Выделение водорода зелеными микроводорослями в условиях недостатка фосфора тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.05, кандидат наук Батырова, Хорческа Александровна

• Батырова, Хорческа Александровна
• кандидат наук
• 2015

Оглавление диссертации кандидат наук Батырова, Хорческа Александровна

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЗЕЛЕНЫХ ВОДОРОСЛЕЙ Chlamydomonas и Chlorella

1.2 ФОТООБРАЗОВАНИЕ ВОДОРОДА ЗЕЛЕНЫМИ

МИКРОВОДОРОСЛЯМИ

1.2.1 Общая характеристика процесса

1.2.2 Физиологические аспекты выделения водорода у зеленых

микроводорослей

1.2.3 Выделение водорода при разных интенсивностях света

1.2.4 Роль светозависимого выделения водорода в метаболизме

1.2.5 Гидрогеназа

1.3 ВЫДЕЛЕНИЕ ВОДОРОДА КУЛЬТУРАМИ С. reinhardtii В УСЛОВИЯХ НЕДОСТАТКА СЕРЫ

1.3.1 Физиология процесса выделения водорода в условиях недостатка серы

1.3.2 Способы получения голодающих по сере культур С. reinhardtii

1.3.3 Выделение водорода морскими микроводорослями

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 ОБЪЕКТЫ И УСЛОВИЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

2.2 ПОСТАНОВКА ЭКСПЕРИМЕНТОВ ПО ИЗУЧЕНИЮ ВЫДЕЛЕНИЯ ВОДОРОДА СУСПЕНЗИОННЫМИ S И Р ДЕФИЦИТНЫМИ КУЛЬТУРАМИ ЗЕЛЕНЫХ МИКРОВОДОРОСЛЕЙ С. reinhardtii. И Chlorella sp

2.3 ПОЛУЧЕНИЕ S, Р-ДЕФИЦИТНЫХ , S-ДЕФИЦИТНЫХ КУЛЬТУР МЕТОДОМ ОТМЫВАНИЯ

2.4 ИЗМЕРЕНИЕ ГИДРОГЕНАЗНОЙ АКТИВНОСТИ

2.5 ДРУГИЕ МЕТОДЫ

2.5.1 Определение крахмала

2.5.2 Определение ацетата

2.5.3 Определение водорода, кислорода, азота

2.5.4 Определение хлорофилла

2.5.5 Общий химический анализ

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 ВЫДЕЛЕНИЕ ВОДОРОДА Р-ДЕФИЦИТНЫМИ КУЛЬТУРАМИ ЗЕЛЕНОЙ МИКРОВОДОРОСЛИ С. reinhardtii В ФОТОГЕТЕРОТРОФНЫХ УСЛОВИЯХ

3.1.1 Выделение водорода культурами С. гетИагЛи при недостатке серы и удалении фосфора

из среды

3.1.2 Отработка метода фосфорного голодания с использованием культур С. reinhardtii

3.1.3 Подбор концентраций инокулята для получения Р-дефицитных культур C.reinhardtii

3.1.4 Выделение водорода в фотобиореакторе Р-дефицитными культурами С. reinhardtii в фотогетеротрофных условиях

3.2 ВЫДЕЛЕНИЕ ВОДОРОДА ЗЕЛЕНЫМИ ВОДОРОСЛЯМИ В УСЛОВИЯХ НЕДОСТАТКА

МАКРО И МИКРОЭЛЕМЕНТОВ

3.2.1 Особенности и ключевые различия в физиологии процесса выделения водорода при недостатке различных макро и микроэлементов

3.3 ВЫДЕЛЕНИЕ ВОДОРОДА Р-ДЕФИЦИТНЫМИ КУЛЬТУРАМИ ЗЕЛЕНОЙ МИКРОВОДОРОСЛИ Chlorella sp

3.3.1 Влияние начальных концентрации хлорофилла на накопление биомассы фотоавтотрофными культурами Chlorella sp

3.3.2 Влияние концентрации хлорофилла на накопление биомассы культурами Chlorella sp. и выделение водорода в искусственной морской воде

3.3.3 Выделение водорода Р-дефицитными культурами Chlorella sp. с использованием искусственной и натуральной морской воды

3.3.4 Влияние СОг на выделение водорода и накопление крахмала Р-дефицитными культурами

Chlorella sp

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ

ТАР - трис-ацетат-фосфатная среда;

ТА-Р - трис-ацетатная среда без фосфора;

TA-S - трис-ацетатная среда без серы;

TA-S-P- трис-ацетатная среда без серы и без фосфора;

НАДФН — никотинамидадениндинуклеотидфосфат;

АТФ — аденозинтрифосфат;

ГТФ — гуанозинтрифосфат;

ЛДГ — лактатдегидрогеназа;

ПДК — пируватдекарбоксилаза;

ПФОР —пируват-ферредоксин-оксидоредуктаза;

ПФЛ — пируват-формиат лиаза;

АДГ — алкоголь/альдегид де-гидрогеназа;

ФАТ — фосфоацетил трансфераза;

Рубиско — рибулозо-1,5-бифосфат карбоксилазы/оксигеназы;

ФС1 - Фотосистема 1;

ФС2 - Фотосистема 2;

Хл. - Хлорофилл;

Гд — гидрогеназа;

FeFe-Гд — Fe-Fe гидрогеназа;

ФД - ферредоксин;

Qa" — хинон А;

Qb--хинон В;

ЭТЦ- электрон-транспортная цепь;

ССК1 — светособирающий комплекс ФС1(2);

Ьб/f — бб/^-ком-плекс;

ПХ — пул пластохинонов;

ПЦ — пластоцианин;

ФНР — ферредоксин-НАДФ редуктаза;

DCMU — 3-[3,4- дихлорфенил]-1,1-Диметилмочевина (диурон);

СССР - карбонил-цианид-3-хлорфенилдразон;

С. vulgaris — Chlorella vulgaris;

С. fusca — Chlorella fusca;

S. obliquus —Scenedesmus obliquus",

C. reinhardtii — Chlamydomonas reinhardtii;

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Выделение водорода зелеными микроводорослями в условиях недостатка фосфора»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Молекулярный водород является экологически чистым энергоносителем. В настоящее время разрабатываются проекты его хранения, транспортировки и использования в будущей системе энергообеспечения разных стран, включая Россию. Вместе с тем для использования водорода в энергетике необходимо его экологически чистое производство. Возможны разные способы получения водорода, включая биологический. Некоторые микроводоросли способны к светозависимому выделению водорода, осуществляя биофотолиз воды. Такой способ получения водорода является экологически чистым, поскольку водород производится из воды, а продуктом его поглощения в топливных элементах является вода. При его сгорании также образуется в основном вода.

Микроводоросли способны к выделению водорода после анаэробной адаптации [Gaffron, Rubin, 1942]. В этом случае начальные скорости выделения водорода близки к скорости фотосинтеза. Однако, одновременно с водородом микроводоросли выделяют кислород, который токсичен для ключевого фермента выделения водорода, Fe-Fe-гидрогеназы [Янюшин, 1982]. Вследствие накопления кислорода активность гидрогеназы снижается, и через короткое время (в зависимости от условий эксперимента 10-1000 сек) выделение водорода прекращается.

В 2000 г американские ученые предложили способ существенного (до нескольких дней) увеличения длительности процесса выделения водорода [Melis et al.„ 2000]. Для этого культуры микроводорослей подвергали серному голоданию. За последние 15 лет этот метод был использован в десятках лабораторий мира, что позволило существенно продвинуться в понимании процесса выделения водорода микроводорослями [Цыганков, 2014]. Однако для практического использования такого способа получения водорода необходимо решить множество фундаментальных проблем, начиная от увеличения скорости процесса, проходя через повышение его стабильности и завершая поддержанием культур микроводорослей в активном состоянии. Среди этих проблем находится и проблема использования чистой воды. Ресурсы чистой воды на Земле не безграничны, и в случае практического применения фотовыделения водорода микроводорослями этот процесс с неизбежностью вступит в конкуренцию с остальными процессами, требующими чистой воды, начиная от потребления воды человечеством для питья и пищи, и завершая

сельским хозяйством. В то же время на Земле имеются практически неисчерпаемые запасы морской воды.

К началу наших исследований в научной литературе не встречалось сообщений о возможности выделения водорода морскими микроводорослями в условиях серного голодания в количествах, сопоставимых с пресноводными видами. В то же время было известно, что многие морские микроводоросли, в частности хлорелла, способны к синтезу гидрогеназ и светозависимому выделению водорода. Нами было сделано предположение, что невозможность получения выделения водорода морскими микроводорослями в условиях серного голодания обусловлена тем, что в морской воде находится значительное количество сульфатов. В результате процесс серного голодания не реализуется даже при исключении всех серных соединений из питательной среды.

Известно, что в составе воды морей и океанов находится очень незначительное количество фосфатов [Paytan et. al., 2007]. В ранних работах показано, что недостаток фосфора приводит к падению активности фотосистемы 2 [WykofF et al., 1998]. Однако выделения водорода в этих условиях не наблюдали. Таким образом, изучение выделения водорода морскими микроводорослями является актуальным.

Целью данной работы было выяснение возможности длительного выделения водорода морскими микроводорослями в условиях недостатка фосфора.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

• Разработать метод перевода пресноводных культур Clamydomonas reinhardtii в условия недостатка фосфора, когда культуры эффективно выделяют водород

• Подобрать условия для получения голодающих по фосфору культур морской микроводоросли Chlorella sp. в искусственной и натуральной морской воде.

• Проверить возможность выделения водорода в условиях недостатка фосфора культурами Chlorella sp. с использованием искусственной и натуральной морской воды.

• Изучить влияние углекислоты на выделение водорода культурами морских микроводорослей в условиях недостатка фосфора.

Научная новизна

Впервые было продемонстрировано выделение водорода культурами пресноводных микроводорослей в условиях недостатка фосфора.

Впервые показана способность морских микроводорослей к длительному выделению водорода в условиях фосфорного голодания.

Практическая значимость

Предложен метод получения голодающих по фосфору фотогетротрофных культур микроводорослей С. reinhardtii и Chlorella sp., который отличается простотой и надежностью. Показано, что метод применим как к пресноводным, так и морским микроводорослям. Использование метода в научных исследованиях позволит подключиться к исследованиям выделения водорода микроводорослями лабораториям и группам, владеющим штаммами морских микроводорослей, в том числе в России. Разработанный метод также может явиться основой для постановки лабораторных практикумов для обучения студентов приемам получения водорода с использованием микроводорослей на свету.

Положения, выносимые на защиту

На защиту данной диссертационной работы выносятся:

1) Метод получения культур пресноводных и морских микроводорослей, голодающих по фосфору.

2) Результаты демонстрирующие способность к значительному выделению водорода голодающими по фосфору пресноводными культурами С. reinhardtii.

3) Результаты демонстрирующие способность к значительному выделению водорода голодающими по фосфору культурами Clorella sp. как в искусственной морской воде, так и в воде Черного моря.

4) Результаты демонстрирующие, что добавление СО2 к голодающим по фосфору культурам морской Chlorella sp. приводит к значительному увеличению выходов водорода.

Степень достоверности полученных результатов

Данные, полученные в работе, обладают высокой степенью достоверности и обоснованы обширным фактическим материалом. Основные результаты диссертационной работы опубликованы в рецензируемых научных изданиях.

Апробация работы

Результаты работы были представлены на 9-й международной Гидрогеназной конференции (Уппсала, Швеция, 2010), на международной конференции «Исследование фотосинтеза для устойчивого развития» (Баку, Азербайджан, 2011), на технологическом саммите Фраунхофер- Делавер «Энергетика и естественные науки - решения для устойчивого развития» (Ньюарк, США, 2011), международной конференции «Исследование фотосинтеза для устойчивого развития» в честь Владимира А. Шувалова (Пущино, Россия, 2014). Работа была поддержана грантом РФФИ (15-54-50032).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 7 работ, из них 3 - в зарубежных журналах, цитируемых базой данных Web of Science, 4 - в сборниках тезисов конференций.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на 85 страницах, иллюстрирована 13 рисунками и 7 таблицами. Список литературы содержит 168 источника (из них 154 на английском языке).

Благодарности

Автор выражает благодарность коллективу лаборатории биотехнологии и физиологии фототрофных организмов, в особенности Цыганкову Анатолию Анатольевичу, Косоурову Сергею Николаевичу, Лауринавичене Татьяне Викториновне, Зорину Николаю Алексеевичу, Гавришевой Анастасие Игоревне, Хуснутдиновой Анне Наилевне, Шастику Евгению Сергеевичу, Ельцовой Зинаиде Александровне, Петушковой Екатерине Павловне.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЗЕЛЕНЫХ ВОДОРОСЛЕЙ Chlamydomonas и

Chlorella.

Chlamydomonas- это одноклеточная зеленая водоросль, относящаяся к отделу Зеленые водоросли Chlorophyta, классу Вольвоксовые Volvocophyceae, порядку Хламидомонадовые Chlamydomonadaceae, роду Chlamydomonas. Наиболее изученной и являющейся модельным организмом для исследований выделения водорода является Chlamydomonas reinhardtii [Chlamy sourcebook].

Chlamydomonas reinhardtii является обитателем мелких, хорошо прогреваемых и загрязненных водоемов. Клетки, размером 11.4-14 цм в длину и 7.8-15цм в ширину (эллипсоидной или овальной формы), имеют хорошо выраженную оболочку, шаровидное ядро в центре клетки, один чашевидный хлоропласт. Клетки подвижны благодаря наличию двух жгутиков. Основным материалом клеточной стенки является целлюлоза, запасным веществом - крахмал. Водоросль способна как к половому, так и к бесполому размножению. В результате полового размножения образуется зигота, которая прорастает после периода покоя. При прорастании зиготы образуются 4 зооспоры (бесполое размножение), а из последних - новые особи [Голлербах, 1977].

Chlorella - это одноклеточная морская зеленая водоросль, относящаяся к отделу Зеленые водоросли Chlorophyta, классу Trebouxiophyceae, порядку хлорококковых Chlorococcales , семейству хлорелловых Chlorellaceae, роду хлорелла Chlorella [Виноградова, 1979]. Клетки, размером 2-10 цм в диаметре (эллипсоидной или овальной формы), неподвижны. В составе клеточной оболочки находятся полисахариды, вторичный полимеризованный каротиноид спорополленин и, природная целлюлоза. Под оболочкой цитоплазма, ядро, хлоропласт, вакуоль, крахмальные зерна.

Микроводоросли Chlorella в зависимости от вида имеют широкий спектр температуры культивирования (22-45°С) [Lee et. al., 1988]. Отсутствует сезонность в их размножении. Chlorella не требовательна к питательной среде и способна к высокой степени очистки различных категорий сточных вод [Винберг Г.Г., 1961; Сивко Т.Н. и др., 1961].

Многие виды Chlorella имеет устойчивость к засоленной воде (с повышенным содержанием хлористого натрия). Chlorella также известна выраженными антагонистическими свойствами к альгофлоре, бактериям, грибам, дрожжам и

инфузориям, обладает невосприимчивостью к фагам [Левина Р.И., 1961]. У Chlorella полностью отсутствует половое размножение, и рост культуры идет за счет формирования в материнской клетке дочерних автоспор, которых может быть в норме 2, 4, 8, 16, 32 (известно образование до 64 автоспор) в зависимости от штамма и условий культивирования. После окончания деления автоспоры выходят из клетки путем разрыва оболочки; молодые клетки, интенсивно фотосинтезируя, растут до стадии созревания, и весь цикл повторяется сначала. Эта особенность облегчает получение синхронных культур водорослей, т. е. культур, у которых все клетки находятся на одной и той же стадии развития.

Chlorella и С. reinhardtii - фототрофные организмы, осуществляющие оксигенный фотосинтез, с участием двух фотосистем подобно высшим растениям. Основными фотосинтезирующими пигментами являются хлорофиллы а и Ь. Когда кванты света поглощаются фотосистемой 1, богатые энергией электроны выбрасываются из реакционного центра и по цепи переносчиков электронов передаются на НАДФ+, восстанавливая его до НАДФН. В результате этого процесса фотосистема 1 переходит в окисленное состояние и приобретает способность к принятию электрона, выбрасываемого с фотосистемы 2 при ее освещении. Электрон с фотосистемы 2 также под действием света попадает на фотосистему 1 по цепи переносчиков, связывающей две фотосистемы. Перенос электрона приводит к тому, что фотосистема 2 также становится окисленной и принимает электрон, который поступает от воды. Таким образом, расщепляясь, молекула воды дает: электрон для фотосистемы 2, Н+- ионы, поступающие в среду и молекулярный кислород, выделяемый в газовую фазу [Климов, 1996].

С. reinhardtii, Chlorella способны расти в различных условиях: фототрофно (фотоавтотрофно, фотомиксотрофно и фотогетеротрофно) - на свету, и хемогетеротрофно - в темноте, аэробно (за счет дыхания) и анаэробно (за счет брожения). При автотрофном росте водоросли ассимилируют СОг в качестве источника углерода, при гетеротрофном росте используют ацетат. Простота культивирования и достаточно высокая скорость роста обусловили использование этих водорослей в качестве объекта исследования всех аспектов фотосинтеза [Hurris, 1989], для фотобиотехнологических целей [Цоглин, Пронина., 2012], а в последние годы и для исследования метаболизма водорода [Цыганков, 2014].

1.2 ФОТООБРАЗОВАНИЕ ВОДОРОДА ЗЕЛЕНЫМИ МИКРОВОДОРОСЛЯМИ

1.2.1 Общая характеристика процесса

Впервые способность микроводорослей к поглощению водорода была показана Гаффроном в 1940 году [цит. по [Кондратьева и Гоготов, 1981]] при изучении зеленой микроводоросли Scenedesmus obliquus. Это открытие явилось подтверждением обобщенной формулы фотосинтеза, объединяющей оксигенный и аноксигенный фотосинтез и предложенной Ван Нилем:

С02+Н2А=[СН20]+2А+Н20

Впоследствии Гаффроном и Рубиным была обнаружена способность некоторых одноклеточных зеленых микроводорослей выделять молекулярный водород при освещении [Gaffron, Rubin, 1942]. Ими была установлена способность зеленых микроводорослей в анаэробных условиях использовать водород в качестве электронного донора в процессе фиксации С02, и продуцировать его как в темноте, так и на свету.

Дальнейшие исследования показали, что способность к вовлечению водорода в метаболизм присуща значительному числу микроводорослей из разных систематических групп. К настоящему времени можно считать установленным, что способностью к светозависимому выделению водорода обладают 30 родов зеленых водорослей, два рода желто-зеленых водорослей и одна диатомовая водоросль [Boichenko and Hoffmann, 1994]. Выделение водорода не обнаружено у макроводорослей.

Микроводоросли в обычных условиях не выделяют водород, используя энергию, запасенную при фотосинтезе в виде АТФ и НАДФН для собственного метаболизма. Восстановление НАДФ происходит при переносе электронов от восстановленного за счет фотосинтеза ФД (ферредоксин) к НАДФ при участии ферредоксин: НАДФ оксидоредуктазы.

У видов, способных к синтезу Fe-гидрогеназы, обнаруживается светозависимое выделение водорода после предварительной темновой анаэробной адаптации. В этом случае Fe-гидрогеназы обеспечивают перенос электронов с восстановленного ферредоксина на Н+ с образованием Н2 [Цыганков, 2006]:

фдвосст + 2н+ фд0к + Н2

Считается, что выделение водорода необходимо микроводорослям для сброса избытка восстановителя при переходе от анаэробных темновых условий к световым [Appel, Schulz, 1998].

После темновой анаэробной адаптации клетки микроводорослей адаптированы к анаэробному типу питания за счет сбраживания накопленного крахмала, цикл Кальвина неактивен и клетки имеют избыток восстановителя в виде НАД(Ф)Н (общая особенность брожения). Поэтому при включении света у таких микроводорослей весь фотосинтетический поток электронов направляется на гидрогеназу, и происходит выделение водорода. Скорость этого процесса близка к скорости СС>2-зависимого выделения кислорода и достигает у наиболее активных продуцентов водорода 300-500 ммоль (чтХл)"1 [Бойченко и др., 1989]. По мере накопления кислорода происходит все более нарастающая инактивация гидрогеназы. В итоге скорость выделения водорода падает. Время, необходимое для включения цикла Кальвина и общего перехода с питания по типу брожения на фототрофный тип примерно соответствует времени, необходимому для накопления образовавшегося кислорода в концентрации достаточной для «выключения» гидрогеназы.

Таким образом, для получения заметных количеств водорода необходимо постоянное удаление из культуры кислорода, выделяющегося в процессе фотосинтеза.

1.2.2 Физиологические аспекты выделения водорода у зеленых микроводорослей

За последнее время был достигнут значительный прогресс в области исследования выделения водорода зелеными водорослями. Известны практически все участники электрон-транспортной цепи, ведущей к образованию водорода [Boichenko et al., 2004]. Выявлены гены кодирующие гидрогеназы [Forestier et al., 2003], а также обнаружены продукты генов, необходимых для матурации гидрогеназ у микроводорослей, и изучено их функционирование [Posewitz et al., 2005]. Изучены особенности регуляции активности фотосистем в условиях выделения водорода [Antal et al., 2003].

Среди представителей Chlorophyta, продуцирующих водород, наибольшее внимание уделяется С. reinhadtii. Как модельная система Chlamydomonas широко используется в исследовательских лабораториях для изучения разных аспектов фотосинтеза. Эта одноклеточная водоросль при благоприятных условиях быстро растет, в некоторых случаях она способна удваивать биомассу за 6 ч, при этом не требуется больших усилий для поддержания ее роста [Hurris, 1989].

С. reinhardîii синтезирует две практически идентичные по строению, но по разному регулирующиеся Фд- зависимые [FeFeJ-гидрогеназы HYDA1 и HYDA2 [Forestier et al., 2003], из которых только HYDA1 играет значительную роль в выделении водорода. Обе гидрогеназы обладают высокой активностью и синтезируются в анаэробных

условиях. Общим свойством всех [FeFeJ-гидрогеназы является их быстрая необратимая инактивация в присутствии следов кислорода.

В настоящее время известно, что Chlamydomonas выделяет Нг за счет двух светозависимых электрон-транспортных путей (с участием двух фотосистем и с участием лишь ФС1), а также в процессе темнового брожения (Рисунок 1) [Цыганков, 2006]. В первом случае светозависимое выделение водорода это последствие прямого биофотолиза, в процессе которого ФС2 катализирует фотосинтетическое разложение воды с выделением 02 и сбросом электронов на электронтранспортную цепь с последующим восстановлением Фд (а именно Фд кодируемого геном PetF), который в свою очередь донирует электроны на гидрогеназу для восстановления Н+ с образованием Нг. Но вследствие необратимой инактивации [FeFe]- гидрогеназ в присутствие кислорода [Stripp et al., 2009b], выделение водорода останавливается вскоре после того как микроводоросли начинают аккумулировать кислород в процессе фотосинтеза [Ghirardi et al., 1997]

Во втором случае светозависимое выделение водорода происходит за счет функционирования ФС1 с использованием восстановителя, образующегося чаще всего при гликолизе. В электронном транспорте последовательно участвуют Пх (пул пластохинонов), цитохром Ь6/комплекс (Цит b6f), пласто- цианин (Пц), ФС I и ферредоксин (Фд), передающий электроны гидрогеназе HydAl. Фд выступает донором электронов также для ферредоксин - НАДФ-редуктазы (ФНР) [Mus et al., 2005; Cournac et al., 2000].

Рисунок 1. Взаимосвязь фотосинтетической электронтранспортной цепи с выделением Нг. Ф С1 — фото-система 1; ФС2 — фотосистема 2; ССК1 (2) — светособирающий комплекс ФС1 (2); Ьб/f— 66/^-ком-плекс; ПХ — пул пластохинонов; ПЦ — пластоцианин; ФД— ферредоксин; ФНР — ферредоксин-НАДФ редуктаза; FeFe-Гд — Fe-Fe гидрогеназа [ Цыганков, 2014].

Выделение водорода микроводорослями в темноте в анаэробных условиях происходит за счет брожения. Рабочая модель анаэробного метаболизма С. reinhardtii в темноте (Рисунок 2) [Цыганков, 2014], основанная на данных геномных, транскриптомных, протеомных и метаболомных данных, разработана рядом авторов [Grossman et al., 2007;Mus et al., 2007]. В этой модели основным путем получения водорода является окисление пирувата с восстановлением ферредоксина. Восстановленный ферредоксин взаимодействует с гидрогеназой с образованием водорода.

В процессе темнового брожения значительная часть запасов крахмала гидролизируется амилазой до Сахаров, которые в свою очередь окисляются до пирувата в процессе гликолиза. Пируват служит основным субстратом в процессе брожения, и его деградация приводит к образованию различных органических кислот, ацетил- КоА , этанола и Ш. В С. reinhardtii, разложение пирувата осуществляют два ключевых фермента пируват - формиат - лиаза1 (ПФЛ1), и пируват- ферредоксин- оксидоредуктаза 1 (ПФОР в некоторых обзорах ПФР). ПФЛ1 локализуется как в митохондриях, так и в хлоропластах [Kreuzberg et al., 1987; Atteia et al., 2006]. ПФЛ1 катализирует неокислительную реакцию превращения пирувата в ацетил-КоА и форимиат [Wagner et al., 1992]. В свою очередь локализованная в хлоропластах ПФОР1 окисляет пируват до ацетил-КоА и СОг с одновременным восстановлением двух молекул Фд, которые в дальнейшем могут быть использованы в процессе выделения водорода [Muller et al., 2003]. Следует отметить, что далеко не все микроводоросли - активные продуценты водорода на свету, так же активно выделяют водород и в темноте. Так, например, модельный организм для изучения световых процессов, С. reinhardtii сс 124, выделяет водород в темноте примерно в 300-500 раз медленнее, чем на свету [Meuser et al., 2012]. В то же время морской штамм Chlamydomonas выделяет водород в темноте со скоростью, близкой к светозависимому выделению водорода модельным штаммом [Miura et al., 1986; Miura et al., 1992]. По-видимому, сопряжение гидрогеназ с фотосинтетической электрон-транспортной цепью и анаэробным метаболизмом имеет неодинаковую эффективность у разных штаммов микроводорослей.

Ацетальгид

Н+-

Нг

J

Фд ПФОР

С02 ]

Гд

С02

АДГ

Формиат

АТФ

Адетилфосфат

Этанол

Ацетаткиназа

Ацетат

Рисунок 2. Метаболизм пирувата у С. reinhardtii (адаптировано из [Burgess et al., 2011]). Ферменты заключены в прямоугольник. ЛДГ — лактатдегидрогеназа; ПДК — пируватдекарбоксилаза; ПФОР —пируват-ферредоксин-оксидоредуктаза; ПФЛ — пируват-формиат лиаза; АДГ — алкоголь/альдегид де-гидрогеназа; ФАТ — фосфоацетил трансфераза; Гд — гидрогеназа [ Цыганков, 2014].

Когда адаптированная к темноте культура С. reinhardtii подвергается внезапному освещению, процесс фотосинтеза запускается мгновенно, и, как следствие, происходит восстановление Фд до более высокой степени в сравнению с темновыми условиями. В связи с переизбытком восстановленного НАДФН, обусловленного предыдущим процессом брожения, восстановление НАДФ+ затруднено. При наличии в клетках активной гидрогеназы происходит кратковременное выделение Нг. Скорость выделения водорода очень высокая в начале освещения, и у некоторых зеленых микроводорослей может достигать таких же значений как и скорость фотосинтетического выделения кислорода до 500 цмоль мг"1 Хл ч"1 [Boichenko and Hoffmann 1994, ,Boichenko et al., 2004].

Исследования с высоким временным разрешением, показали, что при освещении с интенсивностью 0,03 Вт м"2 скорость выделения водорода у адаптированной в анаэробных темновых условиях культуры Chlorella vulgaris достигает максимума через 2,5 сек, и кинетика является линейной, по крайней мере в течение 1 мин [Бойченко др., 1983]. Однако при интенсивности освещения примерно 2 Вт м"2 выделение водорода этой

культурой достигает максимума через 0,6 сек и начинает падать через 1 сек после начала освещения. Другими исследователями было показано снижение скорости выделения водорода спустя несколько минут после начала освещения с последующей полной остановкой [Greenbaum, 1980; Yanyushin, 1982Ь]. Сейчас общепризнано, что снижение скорости выделения водорода - результат ингибирования гидрогеназы кислородом, образующегося в процессе фотосинтеза [Ghirardi et al., 1997]. В течение того времени, когда кислород в среде накапливается до ингибирующих гидрогеназу концентраций, происходит включение цикла Кальвина. У микроводорослей появляется возможность использования восстановительных эквивалентов, и потребность в сбросе избытка восстановителя отпадает. Для начального выделения водорода участие ФС2 не является абсолютно необходимым. Так было показано, что добавление DCMU- 3-[3,4-дихлорфенил]-1,1-диметилмочевина (также известен как диурон), ингибитора транспорта электронов между хиноном A (Qa") и хиноном В ((^В)-вторичным акцептором электронов не ингибирует выделение водорода в течение первой секунды освещения, но скорость выделения водорода начинает значительно снижаться после 1 сек. освещения [Boichenko et al., 1983] . В присутствии DCMU источником электронов для гидрогеназы являются эндогенные восстановители, образующиеся в процессе деградации крахмала, так же было показано, что выделение водорода ингибируется этим разобщителем на 20% у зеленых водорослей Chlorella, Scenedesmus, Ankistrodesmus и некоторых видов Chlamydomonas [Stuart et al., 1972]. Это позволило авторам сделать вывод, что основным донором электронов является вода [Stuart et al., 1972; Greenbaum, 1988; Pow et al., 1979]. Однако у других водорослей (Chlorella fusca, некоторые виды Chlamydomonas) ингибирование выделения водорода диуроном не наблюдалось [Stuart et al., 1972]. Таким образом очень высокие начальные скорости выделения водорода обещают найти практическое применение процесса в системах биоконверсии солнечной энергии. Но поскольку гидрогеназа чувствительна к кислороду, то донирование электронов от ФС2 при разложении воды для выделения водорода зависит от содержания кислорода в среде [Pow, Rrasana, 1979]. При использовании дитионита для удалении кислорода максимальная скорость выделения водорода составляла 20-30 ммоль (гХл)"1 ч"1 у Chlorella и Scenodesmus, а длительность выделения 1-2 часа. У С. reinhardtii скорость фотообразования водорода ниже (2-3 ммоль (гХл) 'ч1), но при постоянном удалении выделяющегося газа из среды инертным газом (гелий), длительность выделения составляла 160 ч [Greenbaum, 1988; Reeves, Greenbaum, 1985]. Для уменьшения концентрации кислорода было предложено также увеличивать относительный объем газовой фазы, что облегчает диффузию Ог из жидкости [Greenbaum et al., 2001], при

одновременном чередовании циклов светового выделения Нг (1 ч) и темнового удаления кислорода (2 ч) в сочетании с периодами ассимиляции СОг позволило продлить получение водорода в фотобиореакторе до 1400 ч [Greenbaum et al., 2001].

Полученные разными авторами скорости выделения Нг тем не менее значительно ниже потенциальных возможностей [FeFej-гидрогеназы. Так, кратковременные измерения гидрогеназной активности in vitro в неочищенных клеточных экстрактах с использованием в качестве донора восстановленного метилвиологена, показали максимальные скорости до 300-500 ммоль (гХлУ'ч"1 [Янюшин, 1982].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Батырова, Хорческа Александровна, 2015 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

[1] Abeles F.B. Cell-free hydrogenase from Chlamydomonas. II Plant Physiology. 1964. 39: 169-176.

[2] Allen R.M., Chatterjee R., Ludden P.W., Shah V.K. Incorporation of iron and sulfur from NifB cofactor into the iron-molybdenum cofactor of dinitrogenase. // J. Biol. Chem. 1995.270: 26890-26896.

[3] Antal Т.К., Krendeleva Т. E., Laurinavichene T.V., Makarova V.V., Ghirardi M. L., Rubina В., Tsygankov A.A., Seibert M. The dependence of algal H2 production on Photosystem II and 02 consumption activities in sulfur-deprived Chlamydomonas reinhardtii cells. // BBA-Bioenergetics. 2003. 1607: 153-160.

[4] Antal TK, Krendeleva ТЕ, Rubin AB. Acclimation of green algae to sulfur deficiency: underlying mechanisms and application for hydrogen production. // Applied Microbiology and Biotechnology. 2011. 89: 3-15.

[5] Antal TK, Volgusheva AA, Kukarskih GP, Bulychev AA, Krendeleva ТЕ, Rubin AB. Effects of sulfur limitation on photosystem II functioning in Chlamydomonas reinhardtii as probed by chlorophyll a fluorescence. // Physiologia Plantarum. 2006 .128: 360-367.

[6] Aparicio PJ, Azuara MP, Ballesteros A, Fernandez VM. Effects of light-intensity and oxidized nitrogensources on hydrogen-production by Chlamydomonas reinhardtii. II Plant Physiology.1985. 78: 803-806.

[7] Appel J., Schulz R. Hydrogen metabolism in organisms with oxygenic photosynthesis: hydrogenase as important regulatory devices for proper redox poising? // Journal of Photochemistry And Photobiology B-Biology. 1998. V. 47, № 1. C. 1-11.

[8] Atteia A, van Lis R, Gelius-Dietrich G, Adrait A, Garin J, Joyard J, Rolland N, Martin W. Pyruvate formate-lyase and a novel route of eukaryotic ATP synthesis in Chlamydomonas mitochondria. // Journal of Biological Chemistry.2006. 281: 99099918.

[9] Bamberger ES, D King.DL Erbbes, M Gibbs. Нг and СОг evolution by anaerobically adapted Chlamydomonas reinhardtii F-60. // Plant Physiol. 1982. V. 69. P. 1268-1273.

[10] Batyrova KA, Tsygankov AA, Kosourov SN. Sustained hydrogen photoproduction by phosphorus-deprived Chlamydomonas reinhardtii cultures. // International Journal of Hydrogen Energy. 2012. 37: 8834-8839.

[11] Bhosale, S.H.; Pant, A.; Khan, M.I. Purification and characterization of putative alkaline NiFe-hydrogenase from unicellular marine green alga, Tetraselmis. kochinensis. II

NCIM 1605. Microbiol. Res. 2009. 164, 131-137. Biochemical and Biophysical Research Communications 417: 704-709.

[12] Bock A., King P.W., Blokesch M., Posewitz M.C. Maturation of hydrogenases. // Advances in Microbial Physiology. 2006. 51: 1-71.

[13] Boichenko V, Arkhipov V, Litvin F. Simultaneous measurements of fluorescence induction and hydrogen evolution of Chlorella under anaerobic conditions. // Biophysics Russ. 1983.28: 976-979.

[14] Boichenko V., Greenbaum E., Seibert M. Hydrogen production by photosynthetic microorganisms. // In: Photoconversion of Solar Energy: Molecular to Global Photosynthesis. Archer, M.D. and Barber, J., eds. 2004. vol. 2, Imperial College Press, London, P. 397-452.

[15] Boichenko V.A., Hoffmann P. Photosynthetic hydrogen-production in prokaryotes and eukaryotes — occurrence, mechanism, and functions. Photosynthetica 30: 527-552.

[16] Brand J.J., Wright J., Lien S. 1989. Hydrogen production by eukaryotic algae. // Biotechnology and Bioengineering. 1994. 33: 1482-1488.

[17] Buhrke T., Loscher S., Lenz O., Schlodder E., Zebger I., Andersen L.K., Hildebrandt P., Dau H., Friedrich B., Haumann M. Reduction'of unusual iron-sulfur clusters in the H2-sensing regulatory Ni-Fe hydrogenase from Ralstonia eutropha HI6. // J. Bacteriol. 2005.280: 19488-19495.

[18] Cakmak T, Angun P, Demiray YE, Ozkan AD, Elibol Z, Tekinay T. Differential effects of nitrogen and sulfur deprivation on growth and biodiesel feedstock production of Chlamydomonas reinhardtii. II Biotechnology and Bioengineering. 2012. 109: 19471957.

[19] Chochois V, Dauvillee D, Beyly A, Tolleter D, Cuine S, Timpano H, Ball S, Cournac, L., and Peltier, G. Hydrogen production in Chlamydomonas: PSIISolar- dependent and independent pathways differ in their requirement on starch metabolism. // Plant Physiol. 2009. 151,613-640.

[20] Cournac L, Redding K, Ravenel J, Rumeau D, Josse EM, Kuntz M, Peltier G. Electron flow between photosystem II and oxygen in chloroplasts of photosystem I-deficient algae is mediated by a quinol oxidase involved in chlororespiration. // Journal of Biological Chemistry. 2000. 275: 17256-17262.

[21] Cohen J., Kim K., Posewitz M., Ghirardi M.L., Schulten K., et al. Molecular dynamics and experimental investigation of H2 and 02 diffusion in [Fe]-hydrogenase. // Biochem Soc. Trans. 2005. 33: 80-82.

[22] D'Adamo S, Jinkerson RE, Boyd ES, Brown SL, Baxter BK, Peters JW, et al. Evolutionary and Biotechnological Implications of Robust Hydrogenase Activity in Halophilic Strains of Tetraselmis. // PLoS ONE. 2014. 91: e85812.

[23] de Hostos E. L., Schilling and A.R. Grosman. Structure and expression of the gene encoding the periplasmic arylosulfatase from Chlamydomonas reinhardtii. II Mol. Gen. Genet. 1988. V. 218. P. 229-239.

[24] Degrenne B, Pruvost J, Christophe G, Cornet JF, Cogne G, Legrand J. Investigation of the combined effects of acetate and photobioreactor illuminated fraction in the induction of anoxia for hydrogen production by Chlamydomonas reinhardtii. II International Journal of Hydrogen Energy. 2010. 35: 1074110749.

[25] Dos Santos P.C., Dean D.R., Hu Y., Ribbe M.W. Formation and insertion of the nitrogenase iron-molybdenum cofactor. // Chem. Rev. 2004. 104: 1159-1173.33.

[26] Ducat D.C., Sachdeva G., Silver P.A. 2011 Rewiring hydrogenase-dependent redox circuits in cyanobacteria.// Proc. Natl. Acad. Sci. 2011. 108: 3941-3946.

[27] Duche O., Elsen S., Cournac L., Colbeau A. Enlarging the gas access channel to the active site renders the regulatory hydrogenase HupUV of Rhodobacter capsulatus 02 sensitive without affecting its transductory activity. // FEBS J. 2005. 272: 3899-3908.

[28] Erbes D.L., King D., Gibbs M. Inactivation of hydrogenase in cell-free extracts and whole cells of Chlamydomonas reinhardtii by oxygen. // Plant Physiology. 1979. 63: 1138-1142.

[29] Florin L., Tsokoglou A., Happe T. A novel type of iron hydrogenase in the green alga Scenedesmus obliquus is linked to the photosynthetic electron transport chain.// Journal of Biological Chemistry. 2001. 276: 6125-6132.

[30] Forestier M., King P.. Zhang L., Posewitz M., Schwarzer S., Happe T., Ghirardi M.L., Seibert M. Expression of two [Fe]-hydrogenases in Chlamydomonas reinhardtii under anaerobic conditions. // European Journal of Biochemistry. 2003. 270: 2750-2758.

[31] Fouchard S, Hemschemeier A, Caruana A, Pruvost K, Legrand J, Happe T, Peltier G, Cournac L . Autotrophic and mixotrophic hydrogen photoproduction in sulfur-deprived Chlamydomonas cells. //Applied and Environmental Microbiology. 2005. 71: 61996205.

[32] Gaffron H., Rubin J. Fermentative and photochemical production of hydrogen in algae. //J. Gen. Physiol. 1942. 26: 219-240.

[33] Gfeller R. P., Gibbs M. Fermentative metabolism of Chlamydomonas reinhardtii. I. Analysis of fermentative products from starch in dark and light. // Plant Phisiol. 1984. V. 75. P.212-218.

[34] Ghirardi M.L., Dubini A., Yu J., Maness P. C. Photobiological hydrogen producing systems. // Chem. Soc. 2009. Rev. 38: 52-61.

[35] Ghirardi M. L., Kosourov S., Tsygankov A., Seibert M. Two-phase photobiological algal h2-production system.// Proc. 2000. DOE Hydrogen Program Review. 2006. NREL: CP-570-28890.

[36] Ghirardi M. L., Zhang L., Flyn T., Seibert M., Greenbaum E., Melis A. Microalgae: a green source of renewable H2 // Trends in Biotechnol. 2000. V.18: P. 506-511.

[37] Ghirardi M.L., Posewitz M.C., Maness P.C., Dubini A., Yu J., Seibert M. Hydrogenase and hydrogen photoproduction in oxygenic photosynthetic organisms. // Annu. Rev. Plant Biol. 2007. 58: 71-91.

[38] Ghirardi M.L., King P.W., Posewitz M.C., Mabess P.C., Fedorov A., Kim K., et al. Approaches to developing biological H2- producing organisms and processes. // Biochem. Soc. Trans. 2005. V. 33. P. 70-72.

[39] Ghirardi M.L., Mohanty P. Oxygenic hydrogen photoproduction: current status of the technology. // Curr. Sci. 2010. 98: 499-507.

[40] Ghirardi ML, Togasaki RK and Seibert M. Oxygen sensitivity of algal H2- production. //Appl. Biochem. Biotechnol. 1997. 63-65, 141-151.

[41] Girbal L., Von Abendroth.G., Winkler M., Benton P. M. C., Meynial-Salles I., Croux C., Peters J. W., Happe T., Soucaille P. Homologous and heterologous overexpression in Clostridium acetobutylicum and characterization of purified clostridial and algal Fe-only hydrogenases with high specific activities. // Appl. Environ. Microbiol. 2005. 71: 2777-2781.

[42] Greenbaum E. Energetic efficiency of hydrogen photoevolution by algal water-splitting. //Biophys. J. 1988. V. 54. P. 365-368.

[43] Greenbaum E. Simultaneous photoproduction of hydrogen and oxygen by photosynthesis. // Biotechnol Bioengin Symp. 1980. 10:1-1 .

[44] Greenbaum E., Blankinship S.L., Lee J.W., Ford R.M. Simultaneous Photoproduction of hydrogen and oxygen in a confined bioreactor. // J. Phys. Chem. B. 2001. V. 105. P. 3605-3609.

[45] Greenbaum E., Lee J.W. Photosynthetic hydrogen and oxygen production by green algae: an overview. // In : Zaboesky O, editor. Biohydrogen, New York, London: Premium press. 1998. P. 235-241.

[46] Grossman A, Takahashi H. Macronutrient utilization by photosynthetic eukaryotes and the fabric of interactions. // Annu Rev Plant Physiol. 2001. 52:163-210.

[47] Grossman A.R., Croft M., Gladyshev V.N., Merchant S. S., Posewitz M.C., Prochnik S., Spalding M.H. Novel metabolism in Chlamydomonas through the lens of genomics. // Curr. Opin. Plant Biol. 2007. 10: 190-198.

[48] Guan, Y.F.; Deng, M.C.; Yu, X.Y.; Zhang, W. Two-stage photobiological production of hydrogen by marine green alga Platymonas subcordiformis. II Biochem. Eng. J. 2004. 19, 69-73.

[49] Hall J.L. Cellular mechanisms for heavy metal detoxification and tolerande. // J. Exp. Bot. 2002. V. 53. P. 1-11.

[50] Happe T., Kaminski A. Differential regulation of the Fe-hydrogenase during anaerobic adaptation in the green alga Chlamydomonas reinhardtii. II European Journal of Biochemistry. 2002. 269: 1022-1032.

[51] Happe T., Mosler B., Naber J.D. Induction, localization and metal content of hydrogenase in the green alga Chlamydomonas reinhardtii. II European Journal of Biochemistry. 1994. 222:769-774.

[52] Happe T., Naber J.D. Isolation, characterization and N-terminal amino acid sequence of hydrogenase from the green alga Chlamydomonas reinhardtii. II European Journal of Biochemistry. 1993. 214: 475-481.

[53] Hase E, Morimura Y, Mihara S, Tamiya H. The role of sulfur in the cell division of Chlorella. II Arch Mikrobiol. 1958. 31:87-95.

[54] Healey F. P. The mechanism of hydrogen evolution by Chlamydomonas reinhardtii. II Plant Physiol. 1970a. V. 45. P. 153-159.

[55] Healey F.P. Hydrogen evolution by several algae. // Planta V. 1970b . 91, P. 220-226.

[56] Hemschemeier A, Jacobs J and Happe T. Biochemical and physiological characterization of the pyruvate formate-lyase Pfl 1 of Chlamydomonas reinhardtii, a typically bacterial enzyme in a eukaryotic alga. // Eukaryot. Cell. 2008b. 7, 518-526.

[57] Hong G, Pachter R., Casalot L., Rousset M. Maturation of the [NiFe] hydrogenases. // Trends Microbiol. 2001. 9:228-237.

[58] Hurris E.H. The Chlamydomonas sourcebook: a Comprehensive Guide to Biology and Laboratory use. // Academic Press, San Diego. 1989. 780 p.

[59] Huss, V. A. R., Huss, G. & Kessler, E. Deoxyribonucleicacid reassociation and interspecies relationships of the genus Chlorella Chlorophyceae. II Plant Syst. Evol. 1989a. 168:71-82.

[60] Jansen M.A.K., Mattoo A.K., Edelman M. D1-D2 protein degradation in the chloroplast. Complex light saturation kinetics. // Eur. J. Biochem. V. 1990. 260. P. 527-532.

[61] Kaltwasser H., Straut T. S., Gaffron H. Light-dependent hydrogen evolution by Scenedesmus. II Planta Berl. 1969. V. 89. P. 309-322.

[62] King P., Posewitz M., Ghirardi M., Seibert M. Functional Studies of [FeFe] Hydrogenase Maturation in an Escherichia coli. II Biosynthetic System Journal of Bacteriology. 2006. 188: 2163-2172.

[63] Komärek, J. & Fott, B. Chlorophyceae Grünalgen Ordnung: Chlorococcales. // In: Huber-Pestalozzi, G. ed.: Das Phytoplankton des Süßwassers 7. 1983. Teil, 1. Hälfte. -1044 pp., E. Schweizerbart'sehe Verlagsbuchhandlung Nägele u. Obermiller-Stuttgart.

[64] Kosourov S, Batyrova K, Petushkova K, Tsygankov A, Ghirardi ML, Seibert M. Maximizing the hydrogen photoproduetion yields in Chlamydomonas reinhardtii cultures: The effect of the H2 partial pressure. 11 Int J Hydrogen Energy. 2012. 88508858.

[65] Kosourov S, Patrusheva E, Ghirardi ML, Seibert M, Tsygankov A . A comparison of hydrogen photoproduetion by sulfur-deprived Chlamydomonas reinhardtii under different growth conditions. // Journal of Biotechnology. 2007. 128: 776-787.

[66] Kosourov S., Makarova V., Fedorov A.S., Tsygankov A., Seibert M., and Ghirardi M.L. The effect of sulfur re-addition on H-2 photoproduetion by sulfur-deprived green algae. // Photosynth Res. 2005. vol. 85, p. 295-305.

[67] Kosourov S., Seibert M., Ghirardi M. L. Effects of extrscellular pH on the metabolic pathways in sulfur-deprived, H2- producting Chlamydomonas reinhardtii Cultures. // Plant Cell Physiol. 2003. V. 44. P. 146-155.

[68] Kosourov S., Tsygankov A., Seibert M., Ghirardi L. M. Sustained Hydrogen photoproduetion by Chlamydomonas reinhardtii effects of culture parameters. // Biotecnology and Bioenginering . 2002. N. X.

[69] Kosourov S.N., Seibert M. Hydrogen Photoproduetion by Nutrient-Deprived Chlamydomonas reinhardtii Cells Immobilized Within Thin Alginate Films Under Aerobic and Anaerobic Conditions. //' Biotechnol. Bioeng. 2009. 102: 50-58.

[70] Kreuzberg K, Klöck G, Grobheiser D. Subcellular distribution of pyruvate-degrading enzymes in Chlamydomonas reinhardtii studied by an improved protoplast fractionation procedure. // Physiologia Plantarum. 1987. 69: 481^188.

[71] Kruse. O.; Hankamer, B. Microalgal hydrogen production. // Curr. Opin. Biotechnol. 2010,21,238-243.

[72] Lambertz, C.; Leidel, N.; Havelius, K.G.; Noth, J.; Chernev, P.; Winkler, M.; Happe, T.; Haumann, M. O2 reactions at the six-iron active site H-cluster in FeFe-hydrogenase. // J. Biol. Chem. 2011. 286, 40614-40623.

[73] Laurinavichene T.V., Tolstygina I.V., Galiulina R.R., Ghirardi M.L., Seibert M., Tsygankov A.A. Dilution methods to deprive Chlamydomonas reinhardtii cultures of sulfur from subsequent hydrogen production. // Int J Hydrogen Energy.2002. V. 27. P. 1245-1249.

[74] Laurinavichene T.V., Tolstygina I.V., Tsygankov A.A. The effect of light intensity on hydrogen production by sulfur-deprived Chlamydomonas reinhadrtii. // J.Biotechnol. 2004.V. 114. P.143-151.

[75] Lee J.W., Greenbaum E. A new oxygen sensitivity and its potential application in photosynthetic H2 production. // Applied Biochemistry and Biotechnology. 2003. 108: 303-313.

[76] Lein T. and Schreiner Q. Purification of a derepressible arylsulfatase from Chlamydomonas reinhardtii. II Biochem. Biophys. Acta. 1975. V. 384. P. 168-179.

[77] Lindholm J., Gustafsson P., Oquist G. Photoinhibition of photosynthesis and its recovery in green alga Chlamydomonas reinhardtii.II Plant Cell Physiol. 1987. V. 28. P. 1133-1140.

[78] Lyman, J.; Fleming, R. Composition of sea water. // J. Mar. Res. 1940. 3, 134-146.

[79] Maione T.E., Gibbs M. Association of the chloroplastic respiratory and photosynthetic electron transport chains of Chlamydomonas reinhardtii with photoreduction and the oxyhydrogen reaction. // Plant Physiol. 1986. 80: 364-368.

[80] Markov A., Eivazova E.R., Greenwood J. Photostimulation of H2 production in the green alga Chlamydomonas reinhardtii upon photoinhibition of its 02-evolving system. // Int J Hydrogen Energy. 2006. V.31. P. 1314-1317.

[81] Martin NC, Goodenough UW. Gametic differention in Chlamydomonas reinhardti. // production of gametes and their fine structure Journal of Cell Biology. 1975. 67: 587605

[82] Martinez-Gomez N. C., Robers M., Downs D. M. Mutational analysis of ThiH, a member of the radical S-adenosylmethionine AdoMet protein superfamily. // J Biol Chem. 2004. 279 : 40505^0510.

[83] McGlynn S.E., Shepard E.M., Winslow M.A., Naumov A.V., Duschene K.S., et al. HydF as a scaffold protein in [FeFe] hydrogenase H-cluster biosynthesis. // FEBS Lett. 2008. 582: 2183-2187.

[84] Melis A., Zhang L. P., Forestier M., Ghirardi M. L., Seibert M. Sustained photobiological hydrogen gas production upon reversible inactivation of oxygen evolution in the green alga Chlamydomonas reinhardtii. II Plant Physiol. 2000. 122: 127-135.

[85] Meuser J.E., Boyd E.S., Ananyev G., Karns D., Radakovits R., Murthy U.M.N., Ghirardi M.L., Dismukes G.C., Peters J.W., Posewitz M.C. Evolutionary significance of an algal gene encoding an [FeFe]-hydrogenase with F-domain homology and hydrogenase activity in Chlorella variabilis NC64A. // Planta. 2011. 234: 829-843.

[86] Meuser J.E., D'Adamo S., Jinkerson R.E., Mus F., Yang W., Ghirardi M.L., Seibert M., Grossman A.R., Posewitz M.C. Genetic disruption of both Chlamydomonas reinhardtii [FeFe]-hydrogenases: Insight into the role of HYDA2 in H2 production. // Biochemical and Biophysical Research Communications. 2012. 417: 704-709.

[87] Meuser J.E., Boyd E.S., Ananyev G., Karns D., Radakovits R., Murthy U. M. N., Ghirardi M. L., Dismukes G. C., Peters J. W., Posewitz M. C. Evolutionary significance of an algal gene encoding an [FeFe]-hydrogenase with F-domain homology and hydrogenase activity in Chlorella variabilis NC64A. // Planta 234. 2011. 829-843.

[88] Meyer J. [FeFe] hydrogenases and their evolution: A genomic perspective. // Cellular and Molecular Life Sciences. 2007. 64 :1063-1084.

[89] Miura Y., Ohta S., Mano M., Miyamoto K. Isolation and characterization of a unicellular green alga exhibiting high activity in dark hydrogen production. // Agric. Biol. Chem. 1986. 50:2837-2844.

[90] Miura Y., Saitoh C., Matsuoka S., Miyamoto K. Stably sustained hydrogen production with high molar yield through a combination of a marine green alga and a

photo synthetic bacterium. //Biosci. Biotech. Biochem. 1992. 56: 751-754.

[91] Mulder D.W., Ortillo D.O., Gardenghi D.J., Naurnov A.V., Ruebush S.S., et al. Activation of HydADeltaEFG requires a preformed [4Fe-4S] cluster. // Biochemistry. 2009.48:6240-6248.

[92] Miiller M. Energy metabolism. Part 1: anaerobic protozoa. Marr JJ, Nilsen TW, Komunieck R, eds. Molecular medical parasitolgy. // Amsterdam, the Netherlands: Academic Press. 2003. 125-139.

[93] Mus F, Cournac L, Cardettini V, Caruana A, Peltier G. Inhibitor studies on non-photochemical plastoquinone reduction and H2 photoproduction in Chlamydomonas reinhardtii. II Biochimica et Biophysica Acta 1708. 2005. 322-332.

[94] Mus F, Dubini A, Seibert M, Posewitz MC, Grossman AR. Anaerobic acclimation in Chlamydomonas reinhardtii: anoxic gene expression, hydrogenase induction, and metabolic pathways. //Journal of Biological Chemistry. 2007. 282: 25475-25486.

[95] Nicolet Y., Piras C., Legrand P., Hatchikian C.E., Fontecilla-Camps J. C. Desulfovibrio desulfuricans iron hydrogenase: the structure shows unusual coordination to an active site Fe binuclear center. // Struct. Fold. Des. 1999. 7: 13-23.

[96] Nicolet Y., De Lacey A.L., Vernede X., Fernandez V.M., Hatchikian E.C., Fontecilla-Camps J.C. Crystallographic and FTIR spectroscopic evidence of changes in Fe coordination upon reduction of the active site of the Fe-only hydrogenase from Desulfovibrio desulfuricans. //J. Am. Chem. Soc. 2001. 123: 1596-1601.

[97] Niyogi K.K. Photoprotection revisited: genetic and molecular approaches. // Annu. Rev. Plant. Physiol. Plant. Mol. Biol. 1999. V. 50. P. 333-359.

[98] Noctor G., Arisi A-C., Jouanin K.L., Kunert H., Rennenberg H and Foyer C. Glutathione: biosynthesis, methabolism and relationship to stress tolerance explored in transgenic plants. // J. Exp. Bot. 1998. V. 49. P. 623-647.

[99] Papazi A, Gjindali A-I, Kastanaki E, Assimakopoulos K, Stamatakis K, Kotzabasis K. Potassium deficiency, a "smart" cellular switch for sustained high yield hydrogen production by the green alga Scenedesmus obliquus JI International Journal of Hydrogen Energy. 2014. 39: 19452-19464 [100] Paytan, A.; McLaughlin, K. The Oceanic Phosphorus Cycle.// J. Chem. Rev. 2007 .107, 563-576.

[101] Peltier G, Schmidt GW. Chlororespiration- an adaptation adaptation to nitrogen deficiency in Chlamydomonas reinhardtii.// Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1991. 88: 4791-4795.

[102] Peters J. W., LanzilottaW. N., Lemon B. J., Seefeldt L. C. X-ray crystal structure of the Fe-only hydrogenase Cpl from Clostridium pasteurianum to 1.8 angstrom resolution. // Science. 1998.282: 1853-1858.

[103] Peters J.W. Structure and mechanism of iron-only hydrogenases. // Curr. Opin. Struct. 1999. 9: 670-676.

[104] Peters J.W., Szilagyi R.K., Naumov A., Douglas T.A. Radical solution for the biosynthesis of the H-cluster of hydrogenase. // FEBS Lett. 2006. 580: 363-367.

[105] Philipps G, Happe T, Hemschemeier A. Nitrogen deprivation results in photosynthetic hydrogen production in Chlamydomonas reinhardtii. II Planta. 2012 .235:729-745.

[106] Posewitz M. C., King P.W., Smolinski S. L., Smith R. D., Ginley A. R., Ghirardi M. L., Seibert M. Identification of genes required for hydrogenase activity in Chlamydomonas reinhardtii. //Biochem. Soc. Trans. 2005. 33: 102-104.

[107] Posewitz M.C., Dubini A., Meuser J.E., Seibert M., Ghirardi M.L. Hydrogenases, hydrogen production, and anoxia, in: The Chlamydomonas sourcebook Second Edition, Stern D.B. edt. // Academic Press,Oxford, UK. 2009. Vol 2: p. 217-255.

[108] Posewitz M.C., King P.W., Smolinski S.L., Smith R.D., Ginley A.R., Ghirardi M.L., Seibert M. Identification of genes required for hydrogenase activity in Chlamydomonas reinhardtii. II Biochem. Soc. Trans. 2005. 33: 102-104.

[109] Posewitz M.C., King P.W., Smolinski S.L., Zhang L., Seibert M., Ghirardi M.L. Discovery of two novel radical S-adenosylmethionine proteins required for the assembly of an active [Fe] hydrogenase. // J. Biol. Chem. 2004. 279: 25711-25720.

[110] Posewitz MC. Increased Lipid Accumulation in the Chlamydomonas reinhardtii sta7-10 Starchless Isoamylase Mutant and Increased Carbohydrate Synthesis in Complemented Strains. // Eukaryotic Cell. 2010. 9: 1251-1261

[111] Pow T., Krasna A. I. Photoproduction of hydrogen from water in hvdrogenase-containing algae. //Arch. Biochem. Biophys. 1979. 194: 413-421.

[112] Pow T., Rrasana A.I. photoproduction of hydrogen from water in hydrogenase-containing algae. II Arch. Biochem. Biophiys. 1979. V.194. P. 413-421.

[113] Prochnik S.E., Umen J., Nedelcu A.M., Hallmann A., Miller S.M., Nishii I., Ferris P., Kuo A., Mitros T., Fritz-Laylin L.K., Hellsten U., Chapman J., Simakov O., Rensing S.A., Terry A., Pangilinan J.. Kapitonov V., Jurka J., Salamov A., Shapiro H., Schmutz J., Grimwood J., Lindquist E., Lucas S., Grigoriev I.V., SchmittR., Kirk D., Rokhsar D.S. Genomic analysis of organismal complexity in the multicellular green alga Volvox carteri. II Science. 2010. 329: 223-226.

[114] Ran, C.Q.; Yu, X.J.; Jin, M.F.; Zhang, W. Role of carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone in enhancing photobiological hydrogen production by marine green alga Platymonas subcordiformis. II Biotechnol. Prog. 2006. 22, 438-443.

[115] Reeves M., Greenbaum E. Long-term endurance and selection studies in hydrogen and oxygen Photoproduction by Chlamydomonas reinhardyii. // Enzyme Microbial Technol. 1985. V. 7. P.169-174.

[116] Rubio L. M., Ludden P. W. Maturation of nitrogenase: a biochemical puzzle. // J. Bacterid. 2005. 187: 405-414.

[117] Saito K. Regulation of sulfate transport and synthesis of sulfur-containing amino acids. // Curr. Opin. Plant. Biol. 2000. V. 3. P. 188-195.

[118] Samuelson G., Lonnenborg A., Rosenquist E. Photoinhibition and reactivation of photosynthesis in cyanobacterium Anacystis nidulans. II Plant Physiol. 1985. V. 79. P. 902-905.

[119] Schreiner Q., Lein T., Knutsen G. The capacity of arylosulfatase synthesis in synchronous and synchronized cultures of Chlamydomonas reinhardtii. II Biochem. Biophys. Acta. 1975. V. 384. P. 180-193.

[120] Sigma, product No 13423. http://www.sigmaaldrich.c0m/catal0g/pr0duct/sial/l 3423?lang=en&region=RU

[121] Skjanes K., Pinto F.L., Lindblad P. Evidence for transcription of three genes with characteristics of hydrogenases in the green alga Chlamydomonas noctigama. II International Journal of Hydrogen Energy. 2010. 35:1074-1088.

[122] Skjanes, K.; Knutsen, G.; Kallqvist, T.; Lindblad, P. H2 production from marine and freshwater species of green algae during sulfur deprivation and considerations for bioreactor design. // Int. J. Hydrog. Energy. 2008. 35, 511-521.

[123] Spalding M.H. Novel metabolism in Chlamydomonas through the lens of genomics. // Curr. Opin. Plant Biol. 2007. 10: 190-198.

[124] Stripp ST, Goldet G, Braridmayr C, Sanganas O, Vincent K A, Haumann M, Armstrong FA, Happe T. How oxygen attacks [FeFe] hydrogenases from photosynthetic organisms. //Proc. Natl. Acad. Sci. 2009b. USA 106, 17331-17336.

[125] Stuart TS and Gaffron H. The mechanism of hydrogen photoproduction by several algae.//Planta. 1972. 106. 101-112.

[126] Styring S., Virgin I., Ehrenberg A., Anderson B. Strong light photoinhibition of electron transport in photosystem II. Impartment of the fuction of the first quinine acceptor Qa. // Biochem Biophys Acta. 1990. V. 1015. P. 269-279.

[127] The Chlamydomonas Sourcebook , Second Edition. // Edited by:Elizabeth H. Harris, Ph.D., David B. Stern, Ph.D., and George B. Witman, Ph.D. 2009. ISBN: 978-0-12370873-1.

[128] Timmins M, Zhou W, Rupprecht J, Lim L, Thomas-Hall SR, Doebbe A, Kruse O, Hankamer B, Marx U C, Smith S.M and Schenk PM. The metabolome of Chlamydomonas reinhardtii following induction of anaerobic H2 production by sulfur depletion. // J. Biol. Chem. 2009b. 284, 35996.

[129] Tolstygina IV, Antal TK, Kosourov SN, Krendeleva TE, Rubin AB, Tsygankov AA. Hydrogen production by photoautotrophic sulfur-deprived Chlamydomonas reinhardtii pre-grown and incubated under high light. // Biotechnology and bioengineering. 2009. 102: 1055-1061.

[130] Tsygankov A., Kosourov S., Seibert M., Girardi M.L. Hydrogen photoproduction under continuous illumination by sulfur-deprived, synchronous Chlamydomonas reinhardtii cultures. // Int. J. of Hydrogen Energy. 2002. V. 27. P. 1239-1224.

[131] Tsygankov A.A., Fedorov A.S., Laurinavichene T.V., Gogotov I.N., Rao K.K., Hal D.O. Actual and potential rates of hydrogen photoproduction by continuous culture of the purple non-sulfur bacterium Rhodobacter capsulatus .11 Appl. Microbiol. Biotechol. 1998. V. 49. P. 102-107.

[132] Tsygankov A.A., Kosourov S.N., Tolstygina I.V., Ghirardi M. L., Seibert M. Hydrogen production by sulfur-deprived Chlamydomonas reinhardtii under photoautotrophic conditions. // Int. J. Hydrogen Energy. 2006. 31: 1574-1584.

[133] Vignais P.M., Billoud B. Occurrence, classification, and biological function of hydrogenases: An overview. // Chem. 2007.107: 4206-4272.

[134] Vignais P.M., Billoud B., Meyer J. Classification and phylogeny of hydrogenases. // FEMS Microbiol. Rev. 2001. 25: 455-501.

[135] Volgusheva A, Kukarskikh G, Krendeleva T, Rubina A, Mamedov F. Hydrogen photoproduction in green algae Chlamydomonas reinhardtii under magnesium deprivation. // RSC Advances. 2014. 5: 5633-5637.

[136] Volgusheva A. Styring S, Mamedov F. Increased photosystem II stability promotes H2 production in sulfurdeprived Chlamydomonas reinhardtii. II Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2013. 110: 7223-7228.

[137] Wagner AF, Frey M, Neugebauer FA, Schafer W, Knappe J. The free radical in pyruvate formate-lyase is located on glycine-734. // Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 1992. 89: 996-1000.

[138] Wang H, Fan X, Zhang Y, Yang D, Guo R Sustained photo-hydrogen production by Chlorellapyrenoidosa without sulfur depletion. // Biotechnology Letters. 2011. 33: 13451350.

[139] Powell N, Shilton A, Chisti Y, Pratt S. Towards a luxury uptake process via microalgae defining the polyphosphate dynamics. // Water Res. 2009. 4317:4207-13.

[140] Weiss RF. The solubility of nitrogen, oxygen and argon in water and seawater. // Deep Sea Research and Oceanographic Abstracts. 1970. 17: 721-735.

[141] William Lee, William H. Lee, Michael Rosenbaum. Chlorella. // McGraw Hill Professional. 1998.

[142] Winkler M., Maeurer C., Hemschemeier A., Happe T. The isolation of green algal strains with outstanding H2 -productivity. // in: Biohydrogen III Int Symp 3rd J. Miyake, Y. Igarashi and M. Roegner eds. Elsevier Science, Oxford. 2004. p. 103-115.

[143] Winkler M., Kuhlgert S., Hippler M., Happe T. Characterization of the key step for light-driven hydrogen evolution in green algae. // The journal of biological chemistry. 2009. 284: 36620 -36627.

[144] Winkler M., Heil B., Heil B., Happe T. Isolation and molecular characterization of the [Fe]-hydrogenase from the unicellular green alga Chlorella fusca. // Biochimica et Biophysica Acta - Gene Structure and Expression. 2002. 1576: 330-334.

[145] Work VH, Radakovits R, Jinkerson RE. Meuser JE, Elliott LG. Vinyard DJ, Laurens LML, Dismukes GC, Wunschiers R., Stangier K., Senger H., Schulz R. Molecular evidence for a Fe-hydrogenase in the green alga Scenedesmus obliquus. II Current Microbiology. 2001. 42: 353-360.

[146] Wykoff DD, Davies JP, Melis A, Grossman AR. The regulation of photosynthetic electron transport during nutrient deprivation in Chlamydomonas reinhardtii. II Plant Physiol. 1998. 117:129-39.

[147] Yan F., Chen Z., Li W., Cao X., Xue S., Zhang W. Purification and characterization of a hydrogenase from the marine green alga Tetraselmis subcordiformis. II Process Biochemistry. 2011. 46:1212-1215.

[148] Yanyushin M. Hydrogenase activation and hydrogen photoevolution in a synchronous culture of Chlamydomonas reinhardtii during anaerobic adaptation under light. // Soviet Plant Physiology. 1982b . 29:863-869.

[149] Zenk M. H. Heavu metal detoxification in higher plants -a review. // Gene. 1996. V. 179. P. 21-30.

[150] Zhang L and Melis A. Probing green algal hydrogen production. // Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 2002. 357, 1499 - 507.

[151] Zhang L., Happe T., Melis A. Biochemical and morphological characterization of sulfur-deprived and h2-producing Chlamydomonas reinhardtii green alga. // Planta. 2002. V.214P. 552-561.

[152] Zhang, Y.T.; Fan, X.L.; Yang, Z.M.: Wang, H.Y.; Yang, D.W.; Guo, R.B. Characterization of H-2 photoproduction by a new marine green alga, Platymonas helgolandica var. tsingtaoensis. V Appl. Energy. 2012. 92, 38^43.

[153] Zinn T.. Schnackenberg J.. Haak D., Romer S., Schulz R., Senger H. Evidence for nickel in the soluble hydrogenase from the unicellular green alga Scenedesmus obliquus .11 Journal of Biosciences. 1994. 49: 33-38.

[154] ZorinN.A., Lissolo T., Colbeau A., Vignais P.M. Increased hydrogen photoproduction by Rhodobacter capsulatus strains deficient in uptake hydrogenase. // J. Mar. Biotech. 1996. V. 4. P. 28-33.

[155] A.A. Цыганков. Метаболизм водорода у микроводорослей. В кн.: Фотосинтез: нерешенные вопросы, и что мы знаем сегодня». // Под редакцией С.И Алахвердиева, А.Б. Рубина, В.А. Шувалова. - Москва-Ижевск:Ижевский институт компьютерных исследований. 2014. т. 1, с. 461-486.

[156] Антал Т. К., Кренделева Т. Е., Лауринавичене Т.В., Макарова В.В., Цыганков A.A., Сейберт М., Рубин А. Б. Связь активности фотосистемы 2 микроводорослей Chlamydomonas reinhardtii с выделением водорода при серном голодании. // Доклады. 2001. АН, Т. 381. № 1. С. 1-4

[157] Бойченко В. А., Сатина Л.Я., Литвин Ф.Ф. Эффективность фотообразования водорода водорослями и цианобактериями. // Физиология растений. 1989. Т.36, с.239-247.

[158] Винберг Г.Г. Культивирование зеленых планктонных водорослей на сточных водах. // Тез. докл. Всесоюзное совещание по культивированию одноклеточных водорослей. 1961. Л.-С. 20.

[159] Голлербах М.М. Зеленые водоросли. В кн.: Жизнь растений. // Голлербах-ред. Москва: Просвещение. 1977. Т. 3. С.226-273

[160] К.Л.Виноградова. Определитель водорослей Дальневосточных морей СССР -Зеленые водоросли. // Изд-во "Наука"!979.

[161] Климов В. В. Окисление воды и выделение молекулярного кислоаода при фотосинтезе. /7 Соросовский образовательный журнал. 1996 . №11. С. 9-12.

[162] Кондратьева E.H., Гоготов H.H. Молекулярный водород в метаболизме микроорганизмов. // Наука. 1981 . Москва.

[163] Левина Р.И. Антибактериальные свойства протококковых водорослей в отношении кишечной микрофлоры. // Тез. докл. Всесоюзное совещание по культивированию одноклеточных водорослей. 1961. Л.-С. 22-23.

[164] Сивко Т.Н, Г.А.Соколова. Массовое развитие планктонных водорослей при самоочищении сточных вод в биологических прудах. // Тез. докл. Всесоюзное совещание по культивированию одноклеточных водорослей. 1961. Л.-С. 21.

[165] Цоглин Л.Н. and Пронина H.A. Биотехнология микроводорослей. // Академиа, 2006, 323 р.

[166] Цыганков A.A. Получение водорода биологическим путем. // Российский химический журнал. 2006. Т. 50. С. 26-33

[167] Янюшин М. Ф. Активация гидрогеназы и фотовыделение водорода у синхронных культур Chlamydomonas reinhardtii при анаэробной адаптации на свету. // Физиология растений .1982. 29: 863-869.

[168] Янюшин М.Ф. Влияние ингибиторов электронного транспорта на фотовыделение водорода синхронной культурой Chlamydomonas reinhardtii. II Физиология растений. 1981. Т. 28, вып.4. С. 749-756.