Высокочувствительная детекция белков на чипах к атомно-силовому микроскопу тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, доктор наук Плешакова Татьяна Олеговна

• Плешакова Татьяна Олеговна
• доктор наук
• 2019

Оглавление диссертации доктор наук Плешакова Татьяна Олеговна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. Обзор литературы

1.1 Проблема обнаружения белков в растворах с низкими концентрациями

1.2 Методы исследования белков на уровне отдельных молекул

1.3 Возможности АСМ при исследовании отдельных биомакромолекул

1.3.1 Контактные и динамические режимы визуализации АСМ

1.3.2 Режим силовой спектроскопии

1.3.3 Расширение возможностей АСМ при комбинации с другими методами

для исследования биомакромолекул

1.4 Применение АСМ в медицине

1.5 Конструкция АСМ-чипа: предпосылки

1.5.1 Материалы для изготовления чипов

1.5.2 Принцип фишинга целевых белков

1.5.3 Формат АСМ-чипов

ГЛАВА 2. Материалы, методы и разработанные методики фишинга

2.1 Атомно-силовые микроскопы

2.1.1 Принцип получения АСМ-изображений в режиме топографии

2.1.2 Обработка результатов АСМ-сканирования в режиме топографии

2.1.3 АСМ-измерения в режиме РюоТКБС

2.2 Вспомогательное лабораторное оборудование

2.3 Краткая характеристика белков, используемых в качестве целевых при АСМ-фишинге

2.4 Антитела, аптамеры, реактивы

2.5 Методика сорбции белков на свежесколотую слюду

2.6 Реализованные схемы фишинга

2.7 Дизайн АСМ-чипов

2.7.1 АСМ-чипы на основе слюды для фишинга в объеме анализируемого раствора

2.7.2 Методика формирования на поверхности АСМ-чипа массива из сенсорных зон

2.7.3 АСМ-чипы на основе ВОПГ для фишинга в проточном режиме

2.7.4 Определение размера сенсорной зоны на поверхности

2.8 Методики активации поверхности и иммобилизации биомолекул лигандов

2.8.1 Методика ковалентной иммобилизации белков на поверхность чипа с применением кросс-линкеров EDC и NHS

2.8.2 Методика активации поверхности с помощью сукцинимидного кросс-линкера и последующей иммобилизации молекул лиганда на поверхность чипа

2.8.3 Модификация иммобилизованных антител

2.8.4 Модификация кантилевера с помощью gp120 для АСМ-измерения в режиме PicoTREC

2.9 Методики фишинга

2.9.1 Неспецифический необратимый (химический) фишинг

2.9.2 Неспецифический обратимый фишинг

2.9.3 Биоспецифический обратимый и необратимый фишинг

ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение

3.1 Результаты предварительных и контрольных экспериментов

3.1.1 Результаты процедуры силанизации

3.1.2 Контроль чистоты используемых растворов

3.1.3 Визуализация белков на поверхности свежесколотой слюды

3.1.4 Результаты определения площади сенсорной зоны на поверхности АСМ-чипа и расчетная оценка чувствительности анализа

3.2 Результаты фишинга неспецифического необратимого (химического)

3.2.1 Химический фишинг авидина

3.2.2 Химический фишинг пероксидазы хрена (ПХ)

3.2.3 Химический фишинг: заключение

3.3 Результаты фишинга неспецифического обратимого

3.3.1 Результаты контрольных экспериментов

3.3.2 Результаты фишинга ЧСА

3.3.3 Результаты фишинга цитохрома Ь5

3.3.4 Результаты измерения заряда в ячейке для фишинга после ввода растворов

3.3.5 Фишинг неспецифический обратимый: обсуждение и заключение

3.4 Результаты биоспецифического обратимого фишинга HCVcoreAg при

использовании АСМ-чипа с иммобилизованными антителами

3.4.1 Результаты иммобилизации антител на поверхность чипа

3.4.2 Результаты биоспецифического обратимого и необратимого фишинга НСVcoreAg при использовании АСМ-чипа с иммобилизованными антителами

3.4.3 Биоспецифический фишинг НСVcoreAg при использовании АСМ-чипа с иммобилизованными антителами: обсуждение и заключение

3.5 Результаты биоспецифического фишинга gp120

3.5.1 АСМ-визуализация после процедуры иммобилизации аптамера против gp120 в полуконтактном режиме

3.5.2 АСМ-визуализация иммобилизованного аптамера против gp120 в режиме PicoTREC

3.5.3 Биоспецифический фишинг gp 120: АСМ-чип с иммобилизованными аптамерами

3.5.4 АСМ-визуализация антител против gp120 в полуконтактном режиме

3.5.5 Биоспецифический фишинг gp 120: АСМ-чип с иммобилизованными антителами

3.5.6 Оценка контрастности изображения молекул белка gp120, выловленного на АСМ-чип с иммобилизованными аптамерами и АСМ-чип с иммобилизованными антителами

3.5.7 Биоспецифический фишинг gp 120: заключение

3.6 Результаты биоспецифического фишинга НСVcoreAg при использовании АСМ-чипа с иммобилизованными аптамерами

3.6.1 АСМ-чипы с одним типом аптамеров для обнаружения рекомбинантного HCVcoreAg в буферном растворе

3.6.2 Биоспецифический фишинг HCVcoreAg при использовании АСМ-чипа с одним типом аптамеров: результаты контрольных экспериментов

3.6.3 Биоспецифический фишинг HCVcoreAg при использовании АСМ-чипа с одним типом аптамеров: обсуждение

3.6.4 Разработка критериев оценки АСМ-данных при использовании чипов с иммобилизованными аптамерами

3.6.5 АСМ-чипы с тремя типами аптамеров для обнаружения рекомбинантного HCVcoreAg в буферном растворе: определение чувствительности анализа

3.7 АСМ-чипы с иммобилизованными аптамерами для обнаружения HCVcoreAg

в сыворотке крови человека

3.7.1 Обнаружение HCVcoreAg в сыворотке: результаты

3.7.2 Обнаружение HCVcoreAg в сыворотке: обсуждение и заключение

3.8 Анализ и обобщение полученных результатов

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

БИБЛИОГРАФИЯ

БЛАГОДАРНОСТИ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Высокочувствительная детекция белков на чипах к атомно-силовому микроскопу»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования и степень ее разработанности. В 2005 г. завершился глобальный международный проект «Геном человека», в результате которого было получено огромное количество новых фундаментальных знаний о молекулярном устройстве человеческого генома. Однако, «полученные знания не позволили ответить на основные вызовы современной медицинской науки и практического здравоохранения» (цит. по [1]). Доступные и простые генетические тесты могут определить предрасположенность, в основном, к моногенным заболеваниям. Но большая часть мультифакториальных заболеваний, в том числе онкологические патологии, диабет и другие, ассоциированы с набором мутаций в нескольких генах. В результате эти болезни трудно обнаружить на ранних стадиях, и также сложно определить мишени для эффективного лечения. Следовательно, расшифровка генокода человека пока не позволяет определить состояние его здоровья.

Передовым научным направлением исследований последних десятилетий стало развитие постгеномных технологий: протеомики, метаболомики и т.д. В 2010 г. стартовал масштабный международный проект «Протеом человека» (https://hupo.org/human-proteome-project), одной из основных задач которого является определение и аннотация всех белков человека [2]. Протеомные исследования предоставляют уникальные знания о молекулярных механизмах процессов в организме. Оценка размера протеома плазмы дает широкий диапазон значений - от нескольких тысяч до двух миллионов различных протеоформ [3]. Однако, несмотря на интенсивное развитие постгеномных технологий и наличие широкого спектра информации о происходящих в организме молекулярных событиях, ассоциированных с развитием патологических процессов, «количество внедренных за это время в диагностику тестов невелико, практически все из них являются уточняющими и не заменяют стандартных методов обследования» (цит. по [4]). Опубликованы сведения о десятках тысячах потенциальных биомаркеров, но в медицинскую практику входит не более двух новых биомаркеров в год [5]. Одной из причин, препятствующих внедрению новых знаний о биомаркерах в клиническую диагностику, является ограниченная чувствительность аналитических методов, которые используются для анализа белкового профиля.

Какая чувствительность аналитического метода необходима, чтобы на ранней стадии патологического процесса выявить биомаркеры - единичные биомакромолекулы, имеющие связь с молекулярной патологией? При небольшой опухоли, которая не наблюдается современными методами визуализации (магнитно-резонансной томографией), имеются миллионы трансформированных клеток, но не ясно присутствуют ли в крови биомаркеры. На основе математической модели, которая описывает динамику появления биомаркеров в плазме относительно роста опухоли, начиная с одной раковой клетки, показано, что для опухоли диаметром около 1 мм единичный биомаркер будет иметь концентрацию в крови порядка 10-15 M [6]. По оценке Rissin и соавторов [7] для ранней диагностики онкологических и вирусных заболеваний концентрационный предел чувствительности (detection limit, DL) диагностических методов также должен быть ниже 10-15 М. Следовательно, обнаружить в плазме крови маркеры патологического процесса на ранних стадиях сложно из-за их низкого содержания.

Чувствительность используемых в настоящее время высокопроизводительных стандартных методов протеомики, таких как масс-спектрометрические методы (МС-методы) с использованием одномерного или двумерного электрофореза, жидкостной хроматографии, составляет порядка 10-8 - 10-14 М [5,8]. Следовательно, применение современных протеомных методов ограничивается областью среднекопийных белков, когда ансамбли целевых биомолекул исчисляются 100 000 и более [4]. В области низко- и ультранизкокопийных белков теряет смысл количественная оценка свойств ансамбля целевых биомолекул, в этой области необходимо регистрировать единичные молекулы. «Концентрация 10-14 M является порогом детекции ансамблей биомолекул, за которым содержание молекул целесообразно выражать не в концентрационных единицах, а в штуках - как результат «инвентаризации» молекулярного состава образца» (цит. по [4]). С целью «инвентаризации» белков применяются детекторы отдельных молекул (или молекулярные детекторы), которые позволяют регистрировать единичные молекулы. Такие детекторы содержат сенсорные элементы, размеры которых сравнимы с размерами биомолекул [9]. При использовании молекулярных детекторов, низкокопийная белковая матрица рассматривается не в качестве ансамбля целевых молекул с усредненными физико-химическими свойствами, а в качестве системы индивидуальных молекул,

компоненты которой различимы по зарядовому состоянию, радиусу Стокса, форме, размеру и другим физико-химическим свойствам.

Метод атомно-силовой микроскопии (АСМ) был разработан как техника визуализации объектов, которая позволяет получать трехмерное топографическое изображение и структурные детали образцов [10]. Возможность работать в жидких средах и при температуре окружающей среды переместила АСМ в биологию, и привела к анализу биомолекул и клеток на субнанометровом разрешении. На сегодняшний день АСМ представляет собой мощную многофункциональную платформу для визуализации биообразцов [11]. Атомно-силовой микроскоп (АСМ) относится к молекулярным детекторам, способным регистрировать молекулы белка в режиме их счета. Таким образом, с одной стороны, в фундаментальных и прикладных областях медицины и биологии существует потребность обнаружения белков на уровне отдельных молекул. С другой стороны, разработан метод, предоставляющий принципиальную возможность визуализировать и подсчитывать отдельные биомолекулы.

Цель работы: разработка подхода на основе атомно-силовой микроскопии, позволяющего регистрировать белки в растворах с низкими концентрациями с целью обнаружения биомаркеров патологических состояний организма. Задачи исследования:

1. Разработка принципов высокочувствительной детекции белков с помощью молекулярного детектора на основе АСМ.

2. Разработка АСМ-чипов для концентрирования белков из растворов.

3. Расчетное и экспериментальное определение концентрационной чувствительности обнаружения белков при использовании АСМ-чипов.

4. Регистрация белков в буферных растворах и в сыворотке крови.

Научная новизна работы. Впервые предложена комбинация методов фишинга и АСМ (АСМ-фишинг) для обнаружения белков в растворе при концентрации от 10-10 М до 10-17 М. Разработаны оригинальные схемы биоспецифического и неспецифического АСМ-фишинга, позволяющие концентрировать белок из объема анализируемого раствора на небольшой поверхности сенсорной зоны. Разработаны методики химической модификации поверхности АСМ-чипа на основе слюды, позволяющие ковалентно фиксировать на

поверхности выловленные биомолекулы. Впервые показана возможность использования аптамеров в качестве молекул-лигандов, иммобилизованных на поверхности АСМ-чипа, для обнаружения белков в буферных растворах и образцах сыворотки крови.

Теоретическая и практическая значимость работы. Разработанное направление перспективно для решения задач протеомики и медицинской диагностики. Комбинация АСМ и фишинга - эффективный инструмент для молекулярного профилирования и поиска биологических маркеров состояний организма. Предложенные методики обратимого и необратимого фишинга позволяют обнаруживать белок в различных объемах анализируемых растворов - от 1 мкл до 100 мл. Дизайн АСМ-чипов предоставляет возможность концентрировать и регистрировать на поверхности различные типы белков. Так, в случае необходимости вылавливания всех белков, присутствующих в растворе, например, для решения задачи «инвентаризации», могут быть использованы чипы с химически активированной поверхностью. В случае необходимости подбора молекул-лигандов с наибольшей аффинностью, на поверхности могут быть иммобилизованы различные типы лигандов против одного целевого белка. Для обеспечения мультиплексного анализа пригодны чипы с массивами сенсорных зон, содержащими различные типы лигандов против спектра белков. Разработанные методики модификации поверхности и иммобилизации биомолекул могут быть использованы не только в АСМ-анализе, но и в других системах биосенсорного анализа, использующих функциональные поверхности.

Методология и методы диссертационного исследования. Работа построена на базе биохимических знаний о строении и функциях белков и олигонуклеотидов (аптамеров) с использованием методологии и методов сканирующей зондовой микроскопии (атомно-силовой спектроскопии) в комплексе с методами подготовки проб для биохимических анализов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Аптамер может быть использован в качестве молекулы-лиганда на поверхности АСМ-чипа. Применение аптамера в качестве аффинного реагента позволяет повысить контрастность АСМ-изображения выловленного белка на поверхности.

2. АСМ-фишинг технология с использованием аптамеров в качестве молекул-

лигандов может быть использована для обнаружения белковых маркеров социально значимых заболеваний в сыворотке крови с помощью АСМ-чипов. 3. АСМ-фишинг позволяет регистрировать белок в растворе в диапазоне концентраций от 10-10 М до 10-17 М.

Личный вклад соискателя. Автором предложен дизайн исследования, в том числе разработаны все схемы АСМ-фишинга. Определены принципы обнаружения белков в растворах с помощью чипов к атомно-силовому микроскопу. Разработаны уникальные методики обнаружения белков в растворах со сверхнизкими концентрациями и в сыворотке крови. Спланированы и реализованы экспериментальные работы, проведены обработка и анализ полученных данных. Разработан дизайн чипов с массивом сенсорных зон для мультиплексного анализа белков. Предложены критерии оценки результатов АСМ-анализа при использовании чипов с иммобилизованными аптамерами.

Степень достоверности и апробация результатов. Работа выполнена на высоком теоретическом и экспериментальном уровне с использованием современного оборудования. Экспериментальные схемы включают большое количество контрольных измерений, а также технических и биологических повторов. Система оценки полученных данных и критерии анализа разработаны специально для решения задач, поставленных в работе. Результаты работы согласуются с расчетными оценочными данными.

Основные результаты работы доложены и обсуждены на ежегодных итоговых конференциях и конгрессах «Биотехнология: состояния и перспективы развития» (Москва, 2014, 2016, 2017), Роснанотех (Москва, 2008, 2009), «Научная конференция МФТИ» (Москва-Долгопрудный-Жуковский, 2012).

Публикации. Материалы диссертационной работы отражены в 48 работах: 27 статей (6 статей в российских и 21 в международных научных изданиях), 16 материалов российских и международных научных конференций, 1 глава в коллективной монографии, 3 патента и 1 свидетельство о регистрации программного обеспечения.

Работа выполнена в лаборатории нанобиотехнологии Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича» (ИБМХ) при поддержке:

1. Программа ФНИ (ФАНО): тема «Поиск постгеномных биомаркеров социально-значимых заболеваний и разработка методов их детектирования» (2015-2017 гг.); тема "Создание биоаналитических методов для диагностики заболеваний" (20132020).

2. Гранты РФФИ: № 09-04-12113-офи_м (2009-2010), № 11-04-12018-офи_м (20112012 гг.), № 12-04-31570 мол_а (2012-2013 гг.), 15-04-08368 A (2015-2017 гг.).

3. ГК № 02.512.11.2334 (2009-2010 гг.), № 02.552.11.7060 (2009-2010 гг.) и 14.512.11.0018 (2013 г) в рамках ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса РФ на 2007-2013 гг.». Грант в форме субсидии в рамках ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг.» по Соглашению №8717 (2012-2013 гг.).

4. Грант РНФ №14-25-00132 от 05.05.17 г. по теме «Хромосомоцентричная таргетная протеомика белков плазмы крови человека».

ГЛАВА 1. Обзор литературы

1.1 Проблема обнаружения белков в растворах с низкими концентрациями

В пятидесятых годах прошлого столетия, академик В.Н. Орехович в своем докладе предположил, что в крови может встречаться до сотен различных высокомолекулярных азотсодержащих соединений [12]. Согласно [4], все белки, упомянутые в этом докладе, на современном этапе развития медицины служат маркерами заболеваний, применяемыми для определения функционального статуса печени, поражения сердечно-сосудистой системы, нарушения работы почек, системы свертываемости крови, аутоиммунных патологий и др.

Постгеномные технологии развиваются уже более двух десятилетий, предоставляя исследователям информацию о происходящих в организме молекулярных процессах. Согласно оценочным данным, клетка содержит более 100 тыс. различных типов молекул [8,13]. Оценка размера протеома плазмы дает широкий диапазон значений от нескольких тысяч до 2 млн различных протеоформ [3,14]. Однако, несмотря на стремительное развитие постгеномных технологий, в настоящее время в диагностике регистрируется и используется лишь 10-20% потенциально значимых диагностических белковых маркеров, что в свою очередь сдерживает создание ранних диагностикумов, основанных на использовании маркерных белков [15]. Динамика появления скрининговых биомаркеров (официально одобренных для клинического применения) с 2000 г. неуклонно снижается, что закономерно определяет актуальность поиска новых индикаторов состояния человеческого организма [4]. Скромное количество тестов, нашедших практическое применение, резко контрастирует с десятками тысяч опубликованных за последние два десятилетия потенциальных биомаркеров. Одна из причин такой ситуации -ограниченная чувствительность аналитических методов при анализе молекулярного профиля [14].

В протеомных исследованиях фундаментального характера низкая чувствительность используемых методик приводит к потере информации о биологических объектах, находящихся в растворах аналита в сверхнизких концентрациях. Новые сведения о белок-белковых и других взаимодействиях необходимы для системного анализа механизмов развития патологических процессов, а также для определения новых лекарственных мишеней.

В работе [4] обсуждается востребованность достижений высокопроизводительных постгеномных технологий и рассматриваются причины, препятствующие внедрению результатов исследований в области геномики, протеомики и метаболомики в рутинную клиническую практику. Ситуация с поиском постгеномных биомаркеров иллюстрируется молекулярным «айсбергом», большая часть которого недоступна для детектирования измерительными методами [2, 5] (Рис. 1). Небольшая надводная часть «айсберга» представлена хорошо известными высококопийными белками, которые нашли клиническое применение [16]. Подводная часть содержит существенно большее число белков, но изучена гораздо хуже, поскольку низкокопийные белки не определяются из-за недостаточной чувствительности постгеномных аналитических методов [17]. В геномике проблема не так остро выражена, вследствие того, что единичная молекула теоретически может быть бесконечно размножена методом ПЦР - полимеразной цепной реакции.

ИХ, ИФА, прямая МС

ЛЯ

Хромато-МС, ИФА, ПЦР

Таргетная-МС, баркодированная ПЦР

ВЫСОКАЯ

"1

-----* ю-"м

СРЕДНЯЯ ---

I I

I-

о о

X

с

о

НИЗКАЯ -------- ^

«Обратное число Авоградро»

-----+> 1016 М

УЛЬТРАНИЗКАЯ "

■■■■■■■■■■МВННН_____► М

Рис. 1 - Иллюстрация ограничения чувствительности современных методов молекулярной медицины. ИХ - иммунохимический анализ, ИФА - иммуноферментный анализ, МС - масс-спектрометрия, ПЦР - полимеразная цепная реакция. Рисунок адаптирован из [4]

Авторами [4] указывается, что существует два направления исследования молекулярного «айсберга»: по горизонтали, определение ширины молекулярного профиля за счет протеоформ высококопийных белков, доступных для анализа (см. стрелку «ширина» на Рис.1), либо вертикально - путем увеличения чувствительности методов детектирования белков в низко- и ультранизкокопийных областях (см. стрелку «глубина» на Рис.1) [18]. Количество белокодирующих генов определяет ширину молекулярного профиля [19]. На сегодняшний день успешно расшифрован геном, но надежды, возлагаемые учеными и медиками на медицинскую значимость полученных данных, не оправдались. Прогресс достигнут в диагностике редких заболеваний, что, возможно, связано не столько с развитием постгеномных технологий, сколько с изобретением ПЦР более 30 лет назад [4]. Одна из причин, как уже указывалось выше, связана с недостаточной чувствительностью аналитических методов (см. Рис.1). До уровня 10-8 M («ватерлиния айсберга») работают иммуноферментные методы, позволяющие регистрировать в биологических образцах высококопийные белки. «Аналитические методы работают до уровня 10-14 M; дальше начинается terra incognita» [4]. «Концентрация 10-12 М является порогом, за которым содержание молекул целесообразно выражать не в концентрационных единицах, а в «штуках» — как результат «инвентаризации» молекулярного состава образца» [13]. С целью «инвентаризации» белков применяются детекторы единичных молекул -молекулярные детекторы, основанные на сенсорных элементах, размеры которых сравнимы с размерами биомолекул, т.е. наносенсоры [20].

Переход от «микро» к «нано» - это не количественный, а качественный переход от манипуляции веществом к контролируемой манипуляции отдельными группами атомов и молекулами. Благодаря своим размерам наночастицы приобретают новые физико-химические свойства и функции, существенно отличающиеся от тех, которыми обладают составляющие их молекулы и атомы веществ в частицах большего размера [20]. Нанобиотехнологии способствуют тесной кооперации наук о живом с физикой, химией и инженерией. Медицинские приложения нанобиотехнологий привели к появлению новой отрасли - наномедицины [21,22]. По определению Freitas [22]: "Наномедицина - это слежение, исправление, конструирование и контроль над биологическими системами человека на молекулярном уровне с использованием разработанных наноустройств и

наноструктур". Таким образом, разработка методов обнаружения с использованием наносенсоров реализуется в рамках развития нанобиотехнологий, связанных с наномедициной: наноаналитическая геномика и протеомика в создании нанодиагностикумов.

Использование молекулярных детекторов на основе наносенсоров - это возможность увеличения чувствительности методов детектирования белков в глубинных низко- и ультранизкокопийных областях [18].

«Насколько глубоко нужно «погружаться», чтобы выявить единичные предвестники, имеющие связь с молекулярной патологией до клинических проявлений?» [4].

Основные измерительные методы в биологии позволяют регистрировать сигнал только от незначительной части молекул белков. При этом, «часть» является ансамблем молекул, в котором не учитывается «индивидуальность» каждой молекулы. Большинство молекул (и тем более их модифицированные формы) невозможно зарегистрировать на современном оборудовании; они скрыты в подводной части молекулярного «айсберга» [4] (Рис. 1).

Какая чувствительность аналитического метода необходима, чтобы выявить единичные предвестники, имеющие связь с молекулярной патологией до клинических проявлений? [4]. При небольшой опухоли (менее 1 мм3 [6]), которая не наблюдается современными методами визуализации (магнитно-резонансной томографией), имеется несколько миллионов трансформированных клеток, но не ясно присутствуют в крови биомаркеры. Hon S.S и Gambhir S.S. [6] выполнили расчеты на основе математической модели, которая описывает динамическую кинетику биомаркеров в плазме относительно роста опухоли, начиная с одной раковой клетки. Расчеты показали, что для опухоли диаметром около 1 мм единичный биомаркер будет иметь концентрацию в крови порядка 10-15 M. Таким образом, обнаружить в плазме крови маркеры патологического процесса сложно из-за их низкого содержания — примерно 1 молекула маркера в 1 мкл крови.

По оценке Rissin и соавторов [7] для диагностики онкологических и вирусных заболеваний концентрационный предел чувствительности (detection limit, DL) диагностических методов также должен быть ниже 10-15 М. Однако чувствительность большинства используемых в настоящее время высокопроизводительных

стандартных методов протеомики таких как МС-методы с использованием одномерного или двумерного электрофореза, жидкостной хроматографии составляется БЬ< 10-12 - 10-14 М [1, 2]

Где искать низкокопийные белки? В протеомных исследованиях сыворотка крови представляет значительный интерес для поиска биомаркеров заболеваний. Сыворотка крови является идеальным биологическим образцом, который является носителем информации посредством множества белков, высвобождаемых пораженной тканью. Изменения белка в ответ на патогенез заболевания делает сыворотку привлекательным образцом для клинических исследований [5]. Несмотря на эти преимущества, анализ протеома сыворотки является весьма сложной задачей из-за широкого динамического диапазона белков. В частности, затруднение вызывает обнаружение целевых аналитов при низкой концентрации в связи с наличием высокопредставленных белков в сыворотке крови, высоких уровней солей и других интерферирующих соединений [3,8,14].

В [3] выполнена оценка количества протеоформ в клетках человека и в плазме. Авторы предложили подход, в котором используется зависимость детектирования количества протеоформ от чувствительности метода. Оценка выполнена на основе использования двумерного электрофореза с последующим окрашиванием белков красителями разной чувствительности. Предложена формула зависимости количества детектируемых полипептидов (пятен) в двумерном геле от чувствительности красителя. Для определения чувствительности красителей авторы провели эксперименты, в которых несколько образцов с понижающимся содержанием белка (бычьего сывороточного альбумина) анализировали одномерным гель-электрофорезом в денатурирующих условиях (SDS-PAGE). Гели окрашивали различными красителями и оценивали минимальное количество белка, которое можно детектировать. Авторы показали, что среди всех используемых ими красителей наименьшая чувствительность соответствует Амидо Черному (предел чувствительности 5*10-8 г), а наивысшая 125! и Cy5 - 2*10-11 г и 10-11г. Экстраполяция зависимости на область чувствительности, позволяющей детектировать самую малую единичную молекулу белка, авторы подсчитали, что вся плазма человека может содержать 1,5 млн белков. Авторы определяют минимальный объем плазмы в 0,1 мкл, который отражает свойства всей плазмы организма, предполагая гомогенность

раствора и, принимая в расчет динамический диапазон белков в 7 порядков. Подчеркивается, что единичная клетка и плазма очень разные объекты. «В сущности, клетка - это микро, а плазма самый большой макрообъект человеческого тела, активно взаимодействующий со всеми органами человека [...]. Таким образом, плазма включает в себя практически все разнообразие протеоформ, присутствующих в клетках разного типа человека, и низкокопийные белки составляют большую часть ее протеома» [3].

Таким образом, далее в литературном обзоре проведен анализ методов, с помощью которых возможны исследования биомакромолекул на уровне отдельных молекул. Кратко приведен принцип метода и рассмотрены следующие аспекты: -возможность обнаружения белков в растворах при концентрациях ниже 10-12 М; -параметры биомолекул, которые могут быть определены;

- возможность обнаружения белков в сложных биологических жидкостях - сыворотке крови и плазме;

- «технологичность» метода для анализа протеома сыворотки с указанием существующих проблем и путей их решения;

- рассмотрена процедура подготовки образцов, так как различие в пробоподготовке в том числе необходимость введения меток, очевидно, влияет на вариабельность результатов анализа протеома.

1.2 Методы исследования белков на уровне отдельных молекул

Установление механизмов межмолекулярных взаимодействий и их количественная характеристика имеет большое значение для описания разнообразных биологических процессов [23,24]. За последние десятилетия развились новые методы, позволяющие манипулировать и изучать отдельные биомолекулы, а также изучать взаимодействие отдельных молекул. Возможность мониторинга биологических процессов на уровне отдельных биомолекул, т.е. на фундаментальном уровне чувствительности, приводит к лучшему пониманию молекулярных механизмов. Могут быть исключены усреднение, распределение и флуктуация молекулярных свойств по ансамблю молекул. Таким образом, по сравнению с обычными ансамблевыми методами исследования эксперименты с одной молекулой позволяют исследовать свойства неоднородных систем [24].

В учебном пособии Сердюка И. [9] подчеркивается, что «о существовании

макромолекул мы узнаем только благодаря методам, с помощью которых их можно наблюдать [...]. Не существует единого метода, обеспечивающего всю необходимую информацию о макромолекулах и их взаимодействии». Также следует учитывать, что биомакромолекулы являются функционирующими единицами только в подходящих растворителях, и в исследование биосистем должно быть включено изучение окружающих биомолекулу водных растворов. В этой же работе предлагается иллюстрация, отражающая возможности некоторых биофизических методов (Рис. 2). Как видно из Рис. 2, несмотря на очень высокое разрешение методов ЯМР и кристаллографии (0,1-1 нм), требуется достаточное большое количество биологического материала (109-1015 усредненных биомолекул) для проведения исследований.

Список литературы диссертационного исследования доктор наук Плешакова Татьяна Олеговна, 2019 год

БИБЛИОГРАФИЯ

1. Брюховецкий А.С. и др. Сравнительное протеомное картирование опухолевых стволовых клеток, выделенных из глиобластомы линии U87, нейрональных стволовых и мультипотентных мезенхимных стромальных клеток человека: от каталогизации клеточных белков к инновационной парадигме протеом-основанной клеточной терапии опухолей // Гены и клетки. 2013. Т. 8, № 2. С. 85-92.

2. Пономаренко Е. А. и др. Россия в международном проекте "протеом человека": первые итоги и перспективы //Биомедицинская химия. 2015. Т. 61. №. 2. С. 169-175.

3. Нарыжный С.Н. и др. Экспериментальная оценка размера протеомов клеток и плазмы крови человека // Биомедицинская химия. 2015. Т. 61, № 2. С. 279-285.

4. Лисица А.В. и др. Постгеномная медицина: альтернатива биомаркерам // Вестник российской академии медицинских наук. 2016. Т. 71, № 3. С. 255-259.

5. Geyer P.E. et al. Revisiting biomarker discovery by plasma proteomics // Mol. Syst. Biol. 2017. Vol. 13, № 9. P. 942.

6. Hori S.S., Gambhir S.S. Mathematical Model Identifies Blood Biomarker-Based Early Cancer Detection Strategies and Limitations // Sci. Transl. Med. 2011. Vol. 3, № 109. P. 109ra116-109rall6.

7. Rissin D.M. et al. Single-molecule enzyme-linked immunosorbent assay detects serum proteins at subfemtomolar concentrations // Nat. Biotechnol. 2010. Vol. 28, № 6. P. 595-599.

8. Archakov A. et al. Biospecific irreversible fishing coupled with atomic force microscopy for detection of extremely low-abundant proteins // Proteomics. 2009. Vol. 9, № 5. P. 1326-1343.

9. Сердюк И., Заккаи И., Заккаи Д. Методы в молекулярной биофизике. Структура. Функция. Динамика / КДУ. Москва, 2010.

10. Binnig G., Quate C.F., Gerber C. Atomic Force Microscope // Phys. Rev. Lett. 1986. Vol. 56, № 9. P. 930-933.

11. Dufrene Y.F. et al. Imaging modes of atomic force microscopy for application in molecular and cell biology // Nat. Nanotechnol. 2017. Vol. 12, № 4. P. 295.

12. Орехович В.Н. Современные представления о белках и их значение в биологии и медицине // Стенограмма публичной лекции. 1952. P. 32.

13. Lisitsa A. et al. The Width of the human plasma proteome compared with a cancer cell line and bacteria. 2015. Vol. 4.

14. Archakov A.I. et al. AFM fishing nanotechnology is the way to reverse the Avogadro number in proteomics // Proteomics. 2007. Vol. 7, № 1. P. 4-9.

15. Archakov A.I., Ivanov Y.D. Analytical nanobiotechnology for medicine diagnostics // Mol. Biosyst. 2007. Vol. 3, № 5. P. 336-342.

16. Anderson N.L. The clinical plasma proteome: a survey of clinical assays for proteins in plasma and serum // Clin. Chem. 2010. Vol. 56, № 2. P. 177-185.

17. Liotta L.A., Petricoin E.F., III. -Omics and Cancer Biomarkers: Link to the Biological Truth or Bear the Consequences // Cancer Epidemiol. Biomark. Prev. Publ. Am. Assoc. Cancer Res. Cosponsored Am. Soc. Prev. Oncol. 2012. Vol. 21, № 8. P. 1229.

18. Ponomarenko E. et al. The Chromosome-centric Human Proteome Project at FEBS Congress // Proteomics. 2014. Vol. 14, № 2-3. P. 147-152.

19. Archakov A. et al. Chromosome-centric approach to overcoming bottlenecks in the Human Proteome Project // Expert Rev. Proteomics. 2012. Vol. 9, № 6. P. 667-676.

20. Медведева Н.В. и др. Нанобиотехнология и наномедицина // Биомедицинская химия. 2006. Vol. 52, № 6. P. 529-546.

21. Пиотровский Л.Б. Наномедицина как часть нанотехнологий // Вестник российской академии медицинских наук. 2010. № 3. С. 41-46.

22. Freitas R.A. What is nanomedicine? // Nanomedicine Nanotechnol. Biol. Med. 2005. Vol. l, № 1. P. 2-9.

23. Hinterdorfer P., Oijen A. Handbook of Single-Molecule Biophysics [Electronic resource] // CERN Document Server. 2009. URL: http://cds.cern.ch/record/l339365.

24. Safenkova I.V., Zherdev A.V., Dzantiev B.B. Application of atomic force microscopy for characteristics of single intermolecular interactions // Biochem. Mosc. 2012. Vol. 77, № 13. P. 1536-1552.

25. Huang B., Bates M., Zhuang X. Super-resolution fluorescence microscopy // Annu. Rev. Biochem. 2009. Vol. 78, № 1. P. 993-1016.

26. Ефимов Г.А., Недоспасов С.А. Методы молекулярной визуализации in vivo Обзор // Биохимия. 2012. Т. 77, № 12. С. 1603-1620.

27. Hell S.W., Dyba M., Jakobs S. Concepts for nanoscale resolution in fluorescence microscopy // Curr. Opin. Neurobiol. 2004. Vol. 14, № 5. P. 599-609.

28. Islam M.S. et al. High sensitive detection of C-reactive protein by total internal reflection fluorescence microscopy on rapidly making nanoarray protein chip // Talanta. 2010. Vol. 81, № 4. P. 1402-1408.

29. Lee S. et al. An ultra-sensitive nanoarray chip based on single-molecule sandwich immunoassay and TIRFM for protein detection in biologic fluids // Analyst. 2009. Vol. 134, № 5. P. 933-938.

30. Ritchie D.B., Woodside M.T. Probing the structural dynamics of proteins and nucleic acids with optical tweezers // Curr. Opin. Struct. Biol. 2015. Vol. 34. P. 43-51.

31. Евстрапов А.А. Физические Методы управления движением и разделением микрочастиц в жидких средах. I. Диэлектрофорез, фотофорез, оптофорез, оптический пинцет // Научное приборостроение. 2005. Т. 15, № 1. С. 3-20.

32. Fologea D. et al. Electrical characterization of protein molecules by a solid-state nanopore // Appl. Phys. Lett. 2007. Vol. 91, № 5. P. 053901.

33. Kowalczyk S.W. et al. Single-molecule transport across an individual biomimetic nuclear pore complex // Nat. Nanotechnol. 2011. Vol. 6, № 7. P. 433-438.

34. Freedman K.J. et al. Solid-state nanopore detection of protein complexes: applications in healthcare and protein kinetics // Small. 2013. Vol. 9, № 5. P. 750-759.

35. Rotem D. et al. Protein detection by nanopores equipped with aptamers // J. Am. Chem. Soc. 2012. Vol. 134, № 5. P. 2781-2787.

36. Soskine M. et al. An engineered ClyA nanopore detects folded target proteins by selective external association and pore entry // Nano Lett. 2012. Vol. 12, № 9. P. 4895-4900.

37. Wei R. et al. Stochastic sensing of proteins with receptor-modified solid-state nanopores // Nat. Nanotechnol. 2012. Vol. 7, № 4. P. 257-263.

38. Siwy Z. et al. Protein biosensors based on biofunctionalized conical gold nanotubes // J. Am. Chem. Soc. 2005. Vol. 127, № 14. P. 5000-5001.

39. Ермолаева Т.Н., Калмыкова Е.Н. Пьезокварцевые иммуносенсоры. Аналитические возможности и перспективы // Успехи химии. 2006. Т. 75, № 5. С. 445-459.

40. Patolsky F., Zheng G., Lieber C.M. Fabrication of silicon nanowire devices for ultrasensitive, label-free, real-time detection of biological and chemical species // Nat. Protoc. 2006. Vol. 1, № 4. P.1711-1724.

41. Elfström N. et al. Surface charge sensitivity of silicon nanowires: size dependence // Nano Lett. 2007. Vol. 7, № 9. P. 2608-2612.

42. Hahm J., Lieber C.M. Direct ultrasensitive electrical detection of DNA and DNA sequence variations using nanowire nanosensors // Nano Lett. 2004. Vol. 4, № 1. P. 51-54.

43. Tian R. et al. Ultrasensitive protein detection using lithographically defined Si multi-nanowire field effect transistors // Lab. Chip. 2011. Vol. 11, № 11. P. 1952-1961.

44. Zheng G. et al. Multiplexed electrical detection of cancer markers with nanowire sensor arrays // Nat. Biotechnol. 2005. Vol. 23, № 10. P. 1294-1301.

45. Zhang G.-J. et al. Label-free direct detection of MiRNAs with silicon nanowire biosensors // Biosens. Bioelectron. 2009. Vol. 24, № 8. P. 2504-2508.

46. Kim K.S. et al. The fabrication, characterization and application of aptamer-functionalized Si-nanowire FET biosensors // Nanotechnology. 2009. Vol. 20, № 23. P. 235501.

47. Gao Z. et al. Silicon nanowire arrays for label-free detection of DNA // Anal. Chem. 2007.

Vol. 79, № 9. P. 3291-3297.

48. Jain A., Nair P.R., Alam M.A. Flexure-FET biosensor to break the fundamental sensitivity limits of nanobiosensors using nonlinear electromechanical coupling // Proc. Natl. Acad. Sci. 2012. Vol. 109, № 24. P. 9304-9308.

49. Cai D. et al. A molecular-imprint nanosensor for ultrasensitive detection of proteins // Nat. Nanotechnol. 2010. Vol. 5, № 8. P. 597-601.

50. Yu Y. et al. Assembly of multi-functional nanocomponents on periodic nanotube array for biosensors // Micro Amp Nano Lett. 2009. Vol. 4, № 1. P. 27-33.

51. Ferreira J. et al. Attomolar protein detection using in-hole surface plasmon resonance // J. Am. Chem. Soc. 2009. Vol. 131, № 2. P. 436-437.

52. Guo L., Kim D.-H. LSPR biomolecular assay with high sensitivity induced by aptamer-antigen-antibody sandwich complex // Biosens. Bioelectron. 2012. Vol. 31, № 1. P. 567-570.

53. Armani A.M. et al. Label-free, single-molecule detection with optical microcavities // Science. 2007. Vol. 317, № 5839. P. 783-787.

54. Truong P.L. et al. A new method for non-labeling attomolar detection of diseases based on an individual gold nanorod immunosensor // Lab. Chip. 2011. Vol. 11, № 15. P. 2591-2597.

55. Sim H.R., Wark A.W., Lee H.J. Attomolar detection of protein biomarkers using biofunctionalized gold nanorods with surface plasmon resonance // Analyst. 2010. Vol. 135, № 10. P. 2528-2532.

56. Forsgard N., Salehpour M., Possnert G. Accelerator mass spectrometry in the attomolar concentration range for 14 C-labeled biologically active compounds in complex matrixes // J. Anal. At. Spectrom. 2010. Vol. 25, № 1. P. 74-78.

57. Lee J.R. et al. Mass spectrometry signal amplification method for attomolar detection of antigens using small-molecule-tagged gold microparticles // Angew. Chem. Int. Ed. 2008. Vol. 47, № 49. P. 9518-9521.

58. Kopylov A.T. et al. Combined use of irreversible binding and MRM technology for low- and ultralow copy-number protein detection and quantitation // Proteomics. 2013. Vol. 13, № 5. P. 727-742.

59. Zhang G.J. et al. Highly sensitive and selective label-free detection of cardiac biomarkers in blood serum with silicon nanowire biosensors // 2009 IEEE International Electron Devices Meeting (IEDM). 2009. P. 1-4.

60. Hoh J.H., Schoenenberger C.A. Surface morphology and mechanical properties of MDCK monolayers by atomic force microscopy // J. Cell Sci. 1994. Vol. 107, № 5. P. 1105-1114.

61. Henderson E., Haydon P.G., Sakaguchi D.S. Actin filament dynamics in living glial cells imaged by atomic force microscopy [Electronic resource] // Science. 1992. URL: http://link.galegroup.com/apps/doc/A12671906/A0NE?sid=googlescholar.

62. Hoh J.H. et al. Atomic force microscopy and dissection of gap junctions // Science. 1991. Vol. 253, № 5026. P. 1405-1408.

63. Mou J., Yang J., Shao Z. Atomic force microscopy of cholera toxin b-oligomers bound to bilayers of biologically relevant lipids // J. Mol. Biol. 1995. Vol. 248, № 3. P. 507-512.

64. Hansma H.G. et al. Reproducible imaging and dissection of plasmid DNA under liquid with the atomic force microscope // Science. 1992. Vol. 256, № 5060. P. 1180-1184.

65. Limanskaya O.Y., Limanskii A.P. Imaging compaction of single supercoiled DNA molecules by atomic force microscopy // Gen. Physiol. Biophys. 2008. Vol. 27, № 4. P. 322-337.

66. Kwak K.J., Kudo H., Fujihira M. Imaging stretched single DNA molecules by pulsed-forcemode atomic force microscopy // Ultramicroscopy. 2003. Vol. 97, № 1. P. 249-255.

67. Egger M. et al. Wet lipid-protein membranes imaged at submolecular resolution by atomic force microscopy // J. Struct. Biol. 1990. Vol. 103, № 1. P. 89-94.

68. Hansma H.G. et al. Imaging nanometer scale defects in Langmuir-Blodgett films with the atomic force microscope // Langmuir. 1991. Vol. 7, № 6. P. 1051-1054.

69. Chi L.F. et al. Domain Structures in Langmuir-Blodgett Films Investigated by Atomic Force Microscopy // Science. 1993. Vol. 259, № 5092. P. 213-216.

70. Yang J., Mou J., Shao Z. Structure and stability of pertussis toxin studied by in situ atomic force microscopy // FEBS Lett. 1994. Vol. 338, № 1. P. 89-92.

71. Müller D.J. et al. Electrostatically balanced subnanometer imaging of biological specimens by atomic force microscope // Biophys. J. 1999. Vol. 76, № 2. P. 1101-1111.

72. Schabert F.A., Henn C., Engel A. Native Escherichia coli OmpF porin surfaces probed by atomic force microscopy // Science. 1995. Vol. 268, № 5207. P. 92-94.

73. Silva L.P. Imaging proteins with atomic force microscopy: an overview // Curr. Protein Pept. Sci. 2005. Vol. 6, № 4. P. 387-395.

74. Müller D.J. et al. The bacteriophage ф29 head-tail connector imaged at high resolution with the atomic force microscope in buffer solution // EMBO J. 1997. Vol. 16, № 10. P. 25472553.

75. Быков И.В., Быков В.А. Режимы притяжения и отталкивания в полуконтактном методе атомно-силовой микроскопии. Автоматизированные способы оптимизации работы в режиме притяжения // Известия высших учебных заведений. Материалы электронной техники. 2008. № 1. С. 75-77.

76. Dufrêne Y.F. et al. Imaging modes of atomic force microscopy for application in molecular and cell biology // Nat. Nanotechnol. 2017. Vol. 12, № 4. P. 295.

77. Engel, A. & Müller, D. J. Observing single biomolecules at work with the atomic force

microscope. Nat. Struct. Mol. Biol. 7, 715 (2000).

78. Albrecht T.R. et al. Frequency modulation detection using high-Q cantilevers for enhanced force microscope sensitivity // J. Appl. Phys. 1991. Vol. 69, № 2. P. 668-673.

79. Putman C.A.J. et al. Tapping mode atomic force microscopy in liquid // Appl. Phys. Lett. 1994. Vol. 64, № 18. P. 2454-2456.

80. Garcia R., Herruzo E.T. The emergence of multifrequency force microscopy // Nat. Nanotechnol. 2012. Vol. 7, № 4. P. 217.

81. Hansma P.K. et al. Tapping mode atomic force microscopy in liquids // Appl. Phys. Lett. 1994. Vol. 64, № 13. P. 1738-1740.

82. Ido S. et al. Beyond the helix pitch: direct visualization of native DNA in aqueous solution // ACS Nano. 2013. Vol. 7, № 2. P. 1817-1822.

83. Ido S. et al. Immunoactive two-dimensional self-assembly of monoclonal antibodies in aqueous solution revealed by atomic force microscopy // Nat. Mater. 2014. Vol. 13, № 3. P. 264.

84. Kienberger F. et al. Dynamic force microscopy imaging of native membranes // Ultramicroscopy. 2003. Vol. 97, № 1. P. 229-237.

85. Scheuring S. et al. AFM Characterization of tilt and intrinsic flexibility of rhodobacter sphaeroides light harvesting complex 2 (LH2) // J. Mol. Biol. 2003. Vol. 325, № 3. P. 569580.

86. Radmacher M. et al. Imaging adhesion forces and elasticity of lysozyme adsorbed on mica with the atomic force microscope // Langmuir. 1994. Vol. 10, № 10. P. 3809-3814.

87. Alonso J.L., Goldmann W.H. Feeling the forces: atomic force microscopy in cell biology // Life Sci. 2003. Vol. 72, № 23. P. 2553-2560.

88. Fotiadis D. et al. Imaging and manipulation of biological structures with the AFM // Micron. 2002. Vol. 33, № 4. P. 385-397.

89. Zlatanova J., Lindsay S.M., Leuba S.H. Single molecule force spectroscopy in biology using the atomic force microscope // Prog. Biophys. Mol. Biol. 2000. Vol. 74, № 1. P. 37-61.

90. Stolz M. et al. Monitoring biomolecular interactions by time-lapse atomic force microscopy // J. Struct. Biol. 2000. Vol. 131, № 3. P. 171-180.

91. Bustamante C. et al. Single-molecule studies of DNA mechanics // Curr. Opin. Struct. Biol. 2000. Vol. 10, № 3. P. 279-285.

92. Rief M. et al. Single molecule force spectroscopy on polysaccharides by atomic force microscopy // Science. 1997. Vol. 275, № 5304. P. 1295-1297.

93. Vengasandra S. et al. Studies on the protein-receptor interaction by atomic force microscopy

// Langmuir. 2003. Vol. 19, № 26. P. 10940-10946.

94. Zhang J., Liu X.Y. Effect of protein-protein interactions on protein aggregation kinetics // J. Chem. Phys. 2003. Vol. 119, № 20. P. 10972-10976.

95. Thomson N.H. et al. Protein tracking and detection of protein motion using atomic force microscopy // Biophys. J. 1996. Vol. 70, № 5. P. 2421-2431.

96. Kiselyova O.I., Yaminsky I.V. Atomic force microscopy of protein complexes // Atomic Force Microscopy. Humana Press, 2004. P. 217-230.

97. Silva LP. atomic force microscopy investigation of ribonuclease A // Protein Pept. Lett. 2001. Vol. 8, № 5. P. 343-347.

98. Bittencourt S.E.. et al. The plant cytolytic protein enterolobin assumes a dimeric structure in solution // FEBS Lett. 2003. Vol. 549, № 1-3. P. 47-51.

99. Neff D. et al. Chloroplast F0F1ATP synthase imaged by atomic force microscopy // J. Struct. Biol. 1997. Vol. 119, № 2. P. 139-148.

100. Petsev D.N. et al. Interactions and aggregation of apoferritin molecules in solution: effects of added electrolytes // Biophys. J. 2000. Vol. 78, № 4. P. 2060-2069.

101. Schneider S.W. et al. Molecular weights of individual proteins correlate with molecular volumes measured by atomic force microscopy // Pflüg. Arch. 1998. Vol. 435, № 3. P. 362367.

102. Wagner P. Immobilization strategies for biological scanning probe microscopy 1 // FEBS Lett. 1998. Vol. 430, № 1-2. P. 112-115.

103. Müller D.J., Amrein M., Engel A. Adsorption of biological molecules to a solid support for scanning probe microscopy // J. Struct. Biol. 1997. Vol. 119, № 2. P. 172-188.

104. Hafner J.H. et al. Structural and functional imaging with carbon nanotube AFM probes // Prog. Biophys. Mol. Biol. 2001. Vol. 77, № 1. P. 73-110.

105. Alessandrini A., Facci P. AFM: a versatile tool in biophysics // Meas. Sci. Technol. 2005. Vol. 16, № 6. P. R65.

106. Lee W. et al. Fabrication of self-assembled protein A monolayer and its application as an immunosensor // Biosens. Bioelectron. 2003. Vol. 19, № 3. P. 185-192.

107. Lacava B.M. et al. Particle sizing of magnetite-based magnetic fluid using atomic force microscopy: A comparative study with electron microscopy and birefringence // Appl. Phys. Lett. 2000. Vol. 77, № 12. P. 1876-1878.

108. Silva L.P. et al. Atomic force microscopy and transmission electron microscopy of biocompatible magnetic fluids: A comparative analysis // J. Nanoparticle Res. 2004. Vol. 6, № 2. P. 209-213.

109. Muller D.J. Out and in: simplifying membrane protein studies by AFM // Biophys. J. 2006. Vol. 91, № 9. P. 3133-3134.

110. Worcester D.L., Miller R. g., Bryant P.J. Atomic force microscopy of purple membranes // J. Microsc. 1988. Vol. 152, № 3. P. 817-821.

111. Worcester D.L. et al. Imaging bacteriorhodopsin lattices in purple membranes with atomic force microscopy // J. Vac. Sci. Technol. Vac. Surf. Films. 1990. Vol. 8, № 1. P. 403-405.

112. Müller D.J. et al. Stability of bacteriorhodopsin a-helices and loops analyzed by single-molecule force spectroscopy // Biophys. J. 2002. Vol. 83, № 6. P. 3578-3588.

113. Walz T. et al. Surface topographies at subnanometer-resolution reveal asymmetry and sidedness of aquaporin-1 // J. Mol. Biol. 1996. Vol. 264, № 5. P. 907-918.

114. Müller D.J. et al. Imaging purple membranes in aqueous solutions at sub-nanometer resolution by atomic force microscopy // Biophys. J. 1995. Vol. 68, № 5. P. 1681-1686.

115. Seelert H. et al. Structural biology: Proton-powered turbine of a plant motor // Nature. 2000. Vol. 405, № 6785. P. 418.

116. Müller D.J. et al. Conformational changes in surface structures of isolated connexin 26 gap junctions // EMBO J. 2002. Vol. 21, № 14. P. 3598-3607.

117. Cohen Simonsen A. et al. Acyl-coenzyme A organizes laterally in membranes and is recognized specifically by acyl-coenzyme A binding protein // FEBS Lett. 2003. Vol. 552, №

2-3. P. 253-258.

118. Choi S. et al. Medical applications of atomic force microscopy and Raman spectroscopy // J. Nanosci. Nanotechnol. 2014. Vol. 14, № 1. P. 71-97.

119. Neuman K.C., Nagy A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy // Nat. Methods. 2008. Vol. 5, № 6. P. 491.

120. Быков И.В. Методика поточечных измерений рельефа, сил взаимодействия и локальных свойств: новый подход для комплексного анализа в атомно-силовой микроскопии // Научное приборостроение. 2009. Т. 19, № 4. С. 38-43.

121. Berquand A. et al. Expression of tumor suppressors PTEN and TP53 in Isogenic Glioblastoma U-251MG cells affects cellular mechanical properties — An AFM-Based quantitative investigation [Electronic resource] // JJAP Conference Proceedings. 2013. URL: https://journals.jsap.jp.

122. Rosa-Zeiser A. et al. The simultaneous measurement of elastic, electrostatic and adhesive properties by scanning force microscopy: pulsed-force mode operation // Meas. Sci. Technol. 1997. Vol. 8, № 11. P. 1333.

123. Maivald P. et al. Using force modulation to image surface elasticities with the atomic force microscope // Nanotechnology. 1991. Vol. 2, № 2. P. 103.

124. Lee G.U., Kidwell D.A., Colton R.J. Sensing discrete streptavidin-biotin interactions with atomic force microscopy // Langmuir. 1994. Vol. 10, № 2. P. 354-357.

125. Moy V.T., Florin E.-L., Gaub H.E. Adhesive forces between ligand and receptor measured by AFM // Colloids Surf. Physicochem. Eng. Asp. 1994. Vol. 93. P. 343-348.

126. Lo Y.-S., Simons J., Beebe T.P. Temperature dependence of the biotin-avidin bond-rupture force studied by atomic force microscopy // J. Phys. Chem. B. 2002. Vol. 106, № 38. P. 98479852.

127. Rief M., Clausen-Schaumann H., Gaub H.E. Sequence-dependent mechanics of single DNA molecules // Nat. Struct. Mol. Biol. 1999. Vol. 6, № 4. P. 346.

128. Harada Y., Kuroda M., Ishida A. Specific and quantized antigen-antibody interaction measured by atomic force microscopy // Langmuir. 2000. Vol. 16, № 2. P. 708-715.

129. Allen S. et al. Detection of antigen-antibody binding events with the atomic force microscope // Biochemistry. 1997. Vol. 36, № 24. P. 7457-7463.

130. Horton M., Charras G., Lehenkari P. Analysis of ligand-receptor interactions in cells by atomic force microscopy // J. Recept. Signal Transduct. 2002. Vol. 22, № 1-4. P. 169-190.

131. Willemsen O.H. et al. Biomolecular interactions measured by atomic force microscopy // Biophys. J. 2000. Vol. 79, № 6. P. 3267-3281.

132. Chtcheglova L.A. et al. Force spectroscopy with a small dithering of AFM Tip: a method of direct and continuous measurement of the spring constant of single molecules and molecular complexes // Biophys. J. 2004. Vol. 86, № 2. P. 1177-1184.

133. Zapotoczny S. et al. Chain length and concentration dependence of P-Cyclodextrin-Ferrocene host-guest complex rupture forces probed by dynamic force spectroscopy // Langmuir. 2002. Vol. 18, № 18. P. 6988-6994.

134. Baumgartner W., Hinterdorfer P., Schindler H. Data analysis of interaction forces measured with the atomic force microscope // Ultramicroscopy. 2000. Vol. 82, № 1. P. 85-95.

135. Allison D.P., Hinterdorfer P., Han W. Biomolecular force measurements and the atomic force microscope // Curr. Opin. Biotechnol. 2002. Vol. 13, № 1. P. 47-51.

136. Li P.-C., Makarov D.E. Ubiquitin-like protein domains show high resistance to mechanical unfolding similar to that of the I27 domain in titin: evidence from simulations // J. Phys. Chem. B. 2004. Vol. 108, № 2. P. 745-749.

137. Janovjak H. et al. Unfolding pathways of native bacteriorhodopsin depend on temperature // EMBO J. 2003. Vol. 22, № 19. P. 5220-5229.

138. Zhang B., Xu G., Evans J.S. A Kinetic molecular model of the reversible unfolding and refolding of titin under force extension // Biophys. J. 1999. Vol. 77, № 3. P. 1306-1315.

139. Choi H.S., Huh J., Jo W.H. Similarity of force-induced unfolding of apomyoglobin to its

chemical-induced unfolding: an atomistic molecular dynamics simulation approach // Biophys. J. 2003. Vol. 85, № 3. P. 1492-1502.

140. Thompson J.B. et al. The backbone conformational entropy of protein folding: experimental measures from atomic force microscopy // J. Mol. Biol. 2002. Vol. 322, № 3. P. 645-652.

141. Carrion-Vazquez M. et al. Mechanical and chemical unfolding of a single protein: a comparison // Proc. Natl. Acad. Sci. 1999. Vol. 96, № 7. P. 3694-3699.

142. Brockwell D.J. et al. Pulling geometry defines the mechanical resistance of a ß-sheet protein // Nat. Struct. Mol. Biol. 2003. Vol. 10, № 9. P. 731.

143. Dufrêne Y.F. et al. Multiparametric imaging of biological systems by force-distance curve-based AFM // Nat. Methods. 2013. Vol. 10, № 9. P. 847.

144. Kienberger F. et al. Molecular recognition imaging and force spectroscopy of single biomolecules // Acc. Chem. Res. 2006. Vol. 39, № 1. P. 29-36.

145. Ludwig M., Dettmann W., Gaub H.E. Atomic force microscope imaging contrast based on molecular recognition // Biophys. J. 1997. Vol. 72, № 1. P. 445-448.

146. Radmacher M. et al. Mapping interaction forces with the atomic force microscope // Biophys. J. 1994. Vol. 66, № 6. P. 2159-2165.

147. Heinz W.F., Hoh J.H. Spatially resolved force spectroscopy of biological surfaces using the atomic force microscope // Trends Biotechnol. 1999. Vol. 17, № 4. P. 143-150.

148. Viani M.B. et al. Fast imaging and fast force spectroscopy of single biopolymers with a new atomic force microscope designed for small cantilevers // Rev. Sci. Instrum. 1999. Vol. 70, № 11. P. 4300-4303.

149. Sahin O. et al. An atomic force microscope tip designed to measure time-varying nanomechanical forces // Nat. Nanotechnol. 2007. Vol. 2, № 8. P. 507.

150. Medalsy I., Hensen U., Muller D.J. Imaging and quantifying chemical and physical properties of native proteins at molecular resolution by Force-volume AFM // Angew. Chem. Int. Ed. 2011. Vol. 50, № 50. P. 12103-12108.

151. Roos W.H., Bruinsma R., Wuite G.J.L. Physical virology // Nat. Phys. 2010. Vol. 6, № 10. P. 733.

152. Herruzo E.T., Perrino A.P., Garcia R. Fast nanomechanical spectroscopy of soft matter // Nat. Commun. 2014. Vol. 5. P. 3126.

153. Raab A. et al. Antibody recognition imaging by force microscopy // Nat. Biotechnol. 1999. Vol. 17, № 9. P. 901.

154. Stroh C. et al. Single-molecule recognition imaging microscopy // Proc. Natl. Acad. Sci. 2004. Vol. 101, № 34. P. 12503-12507.

155. Creasey R. et al. Atomic force microscopy-based antibody recognition imaging of proteins in the pathological deposits in Pseudoexfoliation Syndrome // Ultramicroscopy. 2011. Vol. 111, № 8. P. 1055-1061.

156. Chtcheglova L.A. et al. Nano-scale dynamic recognition imaging on vascular endothelial cells // Biophys. J. 2007. Vol. 93, № 2. P. L11-L13.

157. Müller D.J., Dufrêne Y.F. Atomic force microscopy as a multifunctional molecular toolbox in nanobiotechnology // Nat. Nanotechnol. 2008. Vol. 3, № 5. P. 261-269.

158. Pillet F. et al. Atomic force microscopy and pharmacology: from microbiology to cancerology // Biochim. Biophys. Acta BBA - Gen. Subj. 2014. Vol. 1840, № 3. P. 1028-1050.

159. Азаров В.Ф. и др. Возможности атомно-силовой микроскопии в исследовании структурно-функциональных особенностей слизистой оболочки сфинктерных зон толстой кишки человека // Вестник новых медицинских технологий. 2011. Т. XVIII, № 2.

160. Minelli E. et al. A fully-automated neural network analysis of AFM force-distance curves for cancer tissue diagnosis // Appl. Phys. Lett. 2017. Vol. 111, № 14. P. 143701.

161. Судаков Н.П. и др. Роль митохондрий в реализации механизмов программированной гибели клетки // Бюллетень восточно-сибирского научного центра сибирского отделения российской академии медицинских наук. 2007. № 1. Сю 103-107

162. Hausenloy D.J. et al. Inhibiting mitochondrial permeability transition pore opening: a new paradigm for myocardial preconditioning? // Cardiovasc. Res. 2002. Vol. 55, № 3. P. 534-543.

163. Lee G.-J. et al. Characterization of mitochondria isolated from normal and ischemic hearts in rats utilizing atomic force microscopy // Micron. 2011. Vol. 42, № 3. P. 299-304.

164. Lee G.-J. et al. Quantitative and qualitative analysis of heart mitochondria for evaluating the degree of myocardial injury utilizing atomic force microscopy // Micron. 2013. Vol. 44. P. 167-173.

165. Yamazaki D., Kurisu S., Takenawa T. Regulation of cancer cell motility through actin reorganization // Cancer Sci. 2005. Vol. 96, № 7. P. 379-386.

166. Suresh S. Biomechanics and biophysics of cancer cells // Acta Mater. 2007. Vol. 55, № 12. P. 3989-4014.

167. Cross S.E. et al. AFM-based analysis of human metastatic cancer cells // Nanotechnology. 2008. Vol. 19, № 38. P. 384003.

168. Chen B., Wang Q., Han L. Using the atomic force microscope to observe and study the ultrastructure of the living biu-87 cells of the human bladder cancer // Scanning. 2004. Vol. 26, № 4. P. 162-166.

169. Li Q.S. et al. AFM indentation study of breast cancer cells // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2008. Vol. 374, № 4. P. 609-613.

170. Moreno-Flores S. et al. Stress relaxation and creep on living cells with the atomic force microscope: a means to calculate elastic moduli and viscosities of cell components // Nanotechnology. 2010. Vol. 21, № 44. P. 445101.

171. Faria E.C. et al. Measurement of elastic properties of prostate cancer cells using AFM // Analyst. 2008. Vol. 133, № 11. P. 1498-1500.

172. Cai X. et al. Connection between biomechanics and cytoskeleton structure of lymphocyte and Jurkat cells: An AFM study // Micron. 2010. Vol. 41, № 3. P. 257-262.

173. Li M. et al. Imaging and measuring the rituximab-induced changes of mechanical properties in B-lymphoma cells using atomic force microscopy // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2011. Vol. 404, № 2. P. 689-694.

174. Lekka M. et al. Elasticity of normal and cancerous human bladder cells studied by scanning force microscopy // Eur. Biophys. J. 1999. Vol. 28, № 4. P. 312-316.

175. Jonas E.A. Molecular participants in mitochondrial cell death channel formation during neuronal ischemia // Exp. Neurol. 2009. Vol. 218, № 2. P. 203-212.

176. Fuhrmann A. et al. AFM stiffness nanotomography of normal, metaplastic and dysplastic human esophageal cells // Phys. Biol. 2011. Vol. 8, № 1. P. 015007.

177. Ketene A.N. et al. The effects of cancer progression on the viscoelasticity of ovarian cell cytoskeleton structures // Nanomedicine Nanotechnol. Biol. Med. 2012. Vol. 8, № 1. P. 93102.

178. Cлавнова Е.Н. и др. Применение метода атомно-силовой микроскопии в цитологической диагностике опухолей различных локализаций // Онкохирургия. 2013. № 1. C. 82.

179. Schaus S.S., Henderson E.R. Cell viability and probe-cell membrane interactions of XR1 glial cells imaged by atomic force microscopy // Biophys. J. 1997. Vol. 73, № 3. P. 1205-1214.

180. Kim Y.-S. et al. Quantitative analysis with atomic force microscopy of cisplatin-induced morphological changes in HeLa and Ishikawa Cells // J. Nippon Med. Sch. 2012. Vol. 79, № 5. P. 320-326.

181. Kim K.S. et al. AFM-detected apoptotic changes in morphology and biophysical property caused by paclitaxel in Ishikawa and HeLa Cells // PLOS ONE. 2012. Vol. 7, № 1. P. e30066.

182. Guedes A.F. et al. Atomic force microscopy as a tool to evaluate the risk of cardiovascular diseases in patients // Nat. Nanotechnol. 2016. Vol. 11, № 8. P. 687-692.

183. Wang Q. et al. Evaluation of medicine effects on the interaction of myoglobin and its aptamer or antibody using atomic force microscopy // Anal. Chem. 2015. Vol. 87, № 4. P. 2242-2248.

184. Mороз В.В. и др. Изменения структуры поверхности мембран эритроцитов при

длительном хранении донорской крови // Общая реаниматология. 2012. Т. VIII, № 1. С. 5-12.

185. Технический регламент о требованиях безопасности крови, ее продуктов, кровезамещающих растворов и технических средств, используемых в трансфузионно инфузионной терапии. / Постановление Правительства РФ от 26.01.2010 N 29 (ред. от 04.09.2012)

186. You H., Yu L. Atomic force microscopy as a tool for study of human hair // Scanning. 2007. Vol. 19, № 6. P. 431-437.

187. Gurden S.P. et al. Quantitative analysis and classification of AFM images of human hair // J. Microsc. 2004. Vol. 215, № 1. P. 13-23.

188. Shin M.K. et al. Investigation of the hair of patients with scalp psoriasis using atomic force microscopy // Clin. Exp. Dermatol. 2012. Vol. 37, № 2. P. 156-163.

189. Hutterer S. et al. Data mining supported analysis of medical atomic force microscopy images // 2013 IEEE Symposium on Computational Intelligence in Healthcare and e-health (CICARE). 2013. P. 99-104.

190. Kotova S.L. et al. Collagen structure deterioration in the skin of patients with pelvic organ prolapse determined by atomic force microscopy // Microsc. Microanal. 2015. Vol. 21, № 2. P. 324-333.

191. Trindade G.S. et al. Use of atomic force microscopy as a diagnostic tool to identify orthopoxvirus // J. Virol. Methods. 2007. Vol. 141, № 2. P. 198-204.

192. Nettikadan S.R. et al. ViriChip: a solid phase assay for detection and identification of viruses by atomic force microscopy // Nanotechnology. 2004. Vol. 15, № 3. P. 383.

193. Wagner P. Immobilization strategies for biological scanning probe microscopy 1 // FEBS Lett. 1998. Vol. 430, № 1-2. P. 112-115.

194. Butt H.-J. Measuring electrostatic, van der Waals, and hydration forces in electrolyte solutions with an atomic force microscope // Biophys. J. 1991. Vol. 60, № 6. P. 1438-1444.

195. Bizzarri A.R., Cannistraro S. Atomic force spectroscopy in biological complex formation: strategies and perspectives // J. Phys. Chem. B. 2009. Vol. 113, № 52. P. 16449-16464.

196. Klein D.C.G. et al. Covalent immobilization of single proteins on mica for molecular recognition force microscopy // ChemPhysChem. 2003. Vol. 4, № 12. P. 1367-1371.

197. Adamcik J. et al. Observation of single-stranded DNA on mica and highly oriented pyrolytic graphite by atomic force microscopy // FEBS Lett. 2006. Vol. 580, № 24. P. 5671-5675.

198. Müller D.J., Amrein M., Engel A. Adsorption of biological molecules to a solid support for scanning probe microscopy // J. Struct. Biol. 1997. Vol. 119, № 2. P. 172-188.

199. Hegner M., Wagner P., Semenza G. Immobilizing DNA on gold via thiol modification for atomic force microscopy imaging in buffer solutions // FEBS Lett. 1993. Vol. 336, № 3. P. 452-456.

200. Karrasch S. et al. Covalent binding of biological samples to solid supports for scanning probe microscopy in buffer solution // Biophys. J. 1993. Vol. 65, № 6. P. 2437-2446.

201. Vinckier A. et al. Immobilizing and imaging microtubules by atomic force microscopy // Ultramicroscopy. 1995. Vol. 57, № 4. P. 337-343.

202. Mattson G. et al. A practical approach to crosslinking // Mol. Biol. Rep. 1993. Vol. 17, № 3. P. 167-183.

203. Иванов А. С. и др. Прямой молекулярный фишинг в исследовании молекулярных партнеров белок-белковых и белок-пептидных взаимодействий // Биоорганическая химия. 2016. Т. 42, № 1. С. 18-27.

204. Иванов А.С., Медведев А.Е. Оптический плазмонно-резонансный биосенсор в молекулярном фишинге // Биомедицинская химия. 2015. Т. 61, № 2. С. 231-238.

205. Тарантул В. З. Словарь терминов по биотехнологии //М., Языки славянских культур. 2009. Т. 936.

206. Суханова А.В. и др. Способ получения аналитической тест-системы на основе суспензионных микрочипов для детекции маркеров заболеваний: pat. RU 2638787 USA.

207. Бражник К.И. и др. Новые направления в исследовании и ранней диагностике рака с применением детекционных систем на основе флуоресцентных нанокристаллов // Российский биотерапевтический журнал. 2013. Т. 12, № 3. С11-24.

208. Синяков А.Н. Биочипы: диагноз - дело техники! // Наука из первых рук. 2007. № 5 (17).

209. Князев Д.И. и др. Особенности сплайсинг-ориентированных ДНК-микрочипов и их применение в биомедицинских исследованиях (обзор) // Современные Технологии В Медицине. 2015. Т. 7, № 4. С. 162-173.

210. Дубровин Е.В. и др. Применение атомно-силовой микроскопии для 3D-анализа результатов гибридизации нуклеиновых кислот на микрочипах // Acta Naturae Русскоязычная версия. 2015. Т. 7, № 2 (25). С. 117-124.

211. Talapatra A., Rouse R., Hardiman G. Protein microarrays: challenges and promises // Pharmacogenomics. 2002. Vol. 3, № 4. P. 527-536.

212. Maercker C. Protein arrays in functional genome research // Biosci. Rep. 2005. Vol. 25, № 12. P. 57-70.

213. Васин А.В. и др. Сравнение 2D и 3D подложек для белковых микрочипов // Тезисы международного форума по нанотехнологиям Rus-nanotech. 2009.

214. Миронов В.Л. Основы сканирующей зондовой микроскопии/ М., Техносфера, 2009.

215. Яминский И.В. и др. Сканирующая зондовая микроскопия как главный инструмент бионаноскопии // Медицина и высокие технологии. 2014. № 2. С. 11-26.

216. Ivanov Y.D. et al. Comparative investigation of PdR by usual and ultrafine atomic force microscopy // Anal. Methods. 2010. Vol. 2, № 6. P. 688-693.

217. Johnson W.T. et al. Simultaneous topography and RECognition mapping with PicoTRECTM: A powerful new technology that can be used to map nanometer-scale molecular binding sites on a variety of surfaces. 2005.

218. Kada G., Kienberger F., Hinterdorfer P. Atomic force microscopy in bionanotechnology // Nano Today. 2008. Vol. 3, № 1. P. 12-19.

219. 46-72995SPC_Piezorray.pdf.

220. Schwartz B.L., Light-Wahl K.J., Smith R.D. Observation of noncovalent complexes to the avidin tetramer by electrospray ionization mass spectrometry // J. Am. Soc. Mass Spectrom. 1994. Vol. 5, № 3. P. 201-204.

221. Green N.M., Joynson M.A. A preliminary crystallographic investigation of avidin // Biochem. J. 1970. Vol. 118, № 1. P. 71-72.1.

222. Green N.M. et al. The use of bifunctional biotinyl compounds to determine the arrangement of subunits in avidin // Biochem. J. 1971. Vol. 125, № 3. P. 781-791.

223. Qin H., Liu Z., Sui S.F. Two-dimensional crystallization of avidin on biotinylated lipid monolayers // Biophys. J. 1995. Vol. 68, № 6. P. 2493-2496.

224. Shannon L.M., Kay E., Lew J.Y. Peroxidase isozymes from horseradish roots i. isolation and physical properties // J. Biol. Chem. 1966. Vol. 241, № 9. P. 2166-2172.

225. Veitch N.C. Horseradish peroxidase: a modern view of a classic enzyme // Phytochemistry. 2004. Vol. 65, № 3. P. 249-259.

226. Yamazaki I., Tamura M., Nakajima R. Horseradish peroxidase C // Mol. Cell. Biochem. 1981. Vol. 40, № 3. P. 143-153.

227. Aibara S. et al. Isolation and characterization of five neutral isoenzymes of horseradish peroxidase // J. Biochem. (Tokyo). 1982. Vol. 92, № 2. P. 531-539.

228. Haifeng L. et al. Effects of sodium phosphate buffer on horseradish peroxidase thermal stability // J. Therm. Anal. Calorim. 2008. Vol. 93, № 2. P. 569-574.

229. Davies P.F., Rennke H.G., Cotran R.S. Influence of molecular charge upon the endocytosis and intracellular fate of peroxidase activity in cultured arterial endothelium // J. Cell Sci. 1981. Vol. 49. P. 69-86.

230. Hadziyannis E. et al. Is HCV core antigen a reliable marker of viral load? An evaluation of HCV core antigen automated immunoassay // Ann. Gastroenterol. Q. Publ. Hell. Soc. Gastroenterol. 2013. Vol. 26, № 2. P. 146-149.

231. Buket C A. et al. Comparison of HCV core antigen and anti-HCV with HCV RNA results // Afr. Health Sci. 2014. Vol. 14, № 4. P. 816-82G.

232. Soliman H.A. et al. Significance of the hepatitis C virus core antigen testing as an alternative marker for hepatitis diagnosis in Egyptian patients // Eur. Rev. Med. Pharmacol. Sci. 2G15. Vol. 19, № 12. P. 2240-2245.

233. Dawson G.J. The potential role of HCV core antigen testing in diagnosing HCV infection // Antivir. Ther. 2012. Vol. 17, № 7 Pt B. P. 1431-1435.

234. Kesli R. An Overview of the laboratory assay systems and reactives used in the diagnosis of hepatitis C Virus (HCV) infections // Trends Immunolabelled Relat. Tech. P. 13.

235. Clinical Usefulness of HCV Core antigen assay for the management of patients with chronic hepatitis C // J. Gastrointestin. Liver Dis. 2014. Vol. 23, № 4.

236. Ho D.D. et al. Second conserved domain of gp12G is important for HIV infectivity and antibody neutralization // Science. 1988. Vol. 239, № 4843. P. 1021-1G23.

237. Barbas C.F. et al. Recombinant human Fab fragments neutralize human type 1 immunodeficiency virus in vitro. // Proc. Natl. Acad. Sci. 1992. Vol. 89, № 19. P. 9339-9343.

238. Archakov A.I., Bachmanova G.. Cytochrome P-45G and active oxygen. Trends Biochem. Sci. Taylor and Francis, 199G.

239. Кржечковская В.В., Кубатиев A.A., Шумов Ю.И. Mембранносвязанный цитохром b5 и метаболизм липидов (реакции, не связанные с участием цитохрома Р-450) // Mембраны. 2GG4. Т. 22, № 2. С. 9-21.

24G. Lombard N. et al. Sheep adrenal cytochrome b5: active as a monomer or a tetramer in vivo? // Endocr. Res. 2002. Vol. 28, № 4. P. 485-492.

241. Kulbachinskiy A.V. Methods for selection of aptamers to protein targets // Biochem. Mosc. 2007. Vol. 72, № 13. P. 1505-1518.

242. Лахин А.В., Тарантул В.З., Генинг Л.В. Аптамеры: проблемы, пути их решения и перспективы // Acta Naturae Русскоязычная версия. 2G13. Т. 5, № 4 (19). С. 36-48.

243. Shi S. et al. Inhibition of hepatitis C Virus production by aptamers against the core protein // J. Virol. 2G14. Vol. 88, № 4. P. 1990-1999.

244. Mихайлова Ю.В., Быстрова Т.И Иммунологические и молекулярно-генетические методы в эпидемиологическом надзоре за гепатит С-инфекцией // Журнал Mедиаль. 2014. № 2 (12). С. 1G3-121.

245. Smith D. et al. Sensitivity and specificity of photoaptamer probes // Mol. Cell. Proteomics MCP. 2003. Vol. 2, № 1. P. 11-18.

246. Yamada K. et al. High-density and highly surface selective adsorption of protein-nanoparticle complexes by controlling electrostatic interaction // Jpn. J. Appl. Phys. 2006. Vol. 45, № 5R. P. 4259.

247. Zhang Y., Sheng S., Shao Z. Imaging biological structures with the cryo atomic force microscope // Biophys. J. 1996. Vol. 71, № 4. P. 2168-2176.

248. Schneider S.W. et al. Molecular weights of individual proteins correlate with molecular volumes measured by atomic force microscopy // Pflüg. Arch. 1998. Vol. 435, № 3. P. 362367.

249. Matsumoto M. et al. Homotypic interaction and multimerization of hepatitis C Virus core protein // Virology. 1996. Vol. 218, № 1. P. 43-51.

25G. Haifeng L. et al. Effects of sodium phosphate buffer on horseradish peroxidase thermal stability // J. Therm. Anal. Calorim. 2008. Vol. 93, № 2. P. 569-574.

251. Ivanov Y.D. et al. Atomic force microscopy study of protein-protein interactions in the cytochrome CYP11A1 (P45Gscc)-Containing Steroid Hydroxylase System // Nanoscale Res. Lett. 2011. Vol. 6, № 1. P. 1-13.

252. Kim J., Yoon J. Protein adsorption on polymer particles. //Encyclopedia of surface and colloid science. 2002. Т. 1. С. 4373.

253. Kuznetsov V.Y., Ivanov Y.D., Archakov A.I. Atomic force microscopy revelation of molecular complexes in the multiprotein cytochrome P45G 2B4-containing system //

Proteomics. 2004. Vol. 4, № 8. P. 2390-2396.

254. Ivanov Y.D. et al. Highly sensitive protein detection by combination of atomic force microscopy fishing with charge generation and mass spectrometry analysis // FEBS J. 2014. Vol. 281, № 20. P. 4705-4717.

255. Choi D. et al. Spontaneous electrical charging of droplets by conventional pipetting // Sci. Rep. 2013. Vol. 3, № 1.

256. Burgo T.A.L., Galembeck F., Pollack G.H. Where is water in the triboelectric series? // J. Electrost. 2016. Vol. 80. P. 30-33.

257. Wiig H. et al. Effect of charge on interstitial distribution of albumin in rat dermis in vitro // J. Physiol. 2003. Vol. 550, № 2. P. 505-514.

258. Thomson N.H. Imaging the substructure of antibodies with tapping-mode AFM in air: the importance of a water layer on mica // J. Microsc. 2005. Vol. 217, № 3. P. 193-199.

259. Kanto T. et al. Buoyant density of hepatitis C virus recovered from infected hosts: Two different features in sucrose equilibrium density-gradient centrifugation related to degree of liver inflammation // Hepatology. 1994. Vol. 19, № 2. P. 296-302.

260. Французов П.А. Атомно-силовые чипы для выявления маркеров заболеваний вирусными гепатитами B и C: дис. ... канд.биол.наук: 03.01.04 / Французов Павел Александрович. - М., 2010 - 180с.

261. Chen F. et al. CS-SELEX generates high-affinity ssDNA aptamers as molecular probes for hepatitis C virus envelope glycoprotein E2., CS-SELEX Generates High-Affinity ssDNA Aptamers as molecular probes for hepatitis C virus envelope glycoprotein E2 // PloS One PLoS ONE. 2009. Vol. 4, 4, № 12, 12. P. e8142-e8142.

262. Yu X. et al. Inhibition of hepatitis C virus infection by NS5A-specific aptamer // Antiviral Res. 2014. Vol. 106. P. 116-124.

263. Bellecave P. et al. Inhibition of Hepatitis C Virus (HCV) RNA Polymerase by DNA Aptamers: Mechanism of Inhibition of In Vitro RNA Synthesis and Effect on HCV-Infected Cells // Antimicrob. Agents Chemother. 2008. Vol. 52, № 6. P. 2097-2110.

264. Nishikawa S., Nishikawa F., Fukuda K. In vitro selection of RNA aptamers against HCV-NS3 helicase and their structural similarity with 3'(+)UTR of HCV // Nucleic Acids Symp. Ser. 2003. Vol. 3, № 1. P. 241-242.

265. Green N.M. Avidin // Adv. Protein Chem. 1975. Vol. 29. P. 85-133.

266. Gold L. et al. Advances in human proteomics at high scale with the SOMAscan proteomics platform // New Biotechnol. 2012. Vol. 29, № 5. P. 543-549.

267. Rohloff J.C. et al. Nucleic acid ligands with protein-like side chains: modified aptamers and their use as diagnostic and therapeutic agents // Mol. Ther. - Nucleic Acids. 2014. Vol. 3. P. e201.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает глубокую признательность своим наставникам - академику РАН Александру Ивановичу Арчакову и профессору Юрию Дмитриевичу Иванову.

Автор выражает искреннюю благодарность выдающемуся специалисту в области нанотехнологий, доктору технических наук, профессору, генеральному директору НТ-МДТ - Виктору Александровичу Быкову за поддержку и консультации при решении инструментально-технических задач, возникающих при проведении АСМ-измерений. Также огромная благодарность сервис-инженеру компании НТ-МДТ Сергею Ивановичу Нестеровову за многолетнюю помощь в освоении зондовых нанолабораторий.

Экспериментальные результаты, которые легли в основу данной работы, были получены в период с 2004 по 2018 гг в лаборатории нанобиотехнологий ИБМХ. Автор благодарит научный коллектив и вспомогательный коллектив лаборатории за помощь и содействие в проведении экспериментов и анализе полученных данных на протяжении всего периода работы.

За конструктивную критику и внимательный анализ работы автор благодарит д. б. н. Шумянцеву Викторию Васильевну.

Огромное спасибо моим учителям - сотрудникам лаборатории термохимии химического факультета МГУ им.М.В.Ломоносова - вед. н.с., к.х.н. Монаенковой Алле Сергеевне, с.н.с., к.х.н., доценту Тифловой Людмиле Александровне, с.н.с., к.х.н. Пименовой Светлане Михайловне.

Отдельное спасибо коллективам ИБМХ за плодотворное обсуждение работы в рамках научных семинаров.