Ядерная магнитная и механическая релаксация в дендримерах тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, доктор наук Шевелева Надежда Николаевна

• Шевелева Надежда Николаевна
• доктор наук
• 2026

Оглавление диссертации доктор наук Шевелева Надежда Николаевна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. Состояние вопроса

1.1. Определение и структура

1.2. Способы синтеза дендримеров

1.3. Типы дендримеров

1.3.1. Полиамидоаминные дендримеры

1.3.2. Полипропилениминные дендримеры

1.3.3. Карбосилановые дендримеры

1.3.4. Пептидные дендримеры

1.3.5. Поли-Ь-лизиновые дендримеры

1.4. Применение дендримеров

1.5. ЯМР релаксация и локальная ориентационная подвижность в дендримерах

1.6. Механическая релаксация в дендримерах

Выводы

ГЛАВА 2. 1Н и ^ ЯМР спектроскопия дендримеров

2.1. Описание образцов

2.2. Проведение ЯМР эксперимента

2.3. Анализ ЯМР спектров

2.4. Размер дендримеров

Выводы

ГЛАВА 3. ЯМР релаксация в дендримерах

3.1. Теоретические аспекты

3.2. Теоретические и экспериментальные подходы для исследования ЯМР релаксации в дендримере

3.2.1. Построение теории ЯМР релаксации в функционализированных дендримерах на модели гауссовых субцепей

3.2.1.1. Описание модели и методика расчета частотных зависимостей спин-решеточной ЯМР релаксации

3.2.1.2. Результаты

3.2.2. Сравнение с молекулярно-динамическим моделированием

карбосилановых дендримеров

3.3. Изучение ЯМР релаксации в пептидных дендримерах методами ЯМР и молекулярно-динамического моделирования

3.3.1. ЯМР релаксация и локальная ориентационная подвижность в пептидных дендримерах

3.3.1.1. ЯМР релаксация терминальных (концевых) групп

3.3.1.2. ЯМР релаксация внутренних групп

3.3.1.3. ЯМР релаксация боковых групп

3.3.2. Влияние рН среды на ЯМР релаксацию в пептидных дендримерах

Выводы

ГЛАВА 4. Свойства пептидных дендримеров, содержащих гистидин, и перспективы их практического использования в качестве наноконтейнеров

4.1. Подтверждение коллапса Lys-2His дендримера при повышении pH

4.1.1. Описание методов, используемых для измерения радиуса инерции и гидродинамического радиуса

4.1.2. Результаты

4.1.2.1. Радиус инерции. Измерения МУРР

4.1.2.2. Гидродинамический радиус. Измерения ДРС

4.1.2.3.Результаты МД моделирования

4.2. Дейтерирование пептидных дендримеров

4.3. Использования пептидных дендримеров, содержащих гистидин, в качестве

наноконтейнеров

Выводы

ГЛАВА 5. Механическая релаксация в дендримерах

5.1. Сборка атомистических моделей дендримеров для моделирования методом молекулярной динамики

5.2. Молекулярно-динамическое моделирование механической релаксации в расплавах дендримеров

5.2.1. Релаксационный модуль

5.2.2. Модули упругости и потерь

5.2.3. Сравнение результатов МД моделирования и эксперимента для расплавов PPI дендримеров

5.3. Эффект плотного окружения

5.4. Эффект водородных связей

5.5. Максимальное время механической релаксации и время вращения

дендримера как целого

Выводы

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ А. Детальный анализ HSQC и HMBC ЯМР спектров

различных сегментов Lys-2Arg дендримера

ПРИЛОЖЕНИЕ Б. 2D ЯМР спектры пептидных дендримеров

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Ядерная магнитная и механическая релаксация в дендримерах»

Актуальность

Дендримеры (от греческого 5ev5p®v - дерево) - разветвленные макромолекулы с уникальной высокоупорядоченной архитектурой. Дендримеры имеют звездоподобную топологию, в которой роль «лучей», выходящих из общего центра, играют регулярно ветвящиеся дендроны. Впервые такие макромолекулы, названные «каскадными макромолекулами» по методу синтеза, были получены в 1978 году. Современное название «дендримеры» они получили в работе D. A. Tomalia с соавторами. Дальнейшее развитие методов синтеза в работах этой группы, а также группы G. R. Newkome с соавторами, привело к возможности создания дендронов различной химической структуры в широком интервале числа генераций, а также целого ряда макромолекулярных структур, элементами которых являются дендримеры (линейная цепь из связанных дендримеров - «Starburst-dendritic macromolecules») или отдельные дендроны (дендриграфты, дендронизованные полимеры). Начиная с 1980-90 гг. дендримеры стали объектом многочисленных исследований. Однако даже спустя более 40 лет интерес к исследованию дендримеров не ослабевает. В течение последних лет ежегодно публикуется более 1000 статей, посвященных исследованию дендримеров (по данным наукометрической базы Scopus).

Интерес к дендримерам обусловлен их уникальной архитектурой и рядом исключительных свойств: (i) высокая монодисперсность - получаемые дендримеры практически не содержат распределения по размерам, а их гидродинамические размеры можно контролировать за счет изменения числа поколений, химической структуры концевых групп и условий окружающей среды; (ii) наноразмеры (1-10 нм) обеспечивают высокую проницаемость через клеточные мембраны и биологические барьеры; (iii) большое число концевых групп, которые могут быть модифицированы для придания дендримерам целевых свойств, например, растворимости, биосовместимости или способности к целевой доставке. Все эти особенности стали ключевыми для использования дендримеров в различных областях полимерной химии, биологии и медицины.

Одним из наиболее перспективных направлений применения дендримеров является их использование в качестве наноконтейнеров, способных связывать молекулы или наночастицы внутри или на поверхности и доставлять их в заданную область с последующим контролируемым высвобождением. Механизм связывания зависит от химической структуры дендримера, природы целевого объекта и свойств растворителя, и может быть обусловлен гидрофобными, водородными или электростатическими взаимодействиями. В настоящее время технологии на основе дендримеров уже применяются на практике. Например, дендримеры используются в качестве нанореакторов для синтеза и стабилизации металлических наночастиц. Для усиления сигнала в компьютерной (КТ) и магнитно-резонансной (МРТ) томографии разработаны системы с контрастными агентами, инкапсулированными внутри дендримеров.

Свойства дендримеров как наноконтейнеров уже активно используются для доставки лекарственных препаратов и контрастных агентов в биомедицинских приложениях. В этом контексте применение пептидных дендримеров расширяет возможности таких систем благодаря ряду преимуществ, таких как биоразлагаемость, низкая токсичность и возможность модифицировать аминокислотный состав как концевых, так и внутренних сегментов. Поэтому исследования новых пептидных дендримеров представленных в Главах 2, 3, и 4 являются несомненно актуальными.

Исследования реологических свойств расплавов дендримеров в Главе 5 представляют как фундаментальный интерес (поскольку классические теории полимерных макромолекул не позволяют удовлетворительно описать поведение расплавов дендримеров), так и практический - для разработки новых функциональных материалов.

Целью данной диссертационной работы являлось изучение структурных и динамических характеристик новых пептидных дендримеров, функционализированных путем введения двойных аминокислотных остатков -

(лизина (2Lys), глицина (2Gly), аргинина (2Arg), гистидина (2His), с разным порядком аминокислотных остатков (Arg-His) и (His-Arg)) - во внутренние сегменты макромолекулы и установление общих закономерностей их поведения с использованием экспериментальных и теоретических методов; теоретическое исследование реологических свойств расплавов карбосилановых, полипропилениминных и полиамидаминных дендримеров методом молекулярно-динамического моделирования.

Для достижения данной цели необходимо было решить следующие задачи:

- построить аналитическую теорию ЯМР релаксации для функционализированных дендримеров; использовать данную теорию для анализа корректности результатов компьютерного моделирования и описания экспериментальных данных ЯМР для пептидных дендримеров;

- исследовать структурные и динамические свойства функционализированных пептидных дендримеров в зависимости от аминокислотного состава;

- исследовать временные и частотные зависимости механической релаксации дендримеров различной архитектуры в расплавах методом молекулярно-динамического моделирования;

- выявить общие закономерности ЯМР и механической релаксации в дендримерах, обусловленные их древовидной архитектурой.

Научная новизна

Все представленные результаты являются новыми. Следует отметить следующие важнейшие результаты и методы:

1. Впервые методами ^ и 13С ЯМР спектроскопии была исследована и подтверждена химическая структура новых функционализированных пептидных дендримеров: Lys-2Lys, Lys-2Gly, Lys-2Arg, Lys-2His, Lys-His-Arg и Lys-Arg-His.

2. Впервые построена теория ЯМР релаксации для различных молекулярных групп в функционализированных дендримерах.

3. Получены температурные зависимости скорости спин-решеточной ЯМР релаксации для отдельных групп в новых пептидных дендримерах; установлены закономерности подвижности этих групп и, в частности, групп, расположенных в функционализированных (боковых) сегментах.

4. Впервые показано изменение глобальной конформации Ьув-2Н1в дендримера при повышении рН (от набухшей к коллапсированной конформации), обусловленное влиянием п-п взаимодействия (эффекта пэйринга) между имидазольными группами остатков гистидина, а также проявление этого эффекта в ЯМР спектрах и ЯМР релаксации дендримера.

5. Предложен экспериментальный метод идентификации наличия эффекта пэйринга в гистидинсодержащих дендримерах, на примере Ьув-2Н1в, ЬуБ-А^-Шв и ЬуБ-ШБ-А^ дендримеров, с помощью ЯМР спектроскопии и ЯМР релаксации.

6. Предложен метод создания стабильных дейтериевых меток в имидазольных кольцах остатков гистидина Ьув-2Н1в дендримера.

7. Впервые теоретически и экспериментально показана возможность инкапсуляции Ьув-2Н1в дендримером фуллерена С70.

8. С помощью данных молекулярно-динамического моделирования были получены и проанализированы временные и частотные зависимости динамического модуля расплавов функционализированных карбосилановых, полипропилениминных и полиамидаминных дендримеров различных поколений.

9. Впервые показано, что в расплавах дендримеров при увеличении числа генераций или функционализации внутренних сегментов формируется непроницаемое ядро, которое приводит проявлению эффекта плотного окружения и замедлению механической релаксации.

Научная и практическая значимость работы

В представленной диссертационной работе развиты теоретические представления и экспериментальные подходы, впервые позволившие исследовать структурно-динамические свойства функционализированных пептидных дендримеров в растворе, а также механическую релаксацию дендримеров различной химической природы в расплавах.

Применение интегрированного подхода, сочетающего аналитическую теорию, методы компьютерного моделирования и экспериментальные исследования, позволило выявить ключевые факторы, влияющие на ЯМР релаксацию, структурные свойства и глобальную конформацию функционализированных пептидных дендримеров. В результате получена комплексная картина структурных и динамических свойств функционализированных пептидных дендримеров.

Исследования реологических свойств расплавов дендримеров методом молекулярной динамики позволили разработать методологическую основу для анализа механической релаксации дендримерных систем с различной архитектурой.

Полученные результаты имеют важное научное значение, поскольку расширяют понимание связи между молекулярной структурой и динамическими/равновесными свойствами дендримерных систем.

С практической точки зрения, работа открывает перспективы для практического применения, в частности, в области наномедицины, доставки биологически активных соединений и создания функциональных наноматериалов.

Методы исследования

В работе применялось современное оборудование для проведения экспериментов. Экспериментальные данные были получены методами ЯМР спектроскопии и ЯМР релаксации, малоуглового рентгеновского рассеяния и динамического рассеяния света. ЯМР исследования были проведены на

оборудовании ресурсного центра (РЦ) «Магнитно-резонансные методы исследования» научного парка СПбГУ на спектрометрах ЯМР Bruker Avance III 400 и 500 МГц. Эксперименты по малоугловому рентгеновскому рассеянию выполнены на станции «БиоМУР» синхротронной установки НИЦ «Курчатовский институт». Динамическое рассеяние света проводилось на лабораторной установке «PhotoCor Complex» (Photocor Instruments, Inc., Москва, Россия). Пробоподготовка части образцов проводилась с использованием оборудования РЦ «Центр диагностики функциональных материалов для медицины, фармакологии и наноэлектроники» СПбГУ.

Для моделирования дендримеров использовалось оборудование и программное обеспечение РЦ «Вычислительный центр Санкт-Петербургского государственного университета». Для создания атомистических моделей и квантово-химических расчетов использовался пакет Materials Studio 6.0. Компьютерное моделирование было выполнено методом молекулярной динамики в пакете GROMACS.

Аналитическая теория ЯМР релаксации в функционализированных дендримерах была построена с помощью модели Каргина-Слонимского-Рауза с дополнительным учетом жесткости сегментов дендримера на изгиб.

Достоверность

Достоверность результатов обеспечивается хорошим количественным согласием полученных результатов молекулярно-динамического моделирования с экспериментальными данными, как полученными в работе, так и представленными в научной литературе, а также воспроизводимостью полученных в диссертационной работе экспериментальных результатов.

Апробация работы:

Публикации. Научные результаты, представленные в данной диссертации, опубликованы в 15 статьях, причем все 15 изданы в журналах индексируемых в наукометрических базах Web of Science и Scopus, в том числе 13 из них опубликованы в журналах первого квартиля (Q1) по данным SCImago Journal Rank (SJR) и Journal Citation Reports (JCR). Опубликовано также 12 тезисов докладов по материалам диссертации на российских и международных конференциях.

Конференции. Результаты работы докладывались на следующих конференциях: V International Conference on Colloid Chemistry and Physicochemical Mechanics. Saint Petersburg, 2018; XXV Всероссийской конференции «Структура и динамика молекулярных систем», Йошкар-Ола, 2018; Девятой Всероссийской Каргинской конференции «Полимеры - 2024». Москва, 2024; International Conference «Spinus. Magnetic Resonance and its Applications», Saint Petersburg, 2018, 2024-2021.

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, пяти глав, заключения, списка цитируемой литературы (365 наименований) и приложений. Работа изложена на 221 странице текста, содержит 72 рисунка и 7 таблиц.

В первой главе настоящей работы проведен обзор современных результатов теоретических и экспериментальных исследований, посвященных изучению равновесных и динамических свойств дендримерных макромолекул в растворе; реологических свойств дендримеров в расплавах. Рассмотрены области практического применения дендримерных систем, отражающие их значимость в современных нанотехнологиях и биомедицине.

Во второй главе представлены результаты исследования функционализированных пептидных дендримеров методом ЯМР спектроскопии. Приведен детальный анализ 1H и 13C ЯМР спектров, позволивший подтвердить

химическую структуру макромолекул, а также выявить структурные особенности конкретных дендримеров, связанные с их функционализацией.

В третьей главе описывается развитие теории ЯМР релаксации в функционализированных дендримерах. Проводится теоретическое и экспериментальное исследование температурных зависимостей скорости спин-решеточной ЯМР релаксации различных групп новых функционализированных пептидных дендримеров. Рассмотрено влияние эффектов исключенного объема на ЯМР релаксацию дендримера в набухшей и коллапсированной конформациях.

В четвертой главе исследуются структурные свойства (в т.ч. и глобальная конформация) нового пептидного Ьув-2Н1в дендримера при различных значениях рН с помощью различных экспериментальных методов и молекулярно-динамического моделирования. Обсуждается аномальное изменение отношения радиуса инерции к гидродинамическому радиусу при изменении конформации ЬуБ-2Н18 дендримера.

В пятой главе проводится исследование временных и частотных зависимостей динамического модуля расплавов дендримеров различной химической структуры (карбосилановые, полипропилениминные и полиамидаминные) и разных генераций (О = 2-5). Проводится анализ эффекта плотного окружения и процессов, проявляющихся в механической релаксации.

Основные научные результаты

Материалы диссертации являются обобщением работ автора по теме исследования. Представленные в диссертации результаты получены автором лично, либо в соавторстве при непосредственном участии. Автор внес значительный вклад как в постановку решаемых в работе задач, так и в проведении теоретических исследований и экспериментов, в выполнение обработки и анализа полученных данных и в подготовку результатов исследований для публикации в научных изданиях.

1. Экспериментально подтверждена и проанализирована химическая структура новых пептидных дендримеров второго поколения, содержащих двойные остатки глицина (2Gly), лизина (2Lys), аргинина (2А^), гистидина (2His), а также разный порядок аминокислотных остатков (Arg-His) и (Н^-А^) в боковых сегментах. Работы [1-4] выполнены автором полностью.

2. С помощью развития теории и данных молекулярно-динамического моделирования установлено, что дополнительный процесс, связанный с нерегулярным ветвлением, является отличительной чертой ЯМР релаксации функционализированных дендримеров. Вклад данного процесса в ЯМР релаксацию аналогичен вкладу внутреннего спектра (т.е. слабо зависит от размеров дендримера и положения функционализированных сегментов в дендримере), но смещен относительно него в область низких частот (больших времен). Работа [5] выполнена автором полностью.

3. Подтверждена применимость ранее разработанной теории ЯМР релаксации для стандартных дендримеров для рассматриваемых пептидных дендримеров в водном растворе, поскольку вклад процесса, связанного с функционализацией, оказался незначителен в экспериментальном температурном диапазоне, ограниченном точками кипения и замерзания растворителя. Работы [1,2,4] выполнены автором полностью. В работах [6,7] вклад автора в обработку и анализ данных не менее 50%.

4. С помощью молекулярно-динамического моделирования и ЯМР эксперимента показано, что в функционализированных сегментах дендримера ориентационная подвижность группы и ее вклад в ЯМР релаксацию определяются топологической удаленностью группы от конца сегмента: при минимальной удаленности подвижность группы соответствует подвижности группы в концевом сегменте; при увеличении данной удаленности подвижность группы уменьшается вплоть до подвижности группы внутреннего сегмента. Вклад автора в получение и анализ экспериментальных данных, а также подготовку к публикации работы [8] не менее 50 %.

5. Установлено, что в коллапсированной конформации дендримера ЯМР релаксация групп определяется только вращательной подвижностью дендримера как целого, что обусловлено влиянием эффектов исключенного объема, тогда как в набухшей конформации данные эффекты не оказывают влияние на ЯМР релаксацию в дендримере. Работа [9] выполнена автором полностью.

6. С помощью экспериментальных методов и данных молекулярно-динамического моделирования установлено, что конформация Lys-2His дендримера чувствительна к изменению pH среды: при низких значениях pH макромолекула принимает набухшую конформацию, при нейтральных и повышенных pH переходит в коллапсированную. Показано, что коллапс дендримера вызван п-п взаимодействием (эффектом пэйринга) между имидазольными группами аминокислотных остатков His, которое практически отсутствует при низких pH. Вклад автора в работу [10] составляет не менее 80%.

7. Предложен метод прямого дейтерирования Lys-2His дендримера путем замещения атома водорода дейтерием при углероде в положении C2 в имидазольном кольце остатков гистидина при нагревании в дейтерированной воде. Данный дендример сохраняет достигнутую степень дейтерирования при физиологических условиях. Работа [3] выполнена автором полностью.

8. Установлено, что пептидный дендример Lys-2His образует комплекс с фуллереном С70. При этом молекула фуллерена инкапсулируется во внутренней области дендримера, взаимодействуя с имидазольными кольцами остатков гистидина посредством п-п взаимодействия. Работа [11] выполнена автором полностью. В работе [12] вклад автора в обработку и анализ данных не менее 50%.

9. В расплавах карбосилановых дендримеров дополнительный процесс, связанный с функционализацией дендримера, проявляется в динамическом модуле на малых временах (высоких частотах) только для низких генераций. Работа [13] выполнена автором полностью.

10. С помощью молекулярно-динамического моделирования расплавов дендримеров показано, что формирование в макромолекуле непроницаемого ядра, препятствующего проникновению соседних дендримеров, приводит к появлению в частотной зависимости динамического модуля области, в которой модуль упругости превышает модуль потерь (О' > О"). Установлено, что возникновение этой области связано не с зацеплениями между дендримерами, а с проявлением эффекта плотного окружения, возникающим вследствие пространственного ограничения подвижности макромолекул. Работы [13-15] выполнены автором полностью.

Положения, выносимые на защиту

Совокупность выполненных исследований можно квалифицировать как новое крупное научное достижение в области исследования дендримерных систем. Более детально положения, выносимые на защиту, изложены в следующих пунктах:

1. В функционализированных дендримерах проявление в ЯМР релаксации дополнительного процесса, вызванного подвижностью неветвящихся функционализированных сегментов, аналогично проявлению процесса, обусловленного локальной мелкомасштабной подвижностью сегментов, т.е. слабо зависит от размера макромолекулы и положения сегментов в дендримере. Для пептидных дендримеров в водном растворе вклад дополнительного процесса в исследованном температурном диапазоне незначителен.

2. Ориентационная подвижность группы в функционализированных сегментах дендримера и ее вклад в ЯМР релаксацию зависит от топологической удаленности группы от конца сегмента: при минимальной удаленности подвижность группы соответствует подвижности группы в концевом сегменте; при увеличении удаленности подвижность группы уменьшается, а при максимальной удаленности становится равной подвижности группы внутреннего сегмента.

3. Вращение дендримера как целого является определяющим фактором в ЯМР релаксации групп дендримера в коллапсированной конформации и обусловлено влиянием эффектов исключенного объема.

4. Изменение конформации пептидного дендримера, содержащего аминокислотные остатки гистидина (Lys-2His) зависит от pH среды: при низких значениях pH макромолекула принимает набухшую конформацию, тогда как при нейтральных и повышенных pH переходит в коллапсированную. Коллапс дендримера вызван п-п взаимодействием (эффектом пэйринга) между имидазольными группами аминокислотных остатков His, которое практически отсутствует при низких pH.

5. Формирование в дендримере непроницаемого ядра, препятствующего проникновению соседних макромолекул, приводит к пространственному ограничению подвижности дендримеров в расплавах (эффекту плотного окружения), которое проявляется в замедлении механической релаксации.

ГЛАВА 1. Состояние вопроса 1.1. Определение и структура

Дендримеры представляют собой класс искусственных макромолекул с гиперразветвленной древовидной структурой [16,17]. Термин «дендример» имеет греческое происхождение от слов «dendron», что означает «дерево», и «meros», что означает «часть» [18].

Первые дендримероподобные соединения были синтезированы в 1978 году группой химиков во главе с F. Vogtle [19]. Однако, из-за трудностей возникших при синтезе были получены соединения лишь низкой генерации. Спустя несколько лет, Denkewalter запатентовал дивергентный метод синтеза полилизиновых (PLL) дендримеров. В 1985 году группа D. A. Tomalia синтезировала полиамидаминные (PAMAM) дендримеры вплоть до 10-го поколения [20]. В то же время G. R. Newkome с коллегами опубликовали статью, посвященную синтезу полиэфирных дендримеров [21].

Дендримеры представляют собой наноразмерные макромолекулы с четко определенным молекулярным весом, имеющие радиальную симметрию и чрезвычайно низкую полидисперсность [22-26]. Уникальная структура дендримера характеризуется наличием трех основных компонентов, а именно: центрального ядра; внутренних слоев, состоящих из повторяющихся разветвленных сегментов; и терминального слоя, содержащего концевые группы. Каждый слой мономеров дендримера составляет одно «поколение» или «генерацию» и обозначается как G. Обычно дендримеры с G < 4 и G > 4 называются дендримерами низкой и высокой генерации соответственно. Дендримеры низких генераций отличаются открытой и ассиметричной конформацией. С увеличением поколения дендримерная макромолекула все больше приобретает сферическую форму [27]. Общая структура дендримера показана на рис. 1.1.

Рисунок 1.1. Схематичная иллюстрация структуры дендримера.

С момента открытия дендримеры не перестают являться объектом изучения ученых [28,29], о чем свидетельствует растущее число публикаций. В течение последних лет ежегодно публикуется более 1000 статей, посвященных исследованию дендримеров (по данным наукометрической базы Scopus). Причина этого заключается в глобальном спросе на новые наномолекулы и материалы на их основе, которые могут использоваться в передовых технологиях и медицине [3032]. Благодаря уникальным структурным свойствам, дендримеры широко используются в биомедицине [33,34], особенно в качестве наноносителей для доставки лекарств [31,35-56] и генов [30,57-59] контрастных агентов для МРТ [6062]. В промышленной сфере макромолекулы дендримеров вызывают значительный интерес в качестве катализаторов [34], наносенсоров [63-65], а также модификаторов и технологических добавок для различных материалов с целью улучшения их механических свойств [66-68].

1.2. Способы синтеза дендримеров

Синтез дендримеров представляет собой поэтапный контролируемый процесс, который дает возможность получить монодисперсные макромолекулы с регулярной структурой и определенным молекулярным весом. Дендримеры обычно синтезируются с использованием цепочки последовательных этапов роста и активации [69]. Из-за их идеально разветвленной структуры синтез дендримеров требует использования надежных органических реакций, которые могут эффективно протекать даже на макромолекулярном уровне. Синтез дендримеров в настоящее время осуществляется с применением широкого спектра как известных, так и новых высокоселективных реакций. Однако, не смотря на разработку новых и более простых синтетических процедур, данный процесс все еще очень трудоемкий и времязатратный [70]. Существуют две основные стратегии синтеза дендримеров: дивергентный и конвергентный методы, каждый из которых имеет свои преимущества и недостатки. Главным различием является направление роста дендримера: в случае дивергентного метода - от ядра к периферии, и наоборот, в случае конвергентного [26].

Дивергентный метод синтеза был разработан еще в первых работах по дендримерам [19,20] и до сих пор остается наиболее используемым. Сборка дендримера начинается от ядра и направлена к периферии. В основе метода лежит последовательность двух основных реакций: присоединении мономеров и (и) активации концевых групп мономеров для того, чтобы произошла следующая стадия ветвления. Эти два шага повторяются до получения дендримера необходимого поколения. При этом каждый этап реакции должен быть полностью завершен до добавления нового поколения, чтобы избежать дефектов при ветвлении [71]. Одним из преимуществ данного метода является возможность модифицировать периферийный слой дендримера различными функциональными группами, придавая дендримерам нужные физико-химические свойства. К недостаткам можно отнести избыток используемых реагентов, накопление дефектов с ростом поколений, а также необходимость длительной очистки на каждом шаге от от непрореагировавших реагентов и побочных продуктов [33].

Список литературы диссертационного исследования доктор наук Шевелева Надежда Николаевна, 2026 год

- • -

СН2 группы • .

■ ф Lys-His-Arg, боковые и внутренние •

ф Lys-2His, боковые и внутренние i.i.i.

3.0 3.2 3.4

1000/Т, К'1

3.6

1000/Т,

Рисунок 3.17. Температурные зависимости скорости спин-решеточной релаксации, 1/Тш, внутренних и боковых СН2-(Ы) групп (а) для Lys-Arg-His (б) для Ьуз-Шз-Л^ дендримеров; (в) для терминальных групп дендримеров в температурном диапазоне 283-343 К. Зависимости 1/Тш для рассматриваемых типов групп дендримеров Lys-2Arg (набухшая конформация) и Lys-2His (коллапсированая конформация) использованы в качестве референса.

Как видно из рис. 3.17а, зависимость 1/Тш для боковых и внутренних групп дендримера Lys-Arg-His практически совпадает с кривой 1/Тщ для внутренних групп дендримера Lys-2Arg. Это означает, что подвижность внутренних и боковых групп Lys-Arg-His указывает на набухшую конформацию дендримера. Однако следует отметить, что в дендримере Lys-Arg-His боковые группы в Arg сегментах, вклад которых составляет 40 %, имеют более высокую подвижность, чем боковые

группы в His сегментах и внутренние группы. Для иллюстрации на рис. 3.17а показана кривая 1/T1H для боковых групп дендримера Lys-2Arg, максимум которой наблюдается значительно правее, чем для других групп. Можно ожидать, что в случае Lys-Arg-His боковые группы в Arg сегментах будут иметь аналогичную подвижность. Если можно было бы выделить сигнал только от внутренних групп дендримера Lys-Arg-His, то, очевидно, что положение максимума 1/T1H было бы левее максимума для внутренних групп в Lys-2Arg. Таким образом, можно сделать вывод, что подвижность внутренних групп в Lys-Arg-His медленнее, чем в дендримере Lys-2Arg.

В случае дендримера Lys-His-Arg (рис. 3.17б) максимум кривой 1/Tih для внутренних и боковых групп смещен на 10 К в область высоких температур по сравнению с аналогичным максимумом для Lys-Arg-His (рис. 3.17а). Учитывая вклад боковых групп в Arg сегментах, можно ожидать, что смещение максимума для внутренних групп будет еще более значительным и близким к зависимости 1/Tih для дендримера Lys-2His (в коллапсированной конформации). Такое замедление подвижности внутренних групп свидетельствует о том, что конформация дендримера Lys-His-Arg близка к коллапсированной.

Аналогичные выводы можно сделать из температурной зависимости 1/T1H для концевых групп (рис. 3.17в). Подвижность концевых групп дендримера Lys-Arg-His аналогична подвижности дендримера Lys-2Arg. В то же время зависимости 1/T1H для концевых групп Lys-His-Arg и Lys-2His имеют схожее поведение.

Таким образом, по данным ЯМР релаксации можно утверждать, что, несмотря на одинаковый химический состав, дендримеры Lys-Arg-His и Lys-His-Arg имеют разные конформационные структуры. Глобальная конформация дендримера Lys-His-Arg близка к коллапсированной, а конформация дендримера Lys-Arg-His более набухшая.

Выводы

Была разработана теория ориентационной подвижности для дендримеров с функционализированными сегментами, в которой показано, что дополнительный процесс, связанный с нерегулярным ветвлением, является отличительной чертой ЯМР релаксации функционализированных дендримеров. Наличие данного процесса приводит к значительному максимуму на высоких частотах, который не зависит от топологического положения выбранного сегмента. В исключительных случаях для терминальных сегментов этот процесс не играет никакой роли, поскольку в общей релаксации доминирует вклад одного сегмента. Теоретические результаты были сопоставлены с результатами для расплавов карбосилановых дендримеров, которые были полученными с помощью атомистического молекулярно-динамического моделирования. Было отмечено качественное и количественное соответствие теоретических и моделируемых результатов.

Для исследованных пептидных дендримеров, которые следует отнести к жесткоцепным функционализированным дендримерам, можно сделать вывод, что ранее разработанная теория для стандартных дендримеров может быть использована и для них, поскольку 1) проявление дополнительного процесса аналогично вкладу внутреннего спектра и 2) экспериментальное окно для пептидных дендримеров в водном растворе позволяет наблюдать область, где релаксация ветвей и вращение дендримера как целого вносят основной вклад в ЯМР релаксацию.

Локальная ориентационная подвижность внутри дендримера является важной характеристикой для доставки лекарств и генов, синтеза наночастиц и других специальных целей. Для изучения локальной ориентационной подвижности в этих дендримерах были рассмотрены температурные зависимости скорости спин-решеточной релаксации, 1/7щ, внутренних, боковых и концевых СН2-^) групп. Последние химически связаны с атомами N и имеют сигналы в области (~3 м.д.) 1Н ЯМР спектра пептидного дендримера. Значения 1/Т1Н для концевых СН2-(К) групп экспоненциально увеличиваются с понижением температуры и различаются незначительно для всех исследованных дендримеров. Подвижность

концевых групп практически не зависит от размера и древовидной структуры макромолекул. Подвижность боковых СН2-^) групп во всех рассмотренных дендримерах определяется жесткостью на изгиб бокового сегмента и сильно зависит от топологического расстояния от конца сегмента до выбранной группы. Однако в дендримере Lys-2His ЯМР релаксация боковых и внутренних СН2-^) групп совпадает. Это исключение обусловлено тем, что боковая группа связана с внутренним сегментом одной химической связью.

Экспериментальные исследования дендримеров Lys-2Lys и Lys-2Gly подтверждают теоретический вывод о том, что ЯМР релаксация в дендримере в набухшей конформации слабо чувствительна к эффектам исключенного объема. С одной стороны, плотность в этих дендримерах различна. С другой стороны, температурные зависимости 1/7щ для внутренних групп в дендримерах Lys-2Lys и Lys-2Gly достаточно близки. Поэтому локальная подвижность внутренних групп в этих дендримерах практически одинакова.

Замедление ориентационной подвижности внутренних групп для Lys-2Arg и Lys-2Hisp, по-видимому, связано с увеличением размера ветви, характерное время которой вносит основной вклад в ЯМР релаксацию внутренних групп.

Характер кривой 1/7щ для внутренних СН2-^) групп в Lys-2His (в коллапсированной конформации) отличается от таковой для Lys-2Hisp (в набухшей конформации) и других пептидных дендримеров с различными двойных аминокислотными остатками в боковых сегментах. Поскольку плотность внутри дендримера Lys-2His настолько высока, что она затрудняет внутреннюю ориентационную подвижность внутренних СН2-^) групп. Таким образом, в случае коллапсированной конформации влияние исключенного объема становятся существенными и влияет на ЯМР релаксацию. Поэтому основной вклад в ЯМР релаксацию вносит вращение дендримера как целого, а не релаксация ветвей дендримера.

Можно сделать вывод, что ЯМР релаксация является мощным инструментом для исследования взаимосвязи между структурой и динамикой дендримеров.

ГЛАВА 4. Свойства пептидных дендримеров, содержащих гистидин, и перспективы их практического использования в качестве наноконтейнеров

В данной главе исследуются структурные свойства (в т.ч. и глобальная конформация) нового пептидного Lys-2His дендримера при различных значениях рН с помощью различных экспериментальных методов и молекулярно-динамического моделирования. Обсуждается аномальное изменение отношения радиуса инерции к гидродинамическому радиусу при изменении конформации Lys-2His дендримера. Рассматривается возможность прямого введения стабильных дейтериевых меток и инкапсуляции гостевых молекул в Lys-2His дендример. См. [3,10-12].

4.1. Подтверждение коллапса Lys-2His дендримера при повышении pH 4.1.1. Описание методов, используемых для измерения радиуса инерции и

гидродинамического радиуса

По данным эксперимента по ЯМР релаксации (см. раздел 3.3) было установлено, что подвижность внутренних СН2-^) групп в Lys-2His дендримере замедляется с увеличением рН, что косвенно подтверждает изменение конформации дендримера с набухшей на коллапсированную. Однако, прямым экспериментальным доказательством коллапса дендримера служит уменьшение его размеров. Радиус инерции Яё и гидродинамический радиус Яъ являются основными экспериментальными параметрами, характеризующими размер линейных и разветвленных макромолекул. При этом радиус инерции Яё может быть извлечен из данных малоуглового рентгеновского (МУРР) или нейтронного рассеяния, а гидродинамический радиус Яъ может быть рассчитан из параметров диффузии, например, полученных методами динамического рассеяния света (ДРС) или ядерного магнитного резонанса (ЯМР).

Для прямого подтверждения коллапса Lys-2His дендримера были проведены экспериментальные исследования методом рентгеновского рассеяния и динамического рассеяния света, а также выполнено МД моделирование.

Малоугловое рентгеновское рассеяние

Измерения методом МУРР проводились для образцов Lys-2His при концентрации 0,1 г/дл при pH = 2, 4 и 7. Эта относительно низкая концентрация была выбрана для исключения влияния структурного фактора от межчастичных взаимодействий и обеспечения разумного отношения сигнал/шум в данных МУРР. Образцы были приготовлены с использованием следующих буферов: лимонная кислота (pH = 2), Бис-трис пропан-лимонная кислота (pH = 4) и Трис (pH = 7).

Данные были получены на станции «БиоМУР» Курчатовского источника синхротронного излучения (Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт», Москва, Россия) [327]. Использовалось монохроматическое излучение с длиной волны 0,145 нм (энергия излучения 8,58 кэВ). Размер поперечного сечения рентгеновского пучка составлял 0,35 х 0,50 мм. Образцы помещались в кварцевые капилляры с внешним диаметром 2 мм и толщиной стенок 0,01 мм. Измерения проводились при комнатной температуре.

Расстояние образец-детектор составляло 700 мм, что соответствовало угловому диапазону модуля вектора рассеяния 0,2 нм-1 < s < 4,0 нм-1, где s = 4л sin в/ X, 26 - угол рассеяния, X - длина волны рентгеновского излучения. Сигнал регистрировали с помощью двумерного пиксельного детектора PILATUS 3 1M (Dectris, Швейцария). Каждый образец измерялся в течение 10 минут. Затем двумерная картина рассеяния усреднялась по радиальному направлению с помощью программы FIT2D [328]. Вычитание вклада рассеяния буфера производилось с помощью программы PRIMUS [329].

Радиус инерции Rg дендримера оценивался с помощью приближения Гинье [330] в области малых углов (s < 1,3/Rg), предполагая, что интенсивность рассеяния может быть аппроксимирована формулой:

(4.1)

Динамическое рассеяние света

Эксперименты по динамическому рассеянию света (ДРС) проводились на установке «PhotoCor Complex» (Photocor Instruments, Inc., Россия). Источником

возбуждения служил одномодовый твердотельный линейно-поляризованный лазер (Л,0 = 654 нм). Для образцов Lys-2His при различных значениях pH в исследованном диапазоне концентраций получены нормированные гомодинные автокорреляционные функции интенсивности в диапазоне углов рассеяния в = 40140°.

Автокорреляционные функции интенсивности были преобразованы в функцию распределения W(t) с помощью процедуры обратного преобразования Лапласа с использованием программного обеспечения DynaLS (https://www.photocor.ru/products/dynals) [331].

Значения коэффициента трансляционной диффузии D^c рассчитывались из наклона линейной зависимости обратного времени релаксации 1/т (где время релаксации т - положение максимума в распределении W(t) от квадрата вектора рассеяния q2 = ((4nn0/i0)sin(e/2))2).

Значение D рассчитывалось путем линейной экстраполяции зависимости ^дрс(с) к бесконечному разбавлению (с = 0).

Гидродинамический радиус Rh рассчитывался с использованием уравнения Стокса-Эйнштейна (ур. (2.1) в Главе 2). В качестве растворителя использовали 0,154M NaCl в D2O. pH регулировали с помощью HCl. Измерения проводили при температуре 25 °C.

Молекулярно-динамическое моделирование

Процедура МД моделирования приведена в разделе 3.3. Однако, необходимо отметить, что в данном случае была использована модель воды TIP5P-E [321]. Равновесная длина траектории составляла 500 нс.

В случае pH = 2, была использована модель Lys-2His дендримера с полностью протонированными 28 остатками His (каждый с зарядом +1) и 8 терминальными Lys сегментами (каждый с зарядом +2, а именно заряда (+1) боковой и заряда (+1) концевой аминогруппы (т.е. NH3+)). Таким образом, общий заряд дендримера составил +44 (см. рис. 4.1 б).

По сравнению с моделью дендримера Lys-2His при pH = 7, использованной в разделе 3.3, данная модель также содержит 28 нейтральных остатков His в боковых сегментах, однако, терминальные Lys сегменты имеют заряд +1. Таким образом, общий заряд дендримера равен +8 (см. рис. 4.1а). Обоснованность и необходимость такого изменения будет описана ниже при сопоставлении данных эксперимента и МД моделирования.

(а) (б)

нейтральный рН низкий рН

© заряженная группа

Рисунок 4.1. Схематическое изображение (а) коллапсированной (при нормальном рН) и (б) набухшей (при низком рН) конформации дендримера Ьу8-2Нг8.

Модифицированная версия программы CRYSOL [332] использовалась для расчета профилей рассеяния рентгеновских лучей на основе атомистических моделей структур дендримеров, полученных в результате МД моделирования. Программа вычисляет рассеяние из атомистической модели частицы в растворе как

1(8) = 14(5)/% = П4а (5) - р5А5 (5) +6рь Аь (з)/2^ (4.2)

где Аа(8) - амплитуда рассеяния рентгеновских лучей частицей в вакууме, Л&(8) и Лъ(8) - амплитуды рассеяния от исключенного объема и гидратной оболочки обе с единичной плотностью, и <...> обозначает сферическое среднее в обратном пространстве.

Ур. (4.2) учитывает, что плотность гидратной оболочки, р, может отличаться от плотности растворителя вдалеке от частицы, р, что приводит к ненулевому контрасту гидратной оболочки 8р = р - р. СКУБОЬЗ представляет гидратную

оболочку в виде виртуальных шариков или бусин, покрывающих поверхность частицы. Эти бусины делятся на три типа: (а) внутренняя вода в полостях; (б) водная оболочка на внешней выпуклой поверхности; и (в) вода на вогнутой поверхности. Такое представление позволяет достичь хорошего прогнозирования рассеяния при больших углах, сопоставимое с подходами, использующими моделирование растворителя методом молекулярной динамики, как было продемонстрировано в обзоре [333]. Учитывая координаты атомов, программа аппроксимирует экспериментальную кривую рассеяния, регулируя исключенный объем частицы и контрастность гидратационного слоя, окружающего частицу в растворе, чтобы минимизировать расхождение:

ё2 = —Уы

1ехр(з])-к1са1с^)

1- (43) где N - количество экспериментальных точек, к - коэффициент масштабирования, 1ехр(я) и 1са\с^\) - интенсивности, экспериментальные и рассчитанные, соответственно; и о (я) - экспериментальная ошибка в передаче импульса я). Три члена в уравнении (4.3) вычислялись с использованием мультипольного разложения сферических гармоник для ускорения вычислений. Для получения данных МУРР из данных МД были использованы траектории 1 мкс с шагом 1 нс.

С помощью программы CRYSOL, кривые рассеяния рассчитывались на каждом шаге, а затем все кривые усреднялись для получения итоговой кривой

1са1с(Я).

В МД моделировании, расчет Яъ дендримера на основе данных трансляционной подвижности приводит к его неверным значениям [334]. Поэтому, чтобы получить значение Яъ, согласующееся с экспериментальными значениями [334], он был рассчитан из данных вращательной диффузии с использованием следующего уравнения:

I/3

М^г«) (44)

2

где - вязкость растворителя в МД моделировании; rrot - время вращения дендримера как целого, которое определяется из конечного спада автокорреляционной вращательной функции [238,260,317]:

0)> (4.5)

где bj(t) - единичный вектор, направленный от ядра дендримера к i-й точке ветвления в последней генерации, усредненный по этим векторам. Значение rrot вычисляется из конечного наклона ln(P1rot(i)) с использованием линейной аппроксимации.

4.1.2. Результаты 4.1.2.1. Радиус инерции. Измерения МУРР

Малоугловое рентгеновское рассеяние является классическим методом экспериментального измерения радиуса инерции макромолекул. Экспериментальные данные, полученные для Ьув-2Н1в при рН = 2, 4 и 7, представлены на рис. 4.2а. Радиус инерции дендримера Ьув-2Н1в был определен с использованием приближения Гинье, как показано на рис. 4.2б (ур. (4.1)). Полученные значения Яё представлены в табл. 4.1. Эти результаты в целом подтверждают гипотезу о коллапсе дендримера Ьув-2Н1в при повышении рН, основанную на данных МД моделирования (см. раздел 3.3). Различие между экспериментальными данными и данными МД будет рассмотрено в последней части этого раздела.

S, H M"1 s2, H M"2

Рисунок 4.2. (а) Экспериментальные данные МУРР для дендримера Lys-2His при рН = 2, 4 и 7. (б) Приближение Гинье для данных функции 1п(1) от я2. Кривые 1(я), рассчитанные по данным МД моделирования на рис. 4.2а, и линейное приближение Гинье (см. ур. (4.1)) на рис. 4.2б показаны розовыми и зелеными сплошными линиями, соответственно.

Таблица 4.1. Радиус инерции Яg и гидродинамический радиус Яъ дендримера Lys-2His по данным МУРР, ДРС и МД моделирования

pH Rg, нм Rh, нм

МУРР МД ДРС МД

2,0 1,91 ± 0,05 2,05 ± 0,09 2,2 ± 0,2 2,8 ± 0,6

4,0 1,57 ± 0,05 - - -

7,0 0,9 ± 0,2 1,1 ± 0,1* 1,72 ± 0,05 2,0 ± 0,4*

7,0 - 1,31** - -

Примечание: * В используемой структуре дендримера все концевые сегменты Lys заряжены наполовину (т.е. каждый +1, см. рис. 4.1а), а остатки His в боковых сегментах не заряжены. ** В используемой структуре дендримера все концевые сегменты Lys полностью заряжены (т.е. каждый +2, см. рис. 3.12а в главе 3), а остатки His в боковых сегментах не заряжены.

Экспериментальные данные МУРР, проанализированные с помощью нормализованных графиков Кратки (рис. 4.3), указывают на то, что дендример в своей коллапсированной конформации не проявляет характеристик идеальной плотной сферы [335]. В случае, если дендример представляет собой плотную

сферу, можно было бы ожидать появления характерного максимума на рис. 4.3 (подобного максимуму, описанному в работе [336]); однако такая особенность отсутствует при всех исследованных уровнях рН.

Рисунок 4.3. Нормализованные графики Кратки для экспериментальных данных МУРР дендримера Lys-2His при рН 2, 4 и 7.

4.1.2.2. Гидродинамический радиус. Измерения ДРС

Гидродинамический радиус, отражающий динамические свойства системы, был оценен на основе экспериментальных данных, полученных методом динамического рассеяния света.

Значение Яь обычно получают через коэффициент диффузии макромолекулы в сильно разбавленном растворе (ур. (2.1)).

Для получения коэффициента диффузии в приближении бесконечно разбавленного раствора исследовалась концентрационная зависимость коэффициента диффузии дендримера в водном растворе Ддрс(с), где с -концентрация макромолекул. Анализ этой зависимости также позволяет оценить термодинамическое качество растворителя и выявить наличие агрегатов в разбавленном растворе. На рис. 4.4. показаны зависимости Ддрс(с) для дендримера

Lys-2His при рН = 2 и 7. Для обеих кривых наблюдаются типичные линейные зависимости ДдрС(с), которые можно аппроксимировать следующим уравнением:

Dдpc(c) = D(1 + 2A2MDc)l (4.6)

где с - концентрация макромолекул, - второй вириальный коэффициент, а Мо -молекулярная масса. В табл. 4.2 приведены коэффициенты диффузии и вторые вириальные коэффициенты.

На основании данных ДРС Яъ уменьшается с 2,2 до 1,7 нм с ростом рН, что качественно согласуется с результатами, полученными в эксперименте МУРР (см. табл. 4.1). Однако, изменение Яъ значительно меньше изменения Я^ Одной из возможных причин является предполагаемое образование агрегатов дендримеров при рН = 7. Возможно, эта разница обусловлена различием в концентрациях дендримеров, использованных в ДРС (0,5-4,3 г/дл) и МУРР (0,1 г/дл) экспериментах, и агрегацией дендримеров при больших концентрациях. Однако, согласно данным ДРС, коэффициент диффузии увеличивается с увеличением концентрации дендримеров в растворе и, как следствие, > 0. Это указывает на хороший растворитель для дендримера Lys-2His даже при рН = 7. Например, расчет параметра Флори-Хаггинса (х) из согласно ур. (4.7) дает значение 0,48, которое соответствует © условиям и, следовательно, относится к области хорошего растворителя.

Х = (4.7)

2 Р1

где р1 и р2 - плотности растворителя и сухого полимера соответственно. Поэтому образование агрегатов в сильно разбавленном растворе маловероятно.

Рисунок 4.4. Концентрационные зависимости коэффициентов диффузии дендримера Lys-2His, полученные из экспериментальных данных ДРС, при рН = 2 и 7.

Таблица 4.2. Параметры аппроксимации концентрационных зависимостей коэффициентов диффузии методом ДРС

рН Б, 10"10 м2/с А2 ,103 м"3/моль X

2,0 0,88 ±0,07 1,7 0,43

7,0 1,14+0,03 0,4 0,48

Важно отметить, что экспериментальные результаты МУРР и ДРС непосредственно подтверждают вывод о коллапсе дендримера Ьув-2Н1в при повышении рН, сформулированный в разделе 3.3. Эти результаты согласуются с данными ЯМР релаксации, свидетельствующими о том, что в коллапсированной конформации дендримера Lys-2His ориентационная подвижность внутренних СН2-(К) групп замедляется и становится зависимой от объемных взаимодействий. Поэтому наблюдается смещение влево максимума экспериментальной температурной зависимости скорости спин-решеточной релаксации (1/Г1Н) внутренних групп (см. рис. 3.13а).

4.1.2.3. Результаты МД моделирования

Сравнение результатов МД моделирования, представленных в разделе 3.3, с экспериментальными данными МУРР показывает, что при рН = 2 значения радиуса инерции (Яё) хорошо согласуются друг с другом с учетом погрешности вычислений (см. табл. 4.1). Напротив, в случае рН = 7, значения Яg различаются. Согласно данным МУРР, Яg уменьшается более чем в два раза с ростом рН (см. табл. 4.1). Это указывает на более сильный коллапс дендримера Lys-2His по сравнению с результатами МД моделирования (раздел 3.3), где Яg изменялся от 2,05 нм (рН = 2) до 1,31 нм (рН = 7) (т.е. примерно в 1,6 раза). Возможной причиной этого является ограниченная доступность МН2-групп концевых сегментов дендримера для растворителя в коллапсированной конформации, что приводит к тому, что не все эти группы протонированы. Для проверки этой гипотезы, было проведено МД моделирование дендримера Lys-2His, в котором при рН = 7 протонирована только половина МН2-групп концевых сегментов (рис. 4.1а). Полученное значение радиуса инерции (Яg = 1,1 ± 0,1 нм, см. табл. 4.1) согласуется с данными эксперимента МУРР в пределах статистической погрешности. Необходимо отметить, что кривые рассеяния, 1(я), рассчитанные на основе траекторий МД моделирования (250 нс), находятся в хорошем количественном согласии с экспериментальными данными МУРР для всех рассматриваемых значений рН (рис. 4.2а).

Для оценки значения Яъ (ур. (4.4)) вязкость воды, используемая в МД моделировании, ^^, была откалибрована с помощью следующего уравнения:

ехр

„М^ ехР °зо1У (Л оч

'lso\v = 'lso\v г>мв (4.8)

где - экспериментальная вязкость растворителя, и - коэффициенты диффузии растворителя в эксперименте и МД моделировании соответственно. Согласно работам [321,337], отношение ^оР/А^ составляет 2,3/2,8, а ^^ составляет 0,89 мПа-с при 298 К.

Рассчитанные значения гидродинамического радиуса (Яъ = 2,8 и 2,0 нм для рН = 2 и 7, соответственно) больше значений, полученных в эксперименте ДРС,

однако, довольно близки к ним в пределах погрешности. На основании данных МД моделирования и ДРС можно сделать вывод, что Яъ уменьшается значительно меньше, чем Яё, что связано с изменением конформации дендримера.

Характерные времена вращения дендримера Lys-2His как целого (ты) были рассчитаны из данных МД моделирования с помощью линейной аппроксимации конечного спада автокорреляционной функции 1п(Я1го1) (ур. (4.5)) при pH = 2 и 7 (рис. 4.5).

Рисунок 4.5. Временные зависимости автокорреляционной функции Я/0* для дендримера Lys-2His при рН = 2 и 7. Линейные аппроксимации ¡пр™*) для расчета тГ0* обозначены пунктирными линиями.

На основании экспериментальных данных и согласующихся с ними результатов МД моделирования можно утверждать, что факт коллапса дендримера Lys-2His подтвержден. Для дальнейших исследований важно выявить механизмы данного эффекта. Это имеет особую значимость как для углубления понимания свойств пептидных дендримеров, содержащих аминокислотные остатки His, так и для реализации их потенциала в качестве наноконтейнеров для доставки лекарственных препаратов.

Как уже отмечалось в разделе 3.3, в коротких пептидах, содержащих аминокислотные остатки His или Arg, наблюдается эффект пэйринга, который

представляет собой взаимодействие между геометрически близко расположенными гуанидиновыми или имидазольными группами (см. рис. 4.6).

Рисунок 4.6. Схематическая модель образования пар между имидазольными кольцами. Показаны геометрические параметры пар: расстояние г между центрами групп, нормальные векторы п\ и п2 к плоскостям колец и угол а между этими векторами.

Для иллюстрации этого эффекта по данным МД моделирования были рассчитаны матрицы распределения Npaiгs(а,r), которые отражают среднее число пар имидазольных групп, расположенных в плоскостях под углом а и на расстоянии г друг от друга (см. схематическое изображение параметров а и г на рис. 4.6). Для расчета использовались траектории длиной 250 нс.

На рис. 4.7 представлены распределения пар, ^^(а/), между соседними и несоседними имидазольными группами в боковых сегментах Lys-2His дендримера при pH = 2 и 7. Как видно на рис. 4.7а, при рН =7 образование устойчивых пар между соседними незаряженными имидазольными группами наблюдается в нескольких областях: первая область взаимодействия характеризуется узким диапазоном расстояний около 0,4 нм при углах между плоскостями групп от 30 до 65°, а вторая - более широким диапазоном от 0,6 до 1,1 нм с возможными углами от 15 до 90°.

Согласно рис. 4.7б, при рН = 7 несоседние незаряженные имидазольные группы образуют пары при расстоянии от 0,5 до 1,8 нм и углах между их

плоскостями от 5 до 90 градусов. При этом наибольшее число пар формируется на расстоянии от 0,9 до 1,3 нм с углами от 60 до 90 градусов.

Рис. 4.7в показывает, что при рН = 2 соседние протонированные имидазольные группы образуют пары в двух узких областях: в диапазоне 0,7-0,9 нм с углами 0 до 90 градусов (при r = 0,7 нм углы между плоскостями близки к 20°, а при r = 0,9 нм - к 80°). Вторая узкая область с небольшим числом пар при r ~ 1,1 нм. Важно отметить, что образования пар в области r ~ 0,4 нм, как в случае соседних незаряженных групп (рис. 4.1а), не наблюдается.

Как видно на рис. 4.7г, при рН = 2 для несоседних протонированных имидазольных групп наблюдается широкая область существования пар на расстояниях r от 0,6 до 1.8 нм с большим разбросом возможных углов от 10° до 90°. При этом максимум распределения соответствует диапазону расстояний 1,3-1,6 нм и углов 65-90°.

Таким образом, при pH = 7 эффект пэйринга между имидазольными кольцами наблюдается на расстоянии 0,4 нм в Lys-2His и отсутствует при pH = 2.

Среднее число пар между имидазольными группами в дендримере, np, оценивалось путем интегрирования функции Npairs(a,r) по углу а и расстоянию от 0 до rcut = 0,5 нм, где rcut - радиус обрезки для эффекта пэйринга:

пр = -Г /о360° ^pairs(«, r)dadr (4.9)

При pH = 2 эффект пэйринга практически отсутствует (1-2 пары). Напротив, при pH = 7 имидазольные группы образуют около 18 пар. Это указывает на то, что большинство из 28 остатков His образует пары или собрано в кластеры по три остатка, вероятно, вследствие высокой концентрации боковых гистидиновых сегментов, обусловленной древовидной топологией дендримеров. Следовательно, можно утверждать, что формированием коллапсированной конформации дендримера дендримера Lys-2His обусловлено эффектом пэйринга между имидазольными группами аминокислотных остатков гистидина.

(а) (б)

Рисунок 4.7. Двумерные карты матрицы распределения пар, Ырат (с элементами матрицы ЫРшГ5(а,г)), между соседними (а,в) и несоседними имидазольными группами (б,г) в дендримере Ьуя^Шя при рН = 7 (а,б) и рН = 2 (в,г). Угол а соответствует наклону между нормалями плоскостей имидазольных колец (см. рис.4.6), г - расстояние между центрами имидазольных групп. Цветом показана средняя плотность вероятности присутствия пар имидазольных групп с соответствующими а и г.

Наличие взаимодействия между имидазольными группами подтверждается результатами ЯМР спектроскопии, представленными в главе 2. Было установлено, что наличие эффекта пэйринга влияет на положение сигнала от СН2-(К) групп, связанных с имидазольным кольцом, в 1Н ЯМР спектре. В случае набухшей конформации (Ьув-2Н1вр), наблюдется один общий пик для внутренних и боковых

групп, а в спектре дендримера в коллапсированной конформации происходит расщепление пика и появление дополнительного сигнала около 3,0 м.д (см. рис. 2.21 в главе 2), соответствующего боковым группам. В тех случаях, когда данный эффект отсутствует по данным МД моделирования этот пик не наблюдается в протонных ЯМР спектрах, например, для Ьув-2Н1вр и Ьув-2Лг§ (рис. см. рис. 2.21 в главе 2). Кроме того, наблюдаемые изменения химических сдвигов протонов имидазольных групп («^» и «V») в 1Н ЯМР спектре (рис. 4.8) также свидетельствуют о взаимодействии имидазольных колец в боковых сегментах дендримера.

Рисунок 4.8. Сравнение !Н ЯМР спектров дендримера Ьуз-Шз в коллапсированной (синий) и набухшей (красный) конформациях в диапазоне 9,0-6,6 м.д. при температуре 298 К. Буквенные обозначения соответствуют обозначениям групп на рис. 2.12а в главе 2.

4.2.Дейтерирование пептидных дендримеров

Для улучшения физико-химических и биологических свойств дендримеры модифицируют с использованием различных стратегий. Одной из перспективных стратегий модификации биоактивных молекул является введение стабильных изотопов в их внутреннюю структуру. Изотопы служат меткой для соединения, которое можно обнаружить с помощью ЯМР и масс-спектрометрии [338,339]. Среди наиболее часто используемых стабильных изотопов дейтерий находит

важное применение в фармацевтической промышленности для открытия и разработки лекарственных препаратов [340,341].

Как показано выше, включение аминокислотных остатков His, содержащих имидазольные группы, дает несколько преимуществ пептидному дендримеру как наноконтейнеру. Другим уникальным свойством гистидина является возможность его селективного дейтерирования.

Протоны при атоме углерода в положении C2 имидазольного кольца гистидина могут замещаться дейтерием в тяжелой воде (D2O) [342-344]. После удаления D2O и повторного растворения образцов пептидов в воде лабильные атомы дейтерия в аминных, иминных и амидных группах быстро заменялись протонами, в то время как дейтерирование атома C2 в имидазольном кольце сохранялось [345]. Реакция обмена водорода и дейтерия может стать ценным инструментом для получения меченых дейтерием пептидных дендримеров.

В данном разделе представлены результаты экспериментального дейтерирования пептидного Lys-2His дендримера.

Для приготовления образцов дендример Lys-2His растворяли в D2O в концентрации 1,55 г/дл с 0,157М NaCl и без него. Затем образцы нагревали при температуре от 25 °C до 70 °C с шагом 5 °C. Образцы выдерживались при каждой температуре в течение 2 часов. Замещение протонов водорода дейтерием было обнаружено и подтверждено ЯМР спектрами, которые регистрировались после каждого шага. Замещение протонов атомами дейтерия в имидазольной группе аминокислотного остатка гистидина продемонстрировано на рис. 4.9.

Рисунок 4.9. Замещение протонов атомами дейтерия при углероде в положении С2 в имидазольной группе гистидина при нагревании.

На рис. 4.10 для сравнения приведены 1Н (рис. 4.10а) и 2Н (рис. 4.10б) ЯМР спектры дендримера Lys-2His в D2O после нагревания. Пик <ш» с химическим сдвигом 8,12 м.д. соответствует сигналу от протонов у атомов углерода С2 имидазольных колец. Как показано на рис. 4.10б, сигнал от атомов дейтерия появляется при 8,12 м.д. Присутствие этого пика в 2Н ЯМР спектре указывает на то, что происходит замещение атомов водорода дейтерием при атомах углерода С2 имидазольных колец.

(а)

н2о

(б) 02О

iv

—I---1-■-1---1---1-■-I---1---1---1---1---1—

10 987654321 0

5,М.Д.

Рисунок 4.10. (а) !И и (б) 2H ЯМР спектры дендримера Lys-2His в D2O после нагревания. 2H ЯМР спектр записан с использованием импульсной последовательности для подавления сигнала от растворителя. Буквенные обозначения соответствуют обозначениям групп на рис. 2.12а в главе 2.

Температурная зависимость концентрации протонов у атомов углерода С2 имидазольных колец на рис. 4.11 показывает, что концентрация протонов уменьшается до 30% после повышения температуры от 25 °С до 70 °С. Таким образом, степень дейтерирования углерода С2 в имидазольных кольцах составляет около 70%. При отсутствии №С1 в растворе установлено, что процесс

дейтерирования имеет практически такую же зависимость, но максимальное значение степени дейтерирования меньше 60%), чем в солевом растворе. Возможно, этот результат обусловлен присутствием ионов соли в растворе. В частности, ионы хлора использовались в экспериментах по дейтерированию гистидина [344].

Рисунок 4.11. Температурная зависимость концентрации протонов при атомах углерода С2 имидазольных колец остатков гистидина (см. пик при 8,12 м.д. на рис. 2.12а в главе 2) при нагревании.

Важно изучить, будут ли дейтериевые метки стабильными в ходе биологических и медицинских исследований. Для того чтобы гарантировать, что дейтерированные атомы углерода С2 имидазольных колец в остатках гистидина не будут подвергаться реакции обратного обмена в физиологических условиях, из раствора была удален Э20, а затем дендример Lys-2His повторно растворили в Н2О. Концентрация №С1 в растворе осталась прежней. Нагревание при 40 °С в течение четырех часов не изменило интегральное значение пика при 8,12 м.д., следовательно, степень дейтерирования остается постоянной в физиологических условиях. Замещение атомов дейтерия протонами наблюдалось при нагревании раствора дендримера при 70 °С в течение четырех часов. Рис. 4.12 иллюстрирует эволюцию пика при 8,12 м.д. во время реакций обмена водорода и дейтерия (а) и обмена дейтерия и водорода (б). Как видно из рис. 4.12б, восстановление

интегрального значения пика произошло частично. Следует отметить, что дополнительные пики при 7,95 и 8,30 м.д. соответствуют протонам в группах МН и появились в результате обратного обмена в этих группах в Н20.

(а) (б)

V

V

iv

—I—1—I—1—I—•—I—•—I—1—I—•—I—•—I—1—I—•—I—•—I— —1—1—I—'—I—'—I—'—I—■—I—'—I—'—I—'—I—'—I—

8.6 8.4 8.2 8.0 7.8 7.6 7.4 7.2 7.0 6.8 6.6 8.6 8.4 8.2 8.0 7.8 7.6 7.4 7.2 7.0 6.8

5,м.д. 5,м.д.

Рисунок 4.12. Эволюция пика при 8,12 м.д. от протонов при атомах углерода C2 имидазольных колец остатков гистидина в дендримере Lys-2His: (а) ^ ЯМР спектры дендримера Lys-2His в D2O до (синий) и после (красный) нагревания; (б) ^ ЯМР спектры дендримера Lys-2His в H2O до (красный) и после (зеленый) нагревания. Пики от протонов в группах NH обозначены символом (*).

4.3. Использования пептидных дендримеров, содержащих гистидин, в

качестве наноконтейнеров

В данном разделе рассматривается инкапсуляционная способность пептидного Lys-2His дендримера, содержащего аминокислотные остатки гистидина в боковых сегментах, методами ЯМР спектроскопии и ЯМР релаксации. Также используется анализ данных моделирования для подтверждения экспериментальных выводов.

Для изучения инкапсуляционной способности дендримера Ьув-2Н1в были приготовлены и экспериментально исследованы комплексы с молекулами фуллерена (Сбо или С70): Ьув-2Н1в+Сбо и Ьув-2Н1в+С70.

Комплексы дендример-фуллерен были получены путем смешивания растворов дендримера и фуллерена (Сбо или С70) приготовленных в

диметилформамиде (ДМФ). Соотношение компонент дендример/фуллерен было фиксированным во всех случаях и составляло 50:1 моль/моль. Концентрации растворов фуллеренов контролировали путем спектрофотометрии насыщенных растворов (Спектрофотометр UV-1800, Shimadzu Corp., Киото, Япония). Эксперименты проводились с разрешением 1 нм в диапазоне длин волн X е [190— 1100] нм. Образцы помещали в кварцевую кювету с оптической длиной пути 0,3 см. Термодинамическое качество среды для полученных смесей изменяли добавлением дистиллированной воды в соотношении 1:1 по объему. Формирование комплексов также контролировалось с помощью спектрофотометрии. На последней стадии создания комплексов растворы высушивали последовательно сначала откачкой с предварительным охлаждением в течение суток, с последующей откачкой с нагревом до 50°С в течение нескольких дней, для удаления остатков диметилформамида (ДМФ). Для проведения ЯМР исследований подготовленные образцы растворяли в 0,154 М NaCl H2O (0,154 М NaCl D2O). Концентрации комплексов дендримера Lys-2His с Сбо и C70 в растворителе составляли 0,64 и 0,87 г/дл соответственно.

На рис. 4.13 представлены спектры поглощения фуллеренов Сб0 (а) и С70 (б) и Lys-2His в ДМФ и фуллеренов (Сб0 и С70) и их комплексов с дендримером Lys-2His в смешанном растворителе ДМФ:Н2О (1:1). Смещение максимумов спектров поглощения фуллеренов Сб0 в длинноволновую область (331 нм ^ 338 нм) и уширение полосы поглощения при добавлении воды свидетельствует о слипании молекул фуллеренов при ухудшении термодинамического качества растворителя. Присутствие в растворе дендримера Lys-2His приводит как к меньшему смещению в случае Сб0 (331 нм ^ 335 нм), так и к меньшему уширению полосы поглощения, что подтверждает образование комплексов.

В случае С70 сопоставление спектров в смешанном растворителе в присутствии дендримера и без него так же позволяет предположить образование комплексов, уменьшающее агрегацию фуллеренов. При добавлении воды к раствору С70 в ДМФ наблюдается смещение максимумов спектра поглощения. Визуально уширение пиков С70 выглядит более выраженным по сравнению с Сб0.

Однако это связано с тем, что в случае Сб0 наблюдается только один характерный пик, смещение и уширение которого отчетливо заметны. В случае же С70 спектр характеризуется несколькими пиками, смещения и уширения которых накладываются друг на друга, что визуально создает впечатление более выраженного уширения. Таким образом, эти спектры свидетельствуют о формировании агрегатов фуллеренов при добавлении воды, но не дают количественной информации, например, о размере образующихся агрегатов. Важно отметить, что наблюдаемые различия в спектрах чистых фуллеренов, дендримеров и их комплексов свидетельствуют о формировании комплекса. Хотя добавление воды к раствору, содержащему дендример, вызывает значительные изменения в спектре поглощения, присутствие фуллерена в растворе остается очевидным.

300 400 500 600 700 800 300 400 500 600 700 800

X, нм X, нм

Рисунок 4.13. Спектры поглощения фуллеренов С60 (а) и С70 (б) и Lys-2His в ДМФ, а также фуллеренов (С60 и С70) и их комплексов с Lys-2His в смешанном растворителе ДМФ:Н2О (1:1). Все спектры пересчитаны к концентрациям компонент в спектрах дендример-фуллерен в смешанном растворителе в предположении выполнения закона Бугера-Ламберта-Бера.

На рис. 4.14 представлены 1Н спектры Lys-2His дендримера и его комплексов с Сб0 и С70. Вид и форма спектров чистого дендримера и его комплекса с Сб0 практически совпадают. Детальный анализ спектров Lys-2His дендримера представлен в разделе 2.3. в Главе 2. Согласно рис. 4.14, в целом спектр комплекса

Lys-2His+C70 совпадает со спектром отдельного дендримера (или комплекса Lys-2His+C<50). Единственным, но важным, исключением является смещение пиков «V» и «w», соответствующих группам СН имидазольных колец His (см. рис. 2.12 в Главе 2). По сравнению со спектром отдельного дендримера пики «V» и «w» смещаются на 0,12 и 0,26 м.д. в область слабого поля, соответственно. Причем, как отмечалось выше, в случае Lys-2His+C(50 такого смещения данных пиков нет. Эти результаты позволяют предположить, что взаимодействие между Lys-2His и фуллереном С70 вызывает изменения в электронном окружении имидазольных колец гистидина.

5, м.д.

Рисунок 4.14. Н ЯМР спектры Lys-2His дендримера и его комплексов с фуллеренами C60 и C70. Буквенные обозначения соответствуют обозначениям групп на рис. 2.12а в главе 2. Пики, отмеченные символом *, соответствуют сигналам диметилформамида, который остался после процесса приготовления комплекса.

Полученные экспериментальные данные полностью согласуются с результатами МД моделирования этих комплексов, которые показывают, что

фуллерен С70, в отличие от С60, инкапсулируется дендримером Lys-2His, проникая во внутреннюю область дендримера. Для иллюстрации на рис. 4.15 приведены радиальные профили плотности, рассчитанные от центра масс комплекса (ур. 3.14).

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0

Г, нм г, нм

Рисунок 4.15. Радиальные профили плотности для дендримера, фуллеренов и комплексов дендример-фуллерен (а) Ьу8-2Ш8+Сбо, (б) Ьуя^Шя+Ст.

Как видно из рис. 4.15б в комплексе Ьув-2Н1в+С70 фуллерен располагается на расстояниях от г = 0-0,8 нм с максимумом в центре масс комплекса. В то же время в комплексе Lys-2His+C60 фуллерен (рис. 4.15а) расположен ближе к периферии дендримерной молекулы. Таким образом, можно заключить, что только фуллерен С70 инкапсулируется в дендримере Lys-2His.

Согласно данным МД моделирования, инкапсуляция обусловлена эффектом пэйринга (п-п взаимодействиями) между имидазольными кольцами дендримера Lys-2His и фуллереном С70. Также необходимо отметить, что дополнительные взаимодействия между фуллереном и остатками гистидина приводят к экранированию протонов имидазольных колец, что вызывает сдвиг их сигналов в спектре ЯМР в область слабого поля (дезэкранирование). Изменения в спектрах, зафиксированные экспериментально для комплекса Lys-2His+C70 (рис.4.14), являются прямым подтверждением данных моделирования.

Поскольку Lys-2His изменяет свою конформацию от набухшей (при рН = 2) до коллапсированной (при рН = 7) в зависимости от значения рН среды (см. Главу 3), это конформационное изменение влияет на ориентационную

подвижность сегментов и групп дендримера. В набухшей конформации основной вклад в ориентационную подвижность вносит пульсация ветвей, тогда как в сжатой конформации подвижность определяется вращением дендримера как целого. Кроме того, коллапсированная конформация дендримера Lys-2His характеризуется проявлением эффектов исключенного объема. Причем экспериментально данный эффект наиболее явно проявляется в температурной зависимости 1/7щ для внутренних СН2-(^ групп (см. рис. 3.13 в Главе 3), в которых наблюдается смещение максимума в область высоких температур при изменении конформации дендримера от набухшей к коллапсированной.

На рис. 4.16 приведены температурные зависимости скорости спин-решеточной ЯМР релаксации (1/7щ) для внутренних групп Lys-2His дендримера, как отдельного, так и в комплексе с фуллеренами Сбо и С70. В случае комплекса Lys-2His+С60 положение максимума 1/7щ незначительно смещается в область высоких температур по сравнению с аналогичной зависимостью для Lys-2His. В тоже время для Lys-2His+С70 положение максимума смещается влево на столько, что уже не наблюдается в экспериментально допустимом диапазоне температур. Это, в свою очередь, указывает на существенное замедление подвижности внутренних групп в комплексах Lys-2His+С70.

Как было показано в Главе 3, в случае коллапсированной конформации Lys-2His вращение дендримера как целого вносит основной вклад в ЯМР релаксацию и зависит от гидродинамического радиуса (Яь) макромолекулы. Наличие непроницаемого ядра приводит к увеличению Яь. Очевидно, что инкапсуляция С70 в центре дендримера способствует увеличению размера непроницаемого ядра. В случае комплекса Lys-2His+C70 это приводит к сдвигу максимума кривой 1/7щ внутренних групп.

10ОО/Т, К"1

Рисунок 4.16. Температурная зависимость скорости спин-решеточной ЯМР релаксации (1/Тш) для внутренних СН2-(Ы) групп для отдельного Lys-2His дендримера и его комплексов с фуллеренами С60 и С70 в температурном диапазоне 278-343 К.

Таким образом, экспериментальные результаты и данные МД моделирования подтверждают инкапсуляционную способность пептидного дендримера Lys-2His на примере формирования комплекса с фуллереном C70.

Выводы

Изучение физико-химических свойств новых дендримеров помогает понять их поведение внутри живых клеток и прогнозировать транспорт и высвобождение ими молекул лекарственных средств.

В данной главе экспериментальные исследования коллапса дендримера Lys-2His при повышении рН проводились с использованием методов малоуглового рассеяния рентгеновских лучей и динамического рассеяния света. Результаты хорошо согласуются с данными МД моделирования как для набухшей, так и для коллапсированной конформации дендримера.

По данным МУРР, Яё Lys-2His в коллапсированной конформации уменьшается более чем в два раза по сравнению с набухшей конформацией. Это

вызвано образованием пар между имидазольными группами His, которое наблюдается при pH = 7 и отсутствует при pH = 2. Результаты эксперимента ДРС также показывают уменьшение размера дендримера с ростом pH. Однако значение Rh уменьшается только в 1,3 раза. Поэтому, значение Rg будет более важным параметром, если дендример рассматривать как наноконтейнер. Также данные ДРС эксперимента позволили установить, что качество растворителя (водно-солевой раствор) даже при pH = 7 остается хорошим (/=0.48). Это позволяет заключить, что Lys-2His не склонен к агрегации.

Результаты МД моделирования дают схожие значения для обоих радиусов. Rh значительно больше Rg в обеих конформациях. Представленные результаты напрямую подтверждают, что дендример Lys-2His может изменять свой размер в ответ на кислотность среды и не образует агрегатов. Это позволяет рассматривать дендример Lys-2His как перспективный pH-чувствительный наноконтейнер. Следует отметить, что снижение (68 %) Rg происходит в основном с pH = 4. Это пороговое значение pH может быть изменено путем различных модификаций дендримера. Примером такой модификации служат дендримеры Lys -His-Arg и Lys-Arg-His, в которых в боковых сегментах половина остатков гистидина заменены остатками аргинина в разном порядке. Разница в ЯМР релаксации внутренних CH2-(N) групп этих дендримеров, а также Lys-2His, указывает на разную степень коллапса дендримерных макромолекул при pH = 7.

Было показано, что наличие остатков His, содержащих имидазольные группы, дает дополнительное преимущество пептидному дендримеру для мониторинга систем доставки лекарств или генов. В частности, можно приготовить гистидинсодержащий пептидный дендример с метками дейтерия, используя быстрый и простой метод без особых требований. Водород при углероде в положении С2 в имидазольных кольцах остается дейтерированным в водном растворе при физиологических условиях, до 40 °C.

С помощью методов ЯМР спектроскопии и релаксации была исследована инкапсуляционная способность Lys-2His дендримера на примере его комплексов с фуллеренами Сбо и C70. Было установлено, что фуллерен C70 инкапсулируется

Lys-2His дендримером, в отличие от C60. Это подтверждается смещением сигналов протонов CH групп имидазольных колец остатков гистидина в область более слабого поля в 1H ЯМР спектре комплекса Lys-2His+C70 по сравнению с соответствующими сигналами как для комплекса с C60, так и для отдельно взятого дендримера. Данные ЯМР релаксации также свидетельствуют об инкапсуляции фуллерена C70: максимум кривой 1/7щ для внутренних групп Lys-2His смещается в область более высоких температур, что указывает на значительное замедление их подвижности. Полученный результат согласуется с данными МД моделирования, которые подтверждают инкапсуляцию молекулы C70 во внутренней области дендримера и ее взаимодействие с дендримером посредством эффекта пэйринга.

Таким образом, чувствительность конформации к изменению pH среды, возможность прямого введения дейтерирования, а также способность к инкапсуляции небольших молекул, несомненно, расширяют спектр потенциальных биологических и медицинских применений His-модифицированных пептидных дендримеров.

ГЛАВА 5. Механическая релаксация в дендримерах

Данная глава посвящена исследованию реологических свойств расплавов дендримеров. Рассматриваются временные и частотные зависимости динамического модуля расплавов дендримеров разных генераций (G = 2-5) и различной химической структуры (карбосилановые, полипропилениминные и полиамидаминные). Проводится анализ эффекта плотного окружения и процессов, проявляющихся в механической релаксации. См. [13-15].

5.1. Сборка атомистических моделей дендримеров для моделирования

методом молекулярной динамики

Для МД моделирования были собраны атомистические модели следующих типов дендримеров для каждой из указанных генераций: FCS (функционализированные карбосилановые) дендримеры со второго по четвертое поколение (G = 2-4), PPI со второго по пятое поколение (G = 2-5) и PAMAM дендримеры со второго поколения (G2) (рис. 5.1). Для всех типом дендримеров использовалась модель объединенных атомов, то есть без явного учета неионизированных атомов водорода, например группы СН2 (или CH3) моделировалась как объединенный атом с молекулярной массой равной 14 (или 15). Упрощение модели способствовало существенному ускорению процесса моделирования и не должно оказать существенного влияния на свойства системы.

Создание структуры отдельного дендримера проводилось в пакете Materials Studio 6.0. С помощью редактора Build Polymers дендример был собран дивергентным способом: на каждом следующем шаге из дендримера генерации G собирался дендример генерации G+1 путем присоединения повторяющихся сегментов. На каждом этапе использовалась процедура минимизации энергии с помощью модуля Forcite.

Рисунок 5.1. Примеры химических структур исследованных дендримеров (а) функционализированного карбосиланового (FCS), (б) полипропилениминного (PPI) и (в) полиамидаминного (PAMAM) дендримеров второго поколения ^2). Различие между функционализированным и стандартным карбосилановым дендримером показано красным на рисунке (а).

Квантово-химический расчет парциальных зарядов атомов был проведен в модуле DMol3. Был использован метод Хартри-Фока с базисом dnp (который аналогичен базису 6-3Ш** в программе Gaussian).Для расчета значений зарядов

использовалось приближение RESP. Для проверки полученных результатов были использованы парциальные заряды атомов, рассчитанные в приближениях МиШкеп и Hirshfeld. Рассчитанные заряды для каждой группы усреднялись по атомам, которые одинаково структурно удалены от ядра дендримера.

5.2. Молекулярно-динамическое моделирование механической релаксации

в расплавах дендримеров

Механическая релаксация изучалась путем адаптированного метода, использованного ранее в работе [126]. Этот метод позволяет преодолеть сложность покрытия огромной области временных масштабов, присущей механической релаксации. Главной особенностью метода является суперпозиция кривых релаксации, полученных для динамических систем, подверженных различным внутренним трениям. Моделирование молекулярной динамики проводилось в пакете GROMACS [319]. Системы расплавов функционализированных карбосилановых (FCS) дендримеров были промоделированы в силовом поле Gromos53a6 [346], которое дает значения плотности расплавов данных дендримеров очень близкие к экспериментальным [123,125]. Расплавы PPI и PAMAM дендримеров были промоделированы в силовом поле OPLS [347]. Системы расплавов моделировались в периодических ячейках, каждая содержала по 27 макромолекул.

На предварительном этапе моделирования системы уравновешивали в ^^ансамбле с использованием термостата V-rescale [348] при 600 ^ срабатывающего каждые 0,1 пс, и баростата Берендсена [348] при 1 атм, срабатывающего каждую пикосекунду. Время предварительного уравновешивания составляло не менее 50 нс для G = 2-3 и не менее 400 нс для G = 4-5. Отметим, что соответствующих времен уравновешивания было достаточно как для уравновешивания, так и для «перемешивания» системы, т.е. для того, чтобы в системе не было артефактов, связанных с начальной конфигурацией. Для

иллюстрации на рис. 5.2 приведено среднеквадратичное смещение (ЫБЭ) как функция времени для исследуемых дендримеров максимального О.

Рисунок 5.2. Функция MSD(t) для CS, PPI и PAMAM с максимальным G в ^Т-ансамбле.

Затем системы моделировались в №Т-ансамбле при температуре 600 К с использованием термостата Ланжевена:

д2г1 mid.fi , р; , —>

1 ТТ &

(5.1)

где т.1 и Г1 - масса и радиус-вектор г-го атома, ^ - внешняя сила, действующая на г-й атом, 1/тТ - эффективный параметр, отвечающий за трение в системе [1/пс], а уу^ - случайная внешняя сила, которая отвечает условиям (ю^)) = 0 и + б)) = 2(т.1/тт)квТ8(5)8ц. (8ц - символ Кронекера, который равен 1 при г = у и 0 во всех остальных случаях).

Были использованы различные значения константы тт = 0,005, 0,05, 0,5 пс для изменения трения в системах. Увеличение данного параметра уменьшает трение и, следовательно, позволяет варьировать временной диапазон релаксации в системе. Для наибольшего значения тт было промоделировано десять реплик, чтобы получить лучшую статистику на больших временах.

На финальном этапе моделирование расплавов исследуемых систем проводилось в КУТ-ансамбле с использованием термостата Ланжевена. Оно

состояло из двух этапов: уравновешивания и непосредственно моделирования для получения равновесных траекторий (табл. 5.1). Время уравновешивания составило от 0,1 до 1 мкс (для максимальных генераций).

Таблица 5.1. Продолжительность финальных траекторий. Единицы времени в мкс.

Дендример G2 G3 G4 G5

FCS 0,6 1 2 -

PPI 0,6 1,5 2,2 3

PAMAM 1,2 - - -

G(t) = i^Z (6{Paß(t)Paß(0)) + (Naß(t)Naß(0))), (5.2)

Динамический модуль G(t) был рассчитан из флуктуаций тензора сдвигового напряжения Р = (Paß) [349,350]:

V

'(aß)

где V- объем ячейки моделирования, T - температура, kB - постоянная Больцмана, и Naß = Paa - Pßß, (aß) - суммы по компонентам xy, yz и zx тензора напряжения Р, который рассчитывался по следующей формуле:

Р = 1& щъ ® + Zi<j п ® Fij) (5.3)

где mi - масса, vt - скорость объединенной группы атомов i, F^ - сила, действующая со стороны группы j на i, и rt расстояние между ними. Компоненты тензора напряжения были записаны с шагом 10 фс. Затем с помощью команды «gmx analyze» в пакете GROMACS по временным зависимостям этих компонент вычислялись требуемые в ур. (5.2) автокорреляционные функции:

[(Paß(t)Paß(0))] = ((PXy(t)Pxy(Q)) + (Pxz(t)Pxz(Q)) + (PyZ(t)Pyz(Q))) (5.4)

6У 30квТ

[№ар(№ар(Р))] - РууЮ) (Рхх(0) - Руу(Р))) + {(РууЮ -

(руу(0) - Р22(0))) + {(Р2М - Рхх(Р))(Рхх(0) - Рхх(0)))) (5.5)

Например, члены ур. (5.2) для G5 РР1 дендримеров для параметра тт = 0,005 пс показаны на рис. 5.3.

Рисунок 5.3. Члены ур. (5.2) рассчитаны для расплава дендримера G5 РР1 при тТ = 0,005 пс. Временные зависимости приведены в масштабе времени тТ = 0,5 пс, т.е. с учетом значения К/ц из табл. 5.2.

Расчет G(t) для тт = 0,005 пс и тт = 0,05 пс проводился с использованием одной траектории. В случае тт = 0,5 пс использовалась траектория, усредненная по десяти репликам.

Модули G(t) для различных значений тт накладываются на основе вращательной автокорреляционной функции:

P1rot(t) = (u(t) ■ u(0)>, (5.6)

где u(t) - единичный вектор, соединяющий атом в центре ветвления (в FCS дендримере это атом кремния, а в случае PPI и PAMAM дендримеров - это атомы азота) и атомы в точках ветвления последнего поколения. Функции JP1rot были рассчитаны при тт = 0,5, 0,05, и 0,005 пс. Временные шкалы кривых функций P1rot при тт = 0,05 и 0,005 пс были масштабированы для того, чтобы функции совпадали с P1rot при тт = 0,5 пс (рис. 5.4). Из этой процедуры были определены коэффициенты масштабирования времени, Kflt (табл. 5.2).

1.0 0.8 £ 0-6 ОГо.4 0.2 0.0

1.0 0.8 5 0.6 ОГо.4 0.2 0.0

Рисунок 5.4. (а-г) Кривые функции Р1гог(1) для расплавов дендримеров G = 2-5 РР1 при различных значениях параметра тТ с масштабированным ? по К]ц из табл. 5.2.

Таблица 5.2. Коэффициенты масштабирования времени, К^, полученные из Р1го1(?) при разных тт. Например, Кт (при тт = 0,005 пс) х t (при тт = 0,005 пс) = t (при тт = 0,5 пс). Единицы времени в пс. О - генерация дендримера.

О Ктдля ЕС8 Кт для РР1 Кт для РАМАМ

тт = 0,005 тт = 0,05 тт = 0,005 тт = 0,05 тт = 0,005 тт = 0,05

2 0,0169 0,158 0,0190 0,184 0,0231 0,238

3 0,0182 0,149 0,0188 0,178 - -

4 0,0166 0,145 0,0188 0,172 - -

5 - - 0,0180 0,177 - -

Функция Р1го1 при тт = 0,5 пс была использована для оценки времени вращательной диффузии, тг^. Это время можно извлечь из экспоненциального

хвоста Я1го1 [124]. На рис. 5.5 показаны кривые Я1го1 для РР1 дендримеров всех изученных поколений при тт = 0,5 пс, значения ты, подобранные с помощью P1mt а ехр(—/ты) приведены в табл. 5.2.

1

о

L.

Q^ 0.1

0.01

0 10000 20000 30000 40000

t, ПС

Рисунок 5.5. Кривые P1rot(t) для PPI дендримеров G = 2-5 при tt = 0,5 пс.

Кривые G(t) для различных значений параметра тт были наложены с использованием коэффициентов масштабирования времени Kа (табл. 5.2). Отметим, что совмещение кривых при разных тт и дополнительное усреднение по временным точкам не приводит к увеличению погрешности. Так как слияние кривых происходит в областях, где кривая с меньшим временным интервалом практически не флуктуирует, а кривая, соответствующая большему временному интервалу, совпадает с первой. Кривая G(t) для тт = 0,5 пс была дополнительно усреднена по временным точкам. Например, полученная кривая G(t) при разных тт для дендримеров G5 PPI представлена на рис. 5.6.

Для того чтобы исключить влияние размера ячейки моделирования на зависимость G(t), была промоделирована система, содержащая 64 дендримера G2 PPI. Кривые G(t) для систем из 27 и 64 дендримеров оказались идентичными (рис. 5.7).

Рисунок 5.6. Результирующая кривая О^) для различных значений тТ для расплава РР1 дендримера О5. Для тТ = 0,5 пс использовалось дополнительное усреднение по времени (500, 1000, 10000, 50000 точек, соответствующих = 5, 10, 100 и 500 пс, соответственно).

Рисунок 5.7. Сравнение нормированных модулей релаксации напряжения сдвига [О(1)] = G(t)/G(0) в двойном логарифмическом представлении для систем дендримеров G2 РР1, состоящих из 27 (черные) и 64 (красные) макромолекул дендримеров.

Частотные зависимости модулей упругости О'(ю) и потерь О"(ю) были рассчитаны с помощью численного преобразования Фурье [351,352] результирующей временной зависимости динамического модуля:

(5.7)

(5.8)

(5.9)

"7 У ¿Л" ^и^а

где = /А?, А? - шаг суммирования. Для получения сглаженных функций О'(ш) и О"(ш) исходная кривая О(?) интерполировалась следующим методом: Функция О(?) делилась на несколько частей. Каждая часть этой кривой была аппроксимирована с использованием 4-6 экспонент. Затем данные экспоненты были использованы для восстановления функции О(?) с шагом по времени А? = 1 фс.

Для описания конечного спада временной зависимости, где О(?) < 10-12, использовалось экстраполяция с помощью приближения:

О(?) =С ехр(-2?/ттах) (5.10)

где С - константа аппроксимирования, ттах - максимальное время механической релаксации (табл. 5.3). Исходная и восстановленная кривые О(?) для расплава дендримера G5 РР1 показаны на рис. 5.8.

ю1

10°

10 1

■ 2

210 О 10

з

10"4 10 5 10"6

исходная —востановленная ]

г 1

г

г Д 1

10"4 10 3 10 2 10"1 10° 101 ю2 ю3 ю4 ю5 ПС

Рисунок 5.8. Исходная (черная) и восстановленная (красная) кривые О? для расплава дендримера G5 РР1.

Таблица 5.3. Структурные и динамические параметры рассматриваемых дендримеров: Md - молекулярная масса; Rg - радиус инерции, <Nhb> - среднее количество водородных связей между дендримерами (inter) и внутри одной макромолекулы (intra); rrot - время вращения дендримера как целого; ттах -максимальное (терминальное) время механической релаксации, характеризующее хвост релаксационного модуля (G(t) a exp (-2t/rmax)), и параметр B = Trot / Rg3. Для сравнения приведены параметры для расплавов CS дендримеров, полученные в работе [126]. Все данные приведены для параметра тт = 0,5 пс термостата Ланжевена.

Дендри мер G Md, г/моль нм <Nhb> ^overlap, нм trot ±5%, нс tmax ±5%, нс B ±5%, нс нм-3 tmax/trot ±7%

inter intra

PPI 2 1686,8 0,87 2 0 0,2 1,1 0,63 1,6 0,59

3 3513,9 1,08 3,1 0,9 0,27 3,2 1,7 2,5 0,53

4 7168,0 1,30 5,3 2,5 0,51 8,1 4,0 3,7 0,50

5 14476,3 1,56 9,3 6,7 1,01 25 20 6,6 0,80

CS 2 1964,3 0,87 0 0 0,44 0,83 0,46 1,25 0,55

3 4241,3 1,12 0 0 0,48 2,83 1,98 2,01 0,7

4 8763,0 1,39 0 0 0,93 7,0 9,6 2,6 1,36

FCS 2 2131,6 0,87 0 0 0,47 0,69 0,47 1,03 0,69

3 4746,3 1,14 0 0 0,72 2,56 2,24 1,73 0,88

4 9973,8 1,44 0 0 1,12 8,0 17 2,7 2,1

PAMAM 2 3256,2 1,03 10,9 7,5 - 7,9 4,1 7,2 0,52

Примечание: для анализа водородных связей были использованы стандартные инструменты пакета GROMACS. При расчете использованы следующие параметры: длина водородной связи между донором и акцептором (не более 0,35 нм) и угол «водород-донор-акцептор» (не более 30 градусов).

5.2.1. Релаксационный модуль

Временные зависимости динамического релаксационного модуля О(]) для расплавов дендримеров БСБ О = 2-4, РР1 О = 2-5 и РАМАМ G2 представлены на

рис. 5.9. Во временной зависимости динамического модуля можно выделить следующие области: релаксации напряжения, внутренней релаксации, пульсации ветвей, которая уширяется с числом генераций в дендримере, и терминальную область релаксации.

Рисунок 5.9. Двойное логарифмическое представление нормализованного модуля релаксации напряжения сдвига = G(t)/G(0) расплавов дендримеров (а) FCS

О = 2-4, (б) РР1G = 2-5 и (в) РАМАМ G2.

Во всех рассматриваемых случаях проявляется поведение кривых G(t) универсальное для дендримерных макромолекул. Так, на малых временах, кривые G(t) совпадают для различных поколений, поскольку основной вклад в релаксацию в этой области вносят локальные процессы, которые не зависят от размера дендримера [121,236]. На больших временах с увеличением поколения кривые G(t) спадают медленнее. Эта область отражает релаксационный процесс вследствие пульсационного движения ветвей дендримера как целого [121,269], поэтому

увеличение размера ветвей [126] приводит к более медленной релаксации. Терминальная область кривой О(?) (экспоненциальный хвост) определяется вращением дендримера как целого и/или коллективной подвижностью дендримеров. Для анализа зависимости О({) в этой области было использовано одноэкспоненциальное приближение О^) а ехр(-2?/гтах) и рассчитано максимальное время механической релаксации, гтах, (табл. 5.3). Эта область является наиболее важной для изучения эффекта плотного окружения. Подробное обсуждение эффекта плотного окружения и гтах приведено в разделах 5.3 и 5.5.

Сравнение зависимостей О(]) для функционализированных и стандартных карбосилановых дендримеров позволяет выявить влияние нерегулярного ветвления на механическую релаксацию. Рассмотрим область в диапазоне 0,1-5 пс, поскольку в случае FCS дендримеров именно в ней ожидается проявление дополнительного процесса, связанного с функционализацией. Согласно рис. 5.10а,б, в этой области наблюдаются небольшие различия между поколениями: кривые О(]) для G2 и G3 FCS располагаются несколько ниже, чем для CS дендримеров, причем эффект наиболее выражен в наименьшей генерации. Однако, в случае G4 (рис. 5.10в), различий в поведении О({) для FCS и CS не наблюдается. Отсюда можно сделать вывод, что вклад этого специфического процесса уменьшается с ростом поколения.

Отметим, что несмотря на то, что этот дополнительный процесс едва обнаруживается в экспериментах по механической релаксации, его присутствие существенно для диэлектрической [274] и ЯМР релаксации (см. раздел 3.2 в главе 3).

Рисунок 5.10. Сравнение нормализованного динамического модуля [О^)] = О^)/ 0(0) расплавов дендримеров FCS и CS (а) G2, (б) G3, и (в) G4.

5.2.2. Модули упругости и потерь

Частотные зависимости модулей упругости G'(w) и потерь G"(w) были рассчитаны из временных зависимостей динамического модуля G(t) и показаны на рис. 5.11.

Рисунок 5.11. Двойное логарифмическое представление модулей упругости [&(ю)] и потерь [&'(ю)] для расплавов дендримеров (а, б) РСБ О = 2-4; (в, г) РР1О = 2— 5; (д, е) РАМАМ О2.

Для всех рассматриваемых дендримеров на высоких частотах (1011-1013 рад/с) О'(ш) и 0"(ш) практически не различаются для различных поколений, поскольку это область определяется химической и топологической структурой дендримера и не зависит от его размера. В области низких частот (106-109 рад/с) поведение О'(ш) а ттахш2 и 0"(ш) а гтахш [352], поскольку определяется максимальным временем механической релаксации ттах, которое сильно зависит от размера дендримера. Чем больше генерация, тем ниже частота, при которой модули достигают терминального режима. В диапазоне средних частот функции О'(ш) и 0"(ш) определяются подвижностью (суб)ветвей дендримера как целого [126], что является особенностью древовидной структуры дендримеров [121,124,230,233,269]. В этой области кривые О'(ю) и 0"(а>) характеризуются постоянным наклоном различным для каждой генерации дендримера. Данная область представляет наибольший интерес и будет детально исследоваться ниже в разделе 5.3.

5.2.3. Сравнение результатов МД моделирования и эксперимента для

расплавов РР1 дендримеров

На данный момент в литературе имеется относительно мало экспериментальных исследований динамического модуля расплавов дендримеров. В частности, детальные экспериментальные данные по динамическому модулю доступны лишь для РР1 дендримеров. Так, в работе [254] были проведены экспериментальные исследования РР1 дендримеров G = 1-4 (что соответствует G = 2-5 в нашей нумерации) с помощью реологических методов и метода 1Н ЯМР с циклированием поля. В диапазоне средних частот (109-1011 рад/с) зависимости О'(ш) и 0"(ш) для G = 2-4 РР1 существенно отличаются от данных зависимостей для линейных полимеров. В частности, наклон кривых О'(ш) и 0"(ш) уменьшается с 0,72 ^2) до 0,65 ^4). В случае линейных полимеров эти зависимости имеют наклон около 0,60, что объясняется наличием плато. Авторы делают вывод, что степенной режим аналогичен для О'(ш) и 0"(ш) и составляет около 0,7.

Анализ данных МД моделирования дает схожие результаты. В диапазоне средних частот (рис. 5.11в) в случае О'(ш) наклон уменьшается с ростом генерации дендримера от 0,8 ^2) до 0,68 ^4). Уменьшение наклона и расширение его области соответствует расширению пульсационного спектра (и, как следствие, перераспределению вкладов в динамический модуль) с ростом генерации дендримера [121,269]. В случае О"(ю) (рис. 5.11г) наклон практически не меняется с размером дендримера (0,62 для G4 и 0,63 для G2). Совершенно иное поведение О'(ш) и О"(ш) в этой области наблюдается для дендримера РР1 G5. В отличие от О = 2-4 РР1, имеется область перегиба (примерно одна декада), для которой степенной режим можно оценить как 0,45. Наличие этой области связано с междендримерным взаимодействием, что будет детально рассмотрено в разделе 5.3.

Небольшое несоответствие между степенным режимом по данным МД моделирования и эксперимента может быть связано с разницей в используемых температурах: данные моделирования были получены при 600 К, а экспериментальные данные при 200-320 К.

Также, были рассчитаны частотные зависимости действительной части динамической вязкости, ц'(ю), которая связана с мнимой частью динамического модуля вязкости, следующей формулой [353]:

= (5.11)

Для сравнения с экспериментом полученные значения действительной части динамической вязкости были нормированы путем деления на значение ц'(ю = 0) дендримера РР1 G2 (т.е. [п'(^)] = ц'(ю)/ц'(0)).

Рис. 5.12а иллюстрирует частотные зависимости [ц'(ю)] для РР1 дендримеров О = 2-5. Как видно из рисунка, в диапазоне средних частот (109-1011 рад/с) зависимость [п'(^)] для G4 РР1 характеризуется наклоном около -0,38. Следует отметить, что этот наклон соответствует наклону О"(ш) минус 1, т.е. равен 0,62 -1. В экспериментальном исследовании [254] для дендримера G4 РР1 наклоны п'(ш), полученные из реологических и 1Н ЯМР данных, составили -0,35 и -0,24

соответственно. Таким образом, полученные значения достаточно близки к данным реологического эксперимента.

Несмотря на то, что наклон, полученный из ЯМР релаксации, невозможно воспроизвести из полученных данных моделирования (для этого требуются иные параметры моделирования системы), хотелось бы предложить гипотезу о различии в наклонах ц'(ю), полученных различными экспериментальными методами. Авторы работы [254] предполагают, что в этой области проявляются два слабовыраженных процесса. Важно отметить, что диапазон частот определяется в основном пульсационными процессами. С увеличением поколения дендримера G (см. табл. 5.3) возрастает количество водородных связей между его ветвями, что должно приводить к увеличению характерных времен пульсаций и расщеплению пульсационного спектра. Данное различие можно объяснить тем, что метод ЯМР возможно более чувствителен к внутримолекулярному эффекту водородных связей по сравнению с реологическим методом. По всей видимости, это связано с сильной зависимостью ЯМР релаксации от жесткости на изгиб [233,234,271], которая, в свою очередь, подавляет вклады мелкомасштабной подвижности в ЯМР релаксацию [236,238,260].

На низких частотах зависимость ц'(ю) выходит на плато, значения которого можно считать соответствующими кумулятивному соотношению мод FG [353,354]:

Ро = л'(0)/л'а(0), (5.12)

где Па (0) - предел при нулевой частоте в случае простой жидкости. Зависимость FG от молекулярной массы дендримера представлена на рис. 5.12б. Как и в случае реологических экспериментальных данных [254], функция Е^М) в двойном логарифмическом масштабе характеризуется наклоном близким к 1. Это значение наклона типично для динамики Рауза в кумулятивном пределе. Отличие от поведения Рауза значения наклона, полученного методом ЯМР [254], по-видимому, обусловлено теми же причинами, что и для динамической вязкости, обсуждавшийся выше.

г/моль

Рисунок 5.12. Двойное логарифмическое представление действительной части (а) динамической вязкости и (б) кумулятивного соотношения мод для РР1 дендримеров G = 2-5, рекалиброванных по значению ц'(0) дендримера РР1 G2.

5.3. Эффект плотного окружения

Данный раздел посвящен проявлению эффекта плотного окружения в расплавах исследуемых дендримеров. Эффект плотного окружения очень схож с эффектом джамминга (точнее является его предвестником), повсеместно встречающегося во многих системах мягких веществ (в том числе пен, коллоидных суспензий, эмульсий, полимеров и т.д.). Джамминг вызывает большой интерес в контексте неравновесных фазовых переходов, механики и реологии аморфных материалов, поскольку даже небольшие изменения в локальной конфигурации, плотности и связности частиц могут приводить к общесистемному изменению механической релаксации. К сожалению, с помощью МД моделирования исследовать динамические эффекты, связанные с эффект джамминга, не представляется возможным. Однако, результаты последних исследований расплавов дендримеров указывают на возможность изучения с помощью МД моделирования эффекта плотного окружения, который в отличие от джамминга, проявляется в дендримерах с меньшим номером генерации.

Поскольку проявление данного эффекта обычно связывают с наличием области О'(ш) > в промежуточном диапазоне частот, были

проанализированы частотные зависимости моделей упругости О'(ю) и потерь 0"(ю) расплавов дендримеров FCS О = 2-4 и PPI О = 2-5. PAMAM дендримеры не рассматриваются, поскольку наличие относительно долгоживущих водородных связей приводит к сильному замедлению механической релаксации и требует существенно более длинных траекторий, что сильно затрудняет моделирование больших генераций, в которых может проявляться данный эффект.

На рис. 5.13 представлены зависимости О'(ш) и 0"(ш) для расплавов FCS и CS дендримеров О = 2-4. В области промежуточных частот (108-109 рад/с) наблюдаются качественные различия в механической релаксации между поколениями функционализированных карбосилановых дендримеров. Так, для FCS G2 и G3 кривые О'(ш) располагаются ниже 0"(ш), однако, в случае G4, непосредственно перед переходом в терминальный режим обнаруживается область, охватывающая почти два порядка частот, где О'(ш) > 0"(ш). Отметим, что для низких генераций CS дендримеров О'(ш) и 0"(ш) не пересекаются (рис. 5.13г,д), а в случае G4 лишь соприкасаются друг с другом (рис. 5.13е) [126].

а, рад/с со, рад/с

со, рад/с со, рад/с

Рисунок 5.13. Сравнение модулей упругости [&(ю)] и потерь ^"(ю)] в двойном логарифмическом представлении для расплавов (а-в) FCS дендримеров G = 2-4 и (г-е) CS дендримеров G = 2-4 [126].

Далее рассмотрим аналогичные зависимости для расплавов РР1 дендримеров. Согласно рис. 5.14а-в, в промежуточном диапазоне частот в расплавах G = 2-4 РР1 область О'(ю) > 0"(ю) отсутствует. Что касается G5 РР1, то в области 108-109 рад/с О'(ю) и 0"(ю) имеют практически одинаковые значения и лишь соприкасаются друг с другом, как и в случае G4 CS [126]. По-видимому, это слабое проявление эффекта плотного окружения.

о), рад/с со, рад/с

Рисунок 5.14. Двойное логарифмическое представление модулей упругости [&(ю)] и потерь [&'(ю)] для расплавов РР1 дендримеров G = 2-5.

Для количественной оценки эффектов, имеющих место в системах расплавов дендримеров, были построены графики Ван Гурп-Палмена [355] (рис. 5.15), отражающие зависимость фазового угла 3 от абсолютного значения комплексного динамического модуля |£*| = + С'2:

5(|С*|) = агйап(^) (5.13)

Терминальная область соответствует значениям 8 близким к 90°. Стеклообразное состояние полимерной системы проявляется при 8 ^ 0.

На рис. 5.15 представлены зависимости 8(|О*|) для расплавов СБ, БСБ и РР1 дендримеров.

Рисунок 5.15. Зависимости 8(|0*|) для расплавов дендримеров (а) ЕСБ О = 2-4, (б) СБ О = 2-4 и (в) РР1 G = 2-5.

Как видно из рисунка, в области |О*| = 10-4-10-3 наблюдаются минимальные значения фазовых углов. В случае СБ G4, минимальное значение фазового угла 8тщ ~ 45°; для G4 БСБ оно приближается к 30°. Что касается расплавов дендримеров О = 2-4 РР1, то аналогичный минимум или даже предпосылки к нему отсутствуют. Однако, для G5 РР1 наблюдается минимум 8 такой же глубины, как и для G4 CS (8 ~ 45°).

Отметим, что аналогичные минимальные значения 8 экспериментально наблюдались для расплавов гиперразветвленного полиглицерола (hbPG) с высокой

молекулярной массой [356], при этом такой минимум отсутствовал для масс М^ро < 10000 г/моль. В работе [356] авторы объясняют глубокий минимум, при 3 < 45°, (т.е. О'(ю) > Ог'(ю)) наличием зацеплений, как и для расплавов линейных цепей, для которых 3 < 45° обычно связано с высокоэластичным плато [352,356]. Поскольку средняя молекулярная масса сегмента между двумя точками ветвления (-150 г/моль) значительно меньше массы необходимой для образования физических зацеплений в линейном полимере с аналогичной химической структурой (- 6000 г/моль), авторы предположили, что данный эффект связан с образованием водородных связей межу макромолекулами. Стоит отметить, что данный эффект не проявляется в карбосилановых или РР1 дендримерах, так как в них отсутствуют долгоживущие водородные связи (в отличие от ИЬРО).

В случае Сау1еу4гее полимеров [357,358], появление минимума 3 на низких частотах (при малые значениях ассоциируют с релаксацией ветвей, что

коррелирует с теоретическими результатами работы [269], в которой изучались полимерные сети на основе дендримеров. Однако, в случае расплавов дендримеров значение фазового угла 3 < 45°, имеет иную природу и связано с проявление плотного окружения. В отличие от Сау1еу4гее макромолекул, сегменты полипропилениминных и карбосилановых дендримеров короткие (с молярной массой менее 100 г/моль), что не может приводит к зацеплениям между дендримерами, и как следствие, аналогичный эффект релаксации ветвей на кривой 3(^*|) отсутствует.

Таким образом, согласно рис. 5.15, из рассматриваемых расплавов дендримеров G4, признаки плотного окружения проявляются только у карбосилановых дендримеров, хотя РР1 и карбосилановые дендримеры имеют одинаковые спейсеры между точками ветвления, количество концевых групп, а также близкие размеры и молекулярные массы. В то же время, в расплаве G5 РР1 наблюдается проявление эффекта плотного окружения аналогичное G4 CS. При этом G5 РР1 дендример имеет молекулярную массу примерно в 1,5 раза и Яё на 10% больше, чем у карбосиланового дендримера G4. Следовательно, можно утверждать, что данный эффект не связан напрямую с размерами дендримеров. По

всей видимости, проявление эффекта плотного окружения обусловлено формированием непроницаемого ядра в дендримере, в которое не могут проникать соседние макромолекулы. Действительно, топологическое ядро РР1 дендримера является более объемным по сравнению с ядром карбосилановых дендримеров. Этот факт, вероятно, приводит к тому, что непроницаемая область формируется в РР1 дендримерах при большем числе поколений. Следовательно, следующим важным шагом является установление корреляции между наличием непроницаемого ядра и эффектом плотного окружения.

Степень проникновения оценивалась по радиальным профилям плотности, рассчитанным относительно центра масс макромолекулы как для одного дендримера, рв, так и для остальных дендримеров в системе, р0уег1ар, с использованием ур. 3.14. Радиальные профили плотности выбранного дендримера (рв) и проникающих в него соседних дендримеров (р0уег1ар) представлены на рис. 5.16. Учитывая угол 3Шщ - 45°, наблюдаемый для 04 СБ, целесообразно выбрать величину, характеризующую непроницаемое ядро этого дендримера, и использовать ее в качестве репера при анализе других типов дендримеров. В качестве этой величины было выбрано значение радиуса (гоуеГ1ар), при котором плотность взаимопроникновения дендримеров не превышает 5% (т.е. (р0уег1ар(г0уег1ар)/р0) - 0,05) (см. табл. 5.3). Для 04 СБ значение г0уег1ар составляет около 1 нм (рис. 5.16б). В случае 04 БСБ это значение увеличивается, что согласуется с ожидаемым на основании более низкого значения угла 3тщ - 30°. Для более низких поколений БСБ этот параметр уменьшается. Кроме того, значение Гоуег1ар хорошо коррелирует с проявлением эффекта плотного окружения у РР1 дендримеров. Как видно из рис. 5.16в, в дендримерах РР1 G = 2-4 непроницаемая внутренняя область практически отсутствует, а соседние дендримеры проникают в центр макромолекулы, что подтверждается значениями г0уег1ар в диапазоне 0,2-0,5 нм. В отличие от них, дендример G5 РР1 имеет непроницаемое ядро с радиусом около 1 нм (Г0уег1ар - 1 нм), что сравнимо с аналогичным параметром для дендримера G4 CS (рис. 5.16г).

2.0

(в)

1.5

•ч

I

1.0

0.5

0.0

---1---1---1--— РР1 —I---1-.- Р^Рй -С2 -вз . -в4 -

у' /' А>»ег1ар'А>

/ -----С2

-----вз -

/ /\ Ч -----

N..... С5

- - *- - -1 - *

2.0

(г)

га

1.0

о.

•ч

-р

А 0.5

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0

Г, нм

0.0

Ро'Ро

04 РСЭ

-СЭ ■

-РР1

'/ РоуеМар^Ро

\- - - в4 РСЭ

... в4 СЭ "

РР|

......■

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0