой роли сигнального пути Notch при прямом сокультивировании эндотелиальных клеток и остеобластов при индукции остеогенной дифференцировки. Впервые выявлены компоненты сигнального пути Notch, инактивация или активация которых в эндотелиальных клетках оказывает влияние на остеогенную дифференцировку остеобластов. Более того, в работе был впервые проанализирован эффект влияния инактивации NOTCH1/NOTCH3 и активации их внутриклеточных эффекторных доменов NICD1/NICD3 на транскриптомный профиль эндотелиальных клеток и определены ключевые гены, чувствительные к модуляции сигналов Notch в обоих направлениях.

Теоретическая и практическая значимость работы

Представленная диссертационная работа имеет фундаментальное значение и демонстрирует ранее неизвестные факты о роли эндотелиальных клеток в остеогенной дифференцировке и вносит существенный вклад в понимание перекрестных взаимодействий между ангиогенезом и остеогенезом. В ходе исследования были получены новые данные, которые показывают особый вклад сигнального пути Notch в регуляции остеогенной дифференцировки при прямом взаимодействии эндотелиальных клеток и остеобластов. Продемонстрировано, что путем активации или инактивации сигнального пути Notch в эндотелиальных клетках можно управлять механизмами остеогенной дифференцировки остеобластов. Это открывает новые горизонты для исследований в области регенеративной медицины, так как позволяет рассматривать эндотелиальные клетки как потенциальные мишени для управления механизмами кальцификации, как репаративной, так и патологической.

Таким образом, работа не только углубляет теоретические знания о клеточных взаимодействиях в костной ткани, но и предлагает практические подходы для разработки новых методов лечения заболеваний, связанных с нарушением остеогенеза и сосудистой патологии.

Финансовая поддержка диссертации

Основная часть работы выполнена при финансовой поддержке гранта РНФ № 23-15-00320 «Механизмы регуляции остеогенной дифференцировки в норме и при сердечно-сосудистой патологии».

Личный вклад автора

Личный вклад автора заключался в получении первичных клеточных культур, проведении экспериментальных и теоретических исследований, обработке и анализе полученных данных, написании и подготовке публикаций по теме диссертации. Основные результаты представленной работы были получены автором лично или при его непосредственном участии. Биоинформатический

12

анализ протеомных и транскриптомных данных осуществлялся совместно с Кучур П.Д., Лобовым А.А. и. Хворовой И.А. Боярская Н.В. оказывала помощь в выделении интерстициальных клеток и эндотелиальных клеток аортального клапана человека. Дизайн экспериментов и полученные результаты обсуждались совместно с научным руководителем Малашичевой А.Б. Имена остальных соавторов указаны в соответствующих публикациях.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, результатов исследования, обсуждения, заключения, выводов, приложения и списка литературы, содержащего 223 ссылки на первоисточники. Работа изложена на 121 странице, содержит 23 рисунка и 2 таблицы.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Влияние эндотелиальных клеток на процессы остеогенной индукции в мезенхимных стволовых клетках»

Апробация работы

Результаты диссертационной работы были представлены и обсуждены на международных и отечественных конференциях:

1. VI Национальный конгресс по регенеративной медицине, Санкт-Петербург, 1315 ноября 2024, устный доклад;

2. IX Молодежная школа-конференция по молекулярной и клеточной биологии Института цитологии РАН, Санкт-Петербург, 15-18 октября 2024, устный доклад;

3. VII Петербургский медицинский инновационный форум, Санкт-Петербург, 14-16 мая 2024, устный доклад;

4. IV Балтийский симпозиум по иммунологии, молекулярной и регенеративной медицине: «Механизмы воспаления и регенерации в норме и при патологии», Калининград, 14-16 мая 2024, стендовый доклад;

5. III Международная конференция "StemCellBio-2023: Трансляционная медицина - спектр возможностей", Санкт-Петербург, 17-18 ноября 2023, устный доклад;

6. The Notch Meeting XII, Athens, Greece, 1-5 October 2023, стендовый доклад;

7. Юбилейный X форум молодых кардиологов «Движение вверх», Кемерово, 22-23 июня 2023, устный доклад;

8. 26-ая Пущинская школа-конференция молодых ученых с международным участием «БИОЛОГИЯ НАУКА XXI ВЕКА», Пущино, 9-13 апреля 2023, устный доклад;

9. V Национальный конгресс по регенеративной медицине, Москва, 23-25 ноября 2022, стендовый доклад;

10^Ш молодежная школа-конференция по молекулярной биологии и генетическим технологиям Института Цитологии РАН, Санкт-Петербург, 11-14 октября 2022, устный доклад.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в рецензируемых журналах:

1. Perepletchikova D., Kuchur P., Basovich L., Khvorova I., Lobov A., Azarkina K., Aksenov N., Bozhkova S., Karelkin V., Malashicheva A. Endothelial-mesenchymal crosstalk drives osteogenic differentiation of human osteoblasts through Notch signaling // Cell Communication and Signaling. - 2025. - V. 23. - №1. - P. 100.

2. Perepletchikova D.A., Malashicheva. A.B. Communication between endothelial cells and osteoblasts in regulation of bone homeostasis: Notch players // Stem Cell Research and Therapy. - 2025. - V. 16. - №1. - P. 56.

3. Lobov A., Kuchur P., Boyarskaya N., Perepletchikova D., Taraskin I., Ivashkin A., Kostina D., Khvorova I., Uspensky V., Repkin E., Denisov E., Gerashchenko T., Tikhilov R., Bozhkova S., Karelkin V., Wang C., Xu K., Malashicheva A. Similar, but not the same: multiomics comparison of human valve interstitial cells and osteoblast osteogenic differentiation expanded with an estimation of data-dependent and data-independent PASEF proteomics // GigaScience. - 2025. - V. 14. - P. 110.

4. Lobov A., Kuchur P., Khizhina A., Kotova A., Ivashkin A., Kostina D., Klausen P., Khokhlova E., Repkin E., Postnikova K., Perepletchikova D., Denisov E., Gerashchenko T., Tikhilov R., Bozhkova S., Sereda A., Karelkin V., Enukashvily N., Malashicheva A. Mesenchymal Cells Retain the Specificity of Embryonal Origin During Osteogenic Differentiation // Stem cells. - 2024. - V. 42. - №1. - P. 76-89.

Тезисы докладов:

1. Переплетчикова Д.А., Басович Л.С., Кучур П.Д., Азаркина К.Е., Смирнова Д.В., Боярская Н.В., Карелкин В.В., Малашичева А.Б. Сложное взаимодействие между эндотелиальными клетками и остеобластами во время остеогенной дифференцировки // Материалы VI Национального конгресса по регенеративной медицине; Санкт-Петербург, 13-15 ноября 2024г. - СПб: Эко-Вектор. - 2024. - С. 752-753.

2. Переплетчикова Д.А., Басович Л.С., Лобов А.А., Азаркина К.Е., Кучур П.Д., Хворова И.А., Карелкин В.В., Малашичева А.Б. Клеточные и молекулярные механизмы взаимодействия эндотелиальных клеток с клетками мезенхимного происхождения в остеогенной дифференцировке // Материалы XI Молодежной школы-конференции по молекулярной и клеточной биологии Института цитологии РАН, Санкт-Петербург, 15-18 октября 2024 г. - СПб.: Астерион. -2024. - С. 259-260.

3. Переплетчикова Д.А., Лобов А.А., Басович Л.С., Азаркина К.Е., Хворова И.А., Карелкин В.В., Малашичева А.Б. Роль эндотелия в остеогенной регенерации // Материалы IV Балтийского симпозиума по иммунологии, молекулярной и регенеративной медицине с международным участием. - 2024. - С. 118-120.

4. Переплетчикова Д.А., Лобов А.А., Хворова И.А., Малашичева А.Б. Сигнальный путь Notch как медиатор эндотелиально-мезенхимального клеточного взаимодействия во время остеогенной дифференцировки // Сборник материалов конференции и Школы-конференции «Коллекции культур клеток человека и животных: современные вызовы и сетевые решения». - 2023. - С. 49.

5. Переплетчикова Д.А., Костина Д.А., Карелкин В.В., Хворова И.А., Лобов А.А., Малашичева А.Б. Изучение клеточных и молекулярных механизмов влияния эндотелиальных клеток на процессы остеогенной дифференцировки // Сборник тезисов 26-ой Пущинской школы-конференции молодых ученых с международным участием «БИОЛОГИЯ - НАУКА XXI ВЕКА». - 2023. - С. 104.

6. Переплетчикова Д.А., Костина Д.А., Карелкин В.В., Хворова И.А., Лобов А.А., Малашичева А.Б. Изучение влияния эндотелиальных клеток на процессы остеогенной дифференцировки // Гены и клетки. - 2022. - Т. 17. - № S3. - С. 176.

7. Переплетчикова Д.А., Костина Д.А., Карелкин В.В., Лобов А.А., Малашичева А.Б. Изучение остеоиндуктивных и остеосупрессивных свойств эндотелиальных клеток в модели сокультивирования с остеобластами. Материалы VIII молодежной школы-конференции по молекулярной биологии и

генетическим технологиям Института Цитологии РАН // Цитология. - 2022. - Т. 64. - №.7. - С. 744.

8. Переплетчикова Д.А., Костина Д.А., Карелкин В.В., Лобов А.А., Малашичева А.Б. Изучение остеоиндуктивных свойств эндотелиальных клеток в модели сокультивирования с остеобластами // Сборник тезисов 25-ой Пущинской школы-конференции молодых ученых с международным участием «БИОЛОГИЯ - НАУКА XXI ВЕКА». - 2022. - C. 143-144.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Эндотелий как многофункциональный орган

Кровеносные сосуды представляют собой универсальную транспортную систему, которая распространяется по всему телу, за исключением хряща и хрусталика глаза [20]. Капиллярные сети обеспечивают выполнение общих и тканеспецифичных функций в ответ на различные системные и локальные изменения. Выполнение же этих функций опосредовано специализированными эндотелиальными клетками [21]. Эндотелиальные клетки, прикрепленные к базальной мембране, выстилают внутреннюю поверхность сосудов и формируют диффузно распределенный многофункциональный орган - эндотелий.

Эндотелий выполняет роль пассивного барьера между кровью и окружающими тканями, обеспечивает межклеточный транспорт молекул, участвует в регуляции физиологических процессов и является источником паракринных, так называемых «ангиокринных», молекулярных сигналов, которые способны контролировать поведение других клеток в окружающих их тканях [20].

Эндотелиальные клетки в каждом органе уникальны и в зависимости от того, в какой области они находятся, имеют различные морфологические особенности, профили экспрессии генов и функциональные роли [22,23]. Так, эндотелий в легких регулирует газообмен [24], в почках участвует в ультрафильтрации [25], в центральной нервной системе защищает от потенциально токсических веществ [26], а в печени поддерживает обменные процессы и участвует в регенерации [27]. В кости же эндотелий оказывает непосредственное влияет на развитие, рост и регенерацию костной ткани [2,28].

1.2 Роль кровеносных сосудов в формировании костной ткани

Костная ткань формируется из мезенхимных стволовых клеток (МСК). Известно, что существуют два пути преобразования МСК в клетки остеогенного направления - путем внутримембранного и эндохондрального окостенения (Рис.1.1). В ходе внутримембранного окостенения, характерного для плоских

костей, таких как череп или ключица, происходит прямая дифференцировка МСК в основные костеобразующие клетки - остеобласты. Остеобласты синтезируют коллаген 1 типа, протеогликаны и различные специфичные белки внеклеточного матрикса, которые формируют костный матрикс [29,30]. При эндохондральном окостенении, характерном для большинства костных структур, существует промежуточный этап дифференцировки, в ходе которого МСК конденсируются в аваскулярных областях, дифференцируются в хондроциты, синтезируют коллаген 2 типа и формируют хрящевую матрицу, которая впоследствии реорганизуется, замещается костной матрицей и превращается в кальцифицированную ткань [31]. Оба этих процесса зависят от кровеносных сосудов и паракринных факторов, секретируемых эндотелиальными клетками, которые стимулируют дифференцировку клеток-предшественников и остеобластов, способствуя тем самым нормальной минерализации костного матрикса [21,32,33].

1.2.1 Эндохондральное окостенение

Во время эндохондрального окостенения и реорганизации хряща в зоне хрящевой пластины хондроциты становятся гипертрофированными и инициируют синтез основного проангиогенного фактора - фактора роста эндотелия сосудов VEGF [21,32].

Семейство VEGF состоит из нескольких факторов: VEGF-A, VEGF-B, VEGF-С, VEGF-D и плацентарного фактора роста. VEGF действуют через тирозинкиназные рецепторы VEGF, обозначаемые VEGFR1 и VEGFR2 [34]. VEGFR1 экспрессируется в основном гемопоэтическими стволовыми клетками и воспалительными клетками, в частности моноцитами и макрофагами, а VEGFR2 -эндотелиальными клетками [35,36] . Впервые VEGF был выделен и очищен в 1989 году Наполеоном Феррара и его коллегами [37,38], что послужило основой для формирования современной концепции ангиогенеза. Дальнейшее изучение молекулярных и биологических свойств VEGF определило его главенствующую роль в регуляции ангиогенеза и росте кровеносных сосудов [39,40]. Было показано,

что инактивация даже одного аллеля Vegf в эмбриональных стволовых клетках мышей нарушает внутриутробный ангиогенез и приводит к летальному исходу

[41]. А в 1999 году впервые было обнаружено, что VEGF является не только специфическим регулятором ангиогенеза, но и выполняет роль связующего звена в процессах остео и ангиогенеза [42]. Так, было показано, что при системной инактивации VEGF растворимым химерным белком mFlt (1-3)-IgG - антагонистом VEGF, у ювенильных мышей подавлялась инвазия кровеносных сосудов, нарушался рост гипертрофированных хондроцитов и формирование костной ткани. При этом, когда воздействие ингибитором VEGF было приостановлено, процессы нормализировались, и наблюдалось эндохондральное окостенение хрящевой ткани

[42]. В 2004 году Зельцер и др. представили новые доказательства особой роли VEGF в формировании костной ткани [43]. У линии мышей с условным нокаутом Vegf в хондроцитах при эндохондральном окостенении нарушалась васкуляризация хряща, что приводило к массовой гибели гипертрофированных хондроцитов, в то время как у мышей дикого типа этого не наблюдалось. Также было обнаружено, что клеточная гибель хондроцитов у мышей с нокаутом Vegf имела поразительное сходство с гибелью клеток при нокауте транскрипционного фактора, индуцируемого гипоксией - Ш/1а [43]. Дальнейшие исследования в этой области определили, что при формировании гипертрофированных хондроцитов индуцируется экспрессия транскрипционного фактора Ш/1а, который регулирует синтез VEGF-A [44,45]. Белки VEGF-A, в свою очередь, активируют клеточную сигнализацию за счет связывания с рецептором тирозинкиназы VEGFR2, экспрессируемым эндотелиальными клетками, и стимулируют рост кровеносных сосудов в зоне хрящевой пластины. Из всего семейства белков VEGF именно VEGF-A играет особую роль в ангиогенезе кости и является критически важным посредником в инвазии кровеносных сосудов [20].

Одновременно с инвазией и ростом кровеносных сосудов в область гипертрофированного хряща рекрутируются остеопрогениторные клетки, гемопоэтические клетки и остеокласты - специализированные многоядерные

клетки, происходящие из клеток гемопоэтической линии макрофагов [46]. Остеокласты и ЭК синтезируют матриксные металлопротеиназы (ММР) [47]. ММР представляют собой коллагеназы, реорганизующие внеклеточный матрикс. Именно за счет ММР происходит постепенная деградация и резорбция гипертрофированного хряща, в результате чего из гипертрофированных хондроцитов высвобождается большое количество VEGF. При реорганизации матрикса хрящевая матрица начинает выполнять роль каркаса для остеопрогениторных клеток, и формируется полость костного мозга. Остеопрогениторные клетки, в свою очередь, дифференцируются в остеобласты, а впоследствии в остеоциты - терминально дифференцированные клетки костной ткани. Эти события в совокупности с инвазией кровеносных сосудов в гипертрофированный хрящ приводят к формированию первичного центра окостенения [32,48].

По мере роста гипертрофированные хондроциты подвергаются апоптозу и замещаются трабекулярной костью в направлении к области эпифиза, что способствует продольному росту кости [49]. Однако не все гипертрофированные хондроциты претерпевают апоптоз, часть из них способны напрямую дифференцироваться в остеобласты [50]. В постнатальном периоде в эпифизарной области образуются вторичные центры окостенения. За счет активной инвазии кровеносных сосудов, дифференцировки остеопрогениторных клеток и остеобластов инициируется продольный рост кости и впоследствии формируется трубчатая кость [51].

Таким образом, кровеносные сосуды являются необходимым компонентом при эндохондральном окостенении и способствуют формированию первичных и вторичных центров окостенения, благодаря активной секреции остеогенных факторов эндотелиальными клетками.

1.2.2 Внутримембранное окостенение

Во время внутримембранного окостенения ангиогенез также играет важную роль. Во время конденсации и прямой дифференцировки МСК в остеобласты экспрессируются проангиогенные факторы, в частности VEGF-А, что способствует формированию кровеносных сосудов [52-54]. Новообразованные кровеносные сосуды инвагинируют в области конденсации МСК, где они способствуют минерализации и стимулируют остеогенез. Было показано, что при делеции Vegf у мышей с помощью Osx-Cre в предшественниках остеобластов нарушается процесс внутримембранного окостенения и наблюдается снижение объема костной ткани и ее минерализации [55]. Кроме того, остеобласты, полученные из мышей с нокаутом Vegf, также демонстрировали снижение минерализации [55].

Кровеносные сосуды играют важную роль как при эндохондральном, так и при внутримембранном окостенении. Несмотря на различия в этапах формирования костной ткани, регуляторные механизмы ангиогенеза схожи для обоих процессов. В ответ на секрецию VEGF инициируется рост кровеносных сосудов, что стимулирует пролиферацию эндотелиальных клеток. Эндотелиальные клетки в свою очередь секретируют остеогенные факторы и тем самым регулируют процессы дифференцировки остеопрогениторных клеток и остеобластов, что способствует нормальной минерализации костного матрикса. Различные же изменения механизмов формирования и роста кровеносных сосудов приводят к негативным последствиям и нарушениям образования костной ткани [33,56,57].

Рис.1.1. Этапы инвазии кровеносных сосудов во время внутримембранного и эндохондрального окостенения. 1. В ходе внутримембранного окостенения происходит прямая дифференцировка МСК в основные костеобразующие клетки - остеобласты. Во время конденсации и дифференцировки МСК в остеобласты активно экспрессируется основной проангиогенный фактор VEGF, что способствует формированию кровеносных сосудов. Кровеносные сосуды в свою очередь инвагинируют в области конденсации и стимулируют остеогенез. 2. Во время эндохондрального окостенения МСК конденсируются в аваскулярных областях, дифференцируются в хондроциты и формируют хрящевую матрицу. Затем хрящевая матрица реорганизуется и хондроциты становятся гипертрофированными. Гипертрофированные хондроциты инициируют синтез VEGF и рост кровеносных сосудов. По мере роста гипертрофированные хондроциты подвергаются апоптозу, а часть напрямую дифференцируется в остеобласты. Формируются первичные центры окостенения. В постнатальном периоде в эпифизарной области образуются вторичные центры окостенения за счет дифференцировки остеопрогениторных клеток и активной инвазии кровеносных сосудов.

1.3 Неоднородность эндотелиальных клеток в костной ткани

В постнатальном периоде устройство кровеносной системы в кости значительно преобразуется и приобретает сложную структуру. В настоящее время стало известно, что существует несколько специализированных подтипов кровеносных сосудов, характерных для костных тканей [22,58]. Костные кровеносные сосуды разделяют на два основных подтипа: тип Н и тип L (Рис.1.2). Их классификация основывается на морфологической специализации, молекулярной идентичности и функциональных свойствах [18].

Капилляры типа Н, так называемые эндостальные капилляры или капилляры переходной зоны, локализованы в областях метафиза и эндоста, где они тесно связаны с остеопрогениторными клетками [59], в то время как капилляры типа L локализованы в области диафиза [60,61]. Помимо местоположения, кровеносные сосуды типа Н и L различаются характеристиками эндотелиальных клеток, которые их формируют, в частности, по экспрессии маркеров. Так, эндотелиальные клетки сосудов типа L экспрессируют низкие уровни основных маркеров эндотелиальных клеток, такие как белок CD31 и эндомуцин [18]. Напротив, эндотелиальные клетки в сосудах типа Н экспрессируют высокие уровни CD31 и эндомуцина [18]. Эндотелиальные клетки сосудов типа Н и L также по-разному секретируют различные ангиокринные факторы. Так, эндотелиальные клетки сосудов типа Н выделяют остеогенные факторы, регулируют пролиферацию и дифференцировку остеопрогениторных клеток [17]. Сосуды типа L при этом не связаны с остеопрогениторными клетками, и их действие в основном направлено на поддержание ниши гемопоэтических стволовых и периваскулярных клеток [62]. Несмотря на структурные различия, сосуды типа Н и типа L взаимосвязаны и образуют единую сосудистую сеть в центральной полости костного мозга [21,63,64].

Рис.1.2. Типы кровеносных сосудов в кости. Костные кровеносные сосуды разделяют на два основных подтипа: типа H и типа L. Капилляры типа H локализованы в метафизарной области, экспрессируют высокие уровни основных маркеров эндотелиальных клеток - CD31 и эндомуцина, выделяют остеогенные факторы, и тем самым регулируют пролиферацию и дифференцировку остеопрогениторных клеток, с которыми они тесно связаны. Капилляры типа L локализованы в области диафиза и экспрессируют низкие уровни CD31 и эндомуцина, выделяют паракринные факторы, действие которых направлено на поддержание ниши гемопоэтических стволовых и периваскулярных клеток.

Помимо капилляров типа Ни L выделяют третью популяцию временно существующих кровеносных сосудов, называемых сосудами типа Е [65]. Особенностью субпопуляции капиллярных сетей типа Е является высокий уровень экспрессии CD31, эндомуцина, ангиогенных и проостеогенных генов [20]. Предполагается, что именно эта эндотелиальная субпопуляция на начальных этапах поддерживает пролиферацию остеобластов, способствует быстрому росту костей во время развития и затем порождает другие субпопуляции эндотелиальных клеток [65].

Пропорциональное соотношение подтипов кровеносных сосудов кости изменяется на протяжении всей жизни. Первоначально на этапе поздней эмбриональной и ранней постнатальной стадиях развития преобладают сосуды

типа Е. В постнатальном периоде превалируют сначала сосуды типа Н, затем со временем увеличивается количество сосудов типа L, и уже в зрелом и пожилом возрасте сосуды типа L становятся основной популяцией кровеносных сосудов кости [62].

1.4 Роль кровеносных сосудов в регенерации костной ткани

Кость имеет высокий регенеративный потенциал и особенностью ее регенерации является то, что при заживлении кость способна полностью вернуться в нормальное физиологическое состояние в отличие от мягких тканей, у которых процесс заживления часто приводит к образованию рубцовой ткани [66]. При повреждении или переломе кости нарушается целостность костных структур и их кровоснабжение, из-за чего последующая остеорегенерация происходит в несколько этапов.

1.4.1 Первый этап остеорегенерации: воспаление

На первом этапе в поврежденной области возникает гематома, гранулируются тромбоциты, формируется фибриновый сгусток, выполняющий роль временного внеклеточного матрикса, и образуется воспалительный очаг [67]. Так, активируется ранний иммунный ответ, и в поврежденную область рекрутируются различные иммунные клетки, включая нейтрофилы, М1-подобные макрофаги, которые стимулируют воспалительный процесс и экспрессируют провоспалительные цитокины, такие как фактор некроза опухоли-а (TNF-а) и различные интерлейкины (IL-1, IL-6) [68]. За счет провоспалительных цитокинов в область воспаления привлекаются моноциты, лимфоциты и макрофаги М2, которые в свою очередь обеспечивают удаление фибринового матрикса и некротизированных тканей, а также запускают секрецию вторичных противоспалительных факторов, таких как фактор роста тромбоцитов (PDGF), фактор роста фибробластов (FGF), члены суперсемейства трансформирующего фактора роста (TGF)-P, включая костные морфогенетические белки (BMP) [69].

Макрофаги М1/М2 и продуцируемые ими цитокины являются необходимыми компонентами реакции заживления и играют важную роль как в регуляции воспалительного и противовоспалительного процессов, так и в последующей регенерации [70]. Например, у мышей с нокаутом гена, кодирующего белок Т№-а, наблюдается существенная задержка в последующих этапах остеорегенерации, связанных с дифференцировкой хондроцитов [71]. А у мышей с нокаутом гена, кодирующего белок 1Ь-6, снижается минерализация на начальных стадиях заживления [72]. Кроме того, было показано, что у трансгенных мышей с модельным фиксированным переломом бедренной кости при индуцируемом истощении макрофагов наблюдаются значительные нарушения в процессе эндохондрального образования костной ткани, а также нарушаются процессы формирования остеобластов и процессы минерализации [73] .

В поврежденной области из-за резкого снижения концентрации кислорода формируется гипоксическая среда, и тем самым в иммунных клетках инициируется не только секреция цитокинов и противовоспалительных факторов, но и продукция VEGF, связанная с активацией экспрессии гена ШД [74]. VEGF, в свою очередь, стимулирует начальный ангиогенез. При больших повреждениях гипоксия, в следствие плохой васкуляризации, часто может приводить к задержке или нарушениям при регенерации костной ткани. В таком случае факторы, способствующие ангиогенезу и формированию новых кровеносных сосудов, играют решающую роль и являются критически важными компонентами для остеорегенерации [75].

Рекрутинг макрофагов и начальный ангиогенез являются связанными процессами. Макрофаги секретируют VEGF и содействуют ангиогенезу, а вновь сформированные кровеносные сосуды вербуют макрофаги в поврежденную область [76]. Так, на модельных мышах с остеотомией было показано, что экспрессия VEGF в первые дни остеорегенерации инициируется именно М1 макрофагами CD80+, в то время как в последующих этапах основной вклад в синтез VEGF вносят остеопрогениторные клетки [76]. Начальная острая фаза и ранний

ангиогенез закладывают основу для последующих этапов и играют важную роль в регенерации костной ткани [77]. В итоге, на первом этапе гематома постепенно замещается грануляционной тканью, которая служит основой для формирования новой костной ткани.

1.4.2 Второй этап остеорегенерации: ангио-мезенхимная фаза

Второй этап регенерации связан с ангио-мезенхимной фазой и включает в себя рекрутирование МСК в поврежденную область, их дифференцировку в хондрогенном и остеогенном направлениях, формирование и инвазию новых кровеносных сосудов [67]. Как и при развитии костной ткани, при остеорегенерации существуют два пути преобразования и дифференцировки МСК: внутримембранное - напрямую из МСК в остеобласты и эндохондральное - через промежуточную стадию с образованием хондроцитов [78].

На начальных этапах направление дифференцировки МСК в хондроциты или остеобласты регулируется в основном двумя транскрипционными факторами Sox9 и Runx2 [30]. Sox9 является фактором транскрипции, который играет решающую роль в пролиферации, созревании хондроцитов и их дифференцировке, и в основном преобладает при раннем хондрогенезе [79,80]. Sox9 выполняет роль активатора транскрипции генов, специфичных для хондроцитов, таких как COL2A1 и COL11A2. Так, было показано, что у химерных мышей Sox9-/- не экспрессируются хондроцит-специфичные маркеры COL2A1, COL9A2 и COL11A2 и не образуется хрящ [81]. При этом активация хондроцит-специфичных маркеров приводит к синтезу основных компонентов внеклеточного матрикса - коллагена II типа и неколлагеновых протеогликанов, что способствует образованию аваскулярной хрящевой матрицы и замещению грануляционной ткани [48].

По мере созревания хондроцитов транскрипционная регуляция от Sox9 переходит к Runx2 [82]. Runx2 представляет собой фактор транскрипции, который считается основным регулятором остеогенной дифференцировки и способствует прямой дифференцировке МСК в остеобласты, а также регулирует поздний

хондрогенез и способствует созреванию гипертрофированных хондроцитов [83]. Мыши с гомозиготной мутацией Кипх2 лишены остеобластов, у них полностью нарушаются процессы внутримембранного и эндохондрального окостенения, что приводит к отсутствию костной ткани и летальному исходу сразу после их рождения [84].

Гипертрофированные хондроциты и остеобласты активно экспрессируют VEGF и стимулируют рост кровеносных сосудов в области аваскулярного хряща [55,85]. При этом в процессе васкуляризации и реорганизации хряща гипертрофированные хондроциты подвергаются апоптозу или дифференцируются в остеобласты и остеоциты [50,82]. Инвазия кровеносных сосудов способствует преобразованию матрицы, хрящевой матрикс постепенно замещается на костный. Так, в работе Ху и его коллег было показано, что именно в области, где наблюдается инвазия кровеносных сосудов, снижается количество протеогликанов и наблюдается выработка костного матрикса [82]. В частности, клетки начинают экспрессировать костные белки внеклеточного матрикса, регулирующие минерализацию и кальцификацию хрящевого матрикса, такие как остеокальцин и остеопонтин [82]. Экспрессия этих белков регулируется транскрипционным фактором Osterix (Osx), который в свою очередь регулируется фактором Runx2 [86].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Переплетчикова Дарья Александровна, 2025 год

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Stegen S., Carmeliet G. Metabolic regulation of skeletal cell fate and function // Nat Rev Endocrinol. 2024. Vol. 20, № 7. P. 399-413.

2. Grosso A. et al. It Takes Two to Tango: Coupling of Angiogenesis and Osteogenesis for Bone Regeneration // Front Bioeng Biotechnol. 2017. Vol. 5.

3. Sivan U., De Angelis J., Kusumbe A.P. Role of angiocrine signals in bone development, homeostasis and disease // Open Biol. 2019. Vol. 9, №2 10. P. 190144.

4. Matta R. et al. Endothelial cell secreted VEGF-C enhances NSC VEGFR3 expression and promotes NSC survival // Stem Cell Res. 2021. Vol. 53. P. 102318.

5. Stegen S., Carmeliet G. The skeletal vascular system - Breathing life into bone tissue // Bone. 2018. Vol. 115. P. 50-58.

6. Howe K.L., Fish J.E. Transforming endothelial cells in atherosclerosis // Nat Metab. 2019. Vol. 1, № 9. P. 856-857.

7. Kovacic J.C. et al. Endothelial to Mesenchymal Transition in Cardiovascular Disease // J Am Coll Cardiol. 2019. Vol. 73, № 2. P. 190-209.

8. Yao Y. et al. A Role for the Endothelium in Vascular Calcification // Circ Res. 2013. Vol. 113, № 5. P. 495-504.

9. Zhang L. et al. Contributions of the Endothelium to Vascular Calcification // Front Cell Dev Biol. 2021. Vol. 9.

10. Ramasamy S.K. et al. Endothelial Notch activity promotes angiogenesis and osteogenesis in bone // Nature. 2014. Vol. 507, № 7492. P. 376-380.

11. Cao C. et al. Bidirectional juxtacrine ephrinB2/Ephs signaling promotes angiogenesis of ECs and maintains self-renewal of MSCs // Biomaterials. 2018. Vol. 172. P. 1-13.

12. Fernandes C.J. da C. Unveiling the intricacies of bone homeostasis: Epigenetic regulation, extracellular vesicles, and angiogenesis integration // Extracellular Vesicle. 2024. Vol. 3. P. 100042.

13. Liu L. et al. Endothelial cell-derived exosomes trigger a positive feedback loop in osteogenesis-angiogenesis coupling via up-regulating zinc finger and BTB domain

101

containing 16 in bone marrow mesenchymal stem cell // J Nanobiotechnology. 2024. Vol. 22, № 1. P. 721.

14. Menge T. et al. Human Mesenchymal Stem Cells Inhibit Endothelial Proliferation and Angiogenesis via Cell-Cell Contact Through Modulation of the VE-Cadherin/p-Catenin Signaling Pathway // Stem Cells Dev. 2013. Vol. 22, № 1. P. 148-157.

15. Liao Y. et al. Concentrated Growth Factors Promote hBMSCs Osteogenic Differentiation in a Co-Culture System With HUVECs // Front Bioeng Biotechnol. 2022. Vol. 10.

16. Liu W. et al. Hypoxic environment promotes angiogenesis and bone bridge formation by activating Notch/RBPJ signaling pathway in HUVECs // Genomics. 2024. Vol. 116, № 3. P. 110838.

17. Maggio N., Banfi A. The osteo-angiogenic signaling crosstalk for bone regeneration: harmony out of complexity // Curr Opin Biotechnol. 2022. Vol. 76. P. 102750.

18. Kusumbe A.P., Ramasamy S.K., Adams R.H. Coupling of angiogenesis and osteogenesis by a specific vessel subtype in bone // Nature. 2014. Vol. 507, № 7492. P. 323-328.

19. Bixel M.G. et al. Angiogenesis is uncoupled from osteogenesis during calvarial bone regeneration // Nat Commun. 2024. Vol. 15, № 1. P. 4575.

20. Tuckermann J., Adams R.H. The endothelium-bone axis in development, homeostasis and bone and joint disease // Nat Rev Rheumatol. 2021. Vol. 17, № 10. P. 608-620.

21. Augustin H.G., Koh G.Y. Organotypic vasculature: From descriptive heterogeneity to functional pathophysiology // Science (1979). 2017. Vol. 357, № 6353.

22. Nolan D.J. et al. Molecular Signatures of Tissue-Specific Microvascular Endothelial Cell Heterogeneity in Organ Maintenance and Regeneration // Dev Cell. 2013. Vol. 26, № 2. P. 204-219.

23. Cleuren A.C.A. et al. The in vivo endothelial cell translatome is highly heterogeneous across vascular beds // Proceedings of the National Academy of Sciences. 2019. Vol. 116, № 47. P. 23618-23624.

24. Green C.E., Turner A.M. The role of the endothelium in asthma and chronic obstructive pulmonary disease (COPD) // Respir Res. 2017. Vol. 18, № 1. P. 20.

25. Obeidat M., Obeidat M., Ballermann B.J. Glomerular endothelium: A porous sieve and formidable barrier // Exp Cell Res. 2012. Vol. 318, № 9. P. 964-972.

26. Sweeney M.D. et al. Blood-Brain Barrier: From Physiology to Disease and Back // Physiol Rev. 2019. Vol. 99, № 1. P. 21-78.

27. Ding B.-S. et al. Divergent angiocrine signals from vascular niche balance liver regeneration and fibrosis // Nature. 2014. Vol. 505, № 7481. P. 97-102.

28. Yin Y. et al. Insights into the mechanism of vascular endothelial cells on bone biology // Biosci Rep. 2021. Vol. 41, № 1.

29. Kronenberg H.M. Developmental regulation of the growth plate // Nature. 2003. Vol. 423, № 6937. P. 332-336.

30. Long F. Building strong bones: molecular regulation of the osteoblast lineage // Nat Rev Mol Cell Biol. 2012. Vol. 13, № 1. P. 27-38.

31. Aghajanian P., Mohan S. The art of building bone: emerging role of chondrocyte-to-osteoblast transdifferentiation in endochondral ossification // Bone Res. 2018. Vol. 6, № 1. P. 19.

32. Duan X. et al. Vegfa regulates perichondrial vascularity and osteoblast differentiation in bone development // Development. 2015. Vol. 142, № 11. P. 1984-1991.

33. Xu R. et al. Targeting skeletal endothelium to ameliorate bone loss // Nat Med. 2018. Vol. 24, № 6. P. 823-833.

34. Ferrara N., Gerber H.-P., LeCouter J. The biology of VEGF and its receptors // Nat Med. 2003. Vol. 9, № 6. P. 669-676.

35. Sekiguchi K. et al. VEGF Receptor 1-Expressing Macrophages Recruited from Bone Marrow Enhances Angiogenesis in Endometrial Tissues // Sci Rep. 2019. Vol. 9, № 1. P. 7037.

36. Xiong Y. et al. Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) Receptor-2 Tyrosine 1175 Signaling Controls VEGF-induced von Willebrand Factor Release from Endothelial Cells via Phospholipase C-y1- and Protein Kinase A-dependent Pathways // Journal of Biological Chemistry. 2009. Vol. 284, № 35. P. 2321723224.

37. Leung D.W. et al. Vascular Endothelial Growth Factor Is a Secreted Angiogenic Mitogen // Science (1979). 1989. Vol. 246, № 4935. P. 1306-1309.

38. Ferrara N., Henzel W.J. Pituitary follicular cells secrete a novel heparin-binding growth factor specific for vascular endothelial cells // Biochem Biophys Res Commun. 1989. Vol. 161, № 2. P. 851-858.

39. Ferrara N., Bunting S. Vascular endothelial growth factor, a specific regulator of angiogenesis // Curr Opin Nephrol Hypertens. 1996. Vol. 5, № 1. P. 35-44.

40. Ferrara N. Molecular and biological properties of vascular endothelial growth factor // J Mol Med. 1999. Vol. 77, № 7. P. 527-543.

41. Ferrara N. et al. Heterozygous embryonic lethality induced by targeted inactivation of the VEGF gene // Nature. 1996. Vol. 380, № 6573. P. 439-442.

42. Gerber H.-P. et al. VEGF couples hypertrophic cartilage remodeling, ossification and angiogenesis during endochondral bone formation // Nat Med. 1999. Vol. 5, № 6. P. 623-628.

43. Zelzer E. et al. VEGFA is necessary for chondrocyte survival during bone development // Development. 2004. Vol. 131, № 9. P. 2161-2171.

44. Maes C. et al. VEGF-independent cell-autonomous functions of HIF-1a regulating oxygen consumption in fetal cartilage are critical for chondrocyte survival // Journal of Bone and Mineral Research. 2012. Vol. 27, № 3. P. 596-609.

45. Krock B.L., Skuli N., Simon M.C. Hypoxia-Induced Angiogenesis: Good and Evil // Genes Cancer. 2011. Vol. 2, № 12. P. 1117-1133.

46. Maes C. et al. Osteoblast Precursors, but Not Mature Osteoblasts, Move into Developing and Fractured Bones along with Invading Blood Vessels // Dev Cell. 2010. Vol. 19, № 2. P. 329-344.

47. Romeo S.G. et al. Endothelial proteolytic activity and interaction with non-resorbing osteoclasts mediate bone elongation // Nat Cell Biol. 2019. Vol. 21, № 4. P. 430-441.

48. Salhotra A. et al. Mechanisms of bone development and repair // Nat Rev Mol Cell Biol. 2020. Vol. 21, № 11. P. 696-711.

49. Watson E.C., Adams R.H. Biology of Bone: The Vasculature of the Skeletal System // Cold Spring Harb Perspect Med. 2018. Vol. 8, № 7. P. a031559.

50. Yang L. et al. Hypertrophic chondrocytes can become osteoblasts and osteocytes in endochondral bone formation // Proceedings of the National Academy of Sciences. 2014. Vol. 111, № 33. P. 12097-12102.

51. Berendsen A.D., Olsen B.R. Bone development // Bone. 2015. Vol. 80. P. 14-18.

52. Galea G.L. et al. Making and shaping endochondral and intramembranous bones // Developmental Dynamics. 2021. Vol. 250, № 3. P. 414-449.

53. Percival C.J., Richtsmeier J.T. Angiogenesis and intramembranous osteogenesis // Developmental Dynamics. 2013. Vol. 242, № 8. P. 909-922.

54. De Spiegelaere W. et al. Detection of Hypoxia Inducible Factors and Angiogenic Growth Factors during Foetal Endochondral and Intramembranous Ossification // Anat Histol Embryol. 2010. Vol. 39, № 4. P. 376-384.

55. Hu K., Olsen B.R. Osteoblast-derived VEGF regulates osteoblast differentiation and bone formation during bone repair // Journal of Clinical Investigation. 2016. Vol. 126, № 2. P. 509-526.

56. Su W. et al. Angiogenesis stimulated by elevated PDGF-BB in subchondral bone contributes to osteoarthritis development // JCI Insight. 2020. Vol. 5, № 8.

57. Behr B. et al. Fgf-9 is required for angiogenesis and osteogenesis in long bone repair // Proceedings of the National Academy of Sciences. 2010. Vol. 107, № 26. P. 11853-11858.

58. Potente M., Makinen T. Vascular heterogeneity and specialization in development and disease // Nature Reviews Molecular Cell Biology. Nature Publishing Group, 2017. Vol. 18, № 8. P. 477-494.

59. Acar M. et al. Deep imaging of bone marrow shows non-dividing stem cells are mainly perisinusoidal // Nature. 2015. Vol. 526, № 7571. P. 126-130.

60. Lafage-Proust M.-H. et al. Assessment of bone vascularization and its role in bone remodeling // Bonekey Rep. 2015. Vol. 4.

61. Ramasamy S.K. Structure and Functions of Blood Vessels and Vascular Niches in Bone // Stem Cells Int. 2017. Vol. 2017. P. 1-10.

62. Chen M. et al. Skeleton-vasculature chain reaction: a novel insight into the mystery of homeostasis // Bone Res. 2021. Vol. 9, № 1. P. 21.

63. Ramasamy S.K. et al. Blood flow controls bone vascular function and osteogenesis // Nat Commun. 2016. Vol. 7, № 1. P. 13601.

64. Hendriks M., Ramasamy S.K. Blood Vessels and Vascular Niches in Bone Development and Physiological Remodeling // Front Cell Dev Biol. 2020. Vol. 8.

65. Langen U.H. et al. Cell-matrix signals specify bone endothelial cells during developmental osteogenesis // Nat Cell Biol. 2017. Vol. 19, № 3. P. 189-201.

66. Marsell R., Einhorn T.A. The biology of fracture healing // Injury. 2011. Vol. 42, № 6. P. 551-555.

67. Bahney C.S. et al. Cellular biology of fracture healing // Journal of Orthopaedic Research. 2019. Vol. 37, № 1. P. 35-50.

68. Schlundt C. et al. Macrophages in bone fracture healing: Their essential role in endochondral ossification // Bone. 2018. Vol. 106. P. 78-89.

69. Martino M.M. et al. Extracellular matrix-inspired growth factor delivery systems for bone regeneration // Adv Drug Deliv Rev. 2015. Vol. 94. P. 41-52.

70. Loi F. et al. Inflammation, fracture and bone repair // Bone. 2016. Vol. 86. P. 119130.

71. Gerstenfeld L. et al. Impaired Fracture Healing in the Absence of TNF-a Signaling: The Role of TNF-a in Endochondral Cartilage Resorption // Journal of Bone and Mineral Research. 2003. Vol. 18, № 9. P. 1584-1592.

72. Yang X. et al. Callus mineralization and maturation are delayed during fracture healing in interleukin-6 knockout mice // Bone. 2007. Vol. 41, № 6. P. 928-936.

73. Raggatt L.J. et al. Fracture Healing via Periosteal Callus Formation Requires Macrophages for Both Initiation and Progression of Early Endochondral Ossification // Am J Pathol. 2014. Vol. 184, № 12. P. 3192-3204.

74. Riddle R.C. et al. Role of hypoxia-inducible factor-1a in angiogenic-osteogenic coupling // J Mol Med. 2009. Vol. 87, № 6. P. 583-590.

75. Lokmic Z. et al. Hypoxia and Hypoxia Signaling in Tissue Repair and Fibrosis. 2012. P. 139-185.

76. Stefanowski J. et al. Spatial Distribution of Macrophages During Callus Formation and Maturation Reveals Close Crosstalk Between Macrophages and Newly Forming Vessels // Front Immunol. 2019. Vol. 10.

77. Duda G.N. et al. The decisive early phase of bone regeneration // Nat Rev Rheumatol. 2023. Vol. 19, № 2. P. 78-95.

78. Stegen S., van Gastel N., Carmeliet G. Bringing new life to damaged bone: The importance of angiogenesis in bone repair and regeneration // Bone. 2015. Vol. 70. P.19-27.

79. Song H., Park K.-H. Regulation and function of SOX9 during cartilage development and regeneration // Semin Cancer Biol. 2020. Vol. 67. P. 12-23.

80. Dy P. et al. Sox9 Directs Hypertrophic Maturation and Blocks Osteoblast Differentiation of Growth Plate Chondrocytes // Dev Cell. 2012. Vol. 22, № 3. P. 597-609.

81. Bi W. et al. Sox9 is required for cartilage formation // Nat Genet. 1999. Vol. 22, № 1. P. 85-89.

82. Hu D.P. et al. Cartilage to bone transformation during fracture healing is coordinated by the invading vasculature and induction of the core pluripotency genes // Development. 2017. Vol. 144, № 2. P. 221-234.

83. Komori T. Whole Aspect of Runx2 Functions in Skeletal Development // Int J Mol Sci. 2022. Vol. 23, № 10. P. 5776.

84. Komori T. et al. Targeted Disruption of Results in a Complete Lack of Bone Formation owing to Maturational Arrest of Osteoblasts // Cell. 1997. Vol. 89, № 5. P.755-764.

85. Kodama J. et al. The role of hypertrophic chondrocytes in regulation of the cartilage-to-bone transition in fracture healing // Bone Rep. 2022. Vol. 17. P. 101616.

86. Liu Q. et al. Recent Advances of Osterix Transcription Factor in Osteoblast Differentiation and Bone Formation // Front Cell Dev Biol. 2020. Vol. 8.

87. Nakashima K. et al. The Novel Zinc Finger-Containing Transcription Factor Osterix Is Required for Osteoblast Differentiation and Bone Formation // Cell. 2002. Vol. 108, № 1. P. 17-29.

88. Tang W. et al. Transcriptional Regulation of Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) by Osteoblast-specific Transcription Factor Osterix (Osx) in Osteoblasts // Journal of Biological Chemistry. 2012. Vol. 287, № 3. P. 1671-1678.

89. Barrere F., van Blitterswijk C.A., de Groot K. Bone regeneration: molecular and cellular interactions with calcium phosphate ceramics. // Int J Nanomedicine. 2006. Vol. 1, № 3. P. 317-332.

90. Teitelbaum S.L. Osteoclasts: What Do They Do and How Do They Do It? // Am J Pathol. 2007. Vol. 170, № 2. P. 427-435.

91. Stucker S. et al. Bone Angiogenesis and Vascular Niche Remodeling in Stress, Aging, and Diseases // Front Cell Dev Biol. 2020. Vol. 8.

92. Lu C. et al. Effect of age on vascularization during fracture repair // Journal of Orthopaedic Research. 2008. Vol. 26, № 10. P. 1384-1389.

93. Ren Y. et al. Multimodality imaging reveals angiogenic evolution in vivo during calvarial bone defect healing // Angiogenesis. 2023.

94. Liu Y., Olsen B.R. Distinct VEGF Functions During Bone Development and Homeostasis // Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 2014. Vol. 62, № 5. P. 363-368.

95. Xie H. et al. PDGF-BB secreted by preosteoclasts induces angiogenesis during coupling with osteogenesis // Nat Med. 2014. Vol. 20, № 11. P. 1270-1278.

96. Zhuang Y. et al. Small extracellular vesicles derived from hypoxic mesenchymal stem cells promote vascularized bone regeneration through the miR-210-3p/EFNA3/PI3K pathway // Acta Biomater. 2022. Vol. 150. P. 413-426.

97. Wu M., Chen G., Li Y.-P. TGF-ß and BMP signaling in osteoblast, skeletal development, and bone formation, homeostasis and disease // Bone Res. 2016. Vol. 4, № 1. P. 16009.

98. Bonilla-Claudio M. et al. Bmp signaling regulates a dose-dependent transcriptional program to control facial skeletal development // Development. 2012. Vol. 139, № 4. P. 709-719.

99. Shu B. et al. BMP2, but not BMP4, is crucial for chondrocyte proliferation and maturation during endochondral bone development // J Cell Sci. 2011. Vol. 124, № 20. P. 3428-3440.

100. Yu S. et al. BMP2-dependent gene regulatory network analysis reveals Klf4 as a novel transcription factor of osteoblast differentiation // Cell Death Dis. 2021. Vol. 12, № 2. P. 197.

101. Matsubara H. et al. Vascular tissues are a primary source of BMP2 expression during bone formation induced by distraction osteogenesis // Bone. 2012. Vol. 51, № 1. P. 168-180.

102. Lang A. et al. Endothelial SMAD1/5 signaling couples angiogenesis to osteogenesis during long bone growth. // bioRxiv. 2023.

103. Pearson H.B. et al. Effects of Bone Morphogenetic Protein-2 on Neovascularization During Large Bone Defect Regeneration // Tissue Eng Part A. 2019. Vol. 25, № 23-24. P. 1623-1634.

104. Owen-Woods C., Kusumbe A. Fundamentals of bone vasculature: Specialization, interactions and functions // Semin Cell Dev Biol. 2022. Vol. 123. P. 36-47.

105. Del Gaudio F., Liu D., Lendahl U. Notch signalling in healthy and diseased vasculature // Open Biol. 2022. Vol. 12, № 4.

106. Zhou B. et al. Notch signaling pathway: architecture, disease, and therapeutics // Signal Transduct Target Ther. 2022. Vol. 7, № 1. P. 95.

107. Siebel C., Lendahl U. Notch Signaling in Development, Tissue Homeostasis, and Disease // Physiol Rev. 2017. Vol. 97, № 4. P. 1235-1294.

108. Artavanis-Tsakonas S., Rand M.D., Lake R.J. Notch Signaling: Cell Fate Control and Signal Integration in Development // Science (1979). 1999. Vol. 284, № 5415. P.770-776.

109. Sprinzak D., Blacklow S.C. Biophysics of Notch Signaling // Annu Rev Biophys. 2021. Vol. 50, № 1. P. 157-189.

110. Kopan R., Ilagan Ma.X.G. The Canonical Notch Signaling Pathway: Unfolding the Activation Mechanism // Cell. 2009. Vol. 137, № 2. P. 216-233.

111. Zanotti S., Canalis E. Notch Signaling and the Skeleton // Endocr Rev. 2016. Vol. 37, № 3. P. 223-253.

112. Hassed S.J. et al. RBPJ Mutations Identified in Two Families Affected by AdamsOliver Syndrome // The American Journal of Human Genetics. 2012. Vol. 91, № 2. P. 391-395.

113. Remark L.H. et al. Loss of Notch signaling in skeletal stem cells enhances bone formation with aging // Bone Res. 2023. Vol. 11, № 1. P. 50.

114. Xu Y. et al. Notch activation promotes osteoblast mineralization by inhibition of apoptosis // J Cell Physiol. 2018. Vol. 233, № 10. P. 6921-6928.

115. Osathanon T. et al. Jagged1 promotes mineralization in human bone-derived cells // Arch Oral Biol. 2019. Vol. 99. P. 134-140.

116. Hilton M.J. et al. Notch signaling maintains bone marrow mesenchymal progenitors by suppressing osteoblast differentiation // Nat Med. 2008. Vol. 14, № 3. P. 306314.

117. Liu P. et al. Anabolic actions of Notch on mature bone // Proceedings of the National Academy of Sciences. 2016. Vol. 113, № 15.

118. Dishowitz M.I. et al. Notch signaling components are upregulated during both endochondral and intramembranous bone regeneration // Journal of Orthopaedic Research. 2012. Vol. 30, № 2. P. 296-303.

119. Muguruma Y. et al. Maintenance of Bone Homeostasis by DLL1-Mediated Notch Signaling // J Cell Physiol. 2017. Vol. 232, № 9. P. 2569-2580.

120. Canalis E. Notch in skeletal physiology and disease // Osteoporosis International. 2018. Vol. 29, № 12. P. 2611-2621.

121. Yavropoulou M.P., Yovos J.G. The role of notch signaling in bone development and disease // Hormones. 2014. Vol. 13, № 1. P. 24-37.

122. Zieba J.T. et al. Notch Signaling in Skeletal Development, Homeostasis and Pathogenesis // Biomolecules. 2020. Vol. 10, № 2. P. 332.

123. Majewski J. et al. Mutations in NOTCH2 in families with Hajdu-Cheney syndrome // Hum Mutat. 2011. Vol. 32, № 10. P. 1114-1117.

124. Ponio J.B.-D. et al. Biological function of mutant forms of JAGGED1 proteins in Alagille syndrome: inhibitory effect on Notch signaling // Hum Mol Genet. 2007. Vol. 16, № 22. P. 2683-2692.

125. Meester J.A.N. et al. Heterozygous Loss-of-Function Mutations in DLL4 Cause Adams-Oliver Syndrome // The American Journal of Human Genetics. 2015. Vol. 97, № 3. P. 475-482.

126. Stittrich A.-B. et al. Mutations in NOTCH1 Cause Adams-Oliver Syndrome // The American Journal of Human Genetics. 2014. Vol. 95, № 3. P. 275-284.

127. Kostina A. et al. Context-Specific Osteogenic Potential of Mesenchymal Stem Cells // Biomedicines. 2021. Vol. 9, № 6. P. 673.

128. Semenova D. et al. Dose-dependent mechanism of Notch action in promoting osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells // Cell Tissue Res. 2020. Vol. 379, № 1. P. 169-179.

129. Lobov A. et al. Mesenchymal Cells Retain the Specificity of Embryonal Origin During Osteogenic Differentiation // Stem Cells. 2024. Vol. 42, № 1. P. 76-89.

130. Youngstrom D.W., Hankenson K.D. Contextual Regulation of Skeletal Physiology by Notch Signaling // Curr Osteoporos Rep. 2019. Vol. 17, № 4. P. 217-225.

131. Ji Y., Ke Y., Gao S. Intermittent activation of notch signaling promotes bone formation. // Am J Transl Res. 2017. Vol. 9, № 6. P. 2933-2944.

132. Canalis E. et al. Osteoblast Lineage-Specific Effects of Notch Activation in the Skeleton // Endocrinology. 2013. Vol. 154, № 2. P. 623-634.

133. Xu C. et al. Induction of osteogenesis by bone-targeted Notch activation // Elife. 2022. Vol. 11.

134. Grosso A. et al. VEGF dose controls the coupling of angiogenesis and osteogenesis in engineered bone // NPJ Regen Med. 2023. Vol. 8, № 1. P. 15.

135. Novak S. et al. Endothelial to mesenchymal Notch signaling regulates skeletal repair. // JCI Insight. 2024. Vol. 9, № 12.

136. Lerman D.A., Prasad S., Alotti N. Calcific Aortic Valve Disease: Molecular Mechanisms And Therapeutic Approaches // European Cardiology Review. 2015. Vol. 10, № 2. P. 108.

137. Rutkovskiy A. et al. Valve Interstitial Cells: The Key to Understanding the Pathophysiology of Heart Valve Calcification // J Am Heart Assoc. 2017. Vol. 6, № 9.

138. Kraler S. et al. Calcific aortic valve disease: from molecular and cellular mechanisms to medical therapy // Eur Heart J. 2022. Vol. 43, № 7. P. 683-697.

139. Driscoll K., Cruz A.D., Butcher J.T. Inflammatory and Biomechanical Drivers of Endothelial-Interstitial Interactions in Calcific Aortic Valve Disease // Circ Res. 2021. Vol. 128, № 9. P. 1344-1370.

140. Bogdanova M. et al. Interstitial cells in calcified aortic valves have reduced differentiation potential and stem cell-like properties // Sci Rep. 2019. Vol. 9, № 1. P. 12934.

141. Farrar E.J., Huntley G.D., Butcher J. Endothelial-Derived Oxidative Stress Drives Myofibroblasts Activation and Calcification of the Aortic Valve // PLoS One. 2015. Vol. 10, № 4. P. e0123257.

142. Zebhi B., Lazkani M., Bark D. Calcific Aortic Stenosis—A Review on Acquired Mechanisms of the Disease and Treatments // Front Cardiovasc Med. 2021. Vol. 8.

143. Bosse K. et al. Endothelial nitric oxide signaling regulates Notch1 in aortic valve disease // J Mol Cell Cardiol. 2013. Vol. 60. P. 27-35.

144. Majumdar U. et al. Nitric oxide prevents aortic valve calcification by S-nitrosylation of USP9X to activate NOTCH signaling // Sci Adv. 2021. Vol. 7, № 6.

145. Garg V. et al. Mutations in NOTCH1 cause aortic valve disease // Nature. 2005. Vol. 437, № 7056. P. 270-274.

146. Kostina A. et al. Different Notch signaling in cells from calcified bicuspid and tricuspid aortic valves // J Mol Cell Cardiol. 2018. Vol. 114. P. 211-219.

147. Semenova D. et al. Multi-omics of in vitro aortic valve calcification // Front Cardiovasc Med. 2022. Vol. 9.

148. Liu Y.-H. et al. Identification of key genes involved in calcific aortic valve disease based on integrated bioinformatics analysis // Exp Biol Med. 2023. Vol. 248, № 1. P. 52-60.

149. Lobov A.A. et al. Crenigacestat (LY3039478) inhibits osteogenic differentiation of human valve interstitial cells from patients with aortic valve calcification in vitro // Front Cardiovasc Med. 2022. Vol. 9.

150. Kostina A. et al. Human aortic endothelial cells have osteogenic Notch-dependent properties in co-culture with aortic smooth muscle cells // Biochem Biophys Res Commun. 2019. Vol. 514, № 2. P. 462-468.

151. Chang A.C.Y. et al. Notch Initiates the Endothelial-to-Mesenchymal Transition in the Atrioventricular Canal through Autocrine Activation of Soluble Guanylyl Cyclase // Dev Cell. 2011. Vol. 21, № 2. P. 288-300.

152. Wang J. et al. NOTCH1 mitochondria localization during heart development promotes mitochondrial metabolism and the endothelial-to-mesenchymal transition in mice // Nat Commun. 2024. Vol. 15, № 1. P. 9945.

153. Гончаров Н.В. et al. Эндотелий, старение и сосудистые заболевания // Российский физиологический журнал им. И.М.Сеченова. 2024. Vol. 110, №2 11. P. 1846-1874.

154. Souilhol C. et al. Endothelial-mesenchymal transition in atherosclerosis // Cardiovasc Res. 2018. Vol. 114, № 4. P. 565-577.

155. Ma X. et al. Endothelial-to-Mesenchymal Transition in Calcific Aortic Valve Disease. // Acta Cardiol Sin. 2020. Vol. 36, № 3. P. 183-194.

156. Lin Q.-Q. et al. Roles of notch signaling pathway and endothelial-mesenchymal transition in vascular endothelial dysfunction and atherosclerosis. // Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2018. Vol. 22, № 19. P. 6485-6491.

157. Xu K. et al. Cell-Type Transcriptome Atlas of Human Aortic Valves Reveal Cell Heterogeneity and Endothelial to Mesenchymal Transition Involved in Calcific Aortic Valve Disease // Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2020. Vol. 40, № 12. P. 2910-2921.

158. Blaser M.C. et al. Multi-Omics Approaches to Define Calcific Aortic Valve Disease Pathogenesis // Circ Res. 2021. Vol. 128, № 9. P. 1371-1397.

159. Lobov A., Malashicheva A. Osteogenic differentiation: a universal cell program of heterogeneous mesenchymal cells or a similar extracellular matrix mineralizing phenotype? // Biological Communications. 2022. Vol. 67, № 1.

160. Kostina D. et al. Isolation of Human Osteoblast Cells Capable for Mineralization and Synthetizing Bone-Related Proteins In Vitro from Adult Bone // Cells. 2022. Vol. 11, № 21. P. 3356.

161. Kostina A.S. et al. Notch-dependent EMT is attenuated in patients with aortic aneurysm and bicuspid aortic valve // Biochimica et Biophysica Acta (BBA) -Molecular Basis of Disease. 2016. Vol. 1862, № 4. P. 733-740.

162. Malashicheva A. et al. Lentivirus as a tool for lineage-specific gene manipulations // genesis. 2007. Vol. 45, № 7. P. 456-459.

163. Wang S. et al. NAguideR: performing and prioritizing missing value imputations for consistent bottom-up proteomic analyses // Nucleic Acids Res. 2020. Vol. 48, № 14. P. e83-e83.

164. Rohart F. et al. mixOmics: An R package for 'omics feature selection and multiple data integration // PLoS Comput Biol. 2017. Vol. 13, № 11. P. e1005752.

165. Chen H., Boutros P.C. VennDiagram: a package for the generation of highly-customizable Venn and Euler diagrams in R // BMC Bioinformatics. 2011. Vol. 12, № 1. P. 35.

166. Dobin A. et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner // Bioinformatics. 2013. Vol. 29, № 1. P. 15-21.

167. Liao Y., Smyth G.K., Shi W. featureCounts: an efficient general purpose program for assigning sequence reads to genomic features // Bioinformatics. 2014. Vol. 30, № 7. P. 923-930.

168. Love M.I., Huber W., Anders S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2 // Genome Biol. 2014. Vol. 15, № 12. P. 550.

169. Wickham H. ggplot2. Cham: Springer International Publishing, 2016.

170. Li T. et al. The Mechanism and Role of ADAMTS Protein Family in Osteoarthritis // Biomolecules. 2022. Vol. 12, № 7. P. 959.

171. Medici D. Endothelial-Mesenchymal Transition in Regenerative Medicine // Stem Cells Int. 2016. Vol. 2016, № 1.

172. Docshin P., Bairqdar A., Malashicheva A. Interplay between BMP2 and Notch signaling in endothelial-mesenchymal transition: implications for cardiac fibrosis // Stem Cell Investig. 2023. Vol. 10. P. 18-18.

173. Kostina A. et al. Human aortic endothelial cells have osteogenic Notch-dependent properties in co-culture with aortic smooth muscle cells // Biochem Biophys Res Commun. 2019. Vol. 514, № 2. P. 462-468.

174. Kostina A. et al. Context-Specific Osteogenic Potential of Mesenchymal Stem Cells // Biomedicines. 2021. Vol. 9, № 6. P. 673.

175. Novak S. et al. Endothelial to mesenchymal Notch signaling regulates skeletal repair // JCI Insight. 2024. Vol. 9, № 12.

176. Lobov A. et al. Similar, but not the same: multiomics comparison of human valve interstitial cells and osteoblast osteogenic differentiation expanded with an estimation of data-dependent and data-independent PASEF proteomics // Gigascience. 2025. Vol. 14.

177. Chen W. et al. Multilayered coating of titanium implants promotes coupled osteogenesis and angiogenesis in vitro and in vivo // Acta Biomater. 2018. Vol. 74. P. 489-504.

178. He Y. et al. Fabrication of a bio-instructive scaffold conferred with a favorable microenvironment allowing for superior implant osseointegration and accelerated in situ vascularized bone regeneration via type H vessel formation // Bioact Mater. 2022. Vol. 9. P. 491-507.

179. Rao R.R. et al. Matrix composition regulates three-dimensional network formation by endothelial cells and mesenchymal stem cells in collagen/fibrin materials // Angiogenesis. 2012. Vol. 15, № 2. P. 253-264.

180. Zhang L. et al. Prevascularization of natural nanofibrous extracellular matrix for engineering completely biological three-dimensional prevascularized tissues for diverse applications // J Tissue Eng Regen Med. 2018. Vol. 12, № 3.

181. Lin X. et al. The crosstalk between endothelial cells and vascular smooth muscle cells aggravates high phosphorus-induced arterial calcification // Cell Death Dis. 2022. Vol. 13, № 7. P. 650.

182. Simunovic F. et al. Increased extracellular matrix and proangiogenic factor transcription in endothelial cells after cocultivation with primary human osteoblasts. // J Cell Biochem. United States, 2013. Vol. 114, № 7. P. 1584-1594.

183. Kocherova I. et al. Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) co-culture with osteogenic cells: From molecular communication to engineering prevascularised bone grafts // J Clin Med. 2019. Vol. 8, № 10.

184. Villars F. et al. Effect of HUVEC on human osteoprogenitor cell differentiation needs heterotypic gap junction communication // American Journal of Physiology-Cell Physiology. 2002. Vol. 282, № 4. P. C775-C785.

185. Villars F. et al. Effect of human endothelial cells on Human Bone Marrow Stromal Cell phenotype: Role of VEGF? // J Cell Biochem. 2000. Vol. 79, № 4. P. 672-685.

186. Khvorova I.A. et al. Osteogenic Differentiation In Vitro of Human Osteoblasts Is Associated with Only Slight Shift in Their Proteomics Profile // Cell tissue biol. 2022. Vol. 16, № 6. P. 540-546.

187. Ben Shoham A. et al. Deposition of collagen type I onto skeletal endothelium reveals a new role for blood vessels in regulating bone morphology // Development. 2016.

188. Piera-Velazquez S., Jimenez S.A. Endothelial to Mesenchymal Transition: Role in Physiology and in the Pathogenesis of Human Diseases // Physiol Rev. 2019. Vol. 99, № 2. P. 1281-1324.

189. Fan L. et al. Beyond VICs: Shedding light on the overlooked VECs in calcific aortic valve disease // Biomedicine & Pharmacotherapy. 2024. Vol. 178. P. 117143.

190. Hall I.F. et al. Endothelial to mesenchymal transition: at the axis of cardiovascular health and disease // Cardiovasc Res. 2024. Vol. 120, № 3. P. 223-236.

191. Lin M.I. et al. Angiopoietin-like proteins stimulate HSPC development through interaction with notch receptor signaling // Elife. 2015. Vol. 4.

192. Denzer L. et al. The role of PLVAP in endothelial cells // Cell Tissue Res. 2023. Vol. 392, № 2. P. 393-412.

193. Swaminathan B. et al. Endothelial Notch signaling directly regulates the small GTPase RND1 to facilitate Notch suppression of endothelial migration // Sci Rep. 2022. Vol. 12, № 1. P. 1655.

194. Lilly B., Kennard S. Differential gene expression in a coculture model of angiogenesis reveals modulation of select pathways and a role for Notch signaling // Physiol Genomics. 2009. Vol. 36, № 2. P. 69-78.

195. Gorsi B. et al. The heparan sulfate editing enzyme Sulfl plays a novel role in zebrafish VegfA mediated arterial venous identity // Angiogenesis. 2014. Vol. 17, № 1. P. 77-91.

196. Zhao N., Liu H., Lilly B. Reciprocal Regulation of Syndecan-2 and Notch Signaling in Vascular Smooth Muscle Cells // Journal of Biological Chemistry. 2012. Vol. 287, № 20. P. 16111-16120.

197. Meyers J.R. et al. Sulf1 modulates BMP signaling and is required for somite morphogenesis and development of the horizontal myoseptum // Dev Biol. 2013. Vol. 378, № 2. P. 107-121.

198. Ciumas M. et al. Bone Morphogenetic Proteins Protect Pulmonary Microvascular Endothelial Cells From Apoptosis by Upregulating a-B-Crystallin // Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2013. Vol. 33, № 11. P. 2577-2584.

199. Tian B. et al. CRYAB suppresses ferroptosis and promotes osteogenic differentiation of human bone marrow stem cells via binding and stabilizing FTH1 // Aging. 2024. Vol. 16, № 10. P. 8965-8979.

200. Zhu B. et al. CRYAB promotes osteogenic differentiation of human bone marrow stem cells via stabilizing в-catenin and promoting the Wnt signalling // Cell Prolif. 2020. Vol. 53, № 1.

201. Wang Z. et al. Fibroblast growth factor 2 promotes osteo/odontogenic differentiation in stem cells from the apical papilla by inhibiting PI3K/AKT pathway // Sci Rep. 2024. Vol. 14, № 1. P. 19354.

202. Fei Y. et al. Fibroblast Growth Factor 2 Stimulation of Osteoblast Differentiation and Bone Formation Is Mediated by Modulation of the Wnt Signaling Pathway // Journal of Biological Chemistry. 2011. Vol. 286, № 47. P. 40575-40583.

203. Byun M.R. et al. FGF2 stimulates osteogenic differentiation through ERK induced TAZ expression // Bone. 2014. Vol. 58. P. 72-80.

204. Pieles O., Reck A., Morsczeck C. High endogenous expression of parathyroid hormone-related protein (PTHrP) supports osteogenic differentiation in human dental follicle cells // Histochem Cell Biol. 2020. Vol. 154, № 4. P. 397-403.

205. Vadana M. et al. Parathyroid Hormone Induces Human Valvular Endothelial Cells Dysfunction That Impacts the Osteogenic Phenotype of Valvular Interstitial Cells // Int J Mol Sci. 2022. Vol. 23, № 7. P. 3776.

206. Rashid G. et al. Parathyroid hormone stimulates endothelial expression of atherosclerotic parameters through protein kinase pathways // American Journal of Physiology-Renal Physiology. 2007. Vol. 292, № 4. P. F1215-F1218.

207. Hyun J. et al. Notch1 promotes ordered revascularization through Semaphorin 3g modulation of downstream vascular patterning signalling factors // J Physiol. 2022. Vol. 600, № 3. P. 509-530.

208. Wagley Y. et al. Canonical Notch signaling is required for bone morphogenetic protein-mediated human osteoblast differentiation // Stem Cells. 2020. Vol. 38, № 10. P. 1332-1347.

209. Cao J. et al. Notch signaling pathway promotes osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells by enhancing BMP9/Smad signaling // Int J Mol Med. 2017. Vol. 40, № 2. P. 378-388.

210. Yu G. et al. Multiple pathways coordinating reprogramming of endothelial cells into osteoblasts by BMP4 // iScience. 2021. Vol. 24, № 4. P. 102388.

211. Cen X. et al. miR-20a-5p contributes to osteogenic differentiation of human dental pulp stem cells by regulating BAMBI and activating the phosphorylation of Smad5 and p38 // Stem Cell Res Ther. 2021. Vol. 12, № 1. P. 421.

212. Wu J. et al. Arginine methylation of R81 in Smad6 confines BMP-induced Smad1 signaling // Journal of Biological Chemistry. 2021. Vol. 296. P. 100496.

213. Yano M. et al. Smad7 inhibits differentiation and mineralization of mouse osteoblastic cells // Endocr J. 2012. Vol. 59, № 8. P. 653-662.

214. Xiao F. et al. BMPER Enhances Bone Formation by Promoting the Osteogenesis-Angiogenesis Coupling Process in Mesenchymal Stem Cells // Cellular Physiology and Biochemistry. 2018. Vol. 45, № 5. P. 1927-1939.

215. Zhang J. et al. Matrix Gla Protein Promotes the Bone Formation by Up-Regulating Wnt/ß-Catenin Signaling Pathway // Front Endocrinol (Lausanne). 2019. Vol. 10.

216. Kim S. et al. Stat1 functions as a cytoplasmic attenuator of Runx2 in the transcriptional program of osteoblast differentiation // Genes Dev. 2003. Vol. 17, № 16. P. 1979-1991.

217. Tajima K. et al. Inhibition of STAT1 accelerates bone fracture healing // Journal of Orthopaedic Research. 2010. Vol. 28, № 7. P. 937-941.

218. Zhang Y. et al. SOCS1, the feedback regulator of STAT1/3, inhibits the osteogenic differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells // Gene. 2022. Vol. 821. P. 146190.

219. Takayanagi H. et al. Stat1-mediated cytoplasmic attenuation in osteoimmunology // J Cell Biochem. 2005. Vol. 94, № 2. P. 232-240.

220. H. M. Nascimento M. et al. How can nitric oxide help osteogenesis? // AIMS Mol Sci. 2020. Vol. 7, № 1. P. 29-48.

221. Cooke J.P., Losordo D.W. Nitric Oxide and Angiogenesis // Circulation. 2002. Vol. 105, № 18. P. 2133-2135.

222. Won J. et al. Guided Bone Regeneration with a Nitric-Oxide Releasing Polymer Inducing Angiogenesis and Osteogenesis in Critical-Sized Bone Defects // Macromol Biosci. 2022. Vol. 22, № 10.

223. Veeriah V. et al. Interleukin-1 ß, lipocalin 2 and nitric oxide synthase 2 are mechano-responsive mediators of mouse and human endothelial cell-osteoblast crosstalk // Sci Rep. 2016. Vol. 6, № 1. P. 29880.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает глубочайшую признательность и искреннюю благодарность своему научному руководителю, Анне Борисовне Малашичевой, за ее ценные наставления и конструктивную критику, оказанное доверие и помощь в написании диссертационной работы, а также за всестороннюю поддержку и наставничество на протяжении всего периода работы в лаборатории.

Автор благодарит всех сотрудников лаборатории регенеративной биомедицины за помощь при выполнении диссертационной работы. Полину Кучур, Арсения Лобова и Ирину Хворову за помощь в обработке биоинформатических данных. Надежду Боярскую за помощь в работе с клеточными культурами аортального клапана. Любовь Басович и Ксению Азаркину за помощь в работе с клеточными сокультурами и лентивирусными векторами. Дарью Смирнову и Анну Беляеву, за поддержку, отзывчивость и всестороннюю помощь в выполнении диссертационной работы.

Автор благодарит сотрудников НМИЦ травматологии и ортопедии им. Р.Р. Вредена Виталию Владимировичу Карелкину и Светлане Анатольевне Божковой; сотрудника НМИЦ им. В.А. Алмазова Владимира Евгеньевича Успенского и сотрудника СПб ГБУЗ «Городская многопрофильная больница №2» Михаила Александровича Атюкова за предоставленные материалы тканей человека.

Автор выражает благодарность всем соавторам публикаций за предоставленные материалы, помощь в работе и плодотворное сотрудничество.

Отдельную благодарность автор выражает Алине Чабиной и Юлии Хорольской за ценные советы и всестороннюю поддержку.

В заключении автор хотел бы выразить искреннюю благодарность своей семье за оказанную помощь, неизменную поддержку и веру, которые помогли ему не опустить руки в трудные минуты.