Влияние регуляторных элементов и структуры кодонов на экспрессию бактериальной формиатдегидрогеназы в клетках E. coli тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, кандидат химических наук Савицкий, Павел Александрович

• Савицкий, Павел Александрович
• кандидат химических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат химических наук Савицкий, Павел Александрович

I. ВВЕДЕНИЕ.

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава 1. ЭКСПРЕССИЯ ЧУЖЕРОДНЫХ ГЕНОВ В КЛЕТКАХ Е. coli.

1.1. Структура векторов Е. coli, обеспечивающих эффективную экспрессию.

1.2. Регуляция транскрипции.

1.2.1. Промоторы.

1.2.2. Терминаторы транскрипции.

1.2.3. Антитерминаторы транскрипции.

1.2.4. Системы экспрессии со строгой регуляцией промотора.

1.3. Регуляция трансляции.

1.3.1. Инициация трансляции мРНК.

1.3.2. Усилители трансляции.

1.3.3. Стабильность мРНК.

1.3.4. Терминация трансляции.

1.4. Внутриклеточная локализация экспрессируемых белков.

1.4.1. Цитоплазматическая локализация.

1.4.2. Секреция в периплазму.

1.4.3. Секреция в среду культивирования.

1.5. Частота использования ко донов в чужеродном гене и в клетках Е. coli.

1.6. Протеолиз экспрессируемых белков.

1.7. Условия культивирования бактерий.

Глава 2. СТРУКТУРА ГЕНА ФОРМИАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ И

ПРИЛЕГАЮЩИХ К НЕМУ ОБЛАСТЕЙ.

III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

Глава 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1. Материалы.

3.2. Методы исследования.

IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Глава 4. ОПТИМИЗАЦИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА

ФОРМИАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ.

4.1. Оптимизация экспрессии в системе TGl/pFDH6.

4.2. Оптимизация структуры ко донов в гене формиатдегидрогеназы.

4.3. Оптимизация рибосомсвязывающего участка.

4.4. Оптимизация промоторного участка гена формиатдегидрогеназы.

4.5. Оптимизация условий культивирования клеток Е. coli BL21(DE3)/plysS/pFDH8.

4.6. Увеличение стабильности суперэкспрессирующих формиатдегидрогеназу векторов.

4.7. Объединение в одном векторе оптимизированных регуляторных элементов и оптимизированной структуры гена.

V. ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Влияние регуляторных элементов и структуры кодонов на экспрессию бактериальной формиатдегидрогеназы в клетках E. coli»

Бурное развитие в последние годы методов генетической инженерии позволило клонировать огромное количество генов различных белков из самых разных источников - от бактерий до млекопитающих. Это позволяет изучать белки на новом уровне, который был недоступен ранее: стало возможным изучение взаимосвязи структуры и функции белков, выявление их механизма действия, выяснение роли отдельных аминокислотных остатков в катализе, получение с помощью направленного мутагенеза мутантных белков. Однако, достаточно часто при попытках экспрессии клонированного гена в клетках Е. coli не удается получить больших количеств целевого белка. Нередки случаи, когда клонированный белок вообще не синтезируется клетками Е. coli. Ограничение уровня экспрессии может происходить на всех стадиях биосинтеза белка: транскрипции гена, трансляции матричной РНК и сворачивания полипептидной цепи в трехмерную структуру (фолдинга).

В нашей лаборатории ведутся работы с NAD-зависимой формиатдегидрогеназой (КФ 1.2.1.2., ФДГ) из метилотрофных бактерий рода Pseudomonas, окисляющей формиат-ион до СО2 и при этом восстанавливающей NAD+ в NADH. Этот фермент интересен как с теоретической, так и с практической точек зрения. С теоретической точки зрения этот фермент интересен тем, что является наиболее простым представителем суперсемейства дегидрогеназ 2-0-гидроксикислот. Реакция, катализируемая формиатдегидрогеназой, самая простая среди всего семейства дегидрогеназ и может служить модельной при изучении механизма ферментативного переноса гидрид-иона от атома углерода субстрата к С4-атому никотинамидного кольца кофермента. С практической точки зрения формиатдегидрогеназа также чрезвычайно важна, так как является наилучшим ферментом для системы регенерации NADH. Реакция, катализируемая формиатдегидрогеназой, необратима, восстановление NAD+ можно проводить без его выделения из реакционной среды. Однако, формиатдегидрогеназы из разных источников обладают разной стабильностью и разными кинетическими параметрами. Наиболее высокой удельной активностью и стабильностью среди всех известных к настоящему моменту формиатдегидрогеназ обладает ФДГ из метилотрофных бактерий Pseudomonas sp. 101. В частности, по своей стабильности она поевосходит аналогичные (Ьеоменты из дюожжей минимум в

Л. ' • л- Л- ■ 'JL

1000 раз. Ген этого фермента был клонирован и экспрессирован в клетках Е. coli [1]. Было показано, что в результате отсутствия посттрансляционной модификации в клетках Е. coli рекомбинантная формиатдегидрогеназа по своим кинетическим параметрам превосходит исходный фермент, выделенный из Pseudomonas sp. 101 [2]. В результате направленного мутагенеза был получен фермент, специфичный к NADP+ [3]. Однако, уровень экспрессии формиатдегидрогеназы в клетках Е. coli достаточно низок и не превышает 5-7% даже при использовании высокоэффективных систем на основе промоторов lac и tac [1]. Кроме того, скорость биосинтеза очень низка, примерно в 5 раз ниже, чем для белков из Е. coli. Таким образом актуальной задачей является разработка генноинженерных конструкций, обеспечивающих получение нативной и мутантных форм формиатдегидрогеназы в больших количествах.

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Глава 1.

ЭКСПРЕССИЯ ЧУЖЕРОДНЫХ ГЕНОВ В КЛЕТКАХ Е. coli.

Выбор системы экспрессии для промышленного получения целевого белка зависит от многих факторов, включающих в себя тип организма, синтезирующего целевой белок, необходимый уровень экспрессии, внутриклеточную локализацию белка, его посттрансляционную модификацию, биологическую активность и требуемую степень очистки. Кроме этого, выбор системы экспрессии в каждом конкретном случае зависит еще и от такого фактора, как стоимость процесса в целом, которая включает в себя стоимость химических реактивов, стоимость оборудования и затраченной электроэнергии, а также стоимость очистки целевого белка. Последний фактор играет очень важную роль при производстве пептидов, белков и ферментов, применяемых в медицине. В этом случает простая и дешевая система экспрессии в клетках Escherichia coli в результате последующей очистки целевого продукта оказывается более дорогой, чем система экспрессии в клетках млекопитающих. Дело в том, что все грамм-отрицательные бактерии, к которым принадлежит и Escherichia coli, синтезируют эндотоксин - липосахарид, являющийся компонентом внешней бактериальной мембраны. Эндотоксин является очень токсичным для людей соединением, его допустимая доза составляет 5*10"10 г/кг/час. Существующие в настоящее время системы очистки от эндотоксина дороги, что и приводит к резкому увеличению стоимости полученных в Е. coli фармацевтических препаратов. Однако, в том случае, когда высокая степень очистки целевого белка не требуется, например при производстве ферментов для целей биотехнологии, система экспрессии в Escherichia coli оказывается наиболее приемлемой среди множества остальных.

Несмотря на бурный прогресс в изучении генетики и молекулярной биологии Escherichia coli, попытки экспрессии чужеродного гена в этом организме не всегда приводят к успеху. Это может быть связано с уникальными структурными особенностями последовательности гена, стабильностью мРНК и эффективностью ее трансляции, фолдингом белка, его деградацией под действием клеточных протеаз, различием в частоте использования кодонов в клонированном гене ив Е. coli, а также возможной токсичностью целевого белка для клетки-хозяина. Существует, однако, несколько правил, которыми следует руководствоваться при разработке системы экспрессии целевого белка в Е. coli. Главными чертами Е. coli как штамма-хозяина являются практически полная неспособность осуществлять посттрансляционную модификацию, происходящую в эукариотических клетках, практически полная неспособность секретировать белки в культуральную среду и ограниченная способность образовывать дисульфидные связи. С другой стороны, многие гликозилированные в природе белки сохраняют свою биологическую активность и в негликозилированной форме и, таким образом, могут быть получены в Е. coli. Кроме того, в последнее время достигнут прогресс в создании штаммов Е. coli, способных осуществлять образование дисульфидных связей и секрецию целевого белка в культуральную среду.

Целью настоящего обзора литературы является анализ опубликованных к настоящему времени данных по экспрессии клонированных белков в Е. coli с целью выявления экспериментальных подходов, позволяющих достичь суперпродукции целевого белка.

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Савицкий, Павел Александрович

V. выводы.

1. Оптимизированы состав среды и условия культивирования рекомбинантного штамма Е. coli TGI, содержащего плазмиду pFDH6 с геном NAD -зависимой ФДГ из Pseudomonas sp.101. Выход рекомбинантного фермента увеличился в 2 раза, содержание ФДГ в клетках достигло 200 единиц на грамм сухой биомассы и составило около 10% общего растворимого клеточного белка.

2. На основании данных о частоте использования кодонов в клетках Е. coli и Pseudomonas sp.101 проведен анализ структуры кодонов гена ФДГ и выявлены возможные трансляционные паузы при синтезе ФДГ в этих организмах. Показано неслучайное расположение пауз, предсказанных на основе частоты использования кодонов в Pseudomonas sp.101. Показано, что эти паузы расположены после участков, образующих супервторичные структуры в ФДГ, и сделан вывод о том, что они необходимы для правильного сворачивания белковой глобулы. Результаты анализа также свидетельствуют, что при синтезе ФДГ в клетках Е. coli существуют три дополнительные трансляционные паузы, отсутствующие в исходном штамме Pseudomonas sp. 101.

3. Проведены эксперименты по замене ряда кодонов внутри этих трех трансляционных пауз на кодоны, оптимальные для клеток Е. coli, что обеспечило значительное увеличение скорости синтеза ФДГ. Во всех трех случаях синтезировался полностью активный фермент. Замена на оптимальные кодоны для остатков Lys2 и Val3 привела к 2-х кратному увеличению уровня экспрессии ФДГ по сравнению с природным геном.

4. Оптимизирована структуры рибосомсвязывающего участка перед геном ФДГ. Получено 6 новых плазмид, содержащих различные последовательности рибосомсвязывающего участка. Наибольшее увеличение экспрессии (в 2 раза) получено в случае использования рибосомсвязывающего участка гена 10 фага Т7. Объединение этого участка с оптимизацией структуры кодонов для остатков Lys2 и Val3 в одном векторе привело к увеличению экспрессии ФДГ в 2,8 раза.

5. Оптимизирован промоторный участок перед геном ФДГ и изучено влияние копийности экспрессионного вектора на уровень биосинтеза формиатдегидрогеназы в клетках Е. coli. Наилучший результат получен при использовании позднего промотора фага Т7 и низкокопийного вектора на основе плазмиды pBR322. Уровень экспрессии увеличился в 3 раза по сравнению с ранее использованным тандемом промоторов lac и tac в высокопийном векторе на основе плазмиды pUC19.

6. Изучено влияние среды и условий культивирования рекомбинантных штаммов Е. coli, сконструированных на основе полученных в данной работе векторов, на уровень биосинтеза рекомбинантной ФДГ. Показано, что на экспрессию ФДГ оказывают сильное влияние такие параметры, как температура и время культивирования, состав среды, тип индуктора и условия индукции биосинтеза ФДГ. Оптимизация этих параметров позволила увеличить удельное содержание в 2 раза и общий выход ФДГ до 10 раз для всех типов векторов. Наилучший вектор pFDH8 обеспечивал уровень экспрессии ФДГ более 50-55% от всех растворимых белков в клетке и выход рекомбинантного белка 68000 единиц (более 4 г) с литра среды по сравнению с соответствующими параметрами 10% от растворимых белков и 1800 единиц (110 мг) с литра для исходного вектора pFDH6.

7. Показано, что объединение всех оптимизированных регуляторных участков и гена ФДГ с оптимизированной структурой кодонов в один экспрессионный вектор приводит к значительному увеличению скорости синтеза ФДГ в клетках Е. coli. Удельное содержание ФДГ при этом увеличилось незначительно, что, по-видимому, связано с достижением максимального (до 55-60% от растворимых белков клетки) для данного фермента уровня биосинтеза.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Савицкий, Павел Александрович, 1999 год

1. Тишков В.И., Галкин А.Г., Егоров A.M. NAD-зависимая формиатдегидрогеназа метилотрофных бактерий Pseudomonas sp.101: клонирование, экспрессия и изучение структуры гена. (1991) Докл. АН СССР, т.317, стр.345-348

2. Тишков В.И., Галкин А.Г., Гладышев В.Н., Карзанов В.В., Егоров A.M. Анализ структурной части гена, оптимизация экспрессии в Е. coli и свойства рекомоинантной формиатдегидрогеназы бактерий Pseudomonas sp.101. (1992) Биотехнология, т.5, стр.52-59

3. Тишков В.И. Структура, механизм действия и белковая инженерия NAD-зависимой формиатдегидрогеназы. (1993) Дисс. док. хим. наук, М., МГУ

4. Balbas P., Bolivar F. Design and construction of expression plasmid vectors in Escherichia coli. (1990) Methods Enzymol., v. 185, p. 14-37

5. Das A. Overproduction of proteins in Escherichia coli: vectors, hosts. (1990) Methods Enzymol., v. 182, p.93-112

6. Studier F.W., Rosenberg A.H., Dunn J.J., Dubendorf J.W. Use of T7 RNApolymerase to direct expression of cloned genes. (1990) Methods Enzymol., v. 185, p.60-89

7. Yansura D.G., Heaner D.J. Use of Escherichia coli trp promoter for direct expression of proteins. (1990) Methods Enzymol., v. 185, p.54-60

8. Huttenhofer A., Noller H.F. Footprinting mRNA-ribosome complexes with chemical probes. (1994) EMBO J., v. 13, p.3892-3901.

9. Shine J., Dalgarno L. The S'-terminal sequence of Escherichia coli 16S ribosomal RNA: complementarity to nonsense triplets and ribosome binding sites. (1974) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v.71, p. 1342-1346

10. Chen H.Y., Bjerknes M., Kumar R., Jay E. Determination of the optimal aligned spacing between the Shine-Dalgarno sequence and the translation initiation codon of Escherichia coli mRNAs. (1994) Nucleic Acids Res., v.22, p.4953-4957

11. Schneider T.D., Stormo G.D., Gold L., Ehrenfeucht A. Information content of binding sites on nucleotide sequences. (1986) J. Mol. Biol., v. 188, p.415-431

12. Gold L., Stormo G.D. High-level translation initiation. (1990) Methods Enzymol., v. 185, p.89-93.

13. Backman K., Ptashne M. Maximizing gene expression on a plasmid using recombination in vitro. (1978) Cell, v. 13, p.65-71

14. Ward G.A., Stover C.K., Moss В., Fuerst T.R. Stringent chemical and thermal regulation of recombinant gene expression by vaccinia virus vectors in mammalian cells. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v.92, p.6773-6777

15. Yabuta M., Onai-Miura S., Ohsuye K. Thermo-inducible expression of a recombinant fusion protein by Escherichia coli lac repressor mutants. (1995) J. Biotechnol., v.39, p.67-73

16. Ghrayeb J., Kimura H., Takahara M., Hsiung H., Masui Y., Inouye M. Secretion cloning vectors in Eschehchia coli. (1984) EMBO J., v.3, p.2437-2442

17. Inouye H., Michaelis S., Wright A., Beckwith J. Cloning and restriction mapping of the alkaline phosphatase structural gene (phoA) of Escherichia coli and generation of deletion mutants in vitro. (1981) J. Bacteriol., v. 146, p.668-675

18. Horii T., Ogawa T., Ogawa H. Organization of the recA gene of Escherichia coli. (1980) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, v.77, p.313-317.

19. Taylor A., Brown D.P., Kadam S., Maus M., Kohlbrenner W.E., Weigl D., Turon M.C., Katz L. High-level expression and purification of mature HIV-1 proteasein E^chprirhin roli under control nf the araBAD nromoter. (1992) Aool."" . . -j ^ v j

20. Microbiol. Biotechnol., v.37, p.205-210

21. Herbst B., Kneip S., Bremer E. pOSEX: vectors for osmotically controlled and finely tuned gene expression in Escherichia coli. (1994) Gene, v. 151, p. 137-142

22. Tunner J.R., Robertson C.R., Schippa S., Matin A. Use of glucose starvation to limit growth and induce protein production in Escherichia coli. (1992) Biotechnol. Bioeng., v.40, p.271-279

23. Skerra A. Use of the tetracycline promoter for the tightly regulated production of a murine antibody fragment in Escherichia coli. (1994) Gene, v. 151, p. 131-135

24. Chou C.H., Aristidou A.A., Meng S.Y., Bennett G.N., San K.Y. Characterization of a pH-inducible promoter system for high-level expression of recombinant proteins in Escherichia coli. (1995) Biotechnol. Bioeng., v.47, p.186-192

25. Amann E., Brosius J., Ptashne M. Vectors bearing a hybrid trp-luc promoter useful for regulated expression of cloned genes in Escherichia coli. (1983) Gene, v.25, p. 167-178

26. Bernard H.U., Remsut E., Hershfield M.V., Das H.K., Helinski D.R., Yanofsky C., Franklin N. Construction of plasmid cloning vehicles that promote gene expression from the bacteriophage lambda pi- promoter. (1979) Gene, v.5, p.59-76

27. Oppenheim A.B., Giladi H., Goldenberg D., Kobi S., Azar I. Vectors and transformed host cells for recombinant protein production at reduced temperatures. (1996) International patent application WO 96/03521,

28. Dubendorff J.W., Studier F.W. Controlling basal expression in an inducible T7 expression system by blocking the target T7 promoter with lac repressor. (1991) J. Mol. Biol., v.219, p.45-59.

29. Rosenberg M., Court D. Regulatory sequences involved in the promotion and termination of RNA transcription. (1979) Annu. Rev. Genet., v. 13, p. 319-353

30. Belasco J.G. mRNA degradation in prokaryotic cells: an overview. (1993) In J. G. Belasco and G. Brawerman (ed.), Control of messenger RNA stability. Academic Press, Inc., Sail Diego, Calif., p.3-12

31. Nordstrom K., Uhlin B.E. Runaway-replication plasmids as tools to produce large quantities of proteins from cloned genes in bacteria. (1992) Bio/Technology, v. 10, p.661-666

32. Vasquez J.R., Evnin L.B., Higaki J.N., Craik C.S. An expression system for trypsin. (1989) J. Cell. Biochem, v.39, p.265-276,

33. Doherty A.J., Connolly B.A., Wonall A.F. Overproduction of the toxic protein, bovine pancreatic DNasel, in Escherichia coli using a tightly controlled T7-promoter-based vector. (1993) Gene, v. 136, p.337-340

34. Wülfing C., Pluckthun A. A versatile and highly repressible Escherichia coli expression system based on invertible promoters: expression of a gene encoding a toxic product. (1993) Gene, v. 136, p. 199-203

35. O'Connor C.D., Timmis K.N. Highly repressible expression system for cloning genes that specify potentially toxic proteins. (1987) J. Bacteriol., v. 169, p.4457-4462

36. Thomas C.D., Modha J., Razzaq T.M., Cullis P.M., Rivett A.J. Controlled highlevel expression of the Ion gene of Escherichia coli allows overproduction of Lon protease. (1993) Gene, v. 136, p.237-242

37. Mertens N., Remaut K., Fiers W. Tight transcriptional control mechanism ensures stable high-level expression from T7 promoter-based expression plasmids. (1995) Bio/Technology, v. 13, p. 175-179

38. Lanzer M., Bujard H. Promoters largely determine the efficiency of repressor action. (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, v.85, p.8973-8977,

39. Figge J., Wright C., Collins C.J., Roberts T.M., Livingston D.M. Stringent regulation of stably integrated chloramphenicol acetyl transferase genes by E. coli lac repressor in monkey cells. (1988) Cell, v.52, p.713-722.

40. Bukrinsky M.I., Barsov E.V., Shilov A.A. Multicopy expression vector based on temperature-regulated lac repressor: expression of human immunodeficiency virus env gene in Escherichia coli. (1988) Gene, v.70, p.415-417

41. Giladi H., Goldenberg D., Koby S., Oppenheim A.B. Enhanced activity of the bacteriophage I PL promoter at low temperature. (1995) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, v.92, p.2184-2188.

42. San K.Y., Beanett G.N., Chou C.H., Aristidou A.A. An optimization study of a pH-inducible promoter system for high-level recombinant protein production in Eschehchia coli. (1994) Ann. N. Y. Acad. Sei., v.721, p.268-276

43. Milligan J.F., Grodke D.R., Witherell G.W., Uhlenbeck O.C. Oligonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA template. (1987) Nucleic Acids Res., v. 15, p.8783-8798

44. Hsu L.M., Giannini J.K., Leung T.W.C., Crosthwaite J.C. Upstream sequence activation of Escherichia coli argT promoter in vivo ana in vitro. (1991) Biochemistry, v.30, p.813-822

45. Adhya S., Gottesman M. Promoter occlusion: transcription through a promoter may inhibit its activity. (1982) Cell, v.29, p.939-944

46. Nishihara T., Iwabuchi T., Nohno T. A T7promoter vector with a transcriptional terminator for stringent expression of foreign genes. (1994) Gene, v. 145, p. 145146

47. Stueber D., Bujard H. Transcription from efficient promoters can interfere with plasmid replication and diminish expression of plasmid specified genes. (1982) Embo J., v. 1, p. 1399-1404

48. Hayashi M.N., Hayashi M. Cloned DNA sequences that determine mRNA stability of bacteriophage fX174 in vivo are functional (1985) Nucleic Acids Res., v.13, p.5937-5948.

49. Wong H.C., Chang S. Identification of a nositive retroremlator that stabilizes1. C? / O */ t/ JT , omRNAs in bacteria. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v.83, p.3233-3237

50. Brosius J., Ullrich A., Raker M.A., Gray A., Dull T.J., Gutell R.G., Noller H.F. Construction and fine mapping of recombinant plasmids containing the rrnB ribosomal RNA operon ofE. coli. (1981) Plasmid, v.6, p. 112-118

51. Li S.C., Squires C.L., Squires C. Antitermination ofE. coli rRNA transcription is caused by a control region segment containing lambda nut-like sequences. (1984) Cell, v.38,p.851-860

52. Warne S.R., Thomas C.M., Nugent M.E., Tacon W.C.A. Use of a modified Escherichia coli trpR gene to obtain tight regulation of high copy-number expression vectors. (1986) Gene, v.46, p. 103-112

53. Hasan N., Szybalski W. Control of cloned gene expression by promoter inversion in vivo: construction of improved vectors with a multiple cloning site and the ptacpromoter. (1987) Gene, v.56, p. 145-151.

54. Hasan N., Szybalski W. Construction of laclts and laclqts expression plasmids and evaluation of the thermosensitive lac repressor. (1995) Gene, v. 163, p.35-40.

55. Lisser S., Margalit H. Compilation of E. coli mRNA promoter sequences. (1993) Nucleic Acids Res., v.21, p. 1507-1516

56. Gualerzi C.O., Pon C.L. Initiation of mRNA translation in prokaryotes. (1990) Biochemistry, v.29, p.5881-5889

57. Gold L. Posttranscriptional regulatory mechanisms in Escherichia coli. (1988) Annu. Rev. Biochem., v.57, p. 199-233.

58. Ringquist S., Shinedling S., Barriek D., Green L., Binkley J., Stormo G.D., Gold L. Translation initiation in Escherichia coli: sequences within the ribosome-bindingsite. (1992) Mol. Microbiol., v.6, p. 1219-1229

59. Tessier L.H., Sondermeyer P., Faure T., Dreyer D., Benavente A., Villeval D., Courtney M., Lecocq J.P. The influence of mRNA primary and secondarystructure on human IFN-y gene expression in E. coli. (1984) Nucleic Acids Res., v.12, p.7663-7675

60. Chen H.Y., Pomeroy-Cloney L., Bjerknes M., Tam J., Jay E. The influence of adenine-rich motifs in the 3' portion of the ribosome binding site on human IFN-y gene expression in Escherichia coli. (1994) J. Mol. Biol., v.240, p.20-27

61. Lee N. Zhang S.O., Cozzitorto J., Yang J.S., Testa D. Modification of mRNA secondary structure and alteration of the expression of human interferon al in Escherichia coli. (1987) Gene, v.58, p.77-86

62. Schumperli D., McKenney K., Sobieski D.A., Rosenberg M. Translational coupling at an intercistronic boundary of the Escherichia coli galactose operon. (1982) Cell, v.31,p.865-871

63. Birikh K.R., Lebedenko E.N., Boni I.V., Berlin Y.A. A high-level prokaryotic expression system: synthesis of human interleukin la and its receptor antagonist. (1995) Gene, v. 164, p.341-345

64. Omer C.A., Diehl R.F., Krai A.M. Bacterial expression and purification of human protein prenyltransferases using epitope-tagged, translationally coupled systems. (1995) Methods Enzymol., v.250, p.3-12

65. Boni I.V., Isaeva D.M., Musychenko M.L., Tzareva N.V. Ribosome-messenger recognition: mRNA target sites for ribosomal protein SI. (1991) Nucleic Acids Res., v. 19, p. 155-162

66. Olins P.O., Devine C.S., Rangwala S.H., Kavka K.S. The T7 phage gene 10 leader RNA, a ribosome-binding site that dramatically enhances the expression of foreign genes in Escherichia coli. (1988) Gene, v.73, p.227-235

67. Olins P.O., Rangwala S.H. A novel sequence element derived from bacteriophage T7 mRNA acts as an enhancer of translation of the lacZ gene in Escherichia coli. (1989) J. Biol. Chem., v.264, p. 16973-16976

68. Olins P.O., Rangwala S.H. Vector for enhanced translation of foreign genes in Escherichia coli. (1990) Methods Enzymol., v. 185, p. 115-119

69. Sprengart M.L., Fuchs E., Porter A.G. The downstream box: an efficient and independent translation initiation signal in Escherichia coli. (1996) EMBO J., v.15, p.665-674

70. McCarthy J.E.G., Schairer H.U., Sebald W. Translational initiation frequency of atp genes from Escherichia coli: identification of an intercistronic sequence that enhances translation. (1985) EMBO J., v.4, p.519-526

71. McCarthy J.E.G., Sebald W., Gross G., Lammers R. Enhancement of translational efficiency by the Escherichia coli atpE translational initiation region: its fusion with two human genes. (1986) Gene, v.41, p.201-206

72. Schauder B., Blocker H., Frank R., McCarthy J.E.G. Inducible expression vectors incorporating the Escherichia coli atpE translational initiation region. (1987) Gene, v.52, p.279-283

73. Zhang J., Deutscher M.P. A uridine-rich sequence required for translation of prokaryotic mRNA. (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, v.89, p.2605-2609

74. Tzareva N.V., Makhno V.l., Boai I.V. Ribosome-messenger recognition in the absence of the Shine-Dalgarno interactions. (1994) FEBS Lett., v.337, p. 189-194

75. Sprengart M.L., Fatscher H.P., Fuchs E. The initiation of translation in E. coli: apparent base pairing between the 16S rRNA and downstream sequences of the mRNA. (1990) Nucleic Acids Res., v. 18, p. 1719-1723

76. Faxen M., Plumbridge J., Isaksson L.A. Codon choice and potential complementarity between mRNA downstream of the initiation codon and bases 1471-1480 in 16S ribosomal RNA afects expression of glnS. (1991) Nucleic Acids Res., v. 19, p.5247-5251

77. Ito K., Kawakami K., Nakamura Y. Multiple control of Escherichia coli lysyl-tRNA synthetase expression involves a transcriptional repressor and a translational enhancer element. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v.90, p.302-306

78. Shean C.S., Cottesman M.E. Translation of the prophage X cl transcript. (1992) Cell, v.70, p.513-522

79. Ross J. mRNA stability in mammalian cells. (1995) Microbiol. Rev., v.59, p.423-450

80. Breaner S., Jacob F., Meselson M. An unstable intermediate carrying information from genes to ribosomes for protein synthesis. (1961) Nature (London), v.190, p.576-581

81. Gros F., Hiatt H., Gilbert W., Kurland C.G., Risebrough R.W., Watson J.D.

82. Unstable ribonucleic acid revealed by pulse labelling of Escherichia coli. (1961) Nature (London), v. 190, p.581-585.

83. Belasco J.G., Brawerman G. Control of messenger RNA stability. (1993) Academic Press, Inc., San Diego, Calif,

84. Chen C.Y.A., Belasco J.G. Degradation of pufLMX mRNA in Rhodobacter capsularus is initiated by nonrandom endonucleolytic cleavage. (1990) J. Bacteriol., v. 172, p.4578-4586

85. Bechhofer D. 5' mRNA stabilizers. (1993) In J. G. Belasco and G. Brawerman (ed.), Control of messenger RNA stability. Academic Press, Inc., San Diego, Calif., p.31-52

86. Higgins C.F., Causton H.C., Dance G.S.C., Mudd E.A. The role of the 3' end in mRNA stability and decay. (1993) In J.G. Belasco and G. Brawerman (edA Control of messenger RNA stability. Academic Press. Inc., San Diego. Calit, p. 13-30

87. Gorski K., Roch J.M., Frentki P., Krisch H.M. The stability of bacteriophage T4 gene 32 mRNA: a 5' leader sequence that can stabilize mRNA transcripts. (1985) Cell, v.43, p.461-469.

88. Sandler P., Weisblum B. Erythromycin-induced ribosome stall in the ermA leader: a barricade to 5'-to-3' nucleolytic cleavage of the ermA transcript. (1989) J. Bacteriol., v. 171, p.6680-6688

89. Yamamoto T., Imamoto F. Differential stability of trp messenger RNA synthesized originating at the trp promoter and pL promoter of lambda trp phage. (1975) J. Mol. Biol., v.92, p.289-309

90. Belasco J.G., Nilsson G., von Gabain A., Cohen S.N. The stability ofE. coli gene transcripts is dependent on determinants localized to specific mRNA segments. (1986) Cell, v.46, p.245-251

91. Emory S.A., Bouvet P., Belasco J.G. A 5'-terminal stem-loop structure can stabilize mRNA in Escherichia coli. (1992) Genes Dev., v.6, p. 135-148.

92. Donovan W.P., Kushner S.R. Amplification of ribonuclease II (rnb) activity in Escherichia coli K-12. (1983) Nucleic Acids Res., v. 11, p.265-275

93. Craigen W.J., Lee C.C., Caskey C.T. Recent advances in peptide chain termination. (1990) Mol. Microbiol., v.4, p.861-865

94. Tate W.P., Brown C.M. Translational termination: "stop" for protein synthesis or "pause" for regulation of gene expression. (1992) Biochemistry, v.31, p.2443-2450

95. Scolnik E., Tompkins R., Caskey T., Nirenberg M. Release factors differing in specificity for terminator codons. (1968) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v.61, p.768-774

96. Grentzmann G., Brechemier-Baey D., Heurgue V., Mora L., Buckingham R.H. Localization and characterization of the gene encoding release factor RF3 in Escherichia coli. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v.91, p.5848-5852

97. Sharp P.M., Bulmer M. Selective ditfferences among translation termination codons. (1988) Gene, v.63, p. 141-145

98. Poole E.S., Brown C.M., Tate W.P. The identity of the base following the stop codon determines the efficiency of in vivo translational termination in Escherichia coli. (1995) EMBO J., v. 14, p. 151-158

99. Mottagui-Tabar S., Bjornsson A., Isaksson L.A. The second to last amino acid in the nascent peptide as a codon context determinant. (1994) EMBO J., v. 13, p.249-257

100. Rudolph R., Lilie H. In vitro folding of inclusion body proteins. (1996) FASEB J., v.10, p.49-56

101. Schein C.B. Production of soluble recombinant proteins in bacteria. (1989) Bio/Technology, v.7, p. 1141-1149

102. Wilkinson D.L., Harrison R.G. Predicting the solubility of recombinant proteins in Escherichia coli. (1991) Bio/Technology, v.9, p.443-448

103. Schein C.H. Optimizing protein folding to the native state in bacteria. (1991) Curr. Opin. Biotechnol., v.2, p.746-750

104. Kenealy W.R., Gray J.E., Ivanoff L.A., Tribe D.K., Reed D.L., Korant B.D., Petteway S.R., Jr. Solubility of proteins overexpressed in Escherichia coli. (1987) Dev. Ind. Microbiol., v.28, p.45-52

105. Dale G.E., Broger C., Lsngen H., D'Arcy A., Stiiber D. Improving protein solubility through rationally designed amino acid replacements: solubilization of the trimethoprim-resistant type SI dihydrofolate reductase. (1994) Protein Eng., v.7, p.933-939

106. Battistoni A., Carri M.T., Steinkuhler C., Rotilio G. Chaperonins dependent increase of Cu,Zn superoxide dismutase production in Escherichia coli. (1993) FEBS Lett., v.322, p.6-9

107. LaVallie E.R., DiBlasio E.A., Kovacic S., Grant K.L., Schendel P.F., McCoy J.M. A thioredoxin gene fusion expression system that circumvents inclusion body formation in the E. coli cytoplasm. (1993) Bio/Technology, v. 11, p. 187-193

108. Yasukawa T., Kaneiishii C., Maekawa T., Fujimoto J., Yamamoto T., Ishii S. Increase of solubility of foreign proteins in Escherichia coli by coproduction of the bacterial thioredoxin. (1995) J. Biol. Chem., v.270, p.25328-25331

109. Blackwell J.R., Horgan R. A novel strategy for production of a highly expressed recombinant protein in an active form. (1991) FEBS Lett., v.295, p. 10-12

110. Bowden G.A., Georgiou G. The effect of sugars on ß-lactamase aggregation in Escherichia coli. (1988) Biotechnol. Prog., v.4, p.97-101

111. Sugimoto S., Yokoo Y., Hatskeyama N., Yotsuji A., Teshiba S., Hagino H. Higher culture pH is preferable for inclusion body formation of recombinant salmon growth hormone in Escherichia coli. (1991) Biotechnol. Lett., v. 13, p.385-388

112. Derman A.I., Prinz W.A., Belin D., Beckwith J. Mutations that allow disulfide bond formation in the cytoplasm of Escherichia coli. (1993) Science, v.262, p. 1744-1747

113. Proba K., Ge L.M., Pluckthun A. Functional antibody single chain fragments from the cytoplasm of Escherichia coli: influence of thioredoxin reductase (TrxB). (1995) Gene, v. 159, p.203-207

114. Sandman K., Grayling R.A., Reeve J.N. Improved N-terminal processing of recombinant proteins synthesized in Escherichia coli. (1995) Bio/Technology, v.13, p.504-506

115. Gottesman S. Minimizing proteolysis in Escherichia coli: genetic solutions. (1990) Methods Enzymol., v. 185, p. 119-129

116. Hellebust B., Murby M., Abrahmsen L., Uhlen M., Enfors S.O. Different approaches to stabilize a recombinant fusion protein. (1989) Bio/Technology, v.7, p. 165-168

117. Baneyx F., Georgiou G. Degradation of secreted proteins in Escherichia coli. (1992) Ann. N. Y. Acad. Sei., v.665, p.301-308

118. Pugsley A.P., Schwartz M. Export and secretion of proteins by bacteria. (1985) FEMS Microbiol. Rev., v.32, p.3-38

119. Perez-Perez J., Marquez G., Barbero J.L., Gutierrez J. Increasing the efficiency of protein export in Escherichia coli. (1994) Bio/Technology, v. 12, p. 178-180

120. Kern I., Ceglowski P. Secretion of streptokinase fusion proteins from Escherichia coli cells through the hemolysin transporter. (1995) Gene, v. 163, p.53-57

121. Suominen I., Karp M., Lahde M., Kopio A., Glumolf T., Meyer P., Mantsali P.

122. Extracellular production of cloned a-amylase by Escherichia coli. (1987) Gene, v.61, p.165-176

123. Fahey R.C., Hunt J.S., Windham G.C. On the cysteine and cystine content of proteins. Differences between intracellular and extracel lular proteins. (1977) J. Mol. Evol., v.10, p. 155-160

124. Thornton J.M. Disulfide bridges in globular proteins. (1981) J. Mol. Biol., v. 151, p.261-287

125. Bardwell J.C.A., McGovern K., Beckwith J. Identification of a protein required for disulfide bond formation in vivo. (1991) Cell, v.67, p.581-589

126. Bardwell J.C.A. Building bridges: disulfide bond formation in the cell. (1994) Mol. Microbiol., v. 14, p. 199-205

127. Kavanaugh J.S., Rogers P.H., Arnone A. High-resolution X-ray study of deoxy recombinant human hemoglobins synthesized from ft-glob ins having mutated amino termini. (1992) Biochemistry, v.31, p.8640-8647

128. Adams J.M. On the release of the formyl group from nascent protein. (1968) J. Mol. Biol., v.33, p.571-589

129. Ben-Bassat A., Bauer K., Chang S.Y., Myambo K., Boosman A., Chang S. Processing of the initiation methionine from proteins: properties of the Escherichia coli methionine aminopeptidase ana its gene structure. (1987) J. Bacterid., v. 169, p.751-757

130. Dalboge H., Daht H.H.M., Pedersen J., Hansen J.W., Christensen T. A novel enzymatic method for production of authentic hGH from an Escherichia coli produced hGH-precursor. (1987) Bio/Technology, v.5, p. 161-164

131. Blattner F.R., Plunkett G., Bloch C.A., Perna N.T., Burland V., Riley M., Collado-Vides J., Glasner J.D., Rode C.K., Mayhew G.F., al. e. The comlete genome sequence of Escherichia coli K-12. (1997) Science, v.277, p. 1453-1462

132. Nossal N.G., Heppel L.A. The release of enzymes by osmotic shock from Escherichia coli in exponential phase. (1966) J. Biol. Chem., v.241, p. 3055-3 062

133. Schatz G., Dobberstein B. Common principles of protein translocation across membranes. (1996) Science, v.271, p. 1519-1526

134. Oka T., Sakamoto S., Miyoshi K.L., Fuwa T., Yoda K., Yamasski M., Tamura G., Miyake T. Synthesis and secretion of human epidermal growth factor by Eschehchia coli. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v.82, p.7212-7216

135. Goldstein J., Lehnhardt S., Inouye M. Enhancement of protein translocation across the membrane by specific mutations in the hydrophobic region of the signal peptide. (1990) J. Bacterid., v. 172, p. 1225-1231

136. Hoffman C.S., Wright A. Fusions of secreted proteins to alkaline phosphatase: an approach for studying protein secretion. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v.82, p.5107-5111

137. Kadonaga J.T., Gautier A.E., Straus D.R., Charles A.D., Edge M.D., Knowles J.R. The role of the 3-lactamase signal sequence in the secretion of proteins by Escherichia coli. (1984) J. Biol. Chem., v.259, p.2149-2154

138. Fujimoto K., Fukuda T., Marumoto R. Expression and secretion of human epidermal growih factor by Escherichiv coli using enterotoxin signal sequences. (1988) J. BiotechnoL, v.8, p.77-86

139. Abrahmsen L., Moks T., Nilsson B., Uhlen M. Secretion of heterologous gene products to the culture medium of Escherichia coli. (1986) Nucleic Acids Res, v.14, p.7487-7500

140. Lo A.C., MacKay R.M., Seligy V.L., Willick G.E. Bacillus subtilis /3-1,4-endoglucanase products from intact and truncated genes are secreted into the extracellular medium by Escherichia coli. (1988) Appl. Environ. Microbiol., v.54, p.2287-2292

141. Better M., Chang C.P., Robinson R.R., Horwitz A.H. Escherichia coli secretion of an active chimeric antibody fragment. (1988) Science, v.240, p. 1041-1043

142. Gray G.L., Baldridge J.S., McKeowa K.S., Heyneker H.L., Cbang C.N. Periplasmic production of correctly processed human growth hormone in Escherichia coli: natural and bacterial signal sequences are interchangeable. (1985) Gene, v.39, p.247-254

143. Pugsley A.F. The complete general secretory pathway in gram negative bacteria. (1993) Microbiol. Rev., v.57, p.50-108

144. Saier M.H.J., Werner P.K., Muller M. Insertion of proteins into bacterial membranes: mechanism, characteristics, and comparisons with the eucaryotic process. (1989) Microbiol. Rev., v.53, p.333-366

145. Pluckthun A. Mono-and bivalent antibody fragments produced in Escherichia coli: engineering, folding and antigen binding. (1992) Immunol. Rev., v. 130, p.151-188

146. Wulfing C., Pluckthun A. Correctly folded T-cell receptor fragments in the periplasm of Escherichia coli-influence of folding catalysts. (1994) J. Mol. Biol., v.242, p.655-669

147. Bowden G.A., Baneyx F., Georgiou G. Abnormal fractionation of /3-lactamase in Escherichia coli: evidence for an interaction of /3-lactamase with the inner membrane in the absence of a leader peptide. (1992) J. Bacterid., v. 174, p.3407-3410

148. Cheah K.C., Hanison S., King R., Crocker L., Wells J.R.E., Robins A. Secretion of eukaryotic growth hormones in Escherichia coli is influenced by the sequence of the mature proteins. (1994) Gene, v. 138, p.9-15

149. Little S., Campbell C.J., Evans I.J., Hayward E.C., Lilley R.J., Robinson M.K. Ashort N-proximal region of prochymosin inhibits the secretion of hybrid proteins from Escherichia coli. (1989) Gene, v.83, p.321-329

150. Obukowicz M.G., Turner M.A., Wong K. Y., Tscoo W.C. Secretion and export of IGF-1 in Escherichia coli strain JM101. (1988) Mol. Gen. Genet., v.215, p. 19-25

151. Malke H., Ferretti J.J. Streptokinase: cloning, expression and secretion by Escherichia coli. (1984) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, v.81, p.3557-3561

152. Hsiung H. M., Cantreü A., LuirLnk J., Oudega B., Veros A.J., Becker G. W. Use of bacteriocin release protein in E. coli for excretion of human growth hormone into the culture medium. (1989) Bio/Technology, v.7, p.267-271

153. Gouy m., Gautier c. Codon usage in bacteria: correlation with gene expressivity. (1982) Nucleic Acids Res., v.10, p.7055-7074

154. Chen g. f.t., inouye m. Suppression of the negative effect of minor arginine codons on gene expression: preferential usage of minor codons within the first 25 codons of the Escherichia coli genes. (1990) Nucleic Acids Res, v. 18, p.14651473

155. Goldman K., Rosenberg A. H., Zubay G., Studier F.W. Consecutive low-usage leucine codons block translation only when near the 5' end of a message in Escherichia coli. (1995) J. Mol. Biol., v.245, p.467-473

156. Ivanov I., Alexandrova R., Dragulev B., Saraffova A., AbouHaidar M. G. Effect of tandemly repeated AGG triplets on the translation of CAT-mRNA in E. coli.1992) FEBS Lett., v.307, p.173-176

157. Buell G., Schulz M. F., Selzer G., Chollet A., Movva N. R., Semon D., Escanez s., Kawashima E. Optimizing the expression in E. coli of a synthetic gene encoding Somatomedin-C (IGF-I). (1985) Nucleic Acids Res., v.13, p.1923-1938

158. Bula c., wiieox K. w. Negative effect of sequential serine codons on expression of foreign genes in Escherichia coli. (1996) Protein Expression Purif., v.7, p. 92103

159. Kane j.f. Effects of rare codon clusters on high-level expression of heterologous proteins in Escherichia coli. (1995) Curr. Opin. Biotechnol., v.6, p.494-500

160. Goldberg a.l., Dice j.f. Intracellular protein degradation in mammalian and bacterial cells. (1974) Annu. Rev. Biochem., v.43, p.835-869

161. Goldberg A.L., St. John a. c. Intracellular protein degradation in mammalian and bacterial cells. Part 2. (1976) Annu. Rev. Biochem., v.45, p.747-803

162. Goldberg a.l. The mechanism and functions of ATP-dependent proteases in bacterial and animal cells. (1992) Eur. J. Biochem., v.203, p. 9-23

163. Goldberg a.l., Goff s.a. The selective degradation of abnormal proteins in bacteria. (1986) In W. Reznikolf and l. Gold (ed.), Maximizing gene expression. Buttenvorths, Boston., p.287-314

164. Gottesman s., Maurizi m.R. Regulation by proteolysis: energy dependent proteases and their targets. (1992) Microbiol. Rev., v. 56, p. 592-621

165. Kaufmann a., stierhof y. d., Henning u. New outer membrane-associated protease of Escherichia coli K-12. (1994) J. Bacteriol., v. 176, p.359-367

166. Keiier k. c., Waller p. r. h., Sauer r.t. Role of a peptide tagging system in degradation of proteins synthesized from damaged messenger RNA. (1996)1. Science, v.271, p.990-993

167. Tobias J. w., shrader T. K., Rocap G., Varshavsky A. The N-end rule in bacteria. (1991) Science, v.254, p. 1374-137 7

168. Varshavsky A. The N-end rule. (1992) Cell, v.69, p.725-735

169. Enfors s.o. Control of in vivo proteolysis in the production of recombinant proteins. (1992) Trends Biotechnol., v. 10, p. 310-315

170. Jacques n., Guillerez J., Dreyfus м. Culture conditions differentially affect the translation of individual Escherichia coli mRNAs. (1992) j. Mol. Biol., v. 22 6,p.597-608

171. Jensen е. в., Carisen s. Production of recombinant human growth hormone in Escherichia coli: expression of different precursors and physiological effects of glucose, acetate and salts. (1990) Biotechnol. Bioeng., v.36, p. 1-11

172. AristLdou a. a., San к. y., Bennett G.n. Metabolic engineering of Escherichia coli to enhance recombinant protein production through acetate reduction.1995) Biotechnol. Prog., v. 11, p.475-478

173. Устинникова Т.Б., Попов В.О., Егоров Ц.А. Структурные исследования NAD-зависимой формиатдегидрогеназы метилотрофных бактерий. Локализация существенного остатка цистеина. (1988) Биоорганическая Химия, т. 14, стр.905-909

174. Reznikoff W. S., Siesele D. А., Со winy W., Gross С. A. The regulation of transcription initiation in bacteria. (1985) Ann. Rev. Genet., v.19, p.335-387

175. Rothmel R. K., Chakrabarty A. M., Berry A., Darzins A. Genetic systems in Pseudomonas. (1991) Methods Enzymol., v.204, p.485-514

176. Ausubel F. M., Brent R., Kingston R.E., Moore D. D., Seidman J. G., Smith J.A., Struhl K. (1989). Short protocols in molecular biology (N. Y.: John Wiley & Sons).

177. Kunkel т. A. Rapid and efficient site-directed mutagenesis without phenotypic selection. (1985) Proc. Natl. Acad. ScL USA, v.82, p.488-492

178. Sanger f., Nickien s., Couison a. r. DNA seguencing with chain-terminating inhibitors. (1977) Proc. Natl. Acad. ScL. USA, v.74, p.5463-5467

179. Sorensen M.A., Pedersen s. Absolute in vivo translation rates of individual codons in Escherichia coli. The two glutamic acid codons GAA and GAG are translated with a threefold difference in rate. (1991) j. Mol. Biol., v.222, p. 265280

180. Wada K. N., Wada Y., Ishibashi F., GojoborL Т., Ikemura T. Codon usage tabulated from the GenBank genetic sequence data. (1992) Nucleic Acids Res., v.20(Suppl.), p.2111-2118

181. Adzhubei A.A., Adzhubei I.A., Krasheninnikov I.A., Neidle S. Non-random usage of 'degenerate' codons is related to protein three-dimensional structure.1996) FEBS Letters, v.399, p.78-82

182. Lamzin V.S., Dauter Z., Popov V. 0., Harutyunyan E. H., Wilson K. S. High resolution structure of holo and apo formate dehydrogenase. (1994) J. Moi. Biol., v.236,

183. Grossman T. H., Kawasaki E.S., Punreddy S. R., Osburne M.S. Spontaneous cAMP-dependent derepression of gene expression in stationary phase plays a role in recombinant expression instability. (1998) Gene, v. 2 09, p. 95-103