Взаимосвязь азотного и углеродного метаболизма у дрожжей Komagataella phaffii тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Сидорин Антон Витальевич
Сидорин Антон Витальевич
кандидат наук
2026
- Специальность ВАК РФ00.00.00
- Количество страниц 113
Оглавление диссертации кандидат наук Сидорин Антон Витальевич
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Дрожжи как модельный объект биологии
1.2. Дрожжи К. рка^И как объект биотехнологии
1.3. Общее сравнение дрожжей К. рка//И и еегеугзгае
1.4. Регуляция метаболизма углерода у дрожжей
1.4.1. Углеродный метаболизм и его регуляция у дрожжей еегеу1$1ае
1.4.2. Метаболизм метанола его регуляция у дрожжей К. рка//И
1.5. Регуляция метаболизма азота у дрожжей
1.5.1. Метаболизм азота и его регуляция у дрожжей еегеу1$1ае
1.5.2. Регуляция метаболизма азота у дрожжей К. рка//И
1.6. Метаболизм пролина у дрожжей еегеу1$1ае
1.7. Ретроградная регуляция у дрожжей еегеу1$1ае
1.8. Современные представления о комплексной регуляции гена АОХ1 у дрожжей К. рка//И
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1 Штаммы дрожжей и бактерий
2.2 Плазмиды
2.3 Среды и условия культивирования
2.4 Бактериальная трансформация
2.5 Дрожжевая трансформация
2.6 Выделение хромосомной ДНК из дрожжей
2.7 Выделение тотальной РНК из дрожжей
2.8 Внесение делеций в геном дрожжей
2.9 Методы работы с нуклеиновыми кислотами
2.9.1 Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции
2.9.2 Лигирование фрагментов ДНК
2.9.3 Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
2.9.4 Электрофорез ДНК в агарозном геле
2.9.5 Очистка ДНК из агарозного геля или из реакционной смеси
2.9.6 Пробоподготовка и секвенирование 2-го поколения
2.10 Методы работы с репортерной системой
2.10.1 Качественное определение активности кислой фосфатазы
2.10.2 Количественное определение активности кислой фосфатазы
2.11 Анализ дифференциальной экспрессии генов
2.12 Поиск сайтов связывания ТФ в промоторах
2.13 Проведение моделирования связывания белка и лиганда
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1 Анализ дифференциальной экспрессии генов дрожжей К. рка//И при росте на
средах с различными источниками азота
3.1.1 Изменение экспрессии генов, обеспечивающих катаболизм пролина, цикл трикарбоновых кислот и глюконеогенез, в ответ на тип источника азота
3.1.2 Изменение экспрессии генов, обеспечивающих метаболизм метанола и пентозофосфатный путь, в ответ на тип источника азота
3.1.3 Изменение экспрессии генов, продукты которых влияют на функции митохондрий, в ответ на тип источника азота
3.1.4 Изменение экспрессии генов, обеспечивающих метаболизм аминокислот, в
ответ на тип источника азота
3.1.5 Изменение экспрессии генов, кодирующих транспортеры биогенных элементов, в ответ на тип источника азота
3.1.6 Изменение экспрессии генов, кодирующих белки мембраны и клеточной
стенки, в ответ на тип источника азота
3.1.7 Изменение экспрессии генов, кодирующих факторы трансляции, белки рибосомы, шапероны и белки протеасомы, в ответ на тип источника азота
3.1.8 Изменение экспрессии генов, кодирующих факторы Tor-киназы и глюкозной катаболитной репрессии, в ответ на тип источника азота
3.2 Анализ дифференциальной экспрессии генов дрожжей К. рка//И на средах с глутаматом и глутаматом вместе с сульфатом аммония
3.3 Анализ влияния активности промотора гена РиТ1 у дрожжей К. рка//И на среде с метанолом и разными источниками азота
3.4 Анализ роста штаммов дрожжей К. рка//И, содержащих делеции генов РиТ1 и
РиТ2
3.5 Анализ влияния делеции генов РиТ1 и РиТ2 на активность промотора гена АОХ1
на среде с пролином и сульфатом аммония
3.6 Поиск сайтов связывания транскрипционных факторов в промоторах генов метаболизма метанола дрожжей К. pкaffii
3.7 Анализ влияния делеции генов MIG1 и MIG2 на активность промотора гена AOX1
на среде с пролином и пролином вместе с сульфатом аммония
3.8 Анализ влияния делеции гена PUT4.2 на активность промотора гена AOX1 на
среде с пролином и пролином вместе с сульфатом аммония
3.9. Моделирование связывания белка РШ;4.2 с пролином у дрожжей К. pкaffii
3.10 Промоторы генов дрожжей К. pкaffii, которые могут быть использованы в
биотехнологии
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ
ГЛАВА 5. ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ПРИЛОЖЕНИЕ
БЛАГОДАРНОСТИ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ЦТК - цикл трикарбоновых кислот ПЦР - полимеразная цепная реакция
ПЦР-РВ - полимеразная цепная реакция в режиме реального времени
ТФ - транскрипционный фактор
нм - нанометр
об/мин - оборотов в минуту
мг - миллиграмм
мл - миллилитр
мкл - микролитр
мкл/мл - микролитр на миллилитр М - моль мМ - милимоль
пНФФ - паранитрофенилфосфат
ДЭГ - дифференциально экспрессирующиеся гены
п.о. - пар оснований
KAc - ацетат калия
LiAc - ацетат лития
NaAc - ацетат натрия
MOPS - 3-[Ы-Морфолино]пропансульфоновая кислота PPP - пентозофосфатный путь КФ - кислая фосфатаза
Рекомендованный список диссертаций по специальности «Другие cпециальности», 00.00.00 шифр ВАК
Генетический контроль регуляции генов метаболизма метанола у дрожжей Pichia pastoris2016 год, кандидат наук Румянцев Андрей Михайлович
Исследование и инженерия метаболизма сорбитола у дрожжей KOMAGATAELLA KURTZMANII для продукции рекомбинантных ферментов2024 год, кандидат наук Акентьев Филипп Игоревич
Генетический контроль координированной регуляции метаболизма основных биогенных элементов у дрожжей Saccharomyces cerevisiae2006 год, доктор биологических наук Самбук, Елена Викторовна
Разработка штамма-реципиента Komagataella phaffii для конструирования высокоактивных безмаркерных рекомбинантных продуцентов фитазы и β-амилазы2025 год, кандидат наук Ткаченко Артур Александрович
Исследование генетических механизмов корегуляции метаболизма азота и фосфора у дрожжей Saccharomyces cerevisiae2012 год, кандидат биологических наук Савинов, Владимир Александрович
Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Взаимосвязь азотного и углеродного метаболизма у дрожжей Komagataella phaffii»
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность темы исследования. Клетки прокариот и эукариот находятся в постоянной зависимости от условий среды, основной составляющей которой является концентрация различных биогенных элементов. К таким элементам относятся источники углерода, азота, фосфора, витамины, микроэлементы и другие. Чувствительность клеток на изменение состава и концентрации этих питательных веществ в среде является критичной для их жизнеспособности и размножения. Изучение генетических механизмов адаптации клеток к условиям окружающей среды имеет как фундаментальную, так и практическую ценность для биологии.
На модельном объекте генетики, дрожжах Saеекaromyеes еerevisiae, было подробно изучено влияние биогенных элементов не только на процессы ассимиляции и диссимиляции, но и на координированную регуляцию экспрессии генов. Несмотря на подробное изучение генетического контроля метаболизма биогенных элементов у дрожжей еerevisiae, данный вид имеет ряд значимых отличий по сравнению с близкими видами дрожжей Komagataella pkaffii. Метилотрофные дрожжи К. ркаЛ/И являются облигатными аэробами (не переходят на брожение при высоких концентрациях глюкозы), тогда как еerevisiae - факультативными анаэробами. Более того, К. pкaffii, в отличие от еerevisiae, способны использовать метиловый спирт в качестве источника углерода и энергии. У них была обнаружена координированная регуляция экспрессии генов в ответ на различные источники азота и углерода. Изучение контроля координированной регуляции биогенных элементов и его сравнение между разными микроорганизмами позволит расширить понимание закономерностей как в сложных генетических регуляторных сетях, так и в эволюции регуляторных систем.
Кроме этого, дрожжи используются в биотехнологии для синтеза широкого спектра соединений. Дрожжи К. pкaffii являются очень популярным объектом для синтеза рекомбинантных белков. При этом, несмотря на практическую значимость данных дрожжей, координированная регуляция экспрессии генов в ответ на источники азота и углерода у них изучена гораздо хуже, чем у еerevisiae. Исследование регуляции экспрессии генов у К. pкaffii в ответ на различные компоненты культуральной среды позволит увеличить выход целевого продукта и снизить затраты на производство рекомбинантных белков.
Степень разработанности темы. Исследования, проводимые на дрожжах К. рка]]:И, посвящены в первую очередь влиянию источника углерода на экспрессию генов метаболизма метанола. Подробно изучается регуляция гена АОХ1, промотор которого широко используется в биотехнологии [19,20,64,70,75,80,120]. Однако, у данных дрожжей было обнаружено влияние других компонентов культуральной среды на экспрессию генов метаболизма метанола. В частности, влияние источника азота и фосфата [34,35]. В то же время в литературе отсутствуют
данные о том, какие механизмы или ключевые этапы лежат в основе регуляции генов метаболизма метанола (источника углерода) источниками азота.
Цель работы: изучение взаимосвязи метаболизма метанола, пролина и глутамата у дрожжей Komagataella phaffii.
В рамках данной цели были поставлены следующие задачи:
1. С помощью методов транскриптомного анализа оценить влияние пролина как комплексного источника углерода и азота на экспрессию генов дрожжей K. phaffii.
2. Оценить роль основных репрессоров метаболизма углерода в регуляции гена AOX1 пролином.
3. Оценить роль генов РЦТ1 и РЦТ2, кодирующих ферменты катаболизма пролина, в регуляции гена AOX1.
4. Оценить роль генов, обеспечивающих транспорт пролина, в регуляции экспрессии гена AOX1.
Научная новизна работы. В данной работе был впервые выявлен ключевой этап метаболизма пролина у дрожжей K. phaffii, обеспечивающий репрессию генов метаболизма метанола и биогенеза пероксисом. Показано, что пермеаза пролина РШ;4.2 выступает в качестве основного фактора данной регуляции. Впервые были проведены анализ экспрессии генов на уровне транскриптома для пролина и глутамата (как в качестве единственного источника азота, так и в смеси с сульфатом аммония).
Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты, по-лученные в рамках диссертационной работы, расширяют существую-щие теоретические представления о координированной регуляции экспрессии генов у дрожжей K. phafii в ответ на сочетания источников азота и углерода. Ключевым этапом в регуляции генов метаболизма метанола является транспорт пролина в клетку. Обнаруженный транспортер пролина Р^4.2, вовлеченный в регуляцию генов метаболизма метанола, в частности гена AOX1, позволит оптимизировать культуральные среды, а также сконструировать более эффективные штаммы-продуценты дрожжей K. phaffii.
Методология и методы исследования. В ходе выполнения диссертационной работы был использован широкий спектр современных методов генетики, микробиологии и молекулярной биологии. К ним относятся, в частности, методы работы с нуклеиновыми кислотами, бактериальная и дрожжевая трансформация, качественный и количественный анализ активности
репортерной системы. Использованы различные биоинформатические методы и методы статистической обработки полученных результатов. В ходе работы также проводились транскриптомные анализы с использованием методов секвенирования нового поколения.
Степень достоверности и апробация результатов. Основные резуль-таты диссертационной работы были опубликованы в 6 статьях в рецензируемых на-учных изданиях:
1. Rumyantsev A. Transcriptome Analysis Unveils the Effects of Proline on Gene Expression in the Yeast Komagataella phaffii / A. Rumyantsev, A. Sidorin, A. Volkov, O. Al Shanaa, E. Sambuk, M. Padkina // Microorganisms. - 2022. - Vol. 10, № 1. - P. 67.
2. Makeeva A. Specific features of the transcriptomic response to nitrogen starvation in methylotrophic yeast Komagataella phaffii / A. Makeeva, A. Sidorin, V. Ishtuganova, E. Sambuk, M. Padkina, A. Rumyantsev // Biological Communications. - 2024. - Vol. 69, № 4. - P. 214-228.
3. Makeeva A. Alternative PCR-Based Approaches for Generation of Komagataella phaffii Strains / A. Makeeva, D. Muzaev, M. Shubert, T. Ianshina, A. Sidorin, E. Sambuk, A. Rumyantsev, M. Padkina // Microorganisms. - 2023. - Vol. 11, № 9. - P. 2297.
4. Ianshina T. Effect of Methionine on Gene Expression in Komagataella phaffii Cells / T. Ianshina, A. Sidorin, K. Petrova, M. Shubert, A. Makeeva, E. Sambuk, A. Govdi, A. Rumyantsev, M. Padkina // Microorganisms. - 2023. - Vol. 11, № 4. - P. 877.
5. Makeeva A.S. Effect of Biotin Starvation on Gene Expression in Komagataella phaffii Cells / A.S. Makeeva, A.V. Sidorin, V.V. Ishtuganova, M.V. Padkina, A.M. Rumyantsev // Biochemistry (Mosc). - 2023. - Vol. 88, № 9. - P. 1368-1377.
6. Ishtuganova V.V. Effect of Phosphate Starvation on Gene Expression in Komagataella phaffii Cells / V.V. Ishtuganova, A.V. Sidorin, A.S. Makeeva, M.V. Padkina, A.M. Rumyantsev // Microorganisms. - 2024. - Vol. 13, № 1. - P. 39.
Основные научные результаты. В диссертации представлены основные научные результаты исследования в виде публикации трех научных работ, выполненных соискателем в соавторстве:
1. В экспериментальной статье «Transcriptome Analysis Unveils the Effects of Proline on Gene Expression in the Yeast Komagataella phaffii» [123], опубликованной в Microorganisms (Scopus) в соавторстве с Румянцевым А.М., Волковым А.А., Аль Шанаа У., Самбук Е.В. и Падкиной М.В., представлены результаты по анализу влияния аминокислот на экспрессию генов на уровне транскриптома, влияния делеций генов на активность гена AOX1 и влияния активности гена PUT1 у дрожжей K. phaffii.
2. В экспериментальной статье «Specific features of the transcriptomic response to nitrogen starvation in methylotrophic yeast Komagataella phaffii» [106], опубликованной в Biological Communications (Scopus) в соавторстве с Макеевой А.С., Иштугановой В.В., Самбук Е.В., Падкиной М.В. и Румянцевым А.М., представлены результаты по анализу влияния источника азота на экспрессию генов на уровне транскриптома у дрожжей K. phaffii.
3. В экспериментальной статье «Alternative PCR-Based Approaches for Generation of Komagataella phaffii Strains» [13], опубликованной в Microorganisms (Scopus) в соавторстве с Макеевой А.С., Музаевым Д.М., Шуберт М.А., Яньшиной Т.М., Самбук Е.В., Румянцевым А.М., и Падкиной М.В., представлены результаты по получению штаммов дрожжей K. phaffii с использованием перекрывающихся фрагментов.
В первых двух статьях автор внес персональный вклад в виде разработки дизайна исследования, сбора экспериментального материала, статистической обработки полученных данных, подготовки таблиц, анализа, описания результатов и написания текста работы. В третьей статье автор внес вклад в виде проведения анализа и описания результатов.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Пролин поглощается и метаболизируется клетками дрожжей K. phaffii даже при наличии в среде других источников углерода (метанола) и азота (сульфата аммония).
2. Транспорт или детекция пролина является ключевым фактором в регуляции генов метаболизма метанола пролином у дрожжей K. phaffii.
3. Белок Put4.2 является основным фактором, запускающим репрессию генов метаболизма метанола пролином у дрожжей K. phaffii.
Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследования, обсуждения, выводов, списка литературы, содержащего 133 ссылки, и приложения. Работа изложена на 113 страницах, содержит 26 рисунков и 10 таблиц. Приложение к работе содержит 2 таблицы.
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Дрожжи как модельный объект биологии
Дрожжи - одноклеточные эукариотические микроорганизмы. Способность дрожжей к ферментации (спиртовому брожению) позволила использовать их для производства напитков и продуктов питания на протяжении тысячелетий. Самые ранние известные записи о дрожжевом хлебе найдены в Древнем Египте (1300-1500 гг. до н.э.) и в Китае (500-300 гг. до н.э.) [57,98].
В первой половине XX века дрожжи начали вводить в биологию в качестве модельного организма. Исследования стадий жизненного цикла и типов спаривания дрожжей дали возможность проведения гибридологического анализа, что положило начало использованию дрожжей в качестве объекта генетики. В процессе их изучения были получены данные о механизмах рекомбинации ДНК и цитоплазматической наследственности. Леланд (Ли) Хартвелл, работая на дрожжах Saccharomyces cerevisiae, и Пол Нерс, с использованием дрожжей Schizosaccharomyces pombe, выявили гены CDC, лежащие в основе регуляции клеточного цикла. За эти работы Хартвелл и Нерс были удостоены Нобелевской премии (обзор [6]). На сегодняшний день дрожжи S. cerevisiae используются и для изучения механизмов белковой наследственности ([129], обзоры [81,99]).
В Лаборатории биохимической генетики СПбГУ с использованием дрожжей S. cerevisiae были заложены основы изучения координированной регуляции метаболизма основных биогенных элементов. Клетки дрожжей имеют сложную систему регуляторных путей, обеспечивающих специфический ответ на различные компоненты среды. Такая регуляторная сеть контролирует активность не просто отдельных специализированных генов, а целых генных комплексов, кодирующих как различные метаболические пути, так и биогенез клеточных органелл. Так, например, были обнаружены общие элементы в регуляции метаболизма фосфора, углерода и азота [3,33]. Таким образом, дрожжи S. cerevisiae играют ключевую роль в современной биологии как модельный организм. Актуальность данного объекта подтверждается тем, что за XXI век было выдано 3 Нобелевские премии по физиологии и медицине за работы с использованием дрожжей [73].
Дрожжи S. cerevisiae, наряду с такими объектами, как Escherichia coli, S. pombe, Caenorhabditis elegans, Drosophila melanogaster и Mus musculus, являются очень популярными модельными объектами биологии. Однако на сегодняшний день данный список модельных организмов постоянно пополняется. Можно выделить несколько базовых этапов, которые позволяют сконструировать из организма модельный объект генетики. Это выбор организма, введение его в лабораторную культуру, сборка его генома и получение профиля экспрессии его генов, затем разработка молекулярных методов и экспериментальных условий для работы с этим организмом (обзор [51]).
Таким образом, благодаря современным методам молекулярной биологии большинство организмов можно ввести в лабораторную практику, тем самым создав новый модельный объект. Такие методы, как CRISPR-Cas9, малые интерферирующие РНК, вирусные и бактериальные векторы, позволяют проводить работы по изменению генетического материала организма и создавать коллекции новых трансгенных организмов. Одним из самых сложных и значимых этапов является получение профиля генной экспрессии нового модельного объекта. Для решения этой задачи, помимо классических методов, основанных на репортерных системах, ПЦР-РВ и гибридизации, в настоящее время все чаще используются омиксные технологии, в частности, секвенирование РНК (обзор [51]).
Несмотря на то, что создание новых модельных организмов имеет огромную фундаментальную значимость, в современном мире стоимость данных экспериментов оправдывается практической ценностью такого организма. Так, например, дрожжи S. cerevisiae используются в пищевой промышленности, а бактерии E. coli входят в состав человеческого микробиома. К области биологии, непосредственно связанной с практическим применением, относится биотехнология, объектами которой и являются, в частности, микроорганизмы.
С использованием дрожжей проводят синтез различных химических соединений. Среди них алканы [36,38,48,82], лактат [29], малат [62], сукцинат [54], опиоиды [25] и многие другие соединения (обзор [133]).
Отдельную область в биотехнологии занимает синтез рекомбинантных белков. Данный процесс подразумевает встраивание гена-интереса под контроль промоторов организма-продуцента. В качестве таких продуцентов могут выступать бактерии, дрожжи, клеточные линии млекопитающих. Среди систем для синтеза белков именно дрожжи занимают «золотую середину». По сравнению с бактериями дрожжи способны проводить посттрансляционные модификации белков и формировать дисульфидные связи. При этом, в отличие от клеток млекопитающих, дрожжи легче и дешевле адаптировать к промышленному производству рекомбинантных белков (обзоры [14,60,71,83]).
Особое положение при синтезе рекомбинантных белков занимают дрожжи Komagataella phaffii.
1.2. Дрожжи K. phaffii как объект биотехнологии
Метилотрофные дрожжи K. phaffii, ранее известные как Pichia pastoris, впервые были обнаружены в 1969 году [8]. В 1970-х годах их начали использовать в качестве объекта промышленной биотехнологии в качестве источника белка для животных кормов. В 1980 году компания Phillips Petroleum совместно с институтом биотехнологии SIBIA создали первую систему гетерологичной экспрессии на дрожжах K. phaffii [76].
Их преимуществом, среди других биотехнологических дрожжей, является правильная укладка, эффективная секреция и более простая очистка рекомбинантных белков, а также гликозилирование, схожее с клетками млекопитающих (обзоры [77,78]). Важно отметить, что дрожжи K. phaffii применяются не только для производства рекомбинантных белков, но и выступают в качестве клеточной фабрики для синтеза разнообразных химических соединений. В отличие от, например, бактерий E. coli, эти дрожжи демонстрируют более высокую устойчивость к стрессовым условиям. Кроме того, метанол, являющийся для них источником углерода, снижает риск контаминации культуры в процессе ферментации (обзор [77]). Дрожжи K. phaffii также способны достигать высокой плотности клеточной культуры и обеспечивать эффективный синтез рекомбинантных белков. Это обусловлено тем, что они являются облигатными аэробами. То есть, в отличие от дрожжей S. cerevisiae, при избытке глюкозы в среде дрожжи K. phaffii не переходят к брожению (обзор [131]).
Помимо способности обеспечивать укладку и посттрансляционные модификации рекомбинантных белков, в качестве преимуществ K. phaffii следует назвать доступность сильных регулируемых и конститутивных промоторов. Самым популярным конститутивным промотором является промотор гена GAP, кодирующего глицеральдегид 3-фосфатдегидрогеназу. Среди индуцируемых промоторов самым широко используемым является промотор гена AOX1, кодирующего фермент алкогольоксидазу (обзор [97]).
В связи со значимостью дрожжей K. phaffii для биотехнологии, становится важным вопрос эффективности генетических модификаций данного объекта (обзор [28]). Внедрение конструкции, содержащей целевой ген, в геном дрожжей S. cerevisiae обычно осуществляют за счёт гомологичной рекомбинации. Однако, в случае K. phaffii данный подход обладает низкой эффективностью, поскольку у этих дрожжей при репарации разрывов ДНК в первую очередь работает система негомологичного соединения концов (NHEJ) (обзор [11]). В связи с этим в настоящий момент разрабатываются инструменты для редактирования генома дрожжей K. phaffii с использованием системы CRISPR-Cas9 [27,109], что повышает конкурентоспособность и универсальность данных дрожжей в качестве системы для синтеза рекомбинантных белков.
Таким образом, дрожжи K. phaffii постепенно входят в состав новых и перспективных модельных объектов генетики. На сегодняшний день для них разработаны культуральные среды, молекулярные методы для работы с генетическим материалом, собран геном данных дрожжей, а также проводятся исследования по регуляции генов K. phaffii в ответ на тип источника углерода в среде.
1.3. Общее сравнение дрожжей К. phaffii и сегеу1$1ае
Использование новых модельных объектов биологии позволяет не только расширить имеющиеся представления о различных молекулярных процессах, но также открывает возможность проведения эволюционных исследований. До сих пор наиболее изученными модельными дрожжами были еerevisiae.
Несмотря на то, что данные, полученные при исследовании еerevisiae, имеют огромную ценность, они ограничены одним организмом. При этом дрожжи К. pкaffii отделились от еerevisiae порядка 250 миллионов лет назад и, по всей видимости, эволюционировали медленнее, чем еerevisiae. В связи с этим дрожжи К. pкaffii сохранили больше черт, характерных для общих древних предков. Таким образом, сравнение данных, полученных для К. pкaffii, с данными по еerevisiae позволяет не только выявлять различия в регуляции экспрессии генов, но и проводить эволюционные исследования регуляторных систем в целом [61].
Основные отличия в метаболизме и структуре генома между дрожжами К. pкaffii и еerevisiae представлены в таблице 1.
Таблица 1 — Основные отличия между дрожжами К. phaffii и еerevisiae
(модифицировано из [61]).
Свойство cerevisiae К. phaffii
Тип метаболизма Факультативные анаэробы Облигатные аэробы
Эффект Крэбтри Позитивный Негативный
Размер генома 12 Мп.о. 9.4 Мп.о.
Количество хромосом в гаплоидном наборе 16 4
Количество белок-кодирующих генов ~5885 ~5256
Плоидность Плоидность изменяется спонтанно. Дикий тип преимущественно диплоидный Наиболее стабилен в виде вегетативных гаплоидов
Полногеномная дупликация Да Нет
Механизм репарации ДНК В основном гомологичная рекомбинация В основном негомологичное соединение концов
Предпочитаемый источник углерода Глюкоза Глюкоза, глицерин
Требования к минимальной среде Наличие глюкозы Наличие биотина
Оптическая плотность культуры (OD600) ~50 в биореакторе ~500 в ферментере
Гипоксические условия Гликолиз, пентозофосфатный путь и ЦТК не претерпевают значительных изменений Усиление гликолиза и пентозофосфатного пути, снижении активности ЦТК
Гликозилирование Имеется а-1,3-манозилтрансфераза Отсутствует а-1,3-манозилтрансфераза
Ключевым отличием между данными дрожжами является тип метаболизма. Дрожжи K. phaffii являются облигатными аэробами и относятся к «Крэбтри-негативным» (Crabtree negative) дрожжам, тогда как S. cerevisiae являются факультативными анаэробами и относятся к группе «Крэбтри-позитивных» (Crabtree positive) дрожжей [15,111]. Это значит, что при высоких концентрациях глюкозы у S. cerevisiae, в отличие от K. phaffii, происходит ингибирование активности митохондрий, и клетки переходят с аэробного дыхания на брожение. Более того, уникальной среди эукариот особенностью дрожжей K. phaffii является способность использовать метиловый спирт в качестве источника углерода [8].
Несмотря на эти существенные различия в метаболизме, и у S. cerevisiae, и у K. phaffii обнаруживается сложная координированная регуляция метаболических путей в ответ на доступность биогенных элементов. Причем оказывается, что факторы, обеспечивающие данную регуляцию, сходны между этими видами дрожжей. Таким образом, изучение дрожжей K. phaffii позволяет расширить фундаментальные представление о координированной регуляции метаболических путей у микроорганизмов.
1.4. Регуляция метаболизма углерода у дрожжей 1.4.1. Углеродный метаболизм и его регуляция у дрожжей S. cerevisiae
Для дрожжей S. cerevisiae ключевым источником углерода и энергии является глюкоза. Она транспортируется в клетки дрожжей и входит в процессы гликолиза, в результате чего образуются молекулы АТФ и пировиноградная кислота. При этом если эти дрожжи растут на среде с глюкозой, они переходят в состояние брожения. То есть образованная в результате гликолиза пировиноградная кислота метаболизируется в этиловый спирт. Это происходит за счет того, что у клеток S. cerevisiae подавляются процессы глюконеогенеза и ЦТК, а также репрессируются гены, кодирующие метаболизм альтернативных источников углерода. Данный процесс называется глюкозная катаболитная репрессия [132].
Поступление глюкозы в клетку осуществляется транспортерами гексоз Hxt. У S. cerevisiae известно 20 таких транспортеров. Часть из них активируется высокой концентрацией глюкозы (Hxt1), часть - низкой концентрацией (Hxt2, Hxt4) [26,44]. После того, как глюкоза попала в клетку, под действием гексокиназ происходит её фосфорилирование до глюкозо-6-фосфата.
Регуляция генов метаболизма углерода глюкозой осуществляется через Snf1 киназную сигнальную систему [21]. Данный комплекс ингибирован на среде с глюкозой. Если глюкозы нет, комплекс из 3 киназ (Sak1, Tos3 и Elm1) фосфорилируют Snf1, тем самым активируя его [9].
Комплекс Snf1 работает и как активатор, и как репрессор. Подавление Snf1 приводит к дефосфорилированию белка Mig1, что позволяет Mig1 транспортироваться из цитоплазмы в ядро. Там он образует комплекс с белками Ssn6 и Tup1, который связывается с промоторами
генов метаболизма альтернативных источников углерода, репрессируя их. Дефицит глюкозы в среде приводит к активации комплекса Snf1, который фосфорилирует белок Mig1. В результате этого Mig1 остается в цитоплазме, тем самым переставая блокировать транскрипцию генов [105]. Общая схема глюкозной катаболитной репрессии представлена на рисунке 1.
Помимо Mig1, у дрожжей сетеу1$1ае обнаружены еще 2 сходных белка - Mig2 и Mig3. Каждый из них участвует в репрессии разного набора генов, при этом между Mig1 и Mig2 есть и перекрывание мишений для репрессии [24].
Глюкоза
СЛ£-гены МА /„-ген ы
Рисунок 1 — Механизм глюкозной катаболитной репрессии у дрожжей сегеушае (модифицировано из [74]). Глюкоза попадает в клетку с помощью транспортеров Нх^ её фосфорилирование приводит к инактивации (дефосфорилированию) комплекса Snf1. В результате Mig1 также дефосфорилируется и попадает в ядро, обеспечивая репрессию генов альтернативных источников углерода.
Регуляция углеродного метаболизма у дрожжей сетеу1$1ае осуществляется через посттрансляционные модификации комплекса Snf1, основные эффекторы которого - белки Mig. Интересно, что у дрожжей К. рка//И уникальный путь утилизации метанола также оказывается под контролем белков, гомологичных белкам Snf1 и Mig1.
1.4.2. Метаболизм метанола его регуляция у дрожжей K. phaffii
Использование дрожжей K. phaffii в качестве системы для синтеза рекомбинантных белков основано на их способности использовать метиловый спирт в качестве источника углерода и энергии. В биотехнологии применяются промоторы генов, в частности гена AOX1, продукты которых обеспечивают метаболизм метанола. При этом сама способность K. phaffii расти на среде с метанолом невероятно интересна, поскольку в отличие от бактерий, у эукариот она встречается редко. Более того, у K. phaffii и других метилотрофных дрожжей путь метаболизма метанола также отличается от тех, что известны для метилотрофных бактерий [68].
У дрожжей K. phaffii можно выделить 3 этапа утилизации метанола. Первый этап заключается в его окислении до формальдегида с образованием перекиси водорода. В связи с тем, что перекись водорода токсична для клетки, данная реакция осуществляется в специализированных органеллах - пероксисомах. Второй этап состоит из реакций ассимиляции формальдегида, а третий этап - в его диссимиляции. Второй и третий этапы протекают в цитоплазме.
Первый этап окисления метанола до формальдегида осуществляет фермент алкогольоксидаза, кодируемая генами AOX1 и AOX2. Несмотря на то, что эти гены кодируют практически идентичные белки, активность их промоторов существенно различается. Для биотехнологических штаммов K. phaffii выделяют 3 фенотипа по способности расти на среде с метанолом: Mut+, MutS и Mut-. Если в геноме присутствуют функциональные гены AOX1 и AOX2, то K. phaffii хорошо растут на среде с метанолом и демонстрируют фенотип Mut+. Если имеется только ген AOX2, а ген AOX1 специально нарушен, то наблюдается замедленный рост (фенотип MutS). Наконец, отсутствие обоих генов приводит к утрате способности дрожжей расти на среде с метанолом (фенотип Mut-) [41].
Перекись водорода, которая образуется в результате действия алкогольоксидазы, преобразуется в воду и кислород. Данная реакция осуществляется каталазой, которая кодируется геном CAT [102].
В ходе второго этапа образованный формальдегид входит в реакции ассимиляции. Под действием дигидроксиацетонсинтазы, кодируемой генами DAS1 и DAS2, формальдегид конденсируется с ксилулозо-5-фосфатом, что приводит к образованию глицеральдегид-3-фосфата и дигидроксиацетона. Дигидроксиацетонкиназа (ген DAK) фосфорилирует дигидроксиацетон с образованием дигидроксиацетонфосфата. Он вместе с глицеральдегид-3-фосфатом формирует фруктозо-1,6-бисфосфат. Эта реакция осуществляется ферментом фруктозо-1,6-бисфосфат альдолазой (гены FBA1 и FBA2). Далее под действием фруктозо-1,6-бисфосфатазы (ген FBP1) происходит дефосфорилирование полученного продукта до фруктозо-6-фосфата, который входит в пентозофосфатный путь. В результате образуется ксилулозо-5-
Похожие диссертационные работы по специальности «Другие cпециальности», 00.00.00 шифр ВАК
Экспрессия рекомбинантных ферментов фосфолипазы А2 и химозина в метилотрофных дрожжах Pichia pastoris2025 год, кандидат наук Филькин Сергей Юрьевич
Экспрессия рекомбинантных ферментов фосфолипазы А2 и химозина в метилотрофных дрожжах P. pastoris2025 год, кандидат наук Филькин Сергей Юрьевич
Разработка биотехнологии рекомбинантной фосфолипазы А2 Komagataella phaffii2024 год, кандидат наук Бытяк Денис Сергеевич
Исследование роли протеинкиназы Pho85p в регуляции метаболизма дрожжей Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris2002 год, кандидат биологических наук Попова, Юлия Георгиевна
Изучение роли протеинкиназы Pho85p в регуляции функций митохондрий у дрожжей Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris2010 год, кандидат биологических наук Физикова, Анастасия Юрьевна
Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Сидорин Антон Витальевич, 2026 год
Источники углерода Источники азота
Глюкоза Глицерин Метанол Сульфат аммония Пролин Глутамат
MMN - - 0,5% 0,46% - -
ММР - - 0,5% - 0,46% -
MMPN - - 0,5% 0,46% 0,46% -
ММв - - 0,5% - - 0,46%
MMGN - - 0,5% 0,46% - 0,46%
MGN - 1% - 0,46% - -
MGP - 1% - - 0,46% -
MGPN - 1% - 0,46% 0,46% -
MHN 1% - - 0,46% - -
MHP 1% - - - 0,46% -
MHPN 1% - - 0,46% 0,46% -
Кроме источников углерода и азота, данные среды содержали следующие компоненты: 7,34 мМ KH2PO4, 0,95 мМ K2HPO4x2H2O, 4 мМ MgSO4x7H2O, 0,9 мМ СаС12, 1,7 мМ NaCl, а также 400 мкл/мл 2500х раствора витаминов и микроэлементов [5]. Состав растворов витаминов и микроэлементов (на 100 мл исходного раствора, разведение в среде 2500х) представлены в таблице 6.
Таблица 6 — Состав растворов витаминов и микроэлементов 2500х (на 100 мл).
Биотин 3 мг
Пантотенат Ca 300 мг
Фолиевая кислота 300 мг
Витамины Пара-аминобензойная кислота 30 мг
Пиридоксина гидрохлорид 60 мг
Тиамина гидрохлорид 60 мг
Рибофлавин 30 мг
Инозитол 1500 мг
ZnSÜ4 85 мг
Н3ВО4 125 мг
FeCl3 50 мг
Микроэлементы MnSÜ4 100 мг
KI 25 мг
NaMoÜ4 50 мг
CuSÜ4x5H2Ü 11,75 мг
Также была использована полная среда YEPD: 2% глюкоза, 2% пептон, 1% дрожжевой экстракт, 2,4% агар (если среда твердая) [65].
Для работы с бактериальными клетками использовали среду LB: 1% триптон, 0,5% дрожжевой экстракт и 171 мМ NaCl. Для отбора трансформантов для твердых сред добавляли антибиотики зеоцин (20 мкг/мл) и ампициллин (100 мкг/мл). Для подготовки бактериальных компетентных клеток использовали среду TYM: 0,8% триптон, 0,5% дрожжевой экстракт и 85 мМ NaCl [69,107].
2.4 Бактериальная трансформация
Приготовление компетентных клеток и бактериальную трансформацию проводили согласно [107]. Компетентные бактериальные клетки готовили следующим образом: 1 мл культуры E. coli засевали в 100 мл среды TYM и выращивали при комнатной температуре до оптической плотности OD (550 нм) 0,4. Далее центрифугировали клетки при 5000 об/мин в течение 10 минут. Полученный осадок клеток ресуспендировали в 2 мл буфера TfB1 (15%
глицерина, 10 мМ СаСЬ, 100 мМ KCl, 30 мМ KAc и 50 мМ MnCb), после чего инкубировали 40 минут в ледяной бане. Далее клетки центрифугировали при при 5000 об/мин в течение 15 минут. Полученный осадок ресуспендировали в 2 мл буфера TfB2 (15% глицерина, 10 мМ СаСЬ, 10 мМ KCl, 10 мМ MOPS). Полученную суспензию хранили при -70о C.
Трансформацию проводили на полученной суспензии клеток. К 100 мкл компетентных клеток добавляли 10 мкл лигазной смеси. Клетки инкубировали 30 минут при 0о C в ледяной бане, после чего проводили тепловой шок при 42о C в течение 30 секунд. Далее останавливали тепловой шок, помещая клетки обратно в ледяную баню. Затем клетки инкубировали 1 час в 900 мкл жидкой LB при 37о C, после чего высевали на твердую среду с соответствующим антибиотиком.
2.5 Дрожжевая трансформация
Трансформацию дрожжей проводили методом электропорации согласно [50]. Центрифугировали 500 мкл культуры клеток, отбирали остатки среды, добавляли буфер (100 мМ LiAc, 10 мМ ДТТ, 0,6 М сорбитола и 10 мМ трис-HCl pH 7,5) и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 минут. Далее клетки откручивали клетки в течение 3 минут при 4о C и отмывали в 1 М растворе сорбитола (500 мкл). Данную процедуру проводили 3 раза. Затем к клеткам добавляли раствор ДНК и данную смесь переносили в кювету для электропорации. Далее на смесь воздействовали электрическим полем с разницей потенциала 1600 В в течение 5 секунд, после чего добавляли 500 мкл 1 М сорбитола и 500 мкл жидкой YEPD. После этого клетки переносили в пробирку, инкубировали 1 час при 30о C, центрифугировали и отсевали на чашки с твердой YEPD с добавлением антибиотика.
2.6 Выделение хромосомной ДНК из дрожжей
Выделение хромосомной ДНК проводили согласно [46]. Дрожжевую культуру выращивали в жидкой среде YEPD. Далее отбирали 1 мл клеток, центрифугировали 3 минуты и добавляли к клеткам 500 мкл лизирующего буфера (20 мМ ЭДТА рН 8,0, 1% SDS, 50 мМ трис-HCl pH 7,5) и 300 мг стеклянных шариков. В течение 15 минут перемешивали клетки, затем инкубировали их при 70о C. Далее добавляли 20 мкл 5 M KAc и 150 мкл 5 М NaCl, после чего инкубировали клетки 20 минут при 0о C и центрифугировали в течение 20 минут при 12000 об/мин. Надосадочную жидкость 3 раза промывали равным объемом хлороформа. Далее добавляли 1/15 объема 3 М NaAc и 2 суммарных объема 96% этилового спирта. Эту смесь инкубировали 20 минут при -70о C, центрифугировали 15 минут при 12000 об/мин, промывали осадок 70% этиловым спиртом и сушили в испарителе в течение 20 минут. Полученный осадок ДНК растворяли в 20-40 мкл воды.
2.7 Выделение тотальной РНК из дрожжей
Молекулы РНК выделяли при помощи набора RNeasy Mini Kit в буферах и при условиях, предложенных фирмой-производителем (Quiagen, США).
2.8 Внесение делеций в геном дрожжей
Для проведения делеции получали конструкцию, содержащую 5' и 3' область гена, между которых был встроен ген устойчивости к зеоцину. Конструкция была получена методом перекрывающихся фрагментов. Сначала методом ПЦР нарабатывали 5' и 3' области гена-мишени. Праймеры, использованные при ПЦР, содержали перекрывающиеся участки и сайт рестрикции. Далее по полученным фрагментам проводили еще одну ПЦР, в результате которой образуется общий фрагмент вида 3'-X-5', где X - сайт рестрикции. Этот фрагмент лигировали в вектор, содержащий ген устойчивости к зеоцину (плазмида pPICZaA). Полученную плазмиду гидролизовали по сайту рестрикции Х, в результате чего получался линейный фрагмент с геном устойчивости к зеоцину, фланкированным 5' и 3' участками гена. Этим фрагментом проводили электропорацию дрожжей K. phaffii. Общая схема проведения делеций представлена на рисунке 8.
Кроме этого клетки также трансформировали фрагментами, полученными в результате двух этапов ПЦР по такой плазмиде. Один фрагмент содержал 5' область и часть кодирующей области гена устойчивости к зеоцину, другой - 3' область и другую часть гена устойчивости к антибиотику [13].
После трансформации клетки высевли на среду с зеоцином, отбирали и проверяли наличие вставки в геноме методом ПЦР. В этой проверочной ПЦР использовали праймеры, комплементарные участкам генома за пределами места интеграции конструкций, и праймеры к гену устойчивости к зеоцину. Праймеры представлены в таблице 7.
Рисунок 8 — Схема проведения опыта по внесению делеции в геном дрожжей K. phaffi.
Методом ПЦР нарабатывается фрагмент, содержащий 3' и 5' области, затем этот фрагмент клонируется в вектор pPICZaA. Полученная плазмида подвергается гидролизу, в результате чего образуется фрагмент, которым трансформируются дрожжи.
2.9 Методы работы с нуклеиновыми кислотами
2.9.1 Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции
Гидролиз ДНК проводили в буферах и условиях, предложенных фирмами-производителями ферментов (Thermo Fisher Scientific Inc., США и СибЭнзим, Россия). Рестрикционную смесь инкубировали 1 час при 37о C. В работе были использованы эндонуклеаза рестрикции SacI, AvrIl, BamHI, BglII и XhoI.
2.9.2 Лигирование фрагментов ДНК
Лигирование фрагментов ДНК проводили в объеме 30 мкл. К смеси фрагментов ДНК добавляли 3 мкл 10x буфера и 1 ед. лигазы T4 (Thermo Fisher Scientific Inc., США). Реакцию проводили при 4о C в течение ночи.
2.9.3 Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили согласно рекомендациям фирмы-производителя реактивов и ДНК-полимераз Encyclo (Евроген, Россия) в объеме равном 25 мкл.
Программа реакции амплификации состояла из следующих этапов: денатурация ДНК в течение 3 минут при 95о C. Далее амплификация фрагментов в течение 30 циклов. Сначала 30
секунд при 95о С, затем 30 секунд 55о С и потом 72о С (время зависит от размера фрагмента). Наконец, 3 минуты 72о С для завершения синтеза ДНК.
Олигонуклеотиды (праймеры), использованные в работе, представлены в таблице 7.
Таблица 7 — Олигонуклеотиды, используемые в работе.
Название Последовательность Применение
РРЦП^ас1 5'-ЛТТЛСЛОЛОСТСТЛСОСЛТСТОСТЛТО вЛ-3' Получение промотора гена ^РиТ1
ррцп^ 5' -ОЛЛТЛЛЛСЛЛСЛОЛТТТЛЛЛСЛТТТЛТ ОЛСТОТЛТТЛСТОЛОТЛЛТЛЛЛ-3' Получение промотора гена ^РиТ1
РН05-Р 5'-ЛТОТТТЛЛЛТСТОТТОТТТЛТТСЛЛ-3' Получение кодирующей области гена ScPHO5
РН05^-АУГП 5'-ЛТТЛСЛССТЛООЛЛЛЛСТЛТТОТСТСЛ ЛТЛОЛСТОв-З' Получение кодирующей области гена ScPHO5
КрРЦГ4.2^ 5'-СТСОЛОСССЛТЛСЛСТТОТСОТЛЛЛСТ- 3' Получение 5' области гена РиТ4.2
КрРЦГ4.2^ 5'-ОЛЛТООЛТСССЛОТСЛОЛТСЛТТЛЛЛЛ вССЛ-3' Получение 5' области гена РиТ4.2
КрРЦГ4.2^ 5' -СТОООЛТССЛТТССТЛЛООТСОСТТСЛ ТС-3' Получение 3' области гена РиТ4.2
KpPUT4.2-3R 5'-СТСОЛОСТЛСООЛОООЛЛЛОЛЛЛОЛС- 3' Получение 3' области гена РиТ4.2
testKpPUT4.2-3 5'-ЛОЛТСЛЛСТООЛТСОТСЛЛС-3' Проверка встраивания фрагмента в геном
5Г_РиП 5'-ТСОТЛЛЛОСТСОЛООТОТТСЛТООЛОО ТвТТТТС-3' Получение 5' области гена РиТ1
5Я_РиП 5'-ЛТТЛСЛООЛТССССТССТЛОЛОЛТЛЛО СССЛТ-3' Получение 5' области гена РиТ1
3Г_РиП 5'-ЛТТЛСЛООЛТСССОЛОТТОСТССТТТТ ОТТО-3' Получение 3' области гена РиТ1
3Я_РиП 5'-ЛТОЛЛСЛССТСОЛОСТТТЛСОЛСТССС ЛТТЛССЛ-3' Получение 3' области гена РиТ1
Тез^РиЙ 5'-ССЛТСЛЛЛОЛОЛОСЛСЛОЛО-3' Проверка встраивания фрагмента в геном
Те81_3_РиЙ 5'-ТТСТОЛОТЛТОЛОТССОЛОТ-3' Проверка встраивания фрагмента в геном
Таблица 7 (продолжение) — Олигонуклеотиды, используемые в работе.
Название Последовательность Применение
5F_Put2 5'-ATCAATCGCTCGAGGTTTGCTTCTTCTC TTCGTG-3' Получение 5' области гена PUT2
5R_Put2 5'-ATTACAGGATCCAGTTCTCCAAAAGTC ACCTC-3' Получение 5' области гена PUT2
3F_Put2 5'-ATTACAGGATCCGTCATTCACCAGCAG TCTTA-3' Получение 3' области гена PUT2
3R_Put2 5'-AGCAAACCTCGAGCGATTGATTGAGA GAGCTGA-3' Получение 3' области гена PUT2
Test_Put2 5'-TGAAGAGTTTACGGTGACAG-3' Проверка встраивания фрагмента в геном
Test_3_Put2 5'-CCGCTCTTCTAAATACACGA-3' Проверка встраивания фрагмента в геном
5F_Mig1 5' -GCAAAGATTCTC GAGC TAGCCGGAAG AATAGGAAAG-3' Получение 5' области гена MIG1
5R_Mig1 5'-ATTACAGGATCCGGTGTTCAGTTTACA GGGAA-3' Получение 5' области гена MIG1
3F_Mig1 5' -ATTACAGGATCCAGCAGCAATCTAAGG GTAAC-3' Получение 3' области гена MIG1
3R_Mig1 5' -CGGCTAGCTCGAGAATCTTTGCACGGG ATGG-3' Получение 3' области гена MIG1
Test_Mig1 5'-CCAACGAGAAAACCATAACG-3' Проверка встраивания фрагмента в геном
Test_3_Mig1 5'-CGCAATTATTGTTCGTCCAA-3' Проверка встраивания фрагмента в геном
5F_Mig2 5'-GCAATATCCTCGAGTATACGACCACTA AAAGCCG-3' Получение 5' области гена MIG2
5R_Mig2 5'-ATTACAGGATCCACATGGGGCACTGGT AG-3' Получение 5' области гена MIG2
3F_Mig2 5'-ATTACAGGATCCCTCCAAGCAGTAATA GCCTG-3' Получение 3' области гена MIG2
3R_Mig2 5'-GTCGTATACTCGAGGATATTGCCTATC GTGAAGTTG-3' Получение 3' области гена MIG2
Таблица 7 (продолжение) — Олигонуклеотиды, используемые в работе.
Название Последовательность Применение
Test_Mig2 5'-GTGAGACCGAAGAGTTCAG-3' Проверка встраивания фрагмента в геном
Test_3_Mig2 5' -AACATGACTGACTATCACGG-3' Проверка встраивания фрагмента в геном
ZeoUp 5'-CGGAAGTTCGTGGACAC-3' Проверка встраивания фрагмента в геном
ZeoDown 5'-AGTTGACCAGTGCCGTTC-3' Проверка встраивания фрагмента в геном
2.9.4 Электрофорез ДНК в агарозном геле
Электрофорез фрагментов ДНК проводили по [4]. В 0,7% агарозном геле и в буфере ТАЕ (40 мМ трис-НС1, 40 мМ ледяной уксусной кислоты, 0,5 М ЭДТА рН 8,0). Для окрашивания фрагментов в геле добавляли 2 мкл раствора бромистого этидия на 50 мл раствора агарозного геля. Электрофорез проводили при напряжённости электрического поля 5-7 В/см. В качестве маркера длин нуклеотидов использовали маркер 1 kb DNA Ladder (Евроген, Россия).
2.9.5 Очистка ДНК из агарозного геля или из реакционной смеси
Выделение и очистку фрагментов ДНК из агарозного геля и из реакционной смеси проводили при помощи набора Cleanup Standard согласно рекомендациям фирмы-производителя (Евроген, Россия).
2.9.6 Пробоподготовка и секвенирование 2-го поколения
В экспериментах использовали три биологических повторности для каждой из сред. На первом этапе клетки штамма Х33 дрожжей K. phaffii выращивались на среде с глицерином в качестве источника углерода (MGN). Через 48 часов биомассу клеток переносили на опытные среды с метанолом и пролином (MMP), с метанолом, сульфатом аммония и пролином (MMPN), с метанолом и глутаматом (MMG) и с метанолом, сульфатом аммония и глутаматом (MMGN). В качестве контроля использовали среду с метанолом и сульфатом аммония (MMN).
Через 12 часов из клеток, растущих на данных средах, выделяли молекулы РНК и проводили обработку ДНКазой. Качество тотальной мРНК было проверено методом горизонтального гель-электрофореза. С использованием наборов TruSeq mRNA Stranded (Illumina, США) и QuantSeq 3' mRNA-Seq (Lexogen, США) в полученных образцах проводили обогащение по поли(А+) фракции, а затем синтезировали кДНК с рассеянной затравки. В
результате кДНК была использована для подготовки библиотек, совместимых с технологией секвенирования Illumina (модель MiSeq, США). Качество полученных библиотек было проверено с помощью Fragment Analyzer. Далее библиотеки были отсеквенированы на приборе Illumina (длина прочтений - 300 п.о. с одной стороны фрагментов) компанией Евроген. Файлы в формате FASTQ были получены с помощью программы bcl2fastq v2.20 Conversion Software (Illumina). Формат записи строки данных о качестве - Phred 33.
Транскриптомный анализ был проведен в 3 запуска. Первый анализ и запуск секвенирования был проведен для клеток, растущих на среде с пролином (MMP) и сульфатом аммония (MMN). Второй - для клеток, растущих на среде с пролином и сульфатом аммония (MMPN), глутаматом и сульфатом аммония (MMGN) и сульфатом аммония (MMN). Третий - для клеток, на среде с глутаматом (MMG) и сульфатом аммония (MMN). Количество полученных прочтений приведено в таблице 8.
Таблица 8 — Количество прочтений, полученных при секвенировании РНК.
Номер запуска Образец Среда Количество прочтений
1 N1 MMN 449 310
1 N2 MMN 569 501
1 N3 MMN 831 178
1 P1 MMP 432 625
1 P2 MMP 487 735
1 P3 MMP 648 008
2 N1 MMN 881 205
2 N2 MMN 804 645
2 N3 MMN 663 149
2 PN1 MMPN 796 110
2 PN2 MMPN 637 064
2 PN3 MMPN 747 565
2 GN1 MMGN 828 372
2 GN2 MMGN 588 061
2 GN3 MMGN 745 113
Таблица 8 (продолжение) — Количество прочтений, полученных при секвенировании РНК.
Номер запуска Образец Среда Количество прочтений
3 N1 MMN 823 388
3 N2 MMN 572 648
3 N3 MMN 593 758
3 G1 MMG 663 546
3 G2 MMG 805 737
3 G3 MMG 654 977
2.10 Методы работы с репортерной системой
2.10.1 Качественное определение активности кислой фосфатазы
Качественное определение активности КФ проводили по [1]. На поверхность среды с клетками дрожжей, содержащих репортерный ген кислой фосфатазы РН05, помещали бумажный фильтр, пропитанный раствором а-нафтилфосфата и синего прочного Б (2 мг на 1 мл 0,1 М натрий-цитратного буфера рН 4,5). Через 10-15 минут проводили оценку интенсивности окрашивания клеток дрожжей.
2.10.2 Количественное определение активности кислой фосфатазы
Количественное определение активности КФ проводили по [2]. К 100 мкл культуры дрожжей, содержащих репортерный ген кислой фосфатазы РН05, добавляли 800 мкл 0,1 М натрий-цитратного буфера с рН 4,5 и 100 мкл 0,15 М раствора паранитрофенилфосфата (пНФФ). Данную смесь инкубировали в течение 20 минут при 30о С. В ходе этого процесса клетки синтезируют кислую фосфатазу, ген которой находится под контролем интересующего промотора. В результате этого кислая фосфатаза осуществляет реакцию отщепление фосфатной группы от пНФФ с образованием паранитрофенола, которые имеет максимум поглощения при длине волны 410 нм.
После инкубации добавляли 500 мкл 1 М раствора №ОН для остановки реакции. Далее измеряли оптическую плотность образца при OD 410 нм и клеточной культуры при OD 600 нм. Удельную активность кислой фосфатазы рассчитывали как отношение оптической плотности смеси после реакции к плотности культуры клеток. Для каждого образца использовали по 4 биологических повторности. Статистический анализ критерия Вилкоксона был проведен с использованием языка программирования R (версия 3.6.3)
2.11 Анализ дифференциальной экспрессии генов
После получения прочтений после секвенирования, проводили оценку их качества программой FastQC (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/). Далее при помощи программы Trimmomatic [125] очищали прочтения от адаптерных последовательностей и фильтровали их по качеству. Прочтения, прошедшие проверку, выравнивали на референсный геном дрожжей K. phaffii (ASM2700v1). Последовательность и аннотацию референсного генома брали из базы данных NCBI.
Выравнивание прочтений на геном дрожжей проводил при помощи программы hisat-2 [45] со стандартными параметрами. Подсчет полученных выровненных прочтений проводили с помощью программы featureCounts [40]. В результате получили таблицу с количеством выровненных прочтений на гены.
На основе полученной таблицы провели статистический анализ дифференциальной экспрессии генов с использованием языка программирования R (версия 3.6.3) и пакета DESeq2 (версия 1.24.0) [30]. В дальнейший анализ взяли дифференциально экспрессирующиеся гены (ДЭГ), значение скорректированного p-value которых было меньше 0,05, а значения логарифма изменения количества экспрессии (log2FoldChange) больше 0,5 или меньше -0,5. Полученные ДЭГ проанализировали и сгруппировали по функциям.
Результаты представлены в таблице П1 Приложения.
2.12 Поиск сайтов связывания ТФ в промоторах
Поиск известных сайтов связывания в промоторах генов проводили при помощи языка программирования Python (версия 3.10.8), библиотеки Biopython (версия 1.85) [17] и библиотеки pyjaspar (версия 3.0.0). Последовательности промоторов длинной 500 п.о. были получены из генома дрожжей K. phaffii (ASM2700v1). Сайты связывания транскрипционных факторов дрожжей S. cerevisiae были взяты из базы данных JASPAR [58].
Оценку статистической значимости обнаруженных сайтов проводили с использованием точного теста Фишера. В 10000 случайных последовательностях длинной 500 п.о. провели поиск обнаруженных сайтов связывания. В результате этого для каждого сайта была получена таблица сопряженности формата «количество промоторов с искомым сайтом», «количество промоторов без искомого сайта», «количество случайных последовательностей с искомым сайтом» и «количество случайных последовательностей без искомого сайта».
К полученным в результате статистической обработки данным применили поправку Бенджамини-Хохберга на множественное сравнение. В дальнейшем анализе использовали те сайты связывания, скорректированное значение p-value которых было меньше 0,05.
Результаты представлены в таблице П2 Приложения.
2.13 Проведение моделирования связывания белка и лиганда
Химическая структура пролина была взята из базы данных RCSB (https://www.rcsb.org/ligand/pro). Структура белка Put4.2 дрожжей K. phaffii - из базы данных UniProt (https://www.uniprot.Org/uniprotkb/F2QSD1/entry#structure).
Моделирование связывания пролина с белком Put4.2 проводили в веб-версии утилиты SwissDock (https://www.swissdock.ch/; [108]) методом Attracting Cavities [16]. Настройки поиска использовали следующие: box center: 1, -2, -4; box size: 16, 16, 19; RIC - 4.
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1 Анализ дифференциальной экспрессии генов дрожжей K. phaffii при росте на средах с
различными источниками азота
Дрожжи K. phaffii способны использовать пролин как единственный источник углерода, азота и энергии. Более того, у дрожжей K. phaffii пролин вовлечен в репрессию генов метаболизма метанола. Для того, чтобы оценить влияние пролина на экспрессию генов дрожжей K. phaffii, в данной работе был проведен транскриптомный анализ. Были использованы среды, содержащие метанол в качестве источника углерода и пролин, глутамат и сульфат аммония в качестве источников азота [123].
Использование этих сред позволяет нам выявить позитивное или негативное влияние пролина на экспрессию генов дрожжей K. phaffii.
При сравнении экспрессии генов на среды с пролином в качестве единственного источника азота со средой с сульфатом аммония выявляем гены, экспрессия которых возрастает на пролине. Тогда как сравнение экспрессии генов на среде со смесью пролина и сульфата аммония позволяет нам выявить гены, активность которых подавляется пролином или не реагирует на него.
Выявление дифференциально экспрессирующихся генов (ДЭГ) при росте на среде со смесью пролина и сульфата аммония (опыт, MMPN) и контрольной средой (MMN) позволило понять, как клетки реагируют на пролин, если в среде есть другой, предпочтительный источник азота, например сульфат аммония.
Каждый из экспериментов состоял из двух этапов культивирования. Клетки выращивали на среде с глицерином и сульфатом аммония (MGN) для наработки биомассы. После этого клетки переносили в среды с метанолом и сульфатом аммония (контроль, MMN), метанолом и пролином (опыт, MMP), а также с метанолом, сульфатом аммония и пролином (опыт, MMPN). После 12 часов культивирования выделяли РНК и готовили библиотеки для проведения РНК секвенирования. В результате получили данные о генах, экспрессия которых меняется при добавлении в среду пролина [123]. Схема эксперимента представлена на рисунке 9.
Рисунок 9 — Схема проведения транскриптомного анализа дрожжей K. phaffii в средах с пролином. Биомассу клеток нарабатывали в среде с глицерином (MGN), затем пересевали на среды с метанолом и пролином (MMP), пролином с сульфатом аммония (MMPN) и просто сульфатом аммония (MMN). Выделяли тотальную РНК, которую отдавали на секвенирование. Полученные данные анализировали при помощи представленных программ.
При сравнении экспрессии генов на средах с метанолом и пролином и метанолом и сульфатом аммония (MMP / MMN) было выявлено 929 дифференциально экспрессирующихся гена (ДЭГ), что составляет около 18% от всех белок-кодирующих генов дрожжей K. phaffii. Из них 554 гена были активированы, а 375 генов подавлены на среде, содержащей пролин.
В эксперименте, где в качестве источников азота использовали пролин или смесь пролина и сульфата аммония (MMPN / MMN) было выявлено 425 генов, экспрессия которых изменялась при добавлении пролина в среду. Из них 108 генов были активированы, а 317 - репрессированы.
При сравнении данных этих экспериментов оказывается, что общее пересечение ДЭГ - 224 гена. Среди активирующихся генов 69 общие для обоих экспериментов, 485 активируются только при росте в среде с пролином и 39 активируются только в среде со смесью пролина и сульфата аммония. На обеих типах сред было репрессировано 127 генов, на среде с пролином - 248 генов, а на среде с пролином и сульфатом аммония - 190 (рисунок 10).
Дифференциально экспрессирующиеся гены, полученные в ходе транскриптомного анализа, были сгруппированы по функциональным группам.
Таким образом, показано, что пролин независимо от сульфата аммония активирует экспрессию 69 генов, тогда как 127 генов репрессируются пролином. Есть достаточно большая группа генов, экспрессия которых зависит и от пролина, и от сульфата аммония.
Рисунок 10 — Диаграммы Венна для ДЭГ, выявленных в транскриптомных экспериментах с пролином. Первый эксперимент обозначен как Pro - сравнение сред MMP / MMN. Второй эксперимент обозначен как ProNH4 - сравнение сред MMPN / MMN.
3.1.1 Изменение экспрессии генов, обеспечивающих катаболизм пролина, цикл трикарбоновых кислот и глюконеогенез, в ответ на тип источника азота
Дрожжи К. phaffii способны использовать пролин и как источник азота, и как источник углерода [18]. Пролин поступает в клетку, окисляется до глутамата, которые конвертируется в а-кетоглутарат и, после цикла трикарбоновых кислот (ЦТК), его углеродная часть вовлекается в глюконеогенез.
В ходе работы в первую очередь были рассмотрены гены, продукты которых участвуют в катаболизме пролина. И на среде с пролином, и на среде со смесью пролина и сульфата аммония были активированы гены KpPUT4.2 (PAS_chr2-1_0659), KpPUT1 (PAS_chr1-3_0269), КрРШ2 (PAS_chr2-2_0496), а также KpGDH2 (PAS_chr2-1_0311). Ген KpPUT4.2 кодирует пермеазу пролина, гены KpPUT1 и KpPUT2 кодируют, соответственно, ферменты пролиноксидазу и пирролин-карбоксилатдегидрогенезу, окисляющие пролин до глутамата, а ген KpGDH2 кодирует глутаматдегидрогеназу - фермент, обеспечивающей деградацию глутамата до а-кетоглутарата. То есть у дрожжей K. phaffii наличие сульфата аммония в среде не подавляет экспрессию генов катаболизма пролина. Известно, что у дрожжей & cerevisiae при росте на средах с глюкозой и сульфатом аммония запускаются процессы азотной катаболитной репрессии, которые блокируют экспрессию генов PUT1, PUT2, PUT4 и препятствуют утилизации пролина как источника азота [43,94] (рисунок 11).
Гены кодирующие ферменты ЦТК реагируют на пролин по-разному. Когда пролин является единственным источником азота, происходит увеличение экспрессии ряда генов, кодирующих ферменты ЦТК. Среди них гены изоцитратдегидрогеназы KpIDH1 (PAS_chr4_0580) и КрЮН2 (PAS_chr2-1_0120), а-кетоглутаратдегидрогеназы KpKGD1 (PAS_chr2-1_0089), дигидролипоил транссукцинилазы KpKGD2 (PAS_chr1-3_0094), сукцинил-КоА лигазы KpLSC2 (PAS_chr2-
2_0407) и малик-фермента KpMAEl (PAS_chr3_0181). При этом на среде с пролином и сульфатом аммония экспрессия данных генов не менялась.
Гены аконитазы KpACOl (PAS_chr1-3_0104) и малатдегидрогеназы KpMDHl (PAS_chr4_0815) были репрессированы в обоих экспериментах. При росте клеток на среде с пролином и сульфатом аммония также снижалась экспрессия генов цитратсинтазы KpCIT1 (PAS_chr1-1_0475), малатдегидрогеназы KpMDH2 (PAS_chr2-1_0238), а также гена одной из субъединиц сукцинатдегидрогеназы KpSDH2 (PAS_chr3_1111) (рисунок 11).
На среде с пролином были активированы гены GAD1 (PAS_chr3_0965), UGA1.2 (PAS_chr2-1_0107) и UGA2 (PAS_chr1-3_0024), продукты которых обеспечивают альтернативный путь, связывающий ЦТК и первые этапы метаболизма пролина через гамма-аминомасляную кислоту (ГАБА-шунт). На среде с пролином и сульфатом аммония увеличивалась экспрессия только гена UGA2 (рисунок 11).
В случае экспрессии генов, кодирующих ферменты гликолиза и глюконеогенеза, при росте на среде с пролином (MMP / MMN) наблюдается активация генов KpPGI1 (PAS_chr3_0456, фермент фосфоглюкозоизомераза), KpENO1 (PAS_chr3_0082, фермент енолаза), KpPFK1 (PAS_chr2-1_0402, фермент фосфофруктокиназа), KpGPM1 (PAS_chr3_0826, фермент фосфоглицератмутаза), KpPGK1 (PAS_chr1-4_0292, фермент фосфоглицераткиназа), KpTDH1 (PAS_chr2-1_0437, фермент глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа) и KpPCK1 (PAS_FragB_0061, фермент фосфоенолпируваткарбоксикиназа). При росте клеток на среде с пролином и сульфатом аммония (MMPN / MMN) экспрессия генов KpPGI1, KpENO1 и KpPFK1 не меняется, а генов KpGPM1, KpPGK1, KpTDH1 и KpPCK1 снижается по сравнению с уровнем экспрессии при ростом на среде с сульфатом аммония (рисунок 11). Это свидетельствует об их сложной регуляции как источниками азота, так и источниками углерода.
Рисунок 11 — Схема путей катаболизма пролина и углеродного метаболизма у дрожжей (основано на данных для дрожжей S. cerevisiae). Красным цветом отмечены ДЭГ, репрессированные по сравнению с контрольной средой с сульфатом аммония. Зеленым цветом -активированные ДЭГ. P - сравнение среды с пролином и контроля - среды с сульфатом аммония (MMP / MMN), PN - сравнение среды с пролином и сульфатом аммония контроля - среды с сульфатом аммония (MMPN / MMN).
Можно предположить, что у K. phaffii экспрессия генов, кодирующих транспорт и окисление пролина осуществляется независимо от наличия сульфата аммония. Даже при его наличии в среде происходит активация экспрессии генов PUT4, PUT1 и PUT2. При этом экспрессия генов ЦТК, гликолиза и глюконеогенеза отличается в случае, когда пролин является единственным источником азота и когда вместе с пролином в среде присутствует сульфат аммония.
3.1.2 Изменение экспрессии генов, обеспечивающих метаболизм метанола и пентозофосфатный путь, в ответ на тип источника азота
При изучении влияния источника азота на экспрессию генов метаболизма метанола было показано, что когда пролин является единственным источником азота в среде, в клетках происходит репрессия практически всех MUT-генов, продукты которых участвуют в процессе ассимиляции и диссимиляции метанола (AOX1, AOX2, FLD1, FGШ, FDH1, DAS1, DAS2, DAK1, TPI1, FBA1, FBA2, FBP1). Кроме этого, снижается уровень мРНК генов, вовлеченных в биогенез пероксисом (PEX1, PEX5, PEX6, PEX11, PEX12, PEX13, PEX14), и генов CAT1, SOD1 и PMP20,
участвующих в ответе на защиту клетки от активных форм кислорода (ROS). При росте клеток на среде с пролином и сульфатом аммония все эти гены также подавлены (рисунок 12).
В случае экспрессии генов, вовлеченных в PPP (пентозофосфатный путь), только ген ZWF1 (PAS_chr2-1_0308), продукт которого обеспечивает первый этап PPP, был репрессирован на среде с пролином и сульфатом аммония, тогда как на среде с пролином экспрессия данного гена не меняется. Гены KpRKIl.1 и KpRKI1.2 (PAS_chr4_0212 и PAS_chr4_0213, соответственно), продукты которых осуществляет взаимное превращение рибозы-5-фосфат и рибулозы-5-фосфат, были репрессированы в обоих экспериментах. Ген TLK1 (PAS_chr1-4_0150) активируется, а TAL2 (PAS_chr2-2_0338) подавляется также в обоих экспериментах (рисунок 12).
Рисунок 12 — Схема метаболизма метанола у дрожжей K. phaffii. Красным цветом отмечены ДЭГ, репрессированные по сравнению с контрольной средой с сульфатом аммония. Зеленым цветом - активированные ДЭГ. P - сравнение среды с пролином и контроля - среды с сульфатом аммония (MMP / MMN), PN - сравнение среды с пролином и сульфатом аммония контроля -среды с сульфатом аммония (MMPN / MMN).
Таким образом, наличие пролина в среде обеспечивает репрессию всех МиТ-генов. Это подтверждается данными, полученными ранее для отдельных МиТ-генов с помощью репортерных систем и ПЦР-РВ [34,35]. Важно отметить, что пролин репрессирует гены метаболизма метанола независимо от наличия другого источника азота, особенно такого богатого источника азота как сульфата аммония. То есть само его наличие в среде не только активирует экспрессию генов, кодирующих процессы его транспорта и окисления, но и
обеспечивает репрессию MUT-генов. Возможно, пролин используется клеткой как более предпочтительный источник углерода.
3.1.3 Изменение экспрессии генов, продукты которых влияют на функции митохондрий, в
ответ на тип источника азота
И окисление пролина, и реакции ЦТК протекают в митохондриях. У дрожжей S. cerevisiae на среде с глюкозой функции митохондрий подавлены. Дрожжи K. phaffii являются облигатными аэробами. В связи с этим были изучены изменения экспрессии генов, продукты которых связаны с функциями митохондрий.
Согласно данным, полученным на среде с пролином (MMP / MMN), а также с пролином и сульфатом аммония (MMPN / MMN), было выявлено снижение активности ряда генов, которые кодируют белки электрон-транспортной цепи. Происходит репрессия генов НАД-дегидрогеназы KpNDE1 (PAS_chr1-4_0299), НАД-транспортера KpYIA6 (PAS_chr3_0099), цитохром-C пероксидазы KpCCP1 (PAS_chr2-2_0127), субъединиц цитохром-C оксидазы KpCOX8 (PAS_chr2-2_0266) и KpCOX9 (PAS_chr2-2_0265), а также гена KpINH1 (PAS_chr1-1_0315), продукт которого ингибирует гидролиз АТФ.
Более того, на среде с пролином и сульфатом аммония также были подавлены гены бета-субъединицы F1 сектора АТФ-синтазы KpATP2 (PAS_chr2-2_0165), изоформы цитохрома-C KpCYC1 (PAS_chr4_0018), АТФазы KpSSC1 (PAS_chr3_0365) и АДФ/АТФ-транслоказы KpPET9 (PAS_chr4_0210). На этой среде были также репрессированы гены, связанные с митохондриальным транспортом. Среди них гены транспортера аминокислот KpAGC1 (PAS_chr3_0434), митохондриального порина KpPOR1 (PAS_chr2-2_0392) и транспортера белков KpTAM41 (PAS_chr1-4_0202). На среде с пролином и сульфатом аммония была снижена экспрессия генов KpNFU1 (PAS_chr1-4_0109), продукт которого вовлечен в метаболизм железа, и митохондриального шаперонина KpHSP60 (PAS_chr4_0158).
Таким образом, наличие пролина в среде подавляет активность ряда генов K. phaffii, кодирующих белки электрон-транспортной цепи. Для выявления конкретного механизма, обеспечивающего данную регуляцию, необходимы дальнейшие исследования.
3.1.4 Изменение экспрессии генов, обеспечивающих метаболизм аминокислот, в ответ на
тип источника азота
Для дрожжей S. cerevisiae известно, что ядром метаболизма азота, а также мостом между азотным и углеродным метаболизмами является взаимное превращение а-кетоглутарата в глутамат и глутамата в глутамин. Также известно, что пролин окисляется до глутамата. В связи с этим мы рассмотрели гены, продукты которых вовлечены в метаболизм аминокислот.
Как отмечали ранее, окисление пролина до глутамата происходит за счет работы ферментов пролиноксидазы и пирролин-карбоксилатдегидрогенезы, кодируемых генами PUT1 и PUT2, соответственно. При росте клеток и на среде с пролином, и на среде с пролином и сульфатомом аммония был активирован ген глутаматдегидрогеназы KpGDH2 и репрессирован ген глутаматсинтазы (ГОГАТ) KpGLT1. При этом гены глутаминсинтетазы KpGLN1 (PAS_chr4_0785) и глутаматдегидрогеназы KpGDH1 (PAS_chr1-1_0107) были подавлены только на среде со смесью пролина и сульфата аммония (рисунок 13).
При росте клеток на среде с пролином (MMP / MMN), в отличие от среды со смесью пролина и сульфата аммония (MMPN / MMN), активируются практически все гены, продукты которых вовлечены в метаболизма аргинина и цикла мочевины. Среди них гены орнитин трансаминазы KpCAR2 (PAS_chr3_0410), аргининосукцинат синтетазы KpARG1 (PAS_chr3_0216), малой (KpCPA1, PAS_chr4_0138) и большой (KpCPA2, PAS_chr3_0799) субъединиц карбамоилфосфат синтетазы, ацетилорнитин аминотрансферазы KpARG8 (PAS_chr4_0645), ацетилглутамат киназы KpARG56 (PAS_chr2-1_0168), транспортера орнитина KpYMC1 (PAS_chr2-1_0530) и аргиносукцинат лиазы KpARG4 (PAS_chr1-1_0389). На среде с пролином и сульфатом аммония (MMPN / MMN) был репрессирован ген аргиназы KpCAR1.1 (PAS_chr2-2_0288), активирован его гомолог KpCAR1.2 (PAS_chr4_0684), а экспрессия остальных генов метаболизма аргинина и цикл мочевины не менялась (рисунок 13).
В случае с синтезом аспартата, ген аспартат аминотрансферазы KpAAT2.1 (PAS_chr1-1_0200) был репрессирован только на среде с сульфатом аммония и пролином, а его гомолог KpAAT2.2 (PAS_chr4_0974) был подавлен в обоих экспериментах (рисунок 13).
Синтез аланина обеспечивается ферментом аланин трансаминазой. Ген KpALT1 (PAS_chr3_0482), кодирующий этот фермент, был подавлен в обоих экспериментах (рисунок 13).
Пируват, являющийся субстратом аланин трансаминазы, также участвует в синтезе таких аминокислот, как валин, лейцин и изолейцин. Финальные этапы синтеза этих аминокислот осуществляются аминотрансферазой, кодируемой геном KpBAT1 (PAS_chr4_0248). Его экспрессия увеличивалась на среде с пролином, но не менялась на среде с пролином и сульфатом аммония. Помимо этого, синтез валина и изолейцина осуществляется одинаковыми ферментами, которые кодируются генами KpILV5 (PAS_chr1-1_0432), KpILV3 (PAS_chr1-4_0458) и KpILV2 (PAS_chr4_0228). На среде со смесью пролина и сульфата аммония гены KpILV2 и KpILV5 были репрессированы (рисунок 13).
На среде с пролином, в отличие от среды с пролином и сульфатом аммония, наблюдается активация генов, продукты которых осуществляют синтез цистеина и метионина. Среди них гены цистатионин гамма-лиазы KpCYS3 (PAS_chr1-4_0489), цистатион бетта-лиазы KpSTR3 (PAS_chr2-1_0358), цистатионин синтазы KpCYS4 (PAS_chr2-2_0137), метионин и цистеин
синтазы KpMET17 (PASJchr4_0330), гомосерин ацетилтрансферазы KpMET2 (PASJchr2-1_0383), метионин синтазы КрМЕТб (PASJchr2-1_0160) и аспартат бетта-семиальдегид дегидрогеназы КрНОМ2 (PASJchr3J0471) (рисунок 13).
Синтез глицина из глиоксилата осуществляет фермент глиоксилат аминотрансфераза, кодируемая геном KpAGX1 (PASJchr4J0416). Данный ген был репрессирован в обоих экспериментах. При этом ген треонин альдолазы KpGLY1 (PASJchr4_0112), обеспечивающей синтез треонина из глицина, активирован на среде с пролином, но репрессирован на среде с пролином и сульфатом аммония (рисунок 13).
Был обнаружен ряд ДЭГ, связанных с синтезом лизина. Первый этап осуществляется путем синтеза гомоцитрата из а-кетоглутарата и ацетил-КоА ферментом гомоцитрат синтаза. Ген KpLYS21 (PASJchr1-4_0421), кодирующий данный фермент, был подавлен только на среде с пролином и сульфатом аммония. На среде с пролином в качестве единственного источника азота были активированы гены KpLYS4 (PAS_chr4_0795) и KpLYS1 (PASJchr1-1J0447), а репрессирован ген KpLYS2 (PASJchr1-4_0153). Остальные гены метаболизма лизина не меняют экспрессии в данных экспериментах (рисунок 13).
Мы также обнаружили 3 ДЭГ, ферменты которых осуществляют метаболизм ароматических аминокислот. И на среде с пролином, и на среде с пролином и сульфатом аммония были подавлены гены КрАЯОЮ (PASJchr3J0095), продукт которого катализирует превращение фенилпирувата в фенилацетальдегид, и КрАЯ07 (PASJchr4J0050), кодирующий хоризмат мутазу. Ген КрАЯОЗ (PASJchr3J0936), кодирующий арабиногептулозонатфосфат синтазу, активировался на пролине, но появлялся на пролине с сульфатом аммония.
Рисунок 13 — Схема метаболизма аминокислот (основано на данных для дрожжей S. cerevisiae). Красным цветом отмечены ДЭГ, репрессированные по сравнению с контрольной средой с сульфатом аммония. Зеленым цветом - активированные ДЭГ. P - сравнение среды с пролином и контроля - среды с сульфатом аммония (MMP / MMN), PN - сравнение среды с пролином и сульфатом аммония контроля - среды с сульфатом аммония (MMPN / MMN).
Таким образом, если в среде присутствует пролин как единственный источник азота, происходит активация генов, кодирующих ферменты метаболизма аргинина, лейцина, валина, изолейцина, цистеина, метионина, треонина, лизина и мочевины. Если вместе с пролином в среде имеется еще и сульфат аммония, экспрессия данных генов либо не меняется, либо снижается.
3.1.5 Изменение экспрессии генов, кодирующих транспортеры биогенных элементов, в
ответ на тип источника азота
Для дрожжей S. cerevisiae известно 2 основных транспортера пролина - общая пермеаза аминокислот Gap1 и пролин-специфичная пермеаза Put4. У дрожжей K. phaffii в ходе поиска гомологичных белков были обнаружены три пермеазы Gap1 и две пермеазы Put4. На среде с пролином (сравнение MMP / MMN) мы наблюдали активацию генов общих пермеаз аминокислот KpGAP1.1 (PAS_chr1-4_0479) и KpGAP1.2 (PAS_chr1-1_0203). На среде с пролином и сульфатом аммония (сравнение MMPN / MMN) экспрессия этих генов не изменяется по сравнению с сульфатом аммония. При этом ген пермеазы KpGAP1.3 (PAS_chr1-1_0030) был репрессирован в обоих экспериментах. Сходство обнаруживается и для генов специфических пермеаз пролина. Экспрессия гена KpPUT4.1 (PAS_chr2-1_0129) не изменяется на двух типах сред, а гена KpPUT4.2
(PAS_chr2-1_0659) - увеличивается как на среде с пролином, так и на среде с пролином и сульфатом аммония.
В результате сравнения транскриптомных данных был выявлен ряд ДЭГ, продукты которых обеспечивают транспорт различных соединений. И на среде с пролином, и на среде со смесью пролин и сульфата аммония были репрессированы гены KpATO2 (PAS_chr1-1_0417) и KpMEP2 (PAS_chr1-4_0394), связанные с транспортом аммония. Также был подавлен ген KpFET5 (PAS_chr1-4_0041), продукт которого вовлечен в транспорт железа.
На среде с пролином и сульфатом аммония (MMPN / MMN) происходит репрессия генов, кодирующих транспортеры: дикарбоновых кислот (KpDIP5, PAS_chr4_0287), пиридоксина (KpTPNl, PAS_chr1-3_0153), железа (гены KpFTRl - PAS_chr1-4_0040 и KpFTHl - PAS_chr2-1_0427), полиаминов (гены KpTPOl - PAS_chr1-4_0194, KpTPO2 - PAS_chr1-3_0215 и KpTPO3 - PAS_chr1-4_0090), мио-инозитола (KpITRl - PAS_chr2-1_0489) и монокарбоновых кислот (KpAQRl, PAS_chr2-2_0065). При этом на среде с пролином гены KpTPO3, KpITRl и KpAQRl были активированы.
И на среде с пролином, и на среде с сульфатом аммония наблюдается активация экспрессии генов транспортера фосфата KpPHO89 (PAS_chr2-1_0235) и транспортера меди KpCTRl (PAS_chr4_0181).
Таким образом, в зависимости от типа источника азота наблюдается сложная регуляция активности транспортеров различных соединений. Более того, можно предположить, что источник азота влияет на транспорт не только аминокислот, но и других компонентов среды -железа, меди, фосфора.
Кроме этого, интересным оказался тот факт, что пермеазы сульфата аммония подавляются не только на среде с пролином, но и на среде с пролином вместе с сульфатом аммония. Пролин в этом случае является более предпочтительным источником азота, чем сульфат аммония.
3.1.6 Изменение экспрессии генов, кодирующих белки мембраны и клеточной стенки, в
ответ на тип источника азота
Помимо генов, кодирующих различные транспортеры, мы также обнаружили ряд ДЭГ, связанных с мембраной клетки и белками клеточной стенки. К этим генам относятся KpPMP3 (PAS_chr1-4_0369), KpPIR3 (PAS_chr2-1_0887), KpUTR2 (PAS_chr4_0559), KpSPIl (PAS_chr1-4_0586), KpGASl (PAS_chr1-3_0227), KpHSP12 (PAS_chr4_0627), KpBGL2 (PAS_chr1-4_0426), KpSUR7 (PAS_chr3_1058), KpKRE9 (PAS_chr3_0960), KpSPO7 (PAS_chr1-1_0248), KpPSTl (PAS_chr2-2_0148) и KpFIGl (PAS_chr1-4_0077). Все эти гены были активированы как на среде с пролином, так и на среде с пролином и сульфатом аммония.
Было показано, что культуры дрожжей К. phaffii достигают большой плотности при росте в средах с метанолом и пролином [34,35]. Можно предположить, что при наличии в среде с метанолом пролина клетки начинают активнее делиться, для чего активируется синтез клеточной стенки и происходит стабилизация мембраны.
3.1.7 Изменение экспрессии генов, кодирующих факторы трансляции, белки рибосомы, шапероны и белки протеасомы, в ответ на тип источника азота
В ходе транскриптомного анализа были выявлены ДЭГ, кодирующие факторы элонгации трансляции. В обоих экспериментах были репрессированы гены EF-1 гамма и EF-2 (КрТЕГ4 -РАБ_М_1071 и КрЕРТ2 - РА8_^г2-1_0812 соответственно). Ген EF-1 альфа (КрТЕР2, PAS_FragB_0052) был подавлен только на среде с пролином и сульфатом аммония.
Помимо элонгации трансляции, наличие в среде пролина приводит к репрессии 54 генов, кодирующих непосредственно белки большой и малой субъединиц рибосомы. На среде с пролином в качестве единственного источника азота было подавлено 49 генов, кодирующих белки рибосом, а на среде со смесью пролина и сульфата аммония - 21 ген (рисунок 14).
Рисунок 14 — ДЭГ, кодирующие белки рибосомы. На диаграммах Венна представлены гены, которые были подавлены в исследуемых условиях. Желтым отмечены белки рибосомы, гены которых репрессируются в исследуемых условиях. Pro vs NH4 - сравнение среды с пролином и контроля - среды с сульфатом аммония (MMP / MMN), ProNH4 vs NH4 - сравнение среды с пролином и сульфатом аммония контроля - среды с сульфатом аммония (MMPN / MMN).
Также выявили ДЭГ, кодирующие ряд шаперонов. Два из них связаны с биогенезом рибосомы. Это гены КрБ8В1 (РА8_еНг3_0731) и КрБ^Т1 (РА8_еНг4_0082). Первый был репрессирован в обоих экспериментах, второй - репрессирован только при росте клеток на среде с пролином и сульфатом аммония. Более того, на среде с пролином и сульфатом аммония, в отличие от среды с пролином, снижается уровень мРНК генов KpSQT1 (РАБ_екг4_0082), КрБ8А4 (РА8_еНг3_0230), (PAS_еhr2-2_0151), KpSSA2 (PAS_еhr4_0552), КрАНА1.1 (PAS_еhr1-
4_0072), КрАНА1.2 (PAS_еhr3_0170), КрЖР82 (PAS_еhr1-4_0130), КрУБЛ (PAS_еhr2-2_0066), КрСБС37 (PAS_еhr2-1_0828), КрКАЯ2 (PAS_еhr2-1_0140), КрБ.ВА1 (PAS_еhr1-4_0043), КрЖР104 (PAS_еhr1-3_0102), КрЖР78 (PAS_еhr2-1_0324) и КрЖР10 (PAS_еhr1-4_0163). Все эти гены также кодируют различные шапероны.
В ходе анализа также обнаружено подавление генов, продукты которых участвуют в системе протеасомной деградации белков. Так, например, в обоих экспериментах был репрессирован ген убиквитина КриВ14 (PAS_еhr4_0762). На среде с пролином и сульфатом
аммония были подавлены гены КриВС11 (РЛ8_сНг3_0709) и КриВС4 (РЛ8_сНг3_0710), кодирующие убиквитин-связывающие ферменты (Е2).
И на среде с пролином, и на среде с пролином и сульфатом аммония были репрессированы гены КрСБС48 (PЛS_FragD_0026) и КрЕСМ29 (РЛ8_сНг4_0761). Cdc48 является АТФазой, связанной с убиквитин-опосредованной деградацией, а Ест29 участвует в стабилизации протеасомы.
Более того, также выявили 26 генов, кодирующих белки коровой и регуляторной частицы протеасомы. На среде с пролином в качестве единственного источника азота было подавлено 25 генов, кодирующих белки протеасомы, а на среде со смесью пролина и сульфата аммония была подавлена экспрессия 5 генов (рисунок 15).
Рисунок 15 — ДЭГ, кодирующие белки протеасомы. На диаграммах Венна представлены гены, которые были подавлены в исследуемых условиях. Желтым отмечены белки протеасомы, гены которых репрессируются в исследуемых условиях. Pro vs NH4 - сравнение среды с пролином и контроля - среды с сульфатом аммония (MMP / MMN), ProNH4 vs NH4 - сравнение среды с пролином и сульфатом аммония контроля - среды с сульфатом аммония (MMPN / MMN).
Интересно, что на среде с пролином и сульфатом аммония, в отличие от среды с пролином, репрессируется ген KpATG12 (PAS_chr3_0363). Для S. cerevisiae известно, что данный ген кодирует убиквитин-подобный белок, вовлеченный в процесс аутофагии.
Таким образом, наличие пролина приводит к репрессии ряда генов, кодирующих белки рибосомы. Причем на среде MMP этот эффект более выражен, чем на среде MMPN. Значимый эффект наблюдается также в случае генов, кодирующих белки шаперонов и протеасомы. Если в среде находится пролин как единственный источник азота, у клеток снижается экспрессия генов практически всех белков протеасомы. Если в среде дополнительно есть и сульфат аммония, клетка больше переключается на репрессию генов, кодирующих шапероны.
3.1.8 Изменение экспрессии генов, кодирующих факторы Tor-киназы и глюкозной катаболитной репрессии, в ответ на тип источника азота
В ходе анализа ДЭГ на среде с пролином и сульфатом аммония было обнаружено снижение уровней мРНК четырех генов - PAS_chr4_0271, PAS_chr4_0626, PAS_chr2-2_0150 и PAS_chr1-4_0339. Для первых двух генов белковое выравнивание на протеом дрожжей S. cerevisiae при помощи алгоритма BLAST давало низкий процент сходства, поэтому сложно определить их гомологи. Однако соответствующие белки содержат домен цинковых пальцев ZnF_GATA, который характерен для белков Gln3 и Gatl дрожжей S. cerevisiae. Данные белки вовлечены в Tor-киназный сигнальный путь. Ген PAS_chr2-2_0150 выравнивается на ген LST8 дрожжей S. cerevisiae. Белок Lst8 является одной из субъединиц Tor-киназы. Наконец, ген PAS_chr1-4_0339 выравнивается на ген GCN4, продукт которого у дрожжей S. cerevisiae также участвует в Tor-киназном пути, обеспечивая регуляцию генов метаболизма аминокислот. Гены PAS_chr4_0626 и KpLST8 (PAS_chr2-2_0150) были репрессированы также и на среде с пролином.
Также обнаружили, что на среде с пролином происходит активация экспрессии генов MIG2 (PAS_chr1-4_0526) и SAC1/TOS3/ELM1 (PAS_chr2-1_0639). Для дрожжей S. cerevisiae известно, что продукты этих генов являются ключевыми репрессорами генов метаболизма углерода. На среде с пролином и сульфатом аммония экспрессия данных генов не меняется.
Исходя из этих данных можно предположить, что в регуляции генов метаболизма метанола у дрожжей K. phaffii принимают участие глобальные клеточные системы, обеспечивающие углеродную (Mig) и азотную (Tor) катаболитные репрессии.
Таким образом, пролин оказывает комплексное влияние на экспрессию генов дрожжей K. phaffii. Независимо от наличия в среде другого источника азота (сульфата аммония) в клетке происходит активация генов катаболизма пролина, а также репрессия генов метаболизма метанола и биогенеза пероксисом. При этом наблюдаются различия в экспрессии генов,
кодирующих ферменты цикла трикарбоновых кислот (ЦТК), глюконеогенеза, биосинтеза аминокислот, а также генов рибосомных и протеасом белков.
Эти данные позволяют предположить, что либо сам пролин запускает репрессию генов метаболизма метанола, либо глутамат, полученный в результате его окисления. Для проверки этой гипотезы на следующем этапе работы провели транскриптомный анализ экспрессии генов дрожжей K. phaffii при росте в средах с глутаматом в качестве источника азота.
3.2 Анализ дифференциальной экспрессии генов дрожжей K. phaffii на средах с глутаматом и глутаматом вместе с сульфатом аммония
В ходе катаболизма аминокислот пролин окисляется до глутамата. У дрожжей S. cerevisiae этот процесс обеспечивается ферментами пролиноксидазой Putl и пирролин-карбоксилатдегидрогенезой Put2. Транспорт пролина осуществляется общей пермеазой аминокислот Gapl и специфической пермеазой пролина Put4. Проведенный на первом этапе транскриптомный анализ показал, что само по себе наличие пролина в среде приводит к активации экспрессии генов PUT4.2, PUT1 и PUT2. При этом наблюдается репрессия генов метаболизма метанола (MUT-генов).
Влияние глутамата на клетки K. phaffii оценили с помощью методов транскриптомного анализа. Для этого использовали среды, содержащие метанол и глутамат (MMG) в одном случае и глутамат вместе с сульфатом аммония (MMGN) в другом. В качестве контроля также использовали среду с метанолом и сульфатом аммония (MMN).
Клетки штамма X-33 дрожжей K. phaffii растили на среде с глицерином и сульфатом аммония (MGN), после чего биомассу клеток переносили в среды с метанолом и глутаматом (опыт, MMG), метанолом, глутаматом и сульфатом аммония (опыт, MMGN) и метанолом и сульфатом аммония (контроль, MMN). Из клеток, растущих в данных средах, выделили РНК и подготовили библиотеки для проведения секвенирования и транскриптомного анализа.
Данные об изменении экспрессии генов K. phaffii в ответ на наличие в среде глутамата заметно отличаются от данных, полученных для сред с пролином (рисунок 16). На среде с глутаматом в качестве единственного источника азота выявили только 40 ДЭГ. Из них 32 гена были активированы и 8 генов были репрессированы. Среди генов, который активируются на среде с глутаматом, обнаружили ген метаболизма метанола DAK1, гены ЦТК KpCITl и KpMDHl, ген NAD-транспортера KpYIA6, ген пермеазы аммония KpMEPl (PAS_chr2-2_0391), а также гены PUT2 и KpCYS3.
В случае с ростом клеток на среде с глутаматом и сульфатом аммония выявили 107 ДЭГ. Соответственно, 50 из них были активированы, а 57 были репрессированы на данной среде по сравнению с контрольной средой с сульфатом аммония.
На среде с глутаматом и сульфатом аммония, по сравнению с контролем (только с сульфатом аммония), были репрессированы часть МиТ-генов (ЛОХ2, DЛS1, DЛS2, FBЛ1), РЕХ-генов (РЕХ5, РЕХ11) и генов стрессового ответа (SOD1, РМР20). Также наблюдали подавление экспрессии ряда генов глюконеогенеза (СРМ1, КрРСК1), генов, связанных с энергетическими процессами (КрЛТР2, КрРЕТ9, КрЛБС1), генов метаболизма аминокислот (KpGDH1, КрЛЯБ56, КрЛЛТ2.1, КрЛЛТ2.2, KpЛGX1), генов транспортеров (КрЛТО2, КрТРИ1, КрТРО2), генов рибосомных белков (КрЯРЬЗ, КрЯРЬ15В, КрЯРЬ26Л, КрЯРЬ28, КрЯРЬ30, КрЯРЬ43В, KpRPS6B) и генов шаперонов (KpSSB1, KpSSЛ2). Активируются гены KpGЛD1 (ГАБА-шунт), РиТ2 (окисление пролина), KpCTR1 (транспортер меди), а также гены, кодирующие мембранные белки, КрРМРЗ, КрШР12 и ^Ж7.
Рисунок 16 — Тепловая карта ДЭГ в зависимости от различных источников азота в среде.
Желтым обозначены репрессированные гены, зеленым - активированные, серым представлены гены, экспрессия которых не изменялась. Обозначения: Pro - MMP / MMN, ProNH4 - MMPN / MMN, Glu - MMG / MMN и GluNH4 - MMGN / MMN.
Таким образом, наличие в среде глутамата не приводит к столь кардинальным изменениям в экспрессии генов, которые наблюдаются при наличии в среде пролина, когда изменяется экспрессия около 18% генов. Глутамат не оказывает такого влияния как пролин. В связи с этим на следующем этапы было рассмотрено влияние генов, участвующих в окислении пролина на экспрессию гена АОХ1.
3.3 Анализ влияния активности промотора гена РиТ1 у дрожжей К. рка//И на среде с
метанолом и разными источниками азота
Для подтверждение того, что пролин окисляется клетками даже при наличии в среде сульфата аммония, была проведена оценка активности промотора гена РиТ1 с помощью репортерной системы кислой фосфатазы (КФ) РЫ5.
Транскриптомный анализ дрожжей К. phaffii показал, что само наличие в среде пролина приводит к увеличению уровня мРНК генов, продукты которых обеспечивают окисление пролина до глутамата, то есть что пролин метаболизируется даже при наличии более предпочтительного источника азота. Для того, чтобы подтвердить эти данные, в ходе работы был проведен анализ активности промотора гена пролиноксидазы (ген РиТ1), которая обеспечивает первую реакцию окисления пролина.
Для этого был сконструирован штамм P1AP-GS115 дрожжей К. phaffii. Данный штамм содержит репортерную конструкцию на основе гена кислой фосфатазы, которая была разработана ранее [2]. Эта конструкция содержит ген РНО5 дрожжей & еerevisiae под контролем промотора гена РиТ1 дрожжей К. phaffii [123].
Клетки дрожжей 48 часов культивировали на средах, содержащих метанол, глицерин и глюкозу в качестве источника углерода и пролин, сульфат аммония и смесь пролина с сульфатом аммония в качестве источников азота. После этого проводили качественный анализ активности репортерной КФ (рисунок 17).
Рисунок 17 — Подтверждение транскриптомных данных качественной оценкой активности КФ у штамм P1AP-GS115 дрожжей K. phaffii. А - качественная оценка активности КФ в средах с разной комбинацией источников азота и углерода. Среды: Метанол-Pro - MMP, Метанол-PшNH4 - MMPN, Метанол-Ш4 - MMN, Глицерин-Pro - MGP, Глицерин-ProNH4 -MGPN, Глицерин-Ш4 - MGN, Глюкоза-Pro - MHP, Глюкоза-Pro+NH4 - MHPN, Глюкоза-Ш4 - MHN. Б - среднее количество прочтений без нормализации в экспериментах с Pro (MMP), ProNH4 (MMPN) и NH4 (MMN). Звездочкой обозначен уровень p-value < 0,05.
Качественный анализ активности КФ показывает, что промотор гена PUT1, активен на средах, содержащих пролин (MMP, MMPN, MGP, MGPN, MHP и MHPN). При этом окраски нет на средах с сульфатом аммония как единственным источником азота (MMN, MGN и MHN). Таким образом, промотор гена PUT1 активируется пролином независимо от наличия в среде сульфата аммония. Это также соотносится с транскриптомными данными об изменении уровня мРНК гена PUT1 на средах с пролином. Таким образом, пролин окисляется клетками дрожжей K. phaffii даже при наличии других источников азоте в среде.
На следующем этапе работы проводили анализ влияния делеций генов PUT1 и PUT2 на рост клеток K. phaffii и активность гена алкогольоксидазы AOX1.
3.4 Анализ роста штаммов дрожжей К. рка//И, содержащих делеции генов РиТ1 и РиТ2
У дрожжей & сетеу1$1ае известно, что окисление пролина осуществляется в митохондриях под действием ферментов пролиноксидазы (РШ;1) и пирролин-5-карбоксилатдегидрогенезы (РШ;2). В результате окисления пролина образуется глутамат. Сами реакции протекают с выделением энергии. Можно предположить, что у дрожжей К. рка//И ключевым фактором связывающим пролин и вызываемую им регуляцию экспрессии МиТ-генов может являться его окисление и энергетический метаболизм (рисунок 18).
Рисунок 18 — Возможное влияние пролина на экспрессию генов метаболизма метанола через окисление с выделением энергии. Пролин окисляется под действием Putl и Put2 с выделением энергии. Среды Pro vs NH4 - MMP / MMN, ProNH4 vs NH4 - MMPN / MMN, Glu vs NH4 - MMG / MMN и GluNH4 / NH4 - MMGN / MMN.
Были получены и проверены штаммы Дput1-GSП5 и Дput2-GSП5 дрожжей К. рка//И, содержащие делеции генов РиТ1 и РиТ2, соответственно. У данных штаммов оценили рост на средах, содержащих разные комбинации источников азота и углерода. В качестве источника азота использовали сульфат аммония, пролин и их смесь. В качестве источника углерода были взяты глицерин и метанол. Соответственно, для качественной оценки роста высевали 100000, 10000 и 1000 клеток. Анализировали рост через 5 дней (рисунок 19).
105 1 04 1 0*
Pro
105 104 10'
Pro + NH
4
10' 104 103
Глицерин
Метанол
Рисунок 19 — Рост клеток дрожжей K. phaffii на средах с разными источниками углерода (глицерин и метанол) и азота (сульфат аммония, пролин и их смесь). Среды: Метанол-Рго -MMP, Метанол-Рго+^4+ - MMPN, Метанол-Ш4+ - MMN, Глицерин-Pro - MGP, Глицерин-Pro+NH4+ - MGPN и Глицерин-NH4+ - MGN.
На среде с глицерином наблюдаем рост всех штаммов при наличии в среде сульфата аммония (MGN, MGP, MGPN). Если в среде в качестве источника азота доступен только пролин, можно заметить, что штаммы с делециями генов PUT1 и PUT2 растут хуже контроля. Это можно объяснить нарушением утилизации пролина у клеток. На среде с метанолом наблюдаются более заметные различия. Если единственным источником азота является сульфат аммония, то штаммы с делециями растут несколько хуже контрольного штамма. При использовании пролина на среде с метанолом наблюдается отсутствие роста клеток с делециями генов PUT1 и PUT2. Таким образом, в этих условиях метаболизм пролина нарушен.
3.5 Анализ влияния делеции генов PUT1 и PUT2 на активность промотора гена AOX1 на
среде с пролином и сульфатом аммония
В ходе дальнейшей работы оценили влияние делеций генов PUT1 и PUT2 на активность промотора гена алкогольоксидазы AOX1, являющегося ключевым геном метаболизма метанола. В связи с тем, что штаммы Aput1-GS115 и Aput2-GS115 были получены на основе штамма tr2-4-GS115, в их геномах содержится репортерная конструкция PAOX-PHO5. То есть ген кислой фосфатазы PHO5 дрожжей S. cerevisiae находится под контролем промотора гена АОХ1 дрожжей K. phaffii.
Штаммы выращивали 40 часов на среде с глицерином и сульфатом аммония (MGN). Биомассу клеток затем переносили на среды с метанолом и сульфатом аммония (MMN) или сульфатом аммония с пролином (MMPN). После 24 часов проводили количественное измерение активности репортерного гена КФ (рисунок 20).
Рисунок 20 — Измерение удельной активности кислой фосфатазы Pho5 у штаммов с делециями генов PUT1 и PUT2. Репортерная систем находится под контролем промотора гена AOX1. Синим отмечена среда Pro + NH4 (MMPN). Красным отмечена среда NH4 (MMN). К -контрольный штамм GS115, APUT1 - штамм Aput1-GS115 с делецией гена PUT1, APUT2 - штамм Aput2-GS115 с делецией гена PUT2. Звездочкой обозначен уровень p-value < 0,05.
Как видно, у исходного контрольного штамма tr2-4-GS115 наблюдается снижение уровня синтеза КФ при наличии пролина в среде. Это является результатом репрессии промотора гена алкогольоксидазы АОХ1 пролином. При этом достоверных различий между контрольным штаммом и штаммами с делециями генов РиТ1 и РиТ2 не обнаружили.
Результаты транскриптомного анализа позволили предположить, что действие пролина на клетки К. рка//И и репрессия МиТ-генов связаны с первыми этапами его утилизации. Можно было бы предположить, что регуляция МиТ-генов запускается в ответ на изменение энергетического баланса клетки при окислении пролина до глутамата. Однако результаты анализа активности промотора АОХ1 показали, что делеции генов РиТ1 и РиТ2 хотя и нарушают способность К. рка//И расти на среде с метанолом и пролином, но не приводят к снятию репрессии ключевого гена метаболизма метанола АОХ1. Можно предположить, что окисление
пролина в митохондриях не является непосредственным фактором, запускающим регуляцию MUT-генов. В таком случае ключевую роль могут играть детекция пролина и его транспорт в клетку.
3.6 Поиск сайтов связывания транскрипционных факторов в промоторах генов метаболизма метанола дрожжей K. phaffii
Само наличие пролина опосредованно приводит к репрессии всех генов метаболизма метанола и биогенеза пероксисом. Такая координированная регуляция обычно подразумевает наличие общего репрессора. Если данным репрессором является транскрипционный фактор, то в большинстве промоторов MUT-генов должен находиться общий сайт-связывания для этого фактора. В связи с этим мы провели поиск потенциальный сайтов связывания в промоторах MUT-генов.
В ходе работы были выбраны все известные для дрожжей S. cerevisiae сайты связывания транскрипционных факторов из базы данных JASPAR. Затем с использованием аннотации и генома мы получили последовательности длинной 500 нуклеотидов промоторов MUT-, PEX-генов, а также ряда других генов (KpGAP1.1, KpGAP1.2, KpGAP1.3, KpPUT4.1, KpPUT4.2, KpGDH2, KpGLT1, KpGLN1, KpGDH1, KpPUT1, KpPUT2). В этих последовательностях мы провели поиск известных сайтов связывания транскрипционных факторов.
В результате мы обнаружили 181 сайт, который хотя бы раз встречался в промоторах. Чтобы статистически оценить эти сайты, мы провели их сравнение с фоновым распределением сайта по геному. В итоге получили 16 потенциальных сайтов, значение скорректированного p-value у которых меньше 0,05. Среди этих данных, сайты связывания транскрипционных факторов Mig обнаруживаются практически во всех MUT-генах, кроме гена FLD1. Также данный сайт имеется на промоторах генов PEX1, PEX11 и PEX13 (рисунок 21).
Рисунок 21 — Местоположение потенциальных сайтов связывания факторов Mig в промоторах (500 п.о.) MUT- и PEX-генов. Направление стрелок показывает ориентацию сайта-связывания в промоторах.
Таким образом, в ходе анализа последовательностей промоторов генов метаболизма метанола были обнаружены потенциальные сайты ТФ. Среди них наибольший интерес представляет группа факторов Mig, поскольку встречается практически на всех промоторах MUT-генов. Однако, несмотря на статистический анализ, эти данные необходимо подтверждать молекулярными методами.
3.7 Анализ влияния делеции генов МЮ1 и МЮ2 на активность промотора гена АОХ1 на среде с пролином и пролином вместе с сульфатом аммония
Ранее в ходе транскриптомного анализа мы обнаружили, что у дрожжей K. phaffii экспрессия гена MIG2 на среде с пролином выше, чем на среде с сульфатом аммония. Известно, что у дрожжей & cerevisiae белки Mig2 и Mig1 участвует в глюкозной катаболитной репрессии. Если в среде присутствует глюкоза, Mig1,2 репрессируют ряд генов, продукты которых вовлечены в метаболизм других источников углерода. Более того, у дрожжей K. phaffii Mig1 и Mig2 репрессируют ген AOX1 на среде с глицерином. Наконец, в ходе анализа промоторов MUT-генов были выявлены потенциальные сайты связывания белков Mig1 и Mig2. Можно предположить, что регуляция генов метаболизма метанола пролином осуществляется за счет углеродной катаболитной репрессии.
Для того, чтобы проверить, участвуют ли белки Mig2 и Migl у дрожжей K. phaffii в регуляции генов метаболизма метанола на среде с пролином, мы получили штаммы Amig1-GS115 и Amig2-GS115 с делециями генов MIG1 и MIG2 соответственно. Полученные штаммы также содержали репортерный ген КФ PHO5 под контролем промотора гена AOX1.
Клетки выращивали на среде с глицерином и сульфатом аммония (MGN), после чего пересевали на среды с метанолом и пролином (MMP), метанолом, пролином и сульфатом аммония (MMPN) и метанолом и сульфатом аммония (MMN). Через 24 часа мы измеряли удельную активность КФ (рисунок 22).
Рисунок 22 —Удельная активность КФ Pho5 у штаммов с делециями генов MIG1 и MIG2.
Репортерная система находится под контролем промотора гена AOX1. Красным и зеленым отмечена среда NH4 (MMN). Синим отмечена среда Pro (MMP). Оранжевым отмечена среда Pro + NH4 (MMPN). К - контрольный штамм GS115, AMIG1 - штамм Amig1-GS115 с делецией гена MIG1, AMIG2 - штамм Amig2-GS115 с делецией гена MIG2. Звездочкой обозначен уровень p-value < 0,05.
Несмотря на то, что Mig1 и Mig2 участвуют в регуляции генов метаболизма метанола на среде с глицерином, не было обнаружено их участия в обеспечении регуляции в ответ на пролин. Таким образом, можно предположить, что репрессия MUT-генов пролином обеспечивается иначе, чем репрессия источниками углерода.
3.8 Анализ влияния делеции гена РиТ4.2 на активность промотора гена АОХ1 на среде с пролином и пролином вместе с сульфатом аммония
В данной работе в ходе анализа транскриптомов и штаммов с делециями генов PUT1, PUT2 стало понятно, что окисление пролина и образование глутамата не являются факторами репрессии генов метаболизма метанола пролином.
Для дрожжей & cerevisiae известно, что транспорт пролина в клетку осуществляют два мембранных белка - общая пермеаза аминокислот Gap1 и специализированная к пролину пермеаза РШ;4. При этом у дрожжей К. phafii в результате анализа транскриптомных данных было выявлено, что только ген РиТ4.2 (PAS_chr2-1_0659) активируется и на среде с пролином (ММР), и на среде со смесью пролина и сульфата аммония (ММР^. Таким образом, можно предположить, что именно Р^4.2 играет ключевую роль в процессе репрессии генов метаболизма метанола пролином (рисунок 23).
Рисунок 23 — Возможное влияние пролина на экспрессию генов метаболизма метанола через транспорт или детекцию. Пролин детектируется и/или транспортируется белком РШ;4.2.
Для подтверждения того, что Put4.2 связан с репрессией генов метаболизма метанола пролином, был сконструирован штамм Aput4.2-GS115 дрожжей K. phaffii, содержащий делецию гена PUT4.2. Данный штамм также имеет в геноме репортерный ген КФ PHO5 под контролем промотора гена AOX1 [123].
В ходе работы была оценена активность репортерной КФ на средах с метанолом и пролином (MMP) или сульфатом аммония (MMN). Для наработки биомассы штаммы выращивали 40 часов на среде с глицерином и сульфатом аммония (MGN), после чего клетки переносили на среды с метанолом (MMP, MMN) и культивировали еще 40 часов. После этого проводили количественное измерение активности КФ. Кроме этого, был проведен качественный анализ активности кислой фосфатазы у штамма Aput4.2-GS115. Клетки дрожжей растили 48 часов на среде с метанолом и сульфатом аммония (MMN), пролином (MMP) и пролином вместе с сульфатом аммония (MMPN), после чего анализировали активность репортерной системы (рисунок 24).
10 —1
§
5 —
Ü —1
Контроль APUT4.2
NH4
Контроль ДРШ'4,2
Pro
* р-value < 0.05
Methanol + NH4 Methan«! + Pro + NH4 Methanol + Pro
GS115 (контроль)
4put4.2-GS115
Рисунок 24 — Качественная и количественная оценка активности КФ у штамма с делецией гена PUT4.2. Репортерная систем находится под контролем промотора гена AOX1. А - график количественной оценки активности КФ на средах с метанолом и сульфатом аммония (MMN) и метанолом и пролином (MMP). На графике представлены средние и стандартные отклонения значений КФ. Звездочкой обозначен уровень p-value < 0,05. Б - качественная оценка активности КФ на средах с метанолом и сульфатом аммония (MMN), метанолом, пролином и сульфатом аммония (MMPN) и метанолом и пролином (MMP).
Количественный анализ репортерной КФ показывает, что делеция гена РиТ4.2 приводит к частичной дерепрессии гена АОХ1 на среде с метанолом и пролином. Качественный анализ КФ показывает, что у контрольного штамма (GS115) дрожжей К. рка^И ген АОХ1 активен на среде с метанолом и сульфатом аммония, а на среде с метанолом и пролином происходит репрессия данного гена. На среде с метанолом и смесью сульфата аммония и пролина у контрольного штамма наблюдается слабое окрашивание. При этом у штамма Дput4.2-GSП5, содержащего делецию гена РиТ4.2, промотор гена АОХ1 активен на всех трех средах.
Таким образом, белок РШ;4.2 вовлечен в репрессию генов метаболизма метанола пролином. Это происходит даже при наличии в среде другого источника источника азота. Остается неясным, осуществляется ли данная регуляция путем увеличения внутриклеточной концентрации пролина, либо ключевую роль играет само наличие пролина в среде.
3.9. Моделирование связывания белка Put4.2 с пролином у дрожжей К. рка//И
Для того, чтобы оценить, способен ли пролин проходить через белок РШ;4.2 дрожжей К. рка//И в клетку, мы провели моделирование их связывания (рисунок 25). В ходе анализа была использована веб-версия программы SwissDock. В результате такого моделирования было обнаружено, что наиболее энергетически выгодное положение пролина оказывается внутри белка РШ;4.2. При таком расположении пролина значение свободной энергии связывания ^Р-ёв) соответствовало -6,09 ккал/М, а значение энергии межмолекулярных взаимодействий было -21,87 ккал/М.
Сбоку Со стороны цитоплазмы С внешней стороны клетки
Рисунок 25 — 3D структура белка Put4.2, взаимодействующего с пролином. Зеленым отмечен РШ;4.2, красным - пролин.
Таким образом, биоинформатический анализ позволяет предположить, что белок РШ;4.2 потенциально способен транспортировать пролин в клетку. Однако, для подтверждения этого факта необходимы молекулярные исследования. Кроме этого, нельзя исключать, что РШ/4.2 может быть трансцептором, и что он способен не только транспортировать пролин, но и передавать сигнал о его наличии.
3.10 Промоторы генов дрожжей К. рка//И, которые могут быть использованы в
биотехнологии
Дрожжи К. рка//И активно используются в биотехнологии для синтеза рекомбинантных белков. Для этого в первую очередь применяют промоторы генов метаболизма метанола, в частности, промотор гена АОХ1. Однако, часто для синтеза сложных белков необходимы дополнительные посредники. Например, различные белки, которые осуществляют нужные модификации, шапероны, обеспечивающие правильную укладку белка, различные ко-факторы, которые помогают эффективному транспорту. В связи с тем, что гены метаболизма метанола
имеют очень высокий уровень экспрессии, они могут не подойти для синтеза таких белков посредников. Таким образом, для проведения эффективной ко-экспрессии необходимо иметь коллекцию конститутивных и регулируемых промоторов.
На основе транскриптомных данных в работе был проведен поиск конститутивно экспрессирующихся генов, а также генов, которые активируются при добавлении в среду пролина. На первом этапе выявили гены, экспрессия которых не менялась на средах с пролином, глутаматом и сульфатом аммония. Для полученных генов оценили среднее количество нормализованных прочтений (base mean) и выбрали те, у которых разброс этого значения был минимальным. Список этих генов представлен в таблице 9. Для подтверждения того, действительно ли эти гены экспрессируются конститутивно, необходимы дальнейшие исследования. Однако, несмотря на это, промоторы обнаруженных генов могут стать потенциальными кандидатами для ко-экспрессии белков посредников на среде с метанолом.
Таблица 9 — Гены дрожжей K. phaffii, промоторы которых потенциально можно использовать для конститутивной экспрессии генов факторов-посредников на среде с метанолом. В таблице приведено среднее количество нормализованных прочтений (base mean) для каждого гена в разных условиях.
Название гена ID гена MMP / MMN MMPN / MMN MMG / MMN MMGN / MMN
KpVMA2 PAS_c131_0021 358,3 353,8 385,2 329,6
KpCOX4 PAS_chr2-1_0361 216,6 198,9 316,2 194,9
KpFLC3 PAS_chr 1-1_0176 144,3 157,7 204,5 154,5
KpSOD2 PAS_chr 1 -4_0071 152,2 162,7 130,5 159,4
KpSES1 PAS_chr 1 -4_0463 139,9 140,2 111,6 121,3
KpRVS167 PAS_chr2-1_0116 144,4 112,5 149,7 104,4
KpHFD1 PAS_chr 1 -4_0064 133,2 114,6 137,9 104,6
KpARC15 PAS_chr2-2_0029 79,8 95,9 100,7 84,0
KpMTR10 PAS_chr2-1_0137 56,1 64,5 51,3 59,9
KpTOM6 PAS_chr 1-3_0076 49,9 54,4 47,5 47,3
Помимо генов, экспрессия которых остается постоянной на среде с метанолом, практическую ценность для синтеза дополнительных белков также имеют индуцируемые промоторы. В связи с этим на втором этапе были выявлены гены, активность которых увеличивается при добавлении пролина в среду с метанолом и сульфатом аммония. Для этого
были использованы транскриптомные данные для среды со смесью пролина и сульфата аммония (MMPN / MMN). Полученные ДЭГ были отсортированы по увеличению логарифма изменения экспрессии (log fold change). Список обнаруженных генов представлен в таблице 10.
Таблица 10 — Гены дрожжей K. pkaffii, промоторы которых потенциально можно использовать для индукции экспрессии генов факторов-посредников на среде с метанолом и пролином.
Название гена ID гена Логарифм изменения экспрессии MMPN / MMN Кратное увеличение экспрессии при добавлении пролина
KpPUT1 PAS_chr1-3_0269 6,37 82,71
KpYRB30 PAS_chr1-3_0310 3,74 13,36
KpPUT4.2 PAS_chr2-1_0659 3,54 11,63
KpFLO1 PAS_chr3_0015 3,50 11,31
KpPUT2 PAS_chr2-2_0496 3,38 10,41
KpCPR7 PAS_chr3_0378 3,02 8,11
Таким образом, поиск и анализ регулируемых и конститутивных промоторов дрожжей K. pkaffii имеет огромную практическую значимость для синтеза сложных рекомбинантных белков и их белков-посредников. Транскриптомный анализ позволяет проводить скрининг уровня мРНК всех белок-кодирующих генов K. pkaffii.
В данной работе при помощи анализа транскриптомов были обнаружены гены, промоторы которых потенциально можно использовать как в биотехнологии, так и в работах по проведению сверхэкспрессии. Для этого были предложены 10 генов, экспрессия которых не меняется в среде с метанолом и разными источниками азота, и 6 генов, активность которых увеличивается при добавлении в среду пролина.
Наконец, можно выделить сам ген PUT4.2. Штаммы с делецией транспортера пролина РШ4.2 способны увеличивать выход целевого белка на средах с пептоном и смесью аминокислот, поскольку сам метаболизм пролина не подавлен.
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ
Клетки микроорганизмов обитают в динамической среде, где происходит огромное количество различных процессов. Для того, чтобы обеспечить адекватный ответ на различные изменения, в процессе эволюции сформировались сложные молекулярные механизмы регуляции экспрессии генов. Если у бактерий многие гены группируются в опероны, обеспечивая тем самым согласованную экспрессию в ответ на сигналы от внешней среды, то у эукариот данный процесс происходит в первую очередь за счет сложных промоторов и регуляторных белков. На примере азотной катаболитной репрессии видно, что клетки дрожжей & cerevisiae адаптируются к источнику азота в среде с помощью транскрипционных факторов (в частности, Gln1 и Gat1), которые связываются с промоторами NCR-генов [117,121]. Различные изменения в такой системе позволяют транскрипционным факторам и другим регуляторным белкам контролировать другие гены, тем самым регулируя и другие метаболические пути [3]. Так, на тех же дрожжах & cerevisiae было показано, что на метаболизм азота влияют факторы, связанные с фосфатным метболизмом (РЫ85, РЫ4) [33]. Таким образом, в процессе эволюции у дрожжей формируется сложные механизмы, обеспечивающие координировнную регуляцию экспрессии генов в ответ на различные компоненты среды.
Несмотря на то, что внимание исследователей привлечено к регуляции гена AOX1 и других MUT-генов, остается еще много нерешенных вопросов. В частности, оказалось, что все гены метаболизма метанола и биогенеза пероксисом подавляются добавлением в среду пролина [34,35]. В данной работе была предпринята попытка изучить механизмы регуляции этого процесса. Логика исследования представлена на рисунке 26.
Рисунок 26 — Логика проведения исследований в данной работе.
На первом этапе были получены и проанализированы данные транскриптомов для сред с метанолом в качестве источника углерода, содержащих пролин и смесь пролина с сульфатом аммония. В качестве контроля использовали среду с сульфатом аммония.
В ходе работы было показано, что пролин является важнейшей регуляторной молекулой, которая не только влияет на пути утилизации метанола, но и затрагивает важнейшие клеточные процессы, такие как гликолиз, глюконеогенез, ЦТК, трансляцию и дыхание. Особенно важно, что рост на среде с пролином приводит к изменению экспрессии около 18% белок-кодирующих генов K. phaffii. Для 69 генов наблюдается индукция пролином, которая не снимается добавлением в среду сульфата аммония, 127 генов репрессируются пролином, а на экспрессию оставшихся генов пролин влияет по-разному.
При наличии в среде пролина происходит активация экспрессии генов мембранных белков, снижение активности генов стрессового ответа, сложная регуляция активности транспортеров, рибосом, шаперонов и протеасом. Причем в случае просто пролина (MMP / MMN) подавляется именно экспрессия генов протеасомных белков, а на пролине с сульфатом аммония (MMPN / MMN) - были репрессированы гены различных шаперонов. Таким образом, клетки испытывают стресс на среде с метанолом и сульфатом аммония. В первую очередь это может быть окислительный стресс, который связан с активными формами кислорода, образующимися при окислении метанола. В связи с тем, что на среде с пролином происходит снижение активности
генов метаболизма метанола, клетки выходят из состояния стресса и начинают более активно делиться. Именно поэтому может увеличиваться активность генов мембранных белков, а также снижаться экспрессия генов шаперонов и протеасом. Однако механизм регуляции генов, связанных со стрессорными реакциями, требует дальнейшего изучения. Можно предположить, что пролин сам является защитником от активных форм кислорода, либо он активирует глобальную регуляторную систему (например, Тог-киназу).
Сравнение транскриптомных данных показывает, что на средах с пролином и смесью пролина и сульфата аммония репрессия рибосомных белком происходит несколько по-разному. В связи с тем, что на пролине гены метаболизма метанола репрессируются, клетка, вероятно, адаптирует свой аппарат трансляции и снижает уровень экспрессии генов рибосом [106]. При этом может наблюдаться регуляция за счет гетерогенности самих рибосом. Можно предположить, что такая гетерогенность может влиять на регуляцию общего метаболизма клетки [55,103,113]. Для понимания роли возможной гетерогенности рибосом в координированной регуляции генов дрожжей K. pkaffii, необходимы дальнейшие исследования.
Более того, интересно, что и в том, и в другом варианте опытов была репрессирована часть генов, продукты которых являются частью электрон-транспортной цепи митохондрий. То есть можно предположить, что наличие пролина в среде приводит к частичному снижению активности митохондрий. При этом известно, что у K. pkaffii, в отличие от & cerevisiae, митохондрии не подавляются. Скорее всего на среде с пролином, как и в случае с ЦТК и глюконеогенеза, клетка адаптирует активность митохондрий к синтезу АТФ, поскольку пролин окисляется до глутамата с образованием протонов водорода (энергией). Не до конца понятен конкретный механизм, лежащий в основе этой регуляции. Кроме окисления пролина, это также может быть связано со снижением уровня метаболизма метанола, а также с подавлением активности митохондрий через ретроградную регуляцию.
Среди ДЭГ, на которые влияет пролин, можно выявить гены, продукты которых обеспечивают метаболизм азота и углерода.
В метаболизме углерода у дрожжей важную роль играют продукты генов MIG1/2, которые кодируют репрессоры генов углеродного метаболизма. Они являются универсальными белками, которые работают и у & cerevisisae, и у K. pkaffii [64,122]. Для изучения роли этих генов в регуляции гена AOX1 пролином, были получены делеции генов MIG1 и MIG2. Одиночные делеции не влияли на активность гена AOX1. В связи с этим в дальнейшем планируется получить штаммы, несущие делеции в двух генах одновременно.
Продуктом катаболизма пролина как источника азота является глутамат. Если эффекты пролина связаны с его превращением в глутамат, то влияние глутамата на экспрессию генов будет сходным с эффектами пролина. Для этого мы проанализировали транскриптомы на среде
с глутаматом и глутаматом с сульфатом аммония в качестве источника азота. Результаты транскриптомы показали, что эффект глутамата существенно отличается, от эффекта пролина, а именно количество ДЭГ меньше и нет влияния на экспрессию генов катаболизма метанола. Таким образом, глутамат не участвует в регуляции гена AOX1 пролином.
После поступления в митохондрии, пролин окисляется с помощью ферментов пролиноксидазы и пирролин-5-карбоксилатдегидрогенезы с выделением энергии. В данной работе были получены делеции генов PUT1 и PUT2, кодирующие соответствующие ферменты. С помощью репортерной системы КФ было изучено влияние делеции этих генов на экспрессию гена AOX1 в среде с метанолом, пролином и сульфатом аммония. При этом оказалось, что на среде с пролином у данных штаммов не наблюдали дерепрессию гена AOX1. Таким образом, продукты этих генов, а также возможное изменение энергетического состояния клетки не влияет на регуляцию генов метаболизма метанола пролином.
На последнем этапе изучали влияет ли транспорт пролина на экспрессию гена AOX1. У дрожжей К. phaffii существует несколько генов, кодирующих пермеазы пролина. Было выявлено 2 гена, потенциально кодирующих пермеазы пролина. Следует отметить, что у дрожжей cerevisiae существует только один ген РиТ4, несмотря на то, что их геном претерпел полногеномную дупликацию [61]. Исходя из данных транскриптома при наличии в среде пролина активируется только ген РиТ4.2. В работе было показано, что делеция этого гена приводила к снятию репрессии гена АОХ1 пролином. Таким образом, процессы транспорта пролина инициируют репрессию гена АОХ1 пролином. Можно предположить, что продуктом гена РиТ4.2 является белок-трансцептор, который непосредственно активирует сигнальные пути. Помимо этого можно предположить, что существуют пока не идентифицированные факторы, способные влиять на регуляцию генов метаболизма метанола пролином.
Полученные результаты также позволили предложить ряд генов, промоторы которых могут иметь практическую ценность в биотехнологии.
ГЛАВА 5. ВЫВОДЫ
1. Пролин оказывает глобальный эффект на регуляцию экспрессии генов дрожжей K. pkaffii в среде с метанолом.
2. Основные репрессоры глюкозного метаболизма Mig1 и Mig2 по отдельности не оказывают влияния на регуляцию MUT-генов пролином.
3. Катаболизм пролина в митохондриях не оказывает существенного влияния на регуляцию MUT-генов.
4. Белок РШ;4.2 является основным фактором, участвующим в репрессии генов метаболизма метанола пролином у дрожжей K. pkaffii.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Самсонова М.Г., Падкина М.В., Краснопевцева Н.Г. Генетико-биохимическое изучение кислых фосфатаз дрожжей Saccharomyces cerevisiae // Генетика. - 1975. - Т. 11, № 9. - С. 104115.
2. Падкина М.В., Краснопевцева Н.Г., Петрашень М.Г. Генетико-биохимическое изучение кислых фосфатаз дрожжей. Характеристика кислых фосфатаз разных штаммов // Генетика. -1974. - Т. 10. - С. 100-111.
3. Самбук Е.В. Генетические механизмы реализации закона лимитирующего фактора у дрожжей Saccharomyces cerevisiae // Журнал Общей Биологии. - 2005. - Т. 66, № 4. - С. 310-325.
4. Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. - Москва : МЦНМО, 2002. - 248 с.
5. Захаров И.А., Кожин С.А., Кожина Т.Н. Сборник методик по генетике дрожжей-сахаромицетов. - Ленинград : Наука, 1984. - 142 с.
6. Barnett J.A. A history of research on yeasts 10: foundations of yeast genetics // Yeast. - 2007.
- Vol. 24, № 10. - P. 799-845.
7. Parpinello G., Berardi E., Strabbioli R. A regulatory mutant of Hansenula polymorpha exhibiting methanol utilization metabolism and peroxisome proliferation in glucose // J Bacteriol. -1998. - Vol. 180, № 11. - P. 2958-2967.
8. Ogata K., Nishikawa H., Ohsugi M. A Yeast Capable of Utilizing Methanol // Agricultural and Biological Chemistry. - 1969. - Vol. 33, № 10. - P. 1519-1520.
9. Hong S.-P. Activation of yeast Snf1 and mammalian AMP-activated protein kinase by upstream kinases / S.-P. Hong, F.C. Leiper, A. Woods, D. Carling, M. Carlson // Proc Natl Acad Sci USA. - 2003.
- Vol. 100, № 15. - P. 8839-8843.
10. Zhang F. Adenosine Triphosphate (ATP) Is a Candidate Signaling Molecule in the Mitochondria-to-Nucleus Retrograde Response Pathway / F. Zhang, T. Pracheil, J. Thornton, Z. Liu // Genes (Basel). - 2013. - Vol. 4, № 1. - P. 86-100.
11. Zha J. Advances in Metabolic Engineering of Pichia pastoris Strains as Powerful Cell Factories / J. Zha, D. Liu, J. Ren, Z. Liu, X. Wu // J Fungi (Basel). - 2023. - Vol. 9, № 10. - P. 1027.
12. Wiesenthal A.A. Alanine, proline and urea are major organic osmolytes in the snail Theodoxus fluviatilis under hyperosmotic stress / A.A. Wiesenthal, C. Müller, K. Harder, J.-P. Hildebrandt // J Exp Biol. - 2019. - Vol. 222, № Pt 3. - P. jeb193557.
13. Makeeva A. Alternative PCR-Based Approaches for Generation of Komagataella phaffii Strains / A. Makeeva, D. Muzaev, M. Shubert, T. Ianshina, A. Sidorin, E. Sambuk, A. Rumyantsev, M. Padkina // Microorganisms. - 2023. - Vol. 11, № 9. - P. 2297.
14. Gomes A.R. An Overview of Heterologous Expression Host Systems for the Production of Recombinant Proteins / A.R. Gomes, S.M. Byregowda, B.M. Veeregowda, V. Balamurugan // Adv. Anim. Vet. Sci. - 2016. - Vol. 4, № 7. - P. 346-356.
15. Hagman A., Säll T., Piskur J. Analysis of the yeast short-term Crabtree effect and its origin // FEBS J. - 2014. - Vol. 281, № 21. - P. 4805-4814.
16. Röhrig U.F. Attracting Cavities 2.0: Improving the Flexibility and Robustness for Small-Molecule Docking / U.F. Röhrig, M. Goullieux, M. Bugnon, V. Zoete // J Chem Inf Model. - 2023. -Vol. 63, № 12. - P. 3925-3940.
17. Cock P.J.A. Biopython: freely available Python tools for computational molecular biology and bioinformatics / P.J.A. Cock, T. Antao, J.T. Chang, B.A. Chapman, C.J. Cox, A. Dalke, I. Friedberg, T. Hamelryck, F. Kauff, B. Wilczynski, M.J.L. de Hoon // Bioinformatics. - 2009. - Vol. 25, № 11. - P. 1422-1423.
18. Freese S. C- and N-catabolic utilization of tricarboxylic acid cycle-related amino acids by Scheffersomyces stipitis and other yeasts / S. Freese, T. Vogts, F. Speer, B. Schäfer, V. Passoth, U. Klinner // Yeast. - 2011. - Vol. 28, № 5. - P. 375-390.
19. Zhang P. Catabolite repression of Aox in Pichia pastoris is dependent on hexose transporter PpHxt1 and pexophagy / P. Zhang, W. Zhang, X. Zhou, P. Bai, J.M. Cregg, Y. Zhang // Appl Environ Microbiol. - 2010. - Vol. 76, № 18. - P. 6108-6118.
20. Vijay Kumar N., Rangarajan P.N. Catabolite repression of phosphoenolpyruvate carboxykinase by a zinc finger protein under biotin- and pyruvate carboxylase-deficient conditions in Pichia pastoris // Microbiology (Reading). - 2011. - Vol. 157, № Pt 12. - P. 3361-3369.
21. Celenza J.L., Carlson M. Cloning and genetic mapping of SNF1, a gene required for expression of glucose-repressible genes in Saccharomyces cerevisiae // Mol Cell Biol. - 1984. - Vol. 4, № 1. - P. 49-53.
22. Hancock C.N. Co-regulation of mitochondrial respiration by proline dehydrogenase/oxidase and succinate / C.N. Hancock, W. Liu, W.G. Alvord, J.M. Phang // Amino Acids. - 2016. - Vol. 48, № 3. - P. 859-872.
23. Olivares O. Collagen-derived proline promotes pancreatic ductal adenocarcinoma cell survival under nutrient limited conditions / O. Olivares, J.R. Mayers, V. Gouirand, M.E. Torrence, T. Gicquel, L. Borge, S. Lac, J. Roques, M.-N. Lavaut, P. Berthezene, M. Rubis, V. Secq, S. Garcia, V. Moutardier, D. Lombardo, J.L. Iovanna, R. Tomasini, F. Guillaumond, M.G. Vander Heiden, S. Vasseur // Nat Commun. - 2017. - Vol. 8. - P. 16031.
24. Westholm J.O. Combinatorial control of gene expression by the three yeast repressors Mig1, Mig2 and Mig3 / J.O. Westholm, N. Nordberg, E. Muren, A. Ameur, J. Komorowski, H. Ronne // BMC Genomics. - 2008. - Vol. 9. - P. 601.
25. Galanie S. Complete biosynthesis of opioids in yeast / S. Galanie, K. Thodey, I.J. Trenchard, M. Filsinger Interrante, C.D. Smolke // Science. - 2015. - Vol. 349, № 6252. - P. 1095-1100.
26. Wieczorke R. Concurrent knock-out of at least 20 transporter genes is required to block uptake of hexoses in Saccharomyces cerevisiae / R. Wieczorke, S. Krampe, T. Weierstall, K. Freidel, C.P. Hollenberg, E. Boles // FEBS Lett. - 1999. - Vol. 464, № 3. - P. 123-128.
27. Liu Q. CRISPR-Cas9-mediated genomic multiloci integration in Pichia pastoris / Q. Liu, X. Shi, L. Song, H. Liu, X. Zhou, Q. Wang, Y. Zhang, M. Cai // Microb Cell Fact. - 2019. - Vol. 18, № 1.
Обратите внимание, представленные выше научные тексты размещены для ознакомления и получены посредством распознавания оригинальных текстов диссертаций (OCR). В связи с чем, в них могут содержаться ошибки, связанные с несовершенством алгоритмов распознавания. В PDF файлах диссертаций и авторефератов, которые мы доставляем, подобных ошибок нет.