Влияние переноса протона в основном и возбужденном состояниях на люминесцентные свойства ионных форм флуоресцеина тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Суржикова Дарья Павловна

• Суржикова Дарья Павловна
• кандидат наук
• 2025

Оглавление диссертации кандидат наук Суржикова Дарья Павловна

Введение

Глава 1 Литературный обзор

1.1 Флуоресцентная спектроскопия

1.2 Биологическая значимость воды

1.3 Флуоресцеин как пример многокомпонентной системы

1.4 Явление переноса протона в основном и возбужденном состояниях

1.5 Сенсорные приложения флуоресцеина

Выводы к главе

Глава 2 Спектральные и фотофизические характеристики ионных форм флуоресцеина в возбужденном состоянии

2.1 Кинетический подход описания населенностей ионных форм в основном и возбужденном состояниях

2.2 Экспериментальное определение констант для моделирования

2.2.1 Материалы и методы

2.2.2 Нахождения форм спектров испускания частот 0-0 переходов ионных форм флуоресцеина

2.3 Верификация модели населенностей ионных форм флуоресцеина в основном возбужденном состояниях

2.4 Радиационные, флуоресцентные времена жизни и квантовые выходы ионных форм флуоресцеина

2.5 Направление и эффективность переноса протона в возбужденном состоянии для различных ступеней диссоциации красителя

Выводы к главе

Глава 3 Температурная зависимость ратиометрического флуоресцентного

сигнала флуоресцеина

3.1 Температурная зависимость спектров поглощения водных растворов флуоресцеина

3.2 Температурная зависимость спектров флуоресценции водных растворов

флуоресцеина

3.2.1 Ратиометрический сигнал флуоресцеина в диапазоне рН 4^8

3.2.2 Спектры флуоресценции растворов флуоресцеина при рН 6,0 и 6,5

3.2.3 Термометрические характеристики ратиометрического сигнала

флуоресцеина в физиологическом диапазоне рН

3.3 Моделирование температурной зависимости ратиометрического сигнала76

Выводы к главе

Глава 4 Спектральные исследования локальных характеристик белков разного размера и заряда с помощью флуоресцентной метки на основе флуоресцеина

4.1 Процедура ковалентного связывания метки ФИТЦ с белком

4.2 Спектры поглощения флуоресцентной метки ФИТЦ, ковалентно связанной

с белками

4.3 Флуоресцентные исследования ФИТЦ, ковалентно связанного с белками85

4.4 Структурные параметры белков

4.5 Корреляции экспериментальных и расчетных параметров

4.6 Ионное равновесие зонда вблизи поверхности белка

4.7 Жесткость связывания метки ФИТЦ с белками

Выводы к главе

Заключение

Список сокращений и условных обозначений

Благодарности

Список цитируемой литературы

4

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Влияние переноса протона в основном и возбужденном состояниях на люминесцентные свойства ионных форм флуоресцеина»

Введение

Флуоресцеин - органический краситель, относящийся к семейству ксантено-вых красителей, который был синтезирован 1871 году немецким химиком Адольфом фон Байером. Первое практическое применение флуоресцеина произошло в геологии, где краситель был использован в качестве индикатора общей водной системы Дуная и Рейна. По пришествию лет, краситель нашел применение во многих областях начиная с биологических: визуализации при диагностике и проведении различных операций [1,2], во флуоресцентной микроскопии [3], заканчивая техническими: в качестве активной среды лазера [4], в полупроводниковой электронике [5] и солнечных элементах [6].

В случае медико-биологических применений флуоресцеина его нужно рассматривать в окружении воды. Присутствие в окружении красителя свободных катионов водорода [H+] способствует их диссоциации/ассоциации со структурой флуоресцеина (переносу протона в основном состоянии), и, вследствие этого, появлению набора ионных форм красителя (C - катион, Q - хиноид, Z - цвиттерион, L -лактон, M - моноанион, D - дианион), существующих в равновесии друг с другом [7]. Данный процесс задействует хромофорную группу флуоресцеина, что отражается на фотофизических свойствах красителя при различных значениях pH [8]. Спектральные свойства ионных форм флуоресцеина в основном состоянии в широком диапазоне pH хорошо изучены методами спектрофотометрического титрования [9].

До сих пор не были детально изучены спектры флуоресценции, квантовые выходы и флуоресцентные времена жизни ионных форм флуоресцеина [10]. Причиной этого является сильное перекрытие широких бесструктурных спектров испускания, различная эффективность излучения ионных форм и перенос протона в возбужденном состоянии. Явление переноса протона заключается в изменении ионной формы за время жизни возбужденного состояния. Этот процесс конкурирует с излучательным процессом, что может приводить к ситуации, когда поглощает одна ионная форма, а излучает другая [11].

Актуальность определения спектральных параметров флуоресцеина в возбужденном состоянии связана с необходимостью получать с высоким пространственным и временным разрешением локальные физико-химические характеристики (рН, температура, полярность и др.) сложных неоднородных сред, функциональных биомолекул. Флуоресцентным сенсором также является производный флуоресцеина - изотиоцианат флуоресцеина (ФИТЦ), который имеет схожие спектральные и кислотно-основные свойства с флуоресцеином, но, в отличие от него, фиксируется вблизи функциональной молекулы, благодаря ковалентному связыванию. Размер флуоресцентного сенсора (порядка 1 нм) позволяет проводить измерение локальных характеристик на поверхности белковой структуры на расстоянии длины Дебая (1-2 нм) [12] в физиологических условиях (рН 5^8).

В настоящей диссертации получены результаты, которые вносят вклад в понимание природы излучения флуоресцеинового красителя в гомогенных (объемных) средах в широком интервале рН. На базе фундаментальных знаний исследование продолжено в прикладном направлении, а именно, в направлении использования спектральных аналитических сигналов для получения информации о локальном окружении флуорофора в физиологическом диапазоне рН 5^8. В этом диапазоне существует большинство физиологических жидкостей (кровь, ликвор, синовиальная жидкость и т.д.) и функционально-значимых биомакромолекул (напр. белков). Результаты способствуют увеличению информативности сигнала флуо-ресцеина и ФИТЦ для их дальнейшего использования в реальных химических и биологических объектах.

Цель работы: выявить влияние переноса протона в основном и возбужденном состояниях на спектральные и люминесцентные свойства ионных форм флуо-ресцеина в водных растворах в широком диапазоне рН и проанализировать связь между спектральными свойствами и локальным окружением красителя в физиологическом диапазоне рН.

Для достижения поставленной были решены следующие задачи:

1. измерить и проанализировать спектры люминесценции флуоресцеина в широком диапазоне рН 0^10, выявить форму спектров люминесценции, квантовые выходы, флуоресцентные времена жизни катионной, хиноидной и моноанионной ионных форм флуоресцеина, определить направление и эффективность переноса протона в возбужденном состоянии;

2. разработать и реализовать в виде программы ЭВМ модель, описывающую распределение населенностей ионных форм в зависимости от рН, длины волны возбуждения, температуры для анализа экспериментальных данных и прогнозирования спектральных свойств флуоресцеина;

3. выявить механизмы, ответственные за температурную чувствительность спектров поглощения и люминесценции водных растворов флуоресцеина, в физиологическом диапазоне рН;

4. оценить применимость гомолога флуоресцеин-изотиоцианата (ФИТЦ) для оценки локального окружения на поверхности белковой молекулы в физиологическом диапазоне рН.

Методы исследования

В работе использован ряд экспериментальных и модельных методов.

Были использованы методы абсорбционной и флуоресцентной спектроскопии. Флуоресцентные исследования включали в себя: стационарную, время-разре-шенную и поляризационную спектроскопию.

В качестве модельных методов были использованы:

- метод Аленцева-Фока разделения составных контуров флуоресценции на контуры с заранее неизвестной произвольной формой;

- разложение составных спектров поглощения на компоненты с известным профилем с использованием алгоритма нелинейной аппроксимации Левенберга-Марквардта.

Была разработана модель на основе кинетического подхода, описывающая распределение населенностей ионных форм в зависимости от: рН, длины волны возбуждения и температуры.

Положения, выносимые на защиту:

1. Несмотря на одинаковые хромофорные группы, близкое значение волновых чисел 0-0 переходов (20300±100 см-1) и квантовых выходов флуоресценции 0,46±0,05, 0,42±0,04 моноанионной и хиноидной форм флуоресцеина соответственно, их времена жизни (3,3±0,1 нс и 3,0±0,1 нс для моноаниона и хиноида соответственно) и форма вибронных спектров люминесценции различаются.

2. Эффективный перенос протона в возбужденном состоянии заключается в фотоотрыве протона от катиона с образованием хиноида, от цвиттериона с образованием моноаниона, от моноаниона с образованием дианиона флуоресцеина. Это приводит к уменьшению величины показателя константы ионного равновесия в возбужденном состоянии указанных ступеней диссоциации по сравнению с основным состоянием на величину от 0,84 до 3,96.

3. Температурный аналитический ратиометрический сигнал флуоресцеина (I488//435) линеен в диапазоне 283 К^353 К, с угловыми коэффициентами 1,54±0,03-10-2 К-1 и 1,53±0,03-10-2 К-1 для рН 6,0 и 6,5 соответственно. Основное влияние на температурную чувствительность ратиометрического сигнала оказывает сдвиг дианион-моноанионного равновесия в основном состоянии.

4. Положительный удельный заряд поверхности белка обеспечивает жесткость связи макромолекулы с ковалентно пришитой меткой ФИТЦ, что позволяет корректно определять ее размер по анизотропии флуоресценции зонда. Удельный (на единицу площади) заряд белка линейно коррелирует с ратиометрическим флуоресцентным сигналом /488//435 с коэффициентом корреляции 0,999.

Научная новизна

Впервые определены формы спектров люминесценции и волновые числа 0-0 переходов для катионной, хиноидной и моноанионной ионных форм флуоресце-ина.

Впервые выявлена роль смещения равновесия в основном состоянии и изменение вероятности поглощения из-за температурного изменения формы спектра

поглощения на моноанионной-дианионной ступени диссоциации в температурной зависимости ратиометрического сигнала флуоресцеина (I488//435).

Впервые измерены и проанализированы абсорбционные и люминесцентные (спектры поглощения, стационарные спектры флуоресценции, среднее флуоресцентное время жизни, анизотропия флуоресценции) характеристики для ФИТЦ, ко-валентно связанного с белками различного размера (14-79 кДа) и заряда (+9 - -21 e).

Личный вклад автора

Автором выполнен основной объем теоретических и экспериментальных исследований, включая пробоподготовку, коньюгацию метки с белком, спектральные и др. измерения, обработку полученных данных, систематизацию результатов и подготовку научных статей и тезисов докладов, отражающих основные результаты исследования. Общее руководство и задание направления исследований (цель и задачи) осуществлялось научным руководителем д.ф.-м.н. Е.А. Слюсаревой. Методическую помощь в проведении спектральных исследований на протяжении всего исследования оказывала старший преподаватель кафедры общей физики СФУ М.А. Герасимова. Математическая модель фотопроцессов была реализована при технической поддержке доцента базовой кафедры фотоники и лазерных технологий к.ф.-м.н. А.С. Ципотана и инженера базовой кафедры фотоники и лазерных технологий А.В. Шамшурина. Анализ структурных свойств белков с помощью методов молекулярного моделирования проводил старший преподаватель кафедры биофизики к.ф.-м.н. Л.А. Суковатый. Обсуждение результатов проводилось совместно с соавторами публикаций - Е.А. Слюсаревой, М.А. Герасимовой, доцентом кафедры биофизики СФУ к.ф.-м.н. Е.В. Немцевой.

Практическая значимость работы

1. Создана модель расчета протолитического равновесия органического красителя с трехступенчатой диссоциацией в основном и возбужденном состояниях, описывающая распределение населенностей ионных форм в зависимости от pH,

длины волны возбуждения, которая может быть использована для изучения природы излучения флуоресцентных соединений с выраженными фотокислотными или фотоосновными свойствами.

2. Определены диапазоны pH при которых возможно наблюдение люминесценции «чистых» ионных форм флуоресцеина: pH < 0 (катион) в диапазоне длин волн возбуждения 400-435 нм, pH 1,3 (хиноид), pH 4,4 (моноанион) в диапазоне длин волн возбуждения 435-490 нм.

3. Ратиометрический флуоресцентный сигнал флуоресцеина (I488//435), имеющий линейную зависимость от температуры, может быть использован для аналитических целей в интервале температур 283 К^353 К.

4. Найденные корреляции спектральных свойств ФИТЦ, ковалентно связанного с белками, ратиометрического сигнала (/488//435) с удельным поверхностным зарядом белка и диэлектрической проницаемости с площадью незаряженной поверхности белка, могут быть использованы при анализе зарядовых состояний широкого круга макромолекул.

Достоверность полученных результатов

Достоверность экспериментальных результатов обеспечена:

тщательностью пробоподготовки и использованием реактивов с аттестованной производителем чистотой, использованием приборов всемирно признанных брендов (Jobin Ivon, Perkin Elmer, Mettler Toledo, Agilent Technologies), соблюдением условий проведения спектральных измерений (калибровка, учет спектральной чувствительности детектора, фонового сигнала и реабсорбции люминесценции), воспроизводимостью результатов измерений для нескольких (3-5) повторов экспериментов, сопровождением всех результатов измерений величиной погрешности, использованием статистических критериев (х2, R2) установленных корреляций;

использованием для извлечения количественной информации принятых моделей (цикл Фёрстера, уравнения Вант-Гоффа, Стриклера-Берга, теория Хендер-сона-Хассельбаха и др.), непротиворечивостью полученных данных опубликованным результатам для частных случаев и аналогичных систем.

Достоверность температурной зависимости флуоресцентных свойств флуо-ресцеина обеспечивается повторением результатов в цикле нагревания - охлаждения и использованием различных значений рН (6,0 и 6,5).

Верификация теоретической модели, описывающей распределение населен-ностей ионных форм от рН состоит в совпадении с опубликованным результатами для основного состояния всех ионных форм и дианионного возбужденного состояния, в подтверждении неизменности форм спектров флуоресценции (рН 1,3 и 4,4) при вариации длины волны возбуждения в диапазоне 435-490 нм.

Апробация результатов работы

Основные результаты работы докладывались на следующих научных форумах: 58-ой Международной научной студенческой конференции, МНСК-2020, (г. Новосибирск, 2020г.), Международных конференциях «Проспект Свободный», (Красноярск, 2020 (Диплом II степени), 2021 (Диплом в специальной номинации «Актуальность»), 2023 гг.); Всероссийских научных конференциях с международным участием «Енисейская фотоника» (Красноярск, 2020, 2022, 2024 гг. (Диплом за лучший доклад в категории «Аспиранты»)); Международных конференциях по импульсным лазерам и применениям лазеров AMPL (г. Томск, 2021, 2023 гг.); XXIII Всероссийской научно-технической конференции «Современные проблемы радиоэлектроники» (Красноярск, 2022г.); Молодежной конференции с международным участием по люминесценции и лазерной физике «КЬРЬ> (Иркутск, 2023г.), Всероссийской научной конференции с международным участием «Невская фотоника» (г. Санкт-Петербург, 2023г.); Первой Всероссийской конференции по люминесценции «ШМ08-2024» (Москва, 2024 г.).

Основные результаты диссертации регулярно обсуждались на научных семинарах «Биофотоника», проводимых лабораторией Биофотоники ИИФиРЭ СФУ совместно с лабораторией биолюминесцентных биотехнологий ИФБиБТ СФУ.

Связь с плановыми исследованиями

Работа поддержана грантами:

1. РНФ № 22-22-00724 «Влияние диффузионного ограничения на фотокислотные свойства флуоресцеина при физиологических значениях рН» 2022-2023 гг;

2. Госзадание Минобрнауки (FSRZ-2020-0008) «Разработка фундаментальных основ перспективных оптических и магнитных материалов и синхротронных рентгеноспектральных методов исследования вещества» 2021-2022 гг;

3. РФФИ № 19-02-00450 «Роль фотоиндуцированного переноса протона в природе релаксации возбужденного состояния флуоресцеиновых красителей» 2019-2021 гг.

Публикации

Основные результаты исследования представлены в 13-х печатных работах. Результаты диссертации опубликованы в 5 статьях [13-17] из перечня ВАК и приравненных к ним работ, в том числе 4 статьи в изданиях «Белого списка» из которых 2 статьи К1, 1 статья К2 и 1 статья К3. Все пять статей цитируются международными базами данных WoS/Scopus, автор диссертации является в них первым автором. Результаты опубликованы в 3-х материалах в сборниках всероссийских и международных конференций [18-20], в 5-ти тезисах в сборниках всероссийских и международных конференций [21-25], получены 2 свидетельства о гос. регистрации программы для ЭВМ [26-27].

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, четырех глав, заключения и списка литературы из 157 наименований. Полный объем текста - 121 страница, которые включают 48 рисунков, 11 таблиц и 41 формула.

Глава 1 Литературный обзор

1.1 Флуоресцентная спектроскопия

Люминесценция - спонтанное излучение, избыточное над тепловым, имеющее конечную длительность свечения, превышающую период световых колебаний, и возникающее при переходе молекул из возбужденных электронных состояний в одно из низкорасположенных состояний. Наиболее вероятный процесс - это переход в основное состояние [28-30]. Люминесценцию различают по способу возникновения возбуждения: при использовании химических реакций - хемилюминес-ценция, электрических полей - электролюминесценция, при возбуждении светом -фотолюминесценция и др.

В зависимости от природы возбужденного уровня (триплетное, синглетное), фотолюминесценцию разделяют на фосфоресценцию и флуоресценцию [28-36]. Данные виды фотолюминесценции различаются по времени жизни: триплетное состояние по длительности свечения больше на 4-6 порядков, чем синглетное состояние. Дополнительно, фосфоресценция и флуоресценция различаются спектрально, фосфоресценция сдвинута батохромно. В данной работе используются флуоресцентные методы анализа, которые обладают большой чувствительностью, что позволяет работать с малой концентрацией образца.

Рисунок 1 - Диаграмма Яблонского.

На диаграмме Яблонского отражены характерные процессы возбуждения и дезактивации молекул (Рисунок 1). Эффективность процессов описываются константами скоростей к (с-1), которые обозначают вероятность перехода в различные состояния. При поглощении энергии, молекула из основного уровня ^0) переходит в возбужденное состояние ^п). Значение константы скорости перехода в возбужденное состояние (кпогл) приходятся на диапазон 4 102 ^2- 104с-1. Константа зависит от квантовой интенсивности возбуждаемого излучения (I, см-2 с-1) и значения сечения поглощения (ох, см2):

¿погл = . (1.1)

Вероятность поглощения молекулы зависит от формы спектра поглощения, молярного десятичного коэффициента экстинкции ^^см-1) и сечения поглощение ох (см2):

1п 10

01 = 81 ^, (1-2)

где Ыл - число Авогадро.

Экспериментально измеряемым параметром является оптическая плотность Л, которая рамках закона Бугера-Ламберта-Бера [36] может быть выражена через произведение молярного десятичного коэффициента экстинкции концентрации вещества (И) и длины оптического пути (см).

С уровня Sn будет происходить внутренняя конверсия, потеря энергии молекулы в виде нагревания окружения. Данный процесс является безызлучательным. Согласно правилу Стокса -Люммеля, после попадания на уровень Sl, для излучения молекуле необходимо спуститься на нижний колебательный подуровень, при этом будет происходить колебательная релаксация, данный процесс также безыз-лучательный.

После попадания на нижний колебательный подуровень S1, молекула переходит в основное состояние, испуская квант света. Константа скорости перехода из

возбужденного состояния в основное £фл, (с-1) - это величина, обратная флуоресцентному времени жизни (тфл):

. 1

кфл =-• (1.3)

Тфл

Тфл является экспериментально измеряемой величиной. Существует ненулевая вероятность перехода молекулы в триплетное состояние из в Т1 (интеркомбинационная конверсия). Дальнейший переход в основное состояние Б0 происходит схожим образом с синглетным состоянием - испусканием кванта света. Три-плетный уровень является более долгоживущим (10-4-102) по сравнению с синглетным (10-9-10-7). Вероятность интеркомбинационного перехода возрастает при наличии в структуре молекулы тяжелых атомов.

Помимо излучательных процессов дезактивации возбужденного состояния в системе энергетических уровней широко представлены безызлучательные, различные типы тушения.

Флуоресценция характеризуется спектром F в виде зависимости интенсивности флуоресценции от длин волн (нм), волновых чисел (см-1), который для органических люминофоров представляет собой широкий бесструктурный контур.

Радиационное время жизни ^рад является теоретическим максимумом реального (экспериментального) времени жизни. Его можно найти из формулы Стри-клера - Берга [37], зная форму спектров флуоресценции Е(к) и сечения поглощения

\ ^(X)х3<&

п

погл фл

рад" 8жсп3 г а (X) " ' (1.4)

хпспфл | ^ ^(Х)ёХ

Ба" Б: ^ фл

где Ппогл, Пфл - показатель преломления на длинах волн возбуждения и флуоресценции, с - скорость света, Е(к) - контур флуоресценции, а^(Х)- контур поглощения.

Квантовый выход флуоресценции принимает значение от 0 до 1 и определяется как отношение полного числа фотонов, испущенных в процессе флуоресценции, к полному числу поглощенных. Дополнительно квантовый выход определяется как отношение флуоресцентного и радиационного времен жизни:

т

Ф

фл

т

(1.5)

рад

Для нахождения волнового числа чисто электронного ^^^0) перехода

V

о-о

(см 1) спектры поглощения и флуоресценции необходимо построить в зеркальных координатах [38]. Для этого производится следующее преобразование спектров:

Г(У)

V3

(1.6)

А ^

А(у)

V

(1.7)

где

V-

волновое число, см

Волновое число,

Рисунок 2- Спектры поглощения и флуоресценции в зависимости от волнового числа.

1

Волновое число 0-0 перехода находится как значение волнового числа при пересечении спектров поглощения и флуоресценции, как показано на Рисунке 2.

Анизотропия флуоресценции (г), может быть получена с учетом интенсивно-стей, измеренных при положении поляризатора сонаправленно (!ц) с поляризацией возбуждения и ортогонально (И) к нему:

1\\ -1±

Г = —-. (1.8)

1\\ + 21 ± ( )

Повышенное значение анизотропии по сравнению со свободным сенсором в растворе сигнализирует об ограничении подвижности. Анизотропия может быть использована как мера подвижности метки при связывании с белковой молекулой.

1.2 Биологическая значимость воды

Вода имеет важнейшую биологическую значимость. Жизнеспособность клеток, организмов и даже целых экосистем зависят от её наличия. Так, вода играет значимую роль в работе метаболизма [39]. От трети до половины известных биохимических реакций связаны с потреблением или производством воды, где она выступает в роли субстрата, интермедиата, кофактора и продукта реакции. Авторами [39] показано, что вода составляет 99,4% метаболитов в Escherichia coli по молярной концентрации. Фотодиссоциация воды на ее элементарные составляющие лежит в основе фотосинтеза [40]. Вода является продуктом реакций в процессе клеточного дыхания [41].

Активность воды на границе раздела может быть частично связана с механизмом активации нескольких мембраносвязанных ферментов поверхностным давлением мембраны [42]. Активные потоки воды и растворенных в воде веществ играют существенную роль во время изменений формы клеток и подвижности клеток, подчеркивая роль гидравлического давления в динамике клеток [43].

Вода имеет ключевое значение в третичной структуре белков и обеспечивает гидрофобные взаимодействия, которые имеют решающее значение для сворачивания и агрегации белков [44,45]. Вода стабилизирует структуру биологических макромолекул и надмолекулярных липидных структур, контролирует биохимическую активность и регулирует межмолекулярные взаимодействия [46].

Биологические функции воды включают в себя ее действие в качестве транспортной среды для питательных веществ и продуктов жизнедеятельности, среды для химических реакций [47], клеточной осморегуляции [48] и поддержания упругости клеток [49,50], регулирование температуры тела [51], регулирование рН (1.9) [52].

Н20^>Н++0Н~

рн = -1ё[н+], (1-9)

где ^ - концентрация катионов водорода; pH - водородный показатель среды.

Отклонение pH от стандартного для клетки (7,35-7,45) может свидетельствовать о заболеваниях, например, болезни Альцгеймера [53] и злокачественных опухолях [54]. Роль наличия молекул воды в опухолях до и после лечения химиотера-певтическими препаратами разобрана в работе [55].

Молекулы воды активно участвуют в качестве нуклеофилов и/или доноров или акцепторов катионов водородов ^ (протонов) (1.9) во многих химических реакциях в живых организмах [56,57]. Вода является полярным, протонным растворителем, амфотерным реагентом и обладает способностью ионизировать как саму себя, так и другие молекулы [58]. Важность воды в биологических процессах привлекает внимание научного сообщества уже более ста лет.

Приведенные выше примеры подтверждают значимость исследования водного окружения малых биологически значимых объектов для диагностики и исследования различных болезней. Наибольшую перспективу для анализа биологически значимых объектов имеют флуоресцентные исследования посредством излучающих красителей, например, флуоресцеина.

Флуоресцентный анализ имеет высокую точность, параметры излучения соединения являются чувствительными к условиям ближнего окружения в пределах радиуса Дебая [12]. Органические красители имеют малый размер, с их помощью может быть исследована поверхность небольших объектов, например, белков и

других макромолекул. Несмотря на многофакторность процессов, понимание механизмов и фиксация критических параметров в ряде случаев позволяет извлечь однозначную информацию о состоянии микроокружения сенсора.

1.3 Флуоресцеин как пример многокомпонентной системы

Флуоресцеин (C20H12O5) является органическим красителем и относится к семейству ксантеновых красителей. В порошковом виде имеет оранжевый цвет. Краситель имеет молярную массу 378,2 г/моль. Динатриевая соль флуоресцеина ура-нин (Рисунок 3 а) является водорастворимой и находит широкое применение в биологических приложениях. В водном окружении уранин диссоциирует на флуоресцеин и ионы натрия. В растворенном виде флуоресцеин имеет желтый цвет, при возбуждении в полосе поглощения светится ярко зеленым цветом (Рисунок 3б).

Рисунок 3 - Структурная формула уранина (динатриевая соль флуоресцеина) (а), кювета с раствором флуоресцеина при освещении ультрафиолетовым светом (б).

Флуоресцеин находит широкое техническое применение. Краситель успешно используется в качестве маркера для потоков пещерной воды [59-61], нефтяных приложений, качестве трейсера для нефтяных скважин [62]. Существуют датчики на основе флуоресцеина широкого круга обнаружения: pH, ионы металлов, фториды [63-67]. Флуоресцеин является органическим полупроводником р-типа [68], что открыло для него приложения в полупроводниковой электронике [5,69-71]. Краситель применяется в качестве активной среды лазера [72].

Флуоресцеин находит широкое медицинское применение. Авторами [1,2,73] было заключено, что краситель может использоваться для дифференциации здоровых и злокачественных тканей, может быть использован для локализации и резекции внутричерепных опухолей. Хирургия и резекция под контролем флуоресцентного изображения красителя стали обычной нейрохирургической практикой во время хирургии опухолей [74-77]. Флуоресцеин может быть использован для биопсии интрамедуллярных поражений спинного мозга [78]. Краситель успешно применяется для задач ангиографии [79-82]. Электронная эндоскопия с флуоресце-ином [83] используется для выявления рака желудка на ранней стадии. Краситель используется в стоматологии для обнаружения и мониторинга кариозных поражений [84]. Флуоресцеин используется в качестве контрастного вещества для кольпо-скопии для обнаружения аномальной ткани шейки матки [85].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Суржикова Дарья Павловна, 2025 год

Источник C N M D

[7] 0 0 0,37 0,93

[8] 0,9-1 0,20-0,25 0,25-0,35 -

[9] 0,9-1 0,29 0,36 0,93

[92] 0,39 0 0,26 0,93

1.5 Сенсорные приложения флуоресцеина

Флуоресцеин используется для разработки флуоресцентных сенсоров для различных аналитов благодаря низкой токсичности и его выраженным фотофизическим свойствам (высокие коэффициент экстинкции, квантовый выход флуоресценции). Флуоресцеин является рН-чувствительным молекулярным зондом, благодаря различию абсорбционных и флуоресцентных характеристик его ионных форм. Помимо pH краситель чувствителен к различным характеристикам окружения, например, наличию протондонорных/протонакцепторных добавок, таковыми могут являться фосфат-ионы. Ранее [13,21] было показано, что показатели ионного равновесия в основном (pKa) и возбужденном состояниях ^К*^ зависит от концентрации фосфат-ионов. Анионы флуоресцеина могут быть использованы для обнаружения различных катионов К+, №+ и N^+[110]. Далее в этом разделе будут продемонстрированы примеры модификации структуры флуоресцеина, которые увеличивают его сенсорные приложения.

Флуоресцеин часто используется для создания оптических сенсоров для ионов металлов. С помощью химических модификаций структуры флуоресцеина можно вводить различные функциональные группы или заместители, изменяя характеристики флуоресценции соединения, такие как длина волны излучения, его интенсивность и фотостабильность.

-соон он / vJ5® ©

Рисунок 10 - Структура флуоресцеина и возможные центры модификации молекулы (1-5) [111].

Модификации молекулы флуоресцеина могут происходить по различным центрам 1-5 (Рисунок 10), однако именно хромофорная группа флуоресцеина (ксан-теновое кольцо) будет отвечать за сенсорные свойства нового соединения. В основном модификации молекулы происходят через основание Шиффа [111,112]. Существует возможность подгонять новые флуоресцентные зонды под конкретные экспериментальные требования, повышая их полезность в ряде научных дисциплин [113-116]. Более того, производные флуоресцеина также используются в качестве сенсорного материала для различных аналитов, включая ионы металлов, такие как Al3+, ^2+, Ag+, ^2+, ^2+, Au3+, Pb2+, Zn2+ и т. д., Обнаружение этих ионов имеет большое значение для здоровья человека и защиты окружающей среды [117].

Соединение флуоресцеина (ФЛ1) [118] с другими флуорофорами используется для определения анализируемых веществ на основе резонансного переноса энергии флуоресценции в режиме «включение-выключение». Это ратиометриче-ский метод определения ионов металлов (^2+) с помощью флуоресцеина. Тушение флуоресценции в процессе переноса энергии происходит у флуоресцеина, связанного с золотыми наночастицами. Аналиты могут препятствовать процессу переноса энергии из-за сильного связывания анализируемого вещества, что приводит к восстановлению флуоресценции (Рисунок 11 ).

Рисунок 11 - Флуоресцеиновый зонд для обнаружения ^^[118].

Ионы цинка (7п2+) играют решающую роль в различных биологических процессах, таких как ферментативный катализ, передача сигнала и экспрессия генов, что делает их точное обнаружение в биологических системах очень важным [119121]. Разработка усовершенствованных датчиков на основе флуоресцеина позволила обнаружить ионы 7п2+ на уровне следов, что сделало их бесценными для обнаружения 7п2+ в сложных матрицах образцов [113,122-125]. Авторы [124] представили зонд на основе флуоресценции ФЛ2 для специфического распознавания Zn2+. ФЛ2 показал высокую чувствительность к 7п2+ (предел обнаружения 0,10707 мкМ).

Авторы [126] представили зонд на основе флуоресцеина ФЛ3. Датчик селективно взаимодействовал с ионами Au3+ и усиливал интенсивность флуоресценции зонда. Это усиление было обусловлено гидролизом связи C=N, что приводило к образованию флуоресцентного продукта (4',5'-флуоресцеиндикарбокс-альдегида). В дополнение к своей эффективности в водном растворе зонд продемонстрировал проницаемость для клеток и мог использоваться для обнаружения ионов Аи3+ в живых клетках.

В области биологического обнаружения производные флуоресцеина находят широкое применение при изучении биомолекул, таких как нуклеиновые кислоты,

белки и ферменты. Помимо биологических применений, производные флуоресце-ина широко используются в обнаружении других малых молекул [112-113,127128]. Авторы [129] представили новый двухрежимный флуоресцентный зонд, обозначенный как зонд ФЛ4, который объединил флуорофоры флуоресцеина и кумарина. Основной целью этого зонда было различение цистеина от гомоцистеина и глутатиона в биологических средах. Зонд ФЛ4 демонстрировал быструю реактивность, реагируя на цистеин всего за 5 минут, что приводило к ответу «включения» при возбуждении на длине волны 450 нм. Аминокислоты, содержащие тиол, такие как глутатион, цистеин и гомоцистеин, играют важную роль в клеточном гомео-стазе, поскольку недостаток цистеин может привести к повреждению печени, пигментации волос, раку и другим заболеваниям, тогда как повышенный уровень го-моцистеина приводит к ишемической болезни сердца [130].

Авторы [131] представили ратиометрический флуоресцентный зонд ФЛ5 (Рисунок 12), основанный также на структуре флуоресцеина-кумарина для обнаружения гидразина, высокореактивного аналита. Предложенный зонд ФЛ5 продемонстрировал впечатляющий линейный диапазон обнаружения от 0 до 250 нМ для гидразина с пределом обнаружения 0,000364 мкМ. Кроме того, зонд ФЛ5 зонд был успешно применен для обнаружения и визуализации гидразина в реальных образцах воды, продемонстрировав его практическую полезность в экологическом мониторинге и оценке качества воды.

фл-6

Рисунок 12 - Сенсоры на основе флуоресцеина (ФЛ5 и ФЛ5) для распознавания малондиаль-дегида и гидразина [131,132].

Авторы [132] разработали производное флуоресцеина ФЛ6 в качестве флуоресцентного зонда для специфического обнаружения малондиальдегида. Разработанный зонд продемонстрировал высокую чувствительность и селективность для обнаружения малондиальдегида, что позволило провести точную и надежную количественную оценку этой важной биомолекулы. Чувствительность зонда обеспечена эффектом переноса электрона. Обнаружение малондиальдегида можно было наблюдать как визуально, так и количественно с помощью ультрафиолетового и видимого и флуоресцентного режимов, что еще больше подчеркивает удобство и практичность зонда.

Производные флуоресцеина находят широкое применение в биомедицинских исследованиях, диагностике и визуализации. Например, их можно ковалентно связывать с антителами, белками или другими биомолекулами для обеспечения специфического нацеливания и визуализации клеточных структур, биомаркеров или молекулярных взаимодействий [113,133-137].

33

Выводы к главе 1

Анализ большого количества публикаций продемонстрировал, что краситель флуоресцеин находит обширное применение как технических, так и в биологических областях, тем самым подтверждая необходимость дальнейшего изучения его спектральных и фотофизических характеристик. В водном окружении флуоресцеин демонстрирует набор ионных форм с зарядом от -2(D) до +1(С) и различными спектральными характеристиками вследствие изменения хромофорной группы из-за присоединения протона [H+]. Концентрация ионных форм флуоресцеина, в основном, зависит от pH раствора, практически во всем диапазоне pH краситель существует в виде смеси форм. Фотофизические характеристики (форма спектров и эффективность поглощения) и показатели констант ионного равновесия pKa ионных форм красителя в основном состоянии являются изученными.

В возбужденном состоянии ситуация усложняется из-за нескольких факторов. Помимо того, что флуоресцеин существует в виде нескольких ионных форм одновременно, их спектры флуоресценции сильно перекрываются. Ионные формы красителя имеют различную эффективность излучения (квантовый выход). За счет переноса протона в возбужденном состоянии, конкурирующим с излучением, поглощает одна форма, а излучает другая. Все перечисленные факторы приводят к тому, что спектры флуоресценции помимо pH зависят от многих факторов (длины волны возбуждения, вероятности переноса протона, температуры и т.д.), что осложняет нахождение спектральных и фотофизических характеристик ионных форм флуоресцеина в возбужденном состоянии и приводит к расхождению в опубликованных ранее результатах.

Данная работа направлена на выявление спектральных и фотофизических характеристик ионных форм флуоресцеина в возбужденном состоянии в широком диапазоне pH и дальнейшее применение полученных результатов для получения информации о локальном окружении красителя в физиологическом диапазоне pH.

Глава 2 Спектральные и фотофизические характеристики ионных форм флуоресцеина в возбужденном состоянии

2.1 Кинетический подход описания населенностей ионных форм в основном и возбужденном состояниях

В возбужденном состоянии возможна конкуренция реакции переноса протона с другими процессами, в основном с излучательными, вероятность которых ~108 с-1[108]. Для рассмотрения подобных систем подходит кинетический метод описания населенностей ионных форм красителя в основном и возбужденном состояниях, предложенный Веллером [100]. В кинетической модели совместно рассматриваются вероятности поглощения, излучения и реакции протонирования и де-протонированния. Схема кинетического подхода, основанная на упрощенной диаграмме Яблонского, изображена на рисунке 13:

Рисунок 13 - Схема кинетического подхода, основанная на диаграмме Яблонского, для описания населенностей ионных форм в основном возбужденном состояниях.

Вероятность поглощения ионных форм красителя зависит от формы спектра поглощения ех, [9] или сечения поглощение а^ (см2) (1.2). Вероятность излучатель-ных процессов кфл (с-1) - величина, обратная флуоресцентному времени (тфл) жизни для каждой формы (1.3). Индексы С, 7, Р, Ь, М и Э обозначают принадлежность констант к определенной протолитической форме.

Вероятность процесса депротонирования/протонирования ионных форм учитывается в константах км - мн (с-1) и кмн м - (с-1 М-1), соответственно. Под МН и М-

подразумеваются тауотомерные формы, отличающиеся на единицу заряда. Например, - константа депротонирования С формы с переходом в Q форму, кСр - константа протонирования Q формы с переходом в С форму (Рисунок 14). В возбужденном состоянии вероятность процесса протонирования/депротонированния учитывается подобным образом, как и основном и отмечается (*). Десятичный логарифм отношения констант протонирования/депротонированния в основном и возбужденном состояниях равны показателям констант ионного равновесия (2.1) на рассматриваемой ступени диссоциации:

/

РК =-

к

мнм-

к

м- мн

(2.1)

Условия эксперимента учитываются в виде заданной интенсивности падающего излучения I (2.2), после учета характеристик используемого источника излучения ~ 1020 см-2с-1.

Е

1(12)

где Е - мощность излучения ксеноновой лампы, попадающего на щель (Вт), У -площадь щелевого пятна (см2); V - частота возбуждающего излучения (Гц).

рН окружения красителя (раствора) влияет на населенность ионных форм как в основном, так и в возбужденном состояниях и учитывается в модели в виде сомножителя [Н+] около констант протонирования (Рисунок 13, 14).

Для описания населенностей в основном и возбужденном состояниях красителя флуоресцеина в широком диапазоне рН необходимо учесть все возможные ионные формы красителя и вероятности процессов.

В возбужденном состоянии существуют пять ионных форм красителя - С*, Ъ*, р*, М*, Э*, среди которых две таутомерные формы Р и Ъ являются нейтральными. В основном состоянии существуют все шесть ионных форм красителя - С,

7, Р, Ь, М, Э. Флуоресценция Ь формы была исключена из рассмотрения из-за отсутствия поглощения в видимой области спектра [9], в которой реализовывалось возбуждение в условиях нашего эксперимента. Однако, в основном состоянии населённость Ь формы флуоресцеина вносит существенный вклад в общую населенность (Рисунок 6). Переход между Ь и М формами не осуществляется [9] (Рисунок 14).

Рисунок 14 - Кинетическая схема процессов, происходящих в смеси ионных форм флуоресцеина.

Математическая формализация задачи

Для каждой ионной формы флуоресцеина в основном и возбужденном состояниях были составлены кинетические уравнения (2.3), которые учитывали возможные процессы активации-дезактивации. Например, для расчета населенности возбужденного состояния с* формы, необходимо учитывать увеличение населенности при переходе из основного состояния (с) при поглощении света, уменьшение населенности вследствие перехода С* формы в основное состояние С, уменьшение населенности при переходе из возбужденного состояния С* формы в возбужденные состояния Ъ* и Р* форм и увеличение населенности при переходе из возбужденных состояний Ъ* и Р* форм в возбужденное состояние С* формы (Рисунок 14). Безыз-лучательная дезактивация учитывается во флуоресцентных временах жизни (тфл), измеряемых в эксперименте, которые имеют более низкое значение по сравнению с теоретическим максимально возможным значение (трад) (раздел 1.1). Совокупность уравнений представляет собой систему, результатом решения которой является итоговая равновесная населенность, установившаяся за время непрерывного облучения на выбранной длине волны возбуждения. Влияние окружения красителя, такого как температура, наличие протон донорных/протонакцепторных добавок, учитывается в изменении ионного равновесия как в основном, так и возбужденном состояниях. В модели изменение ионного равновесия учитывается в виде увеличения или уменьшения констант протонирования/депротонирования (2.1), приводящее к изменению их итогового соотношения (рКа).

дГ

— = I oC[C] - kфгл [C- ] - kQ c[C- ] - kcQ[H -][Q-] - kZc[C- ] - kcz[H-][Z-] = О ^Q- = I oQ[Q] - kQ [Q-] - *-q[H+][Q'] - kQ c[C- ] - kMq[Q- ] - kQM [H+][M- ] = О

rU*

=I oZ[Z] - kфZл[z* 1 - ^H-Z-1 -kZc[C-1 - kM[Z-1 -kZM[H-][M-1=О

дt

дм' = I oM [M] - kZí [M- ] - kQ M [H+ ][M- ] - kMq[Q- ] - kZ M [H+ ][M- ] - kMjZ-] - kUH-][D- ] - kD m[M-]=О

дt

д D- = I oD[D] - k¡¿ [D- ] - kMD [H- ][D-] - kDm[M-] = О

дt

дГ дt

kфгл [Г- ] -1 oC [C] - kQc [C] - kcQ [H+ ][Q] - kZc [C] - kcZ [H+ ] [Z] - kLc [C] - kcL [H+ ][L] = О (2 3)

^Q = kфQл [Q- ] -1 oQ [Q] - kcQ [H+][Q] - kQc [C] - kMQ [Q] - kQM [H+][M] = О дТ

— = ^lc[C] - ¿CL[H+ ][L] = О дt

д7

— = kzZл [Z- ] -1 oZ [Z] - kcZ [H+ ] [Z] - kZc [C] - kMZ [Z] - kZM [H + ][M] = О дt

дм = kфMл[M-] -1 oM[M] - kQM[H+ ][M] + kMQ[Q] - kZM[H + ][M] + kMZ[Z] + kMD[H + ][D] - kDM[MM] = О д D

kфDл [D-] -1 oD [D] - kMD [H+ ][D] + kDM [M] = О

U> oo

дt

В уравнениях учтено сохранение нормированной общей концентрации флу-оресцеина на всем диапазоне рН (2.4).

с+с*+2+г*+д+д*+ь+м+м*+Б+Б*=1. (2.4)

Для того чтобы система линейных уравнений (2.3) имела решение матричным методом, ее необходимо преобразовать. Матричный метод может применяться в решении систем линейных уравнений, в которых число неизвестных равно числу уравнений. Другое условие применимости матричного метода - невырожденность матрицы коэффициентов при неизвестных, то есть неравенство нулю определителя этой матрицы. Систему линейных уравнений при выполнении вышеназванных условий, можно представить в матричном виде, а затем решить её путём поиска обратной матрицы к матрице системы. Выразив одну из неизвестных переменных [О], используя (2.4) и произведя математическое преобразование, система уравнений (2.3) примет вид (2.5).

(кфл + kQ c + k*zc )[C*] + kcQ [H+][Q*] + kcz [H +][Z*] +1 aC [C] = О kQjC*] - (kQ + kcQ [H +] + kM Q )[Q*] + kQ M [H+][M*] +1 aQ [Q] = О kZjC*] - (кфл + kcz[H+ ] + kM z )[Z*] + kzM [H+ ][M*] +1 aZ [Z] = О kfmq[Q*] + k^[Z*] - (кфыл + kq m [H + ] + kz m [H+ ] + kd m )[M*] + km d[H + ][D*] +1 am [M] = О

1 aD[С*] +1 aD[Q*] +1 aD[Z*] + ( 1 aD+kDM )[M*] + ( 1 a,D- k£ - kMd[H+])[D*] +1 aD[C] +1 a,D[Q] +1 aD[L] +1 a,D[Z] +1 aD[M] = О kфcл [C* ] - ( 1 aC + kQc + kzc + kLc )[C] + kcQ [H+ ] [Q] + kcz [H + ] [Z] + kŒ [H + ][L] = О (2 5)

kQ [Q* ] + kQc [C] - (1 aQ+kcQ [H+ ] + kMQ )[Q] + kQM [H+ ][M] = О kLC[C]-kCL[H+ ][L] = 0

kZ [Z* ] + kzc [C] - ( 1 aZ + kcz [H + ] + kMz ) [Z] + kzM [H + ][M] = О

о

kMD[H + ][C*] + kMD [H + ][Q*] + kMD[H + ][Z*] + (kMD [H + ] + kM )[M*] + kMD[H + ][D*] + kMD[H + ][C] + ( kMD[H + ] + kMQ )[Q] + +kMD [H + ][L] + (kMD [H + ] + kMZ )[Z] + (kMD [H + ] -1 aM - kQM [H + ] - kZM [H + ] - kDM )[M] = О

Необходимо записать систему уравнений (2.5) в матричном виде. Обозначим отдельно как В матрицу коэффициентов при неизвестных, и как столбец неизвестных и р как столбец свободных членов (правая часть уравнений), соблюдая (2.6). Тогда система уравнений (2.5) в матричном выражении принимает следующий вид (2.8):

В х и = р. (2.6)

Решение систем линейных уравнений матричным методом основано на следующем свойстве обратной матрицы: произведение обратной матрицы и исходной матрицы равно единичной матрице (2.7). Обратная матрица обозначается символом В-1.

В х и = р

Вх В х и = В"1 х р (2.7)

и = Вх р

То есть, для нахождения решений системы нужно обе части уравнения умножить на матрицу, обратную матрице коэффициентов при неизвестных и приравнять соответствующие элементы полученных матриц.

#фл + kQC + kZC ) kCQ[H+] kCz[H +] О О IoC

k* kQC -(kQ+kCQ[H+]+kM Q ) О kQ мР+] О О

k* kZC О -(k¿+kCz[H+]+k;^z ) kZм[H +] О О

О k* MQ k* MZ -(kM + kQ м[H+ ] + kZм[H+ ] + kD м ) k^ID [H+ ] О

I oD I oD I oD 1 oD+kDM I oD - kD - kMD [H+] i oD

kC О О О О -( IoC + kQC + kZC + kLC)

О kQ О О О k QC

О О О О О kLC

О О kZ О О k ZC

kMD[H+ ] kMD[H+ ] kMD[H + ] kM + kмD[H+ ] kмD[H+ ] kMD[H+ ]

(2.8)

О О О О- - C* - - О -

loQ о о о Q* О

О О Z 0 Z* О

О О О T M M* О

I oD I oD I oD i oD D* 1 oD

kCQ[H+] kcL[H + ] kCZ[H+] О x C О

( I oQ + kcQ[H +] + kMQ ) о о kQM[H +] Q О

О -kcL[H + ] О О L О

О О -( I oZ + kcZ[H+ ] + kMZ ) kZM [H + ] Z О

kMD[H ] + kMQ kMD[H+ ] kMD[H ] + kMZ kMD[H + ] - I oM - kQM[H + ] - kZM[H + ] - kDM _ M _ kMD[H + ]_

Данные, использованные в моделировании выделенные в таблицах 2 и 3, являются оригинальными и опубликованы в [14,15], их получение описано в разделе 2.2 и 2.4 данной главы.

Таблица 2 - Константы ионного равновесия, протонирования, депротонированния в основном и возбужденном состояниях для различных ступеней диссоциации флуоресцеина.

Ступень диссоциации Основное состояние Возбужденное состояние

Символ Значение Символ Значение

рКаМ° 6,31 [9] рК*аМ° 5,47е

към (с-1) 1,27 а к*эм (с-1) 2,31 103 а

кмв (с-1-М-1) 2,60-106 [108] к*ив (с-1-М-1) 9,20-108 [108]

рКа^М 3,27 [9] рК*а0М 3,30 [14]

kмQ (с-1) 3,90-105 б к*мо (с-1) 3,90-107 [109]

ком (с-1-М-1) 7,26-108 а к*ом (с-1-М-1) 7,26-1010 а

Ъ~М рКа2М 3,46 [9] рК*а2М -0,50 [14]

кмъ (с-1) 1,87105 а к*мъ (с-1) 1,04-1011 [109]

към (с-1-М-1) 5,40 108 б к*ъм (с-1-М-1) 3,29-ю10 а

рКа^ 3,20 [9] рК*аС0 -0,60 [14]

кос (с-1) 1,07104 а к*ос (с-1) 1,04-1011 [109]

кса (с-1 М-1) 1,70107 б к*со (с-1 М-1) 2,61 • 1010 а

С~Ъ рКаС2 3,01 [9] рК*аС2 3,10 [14]

къс (с-1) 1,66104 а к*ъс (с-1) 1,04-1011 [109]

ксъ (с-1-М-1) 1,70 107 б к*СЪ (с-1-М-1) 1,311014 а

рКаСЬ 2,38[9] -

кьс(с-1) 7,09-104 а -

ксь (с-1-М-1) 1,70 107 б -

а - расчет по формуле (2.1); б - значение, на два порядка меньшее, чем полученное в [109 для возбужденного состояния; в - получено через цикл Фёрстера (1.16).

Отмечены результаты, полученные в настоящей работе

Таблица 3 - Значения флуоресцентных времен жизни тфл и вероятности излучательного процесса кфл для разных ионных форм флуоресцеина.

Форма Значение тфл (• 10-9 с) Символ константы Значение кфл (108 с-1)*

С 3,55 [14] 2,82

Q 3,00 [14] 3,33

Z 3,55 [14] £ 2,82

M 3,30 [15] 3,03

D 4,10 [9] ^л 2,44

*расчет по (1.3)

Отмечены результаты, полученные в настоящей работе

При описании населенности в основном состоянии были использованы константы протонирования/депротонирования из источника [108] и константы на два порядка меньше, чем значения из [109] для возбужденного состояния. Соответствующие константы протонирования/депротонирования были пересчитаны через выражение (2.1) с учетом ионных равновесий из [9].

Возбужденном состоянии, константы депротонированния были взяты из источников [109], константы протонирования были пересчитаны через выражение (2.1) с учетом ионных равновесий из [14]. На ступени диссоциации M-D были использованы константы протонирования из источника [108], константы депротонированния были пересчитаны через выражение (2.1) с учетом найденного ионного равновесия pK*a, получено через цикл Фёрстера (1.16).

Флуоресцентные времена жизни (тфл) для расчета констант излучательных процессов (1.3) были взяты из [9,14,15] Значения молярных десятичных коэффициентов экстинкции sx были взяты из [9] и переведены в значения сечения поглощения ах (1.2).

Для решения матричных задач с большими объемами данных подходит программное обеспечение Matlab. С целью визуализации результатов расчета был использован GUI Interface. Решение системы уравнений проводилось методом обратной матрицы (2.7).

Индивидуальность вещества задается путем ввода экспериментально измеряемых параметров: спектров поглощения ионных форм и показателей констант ионного равновесия в основном состоянии, флуоресцентных времен жизни и показателей констант ионного равновесия возбужденном состоянии. Вводными данными, учитывающими условия эксперимента, являются длина волны возбуждения и интенсивность излучения источника.

Вывод информации осуществляется в виде графиков зависимости населенности красителя в основном и возбужденном состояниях от рН, либо в виде численных данных для заданного значения рН с возможностью сохранения результатов в текстовом файле. Интерфейс программы расчета равновесных концентраций красителя от длины волны возбуждения и рН представлен на Рисунке 15.

Рисунок 15 - Интерфейс программы расчета равновесных концентраций красителя от длины волны возбуждения и рН [26].

2.2 Экспериментальное определение констант для моделирования

2.2.1 Материалы и методы

Химические реактивы

В работе была использована натриевая соль флуоресцеина С2оНю№205 ^1ика) без дальнейшей очистки. В качестве растворителя использовалась дистиллированная вода.

В работе были использованы водные растворы, рН которых изменялся в широком диапазоне 6,7М Н2804-рН 11. Для получения растворов в кислой среде при рН < 7, была использована серная кислота Н28О4 (81§та-АШгю^. Для получения щелочной среды рН > 7, был использован гидроксид калия КОН (81§та-АШпсЬ) (Глава 2).

Для исследования температурной зависимости спектральных свойств флуо-ресцеина были использованы растворы фосфатного буфера (1М) из компонент: ди-гидроортофосфата калия (КН2РО4, 81§та-АМпсЬ) и гидрофосфата натрия (Ка2НР04, 81§та-А1ёпсЬ), при рН 6,0 и 6,5 для смеси М и Б форм, рН 4,4 и 5,0 для М формы и рН 11 для Б формы флуоресцеина (Глава 3).

В работе был использован флуоресцеин-5-изотиоцианат (ФИТЦ, 81§та-АШпсИ) и набор белков: лизоцим куриного белка (ЛКБ, Б1а-М), карбоксиангидраза Б быка II (КАБ, Институт биофизики СО РАН), бычий сывороточный альбумин (БСА, 81§та-А1ёг1сИ), бактериальная люцифераза из Рко^Ъа^вгтт ¡вю^рмЫ (БЛ, «Прикладные Биосистемы»). В качестве растворителя для ФИТЦ был использован диметилсульфоксид (ДМСО, АррН^ет). Реактивы, использованные для реакции ковалентного связывания: карбонат натрия (№2СОз, УеЙоп), гидрокарбонат натрия ^аНСОз, УеЙоп) и хлорид аммония (N^0, УеЙоп) (Глава 4).

Оборудование

Контроль рН полученного раствора осуществлялся с помощью рН-метра 8еуепСотрас1 8220 (МеШегТо^о, Швейцария).

Спектры поглощения были измерены на спектрофотометре Lambda 35 (Perkin Elmer, США). В качестве источника возбуждения использовались дейтериевая (190-400 нм) и галогенная (300-1100 нм) лампа накаливания. Спектральная ширина щели составляла 2 нм. Температурная зависимость спектров поглощения водных растворов флуоресцеина была измерена на спектрофотометре Cary 5000 (Agilent Technologies, Австралия) в диапазоне температур 283^353К, остальные эксперименты проведены при комнатной температуре 298K. Эксперименты проводились в диапазоне длин волн 200 - 700 нм. В спектрах было учтено влияние фона.

Спектры флуоресценции были измерены на спектрофлуориметре Fluorolog 322 (HoribaJobinYvon, США). Эксперименты проводились в диапазоне длин волн 450-650 нм. В качестве источника возбуждения использовалась короткодуговая ксеноновая лампа мощностью 450 Вт, излучающая в спектральном диапазоне 2001100 нм. Спектральная ширина щели монохроматора возбуждения и испускания подбиралась под излучение образца и изменялась в диапазоне 1^2,5 нм. Температурная зависимость спектров флуоресценции водных растворов флуоресцеина была измерена в диапазоне температур 283^353К, остальные эксперименты проведены при комнатной температуре 298K. Длины волн возбуждения принимали значения в диапазоне 400^490 нм. Спектры были скорректированы на эффект реаб-сорбции. В спектрах был убран фон.

Временные спады флуоресценции были получены при помощи модуля DelataHub (HoribaScientific, США) для измерения времен жизни методом счета одиночных фотонов c временной корреляцией. Спады были получены при возбуждении диодным источником Delta Diode laser (спектральный максимум - 407 нм, с длиной импульса ~ 60 пс) и NanoLED diode (спектральный максимум - 453 нм, с длиной импульса <1,3 нс). Спады флуоресценции были измерены на максимальной длине волны спектров флуоресценции - 490 и 515 нм с временным разрешением 28 пс на канал. Времена жизни выделяли c помощью метода деконволюции, для восстановления формы возбуждающего сигнала использовали вьюококоллоидное соединение Ludox 30 вес. % (Sigma-Aldrich). Обработка разрешенных во времени спадов интенсивности флуоресценции проводили с помощью специальной программы

БА86.3 (HoгibaJobinYvon) с использованием статистического критерия %2. В работе были использованы средние флуоресцентные времена жизни.

Поляризационные измерения флуоресценции были проведены в диапазоне 495-525 нм в близи максимума спектра флуоресценции с шагом 1 нм на двух длинах волн возбуждения 488 нм и 435 нм.

Все измерения, описанные в представленной работе, проводились с использованием кварцевой кюветы 1x1 см. Концентрация натриевой соли флуоресцеина в водном растворе 810-6 М. Измерения проводились через 30 минут после приготовления раствора.

2.2.2 Нахождения форм спектров испускания частот 0-0 переходов

ионных форм флуоресцеина

Константы ионного равновесия для С-О, С^, О-М и Z-M ступеней диссоциации в возбужденном состоянии

Для нахождения показателя константы ионного равновесия по формуле (1.16) необходимо знание волновых чисел 0-0 переходов протолитических/тауто-мерных форм, отличающихся на единицу заряда. Первичной информацией для этого является явный вид контуров испускания и поглощения. Нахождение формы контуров испускания ранее неизвестных «чистых» ионных форм является предметом следующего исследования.

Нами был выбран рН < 3,5, при котором в водных растворах флуоресцеина преобладают С, Р, Ъ формы в основном состоянии. Были измерены спектры поглощения и флуоресценции в кислых условиях до концентрации серной кислоты (Н2804) в растворе 6,7 М.

£ 0,4п

6,7М Н БО

рН 3,5

х '...••• V'.....

н 0,0 ------—

§ 350 400 450 500

Длина волны, нм

450 500 550 600 650 Длина волны, нм

а

б

Рисунок 16 - Спектры поглощения (а) и флуоресценции (б) водных растворов флуоресцеина с различным значением рН в кислой среде (рН < 3,5).

Из Рисунка 16а видно, что при увеличении концентрации кислоты изменяется форма и увеличивается амплитуда спектров поглощения. Это связано с увеличением доли С формы молекулы в растворе, которая имеет максимум на 437 нм (Рисунок 7). При достижении концентрации кислоты в растворе равной 1М, амплитуда и форма спектров поглощения неизменны, что свидетельствует о наличии в растворе только С формы флуоресцеина. Спектры флуоресценции были измерены на одной длине волны возбуждения равной 400 нм, на этой длине волны потенциально возбуждаются С, Р и Ъ формы. Выбор одной длины волны возбуждения был выполнен с целью исключить различный вклад флуоресценции ионных форм флуоресцеина в спектрах флуоресценции из-за различной эффективности поглощения ионных форм [9]. В спектрах флуоресценции (Рисунок 16б) наблюдается изменение формы спектра и сдвиг максимума примерно 40 нм в синюю область с увеличением концентрации кислоты. В отличии от спектров поглощения, форма спектров флуоресценции изменялась вплоть до максимальной концентрации кислоты, что предполагает наличие более одной флуоресцирующей формы в сильно кислых растворах.

Разделение составного спектра флуоресценции на две составляющие х и %2 производилось методом Аленцева-Фока [138]. Данный метод позволяет разделить перекрывающиеся контуры неизвестной произвольной формы при условии, что

они частично спектрально разнесены. Для разделения контуров используется пара спектров /1(Х) и У2(Х), полученных при разном рН (Рисунок 16б), в которых две флуоресцирующие формы существуют с разным вкладом:

/ (Х) = Ъ (Х) + & (X) (2.9)

/ (х) = оа, (х)+а2г2 (X) (2.10)

Коэффициенты а1 и а2 определялись путем деления двух экспериментальных спектров У2(Х)//1(Х) и нахождения двух горизонтальных участков в этой зависимости, лежащих за пределами области пересечения спектров. После этого в явном виде вычислялись искомые контуры по формулам:

Х[М = /2 М-а2/1М , (2.Ц)

о2

Х2 (Х) = /1 (Х)-Х1 (X) . (2.12)

На рисунке 17 представлена поэтапная процедура разделения контуров спектров флуоресценции методом Аленцева - Фока для двух значений рН ~ 0 и 0,7. Процедура была успешно выполнена в исследуемом промежутке рН (6,7М Н2804 -рН 3,5). Методом Аленцева-Фока, контуры флуоресценции были разложены на две спектральные составляющие х и %2, формы которых не зависят от выбора экспериментальных контуров /1(Х) и У2(^). Контур Х1 был отнесен С форме, контур Х2 был отнесен к Р форме флуоресцеина.

Два спектра на одном графике

Результат деления спектров и определение коэффициентов al и a2

Расчет по формуле (2.12)

Расчет по формуле (2.11)

Длина волны, в

Длина волны, г

Рисунок 17 - Поэтапная процедура (а-г) разделения контуров спектров флуоресценции методом Аленцева - Фока (для примера для спектров при рН ~ 0 и рН 0,7) [18].

Максимум спектра флуоресценции С формы флуоресцеина имеет значение 478 нм, максимум спектра Р формы сдвинут в красную область относительно С формы и имеет значение - 517 нм. Дополнительно спектр флуоресценции Р формы имеет плечо в красной области примерно 550 нм (Рисунок 18). Спектр флуоресценции Ъ формы не был найден из-за минимальной вероятности излучения Ъ формы флуоресцеина [139], дополнительно это будет подтверждено в моделировании населенности в ионных форм флуоресцеина в возбужденном состоянии.

Длина волны,

Рисунок 18 - Контуры испускания флуоресцеина, найденные в результате разделения спектров методом Аленцева-Фока. Х1 - соответствует спектру (сплошная линия) С ионной формы, Х2 -соответствует спектру (пунктир) Q ионной формы.

Спектры поглощения и флуоресценции С и Q ионных форм флуоресцеина были построены в зеркальных координатах [38] для нахождения волнового числа

чисто электронного перехода у°-0, см-1 (Рисунок 19).

а б

Рисунок 19 - Спектры поглощения и флуоресценции С (а) и Q (б) ионных форм флуоресцеина в зависимости от волнового числа.

Перевод спектров поглощения и флуоресценции выполнен по формулам (1.6 и 1.7). Волновое число чисто электронного перехода для каждой из форм находится

как значение волнового числа при пересечении спектров поглощения и флуоресценции, как показано на рисунках 19 а,б. Величины 0 для С и С) формы составили 22100 см -1 и 20300 см -1 соответственно.

Вероятность фотодиссоциации протона от С формы составляет -1011 с-1 [109], что на 1-2 порядка превышает вероятности излучательных переходов для флуоресцеина. В этом случае за время жизни флуоресцентного состояния успевает установиться равновесие которое может быть рассмотрено в рамках цикла

Фёрстера (1.16). Для нахождения констант ионного равновесия с участием Ъ формы

флуоресцеина, в расчетах было использовано значение у°-° для С формы из-за схожих свойств их хромофоров (см раздел 1.3, Рисунок 4).

Константа ионного равновесия М-Б ступени диссоциации

Для нахождения формы спектра флуоресценции М формы флуоресцеина, были измерены спектры флуоресценции растворов флуоресцеина в диапазоне рН 3,5^5,5. При рН 4,4 была получена минимальная зависимость от длины волны возбуждения, что означает флуоресценцию одного типа излучателя ^ форма). Для D формы флуоресцеина было выбрано значение рН 9,0.

а б

Рисунок - 20 Спектры поглощения и флуоресценции M (а) и D (б) ионных форм флуоресцеина в зависимости от волнового числа.

Спектры поглощения и флуоресценции M и D ионных форм флуоресцеина были построены в зеркальных координатах [38] для нахождения волнового числа

чисто электронного перехода У,М|, см-1 (Рисунок 20). Перевод спектров поглощения и флуоресценции выполнен по формулам (1.6 и 1.7). Для D формы (Рисунок 20б)

красителя величина л/° ° составила 19900 см-1 ±100 см-1, что является близким в пределах ошибки с опубликованными данными [139]. Для M формы (Рисунок 20а)

флуоресцеина у°-0 составила 20300 см-1, что является идентичным значением, что и для Q формы. По формуле (1.16) было найдено значение pK*aMD, которое составило 5,47 при ДpKaMD 0,84. Данное значение использовано в моделировании. Волновые числа чисто электронного перехода и результат расчета через цикл Фёрстера (1.16) для всех ступеней диссоциации, представлены в таблице 4:

Таблица 4 - Значение констант ионного равновесия в основном и возбужденном состояниях для разных ступеней диссоциации флуоресцеина.

Ионная форма Положение 0-0 перехода, 104 см-1 Равновесие Р^ [9] Др^" р^

C 2,21 с-0 3,20 3,80 -0,60

2,03 0-м 3,27 0,03 3,30

Z 2,21* с^ 3,01 -0,09 3,10

м 2,03* Z-M 3,46 3,96 -0,50

D 1,99 м-о 6,31 0,84 5,47

* - Волновые числа 0-0 переходов Z и М- форм были получены в предположении подобия

хромофорных групп Z и С- форм, а также Q и М-форм [9] ** - Рассчитано из цикла Фёрстера (1.16) Отмечены результаты, полученные впервые

Наибольшая разница между показателями равновесия в основном и возбужденном состояниях (ДpKa) составила 3,80 и 3,96, для C-Q и Z-M ступеней диссоциации соответственно. Близким к единице было значение ДpKa для M-Dступени диссоциации. Положительное значение ДpKa свидетельствует об эффективной диссо-

циации протона и фотокислом поведении красителя на данной ступени диссоциации. Низкие значения ДрКа для Р-М и С-7 ступеней диссоциации свидетельствуют о низкой вероятности переноса протона на данных ступенях.

2.3 Верификация модели населенностей ионных форм флуоресцеина в основном возбужденном состояниях

Для верификации модели были выполнены расчеты населенностей ионных форм в основном состоянии в широком диапазоне рН (Рисунок 21) с учетом известных показателей констант ионного равновесия для основного состояния (Таблица 2). Результат расчетов полностью совпал с результатами для всех ионных форм, полученными ранее методами спектрофотометрического титрования [9]. Результат расчетов подтвердил, что практически во всем диапазоне рН краситель существует в виде смеси ионных форм.

Рисунок 21 - Зависимость населенностей ионных форм флуоресцеина от рН в основном состоянии.

Дополнительная верификация программы заключается в совпадении предсказанного рН, при котором в результате установления равновесия формируется преимущественно излучатели одного типа (М и Р форма флуоресцеина). Так, в работе [9], авторами были выбраны значения рН 4,5 и 1,6 для М и Р форм, соответственно, а флуоресцентные времена жизни приняли значения 3,37 и 2,97 нс для М

и Р форм. Данные значения были взяты для первичной итерации моделирования. Для С и Э форм флуоресцеина были взяты значения 3,5 нс [8] и 4,1 нс [9]. Дальнейшие итерации моделирования подтвердили слабую зависимость населенности ионных форм в возбужденном состоянии при вариации флуоресцентных времен жизни Р и М-форм в диапазоне 3^3,5 нс.

Зависимость распределения населенности возбужденных состояний от длины волны возбуждения можно показать на примере результата расчета для двух длин волн возбуждения 488 нм (поглощает преимущественно Э форма) и 435 нм (поглощает преимущественно М и Р форма). В модель были подставлены константы, найденные в разделе 2.2 и [9], вероятности перехода поглощательного, из-лучательного процессов и вероятность изменения ионной формы в следствие переноса протона (таблица 2 и [8,9]).

Рисунок - 22 Моделирование населенности ионных форм в возбужденном состоянии при длинах волн возбуждения 435 и 488 нм [26].

На Рисунке 22, представлено моделирование населенности ионных форм в возбужденном состоянии при длинах волн возбуждения 435 и 488 нм. Различная эффективность возбуждения ионных форм с различными спектрами поглощения (Рисунок 7) и перенос протона в возбужденном состоянии формируют распределе-

ние населенностей в возбужденном состоянии, которое отличается от распределения населенностей в основном состоянии (Рисунок 21). Это распределение зависит не только от рН, но и от длины волны возбуждения. Из графика можно заметить, что населенность Ъ формы флуоресцеина в возбужденном состоянии находится на уровне нуля, что подтверждает результаты [139].

Результаты моделирования показали существование таких рН, при которых преимущественно существуют «чистые» ионные формы в возбужденном состоянии. Для С, Р, М и Б условия кислотности раствора: 6,7М Н2304, рН 1,3, рН 4,4 и рН 9,0, соответственно. Эти условия подходят для обоих длин волн возбуждения -435 и 488 нм. Это значит, что в эксперименте не должна присутствовать зависимость формы спектра флуоресценции от длины волны возбуждения, что нами было показано для значений при рН 1,3 и рН 4,4 в диапазоне длин волн возбуждения 435-490 нм (Рисунок 23 а,б).

Длина волны а

Длина волны, б

Рисунок 23 - Спектры флуоресценции раствора флуоресцеина при рН 1,3 (а) и рН 4,4(б) при длинах волн возбуждения 435-490 нм.

Форма спектров флуоресценции при рН 1,3 не зависит длины волны возбуждения в диапазоне 435-490 нм, что свидетельствует о том, что в растворе после протекания всех быстрых процессов, сформировался излучатель одного типа (Р форма флуоресцеина) в возбужденном состоянии (Рисунок 23 а). Форма спектра флуоресценции, выделенного из экспериментально измеренных диапазоне рН

(6,7M H2SO4 ^ pH 3,5), методом Аленцева-Фока (Рисунок 18) и измеренного при pH 1,3, найденного из моделирования населенностей в возбужденном состоянии, полностью совпадают.

Измеренная форма спектра флуоресценции Б формы при pH 9,0 (Рисунок 20 б), соответствует результатам, предоставленным в [8,139]. Форма спектра для М формы до сих пор не была определена из-за процессов, происходящих в возбужденном состоянии (см. раздел 1.4). Благодаря моделированию населенностей в возбужденном состоянии, удалось провести эксперимент для получения спектра флуоресценции М формы флуоресцеина (Рисунок 23 б). Форма спектров флуоресценции практически не зависит от длины волны возбуждения. При возбуждении на 490 нм увеличивается доля дианионной формы с высоким квантовым выходом, что проявляется в уменьшении плеча в красной области спектра. Спектром флуоресценции М ионной формы флуоресцеина является усредненный спектр без влияния Б ионной формы. Неизменность формы спектров флуоресценции при вариации длины волны возбуждения, подтверждают существование значений рН, найденных в моделировании, при которых происходит флуоресценция «чистых» ионных форм. Модель может быть использована для планирования новых экспериментов.

На Рисунке 24 представлены спектры флуоресценции ионных форм флуо-ресцеина, из которых С, Р, М получены впервые, а Б полностью совпадает с опубликованными результатами:

Длина волны,

Рисунок 24 - Спектры флуоресценции ионных форм флуоресцеина.

Из Рисунка 24 можно увидеть, что спектр флуоресценции D формы сильно перекрывается спектрами M и Q форм. M и D формы имеют одинаковые значения максимумов флуоресценции - 513 нм, максимум флуоресценции Q формы - 518 нм. Формы спектров Q и M форм являются схожими, однако имеют различия в плече в красной области спектра, это свидетельствует о различной вибронной структуре уровней энергии, несмотря на одинаковую хромофорную группу (Рисунок 4). Максимум флуоресценции C формы принимает значение 478 нм. Сильное перекрытие полученных спектров еще раз подчеркивает сложность задачи их разделения при отсутствии очевидных условий наблюдения «чистых» контуров.

2.4 Радиационные, флуоресцентные времена жизни и квантовые выходы ионных форм флуоресцеина

В предыдущем разделе были найдены значения pH, при которых преимущественно излучают «чистые» формы флуоресцеина. С целью нахождения характерных времен жизни для каждой ионной формы, нами были измерены средние флуоресцентные времена жизни при условиях: 6,7M H2SO4 (C), pH 1,3 (Q), pH 4,4 (M), pH 9,0 (D) (Рисунок 25).

Флуоресцентные времена жизни (тфл) для ионных форм флуоресцеина были измерены при pH 1,3 для Q формы красителя и концентрации 6,7 M серной кислоты в растворе для C формы, при преимущественном возбуждении для Q и C форм на 453 нм и 407 нм, соответственно (Рисунок 7).

1,0

0,8

0,6

о 0,4 к

о 0,2

0,0

1 /-1 * *

. 1 • • 1 • * » I ' 1 -$ .

■ \ / ■ , * 1 1 ' 1 9 1 - - С

- !\ / \ ' 1 ' \ * ' ' ' —о ; -

1 1 | • 1 V 1 4

¡]\ \ 1 1 ' • • • • м

-7 \ * \ ' —о ; •

7 * \ ' • \ ' » 1

! \ • \ ^ ' •

": \ \ 1 ' \ 1 ' •

• ! \ • \ 1 ' V»'

^—1—-и" ^-т- —'ГГ ■ » -. - -«г —Д-

4,25

4,00

3,75

Л

V

3,50 о

3,25

3,00

0

8

РН

Рисунок 25 - Нормированная населенность ионных форм флуоресцеина в возбужденном состоянии (линии) и средние флуоресцентные времена жизни (символы) в широком диапазоне рН [22].

Средние флуоресцентные времена жизни, полученные в данных условиях, отнесены к Тфл для С и Р форм флуоресцеина и приняли значения 3,55 и 3,00, соответственно (рисунок 25). Значения для Р формы является близким к опубликованным [9], для С формы, флуоресцентное время Тфл нами было уточнено, ранее оно было определено в диапазоне 3,5-4,4 нс [8]. Обратные величины флуоресцентного времени жизни (вероятность излучательного процесса кфл) были добавлены в модель для применения кинетического подхода, константы представлены в таблице 3.

Измерено среднее флуоресцентное время жизни для Э формы при возбуждении на 490 нм вблизи максимума поглощения. Время жизни приняло значение 4,1 нс (Рисунок 25), что является близким к опубликованным [9]. Было измерено среднее флуоресцентное время жизни при рН 4,4 и возбуждении на 453 нм вблизи максимума поглощения М формы. Время жизни приняло значение 3,3 нс. Ранние опубликованные значения лежат в диапазоне 3,0-3,7 нс [7,9,108]. Такой диапазон времен можно объяснить выбором экспериментальных условий. При изменении длины волны возбуждения или рН можно достичь увеличения Э формы флуоресцеина, что завышает значение среднего Тфл из-за высокого собственного значения времени

жизни (4,1 нс). С другой стороны, изменениями условий измерения можно добиться увеличения доли Р ионной формы красителя, что уменьшит среднее значение регистрируемого флуоресцентного времени жизни.

Имея информацию о форме спектров флуоресценции, появляется возможность расчета радиационного времени жизни Трад (1.4) [22] через формулу Стри-клера-Берга [37]. Показатели преломления для растворов серной кислоты различной концентрации были взяты из [140]. Радиационное время жизни для С и Р форм флуоресцеина принимают значения 3,85 нс и 7,13 нс, соответственно. Радиационное времена жизни трад для М и Б форм флуоресцеина приняли значения 7,17 нс и 4,41 нс соответственно.

Квантовый выход (ф) флуоресценции С и Р форм красителя находился по формуле (1.5). Он составил 0,92±0,07 и 0,42±0,04 для С и Р форм флуоресцеина. Квантовый выход для С формы является близким с данными 0,9-1 [8], для Р формы наиболее близкое с полученным в данной работе, опубликованное значение 0,29 [9]. Эта величина оказывается ниже полученного нами значения с учетом ошибки определения квантового выхода (0,04).

Квантовый выход (ф) флуоресценции М и Б форм красителя также находился по формуле (1.5). Квантовый выход флуоресценции составил 0,46±0,05 и 0,93±0,06 для М и Б форм флуоресцеина [22]. Квантовый выход для Б формы является идентичным с данными 0,93 [9], для Р формы наиболее близкое с полученным в данной работе, опубликованное значение 0,37 [7]. Эта величина оказывается ниже полученного нами значения с учетом ошибки определения квантового выхода (0,05). В таблице 5 представлены полученные в работе фотофизические характеристики ионных форм флуоресцеина и условия рН в которых наблюдаются излучение «чистых» ионных форм.

Таблица 5 - Фотофизические характеристики ионных форм флуоресцеина.

С 0 М Б*

ф 0,92±0,07 0,42±0,04 0,46±0,05 0,93±0,06

<тфл>±0,10, нс 3,55 3,00 3,30 4,10

рН (X) < 0 (400-435нм) 1,3 (435-490нм) 4,4 (435-490нм) 9,0 (435-490нм)

^Подтверждение и дополнение результатов [7,9,92]

Отмечены результаты, полученные впервые

Высокими квантовыми выходами обладают С и Б формы флуоресцеина, примерно в два раза ниже квантовый выход Р и М форм. Близкими квантовыми выходами в пределах ошибки обладают Р и М формы. Флуоресцентные времена жизни ионных форм флуоресцеина принимают значения в диапазоне 3,00^4,10 нс. Самое долгоживущие время жизни флуоресцентного состояния у Б формы. Самое короткое время жизни у Р формы, близкое к нему значение времени у М формы, но их разница является разрешимой. Волновые числа 0-0 перехода ионных форм флуоресцеина принимают значения в диапазоне 19900(Б)^22100(С) см-1. Волновые числа 0-0 перехода имеют идентичные значения для Р и М форм, когда как флуоресцентное время принимает значения 3,0 и 3,3 нс, для Р и М, несмотря на идентичную хромофорную группу (Рисунок 4).

Представленные в главе результаты свидетельствуют о том, что оценка квантового выхода относительным методом с учетом спектров поглощения и флуоресценции в одних условиях [141] является некорректным. Главной причиной этого является поглощение одного набора ионных форм, а излучение другого, вследствие переноса протона в возбужденном состоянии.

2.5 Направление и эффективность переноса протона в возбужденном состоянии для различных ступеней диссоциации красителя

С получением полной информации об ионных равновесиях в основном и возбужденном состояниях открывается возможность построения полной схемы про-

толитических равновесий и определение направлений переноса протона в возбужденном состоянии. Значения показателей констант ионного равновесия и направление переноса протона представлены на Рисунке 26.

Из рисунка видно, что эффективный перенос протона в возбужденном состоянии заключается в фотоотрыве протона от С с образованием р, от Ъ с образованием М, от М с образованием Б формы флуоресцеина. Это приводит к уменьшению величины показателя константы ионного равновесия в возбужденном состоянии указанных ступеней диссоциации по сравнению с основным состоянием на величину от 0,84 до 3,96. Флуоресцеин демонстрирует фотокислотные свойства.

Рисунок 26 - Показатели констант ионного равновесия в основном и возбужденном состояниях, зелеными стрелочками показано направление и эффективность переноса протона в возбужденном состоянии различных ступеней диссоциации флуоресцеина, перечеркнуты красным маловероятные процессы.

Сравнивая показатели константы ионного равновесия в основном и возбужденном состояниях для С-Р ступени диссоциации, где равновесная концентрация наблюдается на рН 3,2 в основном состоянии и - 0,60 для возбужденного состояния, можно сделать заключение, что получение флуоресценции чистой С формы затруднительно в отличие от Б формы, где необходима только щелочная среда при

pH > 9. Для получения флуоресценции C формы необходимо преимущественное возбуждение этой формы на длинах волн возбуждения 400-435 нм. Флуоресценция Z формы не наблюдается из-за эффективного переноса протона с образованием других форм. Показатели констант ионного равновесия в основном и возбужденном состояниях на Q-M ступени диссоциации имеют близкие значения, что свидетельствует об отсутствии переноса протона в возбужденном состоянии на данной ступени.

При рассмотрении флуоресцеина в качестве рН сенсора необходимо учитывать, что форма и интенсивность спектра излучения флуоресцеина зависят от ряда факторов: ^ рН, определяющего количество и вклад ионных форм в основном состоянии (Рисунок 21); и) длины волны возбуждения, влияющей на эффективность поглощения света этими формами (Рисунок 7); ш) переноса протона в возбужденном состоянии, формирующего перераспределение концентраций ионных форм в течение времени жизни возбужденных состояний; гу) формы спектра и квантового выхода возбужденных ионных форм, за которыми следуют перечисленные процессы (Рисунок 24).

65

Выводы к главе 2

В второй главе была подробно рассмотрена кинетическая модель населенности ионных форм флуоресцеина в основном и возбужденном состояниях. Были выявлены основные факторы, влияющие на форму и интенсивность спектра флуоресценции водных растворов флуоресцеина, а именно: pH, длина волны возбуждения, эффективность переноса протона в возбужденном состоянии, различный квантовый выход и перекрытие спектров флуоресценции.

Сочетанием моделирования и методов флуоресцентной спектроскопии (стационарная и время-разрешенная) определены ионные формы, ответственные за излучение красителя флуоресцеина в широком диапазоне pH. Получены фотофизические параметры ионных форм флуоресцеина в возбуждённом состоянии. Впервые разрешены спектры флуоресценции C, Q и M форм. Определены частоты 0-0 перехода C, Q и M форм, 22100 см-1, 20300 см-1, 20300 см-1 соответственно. Определены квантовые выходы C, Q и M форм, 0,92±0,07, 0,42±0,04 и 0,46±0,05 соответственно. Определены характерные временя жизни C, Q и M форм, 3,55±0,10 нс, 3,00±0,10 нс, 3,30±0,10 нс соответственно.

На основании цикла Фёрстера (1.16), оценены показатели констант ионного равновесия в возбужденном состоянии водных растворов флуоресцеина. для различных ступеней диссоциации, которые принимают значения: -0,60 для C^Q, 3,10 для C-^Z, -0,50 для Z^M, 3,30 для Q-^M, 5,47 для M-^D. Определены направления и эффективность переноса протона в возбужденном состоянии. Эффективный перенос протона в возбужденном состоянии заключается в фотоотрыве протона от C с образованием Q, от Z с образованием M, от M с образованием D флуо-ресцеина. Это приводит к уменьшению величины показателя константы ионного равновесия в возбужденном состоянии указанных ступеней диссоциации по сравнению с основным состоянием на величину от 0,84 до 3,96. Для красителя характерен фотоотрыв протона на всех ступенях диссоциации, что характеризует его как фотокислоту.

Глава 3 Температурная зависимость ратиометрического флуоресцентного сигнала флуоресцеина

3.1 Температурная зависимость спектров поглощения водных растворов флуоресцеина

Для оценки температурного влияния на излучение красителя в физиологическом диапазоне рН (5-8) (М-0 ступени диссоциации), были измерены спектры поглощения растворов флуоресцеина при рН 6,0 и 6,5 в диапазоне температур 283-353К. Для поддержания постоянного рН был выбран фосфатный буфер с высокой концентрацией фосфат ионов (1М). Неизменность рН буфера данной концентрации при изменении температуры подтверждается работой [142], дополнительно был проведен эксперимент с нагреванием раствора и измерением кислотности среды электродным рН метром.

Длина волны

а

б

Рисунок 27 - Спектры поглощения растворов флуоресцеина при рН 6,5 (а) и 6,0 (б) в диапазоне температур 283-353К

При повышении температуры раствора флуоресцеина, в спектрах поглощения происходит батохромный сдвиг и изменение их формы для обоих рН, при рН 6,5 происходит увеличение пика поглощения (Рисунок 27 а). В эксперименте для рН 6,0 (Рисунок 27б) данного эффекта не наблюдается, при начальной и конечной

температуре эксперимента, амплитуда спектров поглощения близка. Были измерены спектры поглощения водных растворов флуоресцеина при pH 5,0 (преимущественное поглощение M формы) и pH 11,0 (преимущественное поглощение Б формы) [9] при разных температурах. Как можно заметить на Рисунке 28, спектры поглощения отдельных ионных форм демонстрируют уменьшение максимума оптической плотности и уширение спектров. Наблюдаемые спектральные изменения в спектрах поглощения растворов флуоресцеина при рН 6,0 и 6,5 (Рисунок 27 а,б) являются не только результатом температурных воздействий на два ионных компонента (уменьшение оптической плотности в спектрах поглощения отдельных ионных форм), но и говорят о перераспределении долей между ионными формами (смещении ионного равновесия).

0,25

U.UUi-i-1-i-1---1

400 450 500 550

Длина волны, нм

Рисунок 28 - Спектры поглощения растворов флуоресцеина при pH 5,0 (M) и 11,0 (D) в диапазоне температур 283^353К [16].

Для количественной оценки смещения ионного равновесия были рассчитаны показатели констант ионного равновесия pKa флуоресцеина при различных температурах. В основе расчета лежали амплитуды, полученные из разложения спектров поглощения водных растворов флуоресцеина при рН 6,5 и 6,0 на спектры компонент M и D форм при соответствующих температурах:

ц = № + ^М, (3.1)

где N и N2 - амплитуды компонент Э и М ионных форм красителя соответственно (Рисунок 29). Разложение спектра поглощения смеси форм флуоресцеина при рН 6,5 и 6,0 на компоненты Э и М форм, было выполнено с использованием алгоритма нелинейной аппроксимации Левенберга-Марквардта. Пример разложения спектра поглощения флуоресцеина при рН 6,5 и температуре 298К представлен на рисунке 29.

Длина волны,

Рисунок 29 - Пример разложения измеренного спектра при рН 6,5 температуре 298К (ц) на две компоненты спектров поглощения Э (Р1) и М (Р2) ионных форм флуоресцеина. Пунктиром показана аппроксимированная кривая [16,19].

Амплитуды N и N были скорректированы на различную экстинкцию для М (32200М-1см-1) и Э (88000М-1см-1) форм [9]. Коррекция происходила согласно системе:

82 N2

8! К!

Р1 + Р2 = 1

(3.2)

где Р1 и Р2 - амплитуды Э и М ионных форм красителя с учетом молярного десятичного коэффициента экстинкции е^.

В первом выражении учитывается различная экстинкция Б и М форм, е1 и е2 соответственно. Второе выражение определяет отсутствие в разлагаемом спектре ц контуров других кроме Б и М форм. Делая замену в первом уравнении через второе (Р1 или Р2), становится возможным нахождение амплитуд Р1 и Р2.

Показатели констант ионного равновесия были рассчитаны по формуле (1.12) с учетом амплитуд Р1 и Р2 для форм Б и М флуоресцеина. В формуле (1.12) вместо долей Б и М форм были подставлены амплитуды Р1 и Р2 напрямую. Формула 1.12 в новых обозначениях выглядит как:

p K =-lg

[ P ][H*]

[P ]

(3.3)

Для успешного разделения были использованы спектры поглощения M и D, которые были получены при рН 5,0 и 11,0 при соответствующих температурах раствора. Хотя концентрация M достигает максимума при рН 5, доля D и Z ионов флуоресцеина остается около 3% и 4% соответственно [9]. Чтобы учесть присутствие указанных форм флуоресцеина были скорректированы измеренные спектры поглощения при рН 5,0 путем вычитания соответствующих спектральных вкладов перед дальнейшей обработкой данных. Коэффициенты молярной экстинкции sx, [9] были использованы для пересчета амплитуд спектров в [P1] и [Р2]. Качество аппроксимации экспериментального контура суммой двух контуров определялось значением R2>0,998.

Было обнаружено, что pKa для pH 6,0 уменьшилось с 6,63 до 6,37, для pH 6,5 уменьшилось с 6,52 до 6,25 при увеличении температуры. В исследованном диапазоне температур A pKa temp (разница показателей констант равновесий в основном состоянии при температурах 283 и 353К) составило 0,26±0,01 и 0,27±0,01 для pH 6,0 и pH 6,5, соответственно [23]. Близкое значение A pKa temp , полученное для разных условий эксперимента, оказалось ожидаемым, поскольку является характеристикой M-D ступени диссоциации флуоресцеина в целом. Данное смещение pKa

означает увеличение доли Э ионной формы флуоресцеина с увеличением температуры, что и приводит к увеличению оптической плотности (Рисунок 27а) из-за высокой экстинкции Э формы [9].

Рисунок 30 - График Вант-Гоффа для определения изменения молярной энтальпии реакции переноса протона (ДН) флуоресцеина в буфере при рН 6,5 (круглые символы) при рН 6,0 (квадратные символы) [16].

В соответствии с уравнением Вант-Гоффа (1.17) [104] была проанализирована зависимость - 1п Ка (1/Т) (Рисунок 30) и определено изменение молярной энтальпии реакции диссоциации протона на М-Э ступени диссоциации ДГН.

Для рН 6,5 было получено значение ДН = 7,4±0,4 кДжмоль-1, для рН 6,0 значение ДГН = 7,3±0,4 кДжмоль-1. Реакция диссоциации (переноса) протона в основном состоянии является эндотермической. Значения для разных рН оказались ожидаемо одинаковы в пределах ошибки. Оба значения несколько ниже ранее опубликованного значения (9,6 кДжмоль-1 [7]), однако авторами не были указаны условия в которых было получено данное значения, среди которых важную роль играет, например, состава буфера.

3.2 Температурная зависимость спектров флуоресценции водных растворов флуоресцеина

3.2.1 Ратиометрический сигнал флуоресцеина в диапазоне рН 4^-8

Для нахождения оптимальных длин волн возбуждения и дальнейшего построения ратиометрического флуоресцентного сигнала (5), были проанализированы спектры поглощения растворов флуоресцеина в диапазоне рН 4-8, соответствующему М-Э ступени диссоциации флуоресцеина.

Длина волны, а б

Рисунок 31 - Спектры поглощения (а) и разностные спектры (б) растворов флуоресцеина при рН 4-8.

Из Рисунка 31 а видно уменьшение оптической плотности при уменьшении рН, это связано с увеличением доли М и Р ионных форм флуоресцеина, которые имеют меньшее значение молярного десятичного коэффициента экстинкции [9] по сравнению с Э формой. Наиболее оптимальными длинами волн возбуждения являются длины волн, которые имеют наибольшие различия по значению оптической плотности в разностных спектрах (Рисунок 31 б), что обеспечивает наибольшую чувствительной ратиометрического сигнала. Такими длинами волн являются 488 нм и 435 нм, которые обеспечивают преимущественное поглощение Э и М ионных форм флуоресцеина соответственно. Ратиометрический сигнал является безразмерным, не требует калибровки, является характеристикой самого вещества,

находящегося во взаимодействии с окружением [143]. В данной работе ратиомет-рический сигнал рассчитывается как отношение интегральных интенсивностей флуоресценции при возбуждении на 488 нм (I488) и 435 нм (I435):

т-488

£ =--(3-4)

у435 •

3.2.2 Спектры флуоресценции растворов флуоресцеина при рН 6,0 и 6,5

Спектры флуоресценции растворов флуоресцеина при рН 6,5 и 6,0 были измерены в диапазоне температур 283-353К (Рисунок 32 а,б).

Рисунок 32 - Спектры флуоресценции растворов флуоресцеина при рН 6,5 (а) и 6,0 (б) в диапазоне температур 283-353К при возбуждении 488 нм и 435 нм. Сплошные лини - цикл нагревания, пунктирные линии - охлаждения.

При увеличении температуры максимум спектра флуоресценции сдвигается батохромно для обоих рН. Амплитуда спектра флуоресценции увеличивается при возбуждении на 488 нм для обоих рН. При возбуждении на 435 нм для спектров флуоресценции при рН 6,5 интенсивность уменьшается, тогда как для рН 6,0 интенсивность увеличивается. Данное поведение в спектрах для рН 6,0 можно связать с изменением равновесия в основном состоянии (увеличением доли Э ионной формы флуоресцеина), которые обеспечивает различные начальные населенности ионных форм в основном состоянии. При охлаждении наблюдается реверсивность,

т.е. возвращение в исходное положение спектров (пунктир), что прослеживается для обоих рН.

Были рассчитаны 5 сигналы (3.4) для рН 6,0 и 6,5 в диапазоне температур 283-353К (Рисунок 33).

Рисунок 33 - Температурная зависимость ратиометрического (5) в диапазоне температур 283-353К для рН 6,5 и 6,0. Сплошные символы - цикл нагревания, не закрашенные символы -цикл охлаждения [17].

5 сигналы при рН 6,5 и 6,0 линейно зависят от температуры (К2>0,997). Несмотря на различные начальные значения сигналов, обусловленными различным рН раствора в экспериментах, дальнейший рост значений происходит благодаря идентичным величинам углового коэффициента в пределах ошибки: 1,53±0,03- Ю-2^1 и 1,54±0,03 - 10-2К-1. Различные тенденции изменения амплитуды спектров флуоресценции на длине волны возбуждения 435 нм (Рисунок 32 а,б) для рН 6,5 (уменьшение интенсивности) и 6,0 (увеличение интенсивности), не оказали влияния на угловые коэффициенты итоговых ратиометрических сигналов 5.

По аналогии с оценкой показателя константы ионного равновесия в основном состоянии проведена оценка изменения показателя в возбужденном состоянии (Др^*а ^р). Был произведен расчет через цикл Фёрстера (1.16), где использовались

значения показателей констант равновесий в основном состоянии при соответствующих температурах (p^a), а оценка волнового числа 0-0 перехода была произведена для каждой ионной формы отдельно. Для D формы флуоресцеина был использован раствор при pH 11 (спектры поглощения и флуоресценции), когда как для M формы были использованы pH 5,0, при измерении спектров поглощения и pH 4,4 при измерении спектров флуоресценции (см. раздел 2.3).

а б

Рисунок 34 - Температурная зависимость спектров поглощения и флуоресценции D (а) и M (б) ионных форм флуоресцеина в зависимости от волнового числа.

При увеличении температуры спектры флуоресценции и поглощения сдвигаются в область меньших значений волнового числа. Разница между волновыми

числами — Vq_0 в числителе формулы цикла Фёрстера (1.16) принимала значения от 400 см-1(283K) до 510 см-1 (353K). Значение показателя константы ионного равновесия в возбужденном состоянии уменьшилось с 5,86 (283К) до 5,54 (353К). Величина Ap^*a temp (разница показателей констант равновесий в возбужденном состоянии при температурах 283K и 353К) составила 0,28±0,4 для pH 6,0 и 0,27±0,4 для pH 6,5. При сравнении с результатом для основного состояния Ap^a temp 0,26±0,01 и 0,27±0,01 для pH 6,0 и pH 6,5, соответственно, можно сделать вывод, что сдвиг показателя ионного равновесия в возбужденном состоянии сонаправлен

со сдвигом показателя в основном состоянии, в пределах ошибки сдвиги имеют идентичные значения.

Оценка изменения квантового выхода D формы при нагревании показала незначительное уменьшение выхода (изменение не более 3%). Изменение в 3% входит в ошибку определения квантового выхода, поэтому данный эффект является незначительным. Оценка происходила относительным методом относительно квантового выхода ионной формы О - 0,93 при комнатной температуре.

3.2.3 Термометрические характеристики ратиометрического сигнала флуоресцеина в физиологическом диапазоне рН

Для оценки возможного применения ратиометрического сигнала в качестве оптического аналитического сигнала на локальное значение температуры были сделаны оценки принятых для этого термометрических величин. Были найдены термометрические характеристики ратиометрических сигналов 5 при рН 6,0 и рН 6,5 по формулам:

о ¿8

8а =-, (3.5)

алт

о 1 ¿8

8 =--, (3.6)

г 8 ЛТ

ЛТ = -1 ^, (3 7)

Абсолютная тепловая чувствительность (3.5), относительная тепловая чувствительность (3.6), тепловое разрешение (3.7) и сравнительные данные из литературных источников представлены в Таблице 6:

Таблица 6 - Термометрические характеристики для £ сигнала при pH 6,0 и 6,5 и литературные результаты.

10-2 К-1 £г, К 1 М, К

рН 6,0 1,54 0,35% 7

рН 6,5 1,53 0,33% 7

Результаты в статье [144] 2,30 0,61% 0,3-1,1

Полученные значения оказываются несколько ниже опубликованного аналога для субклеточного ратиометрического температурного датчика (МРуРР(ОН)2) в клетках СНО-К1 и HeLa в биологическом диапазоне температур (30-44°С) [144]. Тем не менее, существуют перспективы улучшения разрешения до 2К путем более тщательного контроля рН среды и выбора оптимальной длины волны возбуждения с учетом температурного сдвига спектра поглощения. Кроме того, флуоресцеин, в связи со своей низкой токсичностью, может использоваться как датчик стабильности температуры в режиме реального времени при проведении процедур и операций с термическим воздействием во избежание перегрева организма.

3.3 Моделирование температурной зависимости ратиометрического сигнала

В разделе 3.2.2 было показано увеличение ратиометрического флуоресцентного сигнала при увеличении температуры в диапазоне 283-353К. Это увеличение может быть обусловлено несколькими механизмами 1-1У (Рисунок 35):

I. изменение ионного равновесия в основном состоянии;

II. изменение ионного равновесия в возбужденном состоянии;

III. изменение квантового выхода флуоресценции ионных форм;

IV. изменение вероятности поглощения из-за температурного изменения формы спектра поглощения.

Рисунок 35 - Кинетическая схема фотопроцессов, протекающих в смеси ионных форм флуо-ресцеина рН 4-8 с указанием механизмов влияния на эффективность процессов.

Применение кинетической модели для описания населенностей в возбужденном и основном состояниях подробно описано в главе 2. В данном разделе модель была применена для выяснения вклада температурных процессов (I, II, III, IV), происходящих как в основном, так и в возбужденном состояниях в итоговый ратио-метрический сигнал.

Изменение равновесия в основном состоянии (I) в моделировании учитывается в виде изменения константы депротонирования (квм), которая является чувствительной к температуре. Среднее значение показателей констант равновесий в основном состоянии (р^амв), найденных в разделе 3.1 при рН 6,0 и 6,5 и одной температуре использовано для расчета константы депротонирования ком через формулу (2.1) при фиксированном значении константы протонирования кмо (Таблица 2).

Изменение равновесия в возбужденном состоянии (II) в моделировании также учитывается в виде изменения константы депротонирования (к*ом), которая является чувствительной к температуре. Среднее значение показателей констант равновесий в возбужденном состоянии (р^*дмв), найденных в разделе 3.2.2 при рН 6,0 и 6,5 и одной температуре использовано для расчета константы депротонирова-ния к*ом через формулу (2.1) при фиксированном значении константы протонирования к*мо (Таблица 2).

Фактор изменения вероятности поглощения из-за температурного изменения формы спектра поглощения учитывается в виде уменьшения значений стМ и ст^, из-

за уменьшения оптической плотности отдельных ионных форм при нагревании [16] (Рисунок 28).

В диапазоне рН 5-8, флуоресценция красителя преимущественно складывается из вклада флуоресценции М и D форм. £ сигнал был рассчитан на основании модели по формуле (3.8), учитывающей квантовый выход дианионной и анионной форм (фв, фм) и их населенность в возбужденном состоянии М*) при двух длинах волн возбуждения: