Выявление и характеристика легионелл в потенциально опасных водных системах и модельных биопленках тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.07, кандидат медицинских наук Дронина, Юлия Евгеньевна

• Дронина, Юлия Евгеньевна
• кандидат медицинских наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат медицинских наук Дронина, Юлия Евгеньевна

Содержание.

Глава 1. Введение.

Глава 2. Обзор литературы.

2.1. Современные представления о легионеллезной инфекции и её возбудителе.

2.1.1. Современные представления о легионеллезной инфекции.

2.1.2 Общая характеристика легионелл.

2.2. Особенности экологии легионелл и их значение в распространении легионеллеза.

2.2.1. Взаимодействие легионелл с простейшими и другими микроорганизмами.

2.2.2. Биопленки легионелл.

2.3. Методы выявления и идентификации легионелл в объектах окружающей среды.

2.3.1. Бактериологический метод выделения легионелл.

2.3.2. Другие методы выявления легионелл в объектах окружающей среды.

2.3.3. Методы идентификации и типирования легионелл.

Глава 3. Материалы и методы.

3.1. Использованные в работе штаммы легионелл.

3.2. Методы культивирования легионелл.

3.3. Получение биоплёнок.

3.3.1. Получение биоплёнок легионелл.

3.3.2. Получение биоплёнок других микроорганизмов.

3.4. Бактериологическое выделение легионелл.

3.5. Определение легионелл методом ПЦР-РВ.

3.5.1. Определение легионелл с помощью тест-системы Кванти Legionella spp. и Кванти Legionella pneumophila.

3.5.2. Определение легионелл с помощью тест-системы АМПЛИ-ЛЕГ-РВ

3.6. Определение чувствительности легионелл к действию дезинфицирующих препаратов.

3.7. Статистические методы обработки результатов.

Глава 4. Результаты.

4.1. Выделение легионелл из объектов окружающей среды.

4.2. Выявление легионелл в объектах окружающей среды с помощью ПЦР в реальном времени.

4.2.1. Отработка методики ПЦР в реальном времени в модельных системах.

4.2.2. Применение ПЦР в реальном времени для выявления легионелл в воде и биоплёнках потенциально опасных водных систем.

4.3. Формирование биопленок легионелл.

4.3.1. Формирование моновидовых биоплёнок легионелл.

4.3.2. Биоплёнки легионелл в ассоциации с другими микроорганизмами.

4.4. Изучение эффективности действия дезинфицирующих препаратов на легионеллы.

4.4.1. Изучение действия дезинфицирующих препаратов на модели биопленок легионелл.

4.4.2. Изучение действия препарата «СаносилСупер 25» на легионеллы в градирне промышленного предприятия.

Глава 5. ОБСУЖДЕНИЕ.

Глава 6. ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Выявление и характеристика легионелл в потенциально опасных водных системах и модельных биопленках»

Легионеллезная инфекция известна уже более 30 лет и достаточно хорошо разработаны методы её диагностики и лечения, однако возбудитель по-прежнему представляет существенную угрозу общественному здоровью, вызывая крупные эпидемические вспышки с летальными исходами в различных странах мира. Среди наиболее заметных эпидемических вспышек легионеллеза, например в Голландии в 1999г (188 случаев, 16 летальных), Австралии 1999 г. (98/9), Испании 2002 г. (470/9), Франции 2004 г. (86/16), Норвегии 2005 г. (55/10), свое место заняла и эпидемическая вспышка легионеллеза в Российской Федерации - г. Верхняя Пышма в 2007 г., во время которой заболели 127 человек, при этом зарегистрировано 5 летальных исходов (2).Легионеллы широко распространены в природных водоёмах, где они паразитируют в организме водных амёб и не представляют существенной опасности для человека. В инженерно-технических сооружениях связанных с циркуляцией воды (поверхности труб и оборудования систем водоснабжения, градирен, систем кондиционирования и увлажнения воздуха), концентрация легионелл резко возрастает, за счёт образования биоплёнок, что является ключевым фактором накопления потенциально опасных концентраций возбудителя (9). В сочетании с возможностью аэрогенного распространения или аспирации возбудителя, возникает угроза возникновения эпидемии легионеллеза (обычно возникают в местах массового скопления людей).Сочетание высокой концентрации легионелл в водной среде с источниками мелкодисперсного аэрозоля, позволяет возбудителю инфекции проникать в нижнюю часть респираторного тракта и легкие человека, где происходит контакт с альвеолярными макрофагами, в которых легионеллы активно размножаются.Сложность количественной оценки легионелл в сочетании с высокой устойчивостью к дезпрепаратам в перечисленных водных объектах создают существенные трудности в оценке потенциальной опасности данных систем и проведении профилактических мероприятий. В этом отношении, экспериментальное изучение процесса образования биоплёнок и анализ эффективности на данной модели различных методов ускоренного выявления возбудителя и оценка действия дезинфекционных средств является одним из наиболее перспективных подходов.Цель и задачи исследования Цель работы: разработать методы выявления и количественного определения легионелл в потенциально опасных водных системах и модельных биопленках.Задачи исследования: 1. Получить коллекцию отечественных штаммов легионелл, выделенных из потенциально опасных водных объектов окружающей среды.2. Разработать и внедрить в практику алгоритм количественного выявления легионелл в модельных и природных образцах воды и биопленок с помощью сочетания бактериологического метода и ПЦР в реальном времени.3. Изучить способность к формированию биопленок у различных видов и штаммов легионелл при различных условиях культивирования, выявить различия в способности к образованию биопленок у разных штаммов легионелл.4. Изучить способность легионелл к персистенции в ассоциативных биопленках, образованных другими микроорганизмами.5. Разработать методику оценки действия дезинфекционных средств.Изучить эффективность действия различных дезинфекционных препаратов против легионелл на модельных биопленках и в водных системах.Научная новизна работы: - Создана коллекция отечественных штаммов легионелл, выделенных из потенциально опасных водных объектов окружающей среды (градирни промышленных предприятий, система автономного и городского водоснабжения, бассейн). - Впервые разработан алгоритм выявления легионелл в потенциально опасных водных системах, основанный на сочетании ПЦР в реальном времени и бактериологических методов. - Впервые выявлен различный уровень способности штаммов легионелл к формированию моновидовых биопленок.Разработаны методические подходы к оценке действия дезинфицирующих препаратов на легионеллы на модели биопленок и в водных системах.Практическая значимость работы: • Разработанный алгоритм определения легионелл в водных системах и биопленках на основе скрининга с помощью ПЦР-РВ, с последующим бактериологическим подтверждением, включен в качестве базового метода в методические указания Роспотребнадзора МУК 4.2.2217-07. «Выявление бактерий Legionella pneumophila в объектах окружающей среды». • Разработана методика определения эффективности действия дезинфекционных препаратов на модельных биопленках легионелл.Материалы диссертации доложены на IX съезде Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, апрель 2007); 22 и 23 конференции Европейской рабочей группы по легионеллезу (Лиссабон, 2006; Стокгольм, 2007); 18 конгрессе Европейского респираторного общества (Берлин, 2008).

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Дронина, Юлия Евгеньевна

Глава 6. ВЫВОДЫ.

1. На основе отработанной методики выделения легионелл из окружающей среды получена коллекция 66 штаммов возбудителя из потенциально опасных водных систем. Впервые в Российской Федерации выделены культуры видов Legionella gratiana и Legionella gormanii.

2. Впервые разработан и внедрен на базе отечественной тест-системы АМПЛИ-ЛЕГ-РВ алгоритм количественного выявления легионелл в природных образцах воды и биопленках с помощью бактериологического метода и ПЦР в реальном времени.

3. Разработана методика формирования моновидовых биопленок легионелл в питательной среде и воде. На основе разработанной методики впервые показан различный уровень способности к формированию моновидовых биопленок у штаммов Legionella pneumophila и Legionella spp.

4. Показана способность штаммов легионелл с высоким уровнем формирования моновидовых биопленок персистировать в биопленках, образованных другими микроорганизмами.

5. Разработана методика оценки действия дезинфекционных средств против легионелл на модели биопленок. Показана необходимость применения более высоких концентраций дезинфектантов при действии на модельные биопленки, по сравнению с бактерицидными концентрациями, рекомендованными для действия на суспензию легионелл. Показано, что элиминация природных биопленок, содержащих легионеллы, является необходимым условием успешной дезинфекции потенциально опасных водных объектов.

Список литературы диссертационного исследования кандидат медицинских наук Дронина, Юлия Евгеньевна, 2008 год

1. МУК 4.2.22-17-07 «Методические указания по выявлению бактерий Legionella pneumophila в объектах окружающей среды», 2007г.

2. Онищенко Г.Г., Покровский В.И., Тартаковский И.С. и др. Современные взгляды на эпидемиологию легионеллеза: алгоритм действия при эпидемических вспышках и профилактическом мониторинге. Журн. Микробиол., 2008 , 2: 5 9.

3. Покровский В.И., Прозоровский С.В. ,Малеев В.В.,Тартаковский И.С. Этиологическая диагностики и этиотропная терапия острых пневмоний. «Медицина» Москва 1995г.

4. Прозоровский С.В., Васильева В.И., Тартаковский И.С. Выявление болезни легионеров на территории СССР. Журн. микробиол. 1980,7:105107.

5. Прозоровский С.В., Покровский В.И., Тартаковский И.С. Выявление случаев легионеллеза среди больных острыми пневмониями. Сов.мед.,1982,3:96-98.

6. Прозоровский С.В., Покровский В.И., Тартаковский И.С. Болезнь легионеров. Москва «Медицина» 1984, с. 67-80.

7. Тартаковский И.С., Прозоровский С.В., Попов B.JI. Выделение первых штаммов Legionella pneumophila в СССР. Журн. микробиол.1983, 11:41-45.

8. Тартаковский И.С., Болезнь легионеров: итоги 25-летнего изучения инфекции, проблемы и перспективы исследования. Вестник РАМН.,2001,11:11-14.

9. Темежникова Н.Д., Тартаковский И.С. Легионеллёзная инфекция. Москва «Медицина» 2007.

10. Abraham W.R. Controlling biofilms of gram-positive pathogenic bacteria. CurrMed Chem. 2006; 13(13):1509-24.

11. Atlas R.M. Legionella: from environmental habitats to disease pathology, detection and control. Environ Microbiol. 1999 Aug; l(4):283-93.

12. Barbeau J., Gauthier C., Payment P. Biofilms, infectious agents, and dental unit waterlines: a review. Can J Microbiol. 1998 Nov; 44(11): 1019-28.

13. Benson R.F., Fields B.S. Classification of the genus Legionella. Semin Respir Infect. 1998 Jun;13(2):90-9.

14. Berry D., Xi C., Raskin L. Microbial ecology of drinking water distribution systems. Curr Opin Biotechnol. 2006 Jun; 17(3):297-302.

15. Blanc D.S., Carrara P., Zanetti G., Francioli P. Water disinfection with ozone, copper and silver ions, and temperature increase to control Legionella: seven years of experience in a university teaching hospital. J Hosp Infect. 2005 May; 60(l):69-72.

16. Borella P., Guerrieri E., Marchesi I., Bondi M., Messi P. Water ecology of Legionella and protozoan: environmental and public health perspectives. Biotechnol Annu Rev. 2005; 11:355-80.

17. Brenner D.J., Steigerwalt A.G., McDade J.E. Classification ofthe Legionnaires' disease bacterium: Legionella pneumophila, genus novum, species nova, of the family Legionellaceae, familia nova. Ann Intern Med. 1979 Apr; 90(4):656-8.

18. Colbourne J.S., Dennis P.J. Distribution and persistence of Legionella in water systems. Microbiological Sciences. 1985, 2:40-43.

19. Cooper A, Barnes HR, Myers ER. Assessing risk of Legionella. ASHRAE Journal.2004, 46(4):22-26.

20. Costa J., Tiago I., da Costa M.S., Verissimo A. Presence and persistence of Legionella spp. in groundwater. Appl Environ Microbiol. 2005 Feb; 71(2):663-71.

21. Cuhna B.A. Clinical features of Legionnaires Disease. Seminars in Respiratory Infection. 1998, 13(2): 116-127.

22. Den Boer J.W., Yzerman E.P. Diagnosis of Legionella infection in Legionnaires' disease. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2004 Dec; 23(12):871-8.

23. Drozanski W. Fatal bacterial infection in soil amoebae. Acta Microbiol Pol. 1956; 5(3-4):315-7.

24. Edelstein P.H. Improved semiselective medium for isolation of Legionella pneumophila from contaminated clinical and environmental specimens. J Clin Microbiol. 1981 Sep; 14(3):298-303.

25. Edelstein P.H., Snitzer J.B., Bridge J.A. Enhancement of recovery of Legionella pneumophila from contaminated respiratory tract specimens by heat. J Clin Microbiol. 1982 Dec; 16(6): 1061-5.

26. Edelstein P.H., Meyer R.D. Legionella pneumonias. 1994. In: Pennington JE .Respiratory infections, diagnosis and management, New York, Raven Press Ltd.

27. Enright M.C., Spratt B.G. Multilocus sequence typing. Trends Microbiol. 1999 Dec; 7(12):482-7.

28. European Guidelines for control and prevention of travel associated legionellosis.2002.

29. Exner M., Kramer A., Lajoie L., Gebel J., Engelhart S., Hartemann P. Prevention and control of health care-associated waterborne infections in health care facilities. Am J Infect Control. 2005 Jun; 33(5 Suppl l):S26-40.

30. Feeley J.C., Gibson R.J., Gorman G.W., Langford N.C., Rasheed J.K., Mackel D.C., Baine W.B. Charcoal-yeast extract agar: primary isolation medium for Legionella pneumophila. J Clin Microbiol. 1979 Oct; 10(4):437-41.

31. Fields B.S. The molecular ecology of legionellae. Trends in Microbiology. 1996, 4:286-290.

32. Fields B.S., Benson R.F., Besser R.E. Legionella and Legionnaires' disease: 25 years of investigation. Clin Microbiol Rev. 2002 Jul; 15(3):506-26.

33. Feeley J.C., Gorman G.W., Weaver R.E. Primary isolation media for Legionnaires diasease bacterium. J Clin Microbiol. 1978 Oct; vol.8:320-325.

34. Fliermans C.B. Philosophical Ecology: Legionella in Historical Perspective. State of the Art Lecture. In Proceedings of the 2nd international symposium Legionella, Atlanta, USA, 1983; 285-289.

35. Fox K.F., Brown A. Application of numerical systematics to the phenotypic differentiation of legionellae. J Clin Microbiol. 1989 Sep; 27(9): 1952-5.

36. Fry N.K., Warwick S., Saunders N.A., Embley T.M. The use of 16S ribosomal RNA analyses to investigate the phylogeny of the family Legionellaceae. J Gen Microbiol. 1991 May; 137(5):1215-22.

37. Fry N.K., Bangsborg J.M., Bernander S., Etienne J., Forsblom В., Gaia V., Hasenberger P., Lindsay D., Papoutsi A., Pelaz C., Struelens M., Uldum

38. Gaia V., Fry N.K., Harrison T.G., Peduzzi R. Sequence-based typing of Legionella pneumophila serogroup 1 offers the potential for true portability in legionellosis outbreak investigation. J Clin Microbiol. 2003 Jul; 41(7):2932-9.

39. Garrity G.M., Brown A., Vickers R.M. Tatlockia and Fluoribacter: two new general organisms resembling Legionella pneumophila. Int J Syst Bacteriol. 1980; 30:609-14.

40. Geary DF.New guidelines on Legionella. ASHRAE Journal.2000, 42(9):44-49.

41. George J.R., Pine L., Reeves M.W., Harrell W.K. Amino acid requirements of Legionella pneumophila. J Clin Microbiol. 1980 Mar; 11(3):286-91.

42. Gilbart J. Detecction of Legionella spp. in Water Samples by Electronj

43. Captor Gas Chromatography. In Proceedings of the 2 international symposium Legionella, Atlanta, USA, 1983; 296-298.

44. Gimenez D.F. Staining Rickettsiae in Yolk-Sac Cultures. Stain Technol. 1964 May; 39:135-40.

45. Gorelik O., Lazarovich Z., Boldur I., Almoznino-Sarafian D., Alon I., Modai D., Cohen N. Legionella in two splenectomized patients. Coincidence or causal relationship? Infection. 2004 Jun; 32(3): 179-81.

46. Harrison T.G., Uldum S., Alexieu-Daniel S.et.al., A multicenter evaluation of the Biotest legionella urinary antigen EIA.Clinical microb. and Infection, 1998, 4(7):359-365.

47. Health and Safety Commission and Executive. Legionnaire's disease. The control of legionella bacteria in water systems. Approved code of practice and guidance. 2000.

48. Hebert G.A. Hippurate hydrolysis by Legionella pneumophila. J Clin Microbiol. 1981 Jan; 13(l):240-2.

49. Huerta M., Castel H., Grotto I., Shpilberg O., Alkan M.5 Harman-Boehm I. Clinical and epidemiologic investigation of two Legionella-Rickettsia co-infections. Isr Med Assoc J. 2003 Aug; 5(8):560-3.

50. ISO standard: Water quality-detection and enumeration of Legionella. 1998.

51. Janssen P., Coopman R., Huys G., Swings J., Bleeker M., Vos P., Zabeau M., Kersters K. Evaluation of the DNA fingerprinting method AFLP as an new tool in bacterial taxonomy. Microbiology. 1996 Jul; 142 ( Pt 7): 1881-93.

52. Jimenez-Lucho V., Shulman M., Johnson J. Bordetella bronchiseptica in an AIDS patient cross-reacts with Legionella antisera. J Clin Microbiol. 1994 Dec; 32(12):3095-6.

53. Joly J.R., McKinney R.M., Tobin J.O., Bibb W.F., Watkins I.D., Ramsay D. Development of a standardized subgrouping scheme for Legionella pneumophila serogroup 1 using monoclonal antibodies. J Clin Microbiol. 1986 Apr; 23(4):768-71.

54. Joseph C. European surveillance of travel-associated Legionnaires disease.Eurosurveillance, 2004, 9(2), 15-18.

55. Katz S.M., Hammel J.M. The effect of drying, heat, and pH on the survival of Legionella pneumophila. Ann Clin Lab Sci. 1987 May-Jun; 17(3): 150-6.

56. Koide M., Saito A. Diagnosis of Legionella pneumophila infection by polymerase chain reaction. Clin.Infect.Dis., 1995, 21:199-201.

57. Legionella and the prevention of Legionellosis.WH0.2006.

58. Liu Z, Lin Y.E., Stout J.E., Hwang C.C., Vidic R.D., Yu V.L. Effect of flow regimes on the presence of Legionella within the biofilm of a model plumbing system. J. Appl Microbiol. 2006 Aug; 101(2):437-42.

59. Lo Presti F., Riffard S., Vandenesch F., Reyrolle M., Ronco E.,1.hai P., Etienne J. The first clinical isolate of Legionella parisiensis, from a liver transplant patient with pneumonia. J. Clin Microbiol. 1997 Jul; 35(7):1706-9.

60. Loret J.F., Robert S., Thomas V., Cooper A.J., McCoy W.F., Levi Y. Comparison of disinfectants for biofilm, protozoa and Legionella control. J. Water Health. 2005 Dec; 3(4):423-33.

61. Luck P.C., Helbig J.H., Drasar V., Bornstein N., Fallon R.J., Castellani-Pastoris M. Genomic heterogenicity amongst phenotypically similar Legionella micdadei strains. FEMS Microbiol. Lett. 1995 Feb 1; 126(1):49-54.61.

62. Management of spa pools: controlling the risk of infection.2006.London.Health Protection Agency.

63. McDade J.E., Shepard C.C., Fraser D.W., Tsai T.R., Redus M.A., Dowdle W.R. Legionnaires' disease: isolation of a bacterium and demonstration of its role in other respiratory disease. N Engl J Med. 1977 Dec 1; 297(22): 1197-203.

64. Medzhitov R., Janeway C.A., Jr. Decoding the patterns of self and nonself by the innate immune system. Science. 2002 Apr 12; 296(5566):298-300.

65. Mermel L.A., Josephson S.L., Giorgio C.H., Dempsey J., Parenteau S. Association of Legionnaires' disease with construction: contamination of potable water? Infect Control Hosp Epidemiol. 1995 Feb; 16(2):76-81.

66. Molofsky A.B., Swanson M.S. Differentiate to thrive: lessons from the Legionella pneumophila life cycle. Mol. Microbiol. 2004 Jul; 53(l):29-40.

67. Muder R.R., Yu V.L. Infection due to Legionella species other than L. pneumophila. Clin Infect Dis. 2002 Oct 15; 35(8):990-8.

68. Murdoch D.R. Diagnosis of Legionella infection. Clin Infect Dis. 2003 Jan 1; 36(l):64-9.

69. Murga R., Forster T.S., Brown E., Pruckler J.M., Fields B.S., Donlan R.M. Role of biofilms in the survival of Legionella pneumophila in a model potable-water system. Microbiology. 2001 Nov; 147(Pt 11):3121-6.

70. Pasculle A.W., Feeley J.C., Gibscon R.J. Pittsburgh pneumonia agent direct isolasion from human lung tissue. J. Infect. Dis. 1980, 141:727-732.

71. Piao Z., Sze C.C., Barysheva O., Iida K., Yoshida S. Temperature-regulated formation of mycelial mat-like biofilms by Legionella pneumophila. Appl Environ Microbiol. 2006 Feb; 72(2): 1613-22.

72. Pine L., George J.R., Reeves M.W., Harrell W.K. Development of a chemically defined liquid medium for growth of Legionella pneumophila. J. Clin Microbiol. 1979 May; 9(5):615-26.

73. Pourcel C., Vidgop Y., Ramisse F., Vergnaud G., Tram C. Characterization of a tandem repeat polymorphism in Legionella pneumophila and its use for genotyping. J Clin Microbiol. 2003 May; 41(5): 1819-26.

74. Rogers J., Keevil C.W. Immunogold and fluorescein immunolabelling of Legionella pneumophila within an aquatic biofilm visualized by using episcopic differential interference contrast microscopy. Appl Environ Microbiol. 1992 Jul; 58(7):2326-30.

75. Rogers J., Dowsett A.B., Dennis P.J., Lee J.V., Keevil C.W. Influence of plumbing material on biofilm formation and growth of Legionella pneumophila in a potable water systems. Appl Environ Microbiol. 1994; 6:1842-51.

76. Rogers J., Dowsett A.B., Keevil C.W. A paint incorporating silver to control mixed biofilms containing Legionella pneumophila. J. Ind Microbiol. 1995 Oct; 15(4):377-83.

77. Rowbotham T.J. Pontiac fever explained? Lancet. 1980 Nov 1; 2(8201):969.

78. Scaturro M., Losardo M., De Ponte G., Ricci M.L. Comparison of three molecular methods used for subtyping of Legionella pneumophila strains isolated during an epidemic of Legionellosis in Rome. J Clin Microbiol. 2005 Oct; 43(10):5348-50.

79. Schwartz Т., Hoffmann S., Obst U. Formation of natural biofilms during chlorine dioxide and u.v. disinfection in a public drinking water distribution system. J Appl Microbiol. 2003;95(3):591-601.

80. Steele T.W. Legionnaires' disease in South Australia, 1979-1988. Med J Aust. 1989 Sep 18; 151(6):322, 5-6, 8.

81. Steinmetz I., Rheinheimer C., Hubner I., Bitter-Suermann D. Genus-specific epitope on the 60-kilodalton Legionella heat shock protein recognized by a monoclonal antibody. J Clin Microbiol. 1991 Feb; 29(2):346-54.

82. Stout JE, Yu V.L. Legionellosis. New England Journal of Medicine. 1997.337:682-687.

83. Storey M.V., Langmark J., Ashbolt N.J., Stenstrom T.A. The fate of legionellae within distribution pipe biofilms: measurement of their persistence, inactivation and detachment. Water Sci Technol. 2004; 49(11-12):269-75.

84. Surman S.B., Morton L., Keevil C. Growth of Legionella pneumophila in aquatic biofilms is not dependent on intracellular multiplication. In: Keevil CW et.al. Biofilm in the aquatic environment. Cambridge, 1999.160-170.

85. Thomas V., Bouchez Т., Nicolas V., Robert S., Loret J.F., Levi Y. Amoebae in domestic water systems: resistance to disinfection treatments and implication in Legionella persistence. J Appl Microbiol. 2004; 97(5):950-63.

86. Walker J.T., Bradshaw D.J., Bennett A.M., Fulford M.R., Martin M.V., Marsh P.D. Microbial biofilm formation and contamination of dental-unit water systems in general dental practice. Appl Environ Microbiol. 2000 Aug; 66(8):3363-7.

87. Wellinghausen N., Frost C., Marre R. Detection of Legionella in hospital water samples by quantative real-time lightcycler PCR. Appl. And Environm. Microbiol., 2001, 67(9):3985-3993.

88. WHO Recommended Surveillance Standarts.1999.

89. William Т. Martin, James M. Barbaree, and James C. Feeley.

90. Detecction and Quantitation of Legionella pneumophila by Immunej

91. Autoradiography. In Proceedings of the 2 international symposium Legionella; Atlanta, USA, 1983; 299-300.

92. Wilson D.A., Yen-Liberman В., Reischl U. et.al. Detection of Legionella pneumophila by real-time PCR for the mip gene. J.clin.microb., 2003., 41(7):3327-3330.

93. Uzel A., Ucar F., Hames-Kocabas E.E. Prevalence of Legionella pneumophila serogroup 1 in water distribution systems in Izmir province of Turkey. Apmis. 2005 Oct; 113(10):664-9.