Выделение, очистка и свойства бета-амилазы Bacillus Polymyxa N 3 тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Рашап, Рима Куснельевна

• Рашап, Рима Куснельевна
• кандидат биологических наук
• 1984

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Рашап, Рима Куснельевна

СОКРАЩЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ б

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Продуценты j> -амилазы

2. Выделение и очистка бактериальной р -амилазы

3. Методы, основанные на специфической сорбции амилаз крахмалом

4. .Физико-химические свойства бактериальныхуй,-амилаз

5. Возможности практического применения Д-амилазы

ГЛАВА II. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

1. Культивирование Bacillus polymyxa И

2. Очистка ^>-амилазы

2.1. Получение технического препарата д-амилазы

2.2. Получение высокоочищенного4 препарата уь-амилазы

2.2.1. Разработка состава сорбента

2.2.2. Разработка условий сорбции-десорбции а) сорбционная емкость кукурузного крахмала б) геометрия колонки в) температура сорбции и десорбции г) условия десорбции: рН и концентрация NaCl в растворе

2.2.3. Очистка ^.-амилазы методом специфической сорбции на крахмале

2.2.4. Очистка ^-амилазы методом осаждения комплекса фермент-субстрат

2.2.5. Обессоливание растворов уь-амилазы методом гель-фильтрации

2.2.6. Концентрирование растворовуа>-амилазы

2.2.7. Изоэлектрическое фокусирование

3. Анализ продуктов гидролиза крахмала

3.1. Бумажная хроматография

3.2. Высокоэффективная жидкостная хроматография

4. Методы определения ферментативной активности

4.1. Определение амилолитической активности

4.2. Определение протеолитическбй активности

5. Определение концентрации белка

6. Изучение свойств ^-амилазы

6.1. Определение молекулярной массы

6.1.1. Диск-электрофорез в присутствии додецил-сульфата натрия а) окрашивание гликопротеидов

6.1.2. Седиментационный анализ

6.2. Определение аминокислотного состава

6.3. Определение карбогидратов

6.4. Изучение зависимости активности д-амилазы от рН и температуры

6.5. Изучение стабильности д-амилазы

6.6. Определение Км эфф

6.7. Изучение субстратной специфичности

7. Реагенты

ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Получение технического препарата Д-амилазы.

2. Получение высокоочищенного препарата

2.1. Разработка состава сорбента

2.2. Условия сорбции-десорбции-Д-амилазы

2.3. Очистка бактериальной уь-амилазы

2.4. Изоэлектрическое фокусирование

3. Свойства изоформ Д-амилазы 70 3.1. Гомогенность и молекулярная масса

3.2. Аминокислотный состав

3.3. Углеводный состав

3.4. Влияние рН на активность и стабильность

3.5. Влияние температуры на активность и стабильность

3.6. Субстратная специфичность и продукты гидролиза 81 ВЫВОДЫ 88 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СОКРАЩЕНИЯ

ПА - протеолитическая активность

ДЭАЭ-целлюлоза - диэтиламиноэтилцеллюлоза

280 ~ поглощение света образцом при длине волны 280 нм эфф ~ эФФективная константа Михаэлиса кин - константа скорости инактивации

V - начальная скорость реакции pi - изоэлектрическая точка трис - 2-амино-2-гидроксиметилпропан -1,3 - диол КМ - карбоксиметил

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Выделение, очистка и свойства бета-амилазы Bacillus Polymyxa N 3»

Амилолитические ферменты широко применяются в пивоварении, виноделии, хлебонечении и производстве малтозы, успешно конкурирующей с глюкозой и сахарозой в кондитерском производстве, выделке ликеров, консервировании. Традиционные источники этих ферментов - ячмень, пшеница, рожь и некоторые другие зерновые культуры.Причем, для повышения осахаривающей и декстринолити-ческой активности приходится проводить осолаживание зерна -сложный процесс, требующий специальных хорошо проветриваемых помещений с регулируемой температурой. Кроме того, для производства солода предпочтительно применение высококачественного зерна. В Японии и Китае для приготовления соевых соусов и спиртных напитков из риса издавна используются амилазы плесневых грибов из родов Aspergillus и Mucor . Еще в 1884 году японский ученый Такамине предложил при производстве спирта заменить солод сухой культурой Aspergillus oryzae /9/.

Современный уровень развития микробиологической промышленности позволяет повсеместно заменить солод бактериальными амилазами. В странах Западной Европы, США и Японии ежегодно производится и применяется значительное количество бактериальных и грибных оС- и ^В-амилаз /119/. В нашей стране промышленным способом производится только бактериальная оС-амилаза. Препараты амилосубтилин Г Зх и Г Юх применяются в сельском хозяйстве, при производстве моющих средств и в разных отраслях пищевой промышленности. Хотя под действием о(-амилазы крахмал гидроли-зуется с образованием глюкозы, мальтозы и других олигосахари-дов, этот фермент применяется и там, где требуется образование одного продукта, в том числе и мальтозы. Ценные качества мальтозы хорошо изучены. Этот дисахарид может стать заменителем сахарозы в питании, так как меньше способствует увеличению веса и порче зубов человека. Добавление мальтозы в коровье молоко делает его равноценным заменителем материнского молока. Применение мальтозы в кондитерской промышленности также дает ощутимый эффект: она легко взбивается, удерживает влагу, предохраняет от потемнения /3/.

О существовании бактерий-продуцентов ^5-амилазы впервые сообщалось в 1942 году /134/. Однако, целевые поиски продуцентов для промышленного производства бактериальной уЗ-амилазы начались лишь в 60-ых годах /36-40, 42-48, 58', 108/. Значительных результатов в этой области добились японские ученые /53, 70, 72, 78, 80, III-II8, 125-128/. В настоящее время для производства мальтозы из крахмала в Японии, США, Англии, Франции, ФРГ, Швеции применяется бактериальная ^-амилаза /80-99/. Выход основного продукта по большинству методик достигает 95%. В то же время, в нашей стране мальтозу получают методом осахарива-ния крахмала солодовым экстрактом. Технологический процесс осложняется образованием глюкозы, декстринов и других побочных продуктов.

В 1978 году во ВНИИ Прикладной энзимологии был отобран продуцент уь-амилазы - Bacillus polymyxa и з . Это создало реальное основание для создания производства отечественной бактериальной ^-амилазы. В связи с этим целью настоящей работы было:

1. Разработка достаточно эффективного метода выделения и очистки бактериальной д-амилазы.

2. Изучение основных физико-химических свойств полученной ^-амилазы, необходимых для ее квалифицированного применения.

Для решения поставленных задач разработаны методики получения технического и высокоочищенного препаратов уб-амилазы.

Технический препарат ^-амилазы получали фракционированием органическими растворителями. Схема получения высокоочгаценного препарата состоит из двух специфических стадий очистки: сорбции-десорбции на кукурузном крахмале и осаждение комплекса ^-амилаза-гликоген 40% этанолом. Детально разработана методика сорбции-десорбции на кукурузном крахмале в динамическом режиме ( первая стадия ). Показано, что десорбцияуВ-амилазы с крахмала происходит вследствие ингибирования фермента продуктом реакции - мальтозой. Для очистки ^-амилазы впервые применен метод осаждения фермент-субстратного комплекса ( вторая стадия ). В полученном после двух стадий очистки препарате методом изоэлектрического фокусирования обнаружено наличие двух изоформ. Определены их молекулярные массы, аминокислотный состав, углеводный состав, рН-оптимум. Изучена зависимость активности изоформ от температуры, а также зависимость их стабильности от рй и температуры. Определены основные продукты гидролиза субстрата.

На основании всей совокупности экспериментальных данных сформулирован вывод, что изоформы ^-амилазы из Bacillus ро1уну-ха 13 представляют собой индивидуальные белки, отличающиеся по таким физико-химическим характеристикам как аминокислотный и углеводный состав, молекулярная масса, изоэлектрические точки.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Рашап, Рима Куснельевна

выводы

1. Разработана методика очистки Д-амилазы методом специфической сорбции-десорбции на кукурузном крахмале в динамическом режиме.

2. Разработана схема получения высокоочищенной ^-амилазы из Bac.polymyxa ж 3 , состоящая из следующих этапов: сорбция-десорбция на кукурузном крахмале из фильтрата культуральной жидкости, осаждение комплекса f> -амилаза-гликоген из элюата этанолом.

3. Методом изоэлектрического фокусирования обнаружено наличие двух изоформ I и II с изоэлектрическими точками 4,9 и 8,4.

4. Молекулярные массы изоформ, определенные методами электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия и седиментационно-го равновесия, равны I - 56000, II - 62000.

5. Аминокислотный состав изоформ различен. Он также отличается от аминокислотного состава других бактериальных уь-амилаз. Обе изоформы - гликопротеиды, содержащие I - 3,5%, II - 1,8% глюкозы.

6. рН-оптимум изоформы 1-6, изоформы II - 7. Обе изоформы одинаково нестабильны в кислой среде. Изоформа I более ста-бильйа при рН больше 7, а также более термостабильна.

7. Определены величины К^ эфф для обеих изоформ по отношению к растворимому крахмалу. Изоформа II обладает большим сродством к этому субстрату. Изоформа I гидролизует субстрат с образованием мальтозы и мальтотриозы, изоформа II -только мальтозы.

8. Методика очистки амилаз методом специфической сорбции-десорбции на кукурузном крахмале в динамическом режиме применена в институте биохимии АН Лит.ССР для очистки «(.-амилазы.

9. Изоформа II f> -амилазы внедрена в практику кафедры химической энзимологии Химического факультета Московского Государственного Университета им. М.В.Ломоносова.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Рашап, Рима Куснельевна, 1984 год

1. А.с. 810723 /СССР/ Способ получения окрашенных субстратов для определения протеолитической активности/ВНИИПЭ, Петнюнас Р.В., Денис Г.И., Карпавичюс В.В. и др. Заявл. 27.02.79, опубл. в Б.И., 1981, №9.

2. Вайнер Л.М., Шульман М.С. Получение сорбата амилазы на модифицированном крахмале. Прикл. биохим. микробиол., 1969, т. 5, вып. 3, с. 364 - 366.

3. Галкина Г.В., Ладур Т.А. Использование ферментов в производстве патоки и других крахмалопродуктов(обзор). М.: Центр, ин-т науч.-техн. информации пищевой пром-сти Гос. ком. по пищевой пром-сти при Госплане СССР, 1964. - 40 с.

4. Галкина Г.В. Современные методы гидролиза крахмала, фильтрации и очистки гидролизатов. М.: Центр, ин-т науч.-техн. информации пищевой пром-сти М-ва пищевой пром-сти СССР, 1966. - 38 с.

5. Галкина Г.В. Исследование ферментативного гидролиза крахмала при производстве сахаристых веществ. Автореферат диссертации на соиск.уч. степени канд. техн. наук. М., 1975.

6. Дьяконова Э.В. Получение мальтозной патоки с применением ферментных препаратов. Автореферат диссертации на соиск.уч. степени канд. техн. наук. М., 1974.

7. Ильин В.А. О сорбции е*-амилазы сорбентами на основе крахмала. Ж. прикл. химии, 1976, т. 49, № 3, с. 529 - 531.

8. Корниш-Боуден Э. Основы ферментативной кинетики. М.: Мир, 1979.- 280 с.

9. Кретович В.Л. Ферментные препараты в пищевой промышленности. М.:Пищ. пром-сть, 1975. - 535 с.

10. Номенклатура ферментов /Рекомендации 1982 г./. Под. ред.

11. Браунштейна А.Е., М.: Изд-во ВИНИТИ, 1979 150 с.

12. Обуховский Э.А. Производство мальтозжж патоки. М.: Пище-промиздат, 1959 30 с.

13. Пронин С.И. Амилолитические ферменты и их роль в пищевой промышленности. М.: Гизлегпищепром, 1953 217 с.

14. Райдер К., Тэйлор К. Изоферменты. М.: Мир, 1983 - 107 с.

15. Рашап Р.К., Юшкайте З.Ю., Глемжа А.А. Выделение и некоторые свойства ^r-амилазы Bacillus polymyxa N3.- Прикл. биохим. микробиол., 1981, т. 17, вып. 2, с. 225 232.

16. Степанов В.М. 0 микрогетерогенности белков. Успехи современной биологии, 1982, т. 93, № I, с. 35-45.

17. Черняк В.Я., Магретова Н.Н. Автокалибровочный метод седи-ментационного равновесия для определения молекулярного веса белков. Идеальные растворы. Молек. биол., 1980, т. 14, вып. 2, с. 330 - 337.

18. Шишкова З.А., Орещенко Л.И., Качалкина М.И., Голуб Н.В. Использование вспомогательных фильтрующих средств для отделения биомассы глубинных культур бактерий. Тр. ВНИИ биосинтеза белковых веществ., 1974, вып. 2, с. 105 - 109.

19. Шилова А.А. Амилолитические ферменты Asp.awamori и их применение в спиртовой промышленности. Автореферат диссертации на соиск. уч. степени канд. техн. наук, М., 1967.

20. Шульман М.С. Сорбция амилолитических ферментов. М.:Пище-вая промышленность, 1966 - 80 с.

21. Шульман М.С., Вайнер Л.М. Сорбция амилазы крахмалом. -Прикл. биохим. микробиол., 1967, т. 3, вып. 6, с. 717 722.

22. Шульман М.С., Вайнер Л.М. Сорбция амилазы крахмалом. -Тр. ВНИИ Продуктов Брожения, 1970, вып. 19, с. 174 181.

23. Юшкайте З.А., Старкувене Б.П., Гальвидис И.Ю. Отбор продуцентов ^.-амилазы. Тез. II Всес. совещ. по ферментам микроорганизмов. Минск, 1978.

24. Bernfeld P. Amylases ol. and |J> . Methods in Enzymol., 1955, vol. 1, N 4, p. 149 - 150.

25. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram .quantities of proteins utilising principle of protein-dye binding. Anal. Biochem., 1976, vol. 72,1. Ж 1, p. 248 254.

26. Blom J., Bak A., Braae B. ol-Amylasen p>-Amylasen. - Hop-pe-Seylers Zeitschrift fur physiologishe Chemie, 1937, Bd. 250, N 64, St. 104 - 122.

27. Caldwell K.D., Axen R., Bergwall M., Porath J. Immobilization of enzymes based on hydrophobic interaction. I.Preparation and properties of a ^-amylase adsorbate. Biotech-nol. Bioeng.,1976, vol. 18, p. 1573 - 1588.

28. Caldwell K.D.,Studies on hydrophobic immobilisation of enzymes with speciel reference to starch hydrolases. Acta Univ. Uppsala Abstrs. Uppsala Diss. Рас. Sci., 1976, N 381, 20 p.

29. Cann J.R. Multibanded isoelectric focusing patterns produced by macromolecular interactions. Meth. Enzymol., 1979, vol. 61, part. H, p. 142 - 147.

30. Chernyak V.Ya., Magretova N.N., Drachev V.A. An "all-speed" autocalibration method for sedimentation equilibrium indilute homogeneous and multicomponent solutions. Anal. Biochem., 1982, vol. 123, N 1, p. 110 - 119.

31. Christensen T.B., Vegarud G., Birkenland A.J. Stabilisation of enzymes by glycosilation. Process. Biochem., 1976, vol. 11, П 6, p. 25 - 26.

32. Dube S.K., Nordin P. Isolation and properties of sorghum «^.-amylase. Arch. Biochem. Biophys., 1961, vol. 94, N 1, p. 121 - 127.

33. Dubois M., Gilles K.A., Hamilton J.K., Rebers P.A. Colo-rimetric method for determination of sugars and related substances. Anal. Chem., 1956, vol. 28, N 3, p. 350 - 356.

34. Erlanger B.F. The interaction of chymotrypsin with an insoluble substrate. Biochim. Biophys. Acta, 1958, vol. 27, N 3, p. 646 - 647.

35. Fairbanks G., Steck T.L., Wallach D.F.H. Electrophoretic analysis of the major polypeptides of the human erythrocyte membrane. Biochemictry, 1971, vol. 10, N 13, p. 2606 -2617.

36. Fogarty W,M., Griffin P.J. Preliminary investigations on the production, purification and properties of an extracellular xylanase from Bacillus polymyxa. Biochem. J., 1972, vol. 128, N 4, p. 125p 126p.

37. Fogarty W.M., Griffin P.J. Studies on production of an extracellular amylase of Bacillus polymyxa in batch cultures. J. Appl. Chem. Biotechnol., 1973, vol. 23, N 2, p. 166 - 167.

38. Fogarty W.M., Griffin P.J. A device for production of microbial extracellular enzymes in concentrated form. J. Appl. Chem. Biotechnol., 1973, vol. 23, N 5, p. 401 -.406.

39. Fogarty W.M., Griffin P.J. Some observations on the production of extracellular enzymes by Bacillus polymyxa. Biochem. Soc. Trans., 1973, vol. 1, N1, p. 263 - 265.

40. Fogarty W.M., Griffin P.J. Purification and properties of ^-amylase produced by Bacillus polymyxa. J. Appl. Bio-teclmol., 1975, vol. 25, N 3, p. 229 - 238.

41. Grant Ж.М., Robbins K.C. Studies on porcine elastase and proelastase. Arch. Biochem. Biophys., 1957, vol. 66, Ж 2, p. 396 - 403.

42. Griffin P.J., Fogarty W.M. Physicochemical properties of the native, zinc- and manganese-prepared metalloprotease of Bacillus polymyxa. Appl. Microbiol., 197.3, vol. 26, Ж 2, p. 191 - 195.

43. Griffin P.J., Pogarty W.M. Production of an amylolytic enzyme by Bacillus polymyxa in batch cultures. J. Appl. Chem. Biotechnol., 1973, vol. 23, Ж 4, p. 301 - 308.

44. Griffin P.J., Pogarty W.M. Preliminary observations on the starch-degrading system elaborated by Bacillus polymyxa. -Biochem. Soc. Trans., 1973, vol. 1, Ж 2, p. 397 400.

45. Griffin P.J., Pogarty W.M. Further studies on the amylolytic systems elaborated by Bacillus polymyxa. Biochem. Soc. Trans., 1973, vol. 1, 15, p. 1097 - 1100.

46. G. de la Haba. The Selective Adsorption of Rubbit-mus-cle glycogen phosphorylase by potato starch: a two-step procedure for isolation of enzyme in pure form. Biochim. Biophys. Acta, 1962, vol. 59, N 3, p. 672 - 674.

47. Hasegawa A., Miwa Ж., Oshima T., Imahori K. Studies on an o(-amylase from a thermophilic bacterium. I.Purification and characterisation. J.Biochem., 1976, vol. 79, И 1, p. 35 - 42.

48. Heller J., Schramm M. o^-Amylase limit dextrins of high molecular weight obtained from glycogen. Biochim. Biophys. Acta, 1964, vol. 81, N 1, p. 96 - 100.

49. Hexner P.E., Radford L.E., Beams J.W. Achievement of sedimentation equilibrium. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1961, vol. 47, N 11, p. 1848 - 1852.

50. Higashihara M., Okada S. Studies on ^-amylase of Вас. megaterium strain N 32. Agr. Biol. Chem., 1974, vol. 38, N 5, p. 1023 - Ю29.

51. Hockenhull D.J.D., Herbert D. The amylase and maltase of Clostridium acetobutilicum. Biochem. J., 1945, vol. 39, N 1, p. 102 - 106.

52. Holmbergh 0. Uber die Asorption von oC-Amylase aus Malz an Starke. Biochem. Z., 1933, Bd. 258, И 1, St. 134 -140.

53. Hon C.C., Reilly P.J. Properties of ^-amylase immobilized to alkylamine porous silica. Biotechn.Bioeng., 1979, vol. 21, N 3, p. 505 - 512.

54. Hoshino M., Hirose Y., Sano K., Mitsugi K. Adsorption of microbial jb-amylase on starch. Agr. Biol. Chem., 1975, vol. 39, Ж 12, p. 2415 -2416.

55. Kneen E., Beckord L.D. Quantity and qaulity of amylase produced by various bacterial isolates. Arch. Biochem. Biophys., 1946, vol. 10, N 1, p. 41 - 54.

56. Kocourek J., Ticha M., Kostir J. The use of diphenylami-ne-aniline-phosphoric acid reagent in the detection and differentiation of monosaccharides and their derivatives on paper chromatograms. J. Chromatogr., 1966, vol. 24, N 1, p. 117 - 124.

57. Kulp K. Carbohydrases. Ih book: Enzymes in Pood Processing. 1975. New-York - London: Ac. Press, Зле. p. 53 -122.

58. Leloir L.P., Goldenberg S.H. Synthesis of glycogen uridine diphosphate glucose in liver. J. Biol. Chem., 1960, vol. 235 - 1 4, p. 919 - 923.

59. Levitzki A., Heller J., Schramm M. Specific precipitation of enzyme by its substrate: the oC-amylase-macrodext-rine complex. Biochim. Biophys. Acta, 1964, vol. 81, 1\T1, p. 101 107.

60. Loyter A., Schramm M. The glycogen-amylase complex as a means of obtaining highly purified oC-amylases. Biochim. Biophys. Acta, 1962, vol. 65, N 2, p. 200 - 206.

61. Martensson K. Preparation of an immobilized two-enzyme system, ^,-amylase-pullulanase to an acrylic acid copolimer for the conversion of starch to maltose. II. Biotechnol. Bioeng., 1974, vol. 16, 1 5, p. 579 - 591.

62. Marshall J.J. Characterisation of Bacillus polymyxa amylase as an exo-acting (1-*-4)-<*.-D-glucans maltohydrola-se. FEBS Lett., 1974, vol. 46, N 1, p. 1-4.

63. Mercier C., Colas A. Les amylases en panification. -An-nales de la Nutrition et de 1'alimentation., 1967, vol. 21, p. B299 340.

64. Morita Y., Wadano A. Studies on Japanese radish ^-amylase. I.Purification and cristallization of ^-amylase from Ja-panese-radisch. Bull. Res. Inst. Pood Sci., Kyoto Univ., 1974, N 37, p. 9 - 18.

65. Murao S., Ohyama K. New amylase inhibitor (S-A1) from Streptomyces diastaticus var. amylostaticus No 2476. -Agr. Biol. Chem., 1975, vol. 39, N 11, p. 2271 2273.

66. Murao S., Ohyama K., Arai M. ^Ь-Amylase from Bacillus polymyxa No 72. Agr. Biol. Chem., 1979, vol. 43, N 4, p. 719 - 726.

67. Nanmori Т., Shinke R., Aoki K., Nishira H. yb-Amylase production by a rifampin-resistant, asporogenous mutant from Вас. cereus BQ 10-S1. Agr, Biol. Chem., 1983, vol. 47, N 3, p. 609 - 611.

68. Nanmori Т., Shinke R., Aoki K., Nishira H. Purification and characterisation of ^-amylase from Вас. cereus BQ 10-S1 Spo II. Agr. Biol. Chem., 1973, vol. 47, N 5, p. 941-965.

69. Norman В.В. The application of polysaccharide degrading enzymes in the starch industry. Microb. polysaccharides and polysaccharases. London e.a., 1979, p. 339 - 376.

70. Ghba R., Shibata Т., Ueda S. Preparation and properties of covalently immobilized jb-amylase on p-aminobenzylcellulose. J. Perment. Technol., 1979, vol. 57, N 2, p. 146 -150.

71. Ghba R., Ueda S. Production of maltose and maltotriose from starch and pullulan by an immobilized multienzyme of pullulanase and ^-amylase. Biotechnol. Bioeng., 1980, vol. 22, N 10, p. 2137 - 2154.

72. Ohlsson E. Sur 1 existence de deux ferments amylolyti-ques dans la diastase du malt. G. r. Lab. Carlsberg., 1926, vol. 16, N 7, p. 3 - 4.

73. Ohyama K., Murao S. Purification and some properties of amylase inhibitor (S-A1). Agr. Biol. Ghem., 1977, vol. 41, IT 11, p. 2221 - 2228.

74. Pasek A., Hanus J., Skachova H. Use of amylum derivatives for isolation of amylolytic enzymes. Nahrung, 1977, vol. 21, p. 113 - 116.

75. Pat. 3 804 718 (USA) Method of producing ^-amylase by bacterial fermentation/Hayashibara Co., Ltd. Japan; Okada S., Higashihara M. Piled 29.03.72, publ. 16.04.74, prior. 1.04.71 (Japan), Int. CI. С 12D 7/02.

76. Pat. 1 414 640 (Great Britain) Method for preparation of an enzyme adsorbed on starch/Ajimoto Co., Inc., Japan; Hoshino M., Tanaka K., Mitsugi K. Piled 22.12.72, publ. 19.11.75, prior. 25.12.71 (1115/71, Japan), Int. CI. С 07G 7/02, С 12D 13/Ю.

77. Pat. 52-46290(Japan) Method for production of maltose from starch/Sankatsu Kogyo,/ Ltd. Piled 5.06.73, publ. 24. 12.75, Int. CI. С 13k 7/00.

78. Pat. 1 426 976 (Great Britain) A method for the production of maltose/Sanmatsu Kogyo, Ltd., Japan; Yoshida Т., Yori-tomi K. Piled 9.04.74, publ. 3.03.76, prior. 5.06.73(Ja-pan), Int. CI. С 13k 7/00, С 08B 37/00, С 12L 1/10.

79. Pat. 56611437 (Japan) Method for producing of maltose/ Hayashibara Co., Ltd. Japan. Piled 12.01.73, publ. 14.03. 81,Int. CI. С 12P 19/22, С 13k 7/00.

80. Pat. 3 996 107(USA) A method for enzymatic production of starch conversion product with high maltose content/AB Stadex, Sweden; K.B.Martensson. Piled 28.08.74, prior. 28. 08.73(7311642, Sweden), publ. 7.12.76, Int. CI. С 12D 13/02.

81. Pat. 1 426 997(Great Britain) Enzymatic production ofstarch conversion product having a high maltose content/AB Stadex, Sweden; К.B.Martensson. Piled 27.08.74, prior. 28.08.73(7311642, Sweden), publ. 3.03.76, Int. CI. С 12D 13/02.

82. Pat. 4 016 038(USA) Process for preparing maltose from starches/Hayashibara Co., Japan; Sugimoto K., Hirao M., Ku-rimoto M., Miyake E. Piled 27.03.72, prior. 01.04.68(43-21367, Japan), publ. 5.04.77, Int. CI. С 12D 13/02.

83. Pat. 2 033 831(Great Britain) Preparing of maltose by saccharification of starch/Meiji Seika Kaisha, Ltd. Japan; Hidemasa Hikaka, Toshiaki Kohno, Toshiaki Eida. Piled 01. 12.79, prior. 7.12.78 (53-150547, Japan), publ. 30.07.80, Int. CI. С 12k 7/00.

84. Pat. 54039 475 (Japan) A method for production of highly purified maltose/Kogyo Co., Ltd. Japan. Piled 04.07. 75, publ. 28.11.79, Int. CI. С 12D 13/00.

85. Pat. 52-6232(Japan) A method for production of maltose using amylase complex, produced by Bacillus/Kogyo Co., Ltd. Japan. Piled 2.01.74, publ. 6.03.78, Int. CI. С 12D 13/00, С 13k 7/00, С 12D 13/10.

86. Pat. 52-9739(Japan) A method for producing maltose of high purity/Hayashibara Co., Japan. Piled 09.04.69, publ. 18.03.77, Int. CI. С 13k 7/00, С 12D 13/02.

87. Pat. 56-170178 (Japan) A method for production maltose of high purity/Hayashibara Co., Ltd. Japan. Piled 31.05. 71, publ. 20.04.81, Int. CI. С 12P 19/22.

88. Pat. 54-3938(Japan) A method for production of maltose from starch/Hayashibara Co., Japan. Piled 26.11.68, publ. 28.02.79, Int. CI. С 13k 7/00, С 13D 13/02.

89. Pat. 4 016 038 (USA) Process for preparing maltose from starches/Hayashibara Co., Japan; Sugimoto K., Hirao M., Kurimoto M., Myake E. Piled 27.03.72, prior. 1.04.69(43--21367, Japan), publ. 5.04.77, Int. CI. С 12D 13/02*

90. Pat. 54-3937(Japan) Method for preparing cristalline mal-tose/Hayashibara Co., Japan. Piled 18.11.68, publ. 28.11. 79, Int. CI. С 12D 13/02, С 13k 7/00.

91. Pat. 3 992 261(USA) Method for manufacturing maltose from starch by enzymes co-produced by a single microorganism

92. Agency of Industrial Science and Technology, Japan; Taka-saki Y., Takahara Y. Piled 6.01.75, prior. 11.01.74(49--6465, Japan), publ. 16.11.76, Int. CI. С 12D 13/02, 13/10, С 07G 7/02.

93. Pat. 3 998 696 (USA) A method for preparing maltose/ Mei'ji Seika Kaisha, Japan; Yomoto C., Adachi Т., Nakajima Y., Hidaka H., Yoshida Т., Sugawara P. Piled 17.05.74, n prior. 22.05.74(48-56373, Japan), publ. 21.12.76, Int. CI. С 12D 13/02.

94. Pat. 2 424 833 (BRD) Verfahren zur Herstellung von Mal-tose/Meiji Seika Kaisha, Japan; Yomoto C., Adachi Т., ITakaji-ma J., Hidaka H., Yoshida Т., Sugawara P. Piled 22.05.77, prior. 22.05.73(56373-73, Japan), publ. 28.05.75, Int. CI.1. С 12D 13/02.

95. Robyt J., Prench D. Purification and action pattern of an amylase from Bacillus polymyxa. Arch. Biochem. Biophys., 1964, vol. 104, N 2, p. 338 -. 345.

96. Rose D. The amylase of Bacillus polymyxa. Arch. Biochem. Biophys., 1948, vol. 16, N 3, p. 349 - 355.

97. Schramm M., Danon D. The mechanism of enzyme secreati-on by the cell. I Storage of amylase in the zymogen granules of the cell. Biochim. Biophys. Acta, 1961, vol. 50,1. N 1. p. 102 112.

98. Schwimmer S., Balls A.K. Isolation and properties of cristalline c^-amylase from germinated barley. I. Biol.юз

99. Chem., 1949, vol. 179, IT 3, p. 1063 Ю74.

100. Schinke R., Mugibayashi N. Studies on barley and malt amylases. Isolation and some properties of barley yb-amylase soluble in urine. Agr. Biol. Chem., 1971, vol. 35, N 9, p. 1381 - 1390.

101. Schinke R. Mugibayashi N. Studies on barley and malt amylases. Activation of zymogen ^-amylase in vivo and amylase formation in isolated aleurone layers. Agr. Biol. Chem., 1972, vol. 36, N 3, p. 378 - 382.

102. Schinke R., Nishira H., Mugibayashi N. Isolation of ^-amylase produsing microorganisms. Agr. Biol. Chem., 1974, vol. 38, N 665 - 666.

103. Schinke R., Kunimi Y., Nishira H. Isolation and characterisation of ^-amylase producing microorganisms. J. Per. Technol., 1975, vol. 53, N 10, p. 687 - 692.

104. Schinke R., Kunimi Y., Nishira H. Production and some enzymatic properties of Д-amylase of Pseudomonas sp. BQ 6. J. Perm. Technol., 1975, vol. 53, N 10, p. 698 - 703.

105. Schinke R., Kunimi Y., Nishira H. Production and some properties of ^-amylase of Bacillus sp. BQ 10. J. Perm. Technol., 1975, vol. 53, N 10, p. 693 - 697.

106. Schinke R., Aoki K., Nishira H., Yuki S. ^-Amylase production by a rifampin-resistant, asporogenous mutant of Вас. cereus and its sporogenous revertant. J. Perm. Technol., 1979, vol. 53, N 10, p. 307 - 312.

107. Schinke R., Yamanaka H., Nanmori Т., Aoki K., Nishira H. Fractionation of tryptofan from polypepton effective for bacterial^-amylase production. J. Perm. Technol., 1982, vol. 60, N 6, p. 585 - 589.

108. Solomon В. Starch hydrolysis by immobilized enzymes industrial applicatios. Adv. Biochem. Eng., 1978, vol. 10, p. 131 - 177.

109. Sova V. Amylazy, jejich ucinek a pouziti. Prumysl potravin, 1953, vol. 4, N 4, p. 151 - 155.

110. Spackman D.H., Stein W.H., Moore S. Automatic recording apparatus for use in the chromatography of amino acids. -Anal. Chem., 1958, vol. 31, N 7, p. 1190 1206.

111. Starkenstein E. Uber Permentwirkung und deren Beeinflus-sung durch Neutralsalze. Biochem. Z., 1910, Bd. 24, St. 210 - 218.

112. Straub P.B. Micro scale isolation amylase from Pancreas. Acta physiol. Acad. Sci. Hung., 1957, vol. 12, N 4, p. 295 - 297.

113. Suganuma Т., Mizukami Т., Moori K., Ohnishi M., Hiromi K. Studies on the action pattern of o^-amylase from Strepto-myces praecox NA-273. J. Biol. Chem., 1980, vol. 88, N 1, p. 131 - 140.

114. Takasaki Y. Production and utilisation of ^.-amylase and pullulanse from Вас. cereus var. mycoides. Agr. Biol. Chem., 1976, vol. 40, N 8, p. 1515 - 1523.

115. Takasaki Y. Purification and enzymatic properties of ^-amylase and pullulanase from Вас. cereus var. mycoides. -Agr. Biol. Chem., 1976, vol. 40, N 8, p. 1523 1539.

116. Takasaki Y. Studies on amylases from Bacillus effective for production of maltose. I.Purification and utilisation of ^-amylase and pullulanase. Rept. Perm. Res. Inst., 1978, N 50, p. 19 - 20.

117. Takasaki Y. Studies on amylases from Bacillus effective for production of maltose. II.Purification and enzymatic properties of ^-amylase and pullulanase from Bacillus cereus var. mycoides. Rept. Perm. Res. Inst., 1978, vol. 50, p. 29 - 34.

118. Takasaki Y. , Yamanobe T. Studies on amylase from Bacillus effective on maltose production. Part V. Rept. Perm. Res. Inst., 1978, vol. 50, p. 63-71.

119. Takasaki Y., Yamanobe T. Studies on amylases from Bacillus effective on production of maltose. Part VI. Rept. Perm. Res. Inst., 1979, vol. 52, p. 1 - 9.

120. Takasaki Y. Yamanobe T. Studies on amylases from Bacillus effective for production of maltose. Part VII. Rept. Perm. Res. Inst., 1979, vol. 52, p. 11 - 16.

121. Thayer R. The amylases of Pseudomonas saccharophila. -J. Bacteriol., 1953, vol. 66, Ж 6, p. 656 663.

122. Thomas M., Priest P. G., Stark J.R. Characterisation of an extracellular ^-amylase from Bacillus megaterium sensu stricto. J. Gen. Microbiol., 1980, vol. 118, Ж 1, p. 67 -72.

123. Tilden E.B., Hudson C.S. Preparation and properties of amylase produced by Bacillus macerans and Bacillus polymyxa. J. Bacteriol., 1942, vol. 43, Ж 4, p. 527 - 544.

124. Tkachuk R., Tipples K.H. Wheat ^-amylases. I.Purification and characterisation. Cereal Chem., 1966, vol. 43, Ж 1, p. 62 - 79.

125. Res. Inst., 1978, vol. 50, p. 51 62.

126. Yamanobe Т., Takasaki Y. Studies on amylases from Bacillus effective on maltose production. Part VIII. Rept. Perm. Res. Inst., 1979, vol. 52, p. 17 - 23.

127. Yamanobe Т., Takasaki Y.Production of maltose from starch of various origins by beta-amylase and pullulanaseof Bacillus cereus var. mycoides. J. Agr. Chem. Soc. Jap., 1979, vol. 53, N 3, p. 77-79.

128. Vesterberg 0., Svensson H. Isoelectric fractionation, analysis and characterisation of ampholytes in natural pH gradients. Acta Chem. Scand., 1966, vol. 20, К 3, p. 820 - 834.

129. Visuri K., Nummi M. Purification and characterisation of cristalline ^-amylase from barley. Eur. J. Biochem., 1972, vol. 28, U 4, p. 555 - 565.

130. Wadano A., Morita Y. Studies on Japanese-radish ^-amylase. Part II. Physicоchemical and enzymatic properties of cristalline Japanese-radish ^-amylase. - Bull. Res. Inst. Pood Sci., Kyoto Univ., 1974, vol.37, p. 19 - 27.

131. Weber K., Pringle J.R., Osborn M. Measurement of molecular weight by electrophoresis on SDS-acrylamide gel. -Meth. Enzymol., 1972, vol. 26C, p. 3 28.

132. Weber M., Poglietti M.-J., Percheron P. Purification d' oC-amylase par chromatographie d'affinite sur amidon reticule. Biochimie, 1976, vol. 58, N 11-12, p. 1299 - 1302.

133. Wijsman M.H.P.-La diastase considere un melange de maltase et de dextrinase. Rec. des travaux chim. des Pays Bas. Amsterdam, 1890, vol. 9, p. 1 - 13.

134. Woodward J.P. Enzymes in practical brewing. Brew. Dig., 1978, vol. 53, p. 5 - 44.

135. Ueda S., Ohba R., Kono S. fractionation of the gluco-amylase system from black-koji mold and the effects of adding isoamylase and amylolysis by glucoamylase fraction* -Starke, 1974, vol. 26, N 11, p. 374 378.

136. Ueda S. Raw strach digestion by amylases. J. Jap. Soc. Starch Sci., 1974, vol. 21, IT 3, p. 210 - 221.

137. Ueda S., Studies on raw starch digestion by enzymes from microorganisms. J. Jap. Soc. Starch. Sci., 1975, vol, 22, 1 4, p. 114 - 124.

138. Ueda S. Amylase adsorption on raw starch and its relation to raw starch digestion. J. Jap. Soc. Starch Sci., 1978, vol. 25, N 2, p. 124 - 131.

139. ШОСТКИНСКИЙ ЗАВОД ХИМИЧЕСКИХ РЕАКТИВОВ1. ИМЕНИ XXV СЪЕЗДА КПСС

140. J 245II0, г. Шостка, СумскСй обл.1. J от «.т?.-э г. м.22.1. Ваш JS 3178 от 5.01.79

141. Директору ВНИИПЭ т. Д.Г.Казляуакасу1Г .•.Г" 232028, г. Вильнюс,

142. Об использовании Дамилазь!. Ферменту, 8.

143. Прощу Вас сообщить существует ли в настоящий момент промышленное производство ^-амилазы или предполагаемое место и время его освоения.1. Главный инженер заводаts1. И.в. Галич

144. Гах 9-44-23 2 экз. М.М. 09.02.791. ВШАИ opu.ma^в*. JA .I'?1. САМУСКАС П.Б.1. V'"1. АКТо внедрении метода очистки амилаз на. основе специфической сорбции на крахмале

145. Представители Института биохимии ~ "к.б.н. ЧЮРЖС Т.К.1. СТЕПОНАВИЧЮС Ю.Ю.1. Мл.науч.сотр. РАШАП Р.К.26 января 1984 года.1. СССР1СТЕРСТВО ВЫСШЕГО И СРЕДНЕГО СПЕЦИАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

146. МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М. В. ЛОМОНОСОВА234, Москва, В-234, шнсхне горы, МГУ1. ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ1. Тел. [phone]. Акт о внедрении

147. Зам.декана Химического факультета, д.х.н.

148. Зам.зав.кафедрой химической энзимологии1. О.А.Петрий1. Н.Н.Угарова