Влияние ингибитора системы секреции III типа на развитие экспериментальной инфекции, вызванной Chlamydia trachomatis тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.03, кандидат наук Кост, Елена Андреевна

• Кост, Елена Андреевна
• кандидат наук
• 2014

Оглавление диссертации кандидат наук Кост, Елена Андреевна

Оглавление

Введение

Глава 1. Обзор Литературы

1.1 Характеристика семейства Chlamydiaceae

1.2 Патогенные для человека хламидии

1.3 Жизненный цикл Chlamydia trachomatis

1.4 Персистирующие формы Chlamydia trachomatis

1.5 Системы секреции бактерий

1.6 Система секреции III типа (ССТТ): строение и функции

1.7 Специфические ингибиторы ССТТ

Глава 2. Материалы и Методы

2.1 Материалы

2.2. Методы

2.2.1 Методы оценки токсичности препаратов для эукариотических клеток

2.2.2 Культуральный метод

2.2.3 Иммуноцитохимическая детекция хламидии в монослое клеток

2.2.4 Иммуноцитохимическая детекция белков-эффекторов ССТТхламидий в монослое клеток

2.2.5 Автоматизированный метод учета изображений для количественной оценки показателей внутриклеточного размножения C.trachomatis

2.2.6 Оценка действия ингибитора на представителей нормальной микрофлоры человека

2.2.7 Электронно-микроскопическое исследование образцов

2.2.8 Выделение тотальной РНК из культуры клеток

2.2.9 Реакция обратной транскрипции

2.2.10 ПЦР-РВ для анализа экспрессии генов Chlamydia trachomatis

2.3 Дизайн исследования

Глава 3. Результаты

3.1 Характеристика нормального жизненного цикла C.trachomatis в процессе взаимодействия с культурой клеток фибробластов McCoy

3.1.1 Основные этапы жизненного цикла

3.1.2 Особенности ультраструктурной организации форм C.trachomatis

на стадии их развития внутри фагосомы

3.1.3 Изучение морфологических особенностей клеточного пласта в условиях инфицирования C.trachomatis

3.2 Характеристика препарата

3.2.1 Отбор и синтез ингибитора ССТТ

3.2.2 Изучение токсичности ингибитора для эукариотических клеток

3.3 Характеристика биологического действия ингибитора системы секреции III типа (ССТТ) в условиях in vitro

3.3.1 Выбор эффективной концентрации ингибитора ССТТ, подавляющей внутриклеточное размножение C.trachomatis

I «и I j « I t« t t i V f-4

I ' > '' 11 I

'

3.3.2 Ультраструктурное изучение действия ингибитора ССТТ на внутриклеточный

цикл СЛгасНотайБ

3.3.3 Анализ специфической активности соединения в отношении системы секреции III типа

3.3.3.1 Анализ влияния ингибитора СЬ-55 на локализацию белка 14-З-Зр эукариотической клетки

3.3.3.2 Оценка действия соединения на локализацию эффекторного белка 1псА в клетках

3.4 Оценка эффективности действия препарата СЬ-55 на СЛгаскотайъ на разных стадиях ее жизненного цикла

3.4.1 Воздействие препарата СЬ-55 на стадию адгезии и интернализации хламидий

3.4.2 Воздействие СЬ-55 на внутриклеточные этапы развития СЛгаскотайв

3.5 Нарушение структуры ССТТ под воздействием ингибитора

3.6 Изучение морфологических особенностей клеточного пласта в условиях инфицирования СЛгаскотайъ и действия СЬ-55

3.7 Действие СЬ-55 на персистентную инфекцию

3.7.1 Получение персистентных форм СЛгасИотаНв экспериментальной модели

3.7.2 Изучение активности ССТТ у персистирующих форм

3.7.2.1. Анализ локализации белка 1псС при персистентной инфекции

3.7.2.2 Анализ локализации белка 1псА при персистентной инфекции

3.7.3 Действие 55 на персистентную инфекцию

3.7.4 Влияние СЬ-55 на процесс реверсии

3.8 Влияние ингибитора ССТТ на экспрессию генов СЛгаскотайъ

3.8.1 Действие СЬ-55 на экспрессию генов при внесении на разных стадиях жизненного цикла

3.8.2 Уровень экспрессии генов в условиях индукции персистенции с помощью пенициллина и добавления соединения 55

3.9 Оценка действия ингибитора на представителей аутохтонной микрофлоры человека

Глава 4. Обсуждение результатов

4.1. Собственные данные об изменении жизненного цикла СЛгасЪотайъ под действием соединения

4.2. Специфичность действия

4.3 Персистентная инфекция

4.4.Изменение экспрессии генов под действием СЬ-55

4.5 Изменение экспрессии генов под воздействием СЬ-55 у персистентных форм

Выводы

Список литературы

Список сокращений

ВОЗ - всемирная организация здравоохранения

ССТТ - система секреции третьего типа

ЛПС - липополисахарид

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ЭТ - элементарное тело

РТ - ретикулярное тело

МОМР - major outer membrane protein - главный белок наружной мембраны

ПЦР - полимеразная цепная реакция

СС - система секреции

АТФ - аденозинтрифосфат

АГ - аппарат Гольджи

РНК - рибонуклеиновая кислота

ФСБ - фосфатно-солевой буфер

МОИ - множественность инфекции

ФИТЦ - флюоресцеинизотиоцианат

ТРИТЦ - тетраметилродаминизотиоцианат

МУК - методическое указание

ТЭМ - трансмиссионная электронная микроскопия

СЭМ - сканирующая электронная микроскопия

ЦПМ - цитоплазматическая мембрана

ПП - периплазма

ДМФА - диметилформамид

ДМСО - диметилсульфоксид

CCso - 50% Cytotoxic Concentration - 50% Цитотоксическая концентрация ч.п.и - часов после инфицирования ж.ц. - жизненный цикл

Inc - inclusion membrane protein - белки мембраны включения

КС - клеточная стенка

КОЕ - колониеобразуюшая единица

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Влияние ингибитора системы секреции III типа на развитие экспериментальной инфекции, вызванной Chlamydia trachomatis»

Введение

Хламидии относятся к грамотрнцательным бактериям со сложным жизненным циклом и являются облигатными внутриклеточными паразитами. В семействе Chlamydiaceae, возбудителями заболеваний человека являются - Chlamydia trachomatis, Chlamydophila pneumoniae, и Chlamydophila psittaci [41].

В структуре бактериальных инфекционных заболеваний, передающихся половым путем (ИППП), хламидийная инфекция, вызываемая С. trachomatis, занимает первое место (приблизительно 100 млн новых случаев в год), при стабильной тенденции к увеличению числа вновь инфицированных (WHO CISID). Несвоевременная диагностика острых случаев урогенитального хламидиоза и, соответственно, отсутствие специфического лечения приводит к хронизации инфекционного процесса. Хронические урогенитальные хламидиозы рассматриваются как этиологический фактор синдрома Рейтера, воспалительных заболеваний органов малого таза у женщин, простатитов, стриктуры уретры, орхоэпидемимитов у мужчин, что может приводить к развитию женского и мужского бесплодия, и являться фактором риска в развитии реактивных артритов, патологии беременности [35]. Помимо этого системное воспаление может приводить к развитию ожирения и диабета II типа. В настоящее время существующие методы профилактики и лечения урогенитальных хламидиозов не являются оптимальными. Применяемые для лечения этой инфекции антибиотики, как правило, не предотвращают развитие хронического инфекционного процесса и неэффективны при лечении последнего [30].

В связи с этим актуальной задачей является поиск новых препаратов, направленных на эрадикацию возбудителей хламидиозов.

В последнее время для разработки антибактериальных препаратов нового поколения применяется технология мишень-направленного поиска лекарственных средств [4],[66]. Эта технология включает в себя следующие этапы:

- выбор в качестве мишеней для действия ингибиторов бактериальных белковых молекул или структур, ответственных за реализацию вирулентных свойств микроорганизма, с последующим поиском специфических ингибиторов с помощью специализированных компьютерных программ;

применение методов органического синтеза для получения активных веществ или использование природных соединений;

- экспериментальное тестирование биологической активности в отношении возбудителя инфекционного процесса в модельных системах in vitro и in vivo;

- определение безопасности применения новых препаратов.

Одним из ключевых механизмов, определяющих развитие инфекционного процесса, является транслокация белковых факторов патогенности непосредственно в эукариотические клетки организма-хозяина. Система, обеспечивающая транспорт бактериальных белков в эукариотическую клетку посредством «молекулярного шприца», получила название система секреции III типа (ССТТ) [1] . «Молекулярный шприц» формируется только у патогенных бактерий, с различными типами паразитизма [18]. По данным ряда авторов ССТТ реализует комплекс процессов, подавляющих защитные механизмы эукариотических клеток по отношению к хламидиям, обеспечивая им возможность внутриклеточного размножения [48]

В настоящее время известно несколько ингибиторов ССТТ, относящихся к различным классам низкомолекулярных соединений, которые были отобраны методами высокопроизводительного скрининга библиотек химических соединений [101], [95]. Общими недостатком этих соединений являются: плохая растворимость в органических растворителях и/или воде; токсичность в отношении клеточных культур млекопитающих (гибель до 60% клеток в присутствии специфической ингибирующей концентрации в 50мкМ). Наличие столь существенных недостатков ограничивает возможности их дальнейшей разработки для использования в качестве антибактериальных препаратов.

На основе технологии мишень-ориентированного поиска новых антихламидийных препаратов, разработанной в лаборатории хламидиозов ФГБУ «НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи» Минздрава России, были получены новые ингибиторы ССТТ хламидий, относящиеся к классу тиогидразидов оксаминовых кислот. В предварительных исследованиях была выявлена ингибирующая активность в отношении хламидий. У полученных ингибиторов ССТТ имеется ряд преимуществ по сравнению с ранее синтезированными соединениями:

- минимальное повреждающее действие на эукариотические клетки в условиях in vitro;

- хорошая растворимость в воде и органических растворителях;

- высокая стабильность.

Совокупность вышеперечисленных свойств полученных препаратов ингибиторов ССТТ хламидий определила целесообразность их дальнейшего детального изучения в условиях экспериментальной хламидийной инфекции.

В связи с вышеизложенным, цель настоящего исследования - изучить влияние нового ингибитора системы секреции III типа на развитие экспериментальной инфекции, вызванной С trachomatis в условиях in vitro.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи: 1. Изучить действие нового низкомолекулярного ингибитора системы секреции III типа на разные этапы жизненного цикла C.trachomatis в условиях in vitro.

2. Оценить влияние ингибитора на субмикроскопическую организацию элементарных, ретикулярных телец и персистирующих форм хламидий.

3. Охарактеризовать специфичность подавления ингибитором функциональной активности ССТТ С. trachomatis.

4. Провести анализ экспрессии генов, кодирующих структурные и эффекторные белки ССТТ C.trachomatis, при продуктивной и персистентной инфекции.

5. Изучить действие ингибитора ССТТ на жизнеспособность эукариотических клеток и некоторых представителей нормальной микрофлоры человека.

Научная новизна

Для представителя нового класса ингибиторов ССТТ, низкомолекулярного соединения, полученного на основе тиодиазинонов, впервые получена детальная микробиологическая, морфологическая и молекулярно-биологическая характеристика действия ингибитора на развитие C.trachomatis в культуре клеток. Впервые получены характеристики зависимого от дозы препарата ингибирования внутриклеточного размножения возбудителя и показана его эффективность в отношении блокирования формирования инфекционных форм патогена. Показана специфичность действия соединения на транслокацию эффекторных белков хламидий и экспрессию генов, кодирующих структурные белки ССТТ.

Впервые продемонстрирована роль ССТТ хламидий на этапе первичного взаимодействия с клеткой - мишенью, обеспечивая проникновение хламидий в клетку. Показано, что на внутриклеточной стадии развития хламидий эффекторные белки ССТТ участвуют в трансформации мембраны фагосомы, в регуляции роста, деления и дифференциации в инфекционные элементарные тельца

Впервые показано, что при персистенции экспрессируются гены ССТТ, что указывает на участие этого секреторного аппарата в обеспечении жизнедеятельности персистирующих форм. Действие ингибитора приводило к снижению активности экспрессии генов, кодирующих структурные белки ССТТ при отсутствии действия на консервативные гены, что находится в полном соответствии с механизмом действия ингибитора. На модели персистентной инфекции было впервые продемонстрировано, что ингибиторы ССТТ вызывают дезорганизацию персистирующих форм и блокируют процесс их реверсии в типичные инфекционные формы, что, в конечном счете, прекращает развитие инфекционного процесса при его хроническом течении.

Практическая значимость В рамках выполнения научной тематики ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, направленной на разработку новых антибактериальных препаратов,

проведено изучение механизма действия и безопасности нового ингибитора ССТТ хламидий. Результаты проведенного исследования являются основой для разработки лекарственного препарата для лечения острых и хронических форм урогенитальных хламидиозов. Антихламидийное лекарственное средство на основе разрабатываемого ингибитора ССТТ будет иметь существенные преимущества по сравнению с применяемыми для терапии урогенитального хламидиоза антибиотиками. Это обусловлено тем, что ингибитор нетоксичен в отношении эукариотических клеток, не обладает повреждающим действием на бактерии нормальной микрофлоры человека и эффективен в отношении персистирующих форм хламидий.

Результаты диссертационной работы Кост Е.А. в части разработки метода автоматизированного исследования препаратов культур клеток, инфицированных хламидиями, внедрены в практику работы клинико-диагностической лаборатории ГБУЗ ГКБ им. С.П. Боткина Департамента здравоохранения г.Москвы, а так же в учебный процесс кафедры Биомедицинских технических систем МГТУ им. Н.Э. Баумана (имеются акты о внедрении).

Глава 1. Обзор Литературы 1.1 Характеристика семейства Chlamydiaceae

Считается, что первыми исследователями хламидий, как возбудителя трахомы, были L. Halbersta и S. Prowazek в 1907, которые предложили первое название семейства Chlamydozoa (от греч. chlamys - мантия) для обозначения матрикса вокруг элементарных телец, наблюдаемых при окраске по Гимзе. Долгое время хламидии относили к вирусам, из-за их небольших размеров и неспособности поддерживать рост в искусственных питательных средах. Позже, в 1934 г., Bedson Meyer установил сходство в жизненных циклах возбудителей трахомы и пситтакоза. Таким образом, в семействе появился новый вид, который первоначально получил название Bedsonia, а впоследствии был переименован в Chlamydia psittaci. Название рода Chlamydia было присвоено в 1945 г. авторами Jones, Rake и Stearns.

В 1968 г. было предложено различать два вида в одном роде, а именно: С. trachomatis и C.psittaci. Согласно фенотипическим признакам, положенным в основу классификационного деления, разделение на штаммы Chlamydia trachomatis было обосновано их различной способностью накапливать гликоген, который хорошо виден во включениях при окрашивании йодом, а также чувствительностью к сульфадиазину [39].

Несколько позже, благодаря развитию новых подходов, в частности технологии ДНК-ДНК гибридизации, были получены данные, которые параллельно с результатами серологических и микробиологических наблюдений позволили идентифицировать новые виды - С. pneumoniae и С. ресогит.

В последнее время данные, полученные при изучении генома хламидий с помощью методов рестрикционного генетического картирования, молекулярной гибридизации и секвенирования, были существенно дополнены результатами филогенетического анализа первичной структуры генов 16S и 23 S рРНК различных представителей порядка Chlamydiales. Данные геносистематики послужили основой для изменения номенклатуры и таксономии хламидий и родственных им микроорганизмов, описанных сравнительно недавно.

На основании выраженной гомологии генов рРНК ранее неклассифицированные микроорганизмы, характеризующиеся сходным с хламидиями циклом развития, были выделены в три дополнительных семейства: Parachlamydiaceae, Simkaniaceae и Waddliaceae в составе порядка Chlamydiales.

Филогенетический анализ рибосомальных генов позволил также выделить 9 отдельных групп на уровне видов в семействе Chlamydiaceae. Наличие 9 видов в семействе

подтверждается данными о различии их культуральных, биохимических и антигенных свойств, способностью вызывать специфические заболевания у строго определенного для каждого вида круга хозяев, а также данными гибридизации и рестрикционного анализа генома [41]. Современная таксономия порядка СЫатусНЫея представлена в таблице 1.

Таблица 1. Классификация порядка Chlamydiales [41]

Семейство Chlamydiaceae Семейство Parachlamydiaceae Семейство Simkaniaceae Семейство Waddliaceae

Род Chlamydia Род Chlamydophila Род Parachlamydia Род Simkania Род Waddia

С. trachomatis C.pneumonia P.acanthamoebae S.negevensis W.chondrophilia

С. suis C.pecorum

C.muridarum C.psittaci

C.caviae

C.felis

Семейство Chlamydiaceae относят к 9 группе в классификации Берджи, включающей в себя неспорообразующие обязательные внутриклеточные паразитические микроорганизмы [20]. Представители данного семейства представляют собой грамотрицательные бактерии. Они являются облигатными внутриклеточными паразитами, не способны синтезировать энергетические субстраты и размножаются только в живых клетках эукариотического организма [17], [10].

Строение клеточной стенки хламидий несколько отличается от такового у подавляющего большинства грамотрицательных бактерий. Морфологически клеточная стенка представляет собой наружную мембрану, которая связана с помощью липопротеинов с периплазмой, прилежащей к цитоплазматической мембране. Внутренний слой наружной мембраны представлен фосфолипидами, в наружном слое помимо фосфолипидов присутствуют липополисахариды (ЛПС) [5]. Хламидии имеют родо-, видо-и типоспецифические антигены. Несмотря на наличие множества специфических хламидийных антигенов, только некоторые из них используются для диагностики и играют ключевую роль в патогенезе инфекционного процесса.

Липополисахарид — родоспецифический антиген клеточной стенки хламидий. ЛПС, как антигенная структура, имеется у всех членов рода Chlamydia. ЛПС состоит из глюкозамина, длинной цепи жирных кислот, 3 -деокси-Б-манно-октулоновой кислоты

(КДО) и фосфата. Антитела против ЛПС хламидий дают перекрестную реакцию с ЛПС энтеробактерий [33].

В хламидийной клеточной стенке отсутствует слой пептидогликана. Структурную прочность клеточной стенке придают дисульфидные мостики связывания внутри белковых молекул, богатых цистеином [3].

К наиболее значимым белкам наружной мембраны хламидий относят белки МОМР, ОМР-2 и ОМР-3.

Главный белок наружной мембраны (МОМР-ОМР1) имеет молекулярную массу приблизительно 40 кДа. МОМР найден во всех изученных видах хламидий, содержит родо-, видо-, типо- и сероварспецифические антигенные детерминанты. Антитела против МОМР нейтрализуют инфекционную способность элементарных тел (ЭТ) in vivo. МОМР С.trachomatis наиболее хорошо изучен, т.к. представляет потенциальный интерес в качестве вакцины. Существуют данные, что антитела, полученные против МОМР, могут нейтрализовать инфицирование in vitro и in vivo [98].

Белок ОМР2 — второй из наиболее представленных белков наружной мембраны с молекулярной массой около 60 кДа. Ген, кодирующий данный белок у С.trachomatis L2 состоит из 1641 пар оснований, которые кодируют 547 аминокислот [78].

Белок ОМРЗ имеет молекулярную массу около 15 кДа. Анализ этого белка из С.trachomatis показывает, что он имеет сероварспецифические эпитопы. Антитела, полученные против ОМРЗ, не реагируют с интактными ЭТ. По-видимому, данные специфические эпитопы не доступны на поверхности хламидийной клетки [98].

ДНК хламидий представлена двуцепочечной, кольцевой молекулой. Линейные размеры хромосом ДНК варьируют от 600 до 1440 тысяч пар оснований. Методом электрофореза в пульсирующем поле были определены размеры больших частей ДНК. Стоит отметить, что молекула ДНК разных видов хламидий различна по G+C составу. Эксперименты по гибридизации ДНК показали, что существует сильная гомология (94100%) между штаммами каждого хламидийного вида. Плазмиды были обнаружены у 2 видов хламидий С.trachomatis и у некоторых штаммов С. psittaci. При изучении не было обнаружено плазмид среди выявленных штаммов С. pneumoniae. ДНК описанных плазмид представляет менее 1% общей хламидийной ДНК [41]. К настоящему времени секвенированы полные геномы всех видов представителей семейства Chlamydiaceae.

1.2 Патогенные для человека хламидии

При инфицировании организма человека хламидии проникают внутрь клеток, где происходит их развитие и размножение, что в итоге приводит к гибели зараженных клеток, приводя к развитию местных воспалительных реакций. Разные представители хламидий имеют тропизм к разным тканям организма. Это может быть эпителий респираторного или урогенитального тракта, конъюнктива глаза, эндотелиальные клетки, моноциты/макрофаги. Входные ворота инфекции определяют специфичность клинической картины. При гематогенном или лимфогенном распространении возбудителей в организме больного инфекционный процесс приобретает генеразизованный характер.

Род Chlamydophila составляют виды С. psittaci, С. pneumoniae и С. ресогит, а также Chlamydophila abortus, Chlamydophila caviae и Chlamydophila felis, которые выделены в самостоятельные виды из Chlamydia psittaci.

Chlamydophila pneumoniae (прежнее название — Chlamydia pneumoniae) рассматривается, в основном, как возбудитель респираторных инфекций. Этот вид имеет три биовара: TWAR, название которого произошло от слияния двух первых букв в обозначении штаммов, выделенных от людей — TW 183 и AR-39, коала и конский, названия которых связаны с источником выделения штаммов. Штаммы TWAR, в основном, являются возбудителями заболеваний респираторного тракта у человека, вызывая преимущественно острые и хронические бронхиты и пневмонии. В последнее время накапливается все больше данных, свидетельствующих о возможной взаимосвязи

Chlamydophila psittaci (прежнее название — Chlamydia psittaci). Раньше вид С. psittaci разделяли на 4 группы возбудителей, которые существенно отличались как генетически, так и фенотипически, вызывая различные заболевания у человека и животных. В новой классификации Chlamydophila psittaci включает штаммы, для которых основными хозяевами являются птицы. Все эти штаммы могут передаваться человеку, вызывая пситтакоз. С. psittaci включает 8 сероваров, многие из которых могут паразитировать у нескольких видов птиц [97].

Наиболее распространённым представителем в популяции человека является С.trachomatis. Различные штаммы C.trachomatis способны вызывать трахому, урогенитальные заболевания, некоторые формы артрита, конъюнктивит и пневмонию у новорожденных. Восемнадцать сероваров C.trachomatis объединены в два биовара:

вызывающие трахому (серовары А-К, Ва, Da и 1а, урогенитальные инфекции) и венерическую лимфогранулему (LGW серовары LI, L2, L2a и L3) [7].

Учитывая особую значимость С. trachomatis в инфекционной патологии, этот вид хламидий был выбран для данной работы.

Жизненный цикл С.trachomatis, как и других представителей семейства, является двухфазным. Большая его часть протекает внутри эукариотической клетки. В течение цикла развития бактерии в эукариотической клетки происходит смена двух форм:

Элементарные тельца (ЭТ) - внеклеточная форма хламидий, характеризующаяся высокой инфекционностью и низкой метаболической активностью. Представляют собой мелкие сферические клетки диаметром 200-300 нм.

Ретикулярные тельца (РТ) - внутриклеточная форма. Это метаболически активная форма, в которой хламидии существуют на репродуктивной стадии цикла. Данная форма считается инфекционно неактивной. РТ хламидий имеют размер 0,6-1,5 мкм и значительно менее электронно-плотную цитоплазму. Размножение хламидий происходит путём бинарного деления [69].

Нормальный цикл развития Chlamydia trachomatis занимает примерно 48-72 часа. Схематично он представлен на Рис. 1.

1.3 Жизненный цикл Chlamydia trachomatis

Клетка разрывается и выбрасывает Э Т. Заражение других клеток

Элементарное тельце (ЭТ) хламидии Диаметр 300 нм

• в

На этой ста инфекцион: возрастает

I этой стадии >фекционность

Адге>ия и мнте|>н.1лм;«|ция ЭТ в клетку хозяин«! путем эвдоцнтогл

Присутствуют в основном ЗТ

40

ЧАСЫ

Транскрипция ДНК, синтез РНК и синтез белка в ЭТ

12

Превращение ЗТ в ретикулярное тельце (РТ)

Превращение РТ в ЭТ Низкая инфекционность

Бинарное деление РТ Синтез ДНК клетки-хозяина снижается (промежуточные формы)

Рисунок 1. Жизненный цикл Chlamydia trachomatis. [69]

Первым этапом инфекционного процесса является адгезия ЭТ хламидии к клетке хозяина. Обычно это клетки нереснитчатого цилиндрического или кубического эпителия слизистых оболочек (конъюнктива, уретра, эндоцервикс, эндометрий, маточные трубы), эпителиальные клетки различных органов, клетки ретикулоэндотелия, лейкоциты, моноциты и макрофаги [43]. Посредством взаимодействия ЭТ с рецепторами гепарансульфата на поверхности эпителиальных клеток организма-хозяина, а так же при помощи секретируемых белков хламидий, о которых будет сказано далее, происходит проникновение патогена внутрь клетки путём эндоцитоза - интернализация [51]. Дальнейшее развитие происходит внутри цитоплазматической вакуоли — фагосомы (которую так же называют включением). Оказавшись внутри фагосомы, ЭТ трансформируется в РТ: ослабевают дисульфидные связи между МОМР и другими внешними белками мембраны, что приводит к повышению проницаемости мембраны хламидийной клетки, увеличению транспорта питательных веществ и возрастанию метаболической активности. Помимо изменений клеточной поверхности, происходит деконденсация хромосом хламидий, что необходимо для активации процессов транскрипции и трансляции. В мембрану фагосомы встраиваются секретированные хламидией белки, препятствующие слиянию фагосом с лизосомами и обеспечивающие поступление питательных веществ из цитоплазмы клетки. Считается, что именно в это время хламидия наиболее чувствительна к действию антибиотиков [72]. Во время инфицирования в клетку могут попасть несколько ЭТ, которые будут претерпевать дифференцировку в РТ и деление, образуя включение - фагосому, содержащую популяцию хламидий. В дальнейшем все фагосомы одной клетки сливаются между собой, образуя единое включение.

Очень часто в непосредственной близости от мембраны включения расположены митохондрии [81]. Нередко даже описывают агрегирование большого количества митохондрий вокруг включения. Однако связано ли подобное расположение митохондрий с процессами энергетического обмена до сих пор остаётся неясным, так же как и механизмы регуляции подобного привлечения [73].

Процесс деления ретикулярных телец происходит в интервале от 8 до 24 часов после инфицирования. РТ претерпевают 8-12 циклов бинарного деления. Постепенно некоторые из дочерних ретикулярных телец начинают уменьшаться в размерах, конденсируются, уплотняются, преобразуются в промежуточные тельца и далее редифферинцируются в новые элементарные тельца второго поколения [39].

1 *

» I I а I 1

Через 48-72 часа включение достигает очень больших размеров, занимая практически всю цитоплазму клетки, а ядро эукариотической клетки оказывается смещено к периферии. После чего клеточная мембрана разрывается, и во внеклеточное пространство выходят вновь образованные элементарные и ретикулярные тельца хламидий. Новые элементарные тельца вновь фагоцитируются чувствительными клетками, начиная новый цикл развития, таким образом, инфицирование прогрессирует [7].

В течение своего жизненного цикла хламидии реализуют свои вирулентные свойства, обеспечивают себе продолжительное внутриклеточное существование, избегая естественных механизмов защиты эукариотической клетки и всего макроорганизма вцелом. Кроме того, чаще всего результатом течения инфекционного процесса является переход хламидий в персистирующие формы.

1.4 Персистирующие формы Chlamydia trachomatis

Персистенцией называют длительное переживание возбудителя в организме хозяина. По современным представлениям, персистирование микроорганизмов обусловлено состоянием их индифферентности к воздействующим внешним факторам физико-химической природы, обеспечением стабильных антагонистических эффектов в биоценозе и сохранением жизнеспособности популяции за счёт приобретения ею устойчивости к защитным механизмам хозяина [2].

Персистенция хламидий была описана как жизнеспособная, но плохо культивируемая фаза развития в результате остановки процесса формирования нового поколения ЭТ. Персистенция характеризуется изменением характеристик роста: потерей инфекционности и развитием включений, которые содержат мало РТ хламидий [16].

Для понимания механизмов персистенции патогена в организме были детально изучены механизмы персистенции Chlamydia trachomatis в условиях in vitro. Существует ряд методик, которые позволяют моделировать персистентное состояние хламидий в культуре клеток путём воздействия на них различных веществ.

Так, например, аномальное течение жизненного цикла хламидий может быть вызвано антибиотиками. Лекарственные препараты, такие как эритромицин, могут ингибировать переход хламидий из ретикулярных телец в элементарные тельца или, наоборот, в зависимости от того, на каком этапе жизненного цикла антибиотик был добавлен в культуру. Антибиотики, мишенью для которых является синтез пептидогликана, такие как пенициллин или цефалоспорин так же ингибируют дифференцировку ретикулярных телец в элементарные [32].

Кроме того, было установлено, что хламидин чувствительны к недостатку питательных веществ, в первую очередь к дефициту аминокислот, железа, глюкозы. Было показано, что культивирование хламидий на клеточной линии McCoy в условиях дефицита глюкозы вызывает образование нетипичных по своему строению - аберрантных неинфекционных форм, которые восстанавливают свои свойства после добавления глюкозы [50].

Ещё одним важным фактором, обусловливающим переход хламидии в персистентное состояние в условиях in vitro, является действие цитокинов [91]. Цитокины влияют на поступление питательных веществ, что может индуцировать персистенцию. Например, действие IFNy активирует индоламин-2,3-диоксигеназу (IDO) - фермент, катализирующий окисление триптофана в формилкинуренин, что вызывает снижение уровня триптофана в культуре клеток [16].

При хронической инфекции, индуцированной добавлением в среду роста IFN-y, отмечено отсутствие гистоноподобных белков Нс-1 и Нс-2, участвующих в конденсации хроматина. Данный признак в настоящее время считается маркером хронической инфекции [83].

Следует отметить, что в условиях in vitro, также описано развитие спонтанной персистенции на модели культивирования С trachomatis серовара К в свежевыделенных моноцитах человека [67].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Кост, Елена Андреевна, 2014 год

Список литературы

1. Бондаренко В.М, Мавзютов А.Р. Типы секреции и ргуляции функциональной активности молекул, ассоциированных с патогенностью энетробактерий. // ЖМЭИ 2002.N 5. с.86-91

2. Бухарин О.В., Гинцбург A.JL, Романова Ю.М., Эль-Регистан Г.И. Механизмы выживания бактерий. // М. Медицина 2005 с.239-285

3. Воробьёв А.А., Быков А.С. Атлас по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии. // М. Медицинское информационное агентство 2003, с. 89-91

4. Гинцбург A.JI, Зигангирова Н.А., Зорина В., Карягина А.С., Федина Е.Д., Токарская Е.А., Борцов П.А., Алексеевский А.В., Заякин Е.С., Краюшкин М.М., Яровенко В.Н. Мишень-направленный поиск антивирулентных лекарсвенных средств. // ЖМЭИ 2009.N 4.С.71-77

5. Грин И., Стаут У., Тейлор Д. Биология. // Издение 2-е, М. Мир 1996, Том 1, с. 15-17

6. Гусев М. В., Минеева JI. А. Микробиология // М.: Изд-во МГУ, 2004

7. Коротяев А., Бабичев С. А. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология: Учебник для мед.вузов // 2-е изд.,испр.,СпецЛит, Спб 2000, с.591

8. Миронов А.Н. глав.ред. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. // М. Гриф и К. 2013 // 511-13

9. Перепанова Т.С. Русский медицинский журнал //2009.N 12.С. 841-845

10. Поздеев О. К. Медицинская микробиология (Под ред.акад.РАМН В.И.Покровского) // ГЭОТАР-МЕД, Москва, 2001, с. 768

11. Современная микробиология. Прокариоты: В 2-х томах / Под ред. Й. Ленглера, Г. Древса, Г. Шлегеля. — М.: Мир, 2005.

12. Шипицина Е.В., Савичева A.M., Хуснутдинов Т.А., Шампо К.В., Мисюрина О.Ю. и др. Устойчивость C.trachomatis к антибиотикам in vitro: методологические аспекты и клиническое значение. // Клиническая микробиология и химиотерапия. 2004.том 6.№ 1.С.-54-64

13. Baron, С. From bioremediation to biowarfare: on the impact and mechanism of type IV secretion systems. // FEMS Microbiol Lett 2005, 253, 163-70

14. Baron, C., Coombes, B. Targeting bacterial secretion systems: benefits of disarmament in the microcosm. // Infect Disord Drug Targets 2007, 7, 19-27

15. Beatty, WL., Morrison RP, Byrne GY., Immunoelectron-microscopic quantitation of differential levels of chlamydial proteins in a cell culture model of persistent Chlamydia trachomatis infection. // Infect. Immun. 1994; 62:4059-4062

16. Beatty, WL. Tryptophan depletion as a mechanism of gamma interferon-mediated chlamydial persistence// Infect. Immun. 1994; 62:3705-3711

»i

'i -л

116

$

17. Becker Y. The molecular biology of trachoma agent. Studies on the nature of trachoma obligate parasitism. // Isr J Med Sei. 1972; 8(8): 1134-7.

18. Beeckman D.S, Vanrompay D.C. Bacterial Secretion Systems with an Emphasis on the Chlamydial Type III Secretion System // Curr Issues Mol Biol. 2010, Vol.12, P. 17-41

19. Beiland, R.J. Transcriptome analysis of chlamydial growth during IFN-y-mediated persistence and reactivation // Proc. Natl. Acad. Sei. USA 2003; 100:15971-15976

20. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology 2nd Edition Vol.4 (2011) Editors: Noel R. Krieg, James T. Staley, Daniel R. Brown, Brian P. Hedlund, Bruce J. Paster, Naomi L. Ward, Wolfgang Ludwig and William B. Whitman

21. Betts J., Twiggs L. E., Sal M. S., Wyrick P. B., Fields K. A. Bioinformatic and Biochemical Evidence for the Identification of the Type III Secretion System Needle Protein of Chlamydia trachomatis. // J Bacteriol. 2008 March; 190 (5): 1680-1690

22. Blocker, A., Komoriya, K., Aizawa, S. I. Type III secretion systems and bacterial flagella: Insights into their function from structural similarities. // PNAS 2003, 100, 3027-3030

23. Brocklehurst P., Rooney G. Interventions for treating genital chlamydia trachomatis infection in pregnancy // National Perinatal Epidemiology Unit, Institute of Health Sciences, Old Road, Headington, Oxford, UK, OX3 7LF. Cochrane Database Syst Rev 2000; (2): CD000054

24. Brutinel, E. D., Yahr, T. L. Control of gene expression by type III secretory activity. // Curr Opin Microbiol 2008. 11, 128-133.

25. Bulut Y. Chlamydial heat shock protein 60 activates macrophages and endothelial cells through Toll-like receptor 4 and MD2 in a MyD88-dependent pathway // J Immunol. 2002 Feb 1; 168(3): 1435-40

26. Buttner D. and Bonas,U. Port of entry - the type III secretion translocon. // Trends Microbiol. 2002,10, 186-192

27. Büttner D. Protein Export According to Schedule: Architecture, Assembly, and Regulation of Type III Secretion Systems from Plant- and Animal-Pathogenic Bacteria. // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2012, 76(2):262-310

28. Capmany A, Damiani MT. Chlamydia trachomatis intercepts Golgi-derived sphingolipids through a Rabl4-mediated transport required for bacterial development and replication. // PLoS One. 2010 Nov 22; 5(ll):el4084. doi: 10.1371/journal.pone.0014084

29. Chakravortty D, Rohde M, Jäger L, Deiwick J, Hensel M. Formation of a novel surface structure encoded by Salmonella Pathogenicity Island 2. // EMBO J. 2005 Jun l;24(ll):2043-52. Epub 2005 May 12

30. Chang J. Y., D. Antonopoulos, A. Kalra, A. Tonelli, W. T. Khalife, T. M. Schmidt, and V. B. Young. Decreased diversity of the fecal Microbiome in recurrent Clostridium difficile-associated diarrhea. // The Journal of infectious diseases 2008, 197:435-8

31. Chang JJ, Leonard KR, Zhang YX. Structural studies of the surface projections of Chlamydia trachomatis by electron microscopy. // J Med Microbiol. 1997 Dec; 46(12):1013-8

I i

i ;

' i

yi n

t- il^'

'.it'

ill *

|i ' > lit ,1

V i

117

32. Clark, R. B. Ultrastructural analysis of the effects of erythromycin on the morphology and developmental cycle of Chlamydia trachomatis HAR-13/ R. B. Clark, P. F. Schatzki, H. P. Dalton//Arch. Microbiol. 1982; 133:278-282

33. Crane, D. D., Carlson, J. C., Fisher, E. R., Bavoil, P.,Hsia, R., Tan, C., Kuo, C., Caldwell, H.D. Chlamydia trachomatis polymorphic membrane protein D is a species-common pan-neutralizing antigen. // PNAS 2006, № 103, 1894-1899

34. Dahlgren, M. K., Kauppi, A. M., Olsson, I. M., Linusson, A., Elofsson, M. Design, synthesis, and multivariate quantitative structure-activity relationship of salicylanilides-potent inhibitors of type III secretion in Yersinia. // J Med Chem 2007, 50, 6177 -6188

35. Dean D. Chlamydia trachomatis today: treatment, detection, immunogenetics and the need for a greater global understanding of chlamydial disease pathogenesis. // Drugs Today (Bare). 2009 Nov;45 Suppl B:25-31

36. Delevoye,C., Nilges,M., Dehoux,P., Paumet,F., Perrinet,S., Dautry-Varsat,A., and Subtil,A. SNARE protein mimicry by an intracellular bacterium. // PLoS. Pathog. 2008, 4, el000022

37. Dreses-Werringloer, U. Persistence of Chlamydia trachomatis is induced by ciprofloxacin and ofloxacin in vitro // Antimicrob. Agents Chemother. 2000; 44:3288-3297

38. Miles C. Duncan, Roger G. Chemical Inhibitors of the Type Three Secretion System: Disarming Bacterial Pathogens // Linington and Victoria Auerbuch Antimicrob. Agents Chemother. 2012, 56(11):5433. DOI 10.1128/AAC.00975-12

39. Dwyer, J D Treharne, B R Jones, and J Herring. Chlamydial infection. Results of micro immunofluorescence tests for the detection of type specific antibody in certain chlamydial infections. // Brit J Vener Dis 1972, 48, 452 -459

40. Erhardt M., Namba K., Hughe K. Bacterial Nanomachines: The Flagellum and Type III Injectisome. // Cold Spring Harb Perspect Biol 2010: 10, 1101, a000299

41. Everett KD, Bush RM, Andersen AA. Emended description of the order Chlamydiales, proposal of Parachlamydiaceae fam.nov. and Simkaniaceae fam.nov.,each containing one mono typic genus, revised taxonomy of the family Chlamydiaceae, including a new genus and five new species, and standards for the identification of organisms. // Inter J Syst Bacterial 1999, 49, 415-440

42. Everett KD, Hornung LJ, Andersen AA Rapid detection of the Chlamydiaceae and other families in the order Chlamydiales: three PCR tests // J.Clin.Microbiol.v 1999 .v Vol..37.v P.575 v580.

43. Fields, K. A., Hackstadt, T. Evidence for the secretion of Chlamydia trachomatis CopN by a type III secretion mechanism. // Mol Microbiol 2000, 8, 1048-60

44. Fields,K.A. and Hackstadt,T. The chlamydial inclusion: escape from the endocytic pathway. //Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2002, 18, 221-245

45. Fox JG, Stills HF, Paster BJ, Dewhirst FE, Yan L, Palley L, Prostak K.. Antigenic specificity and morphologic characteristics of Chlamydia trachomatis, strain SFPD, isolated from hamsters with proliferative ileitis // Lab. Anim.Sci. 1993., Vol.43., P.405-410

n> > ! ' *

!>iW

<'(T .1

46. Gauthier, A., Robertson, M. L, Lowden, M., Ibarra, J. A., Puente, J. L., Finlay, B. B. Transcriptional inhibitor of virulence factors in enteropathogenic Escherichia coli // 2005, 49,4101-4109

47. Gérard H.C. Chlamydia trachomatis genes whose products are related to energy metabolism are expressed differentially in active vs. persistent infection // Microbes Infect. 2002;4:13-22

48. Ghosh, P. Process of protein transport by the type III secretion system. // Microbiol Mol Biol Rev 2004, 68, 771-795

49. Hackstadt T, Scidmore-Carlson MA, Shaw EI, Fischer ER. The Chlamydia trachomatis IncA protein is required for homotypic vesicle fusion. // Cell Microbiol. 1999 Sep; 1(2): 11930

50. Harper, A. Chlamydial development is adversely affected by minor changes in amino acid supply, blood plasma amino acid levels, and glucose deprivation // Infect. Immun.2000; 68:1457-1464

51. Heinzen, R. A, Scidmore, M. A, Rockey, D. D, Hackstadt, T. Differential interaction with cndocytic and exocytic pathways distinguish parasitophorous vacuoles of Coxiella burnetii and Chlamydia trachomatis, i'/ Infect Immun 1996, 64, 796-809

52. Henderson, I. R., Navarro-Garcia, F., Desvaux, M., Fernandez, R., Ala'Aldeen, D. Type V Protein Secretion Pathway: the Autotransporter Story. // Microbiol Mol Biol 2004, 68, 692-744

53. Hoare A, Timms P, Bavoil PM, Wilson DP. Spatial constraints within

the chlamydial host cell inclusion predict interrupted development and persistence. // BMC Microbiol. 2008 Jan 9;8:5

54. Hogan RJ, Mathews SA, Mukhopadhyay S, Summersgill JT, Timms P. Chlamydial persistence: beyond the biphasic paradigm.// Infect Immun. 2004; 72:1843-1855

55. Huang J, Lesser CF, Lory S. The essential role of the CopN protein in Chlamydia pneumoniae intracellular growth. // Nature. 2008 Nov 6; 456(7218): 112-5. Epub 2008 Oct 1

56. Hudson, D. L., Layton, A. N., Field, T. R., Bowen, A. J., Wolf-Watz, H., Elofsson, M., Stevens, M. P., Galyov, E. E. Inhibition of type III Secretion in Salmonella enterica serovar Typhimurium by small-molecule inhibitors. // Antimicrob Agents Chemother 2007, 51, 2631-2635.

57. Hueck,C.J. Type III protein secretion systems in bacterial pathogens of animals and plants. // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1998, 62, 379-433.

58. Hviid A., H. Svanstrôm, and M. Frisch. 2011. Antibiotic use and inflammatory bowel diseases in childhood. // Gut 60:49-54.

59. Hybiske K, Stephens RS. Mechanisms of host cell exit by

the intracellular bacterium Chlamydia. // Proc Natl Acad Sci USA. 2007 Jul 3;104 (27): 11430-5. Epub 2007 Jun 25

60. Iliffe-Lee ER, McClarty G. Regulation of carbon metabolism in Chlamydia trachomatis II Mol. Microbiol. 2000; 38:20-30

61. Jamison WP., Hackstadt T. Induction of Type III Secretion by Cell-Free Chlamydia trachomatis Elementary Bodies. // Microb Pathog. 2008; 45(5-6): 435^140.

62. Jewett TJ, Fischer ER, Mead DJ, Hackstadt T. Chlamydial TARP is a bacterial nucleator of actin. // Proc Natl Acad Sci USA. 2006 Oct 17; 103 (42): 15599-604. Epub 2006 Oct 6

63. Jiwani S, Ohr RJ, Fischer ER, Hackstadt T, Alvarado S, Romero A, Jewett TJ. Chlamydia trachomatis Tarp cooperates with the Arp2/3 complex to increase the rate of actin polymerization. // Biochem Biophys Res Commun. 2012 Apr 20; 420(4):816-21. Epub 2012 Mar 23

64. Kaul R. The chlamydial EUO gene encodes a histone HI-specific protease // J Bacteriol. 1997 September; 179(18): 5928-5934

65. Kauppi A.M., Nordfelth R., Uvell H., Wolf-Watz H., Elofsson M.Targeting bacterial virulence inhibitors of type III secretion in Yersinia. II Chem Biol 2003, 10, 241-249

66. Toni Kline, Heather BF, Sanowar S., Miller SI. The Type III Secretion System as a Source of Novel Antibacterial Drug Targets // Current Drug Targets, 2012, 13, 338-351

67. Koehler, L. Ultrastructural and molecular analyses of the persistence of Chlamydia trachomatis (serovar K) in human monocytes // Microb. Pathog. 1997; 22:133-142

68. Kubori T, Matsushima Y, Nakamura D, Uralil J, Lara-Tejero M, Sukhan A, Galán JE, Aizawa SI. Supramolecular structure of the Salmonella typhimurium type III protein secretion system. // Science. 1998 Apr 24;280(5363):602-5

69. Kumar Y., Valdivia R.H. Reorganization of the host cytoskeleton by the intracellular pathogen Chlamydia trachomatis // Communicative & Integrative Biology 2008, 1:2, 175177

70. Lane,B.J., Mutchler,C., Al Khodor,S., Grieshaber,S.S., Carabeo,R.A. Chlamydial entry involve TARP binding of guanine nucleotide exchange factors. // PLoS. Pathog. 2008. 4, el000014.

71. Lee, V.T., Schneewind, O. Type III secretion machines and the pathogenesis of enteric infections caused by Yersinia and Salmonella spp. Immuno. //Rev 1999, 168, 241-255.

72. Marra, A. Targeting virulence for antibacterial chemotherapy: identifying and characterising virulence factors for lead discovery. // Drugs R D 2006, 7, 1-16

73. Matsumoto A., Bessho H., Uehira, Suda T.. Morphological Studies of the Association of Mitochondria with Chlamydial Inclusions and the Fusion of Chlamydial Inclusions. // Electron Microsc 1991, 40: 356-363

74. Mecsas, J. J., Strauss E. J. Molecular Mechanisms of Bacterial Virulence: Type III Secretion and Pathogenicity Islands. II Emerg Infect 1996, 2, 270-88

75. Moraes, T. F., Spreter, T., Strynadka, N. Piecing together the Type III injectisome of bacterial pathogens . // Cu. Opin Struct Biol 2008, 18, 258-266.

76. Mueller, C. A., Broz, P., Cornells, G. R. The type III secretion system tip complex and translocon. II Mol Microbiol 2008, 68, 1085-1095.

77. Muschiol S, Bailey L, Gylfe A, Sundin C, Hultenby K, Bergström S, Elofsson M, Wolf-Watz H, Normark S, Henriques-Normark B. A small-molecule inhibitor of type III secretion inhibits different stages of the infectious cycle of Chlamydia trachomatis. II Proc Natl Acad Sei USA. 2006 Sep 26; 103(39): 14566-71. Epub 2006 Sep 14

78. Mygind, P., Christiansen, G., Birkelund, S. Topological analysis of Chlamydia trachomatis L2 outer membrane protein 2. HJBacteriol 1998, 180, 5784-7.

79. Pallen, M. J., Bailey, C. M., Beatson, S. A. Evolutionary links between FliH/YscL-like proteins from bacterial type III secretion systems and second-stalk components of the FoFl and vacuolar ATPases. //Protein Sei 2006, 15, 935-941.

80. Peters, J., Wilson, D. P., Myers, G., Timms, P., Bavoil, P. M. Type III secretion a" la Chlamydia. II TRENDS in Microbiology 2007, 15, 241-251.

81. Peterson EM, de la Maza LM Chlamydia parasitism: ultrastructural characterization of the interaction between the chlamydial cell envelope and the host cell. // J. Bacteriol. 1988 Mar; 170 (3):1389-92.

82. Pukatzki,S., Ma,A.T., Sturtevant,D., Krastins,B., Sarracino,D., Nelson,W.C., Heidelberg,J.F., and Mekalanos,J.J. Identification of a conserved bacterial protein secretion system in Vibrio cholerae using the Dictyostelium host model system. // Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A 2006,103, 1528-1533.

83. Rachel J. Penicillin Induced Persistence in Chlamydia trachomatis: High Quality Time Lapse Video Analysis of the Developmental Cycle // PLoS One. 2009; 4(11): e7723

84. Ridgway G.L. In: New Macrolides, Azalides and Streptogramins in Clinical Practice. // Ed. Neu H.C., Young L.S., Zinner S.H., Acar J. F. Pub. Dekker New York, USA ,1995; 147-54

85. Rockey,D.D., Scidmore,M.A., Bannantine,J.P., Brown,W.J. Proteins in the chlamydial inclusion membrane. // Microbes. Infect. 2002, 4, 333-340

86. Ronzone E., Paumet F. Two Coiled-Coil Domains of Chlamydia trachomatis IncA Affect Membrane Fusion Events during Infection. // PLoS One. 2013; 8(7): e69769.

87. Scidmore-Carlson MA, Shaw EI, Dooley CA, Fischer ER, Hackstadt T Mol Microbiol 1999,33:753-765

88. Schmitz-Esser, S., Linka, N., Collingro, A, Beier, C.L., Neuhaus, H.E., Wagner, M., Horn, M. ATP/ADP translocases: a common feature of obligate intracellular amoebal symbionts related to Chlamydiae and Rickettsiae .11 J Bacteriol 2004, 186, 683-691

89. Shapiro L.G., Stockman G.S. Computer Vision // New Jersey, Prentice-Hall 2001, pp 279—325

90. Shaw, E. I., Dooley, C. A., Fischer, E. R., Scidmore, M. A., Fields, K. A., Hackstadt, T. Three temporal classes of gene expression during the Chlamydia trachomatis developmental cycle. // Mol Microbiol 2000, 37, 913-25

91. Shemer, Y. Inhibition of growth of Chlamydia trachomatis by human gamma interferon/ Y. Shemer, I. Sarov // Infect. Immun. 1985; 48:592-596

92. Silva-Herzog E., Joseph S.S., Avery A.K., et al. J. Bacteriol. 2011, 193, 3490-3496

93. Skilton RJ, Cutcliffen LT, Barlow D, Wang Y, Salim O, Lambden PR, Clarke IN.. Penicillin induced persistence in Chlamydia trachomatis: high quality time lapse video analysis of the developmental cycle. // PLoS One. 2009 Nov 6;4(1 l):e7723

94. Slepenkin, A., de la Maza, L. M., Peterson, E. M. Interaction between components of the type III secretion system of Chlamydiaceae II J Bacteriol 2005, 187, 473^179

95. Slepenkin A., Chu H., Elofsson M., Keyser P., and Peterson E. M. Protection of mice from a Chlamydia trachomatis vaginal infection using a Salicylidene acylhydrazide, a potential microbicide. // The Journal of infectious diseases 2011, 204, 1313-20

96. Stenner-Liewen,F., Liewen,H., Zapata,J.M., Pawlowski,K., Godzik,A., and Reed,J.C. CADD, a Chlamydia protein that interacts with death receptors.// J. Biol. Chem. 2002, 277, 9633-9636

97. Stephens R.S.Chlamydia.Intracellular Biology // Pathogenesis,and Immunity.vWashington:ASM Press, 1999.V P.143 vl46

98. Su, H., Raymond, L., Rockey, D. D., Fischer, E., Hackstadt, T., Caldwell, H. D. A recombinant Chlamydia trachomatis major outer membrane protein binds to heparan sulfate receptors on epithelial cells. // Proc Natl Acad Sei USA 1996,93, 11143-8.

99. Subtil, A., Parsot, C., Dautry-Varsat, A. Secretion of predicted Inc proteins of Chlamydia pneumoniae by a heterologous type III machinery. // Mol Microbiol 2001, 39, 792-800

100.Thanassi,D.G. and Hultgren,S.J. Multiple pathways allow protein secretion across the bacterial outer membrane.// Curr. Opin. Cell Biol. 2000,12, 420-430

101.Wang D., Zetterstrom C. E., Gabrielsen M., Beckham K. S. H., Tree J. J., Macdonald S. E., Byron O., Mitchell T. J., Gaily D. L., Herzyk P., Mahajan A., Uvell H., Burchmore R., Smith B. O., Elofsson M., and Roe A. J. Identification of bacterial target proteins for the salicylidene acylhydrazide class of virulence blocking compounds // The Journal of biological chemistry. 2011

102.Ward ME. An update on the immunology of chlamydial infection // Abstracts of Proceedings of the 3rd Meeting of the European Society for Chlamydial Research. Vienna. Austria. 11-14 September 1996:58-62

103.Wolf K., H. J. Betts, B. Chellas-Gery, S. Hower, C. N. Linton, and K. Fields.. Treatment of Chlamydia trachomatis with a small molecule inhibitor of the Yersinia type III secretion system disrupts progression of the chlamydial developmental cycle. // Molecular microbiology 2006, 61:1543-55

104.Wyrick J Chlamydia trachomatis Persistence in Vitro - An Overview. // Infect Dis. 2010 June 15; 201(Suppl 2): S88-S95.