Взаимодействие аннексинов с белковыми компонентами мембран саркоплазматического ретикулума тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Красавченко, Кирилл Сергеевич

• Красавченко, Кирилл Сергеевич
• кандидат биологических наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Красавченко, Кирилл Сергеевич

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. OIHOl' ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Липск'сппм.

2.1.1. Общее строение аннексинов.

2.1.2. Распространение в природе.

2.1.3. Номенклатура.

2.1.4. Свойства аннексинов.

2.1.4.1. Взаимодействие аннексинов с ионами кальция.

2.1.4.2. Взаимодействие аннексинов с ионами других металлов.

2.1.4.3. Взаимодействие аннексинов с липидными бмслоямн.

2.1.4.4. Взаимодействие аннексинов с белками.

2.1.5. Возможные биологические функции аннексинов.

2.1.5.1. Аннексины в мембранном траффике и организации структурных доменов мембран.

2.1.5.2. Аннексины и ионные каналы.

2.1.5.3. Функции аннексинов вне клетки.

2.1.6. Аннексии: А5.

2.1.7. Аннексии А6.

2.2. Саркоилазматнческнн peiнкулум.

2.2.1. Са2*-ЛТРаза.

2.2.2. Рианодиновый рецептор.

2.2.3. Другие белки саркоплазматичсского ретикулума.

2.2.4. Аннексины в саркоплазматическом ретикулуме.

3. МАТЕРИАЛЫ II МЕТОДЫ.

3.1. Материалы.

3.1.1. Объект исследования.

3.1.2. Антисыворотки.

3.1.3. Белковые маркеры.

3.2. Общие параметры.

3.2.1. Температурные условия.

3.2.2. Центрифугирование.

3.3. Вспомогательные методы.

3.3.1. Приготовление липосом.

3.3.2. Концентрирование белков в полиэтиленгликоле.

3.3.3. Мечение аннексинов флуоресцеин-изотиоцианатом.

3.4. Нрепарлтшшые методы.

3.4.1. Выделение фрагментов сарконлазматического ретикулума из скелетных мышц кролика.

3.4.2. Выделение периферических белков сарконлазматического ретикулума.

3.4.3. Выделение суммарных аннексинов из скелетных мышц кролика.

3.4.4. Выделение суммарных аннексинов из печени кролика.

3.5. Хроматографнчсасне методы.

3.5.1. Гель-фильтрация аннексинов.

3.5.2. Аффинная хроматография.

3.6. Элсктрофорегическис методы.

3.6.1. Приборы для электрофореза.

3.6.2. Приготовление и заливка гелей.

3.6.3. Приготовление проб.

3.6.4. Режим проведения электрофореза.

3.6.5. Фиксация и окрашивание гелей после электрофореза.

3.6.5.1. Окраска ПЛЛГ при помощи Кумасси R-250.

3.6.5.2. Окраска белков при помощи нитрата серебра.

3.6.6. Высушивание гелей.

3.7. Пммунохнмнчсскпс методы.

3.7.1. Состав фосфатно-солевого буфера.

3.7.2. Определение рабочего титра антител и их специфичности.

3.7.2.1. Раститровка антител.

3.7.2.2. Оценка специфичности антител.

3.7.3. Метод иммуноблотинга.

3.7.3.1. Фракционирование образцов.

3.7.3.2. Перенос фракций из геля на фильтр.

3.7.3.3. Иммунное выявление антигенов на фильтре.

3.7.4. Лиганд-блотинг.

3.8. Аналитические методы.

3.8.1. Оценка гидрофильно-гидрофобных свойств белков.

3.8.2. Определение опосредуемой аннексинами агрегации липосом.

3.8.3. Определение концентрации неорганического фосфата.

3.8.4. Определение активности Са2'-ЛТФазы.

3.8.5. Определение концентрации белка.

3.8.5.1. Определение концентрации белка биуретовым методом.

3.8.5.2. Определение концентрации белка по модифицированному методу Брэдфорд.

3.8.5.3. Определение концентрации белка в пробе с использованием амилового. черного.

4. н; ши.тлты II оксуждмии-:.

4.1. Oiimimiiuiiiiii мсгоднкн выделении аннсксниов.

4.1.1. Оптимизация методики получения бесклеточных экстрактов из скелетных мышц.

4.1.1.1. Ионообменная хроматография аппекеппов.

4.1.2. ВЕлделение аннексинов из печени.

4.1.2.1. Получение и характеристика препарата суммарных анпекеннов.

4.1.2.2. Получение очищенных препаратов аннексинов Л5 и А6.

4.2. Влшпшс попов двухвалентных металлов па опосредуемую аннсксппамн агрегацию лппосом.

4.3. Гетерогенность анпекеннов в бескл сточных экстрактах, нндунпрусман iioiiumii Са2*.

4.4. Обнаружение разных форм индивидуальных анпекеннов в препаратах клеточных мембран.

4.5. Влшпшс аннскспшш А5 п Л6 на активность Са2+-АТФазы саркоплазматпческого ретпкулума.

4.5.1. Выделение очищенных препаратов мембран саркоплазматпческого ретикулума.

4.5.2. Оценка влияния аннексина А6 на активность Са2+-АТФазы саркоплазматпческого ретикулума.

4.6. Образование прочно-евпзаппых форм апиекеппов па мембранах, не содержащих белков.

4.7. Поиск белков саркоплазматпческого ретпкулума, снизывающихся с аннекеппом А6.

4.7.1. Поиск белков-мишеней среди интегральных белков мембран саркоплазматпческого ретикулума.

4.7.2. Поиск белков-мишенеп среди периферических белков мембран саркоплазматпческого ретикулума.

5. ВЫВОДЫ.

6. Цитированная литература.

СПИСОК" ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИИ лл - акриламид

ЛТФ - аденозии трифосфат

БСЛ - бычий сывороточный альбумин дтт - дитпотрейтол

МГ.Л- N, N'-метилен-бисакриламид иллг- полиакриламидный гель пэг - полиэтилснгликоль

CP - саркоплазматичсский ретикулум

СФ - спектрофотометр

ФМСФ- фенилметилсульфонилфторид

Трис - трис(п1дроксимет11л)ам1июметан

ТХУ - трихлоруксусная кислота эгтл- этиленгликоль-бис(-ампноэтиловый офир)-Ы, N, N', N'-тетраацегат эдтл- этилендиамин- N, N, N', N'-тетраацетат

APS - персульфат аммония

Dx - поглощение при длине волны А. им

PBS- фосфатно-солевой буфер

SDS - додецилсульфат натрия

TEN1ED - N, N, N', N'-тетраметилэтилендиамин

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Взаимодействие аннексинов с белковыми компонентами мембран саркоплазматического ретикулума»

Кальций играет важнейшую роль во многих процессах жизнедеятельности. Одной из основных функций кальция в живых организмах является участие в передаче сигнала и регуляции различных клеточных функций. В живых клетках существует сложная и развитая система поддержания концентрации кальция на необходимом уровне и восприятия колебаний его концентрации. Действие Са21" реализуется через работу множества Са2+-связывающих белков. Одними из эгих белков являются аннексины.

Аннексины — мультигениое семейство Са2+-зависимых фосфолипид-связывающих белков. Отличительной особенностью белков этого семейства является способность Са2+ зависимым образом связываться с природными и модельными фосфолипидпыми мембранами. Белки этого семейства находят у всех эукариот, они присутствуют во всех тканях организма, однако биологические функции этих белков до сих пор однозначно не установлены. Обнаружено участие аннексинов в таких процессах, как мембранный транспорт, слияние внутриклеточных секреторных пузырьков с плазматической мембраной в ходе экзоцитоза, организация структу рных доменов мембран, транспорт ионов, адгезия клеток, проведение сигнала, а также наличие у аннексинов противовоспалительной и антикоагулянтной активности (Moore, Dedman, 1982, Geisowet al., 1984, 1987, Burgoyne, Geisow, 1989, Romisch, Paques, 1991, Creutz, 1992, Gerke, Moss, 1997, 2002, Gerke et al., 2005). Функция аннексинов в мышечной клетке до сих пор окончательно не установлена.

В скелетных мышцах кальцием регулируется их основная функция - сокращение. Саркоплазматический ретикулум служит внутриклеточным депо кальция. Концентрация кальция в цитоплазме клетки регулируется кальциевыми каналами и активными переносчиками, в том числе Са^-АТФазои саркоплазматического ретикулума, а также Ca2t-связывающими белками (они также принимают участие в транедукции кальциевого сигнала).

Ранее в нашей лаборатории было показано, что в скелетных мышцах присутствуют такие представители семейства аннексинов, как аннексии А6, А5, А4 и A3. Основная доля приходится на аннексии А6, значительно менее представлен А5, а А4 и A3 находятся лишь в небольшом количестве. Аннексины в скелетных мышцах локализуются в сарконлазмагическом ретикулуме (Melgunov et al., 1990), поэтому изучение аннексинов саркоплазматического ретикулума может оказаться пролезпым для установления тонких механизмов регуляции мышечного сокращения.

Одним из направлении таких исследований может быть изучение взаимодействия аннексинов с компонентами мембран сарконлазматического ретикулума. Так, например, крайне интересной является способность образовывать прочные, Са^-независимые связи с мембранами (Raeymaekerse al.,1985). В таком случае аннексины перестают экстрагироваться растворами хелаторов и требуют для солюбнлизацни обработки детергентами. Механизм образования аннексинами таких связей в различных тканях остается неизученным, хотя можно предположить, что в нем могут принимать участие как белковые, так и липидные компоненты мембран, а также, возможно, ионы других, помимо Са2\ двухвалентных металлов.

Поэтом}', целю настоящей работы было изучить взаимодействие аннексинов А5 и А6 с различными компонентами мембран сарконлазматического ретикулума.

Исходя из поставленной цели, были сформулированны следующие задачи:

1) разработать и наладить метод получения высокоочшценных препаратов аннексинов А5 и А6;

2) изучить влияние ионов двухвалентных металлов на опосредуемую аннексинами агрегацию липосом;

3) выяснить, образуют ли аипексины сарконлазматического ретикулума формы, связанные с мембранами Са2+-независимым образом;

4) проверить, способны ли аннексины А5 и Аб прочно связываться с мембранными везикулами, не содержащими белков;

5) оценить влияние аннексинов А6 и А5 на активность основного фермента сарконлазматического ретикулума - Са2<-зависимой АТФазы;

6) провести поиск белков мембран сарконлазматического ретикулума, связывающихся с аииексином А6.

В связи с конкретностью задач, стоящих перед нами, в обзоре литературы мы решили ограничиться рассмотрением только тех работ, которые были наиболее близки к теме наших исследований.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1. Аннексины

Аннексииы представляют собой мультигснпос семейство кальций- и фосфолипид-связывающих белков, характеризующихся также общими структурными особенностями. В присутствии Са24" аннексииы переходят из растворенного состояния в связанное с мембраной, содержащей отрицательно заряженные фосфолипнды. Аннексииы повсеместно встречаются во всех трех царствах эукариот и высоко консервативны по своей структу ре, что может указывать на выполнение ими какой-то фундаментальной функции.