Взаимодействие фосфоаналогов S-аденозилметионина и глутамата с ДНК-метилтрансферазами и глутаматдегидрогеназой тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Филонов Всеволод Львович

• Филонов Всеволод Львович
• кандидат наук
• 2026

Оглавление диссертации кандидат наук Филонов Всеволод Львович

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Аминофосфоновые кислоты: взаимодействие с ферментами и биологическая активность

1.2. Аминофосфонистые кислоты: взаимодействие с ферментами и биологическая активность

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Материалы

2.2. Выделение Dnmt3a-CD методом металл-аффинной хроматографии

2.3. Анализ образования комплексов ,OHK*(Dnmt3a-CD>SAH/SAH-PH/SAH-P5

2.4. Определение активности Dnmt3а, субстратных свойств фосфоаналогов SAM

и ингибирующей активности фосфоаналогов SAH

2.5. Определение активности Dnmt1, субстратных свойств фосфоаналогов SAM и ингибирующей активности фосфоаналогов SAH

2.6. Определение активности GDH и расчет кинетических параметров

Z-глутамата и Z-Glu-y-PH в глутаматдегидрогеназной реакции

2.7. Определение степени превращения Z-Glu или Z-Glu-y-PH в a-KG или a-KG-y-

Ph, соответственно

2.8. Анализ превращения Z-лейцина в a-кетоизокапроновую кислоту при pH

2.9. Препаративный ферментативный синтез a-KG-y-PH

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Взаимодействие фосфоаналогов SAM и SAH с ДНК-метилтрансферазами

3.1.1. Выделение Dnmt3a-CD

3.1.2. Взаимодействие фосфоанлогов SAM и SAH с Dnmt3a

3.1.2.1. Фосфоаналоги SAM и SAH не влияют на активность эндонуклеазы рестрикции Hin61

3.1.2.2. Фосфоаналоги SAM служат донорами метильной группы в реакции метилирования ДНК, катализируемой Dnmt3a

3.1.2.3. Фосфоаналоги SAH ингибируют метилирование ДНК, катализируемое Dnmt3a

3.1.2.4. SAH-Рн и SAH-?5 образуют тройные комплексы с ДНК-дуплексом D3/D4 и Dnmt3a CD

3.1.3. Взаимодействие фосфоаналогов SAM и SAH с Dnmtl

3.1.3.1. Модификация известной методики определения активности Dnmtl

3.1.3.2. Фосфоаналоги SAM - не субстраты Dnmtl

3.1.3.3. Ингибирование Dnmt1 фосфоаналогами SAM и SAH

3.1.4. Почему (R^-SAM-Ph субстрат Dnmt3a, но не субстрат Dnmt1 ?

3.2. Взаимодействие фосфоаналогов глутамата с глутаматдегидрогеназой

3.2.1. Субстратом глутаматдегидрогеназы служит Z-Glu-y-PH, но не D-Glu-y-PH

3.2.2. Кинетические параметры окислительного дезаминирования Z-Glu-y-PH, катализируемого глутаматдегидрогеназой

3.2.3. rac-Glu-y-P5 и rac-PT не являются ни субстратами, ни ингибиторами глутаматдегидрогеназы

3.2.4. Препаративный ферментативный синтез a-KG-y-PH

3.2.4.1. Возможность ферментативного синтеза a-KG-y-PH без буфера. Оптимизация концентраций и соотношения Z-Glu-y-PH и NAD+

3.2.4.2. Z-лейцин не может быть использован в качестве активатора глутаматдегидрогеназной реакции при превращении Z-Glu-y-PH в a-KG-y-PH

3.2.4.3. Ферментативный синтез a-KG-y-PH

3.2.4.4. ЯМР-анализ структуры a-KG-y-PH

3.2.5. Почему Z-Glu-y-PH служит субстратом глутаматдегидрогеназы ?

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

BHQ2 - Black Hole Quencher 2 BSA - бычий сывороточный альбyмин Cy3 - Cyanine

Dnmt1 - ДНК-метилтрансфераза

Dnmt3a - ДНК-метилтрансфераза За

Dnmt3a-CD - каталитический домен Dnmt3a

DTT - 1,4-дитиотреитол

EDTA - этилендиаминтетраацетат натрия

FAM - 6-карбоксифлyоресцеин

GDH - глyмататдегидрогеназа

Glu-y-PH - фосфонистый аналог п^тамата

Glu-y-P5 - фосфоновый аналог ^^тамата

IC50 - концентрация полyмаксимального ингибирования

kcat - каталитическая константа

Kd - константа диссоциации

KI - константа ингибирования

Km - константа Михаэлиса

m5C - 5-метилцитозин

P - поляризация флyоресценции

PMSF - фенилметилсyльфонилфторид

PT - фосфинотрицин

SAM - £-аденозил-£-метионин

SAM-Ph - фосфонистый аналог £-аденозил-£-метионина SAM-P5 - фосфоновый аналог £-аденозил-£-метионина SAH - £-аденозил-£-гомоцистеин

SAH-Ph - фосфонистый аналог £-аденозил-£-гомоцистеина

SAH-P5 - фосфоновый аналог £-аденозил-£-гомоцистеина

SDS - додецилсyльфат натрия

Tris - трис-(гидроксиметил)-аминометан

ПААГ - полиакриламидный гель

v0 - начальная скорость

Vmax - максимальная скорость ферментативной реакции

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Взаимодействие фосфоаналогов S-аденозилметионина и глутамата с ДНК-метилтрансферазами и глутаматдегидрогеназой»

Актуальность темы

Дизайн и синтез специфических ингибиторов и регуляторов активности ферментов представляет собой один из важнейших алгоритмов, используемых при создании биологически активных соединений, включая и практически значимые. В последние годы для решения этих задач активно используются данные структурной биологии макромолекул, а применение компьютерного анализа и искусственного интеллекта сформировало новые подходы и возможности для создания биологически активных веществ.

Метилирование ДНК является наиболее устойчивой эпигенетической меткой, которая локализована в CpG-последовательностях, расположенных в основном в CpG-островках, присутствующих более чем в половине промоторов генов. При онкологических заболеваниях часто наблюдается общее гипометилирование генома и локальное гиперметилирование промоторных участков генов-супрессоров опухолей.

Ингибирование метилирования ДНК приводит к торможению роста опухолей благодаря частичной реактивации генов-супрессоров опухолей. Азацитидин и децитабин используются в практической онкотерапии. Проникнув в клетки, они превращаются в соответствующие трифосфаты и встраиваются в ДНК, что делает невозможным метилирование по С5-положению цитозина. Создание избирательных ингибиторов ДНК-метилтрансферазы Dnmt3a, которая формирует рисунок метилирования ДНК de novo, и ДНК-метилтрансферазы Dnmtl, копирующей рисунок метилирования на дочернюю цепь при репликации ДНК, представляет собой нетривиальную задачу в силу сходства каталитических механизмов этих ферментов. Тем не менее, селективные ингибиторы этих ферментов известны, но еще не нашли практического применения.

Альтернативным подходом к регуляции метилирования ДНК может быть использование аналогов ^-аденозилметионина, которые служат донорами метильных групп в Dnmt3a-реакции, но не узнаются Dnmtl, или наоборот. Однако подобные аналоги ^-аденозилметионина неизвестны, хотя такая задача и весьма актуальна. В настоящей работе исследованы первые соединения с подобными свойствами - фосфорорганические аналоги ^-аденозилметионина.

Глутаминовая кислота занимает одно из центральных мест в азотистом обмене, и ингибирование ферментов ее метаболизма даже на клеточном уровне представляет собой непростую задачу в силу существования многочисленных компенсаторных путей метаболизма. Классическим примером ингибиторов, действующих на путях метаболизма глутамата, служит коммерческий гербицид Биалафос, который превращается в растениях в фосфинотрицин -мощный ингибитор глутаминсинтетазы. Недавно мы показали, что пептидильные производные фосфинотрицина эффективно ингибируют рост клинических изолятов Klebsiella pneumoniae со множественной лекарственной устойчивостью, а дистальные фосфонистые аналоги глутамата и

а-кетоглутарата обладают необычным спектром антибактериальной активности, что делает поиск новых подходов к созданию биологически активных соединений на основе необычных аналогов глутамата весьма актуальным.

Цель и задачи исследования

Цель работы - исследование биохимического потенциала необычных аналогов ^-аденозилметионина и глутамата, карбоксильная группа которых заменена на кислый фосфорсодержащий фрагмент.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

• Изучить способность фосфонистого и фосфонового аналогов ^-аденозилметионина служить донорами метильной группы в реакции метилирования ДНК, катализируемых Dnmt3a и Dnmt1;

• Исследовать ингибирование ДНК-метилтрансфераз Dnmt3a и Dnmt1 фосфонистым и фосфоновым аналогами SAH;

• Изучить взаимодействие глутаматдегидрогеназы II типа с аналогами глутамата, дистальная карбоксильная группа которых заменена на фосфорсодержащий фрагмент;

• Впервые осуществить ферментативный синтез дистального фосфонистого аналога а-кетоглутарата с использованием глутаматдегидрогеназы и соответствующего аналога глутамата.

Научная новизна

Впервые исследовано взаимодействие аналогов ^-аденозилметионина с модифицированной карбоксильной группой с эукариотическими ДНК-метилтрансферазами Dnmt3a и Dnmt1.

Найдено, что фосфонистый и фосфоновый аналоги ^-аденозилметионина представляют собой оригинальные эпигенетические регуляторы, так как Dnmt3a, формирующая первичный рисунок метилирования ДНК, использует эти аналоги в качестве доноров метильной группы, в противоположность Dnmt1, копирующей рисунок метилирования на дочернюю цепь.

Впервые исследовано взаимодействие дистального фосфонистого аналога глутамата с глутаматдегидрогеназой II типа и показано, что он является субстратом фермента несмотря на реакционноспособную Р-Н-связь в фосфорсодержащем фрагменте. Определены кинетические параметры этой реакции.

Осуществлен первый ферментативный синтез дистального фосфонистого аналога а-кетоглутарата, исходя из соответствующего аналога глутамата с использованием

глутаматдегидрогеназы II типа, что позволило получить препаративные количества этого аналога a-кетоглутарата.

Теоретическая и практическая значимость исследования

Полученные результаты полезны для понимания причин превосходной фунгицидной активности фосфонистого аналога метионина, который является субстратом синтетазы ^-аденозилметионина, а также и особенностей хорошей антибактериальнной активности легко взаимопревращающихся дистальных фосфонистых аналогов a-кетоглутарата и глутамата.

Методология и методы исследования

В настоящей работе были использованы методы молекулярной биологии - экспрессия рекомбинантного каталитического домена Dnmt3a в E. coli, разрушение клеток E. coli., электрофорез дезоксирибоолигонуклеотидов в полиакриламидном геле, белковый денатурирующий электрофорез в полиакриламидном геле. Хроматографические методы, использованные для выделения и очистки Dnmt3a и дистального фосфонистого аналога a-кето-глутарата включали в себя аффинную, ионообменную и обращенно-фазовую хроматографии. Также использованы спектрофотометрия, спектрофлуорометрия и ЯМР спектроскопия..

Положения, выносимые на защиту

1. Установлено, что фосфонистый и фосфоновый аналоги ^-аденозилметионина, карбоксильная группа которых заменена на кислый фосфорсодержащий фрагмент, служат донорами метильной группы в ДНК-метилтрансферазной реакции, катализируемой Dnmt3a, формирующей рисунок метилирования ДНК de novo. При этом исследуемые фосфорные аналоги ^-аденозилметионина не узнаются ДНК-метилтрансферазой Dnmt1, копирующей рисунок метилирования на дочернюю цепь при репликации ДНК.

2. Найдено, что фосфонистый и фосфоновый аналоги ^-аденозилгомоцистеина эффективно ингибируют активность Dnmt3a, лишь немного уступая природному ^-аденозилгомоцистеину, но при этом малоэффективны в отношении Dnmtl.

3. Впервые показано, что дистальный фосфонистый аналог глутамата служит субстратом NAD+-зависимой глутаматдегидрогеназы II типа из печени быка.

4. Впервые осуществлен ферментативный синтез дистального фосфонистого аналога a-кетоглутарата, исходя из соответствующего фосфонистого аналога глутамата с использованием глутаматдегидрогеназы.

Степень достоверности и апробация работы

Достоверность результатов, представленных в диссертационной работе, обеспечена использованием современных методов исследования, проведением независимых экспериментов с применением соответствующих контролей и подтверждается их воспроизводимостью. Все эксперименты выполнены на сертифицированном оборудовании в трех и более повторах, и полученные данные проанализированы с помощью современных методов статистической обработки.

Основные результаты диссертационной работы опубликованы в 3 статьях в рецензируемых журналах и были представлены в виде устных и стендовых докладов на 6 международных и всероссийских конференциях.

Личное участие автора в получении результатов, изложенных в диссертации

Основные результаты работы были получены соискателем, он активно участвовал в планировании экспериментов, их реализации, анализе полученных результатов, подготовке научных публикаций и формировании текста диссертации. В ходе работы автор продемонстрировал самостоятельность в проведении исследований и способность критически интерпретировать их результаты.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа изложена на 78 страницах и включает 63 рисунка и 5 таблиц; содержит список сокращений, введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, выводы, заключение и список литературы, который включает в себя 106 источников.

ВВЕДЕНИЕ

Соединения с необычными связями фосфор-углерод (Р-С и С-Р-С) и даже связью фосфор-водород (С-Р-Н) найдены в природе, а некоторые из этих веществ нашли практическое применение в медицине и сельском хозяйстве [1, 2]. Известными примерами (Рис. 1) являются антибиотик фосфомицин (необратимый ингибитор мурамиллигазы А [3], первого фермента синтеза пептидогликана), применяемый для лечения цистита; противомалярийный препарат фосмидомицин (ингибитор 1-дезокси-0-ксилулозо-5-фосфатредуктоизомеразы [4, 5], важнейшего фермента немевалонатного пути биосинтеза изопреноидов), который также активен в отношении различных энтеробактерий.

Рис. 1. Некоторые из наиболее известных и практически значимых природных фосфоновых кислот.

Фосфинотрицин (L-PT; глюфосинат; Рис. 1), непротеиногенная аминокислота, которая сначала была выделена как биологически активный компонент трипептида Биалафоса (£-фосфинотрицил-£-аланил-£-аланин), хорошо известного практически значимого гербицида [6, 7]. L-PT является высокоэффективным ингибитором глутаминсинтетазы (GS) [8, 9]. В растениях ингибирование GS приводит к быстрому накоплению аммиака в клетках, что нарушает кислотно-основный баланс и приводит к их гибели. Помимо хорошо известной гербицидной активности, Биалафос и L-PT-содержащий дипептид L-Leu-L-PT оказались эффективными в отношении клинических изолятов Klebsiella pneumoniae, устойчивых к более чем 20 коммерческим антибиотикам разных классов [10]. Следует отметить, что L-РТ является единственным природным соединением, содержащим две Р-С-связи

Связь C-P, в отличие от фосфоэфирной связи (C-O-P) устойчива к химическому и ферментативному гидролизу. Единственный известный путь образования P-C связи в природных соединениях заключается в катализируемой фосфоенолпируватмутазой перегруппировке фосфоенолпирувата в фосфонопируват, который служит универсальным строительным блоком для биосинтеза других соединений с P-C связью (Рис. 2). Последующее декарбоксилирование фосфонопирувата, катализируемое тиамин-зависимой фосфонопируватдекарбоксилазой, приводит к фосфоноацетальдегиду (Рис. 2), который претерпевает широкий спектр превращений и выступает в качестве еще одного универсального биохимического строительного блока [1, 11].

О

^ ILOH О

Фосфомицин

Фосмидомицин

nh2

Фосфинотрицин (РТ)

Биалафос

PEP Фосфонопируват-

CH? О мутаза О Q декарбоксилаза О

Ън Y он о^^ "ОН

о о

Фосфоенолпируват Фосфонопируват Фосфоноацетальдегид

Рис. 2. Ключевые стадии биосинтеза соединений с P-C связью. Фосфонопируват и фосфоноацетальдегид - основные строительные блоки для биосинтеза фосфонатов.

Уникальность пути образования Р-С-связи позволила разработать современный способ поиска подобных соединений, включая и биологически активные. Genome-mining 10000 актиномицетов выявил около 300 штаммов, содержащих кластеры генов синтеза фосфонатов, что позволило найти несколько новых, а также большое число уже известных фосфорсодержащих биологически активных соединений [12]. Среди этих вторичных фосфорсодержащих метаболитов в некоторых актиномицетах был обнаружен и дистальный фосфонистый аналог глутаминовой кислоты - десметилфосфинотрицин (Рис. 3, Glu-y-Ры), ранее найденный лишь в Streptomyces hygroscopicus с мутациями на путях биосинтеза Биалафоса [13]. На данный момент, Glu-y-Ры является единственным известным природным соединением с Р-Н-связью.

Замена карбоксильной группы в молекулах аминокислот на кислый фосфорсодержащий фрагмент приводит к аналогам разных типов, включая аминофосфоновые (I) и аминофосфонистые (II) кислоты (Рис. 3).

е ° О О

II H^N

e0/RYR X ®</YR = eo/PYR nh2 nh2 nh2

(I) 2 2 (II) 2 Z.-Glu-y-PH

Рис. 3. а-Аминофосфонистые (I) и а-аминофосфоновые (II) аналоги аминокислот. Дистальный фосфонистый аналог глутамата (Z-Glu-y-Ры).

Взаимодействие а-аминофосфоновых кислот (I) с ферментами метаболизма аминокислот хорошо исследовано, но подобные аналоги, как правило, оказываются слабыми конкурентными ингибиторами соответствующих ферментов или, что намного реже, субстратами, сродство которых хуже, чем у природных аминокислот (см. обзоры: [1, 2, 14]). Эти свойства кислот (I) обусловлены тем, что фосфоновый фрагмент представляет собой объемный двухзарядный тетраэдр, который плохо моделирует плоскую однозарядную карбоксильную группу (Рис. 3), а аминогруппа в а-аминофосфоновых кислотах (I) примерно на порядок основнее, чем в аминокислотах [15]. Вместе с тем, один из алгоритмов создания эффективных ингибиторов ферментативных превращений, протекающих по карбоксильной группе аминокислот и их производных, включая эфиры и пептиды, заключается в использовании фосфор-замещенных производных а-аминофосфоновых кислот (I), поскольку их тетраэдрический фосфорсодержащий

фрагмент хорошо моделирует тетраэдрическое переходное состояние, возникающее в ходе реакций по карбоксильной группе (см. обзоры [1, 2, 14, 16]).

Биохимия а-аминофосфонистых кислот, содержащих связи углерод-фосфор-водород (С-Р-Н) (II), малоисследована по сравнению с энзимологией и биохимией аминофосфонатов (I). Фосфонистый фрагмент аминокислот (II) (Рис. 3) представляет собой однозарядный сплюснутый тетраэдр, который достаточно хорошо моделирует плоскую однозарядную карбоксильную группу и является ее биоизостером [17]. Аминогруппа в кислотах (II) примерно на порядок менее основная, чем в аминокислотах [15], что также существенно для продуктивного связывания подобных аналогов с ферментами. Совокупность этих факторов позволяет а-аминофосфонистым кислотам (II) претерпевать некоторые субстратоподобные ферментативные превращения, которые приводят к новым соединениям с необычными связями С-Р-Н.

Так, пиридоксаль-5'-фосфат (PLP)-зависимые трансаминазы аланина и аспарагиновой кислоты переаминируют фосфонистые аналоги аланина (Рис. 3, R = СНз) [18, 19] и проксимальные фосфонистые аналоги аспарагиновой и глутаминовой кислот (Рис. 3, R = СН2СООН, или R = СН2СН2СООН) [20]. PLP-зависимые тирозин-фенол-лиаза и метионин-гамма-лиаза расщепляют фосфонистые аналоги тирозина (Рис. 3, R = p-СШСбШОН) и метионина (Рис. 3, R = СШСН^СНз) с образованием фосфонистых аналогов пирувата [21] и а-кетобутирата [22], соответственно. Наконец, L-Glu-y-Рн (Рис. 3) под действием PLP-зависимой глутаматдекар-боксилазы превращается в фосфонистый аналог гамма-аминомасляной кислоты, из которой под действием соответствующей PLP-зависимой трансаминазы возникает фосфонистый аналог полуальдегида янтарной кислоты [17]. Последний окисляется КАОР+-зависимой сукцинил-полуальдегиддегидрогеназой до фосфонистого аналога сукцината [17].

а-Аминофосфонистые кислоты (II), в отличие от соответствующих аминофосфонатов (I) проникают в бактерии и грибы и обладают разнообразной биологической активностью. Особенностью соединений этого класса является то, что вещества могут быть активны как таковые и ингибировать соответствующие ферменты. Однако, действующим началом может служить и один из их фосфорсодержащих метаболитов с Р-Н-связью, образующихся в клетке в результате субстратоподобных превращений аминофосфонистых кислот (II). Эти уникальные особенности действия формируют обширное поле исследований.

Первым объектом исследования в настоящей диссертационной работе служат ДНК-метилтрансферазы млекопитающих - Dnmt3a, которая создает рисунок метилирования ДНК de novo, и Dnmt1 копирующая рисунок метилирования на дочернюю цепь при репликации ДНК. Метилирование остатков цитозина в CpG-последовательностях ДНК, которые присутствуют более чем в половине промоторов генов, является одним из факторов, определяющих эпигенетическую регуляцию экспрессии генов эукариот [23-25].

Метилирование CpG-последовательностей в промоторах генов приводит к их инактивации вследствие ослабления взаимодействия с транскрипционными факторами и ремоделирования хроматина [25]. Аберрантный рисунок метилирования ДНК часто выявляют при онкологических заболеваниях - при общем гипометилировании генома наблюдается локальное гиперметилирование промоторных участков генов-супрессоров опухолей [26].

Ингибирование ДНК-метилтрансфераз приводит к торможению роста опухолей за счет частичной реактивации генов-супрессоров опухолей, и ингибиторы этих ферментов обладают определенным потенциалом для онкотерапии. Однако в настоящее время только два ингибитора (азацитидин и децитабин) одобрены FDA как лекарства. Эти аналоги пиримидиновых нуклеозидов превращаются в соответствующие трифосфаты, которые встраиваются в ДНК. В ходе метилтрансферазной реакции азацитозин ковалентно связывается с ферментом, что приводит к его инактивации [27] (Рис. 4А). Азацитидин и децитабин весьма токсичны, поэтому поиск новых регуляторов метилирования ДНК с альтернативными механизмами действия весьма актуален [27, 28].

ДНК-полимераза

5-aza-dCTP -^-

dNTPs РР;

Dnmt3a

5'—5-azaCpG—3' „ нет

метилирования

| комплементарная цепь|

Dnmtl

nh2

5-aza-dC = 'Г N o n

чЛр! /V/4

5'—CpG-3' 3'—GpC-5'

Dnmt3a

т

5'-m5CpG-3' Репликация 3'—Gpm5C-5'

хиназолин-хинолиновый ингибитор [29]

5'-m5CpG-3' 3'—GpC-5'

б'-Срб-З' 3'—Gpm5C-5'

Dnmtl

5'-m5CpG-3' 3'—Gpm5C-5'

б'-тХрв-З' 3'—Gpm5C-5'

производное триптамина [30]

Рис. 4. Ингибирование ДНК-метилтрансфераз азацитидином (А) и специфические ингибиторы Dnmt3a и Dnmt1 (Б).

Один из таких подходов заключается в использовании избирательных ингибиторов Dnmt1 и Dnmt3a, создание которых представляет собой нетривиальную задачу в силу сходства каталитических механизмов этих ферментов. Тем не менее, для этих ферментов найдено несколько селективных ингибиторов. Например, бисубстратный хиназолин-хинолиновый ингибитор примерно в 100 раз активнее в отношении Dnmt3a по сравнению с Dnmt1 [29], тогда как некоторые #-алкильные производные триптамина в 20 раз лучше ингибируют Dnmtl по сравнению с Dnmt3a (Рис. 4Б) [30]. Эти и подобные ингибиторы ароматической природы связываются или в активном центре, или в гидрофобном кармане ДНК-метилтрансфераз.

Альтернативным подходом к регуляции SAM-зависимого метилирования ДНК может быть использование аналогов SAM, которые представляют собой субстраты Dnmt3a, но не

узнаются Dnmtl. Однако алгоритмы, пригодные для дизайна аналогов SAM с необходимым комплексом свойств, неизвестны. Для осуществления этой задачи, в настоящей работе были использованы фосфорсодержащие аналоги SAM, в которых карбоксильная группа заменена на фосфорсодержащий фрагмент (Рис. 5 А). Следует отметить, что взаимодействие эукариотических ДНК-метилтрансфераз с аналогами SAM с модифицированной карбоксильной группой до сих пор не изучалось.

Глутаминовая кислота занимает одно из центральных мест в клеточном метаболизме и вторым объектом исследования настоящей работы служит NAD+-зависимая глутамат-дегидрогеназа (GDH) II типа, которая занимает важное место в превращениях глутамата. Создание в рамках одного класса соединений новых химических регуляторов активности ферментов метаболизма глутаминовой кислоты и SAM-зависимых метилтрансферазных реакций представляет собой очень сложную задачу. Тем не менее, нам удалось найти подходы к ее решению, использовав фосфонистые аналоги SAM и SAH (Рис. 5 А), глутамата и а-кетоглутарата (Рис. 5Б), в которых соответствующая карбоксильная группа заменена на кислый фосфорсодержащий фрагмент с Р-Н-связью.

НО

JS)

СН3

S + (S)

nh2

(S.S)-SAM

о

но

45

nh2

(S)-SAH

о

он он

о

он он

nh2

(/?,S)-SAM-PH ОН ОН

о

nh2

гас-SAH-Ph он он

О

н4

но"

L-Glu-y-Рн

О

(L)

ОН

NH,

Рис. 5. Фосфорсодержащие аналоги SAM, SAH, глутаминовой и а-кетоглутаровой кислот. (А) Природные (S^-SAM, (S)-SAH, а также фосфонистые аналоги SAM ((ä,,S)-SAM-Ph) и SAH (rac-SAH-Рн) для исследования ДНК-метилтрансфераз Dnmt3a и Dnmtl. (Б) Фосфонистые аналоги а-кетоглутарата (a-KG-Y-Ph) и глутамата (Z-G1u-y-Ph) для исследования глутаматдегидрогеназы.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Аминофосфоновые кислоты: взаимодействие с ферментами и биологическая активность

Замена карбоксильной группы аминокислот на кислый фосфорсодержащий фрагмент приводит к обширному семейству аналогов, наиболее изученными из которых являются аминофосфоновые кислоты (Рис. 6).

о о

ЧЭН # ^

nh,

он

y он

nh2

Рис. 6. а-Аминокарбоновые и а-аминофосфоновые кислоты.

Фосфоновая группа (-P(O)(OH)2) представляет собой двухзарядный тетраэдр, что существенно отличает ее от плоской однозарядной карбоксильной группы. Связи P-C и P-O на 10-15% длиннее связей C-C и C-O, соответственно, что делает фосфоновую группу значительно более объемной в сравнении с карбоксильной [31]. Значение pKa аминогруппы аминофосфоновых кислот на единицу выше, чем у аминокислот, а основность аминогруппы критически важна для большинства ферментов, многие из которых крайне чувствительны к протонированию аминогруппы. Поэтому аминофосфоновые кислоты представляют собой плохие миметики аминокислот, и существуют лишь единичные примеры субстратных свойств фосфонатов в ферментативных реакциях. Одним из таких примеров является катализируемое тирозиназой окисление фосфонового аналога DOPA (DOPA-P5, Рис. 7А) в соответствующий хинон [32]. Другим примером является образование цилиатина (ß-аминоэтилфосфоновая кислота, Рис. 7Б)) из фосфоноацетальдегида, катализируемое соответствующей трансаминазой [33]. Эти и несколько других подобных превращений не затрагивают фосфоновую группу, которая удалена от реакционного центра.

Тирозиназа

%Н он

DOPA-P5

хинон

о'

о

ид)н

он

Цилиатин-трансаминаза

h,n'

nh,

О

и.он Р-ОН

Фосфоноацетальдегид

Цилиатин

Рис. 7. Ферментативные реакции с участием некоторых аминофосфоновых кислот. (А) Окисление БОРА-Р5. (Б) Трансаминирование цилиатина.

В большинстве случаев аминофосфонаты представляют собой конкурентные ингибиторы

соответствующих ферментов обмена аминокислот, а сродство аналогов варьируется в широких

пределах. Так, фосфоновый аналог тирозина (Tyr-P5, Рис. 6, R= ^-НОС6ШСШ) не узнается PLP-зависимой тирозин-фенол-лиазой [34]. Проксимальный фосфоновый аналог глутамата (Glu-a-Ps, Рис. 6, R= НООССН2СН2) представляет собой слабый конкурентный ингибитор PLP-зависимых глутаматдекарбоксилазы E. coli и глутаматдекарбоксилазы из мозга крыс, а дистальный фосфоновый аналог глутамата (Glu-y-Ps) не узнается этими ферментами [35]. Дистальные и проксимальные фосфоновые аналоги аспартата и глутамата оказались очень слабыми конкурентными ингибиторами PLP-зависимой аспарттрансаминазы из сердца свиньи [20]. Вместе с тем, Tyr-Ps достаточно эффективен в отношении тирозинтрансаминазы (Ki/Km 0,3) из печени крыс [36], а Glu-y-Ps ингибирует глутаминсинтетазу из E. coli значительно лучше, чем фермент из печени крыс (Ki/Km 0.01 [37] и Ki/Km 0.1 [38], соответственно). Описаны и другие многочисленные примеры взаимодействия аминофосфоновых кислот с соответствующими ферментами метаболизма аминокислот (см. обзоры [1, 2, 14, 16]).

Удивительно, но среди аминофосфоновых кислот, не имеющих в своей структуре реакционноспособных групп, найдено несколько необратимых ингибиторов ферментов. Так, фосфоновый аналог аланина (Ala-Ps, Рис. 8) ингибирует PLP-зависимую рацемазу аланина и D-Ala-D-Ala-лигазу - важные ферменты биосинтеза клеточной стенки бактерий [39-41].

Фосфоновый аналог £-аденозил-£-гомоцистеина (БАН-Ps, Рис. 8) необратимо ингибирует БАН-гидролазу, что приводит к изменению соотношения S-аденозилметио-нин/ЗАН и снижению эффективности процессов метилирования. Следует отметить, что и S-, и .R-изомер БАН-Ps необратимо ингибируют фермент, но активность S-изомера намного выше, чем у .R-изомера: Ki 345 ± 3 мкМ, kinact 0.0049 мин-1 и Ki 1094 ± 49 мкМ, kinact 0.0145 мин-1, соответственно [42].

Рис. 8. Фосфоновые аналоги аланина и «-аденозилгомоцистеина - необратимые ингибиторы рацемазы аланина и 8ЛИ-гидролазы, соответственно.

Ингибиторы рацемазы аланина, как правило, обладают антибактериальной активностью [43, 44], но Л1а-Р5 (Рис. 8) неактивен, так как плохо проникает через клеточную стенку [16]. Одним из способов улучшить транспорт аминофосфонатов в клетки является использование пептидилпермеазной системы, что позволяет активно переносить в клетку пептиды с С-концевыми аминофосфонатами. Последующий внутриклеточный протеолиз приводит к образованию токсичных для бактерий аминофосфоновых кислот [39, 45]. Одним из первых и наиболее известных примеров является дипептид алафосфалин (Л1а-Л1а-Р5, Рис. 9), который

ОН ОН

А1а-Р5

SAH-P5

эффективно подавляет рост E. coli, Klebsiella aerogenes, Staphylococcus aureus и ряда других бактерий [39].

СН3

H,N

Н II n i.p:

.ОН

ЧЭН

о сн3

Ala-(R)-Ala-P5

сн.

H,N

V он

сн3

пептидазы

н3с ^ РС0Н

3 у он

nh2

(R)-Ala-P5

ингибирование А1а-рацемазы

ингибирование D-Ala-D-Ala лигазы

клеточная стенка

Рис. 9. Алафосфалин как пример соединения, проникающего через клеточную стенку бактерий с помощью системы активного транспорта. В клетке алафосфалин гидролизуется с высвобождением А1а-Р5 - ингибитора ферментов биосинтеза клеточной стенки бактерий.

Важное применение аминофосфоновых кислот в энзимологии связано с использованием их производных по фосфору (фосфонаты, амиды, эфиры и т.п.) для создания эффективных ингибиторов превращений, протекающих по карбоксильной группе аминокислот. Основой для этого послужили общие соображения, сформулированные еще Полином, о том, что фермент имеет более высокое сродство к промежуточным соединениям и переходным состояниям реакции, нежели к субстрату [46]. Позднее, эта концепция реализовалась в соединениях, структурно близких промежуточным соединениям и переходным состояниям ферментативной реакции - эти вещества могут быть источником эффективных и избирательных ингибиторов ферментов [47]. Применительно к превращениям, происходящим по карбоксильной группе или ее производным, это означало необходимость моделирования тетраэдрического переходного состояния:

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Филонов Всеволод Львович, 2026 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Horsman, G.P., Zechel, D.L. "Phosphonate biochemistry". Chem Rev., 117(8), 5704-5783

(2017).

2. Kafarski P. "Phosphonopeptides containing free phosphonic groups: recent advances". RSC Adv., 10(43), 25898-25910 (2020).

3. Falagas M.E., Vouloumanou K., Samonis G., Vardakas K.Z. "Fosfomycin". Clin. Microbiol. Rev., 29, 321-347 (2016).

4. Jawaid S., Seidle H., Zhou W., Abdirahman H., Abadeer M., Hix J.H., van Hoek M.L., Couch R.D. "Kinetic characterization and phosphoregulation of the Francisella tularensis 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase (MEP synthase)". PLoS ONE, 4, e8288. (2009).

5. Pines G., Oh E.J., Bassalo M.C., Choudhury A., Garst A.D., Fankhauser R.G., Eckert C.A., Gill R.T. "Genomic deoxyxylulose phosphate reductoisomerase (DXR) mutations conferring resistance to the antimalarial drug fosmidomycin in E. coli". ACS Synth. Biol., 7, 2824-2832

(2018).

6. Seto H., Kuzuyama T. "Bioactive natural products with carbon-phosphorus bonds and their biosynthesis". Nat. Prod. Rep., 16, 589-596 (1999).

7. Ujvâry I. "Pest control agents from natural products". In: Hayes' handbook of pesticide toxicology, Academic Press, 183-188 (2010).

8. Abell L.M., Villafranca J.J. "Investigation of the mechanism of phosphinothricin inactivation of Escherichia coli glutamine synthetase using rapid quench kinetic technique". Biochemistry, 30, 6135-6141 (1991).

9. Gill H.S., Eisenberg D. "The crystal structure of phosphinothricin in the active site of glutamine synthetase illuminates the mechanism of enzymatic inhibition". Biochemistry, 40, 1903-1912 (2001).

10. Demiankova M.V., Giovannercole F., Khomutov M.A., Salikhov A.I., Onillon L., Valuev-Elliston V.T., Vasilieva B.F., Khurs E.N., Gabrielyan N.I., Kochetkov S.N., Efremenkova OV, De Biase D, Khomutov AR. "Antibacterial activity of peptide derivatives of phosphinothricin against multidrug-resistant Klebsiella pneumoniae". Molecules, 28, 1234 (2023).

11. Metcalf, W.W., van der Donk, W.A. "Biosynthesis of phosphonic and phosphinic acid natural products". Annu. Rev. Biochem., 78, 65-94 (2009).

12. Ju K.S., Gao J., Doroghazi J.R., Wang K.K., Thibodeaux C.J., Li S., Metzger E., Fudala J., Su J., Zhang J.K., Lee J., Cioni J.P., Evans B.S., Hirota R., Labeda D.P., van der Donk W.A.,

Metcalf W.W. "Discovery of phosphonic acid natural products by mining the genomes of 10,000 actinomycetes". Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 112(39), 12175-12180 (2015).

13. Seto H., Sasaki T., Imai S., Tsuruoka T., Ogawa H., Satoh A., Inouye S., Niida T., Otake N. "Studies on the biosynthesis of bialaphos (SF-1293). 2. Isolation of the first natural products with a C-P-H bond and their involvement in the C-P-C bond formation". J. Antibiot. (Tokyo), 36(1), 96-98 (1983).

14. Kafarski P., Lejczak B. "Aminophosphonic acids of potential medical importance". Curr. Med. Chem. Anticancer Agents, 1, 301-312 (2001).

15. Baylis E.K., Campbell C.D., Dingwall J.G. "1-Aminoalkylphosphonous acids. Part 1. Isosteres of the protein amino acids". J. Chem. Soc. Perkin Trans., 1, 2845-2853 (1984).

16. Kafarski P. "Phosphonates: Their natural occurrence and physiological role". Contemporary Topics about Phosphorus in Biology and Materials, 1-19 (2020).

17. De Biase D., Cappadocio F., Pennacchietti E., Giovannercole F., Coluccia A., Vepsalainen J., Khomutov A. "Enzymatic kinetic resolution of desmethylphosphinothricin indicates that phosphinic group is a bioisostere of carboxyl group". Commun. Chem., 3(1), 1-13 (2020).

18. Laber B., Amrhein N. "Metabolism of 1-aminoethylphosphinate generates acetylphosphinate, a potent inhibitor of pyruvate dehydrogenase". Biochem. J., 248(2), 351-358 (1987).

19. Хомутов Р. М., Хурс Е. Н., Джавахия В. Г., Воинова Т. М., Ермолинский Б. С. "1-Аминоэтилфосфонистая кислота - новый ингибитор поликетидного пути биосинтеза природных соединений". Биоорган. Химия, 13(10), 1422-1424 (1987).

20. Хурс Е.Н., Осипова Т.И., Хомутов Р.М. "Ферментативное переаминирование фосфорорганических аналогов аспартата и глутамата". Биоорган. химия, 15(4)., 552-555 (1989).

21. Faleev N.G., Zhukov Yu.N., Khurs E.N., Gogoleva O.I., Barbolina M.V., Bazhulina N.P., Belikov V.M., Demidkina T.V., Khomutov R.M. "Interaction of tyrosine phenol-lyase with phosphoroorganic analogues of substrate amino acids". Eur. J. Biochem., 267(23), 6897-6902 (2000).

22. Faleev N.G., Alferov K.V., Tsvetikova M.A., Morozova E.A., Revtovich S.V., Khurs E.N., Vorob'ev M.M., Phillips R.S., Demidkina T.V., Khomutov R.M. "Methionine gamma-lyase: mechanistic deductions from the kinetic pH-effects. The role of the ionic state of a substrate in the enzymatic activity". Biochim. Biophys. Acta, 1794, 1414-1420 (2009).

23. Mensah I.K., Norvil A.B., AlAbdi L., McGovern S., Petell Ch.J., He M., Gowher H. "Misregulation of the expression and activity of DNA methyltransferases in cancer". NAR Cancer, 3(4), 1-20 (2021).

24. Moore L.D., Le T., Fan G. "DNA methylation and its basic function". Neuropsychopharmacology, 38(1), 23-38 (2013).

25. Belle R., Kawamura A., Arimondo P.B. "Chemical compounds targeting DNA methylation and hydroxymethylation". In: Mai, A. (eds) Chemical Epigenetics. Topics Med. Chem., 33. Springer, Cham. (2019).

26. Gros C., Fahy J., Halby L., Dufau I., Erdmann A., Gregoire J.M., Ausseil F., Vispe S., Arimondo P.B. "DNA methylation inhibitors in cancer: recent and future approaches". Biochimie, 94(11), 2280-2296 (2012).

27. Yu J., Xie T., Wang Z., Wang X., Zeng S., Kang Y., Hou T. "DNA methyltransferases: emerging targets for the discovery of inhibitors as potent anticancer drugs". Drug Discov. Today, 24(12), 2323-2331 (2019).

28. Huang S., Stillson N.J., Sandoval J.E., Yung C., Reich N.O. "A novel class of selective non-nucleoside inhibitors of human DNA methyltransferase 3A". Bioorg. Med. Chem. Lett., 40, 127908.

29. Halby L., Menon Y., Rilova E., Pechalrieu D., Masson V., Faux C., Bouhlel M.A., David-Cordonnier M.-H., Novosad N., Aussagues Y., Samson A., Lacroix L., Ausseil F., Fleury L., Guianvarc'h D., Ferroud C., Arimondo P.B. "Rational design of bisubstrate-type analogues as inhibitors of DNA methyltransferases in cancer cells". J. Med. Chem. 60, 4665-4679 (2017).

30. Chen S., Wang Y., Zhou W., Li S., Peng J., Shi Z., Hu J., Liu Y.C., Ding H., Lin Y., Li L., Cheng S., Liu J., Lu T., Jiang H., Liu B., Zheng M., Luo C. "Identifying novel selective non-nucleoside DNA methyltransferase 1 inhibitors through docking-based virtual screening". J. Med. Chem., 57(21), 9028-9041 (2014).

31. Bartlett P.A. Hunt J.T., Adams J.L., Gehret J.C.E. "Phosphorus-containing purines and pyrimidines: a new class of transition state analogs". Bioorg. Chem., 7(4), 421-436 (1978).

32. Lejczak B., Kafarski P., Makowiecka E. "Phosphonic analogues of tyrosine and 3,4-dihydroxyphenylalanine (dopa) influence mushroom tyrosinase activity". Biochem. J., 242(1), 81-88 (1987).

33. Dumora C., Lacoste A.-M., Cassaigne A. "Purification and properties of 2-aminoethylphosphonate:pyruvate aminotransferase from Pseudomonas aeruginosa". Eur. J. Biochem., 133(1), 119-125 (1983).

34. Хомутов Р.М., Фалеев Н.Г., Белянкин А.В., Хурс Е.Н., Хомутов А.Р., Перышкова О.Е., Беликов В.М. "1-амино-2-(4-гидроксифенил)этилфосфонистая кислота - новый субстрат тирозин-фенол-лиазы". Биоорган. химия, 23(11), 919-921 (1997).

35. Lacoste A.-M., Mansour S., Cassaigne A., Neuzil E. "Effect of phosphonic analogues of glutamic acid on glutamate decarboxylase". Experientia, 41(5), 643-644 (1985).

36. Iron A., Ruart M., Duboy J.-P., Beranger M., Cassaigne A., Neuzil E. "The phosphonic analogue of tyrosine: a tool in metabolic studies". Biochem. Soc. Trans., 9(2), 246-251 (1981).

37. Meek T.D., Villafranca J.J. "Kinetic mechanism of Escherichia coli glutamine synthetase". Biochemistry, 19(24), 5513-5519 (1980).

38. Leiczak B., Starzemska H., Mastalerz P. "Inhibition of rat liver glutamine synthetase by phosphonic analogues of glutamic acid". Experientia, 37(5), 461-462 (1981).

39. Allen J.G., Atherton F.R., Hall M.J., Hassall C.H., Holmes S.W., Lambert R.W., Nisbet L.J., Ringrose P.S. "Phosphonopeptides, a new class of synthetic antibacterial agents". Nature, 272(5648), 56-58 (1978).

40. Atherton F.R., Hassall C.H., Lambert R.W. "Synthesis and structure-activity relationships of antibacterial phosphonopeptides incorporating (1-aminoethyl)phosphonic acid and (aminomethyl)phosphonic acid". J. Med. Chem., 29(1), 29-40 (1986).

41. Badet B., Walsh C. "Purification of an alanine racemase from Streptococcus faecalis and analysis of its inactivation by (1-aminoethyl)phosphonic acid enantiomers". Biochem., 24(6), 1333-1341 (1985).

42. Steere J.A., Sampson P.B., Honek J.F. "Synthesis of an a-aminophosphonate nucleoside as an inhibitor of ^-adenosyl-Z-homocysteine hydrolase". Bioorg. Med. Chem. Lett., 12(3), 457-460 (2002).

43. Azam M.A., Jayaram U. "Inhibitors of alanine racemase enzyme: a review". J. Enzyme Inhib. Med. Chem., 31(4), 517-526 (2016).

44. Kondacs L.A., Orenga S., Anderson R.J., Marrs E.C.L., Perry J.D., Gray M. "C-terminal 1-aminoethyltetrazole-containing oligopeptides as novel alanine racemase inhibitors". Molecules. 25(6), 1315 (2020).

45. Podstawka, E., Andrzejak, M., Kafarski, P., Proniewicz, L.M. "Comparison of adsorption mechanism on colloidal silver surface of alafosfalin and its analogs". J. Raman Spectrosc., 39(9), 1238-1249 (2008).

46. Pauling L. "Molecular architecture biological reactions". Chem. Eng. News, 24, 1375-1377 (1946).

47. Wolfenden R. "Transition state analog inhibitors and enzyme catalysis". Annu. Rev. Biophys. Bioeng., 5, 271-306 (1976).

48. Biryukov A.I., Osipova T.I., Khomutov R.M. "a-aminophosphonous acids: the substrates of ATP-PPi exchange reaction, catalysed by aminoacyl-tRNA synthetases". FEBS Lett., 91(2), 246-248 (1978).

49. Jacobsen, N.E., Bartlett, P.A. "A phosphonamidate dipeptide analog as an inhibitor of carboxypeptidase A". J. Am Chem. Soc., 103(3), 654-657 (1981).

50. Thorsett E.D., Harris E.E., Peterson E.R., Greenlee W.J., Patchett A.A., Ulm E.H., Vassil T.C. "Phosphorus-containing inhibitors of angiotensin-converting enzyme". Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79(7), 2176-2180 (1982).

51. Morrison R.A., Singhvi S.M., Peterson A.E., Pocetti D.A., Migdalof B.H. "Relative contribution of the gut, liver, and lung to the first-pass hydrolysis (bioactivation) of orally administered 14C-fosinopril sodium in dogs. In vivo and in vitro studies". Drug. Metab. Dispos., 18(2), 253-257 (1990).

52. Queffelec C., Ribiere P., Montchamp J.L. "Synthesis of Z.N-heterocycles from omega-amino-Я-phosphinates: conformationally restricted alpha-amino acid analogs". J. Org. Chem., 73(22), 8987-8991 (2008).

53. Nemeria N.S., Korotchkina L.G., Chakraborty S., Patel M.S., Jordan F. "Acetylphosphinate is the most potent mechanism-based substrate-like inhibitor of both the human and Escherichia coli pyruvate dehydrogenase components of the pyruvate dehydrogenase complex". Bioorg. Chem., 34(6):362-379 (2006).

54. Nemeria N.S., Chakraborty S., Baykal A., Korotchkina L.G., Patel M.S., Jordan F. "The 1',4'-iminopyrimidine tautomer of thiamin diphosphate is poised for catalysis in asymmetric active centers on enzymes". Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 104(1), 78-82 (2007).

55. Ревтович С.В., Морозова Е.А., Хурс Е.Н., Закомырдина Л.Н., Никулин А.Д., Демидкина Т.В., Хомутов Р.М. "Пространственные структуры нековалентных комплексов Citrobacterfreundii метионин^-лиазы с субстратами". Биохимия, 76(5), 692-700 (2011).

56. Alferov K.V., Faleev N.G., Khurs E.N., Zhukov Yu.N., Khomutov R.M. "A phosphinic analogue of methionine is a substrate of L-methionine-Y-lyase and induces the synthesis of the enzyme in Citrobacter intermedius cells", Mendeleev Commun., 12(1), 2-3 (2002).

57. Relyea H.A., van der Donk W.A. "Mechanism and applications of phosphite dehydrogenase". Bioorg. Chem., 33(3), 171-189 (2005).

58. Rudenko A.Y., Mariasina S.S., Bolikhova A.K., Nikulin M.V., Ozhiganov R.M., Vasil'ev V.G., Ikhalaynen Y.A., Khandazhinskaya A.L., Khomutov M.A., Sergiev P.V., Khomutov A.R., Polshakov V.I. "Organophosphorus ^-adenosyl-Z-methionine mimetics: synthesis, stability, and substrate properties". Front. Chem., 12, 1448747 (2024).

59. Руденко А.Ю., Марьясина С.С., Сергиев П.В., Польшаков В.И. "Аналоги ^-аденозил-Z-метионина в изучении метилтрансфераз". Молек. биология, 56(2), 296-319 (2022).

60. Lu S.C., Mato J.M. "^-adenosylmethionine in liver health, injury, and cancer". Physiol. Rev., 92(4), 1515-1542. (2012).

61. Giovannercole F., Gafeira Gon9alves L., Armengaud J., Varela Coelho A., Khomutov A., De Biase D. "Integrated multi-omics unveil the impact of Я-phosphinic analogs of glutamate and a-ketoglutarate on Escherichia coli metabolism". J. Biol. Chem., 300(10), 107803 (2024).

62. Khomutov M.A., Giovannercole F., Onillon L., Demiankova M.V., Vasilieva B.F., Salikhov A.I., Kochetkov S.N., Efremenkova O.V., Khomutov A.R., De Biase D. "A desmethylphosphinothricin dipeptide derivative effectively inhibits Escherichia coli and Bacillus subtilis growth". Biomolecules, 13(10), 1451 (2023).

63. Жуков Ю.Н., Вавилова Н.А., Осипова Т.И., Воинова Т.М., Хурс Е.Н., Джавахия В.Г., Хомутов Р.М. "Аминоалкилфосфинаты - новые эффективные ингибиторы меланиногенеза и фунгициды". Докл. Академии наук, 398(5), 696-698 (2004).

64. Zhukov Yu.N., Vavilova N.A., Osipova T.I., Khurs E.N., Dzhavakhiya V.G., Khomutov R.M. "New synthesis and fungicidal activity of the phosphine analogues of serine and threonine", Mendeleev Commun., 15(2), 57-58 (2005).

65. Жуков Ю.Н., Вавилова Н.А., Осипова Т.И., Воинова Т.М., Хурс Е.Н., Джавахия В.Г., Хомутов Р.М. " Фунгицидная активность фосфиновых аналогов аминокислот обмена метионина". Докл. Академии наук, 397(1), 120 (2004).

66. Selvam C., Goudet C., Oueslati N., Pin J.P., Acher FC. "Z-(+)-2-Amino-4-thiophosphonobutyric acid (Z-thioAP4), a new potent agonist of group III metabotropic glutamate receptors: increased distal acidity affords enhanced potency". J. Med. Chem., 50(19), 4656-4664 (2007).

67. Froestl W., Mickel S.J., Hall R.G., von Sprecher G., Strub D., Baumann P.A., Brugger F., Gentsch C., Jaekel J., Olpe H.R., Rihs G., Vassout A., Waldmeier P.C., Bittiger H. "Phosphinic

acid analogues of GABA. 1. New potent and selective GABAB agonists". J. Med. Chem., 38(17), 3297-3312 (1995).

68. Froestl W., Mickel S.J., von Sprecher G., Diel P.J., Hall R.G., Maier L., Strub D., Melillo V., Baumann P.A., Bernasconi R., Gentsch C., Hauser K., Jaekel J., Karlsson G., Klebs K., Maître L., Marescaux C., Pozza M.F., Schmutz M., Steinmann M.W., van Riezen H., Vassout A., Mondadori C., Olpe H.R., Waldmeier P.C., Bittiger H. "Phosphinic acid analogues of GABA. 2. Selective, orally active GABAB antagonists". J. Med. Chem., 38(17), 3313-3331 (1995).

69. Хомутов Р.М., Жуков Ю.Н., Хомутов А.Р., Хурс Е.Н., Крамер Д.Л., Миллер Дж.Т., Портер К.В. "Фосфиновый аналог метионина тормозит рост лейкозных клеток L1210 и превращается в фосфиновый аналог 5-аденозилметионина". Биоорган. Химия, 26(9), 718-720 (2000).

70. Yonaga, T., Akabori Y., Fujino Y. "Acute Toxicity Studies of MP101". Pharmacol. Ther., 10, 43-51 (1982).

71. Хомутов М.А., Формановский А. А., Михура И.В., Вепсалайнен Й., Кочетков С.Н., Биазе Д. Д., Хомутов А.Р. "Удобные методы синтеза фосфиновых аналогов у-аминомасляной и глутаминовой кислот". Биоорган. Химия, 42(6), 741-745 (2016).

72. Сергеев А.В., Тевяшова А.Н., Воробьев А.П., Громова Е.С. "Влияние противоопухолевого антибиотика оливомицина А и нового полусинтетического производного, оливамида, на функционирование ДНК-метилтрансферазы мыши Dnmt3a". Биохимия, 84(2), 229-239 (2019). doi: 10.1134/S0320972519020064

73. Wood R.J., McKelvie J.C., Maynard-Smith M.D., Roach P.L. "A real-time assay for CpG-specific cytosine-C5 methyltransferase activity". Nucleic Acids Res., 38, e107 (2010)

74. Rogers K.S., Yusko S.C. "Sodium dodecyl sulfate inactivation of bovine liver glutamate dehydrogenase". J. Biol. Chem., 244(24), 6690-6695. 1969

75. Lee Y.-H., Ren D., Jeon B., Liu H.-W. "^-Adenosylmethionine: More than just a methyl donor". Nat. Prod. Rep., 40, 1521-1549 (2023).

76. Wijayasinghe Y.S., Blumenthal R.M., Viola R.E. "Producing proficient methyl donors from alternative substrates of ^-adenosylmethionine synthetase". Biochemistry, 53(9), 1521-1526 (2014).

77. Huber T.D., Wang F., Singh S., Johnson B.R., Zhang J., Sunkara M., Van Lanen S.G., Morris A.J., Phillips G.N., Thorson J.S. "Functional AdoMet isosteres resistant to classical AdoMet degradation pathways". ACS Chem. Biol.., 11(9), 2484-2491 (2016).

78. Guo X., Soderholm A., Kanchugal P. S., Isaksen G.V., Warsi O., Eckhard U., Triguis S., Gogoll A., Jerlstrom-Hultqvist J., Âqvist J., Andersson D.I., Selmer M. "Structure and mechanism of a phage-encoded SAM lyase revises catalytic function of enzyme family". eLife, 10, 1-29. (2021)

79. Jia D., Jurkowska R.Z., Zhang X., Jeltsch A., Cheng X. "Structure of Dnmt3a bound to Dnmt3L suggests a model for de novo DNA methylation". Nature. 449(7159), 248-251 (2007).

80. Chen T., Li E. "Structure and function of eukaryotic DNA methyltransferases". Curr. Top. Dev. Biol., 60, 55-89 (2004

81. Gowher H., Jeltsch A. "Molecular enzymology of the catalytic domains of the Dnmt3a and Dnmt3b DNA methyltransferases". J. Biol. Chem., 277(23), 20409-20414 (2002).

82. Jurkowska R.Z., Jurkowski T.P., Jeltsch A. "Structure and function of mammalian DNA methyltransferases". Chembiochem, 12(2), 206-222 (2011)

83. Okano M., Xie S., Li E. "Cloning and characterization of a family of novel mammalian DNA (cytosine-5) methyltransferases". Nat. Genet., 19(3), 219-220 (1998).

84. Сергеев А.В., Кирсанова О.В., Лойко А.Г., Номероцкая Е.И., Громова Е.С. "Определение степени метилирования ДНК метилтрансферазой Dnmt3a с использованием метилзависимых эндонуклеаз рестрикции". Молекуляр. биология, 52(4), 318-325 (2018).

85. Takeshita K, Suetake I, Yamashita E, Suga M, Narita H, Nakagawa A, Tajima S. "Structural insight into maintenance methylation by mouse DNA methyltransferase 1 (Dnmtl)". Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 108(22), 9055-9059 (2011).

86. Song J., Rechkoblit O., Bestor T.H., Patel D.J. "Structure of DNMT1-DNA complex reveals a role for autoinhibition in maintenance DNA methylation". Science, 331(6020), 1036-1040 (2011).

87. Ye F., Kong X., Zhang H., Liu Y., Shao Z., Jin J., Cai Y., Zhang R., Li L., Zhang Y.W., Liu Y.C., Zhang C., Xie W., Yu K., Ding H., Zhao K., Chen S., Jiang H., Baylin S.B., Luo C. "Biochemical Studies and Molecular Dynamic Simulations Reveal the Molecular Basis of Conformational Changes in DNA Methyltransferase-1". ACS Chem. Biol., 13(3), 772-781 (2018).

88. Jensen D., Ruiz Manzano A., Rector M., Tomko E.J., Record M.T., Galburt E.A. "High-throughput, fluorescent-aptamer-based measurements of steady-state transcription rates for the Mycobacterium tuberculosis RNA polymerase". Nucleic Acids Res., 51(19), e99 (2023).

89. Yu J., Xie T., Wang Z., Wang X., Zeng S., Kang Y., Hou T. "DNA methyltransferases: Emerging targets for the discovery of inhibitors as potent anticancer drugs". Drug Discov. Today, 24(12), 2323-2331 (2019).

90. Tajima S, Suetake I, Takeshita K, Nakagawa A, Kimura H. "Domain structure of the Dnmtl, Dnmt3a, and Dnmt3b DNA methyltransferases". Adv. Exp. Med. Boil., 945, 63-86 (2016).

91. Ren W., Gao L., Song J. "Structural Basis of DNMT1 and DNMT3A-Mediated DNA Methylation". Genes (Basel), 9(12), 620 (2018).

92. Espada J. "Non-catalytic functions of DNMT1". Epigenetics, 7(2), 115-118 (2012).

93. Kumar S., Cheng X., Klimasauskas S., Mi S., Posfai J., Roberts R.J., Wilson G.G. The DNA (cytosine-5) methyltransferases. Nucleic Acids Res., 22(1), 1-10 (1994).

94. Jeltsch A., Jurkowska R.Z. "Allosteric control of mammalian DNA methyltransferases—A new regulatory paradigm". Nucleic Acids Res., 44(18), 8556-8575 (2016).

95. Yoo J., Choi S., Medina-Franco J.L. "Molecular modeling studies of the novel inhibitors of DNA methyltransferases SGI-1027 and CBC12: Implications for the mechanism of inhibition of DNMTs". PLoS ONE, 8(4), e62152 (2013).

96. Xie T., Yu J., Fu W., Wang Z., Xu L., Chang S., Wang E., Zhu F., Zeng S., Kang Y., Hou T. "Insight into the selective binding mechanism of DNMT1 and DNMT3A inhibitors: A molecular simulation study". Phys. Chem. Chem. Phys., 21(24), 12931-12947 (2019).

97. Blodgett J.A., Thomas P.M., Li G., Velasquez J.E., van der Donk W.A., Kelleher N.L., Metcalf W.W. "Unusual transformations in the biosynthesis of the antibiotic phosphinothricin tripeptide". Nat. Chem. Biol., 3, 480-485 (2007).

98. Li M., Smith C.J., Walker M.T., Smith T.J. "Novel inhibitors complexed with glutamate dehydrogenase. Allosteric regulation by control of protein dynamics". J. Biol. Chem., 284, 22988-23000 (2009).

99. Schulz A., Taggeselle P., Tripier D., Bartsch K. "Stereospecific production of the herbicide phosphinothricin (glufosinate) by transamination: Isolation and characterization of a phosphinothricin-specific transaminase from Escherichia coli". Appl. Environ. Microbiol., 56, 1-6 (1990).

100. Yin X., Wu J., Yang L. "Efficient reductive amination process for enantioselective synthesis of L-phosphinothricin applying engineered glutamate dehydrogenase". Appl. Microbiol. Biotechnol., 102, 4425-4433 (2018).

101. Stillman T.J., Baker P.J., Britton K.L., Rice D.W. "Conformational flexibility in glutamate dehydrogenase. Role of water in substrate recognition and catalysis". J. Mol. Biol., 234(4), 1131-1139 (1993).

102. Abdel-Hady G.N., Tajima T., Ikeda T., Ishida T., Funabashi H., Kuroda A., Hirota R. "A novel salt- and organic solvent-tolerant phosphite dehydrogenase from Cyanothece sp. ATCC 51142". Front. Bioeng. Biotechnol., 11, 1255582 (2023).

103. Barton J.S., Fisher J.R. "Nonlinear kinetics of glutamate dehydrogenase. Studies with substrates-glutamate and nicotinamide-adenine dinucleotide". Biochemistry. 10, 577-585 (1971).

104. Li M., Li C., Allen A., Stanley C.A., Smith T.J. "Glutamate dehydrogenase: structure, allosteric regulation, and role in insulin homeostasis". Neurochem. Res., 39(3), 433-445 (2014).

105. Sener A., Malaisse W.J. "L-leucine and a nonmetabolized analogue activate pancreatic islet glutamate dehydrogenase". Nature, 288(5787), 187-189 (1980).

106. Tensi, L., Macchioni, A. "Extremely fast NADH-regeneration using phosphonic acid as hydride source and iridium-pyridine-2-sulfonamidate catalysts". ACS Catal., 10, 7945-7949 (2020).