Защитные эффекты стресс-индуцируемого шаперона Hsp70 в модели болезни Паркинсона у крыс тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.03.01, кандидат наук Белан Дарья Владимировна

• Белан Дарья Владимировна
• кандидат наук
• 2020

Оглавление диссертации кандидат наук Белан Дарья Владимировна

Введение

Глава I Обзор литературы

1.1 Общая характеристика болезни Паркинсона

1.2 Патогенез болезни Паркинсона

1.3 Экспериментальные модели болезни Паркинсона in vivo

1.4 Шаперон Hsp70 и болезнь Паркинсона

1.5 Индукторы белка теплового шока Hsp70 в терапии нейродегенеративных заболеваний

Глава II Материалы и методы исследования

2.1 Объект исследования

2.2 Стереотаксические операции по вживлению направляющих канюль в черную субстанцию

2.3 Моделирование болезни Паркинсона у крыс с помощью ингибитора протеасом лактацистина

2.4 Нокдаун Hsp70 в компактной части черной субстанции в модели доклинической стадии болезни Паркинсона у крыс среднего возраста

2.5 Интраназальное введение рекомбинантного белка теплового шока Hsp70 человека крысам среднего возраста в модели клинической стадии болезни Паркинсона

2.6 Системное введение индуктора белков теплового шока соединения U133 крысам среднего и пожилого возраста в моделях клинической и доклинической стадий болезни Паркинсона

2.7 Тесты на моторное поведение

2.8 Декапитация

2.9 Вестерн-блот

2.10 Иммуногистохимическое исследование

2.11 Двойное иммуномечение и конфокальная микроскопия

2.12 Метод ловушки на фильтре

2.13 Статистическая обработка результатов

Глава III Результаты исследования

3.1 Влияние нокдауна Hsp70 (HSPA1) в дофаминергических нейронах компактной части черной субстанции на показатели нейродегенерации и компенсаторные процессы в нигростриатной системе в модели доклинической стадии болезни Паркинсона у крыс среднего возраста

3.2 Исследование возрастных особенностей в проявлении нейродегенерации и развитии компенсаторных процессов в нигростриатной системе на модели доклинической стадии болезни Паркинсона у крыс

3.3 Исследование защитных эффектов белка теплового шока Hsp70 при его интраназальном введении при моделировании клинической стадии болезни Паркинсона у крыс среднего возраста

3.4 Исследование нейропротективного потенциала индуктора шаперонов U133 в моделях доклинической и клинической стадий болезни Паркинсона у крыс среднего и пожилого возраста

3.5 Исследование влияния препарата U133 на а-синуклеиновую патологию и микроглиоз в головном мозге крыс при моделировании болезни Паркинсона

Глава IV Обсуждение

Заключение

Выводы

Список использованных сокращений

Список цитируемой литературы

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Защитные эффекты стресс-индуцируемого шаперона Hsp70 в модели болезни Паркинсона у крыс»

ВВЕДЕНИЕ Актуальность работы

Болезнь Паркинсона (БП) - мультисистемное медленно прогрессирующее нейродегенеративное заболевание, характеризующееся широким спектром моторных и немоторных симптомов. Ведущим симптомом БП является наличие в клинической стадии типичных моторных нарушений (гипокинезии, мышечной ригидности, тремора покоя), связанных с дегенерацией 60-70% двигательных дофамин (ДА)-ергических нейронов в компактной части черной субстанции (кчЧС) и снижением уровня дофамина в стриатуме на 70%-80% [1]. Сегодня БП - это второе по распространенности нейродегенеративное заболевание, уступающее по частоте встречаемости лишь болезни Альцгеймера. Около 10 миллионов людей во всем мире страдают от БП, и заболеваемость неуклонно растет с возрастом: среди лиц 65 лет распространенность БП составляет 1%, а к 85 годам достигает 5% [2]. Увеличение долгожителей, предсказанное в течение ближайших 20-30 лет, будет сопровождаться 1.5 - 2-кратным увеличением числа пациентов с БП [3].

За весь исторический период, когда БП приобрела статус социально значимого заболевания, не вылечено ни одного больного. Причины неизлечимости известны - поздняя постановка диагноза, когда основная часть специализированных нейронов в кчЧС уже погибла, и применение симптоматической терапии, целью которой является улучшение самочувствия больного и «качества» его жизни, а не воздействие на патогенетические механизмы развития нейродегенерации при БП [4]. Поэтому одной из глобальных проблем фундаментальной биомедицины является разработка новых технологий ранней диагностики БП и терапевтических препаратов, нацеленных на предупреждение или замедление дегенерации нейронов головного мозга, а не на элиминацию внешних проявлений БП [4, 5].

Многочисленные данные литературы указывают, что нарушение укладки белка а-синуклеина является молекулярной основой развития нейродегенерации при БП [6, 7]. Нарушение фолдинга а-синуклеина приводит к накоплению в нейронах токсичных гидрофобных форм этого белка в виде олигомеров или протофибрилл, которые затем превращаются в нерастворимые фибриллы а-синуклеина [2, 8, 9]. Олигомеры а-синуклеина нарушают работу всего белоксинтезирующего аппарата клетки, приводят к развитию нейродегенеративного и нейровоспалительного процессов в головном мозге. Наличие аберрантных форм а-синуклеина в нейронах кчЧС характерно как для наследственной, так и для спорадической формы БП [9].

Важнейшими молекулярными механизмами защиты нейронов от процесса агрегации белковых молекул являются механизмы, направленные на поддержание протеостаза, в которых участвуют около 2000 факторов, однако ключевыми являются убиквитин-протеасомная система (УПС) и система белков теплового шока ЖР70. Основной функцией УПС является протеолиз мутантных, неверно свернутых и агрегированных белков, направленных шаперонами на деградацию [10]. Ослабление активности УПС характерно для БП и является одним из основных

механизмом гибели нейронов [11]. На основе этого механизма созданы животные модели БП, имитирующие доклиническую и клиническую стадии БП [12-16]. Функционирующая в клетках шаперонная система белков теплового шока ЖР70 является первой линией защиты от фатальных последствий неправильной укладки белков. Члены этого семейства белков, в частности стресс-индуцируемый №р70, препятствуют неправильному фолдингу белков, контролируя процесс укладки и рефолдинга белков на всех этапах, а также помогают транспортировать аномальные белки в протеасому и лизосому для деградации [17, 18].

Ряд экспериментальных исследований показывает, что шапероны НБРб вовлечены в патогенез БП и могут быть первой линией защиты функции клетки при нарушении укладки белков и развитии нейродегенерации [19-21]. Первые сведения о вовлечении шаперонов в патогенез БП были получены в работах, в которых определили НБРб как компоненты телец Леви, колокализованные с агрегатами а-синуклеина [20, 22]. За последние 10 лет накопились данные о защитном действии стресс-индуцируемого шаперона №р70 в моделях эпилепсии, нарушений сна и эндотоксемии [23-26]. Кроме того, защитный эффект экзогенного №р70 отмечен в некоторых моделях БП у трансгенных животных со сверхэкспрессией а-синуклеина [22, 27, 28]. Показано, что в модели БП у крыс, созданной на основе угнетения работы протеасом в кчЧС, выживают нейроны с повышенным содержанием №р70 [29]. Однако прямых доказательств, подтверждающих роль стресс-индуцируемого белка теплового шока №р70 в молекулярных механизмах нейропротекции и защиты функций мозга от нейротоксических факторов при БП, до сих пор не получено. Остается неясным, сопряжено ли снижение или повышение экспрессии генов, кодирующих №р70, с выживаемостью нейронов в кчЧС, являющейся значимой для БП структурой головного мозга.

Спорадическая форма БП обычно развивается в пожилом возрасте, для которого характерно снижение активности работы УПС и АТФ-зависимой шаперонной системы [2, 30, 31]. Показано, что при БП экспрессия некоторых шаперонов снижена в кчЧС, что отражает ослабление механизмов конформационного контроля и клеточной защиты [32]. Однако в литературе до сих пор отсутствуют экспериментальные данные, подтверждающие сопряженность между связанным со старением снижением содержания Шр70 и устойчивостью ДА-ергических нейронов в кчЧС к патологии, характерной для БП. Пока остается неясным, можно ли с помощью шаперонной терапии ослабить или остановить процесс нейродегенерации в головном мозге при БП.

Цель работы

Выяснить роль стресс-индуцируемого белка теплового шока Шр70 в молекулярных механизмах нейропротекции и защиты функций мозга от нейротоксических факторов в моделях болезни Паркинсона, созданных на основе ингибирования протеасом головного мозга у крыс.

Задачи

1) Изучить изменения патоморфологических признаков нейродегенерации и компенсаторных процессов в ДА-ергической нигростриатной системе в модели доклинической стадии БП у крыс среднего возраста в условиях снижения содержания Шр70 в нейронах кчЧС.

2) Выяснить, сопряжены ли возрастные изменения в нейродегенеративных и компенсаторных процессах в нигростриатной системе с содержанием №р70 в кчЧС при моделировании доклинической стадии БП у крыс.

3) Изучить влияние курсового интраназального введения рекомбинантного белка №р70 человека на нейродегенеративный и компенсаторный процессы в нигростриатной системе при моделировании клинической стадии БП у крыс среднего возраста.

4) Оценить защитный потенциал индуктора шаперонов хиноидного соединения Ш33 в моделях доклинической и клинической стадий БП у крыс среднего и пожилого возраста.

5) Изучить влияние соединения Ш33 на альфа-синуклеиновую патологию и реактивный микроглиоз в головном мозге при моделировании БП у крыс.

Положения, выносимые на защиту

1) Стресс-индуцируемый белок теплового шока №р70 составляет важнейшую систему защиты ДА-ергических нейронов нигростриатной системы от нейротоксических факторов при развитии Паркинсон-подобной патологии; уменьшение содержания №р70 в ДА-ергических нейронах кчЧС приводит к прогрессии нейродегенерации в нигростриатной системе, а увеличение - препятствует развитию нейродегенерации и усиливает нигростриатную функцию при моделировании БП у животных.

2) Hsp70-индуцирующий эффект соединения Ш33 лежит в основе его нейропротективного действия в моделях доклинической и клинической стадий БП. Молекулярными мишенями №р70 являются агрегаты а-синуклеина, фосфорилированная по Ser129 форма а-синуклеина и активированная микроглия.

Научная новизна работы

На моделях БП у крыс среднего и пожилого возраста впервые показано, что снижение содержания Hsp70 в ДА-ергических нейронах кчЧС способствует прогрессированию нейродегенерации и ускоряет переход патофизиологических признаков БП из доклинической в клиническую стадию БП, а увеличение - напротив, замедляет развитие нейродегенерации и способствует активации ДА-ергических компенсаторных процессов в нигростриатной системе. Полученные данные указывают на важную роль Hsp70 в механизмах нейропротекции и пластичности мозга при развитии Паркинсон-подобной патологии. Впервые в моделях БП у животных установлены нейропротективные и противовоспалительные эффекты терапии с индуктором шаперонов, малой молекулой U133. Впервые выяснено, что защитное действие шаперона Hsp70 связано с его способностью разбирать белковые агрегаты а-синуклеина, снижать содержание фосфорилированной по Ser129 формы а-синуклеина и уменьшать реактивный микроглиоз.

Теоретическая и практическая значимость работы

Результаты настоящего исследования имеют значение для фундаментальной нейрофизиологии, фармакологии и биомедицины. Теоретическое значение диссертационной работы состоит в доказательстве защитного действия стресс-индуцируемого шаперона Hsp70 при развитии Паркинсон-подобной патологии. Полученные в работе данные о терапевтическом потенциале рекомбинантного белка Hsp70 человека и отечественного индуктора шаперонов соединения U133 в моделях БП у животных могут найти применение в клинических исследованиях при разработке технологии превентивной фармакотерапии БП и других нейродегенеративных заболеваний. Полученные результаты могут быть использованы в курсах лекций по физиологии и неврологии для студентов биологических и медицинских специальностей университетов и медицинских институтов.

Апробация работы

Результаты исследования представлены в виде устных и стендовых докладов на всероссийских и международных конференциях: 2nd World Congress on Neurotherapeutics (Прага, Чехия, 2015), 21st, 23rd и 26th Multidisciplinary International Neuroscience and Biological Psychiatry Conference «Stress and Behavior» (Санкт-Петербург, Россия, 2014, 2016, 2019), XV Всероссийское совещание с международным участием и VIII Школа по эволюционной физиологии (Санкт-Петербург, 2016), 13th International Conference on Alzheimer's and Parkinson's Diseases (Вена, Австрия, 2017), Первая Всероссийская конференция и школа с международным участием «Оптогенетика и Оптофармакология» (Санкт-Петербург, Россия, 2018), 2nd Brainstorming Research Assembly for Young Neuroscientists (Милан, Италия, 2019), II Всероссийская научная конференция с международным участием «Оптогенетика+ 2020» (Санкт-Петербург, Россия, 2020).

Публикации по теме диссертации

По теме диссертации опубликовано 9 статей в рецензируемых научных журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией РФ для размещения материалов диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, и 9 тезисов докладов всероссийских и международных конференций.

Личный вклад автора

Все экспериментальные процедуры - подготовка и проведение хирургических операций, введение препаратов, моторные тесты, сбор образцов тканей головного мозга, биохимические и гистохимические исследования, статистическая обработка полученных результатов - выполнены автором лично. Автор участвовала в подготовке публикаций по материалам работы совместно с научным руководителем и с соавторами, представляла результаты исследований на всероссийских и международных конференциях.

Финансовая поддержка работы

Работа выполнена при частичной финансовой поддержке программы № 5 Президиума РАН "Фундаментальные науки - медицине" (2014 г.), грантов РФФИ № 14-04-00478 (2014-2016 г.) и РНФ 16-15-00278 (2016-2018 г.). Морфологические исследования выполнены на базе ЦКП ИЭФБ РАН.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 138 страницах машинописного текста и состоит из введения, содержащего цель и задачи исследования, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследования, обсуждения, заключения и выводов. Список литературы включает 58 публикаций отечественных авторов и 343 зарубежных источника. Работа иллюстрирована 36 рисунками и 1 таблицей.

ГЛАВА I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Общая характеристика болезни Паркинсона

Болезнь Паркинсона (БП) была впервые описана Джеймсом Паркинсоном в 1817 году. Внешние симптомы этого заболевания проявляются моторными нарушениями, которые были объединены Паркинсоном в так называемую триаду: брадикинезия, мышечная ригидность и тремор покоя. Помимо моторных феноменов, Паркинсон также описал наличие немоторных проявлений заболевания у своих пациентов - нарушения сна и речи, дисфагия, слюнотечение, запоры и т.д. [33]. Сегодня БП - это второе по распространенности нейродегенеративное заболевание, уступающее по частоте встречаемости лишь болезни Альцгеймера. На настоящий момент, по всему миру 1% людей старше 60 лет страдают этим заболеванием, в Европе насчитывается около 5 млн человек с диагнозом БП и, по прогнозам, к 2030 году их число может увеличиться до 8.67 млн [3]. Годовая стоимость ухода за одним пациентом в среднем составляет около 11000 евро [34]. Таким образом, на сегодняшний день БП представляет собой одно из социально-значимых нейродегенеративных заболеваний, которое отрицательно сказывается как на жизни отдельных людей, так и на социальной и экономической политике целых стран.

Особенностью БП является длительный (до 20-30 лет) бессимптомный период, когда болезнь находится в так называемой «доклинической» стадии и постановка диагноза невозможна. На ранних стадиях БП происходит активация различных механизмов компенсации недостаточности нигростриатной дофамин (ДА-)ергической системы головного мозга, препятствующих проявлению моторных феноменов даже при значительном уровне нейродегенерации и снижении содержания ДА в нигростриатной системе [35]. Показано, что в ответ на снижение выработки ДА из-за прогрессирующей нейродегенерации в компактной части черной субстанции среднего мозга (кчЧС) включаются механизмы компенсации этого недостатка [36]. Так, в 1965 году было установлено, что у больных БП в ранней клинической стадии при сниженном содержании ДА в стриатуме, содержание его основных метаболитов (3,4-дигидроксифенилуксусной и гомованилиновой кислот) остается неизменным, что свидетельствует об усилении метаболизма ДА и представляет собой один из пресинаптических компенсаторных процессов при БП [37]. Позже этот же механизм компенсации был продемонстрирован в различных моделях БП у грызунов и обезьян [38-40]. Помимо усиления эффективности метаболизма ДА, в доклинической стадии БП происходит компенсаторное усиление транскрипции гена тирозингидроксилазы (ТГ), скорость-лимитирующего фермента синтеза ДА, и увеличение активности ТГ, причем при усилении нейродегенерации эта активность возрастает, что продемонстрировано в модели БП у мышей, созданной на основе 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридина (МФТП) [41].

Поддержание нормального уровня ДА при прогрессирующей дегенерации ДА-ергических нейронов может объясняться также тем, что недофаминергические, (в основном пептидергические) нейроны начинают экспрессировать ферменты синтеза ДА и синтезируют ДА по принципу «конвейера»: в нейронах, содержащих ТГ, L-тирозин превращается в промежуточный продукт реакции синтеза ДА - L-3,4-диоксифенилаланин (Ь-ДОФА), который выделяется в межклеточную среду и захватывается с помощью мембранного переносчика крупных нейтральных аминокислот в нейроны, содержащие декарбоксилазу ароматических аминокислот, которые завершают цепочку реакций синтеза ДА (рис. 1). Такой компенсаторный механизм с участием «моноэнзиматических» нейронов показан в нейротоксической МФТП-модели БП у мышей [40, 42-44]. Помимо этого, увеличение количества «моноэнзиматических» нейронов продемонстрировано в модели БП-подобной нейродегенерации у обезьян, а также у людей, страдающих БП [45], что предполагает важную роль этого механизма в поддержании нормального уровня ДА при развитии нейродегенеративной патологии.

Рисунок 1. Схема реакций синтеза дофамина из L-тирозина.

Не менее важным пресинаптическим механизмом компенсации недостатка ДА в стриатуме могут быть изменения в работе системы транспорта ДА. Известно, что загрузка ДА в пресинаптические везикулы для последующего экзоцитоза осуществляется везикулярным транспортером моноаминов 2 (ВТМА 2), а обратный захват из синаптической щели -транспортером ДА (dopamine transporter; DAT). Продемонстрировано, что в модели доклинической стадии БП у мышей происходит компенсаторное повышение содержания ВТМА 2 в нейронах кчЧС, что может свидетельствовать об усилении захвата ДА в везикулы для экзоцитоза [46]. С другой стороны, происходит уменьшение активности процесса обратного захвата ДА в пресинаптическое нервное окончание с помощью DAT, что может «продлевать» время нахождения ДА в синаптической щели. Снижение содержания мРНК DAT и ослабление его сродства с ДА было показано у пациентов с БП [47, 48].

Одним из постсинаптических механизмов компенсации недостатка ДА в стриатуме у животных в моделях БП является увеличение плотности рецепторов ДА типа 2, возможно из-за транслокации на поверхность мембраны большего их количества [49, 50]. Однако данные, полученные на пациентах с БП, разнятся - в некоторых работах увеличения количества ДА2-рецепторов не обнаружено [36].

Несмотря на то, что БП была подробно охарактеризована более 200 лет назад и с тех пор активно изучается, не известно ни одного случая полного излечения от данного заболевания. Одной из проблем является поздняя постановка диагноза, которая производится только при появлении четко выраженных моторных симптомов. Клинической (или моторной) стадией БП называют состояние, когда процесс нейродегенерации в кчЧС достигает 60-70%, уровень нейромедиатора ДА падает на 70% в стриатуме и дефицит ДА уже не может быть компенсирован организмом, что приводит к развитию моторных нарушений [51, 52].

Основной комплекс терапевтических подходов, применяемых в современной медицине для терапии БП, направлен на устранение или ослабление двигательных симптомов. Условно эти подходы можно разделить на три группы. В первой группе находятся препараты, применение которых позволяет увеличить содержание в головном мозге ДА, уровень которого резко понижен при БП. К таким препаратам относится, например, леводопа, действующим веществом которой является предшественник ДА L-ДОФА (см. рис. 1). Во вторую группу входят препараты, чье действие направлено на уменьшение обратного захвата эндогенного ДА из синаптической щели, например, ингибиторы моноаминоксидазы типа Б или дофаминомиметики. Третья группа включает в себя агонисты дофаминовых рецепторов. Стоит отметить, что ни один из этих подходов не может остановить или хотя бы замедлить прогрессирование нейродегенерации, происходящее в головном мозге заболевших, поэтому дозы лекарственных средств постоянно увеличиваются, появляется все больше побочных эффектов, а терапевтический эффект применяемых препаратов постепенно снижается [53]. К глобальным проблемам современной биомедицины можно отнести поиск новых надежных методов постановки диагноза БП на доклинической (премоторной) стадии развития заболевания, когда процесс нейродегенерации может быть остановлен или замедлен еще до проявления моторных феноменов, а также разработку новых терапевтических средств, направленных на нейропротекцию, а не на элиминацию внешних проявлений заболевания.

1.2 Патогенез болезни Паркинсона

В среднем мозге человека выделяют три крупных группы ДА-ергических нейронов, лежащие в ретрорубральном поле (А8), черной субстанции (А9) и вентральной тегментальной области (А10). Терминали этих групп нейронов формируют проекции, которые образуют соответственно мезокортикальную, нигростриатную и мезокортиколимбическую ДА-ергические системы мозга. Черная субстанция среднего мозга состоит из трех отделов - компактного, ретикулярного и латерального. Терминали аксонов компактной части черной субстанции оканчиваются в области хвостатого ядра или неостриатума. Нигростриатная система является основной ДА-ергической системой мозга, вовлеченной в организацию двигательных актов [54].

Согласно современным представлениям о центральных механизмах реализации движения, важную роль в этих процессах играет именно ДА-ергический вход из кчЧС [55]. Дорсальный стриатум получает возбуждающий глутаматный вход через отростки пирамидных нейронов коры больших полушарий и ДА-ергический вход от нигростриатной системы. Показано, что конвергенция кортикального и дофаминового входов в дорсальном стриатуме облегчает организацию поведения, направленного на получение подкрепления. Через прямой выход (дофаминовые рецепторы первого типа (Д1), активирующие Gs-белки аденилатциклазной системы) стриатум тормозит внутренний паллидум и ретикулярную часть черной субстанции, уменьшая их тормозящие влияния на таламокортикальные входы (т.е. растормаживает их) и облегчая запуск запланированного движения. Таким образом, прямой выход является активирующим. С другой стороны, через непрямой выход (дофаминовые рецепторы второго типа (Д2), активирующие Gi-белки аденилатциклазной системы) стриатум тормозит наружный паллидум и снижает его тормозящее влияние на субталамическое ядро, что приводит к увеличению активирующего влияния последнего на внутренний паллидум и ретикулярную часть черной субстанции и в результате увеличивает их тормозящие влияния на таламокортикальные входы и уменьшает растормаживающее влияние прямого пути [56]. Таким образом, непрямой выход является тормозным (рис. 2). В результате конвергенции этих двух путей осуществляется запуск или отмена движения [57, 58].

«Активирующий» выход nepei Д,-рецепторы «Тормоншши» выход через Д2-рсцепторы

Рисунок 2. Схематичное изображение прямого и непрямого путей регуляции двигательной функции. БШвн - внутренний паллидум; БШн - наружный паллидум; кчЧС -компактная часть черной субстанции; рчЧС - ретикулярная часть черной субстанции; Д1 -рецепторы дофамина первого типа; Д2 - рецепторы дофамина второго типа. Сплошные стрелки - возбуждающие входы (глутамат), пунктирные стрелки - тормозные входы (ГАМК), стрелки штрих-пунктир - дофаминергические входы от кчЧС.

Впервые предположение о связи повреждений нигростриатной системы с развитием патологического состояния, которое впоследствии было названо БП, высказано в 1893 году при исследовании postmortem головного мозга человека, страдающего паркинсоническим тремором [59, 60]. Позже, Фридрих Генрих Леви впервые описал характерные внутриклеточные включения в дорсальном моторном ядре блуждающего нерва, базальном ядре Мейнерта, стриатуме и ядрах таламуса, а в 1919 году российский невропатолог К.Н. Третьяков сообщил о наличии таких включений в кчЧС пациентов с идиопатическим и пост-энцефалическим паркинсонизмом и назвал их тельцами Леви [61-63].

На сегодняшний день абсолютно точно установлено, что к развитию основного симптома БП - моторных феноменов - приводит нарушение метаболизма ДА, в основе которого лежит дегенерация ДА-ергических нейронов кчЧС и их отростков в стриатуме, уменьшение уровня ДА и ненормальная работа прямого и непрямого путей регуляции двигательной функции [1, 64]. Интересно, что дегенерация ДА-ергических нейронов в кчЧС наблюдается и при нормальном старении и составляет примерно 5% от общего числа нейронов кчЧС в десятилетие [65]. Однако

при развитии БП процесс дегенерации значительно ускоряется и, в клинической стадии, к моменту появления двигательных симптомов, погибает более 60% ДА-ергических нейронов кчЧС, а уровень ДА в стриатуме падает на 70% по сравнению с возрастным контролем.

БП является заболеванием всей нервной системы, поэтому, помимо нигростриатной системы, процесс агрегации белков, формирования телец Леви и нейродегенерации охватывает и другие области головного мозга, а также периферическую нервную систему. Считается, что развитие нейродегенерации начинается с терминальных отделов мозга (обонятельные луковицы, дорсальное двигательное ядро блуждающего нерва), а затем распространяется в различные области головного мозга через проекции аксонов [66]. Эта гипотеза подтверждается тем, что одним из первых симптомов БП (как и некоторых других нейродегенеративных заболеваний) является ольфакторная дисфункция, т.е. неспособность чувствовать запахи, которая развивается у 90% больных БП задолго до появления моторных феноменов [67]. Также во время этой немоторной фазы заболевания, называемой продромальной стадией БП, проявляются и иные немоторные признаки, например, быстрый сон без мышечной атонии, запоры и другие вегетативные нарушения [52, 68, 69], возникающие вследствие нейродегенеративного процесса в обонятельных луковицах, голубом пятне, дорсальном моторном ядре блуждающего нерва, ядре шва, туберомамиллярном гипоталамическом ядре [70]. Однако вопрос, почему именно моноаминергические нейроны кчЧС, голубого пятна и других ядер оказываются особо чувствительными к дегенерации при БП, до сих пор обсуждается.

Несмотря на то, что БП открыта давно и ведется ее непрерывное изучение, этиология этого заболевания остается неясной. Мутации являются причиной лишь малой части всех эпизодов БП: около 90% случаев являются спорадическими. Считается, что основными факторами риска являются генетическая предрасположенность, подверженность стрессам, травмы мозга, воздействие эндо- и экзогенных токсичных веществ, способных запустить нейродегенеративный процесс [71, 72]. Несмотря на открытия, сделанные генетиками в последние годы, точные патогенетические механизмы, лежащие в основе селективной гибели ДА-ергических нейронов кчЧС, остаются до конца не изученными, и на сегодняшний день считается, что к нейродегенерации при БП приводит сочетание эндогенных и экзогенных факторов.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Белан Дарья Владимировна, 2020 год

- 100 -

Г- в

с/ н о 80 -

и

Б 60 -

я О

я и 'А и 40 -

с. о

о ч о н 20 -

и В о 0 -

*

■

Контроль ЛВК-эЬШрТО

Рисунок 8. Изменение уровня Hsp70 в компактной части черной субстанции (кчЧС) у крыс через 14 дней после введения в кчЧС лентивирусной конструкции shRNA-Hsp70 (ЛВК-8ЬНвр70). Слева на рисунке представлены репрезентативные иммуноблоты кчЧС. Достоверность различий в опыте относительно ЛВК^И№р70 по сравнению с контролем * - р < 0.05.

3.1.2 Изменение показателей нейродегенерации и компенсаторных процессов в нигростриатной системе у крыс в модели доклинической стадии БП в условиях нокдауна

Шр70

Для моделирования нейродегенеративной патологии нигростриатной системы, характерной для БП, была воспроизведена ранее разработанная в лаборатории модель доклинической стадий БП у крыс среднего возраста на основе ЛЦ [15, 29], который вводился локально в кчЧС дважды с интервалом 7 дней (см. рис. 4). Проведенный морфологический анализ нейронов, иммунореактивных к ТГ, выявил уменьшение на 30% (р < 0.05) количества ДА-ергических нейронов в кчЧС и на 20% (р < 0.05) - их аксонов в дорсальном стриатуме через 2 недели после последней микроинъекции ЛЦ (рис. 10). Такие изменения в уровне дегенерации в нигростриатной системе характерны для доклинической стадии БП. Для того чтобы выяснить, сопровождается ли процесс нейродегенерации в нигростриатной системе в модели доклинической стадии БП у крыс активацией компенсаторных механизмов, направленных на поддержание уровня ДА, мы проанализировали изменение содержания в нейронах кчЧС скорость-лимитирующего фермента синтеза ДА ТГ и ВТМА 2, укладывающего ДА в синаптические везикулы. ТГ и ВТМА 2 являются косвенными показателями, отражающими функциональное состояние ДА-ергических нейронов. Установлено, что через две недели после последней микроинъекции ЛЦ оптическая плотность иммунореактивного вещества ТГ практически не изменялась, однако наблюдалось снижение уровня иммунореактивности ВТМА 2 на 18% (р < 0.05) в нейронах кчЧС по сравнению с контрольной группой животных (рис. 11).

После проверки эффективности трансфекции ДА-ергических нейронов кчЧС лентивирусной конструкцией вЬКЫА-НврТО были выполнены ее микроинъекции крысам среднего возраста в модели доклинической стадии БП. Введение ЛЦ этим крысам осуществлялось через 14 дней после введения ЛВК, когда содержание Нвр70 в нейронах кчЧС было снижено (рис. 9).

ЛЦ 1 (0.4) ЛЦ 2 (4.0)

А А Тесты на моторное

Операция по восстановление_Т_Т_г

----' поведение

вживлению канюль

восстановление т »

7 дней ♦ 14 дней 7 дней 1 14 дней

1 $ЬША-Н$р70 пролонгирование

Декантация

Рисунок 9. Схема эксперимента по изучению эффектов лентивирусной конструкции бИККА-Нвр70 в модели доклинической стадии БП у крыс. ЛЦ - лактацистин.

Установлено, что введение вЬКЫА-НврТО животным в модели доклинической стадии БП, приводило к прогрессированию нейродегенерации в нигростриатной системе, о чем свидетельствовало снижение количества выживших ДА-ергических нейронов кчЧС и их аксонов в стриатуме до 50% (р < 0.05) по сравнению с контролем (рис. 10).

1 / "С ШиЯ- "' .'-..'■л йябяР 9

* '» 4 >> ■ ■ > *' • ■ 10 /ни

!

т ЙЙ4

:

«йй

йй»

ж

■ :

■евог

II

Контроль

Контроль ЛВК

ЛЦ ЛВК + ЛЦ

Рисунок 10. Изменение количества ДА-ергических нейронов в компактной части черной субстанции (кчЧС) (а, в) и ДА-ергических аксонов в дорсальном стриатуме (б, г) у крыс в модели доклинической стадии БП при введении лентивирусной конструкции shRNA-Hsp70 (ЛВК). Световая микроскопия: (а) ТГ-иммунореактивные нейроны в кчЧС (масштаб 50 мкм); (б) ТГ-иммунореактивные аксоны в дорсальном стриатуме (масштаб 10 мкм). Достоверность различий в опыте относительно: контроля * - р < 0.05; ЛВК + ЛЦ по сравнению с действием ЛЦ # - р < 0.05.

Развитие обширной нейродегенерации в нигростриатной системе сопровождалось снижением уровня ТГ на 16% ф < 0.05), а также падением в 2 раза ф < 0.05) уровня ВТМА 2 в нейронах кчЧС по сравнению с моделью доклинической стадии БП (рис. 11).

Рисунок 11. Изменение содержания тирозингидроксилазы (ТГ) и везикулярного транспортера моноаминов 2 (ВТМА 2) в ДА-ергических нейронах кчЧС у крыс в модели доклинической стадии БП при локальных микроинъекциях в кчЧС лентивирусной конструкции shRNA-Hsp70 (ЛВК). Световая микроскопия (а): ТГ- и ВТМА 2-иммунореактивные нейроны в кчЧС (масштаб 10 мкм). Достоверность различий в опыте относительно: контроля * - р < 0.05; ЛВК + ЛЦ по сравнению с действием ЛЦ # - р < 0.05.

При оценке нейропротективного потенциала выживших ДА-ергических нейронов в модели доклинической стадии БП выяснено, что через две недели после последней микроинъекции ЛЦ содержание №р70 увеличивается на 25% (р < 0.05). Однако у крыс, которым выполнялись превентивные инъекции вИККА-Нвр70, содержание №р70 в нейронах кчЧС падает на 44% (р <0.05) по сравнению животными, получавшими только микроинъекции ЛЦ (рис. 12).

Контроль ЛВК ЛЦ ЛВК + ЛЦ

Рисунок 12. Изменение содержания белка теплового шока №р70 в ДА-ергических нейронах кчЧС у крыс в модели доклинической стадии БП при локальных микроинъекциях в кчЧС лентивирусной конструкции shRNA-Hsp70 (ЛВК). Световая микроскопия (а): Нвр70-иммунореактивные нейроны в кчЧС (масштаб 10 мкм). Достоверность различий в опыте относительно: контроля * - р < 0.05; ЛВК + ЛЦ по сравнению с действием ЛЦ # - р < 0.05.

Таким образом, установлено, что моделирование доклинической стадии БП у крыс в условиях нокдауна Нвр70 характеризуется развитием обширной нейродегенерации нигростриатной системы и отчетливым ослаблением механизмов синтеза ДА и его упаковки в синаптические везикулы.

3.1.3 Изменение моторного поведения крыс в модели доклинической стадии БП в

условиях нокдауна Hsp70

В ходе следующего этапа работы необходимо было выяснить, какое влияние оказывает снижение содержания шаперона №р70 с помощью микроинъекций ЛВК вЬЯКА-Шр70 на показатели моторного поведения в модели доклинической стадии БП у крыс. Для этого были выполнены тесты, позволяющие оценить тонкую моторику передних конечностей, рта и языка, нарушения в походке, постуральной устойчивости и координации движений. Проведенные тесты не выявили у крыс через две недели после последней микроинъекции ЛЦ нарушений изучаемых показателей моторного поведения. Однако локальные микроинъекции лентивирусной конструкции вЬККА-Нвр70 в кчЧС и последующее введение ЛЦ привели к появлению у крыс моторных дисфункций характерных для клинической стадии БП. На это указывало сокращение в 1.3 раза (р < 0.05) количества съеденных крысой семечек подсолнечника, увеличение в 2 раза (р < 0.05) количества соскальзываний лапок с планки в тесте «Суок» по сравнению с животными, получавшими только ЛЦ (рис. 13).

Рисунок 13. Изменение моторного поведения крыс в модели доклинической стадии БП при локальных микроинъекциях в кчЧС лентивирусной конструкции shRNA- Шр70 (ЛВК): а -количество съеденных крысой за 5 минут семян подсолнечника; б - количество соскальзываний лапок крысы с планки в тесте «Суок»; в - общая оценка качества прохождения крысы по планке в тесте «Суок».

Следовательно, снижение содержания №р70 в кчЧС с помощью 8ИКМА-Н8р70 приводит к развитию обширной нейродегенерации и дисфункции нигростриатной системы, проявляющейся в нарушении тонкой моторики передних конечностей, рта и языка, а также походки и координации движений.

Таким образом, снижение содержания индуцибельного Шр70 в нейронах кчЧС с помощью микроинъекций в кчЧС лентивирусной конструкции shRNA-Hsp70 в модели доклинической стадии БП у крыс ускоряет развитие нейропатологических процессов и переход заболевания на следующую, клиническую стадию БП, для которой характерно развитие обширной дегенерации нигростриатной системы и угасание компенсаторных механизмов мозга, что приводит к появлению моторных нарушений. Можно заключить, что шаперон №р70 является ключевой молекулой, продлевающей жизнь ДА-ергических нейронов кчЧС при дисфункции нигростриатной системы, характерной для БП. Снижение содержания Шр70 приводит к прогрессирующей гибели клеток, угасанию механизмов пластичности мозга и переходу БП от доклинической (премоторной) к клинической (моторной) стадии.

3.2 Исследование возрастных особенностей в проявлении нейродегенерации и развитии компенсаторных процессов в нигростриатной системе на модели доклинической стадии

болезни Паркинсона у крыс

Старение является сложным биологическим явлением, в процессе которого нарушается молекулярно-генетическое и физиологическое поведение клеток и накапливаются возрастные повреждения [209, 210]. Преклонный возраст - основной фактор риска развития и прогрессии нейродегенеративных заболеваний. У пожилых людей отмечено снижение уровня ТГ и ДА в стриатуме, уменьшение количества пигментированных нейронов в кчЧС и плотности рецепторов ДА в стриатуме [212]. Синтез белков теплового шока НБР70 и других шаперонов, обладающих нейропротективными свойствами, в клетках и тканях при старении ослабевает, стресс не вызывает такого отчетливого повышения экспрессии шаперонов, как у молодых [18, 160, 225, 226]. Однако в литературе до сих пор отсутствуют данные, экспериментально подтверждающие зависимость от возраста и содержания №р70 в нейронах головного мозга темпа прогрессии нейродегенерации и активности компенсаторных процессов в нигростриатной системе при развитии БП. Поэтому следующей задачей исследования было выяснить, является ли возрастное снижение уровня №р70 в нейронах кчЧС одним из факторов, способствующих развитию нейродегенерации и ослаблению механизмов пластичности мозга при моделировании доклинической стадии БП у крыс.

3.2.1 Изменение содержания Hsp70 в нейронах компактной части черной субстанции у крыс разных возрастных групп при моделировании доклинической стадии болезни

Паркинсона

Для решения этой задачи мы применили антитела против индуцибельного белка №р70 и исследовали содержание №р70 в нейронах кчЧС у крыс разных возрастных групп при моделировании доклинической стадии БП. Проведенный анализ иммунореактивности №р70 в нейронах кчЧС показал, что в контрольных условиях содержание №р70 в нейронах кчЧС сходно у молодых крыс и животных среднего возраста, а у пожилых крыс по сравнению с молодыми уровень №р70 снижен на 14% (р < 0.05). Выяснено, что при моделировании доклинической стадии БП с помощью ЛЦ содержание №р70 в кчЧС возросло на 41% (р < 0.05) и 38% (р < 0.05) соответственно через две недели после последней микроинъекции ЛЦ, у крыс молодого и среднего возраста, а у пожилых крыс наблюдалась лишь тенденция к приросту уровня №р70 по сравнению с возрастными контрольными значениями (рис. 14). Следовательно, введение ЛЦ в кчЧС вызывает в 2.7 раза меньшее увеличение уровня №р70 в нейронах кчЧС у пожилых крыс по сравнению с молодыми животными и крысами среднего возраста, что указывает на ослабление мобилизации шаперонного механизма, основанного на №р70, при старении.

а

Молодые Сред. возр. Пожилые

гс.

** О ? ■ Ъ» V г «* с Я

- Уе / а ■ Щ ". Л 1 < * <*> 11 / 10 (Ш1

Н О

5 а 120 Н 8

5 и

£ °

= а

°= £ 80

к в

« е!

а о ч

£ 2 40

Контроль | ЛЦ Молодые

Контроль | ЛЦ Сред. возр.

Контроль] ЛЦ Пожилые

Рисунок 14. Изменение содержания белка теплового шока №р70 в нейронах компактной части черной субстанции после микроинъекций лактацистина (ЛЦ) у крыс молодого, среднего и пожилого возраста. Световая микроскопия: (а) Нвр70-иммунореактивные нейроны в кчЧС (масштаб 10 мкм). Достоверность различий в опыте относительно: соответствующего возрастного контроля * - р < 0.05; пожилого контроля по сравнению молодым # - р < 0.05.

3.2.2 Изменение показателей нейродегенерации и дофаминергических компенсаторных процессов в нигростриатной системе у крыс разных возрастных групп при моделировании доклинической стадии болезни Паркинсона

Для того чтобы выяснить, насколько зависит от возраста темп развития нейродегенерации и активность компенсаторных процессов в нигростриатной системе при введении ЛЦ, проанализировано количество выживших ДА-ергических нейронов в кчЧС и их аксонов в стриатуме, содержание в нейронах кчЧС ТГ и ВТМА 2. Проведенный морфологический анализ нейронов, иммунореактивных к ТГ, показал, что в контрольных условиях количество ДА-ергических нейронов в кчЧС на 17% (р < 0.05) и 12% меньше у пожилых по сравнению с крысами молодого и среднего возраста, соответственно. Следовательно, по мере старения животных ДА-ергические нейроны подвергаются нейродегенерации. После введения ЛЦ количество выживших нейронов в кчЧС уменьшилось на 14% (р < 0.05) у молодых, на 24% (р < 0.05) в среднем возрасте и на 35% (р < 0.05) у пожилых крыс по сравнению с соответствующими возрастными контролями (рис. 15 а, б). Сходная картина наблюдалась в дорсальном стриатуме - в контрольных условиях у пожилых крыс количество ТГ-иммунопозитивных ДА-ергических терминалей аксонов было ниже на 16% (р < 0.05) и на 13% по сравнению с животными молодого и среднего возраста, соответственно. При введении ЛЦ количество ДА-ергических аксонов в дорсальном стриатуме значимо не изменялось у молодых животных; у животных среднего возраста количество аксонов уменьшилось на 14% (р < 0.05), а у пожилых - на 21% (р < 0.05), по сравнению с возрастным контролем (рис. 15 в, г).

Таким образом, микроинъекции ЛЦ в кчЧС приводят к уменьшению в 2.5 раза числа выживших ДА-ергических нейронов в кчЧС и в 2.3 раза их аксонов в дорсальном стриатуме у пожилых крыс по сравнению с молодыми. Это указывает на ослабление резистентности нигростриатной системы к токсическому действию ЛЦ при старении.

И Молодые Сред. вогр. Пожилые в Молодые Сред. возр. Пожилые

Рисунок 15. Изменение количества ДА-ергических нейронов в компактной части черной субстанции (а, б) и ДА-ергических аксонов в дорсальном стриатуме (в, г) в модели доклинической стадии БП (ЛЦ) у крыс молодого, среднего и пожилого возраста. Световая микроскопия: (а) ТГ-иммунореактивные нейроны в кчЧС (масштаб 50 мкм); (в) ТГ-иммунореактивные аксоны в дорсальном стриатуме (масштаб 10 мкм). Достоверность различий в опыте относительно: соответствующего возрастного контроля * - р < 0.05; пожилого контроля по сравнению молодым # - р < 0.05.

Обнаружено, что у пожилых крыс в контрольных условиях происходит увеличение на 19% (р < 0.05) содержания ТГ в нейронах кчЧС по сравнению с молодыми. При введении ЛЦ наблюдалось возрастание уровня ТГ в выживших нейронах кчЧС у крыс молодого и среднего возраста, а у пожилых, напротив, содержание ТГ снижалось на 18% (р < 0.05) в кчЧС по сравнению с соответствующим возрастным контролем (рис. 16 а, б). Сходная направленность отмечена при анализе содержания ВТМА 2. При старении в контрольных условиях содержание ВТМА 2 в нейронах кчЧС увеличивалось на 21% (р < 0.05). Введение ЛЦ вызывало повышение ВТМА 2 на 17% (р < 0.05) у крыс молодого и среднего возраста, а у пожилых- снижение на 19% (р < 0.05) (рис. 16 в, г).

Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что микроинъекции ЛЦ в кчЧС вызывают у пожилых крыс, в отличие от животных молодого и среднего возраста, не увеличение, а снижение уровня ТГ и ВТМА 2 в нейронах кчЧС. Это свидетельствует об ослаблении

активности механизмов, направленных на компенсацию функциональной недостаточности ДА-ергической системы к действию ЛЦ при старении.

а Молодые Сред, во <р. Пожилые В Молодые Сред, во |р. Пожилые

Рисунок 16. Изменение содержания тирозингидроксилазы (ТГ) и везикулярного транспортера моноаминов 2 (ВТМА 2) в ДА-ергических нейронах кчЧС в модели доклинической стадии БП (ЛЦ) у крыс молодого, среднего и пожилого возраста. Световая микроскопия: (а) ТГ-иммунореактивные нейроны в кчЧС (масштаб 50 мкм); (в) ВТМА 2-иммунореактивные нейроны в кчЧС (масштаб 50 мкм). Достоверность различий в опыте относительно: соответствующего возрастного контроля * - р < 0.05; пожилого контроля по сравнению молодым # - р < 0.05.

3.2.3 Возрастные особенности проявления а-синуклеиновой патологии в дофаминергических нейронах компактной части черной субстанции у крыс при моделировании доклинической стадии болезни Паркинсона

На сегодняшний день в литературе превалирует мнение, что основной причиной гибели нервных клеток при БП является образование в телах нейронов токсичных агрегатов белка а-синуклеина [6, 340]. Ключевое значение в предотвращении образования белков с неправильной укладкой играют белки теплового шока семейства ЖР70 и малые белки теплового шока бНБРб. Мы предположили, что возрастное снижение экспрессии №р70 может являться причиной ускоренной агрегации а-синуклеина, инициирующей гибель нейронов.

Методами двойного иммуномечения с применением первичных антител к а-синуклеину и ТГ проведен сравнительный анализ наличия и локализации а-синуклеин-позитивных включений в ДА-ергических нейронах кчЧС при моделировании доклинической стадии БП у крыс среднего и пожилого возраста. Показано, что патологическое агрегирование а-синуклеина ускоряется у крыс при старении, о чем свидетельствует наличие многочисленных телец Леви, содержащих более крупные агрегаты белка а-синуклеина, по сравнению с агрегатами этго белка у крыс среднего возраста через две недели после последнего введения ЛЦ (рис. 17). Ускорение процесса

образования патологических форм белка а-синуклеина в ДА-ергических нейронах может быть одной из причин прогрессии нейродегенеративного процесса при БП в пожилом возрасте.

Рисунок 17. Конфокальная микроскопия препаратов кчЧС при моделировании доклинической стадии БП у крыс среднего (сред.возр.) и пожилого возраста: двойное иммуномечение с применением антител против тирозингидроксилазы (ТГ; зеленый сигнал) и а-синуклеина (красный сигнал). На результирующих изображениях стрелками показаны агрегаты а-синуклеина. Масштаб 15 мкм.

3.2.4 Изменение показателей моторного поведения у крыс разных возрастных групп при

Выявленные признаки прогрессирования нейродегенерации и снижения активности механизмов, направленных на компенсацию функциональной недостаточности ДА-ергической системы, в модели доклинической стадии БП у крыс при старении, явились основанием для анализа моторного поведения животных разных возрастных групп. Проведенный тест с семенами подсолнечника не выявил значимых изменений в количестве съеденных семян в контрольных условиях у пожилых крыс по сравнению с животными молодого и среднего возраста. Введение ЛЦ в кчЧС крысам молодого и среднего возраста не оказало влияния на число съеденных семян подсолнечника через две недели после второй микроинъекции ЛЦ. При введении ЛЦ пожилым крысам обнаружено снижение в 1.5 раза (р < 0.05) количества съеденных семян подсолнечника по сравнению с контролем (рис. 18 а). Следовательно, нарушение тонкой моторики характерно только для пожилых крыс при моделировании доклинической стадии БП.

ТГ

а-синуклеин ТГ + ц-синуклеин

моделировании доклинической стадии болезни Паркинсона

Тест с зависанием животных на решетке показал, что время зависания крысы в контрольных условиях зависит от ее возраста: чем старше животное, тем меньше времяее зависания на решетке. Причем у крыс при старении временной показатель имеет наиболее низкие значения, что свидетельствует о наличии у этих животных возрастного сенсомоторного дефицита конечностей. Введение ЛЦ пожилым крысам не усиливало сенсомоторный дефицит по сравнению с контролем. ЛЦ не оказывал влияние на время зависания на решетке молодых крыс и животных среднего возраста (рис. 18 б).

Рисунок 18. Изменение моторного поведения у крыс молодого, среднего и пожилого возраста в модели доклинической стадии БП: а - количество съеденных крысой за 5 минут семян подсолнечника; б - продолжительность зависания крысы на решетке в тесте «Перевернутая решетка». Достоверность различий в опыте относительно: соответствующего возрастного контроля * - р <0.05; контрольных животных среднего и пожилого возраста по сравнению молодыми # - р <0.05.

***

Таким образом, возрастное снижение содержания индуцибельного №р70 в нейронах кчЧС в модели доклинической стадии БП у пожилых крыс способствует прогрессии нейродегенерации и угасанию компенсаторных механизмов в нигростриатной системе, что приводит к появлению нарушений в тонкой моторике, характерных для клинической стадии БП. Сходные результаты нами получены при снижении уровня №р70 в кчЧС с помощью лентивирусной конструкции 8ЬККЛ-Н8р70, что указывает на значимую роль шаперона №р70 в молекулярных механизмах защиты ДА-ергических нейронов от развития БП-подобной нейродегенеративной патологии.

Полученные результаты подтверждают гипотезу о зависимости устойчивости ДА-ергических нейронов к нейротоксическим повреждениям от уровня содержания шаперона №р70 в кчЧС. Кроме того, полученные факты имеют фундаментальное значение для понимания молекулярных механизмов развития нейродегенерации при БП и могут быть использованы для обоснования разработки способов замедления или остановки процесса нейродегенерации в нигростриатной системе при развитии БП на основе белка №р70 или индукторов его синтеза.

3.3 Исследование защитных эффектов белка теплового шока Hsp70 при его интраназальном введении при моделировании клинической стадии болезни Паркинсона у

крыс среднего возраста

Результаты, полученные на предыдущих этапах работы, указывают, что снижение экспрессии Hsp70 в ДА-ергических нейронах кчЧС может быть существенным фактором, ускоряющим развитие нейродегенеративного процесса в нигростриатной системе при БП. Следовательно, для того чтобы повысить выживаемость ДА-ергических нейронов и остановить или ослабить нейродегенерацию необходимо усилить экспрессию и/или увеличить содержание Hsp70 в нигростриатной системе при этой патологии. Поэтому в задачу следующего этапа работы входило выяснить, способно ли повышение содержания Hsp70 в головном мозге, достигнутое путем интраназального введения рекомбинантного белка Hsp70 человека, ослабить процесс нейродегенерации и уменьшить проявления моторной дисфункции в модели клинической стадии БП у крыс среднего возраста.

3.3.1 Исследование способности рекомбинантного Hsp70, введенного интраназально, проникать в дофаминергические нейроны компактной части черной субстанции в модели

клинической стадии болезни Паркинсона

Для оценки способности Hsp70, введенного интраназально, проникать в ДА-ергические нейроны кчЧС, использован меченый флуоресцентным красителем Hsp70 и применены методы конфокальной микроскопии с использованием первичных антител против ТГ и Hsp70. Меченый Hsp70 (5 мкг) вводился интраназально контрольным (n=3) и модельным (n=3) животным через 4 ч после микроинъекции контрольного раствора (PBS) или ЛЦ. Взятие материала головного мозга осуществлялось через 4 ч после интраназального введения Hsp70. С помощью конфокального микроскопа Leica TCS SL проанализировано наложение сигналов для ТГ и меченого Hsp70 в нейронах кчЧС. При анализе результирующего изображения выяснено, что введеный интраназально меченый Hsp70 активно интернализуется ДА-ергическими нейронами кчЧС. Проникая в нейроны, меченый Hsp70 локализуется в цитоплазме и не обнаруживается в ядре (рис. 19 а). Для доказательства, что в нейроны кчЧС проникает именно меченый Hsp70 мы провели иммуногистохимическую реакцию с антителами против Hsp70 человека. При анализе результирующего изображения наблюдалась полная колокализация сигналов красной флуоресцентной метки, конъюгированной с рекомбинантным белком Hsp70 человека, и зеленой флуоресцентной метки, конъюгированной с антителами против Hsp70 человека (рис. 19 б).

Следовательно, рекомбинантный Hsp70, введенный интраназально, способен проникать в мозг, мигрировать в область кчЧС и интернализоваться ДА-ергическими нейронами в модели БП у крыс среднего возраста.

а ТГ Шр70-А1еха555 Наложение

б Шр70 Н$р70-А1еха555 Наложение

Рисунок 19. Конфокальная микроскопия: (а) проникновение меченого флуоресцентным красителем №р70 (№р70-А1еха555; красный сигнал) в дофаминергические нейроны компактной части черной субстанции (ТГ, зеленый сигнал) при интраназальном введении; (б) колокализация флуоресцентных меток, конъюгированных с антителами против №р70 человека (зеленый сигнал) и интраназально введеным Шр70-А1еха555 (красный сигнал). Масштаб 10 мкм.

3.3.2 Влияние интраназального введения Шр70 на показатели нейродегенерации и компенсаторные процессы в дофаминергической нигростриатной системе в модели клинической стадии болезни Паркинсона у крыс среднего возраста

Для моделирования нейродегенеративной процессов в нигростриатной системе, характерных для БП, была воспроизведена модель клинической стадий БП у крыс среднего возраста на основе ЛЦ, который вводился локально в кчЧС дважды с интервалом 7 дней (рис. 4). Проведенный подсчет нейронов, иммунореактивных к ТГ, выявил уменьшение на 62% (р < 0.05) числа ДА-ергических нейронов в кчЧС и на 68% (р < 0.05) аксонов в дорсальном стриатуме через 2 недели после последней микроинъекции ЛЦ (рис. 21). Полученные данные позволяют заключить, что у крыс, получавших микроинъекции ЛЦ в кчЧС, развивается обширная нейродегенерация нигростриатной системы, характерная для клинической стадии БП.

Для того чтобы оценить нейропротективный эффект №р70 мы провели сравнительный анализ количества выживших нейронов в кчЧС и их аксонов в дорсальном стриатуме у модельных животных, получавших интраназально №р70, и модельных животных, получавших растворитель №р70. Для исследования защитных эффектов экзогенного Шр70 в модели клинической стадии БП его вводили интраназально модельных животным через 4 и 24 часа после каждой микроинъекции ЛЦ и через 7 дней после последней микроинъекции ЛЦ (рис. 20). Введение №р70 после микроинъекций ЛЦ позволило оценить его терапевтический эффект в ситуации, когда нейроны уже вступили на путь апоптоза вследствие дисфункции протеасом, вызванной нейротоксином ЛЦ.

Операция по вживлению канюль

ЛЦ 1 (4.0)

восстановление

7 дней

^ 7 дней Hsp70

ЛЦ 2 (4.0)

t|| 7 дней

Hsp70

7 дней

IIsp7(l

Тесты на моторное поведение Декапитацпя

пролонгирование

Рисунок 20. Схема эксперимента по изучению эффектов экзогенного Шр70 в модели клинической стадии БП у крыс. ЛЦ - лактацистин.

Результаты проведенного анализа показали, что введение №р70 модельным животным увеличивает в 2 раза (р < 0.05) количество выживших ДА-ергических нейронов в кчЧС по сравнению с животными, получавшими только ЛЦ. При подсчете числа ДА-ергических аксонов в стриатуме животных, получавших №р70 после введения ЛЦ, также обнаружено увеличение в 2.4 раза (р < 0.05) их количества по сравнению с действием ЛЦ (рис. 21). Полученные данные указывают, что увеличение содержания №р70 в нигростриатной системе с помощью его интраназального введения в модели клинической стадии БП у крыс ослабляет развитие нейродегенеративного процесса до уровня доклинической стадии БП. Эти данные указывают на наличие нейропротективного потенциала у стресс-индуцируемого белка Шр70.

Рисунок 21. Изменение числа ДА-ергических нейронов в компактной части черной субстанции (а, в) и ДА-ергических аксонов в дорсальном стриатуме (б, г) у крыс в модели клинической стадии БП при проведении терапии с помощью интраназального введения №р70. Световая микроскопия: (а) ТГ-иммунореактивные нейроны в кчЧС (масштаб 50 мкм); (б) ТГ-иммунореактивные аксоны в дорсальном стриатуме (масштаб 10 мкм). Достоверность различий в опыте относительно: контроля * - р < 0.05; ЛЦ + №р70 по сравнению с действием ЛЦ # - р < 0.05.

Для того чтобы выяснить, сопровождается ли процесс нейродегенерации в нигростриатной системе при введении ЛЦ активацией компенсаторных механизмов, направленных на поддержание уровня ДА, мы проанализировали изменение содержания в нейронах кчЧС ТГ и ВТМА 2. Установлено, через две недели после последней микроинъекции ЛЦ происходит снижение оптической плотности ТГ на 20.3% ф < 0.05) и ВТМА 2 на 23% ф < 0.05) в нейронах кчЧС по сравнению с контрольной группой животных (рис. 22). Следовательно, развитие обширной нейродегенерации в нигростриатной системе сопряжено со снижением компенсаторных процессов, направленных на поддержание уровня ДА в модели клинической стадии БП у крыс среднего возраста.

Для того чтобы оценить способность рекомбинантного Hsp70 влиять на функциональное состояние выживших нейронов в кчЧС, мы сопоставили изменение содержания ТГ и ВТМА 2 у модельных животных, получавших интраназально №р70, и модельных животных, получавших растворитель №р70. Проведенный анализ показал, что №р70 препятствует снижению ТГ и увеличивает ее уровень до контрольных значений в нейронах кчЧС (р < 0.05), однако не оказывает значительного влияния на уровень ВТМА 2 по сравнению с животными в модели клинической стадии БП, получавшими интраназально растворитель №р70 (рис. 22).

ВТМА:

Рисунок 22. Изменение содержания тирозингидроксилазы (ТГ) и везикулярного транспортера моноаминов 2 (ВТМА 2) в ДА-ергических нейронах кчЧС у крыс в модели клинической стадии БП при интраназальном введении №р70. Световая микроскопия (слева): ТГ- и ВТМА 2-иммунореактивные нейроны в кчЧС (масштаб 10 мкм). Достоверность различий в опыте относительно: контроля * - р < 0.05; ЛЦ + №р70 по сравнению с действием ЛЦ # - р < 0.05.

Таким образом, интраназальное введение рекомбинантного Hsp70 в модели клинической стадии БП у крыс среднего возраста ослабляет процесс дегенерации в нигростриатной системе, а также способствует частичной активации механизмов, направленных на компенсацию функциональной недостаточности ДА в нейронах кчЧС.

3.3.3 Влияние интраназального введения Hsp70 на моторное поведение в модели клинической стадии болезни Паркинсона у крыс среднего возраста

Двигательные нарушения - важнейший клинический признак, характерный для БП. Они проявляются у людей снижением общей двигательной активности (брадикинезия), тремором покоя, изменением походки, повышением мышечного тонуса и постуральной неустойчивостью [341]. Для того чтобы оценить моторные дисфункции, характерные для нашей модели клинической стадии БП у крыс мы провели поведенческие тесты, позволяющие оценить тонкую моторику передних конечностей, рта и языка, нарушения в походке и координации движений.

Выяснено, что через 2 недели после последней микроинъекции ЛЦ в кчЧС у крыс появились нарушения в координации движений и походке в тесте «Суок». Об этом свидетельствовало возрастание в 5 раз (р < 0.05) числа соскальзываний лапок крысы с планки, снижение скорости прохождения по планке и изменение положения задних конечностей относительно тела при прохождении планки по сравнению с контрольной группой животных. В среднем, в соответствии с разработанной неврологической шкалой (см. табл. 1), у крыс, получавших ЛЦ, развились моторные нарушения (6.1 ± 1.0 против 0.7 ± 0.2 баллов в контроле; р < 0.05) (рис. 23 б, в). Применение теста с семенами подсолнечника показало уменьшение в 1.7 раза (р < 0.05) числа раскрытых и съеденных семечек в течение пятиминутного теста (рис. 23 а), что свидетельствует о появлении нарушений в тонкой моторике передних конечностей, рта и языка. Таким образом, для модели клинической стадии БП характерными признаками моторной дисфункции являются нарушение координации движений и походки, ухудшение мелкой моторики передних конечностей, рта и языка.

Увеличение содержания №р70 в нигростриатной системе путем его интраназального введения в модели клинической стадии БП препятствует развитию моторной дисфункции. Повышение уровня №р70 уменьшает в 3 раза (р < 0.05) число соскальзываний лапок крыс с планки в тесте «Суок». Согласно примененной нами неврологической шкале, Шр70 ослабляет в 6.5 раз (р < 0.05) общий уровень моторных нарушений при прохождении по планке (0.9 ± 0.25 против 6.1 ± 1.0 баллов у модельных животных) (рис. 23 б, в). Кроме того, введение №р70 увеличивает в 1.5 раза (р < 0.05) число съеденных крысой за 5 минут семечек по сравнению с животными в модели БП (рис. 23 а).

а б в

Контроль ЛЦ ЛЦ + Контроль ЛЦ ЛЦ + Контроль ЛЦ ЛЦ +

Нвр70 Нзр70 №р70

Рисунок 23. Изменение моторного поведения в модели клинической стадии БП у крыс среднего возраста при интраназальном введении №р70: а - количество съеденных крысой за 5 минут семян подсолнечника; б - количество соскальзываний лапок крысы с планки в тесте «Суок»; в -общая оценка качества прохождения крысы по планке в тесте «Суок». Достоверность различий в опыте относительно: контроля * - р < 0.05; ЛЦ + №р70 по сравнению с действием ЛЦ # - р < 0.05.

Таким образом, увеличение содержания №р70 в кчЧС с помощью его интраназального введения ослабляет процесс нейродегенерации в нигростриатной системе до уровня доклинической стадии БП и способствует частичной активации механизмов, направленных на

компенсацию функциональной недостаточности ДА-ергических нейронов, а также препятствует проявлению симптомов моторной дисфункции в модели клинической стадии БП у крыс среднего возраста. Полученные факты демонстрируют, что поддержание физиологического уровня №р70 является необходимым условием для ослабления нейродегенерации и указывают на нейропротективный потенциал рекомбинантного стресс-

индуцируемого белка №р70.

3.4. Исследование нейропротективного потенциала индуктора шаперонов U133 в моделях доклинической и клинической стадий болезни Паркинсона у крыс среднего и пожилого

возраста

Болезнь Паркинсона - это системное нейродегенеративное заболевание, затрагивающее не только головной мозг, но и периферические отделы нервной системы [342]. Повышения содержания Hsp70 в нервной системе можно достичь с помощью фармакотерапии, нацеленной на индукцию синтеза Hsp70 и других шаперонов в организме. В связи с этим, следующей задачей исследования стала оценка терапевтического потенциала малой молекулы, индуктора индуцибельных форм шаперонов соединения U133, являющегося производным эхинохрома, основного пигмента морских ежей. U133 не обладает цитотоксическим действием и дозо-зависимо увеличивает содержание Hsp70 и его ко-шаперона Hsp40 в клетках линии U-937, а также повышает субстрат-связывающую активность Hsp70 [14, 324]. Протективный эффект U133 был продемонстрирован в опытах с клеточными линиями человека, подверженными окислительному стрессу [326], однако исследования нейропротективных свойств U133 в модели БП ранее никем не проводилось.

3.4.1 Исследование содержания стресс-индуцируемого белка Hsp70 в компактной части черной субстанции и стриатуме при системном введении U133 у крыс среднего возраста

На первом этапе работы необходимо было оценить Hsp70-индуцирующую способность U133 в значимых для БП отделах головного мозга при его системном (внутрибрюшинном) введении. При выборе эффективной концентрации U133 мы основывались на результатах, полученных ранее в НИЦ РАН, свидетельствующих, что в концентрациях 0.5 мкМ и 1 мкМ соединение U133 вызывает значимое увеличение содержания Hsp70 в различных клеточных линиях и не оказывает токсичного действия на клетки [343]. Руководствуясь этими данными, были выбраны дозы 0.5 мг/кг и 5 мг/кг, что соответствует концентрациям 0.5 мкМ и 1 мкМ, используемым in vitro. С помощью иммуноблоттинга установлено, что введение U133 крысам сопровождается дозо-зависимым возрастанием содержания Hsp70 в кчЧС и дорсальном стриатуме через 24 ч с момента введения препарата. При использовании максимальной дозы U133 (5 мг/кг) отмечалось возрастание уровня Hsp70 в 4 раза в кчЧС (р < 0.01), и в 3.1 раза - в стриатуме (р < 0.01) (рис. 24). Эта доза U133 была выбрана нами для дальнейшей работы.

Стриатум кчЧС

Рисунок 24. Изменение содержания №р70 в стриатуме и компактной части черной субстанции (кчЧС) у крыс среднего возраста через 24 ч после внутрибрюшинного введения контрольного раствора или Ш33 в дозе 0.5 или 5 мг/кг. Слева представлены репрезентативные иммуноблоты стриатума и кчЧС. Достоверность различий в опыте относительно: контроля * - р < 0.05, ** - р < 0.01.

3.4.2 Влияние соединения Ш33 на морфологические показатели нейродегенерации и компенсаторные процессы в нигростриатной системе у крыс среднего возраста в модели

клинической стадии болезни Паркинсона

Для исследования терапевтических эффектов Ш33 в модели клинической стадии БП у крыс среднего возраста были выполнены его внутрибрюшинные инъекции в дозе 5 мг/кг через 4 ч и 24 ч после каждого введения ЛЦ, а также через 7 дней после последней микроинъекции ЛЦ (рис. 25).

Рисунок 25. Схема эксперимента по изучению эффектов Ш33 при моделировании клинической стадии БП у крыс среднего возраста. ЛЦ - лактацистин.

Проведенный морфологический анализ показал, что введение Ш33 контрольной группе животных не привело к изменению количества ДА-ергических нейронов в кчЧС и содержания ТГ и ВТМА 2 (рис. 26, 27). Для модели клинической стадии БП у крыс характерно снижение на 62% (р < 0.01) количества выживших ДА-ергических нейронов в кчЧС и на 68% (р < 0.05) - их аксонов в дорсальном стриатуме. Терапия с использованием Ш33 приводила к возрастанию в 2.3 раза (р < 0.05) количества ДА-ергических нейронов в кчЧС по сравнению с модельными животными и восстанавливала до контрольного уровня (р < 0.05) количество ТГ-позитивных аксонов в дорсальном стриатуме (рис. 26), что свидетельствует о наличии у Ш33 нейропротективного потенциала в модели клинической стадии БП у крыс среднего возраста.

Рисунок 26. Изменение количества ДА-ергических нейронов в компактной части черной субстанции (а, в) и ДА-ергических аксонов в дорсальном стриатуме (б, г) у крыс среднего возраста в модели клинической стадии БП при терапии с Ш33. Световая микроскопия: (а) ТГ-иммунореактивные нейроны в кчЧС (масштаб 50 мкм); (б) ТГ-иммунореактивные аксоны в дорсальном стриатуме (масштаб 10 мкм). Достоверность различий в опыте относительно: контроля * - р < 0.05, ** - р < 0.01; ЛЦ + Ш33 по сравнению с действием ЛЦ # - р < 0.05.

Развитие процесса дегенерации в нигростриатной системе при моделировании БП сопровождалось снижением компенсаторных процессов в кчЧС: через две недели после последней микроинъекции ЛЦ происходило снижение оптической плотности иммунореактивного вещества ТГ на 15.8% (р < 0.05) и ВТМА 2 на 20% (р < 0.05) в телах ДА-ергических нейронов кчЧС по сравнению с контрольной группой животных (рис. 27). Введение и133 препятствовало снижению содержания ТГ и ВТМА 2 в нейронах кчЧС, что свидетельствует об усилении функциональной активности нигростриатной системы.

Характерной чертой модели клинической стадии БП явилось снижение содержания №р70 в нейронах кчЧС на 21.6% (р < 0.05) по сравнению с контролем. Использование Ш33 в качестве терапии препятствует снижению уровня №р70, что свидетельствует о восстановлении нейропротективного потенциала шаперонной системы в нейронах нигростриатной системы (рис. 27).

Таким образом, системное введение Ш33 в модели клинической стадии БП ослабляет процесс дегенерации в нигростриатной системе до уровня доклинической стадии и способствует усилению функциональной активности выживших ДА-ергических нейронов.

Рисунок 27. Изменение содержания тирозингидроксилазы (ТГ), везикулярного транспортера моноаминов 2 (ВТМА 2) и Ивр70 в нейронах кчЧС у крыс в модели клинической стадии БП при терапии с Ш33. Световая микроскопия (слева): ТГ-, ВТМА 2- и Ивр70-иммунореактивные нейроны в кчЧС (масштаб 10 мкм). Достоверность различий в опыте относительно: контроля * -р <0.05; ЛЦ + И133 по сравнению с действием ЛЦ # - р <0.05.

3.4.3 Влияние соединения Ш33 на показатели моторного поведения крыс среднего

возраста в модели клинической стадии БП

При анализе моторного поведения животных в модели клинической стадии БП обнаружены моторные феномены, сходные с описанными в разделе п. 3.3: снижение в 1.6 раза количества съеденных за 5 мин семян подсолнечника, возрастание в 7 раз (р < 0.05) числа соскальзываний лапок крысы с планки по сравнению с контролем, появление моторных нарушений при прохождении по планке (6.0 ± 0.9 против 0.7 ± 0.2 баллов в контроле; р < 0.05). Системное введение Ш33 препятствовало развитию у животных моторных нарушений, характерных для модели клинической стадии БП (рис. 28): отмечалось улучшение мелкой моторики рта, языка и передних конечностей, координации движений и походки.

Рисунок 28. Изменение моторного поведения крыс в модели клинической стадии БП при введении Ш33: а - количество съеденных крысой за 5 минут семян подсолнечника; б -количество соскальзываний лапок крысы с планки в тесте «Суок»; в - общая оценка качества прохождения крысы по планке в тесте «Суок». Достоверность различий в опыте относительно: контроля * - р < 0.05; ЛЦ + Ш33 по сравнению с действием ЛЦ # - р < 0.05.

В совокупности, полученные данные свидетельствуют о нейропротективных свойствах малой молекулы Ш33 и ее способности усиливать функцию выживших ДА-ергических нейронов в модели клинической стадии БП у крыс среднего возраста. Данные эффекты опосредованы поддержанием уровня №р70 в нигростриатной системе, индуцированным Ш33.

3.4.4 Исследование содержания стресс-индуцируемого белка Hsp70 в ольфакторной и нигростриатной системах при системном введении Ш33 у крыс пожилого возраста

БП - заболевание преимущественно пожилых людей. В стареющем мозге людей отмечается ряд функциональных и специфических молекулярно-структурных изменений: замедляется быстрота реакций на внешние стимулы, ослабевает память, изменяется сон, уменьшается активность УПС и системы транскрипции белков теплового шока [344, 345]. Возрастные изменения должны приниматься во внимание при переносе результатов исследований от модельных животных с БП на стареющего человека. Оставалось неясным, будет ли проявляться №р70-индуцирующий эффект соединения Ш33 в пожилом возрасте и будет ли применение препарата Ш33 терапевтически эффективным в стареющем мозге при БП-подобной патологии. Поэтому следующей задачей исследования было выявить особенности в №р70-индуцирующей активности хиноидного соединения Ш33 и оценить его нейропротективный потенциал в стареющем мозге у крыс в модели доклинической стадии БП, созданной ранее в лаборатории на основе интраназального введения ингибитора протеасом ЛЦ.

Для оценки №р70-индуцирующей активности соединения Ш33 у пожилых крыс была использована та же доза (5 мг/кг), что и у крыс среднего возраста. Выяснено, что после введения и133 пожилым крысам прирост №р70 в кчЧС и стриатуме составил 130% (р < 0.05) и 26% (р < 0.05) по сравнению с контролем (рис. 29). При этом, в отличие от крыс среднего возраста (см. разд. 4.1), повышение уровня Шр70 отмечалось только через 7 суток с момента инъекции Ш33; в 1 сутки изменений в содержании №р70 не обнаружено. Это может быть связано с возрастным снижением скорости экспрессии генов №р70 и, соответственно, синтеза белка №р70 в головном мозге. В обонятельных луковицах анализ иммуноблотов не выявил увеличения содержания №р70 у пожилых крыс через 1 и 7 суток с момента введения Ш33 (рис. 29), что может быть связано с возрастным снижением уровня и активности транскрипционного фактора HSF1.

Рисунок 29. Изменение содержания №р70 в обонятельной луковице (Обон. лук.) компактной части черной субстанции (кчЧС) и дорсальном стриатуме (дорз. стр.) у пожилых крыс через 1 и 7 дней после внутрибрюшинного введения контрольного раствора или Ш33 в дозе 5 мг/кг. Слева представлены репрезентативные иммуноблоты обонятельной луковицы, кчЧС и дорсального стриатума. Достоверность различий в опыте относительно: контроля * - р < 0.05.

3.4.5 Влияние Ш33 на морфологические показатели нейродегенерации и компенсаторные процессы в ольфакторной и нигростриатной системах в модели доклинической стадии БП

у крыс пожилого возраста

Установлено, что интраназальное введение ЛЦ вызывает у пожилых крыс уменьшение количества тел ТГ-позитивных нейронов на 30% (р < 0.05) в обонятельных луковицах и на 27% (р < 0.05) в кчЧС, по сравнению с контролем (рис. 31). Выявленные деструктивные изменения в кчЧС были сопряжены с дегенерацией аксонов в стриатуме: количество ДА-ергических терминалей аксонов уменьшилось на 18% (р < 0.05) по сравнению с контролем (рис. 31). Таким образом, через две недели после двукратного интраназального введения ЛЦ у пожилых крыс развивается нейродегенеративный процесс в головном мозге, характерный для доклинической стадии БП.

Для оценки потенциала Ш33 в предотвращении развития нейродегенерации в головном мозге, характерной для БП, пожилым крысам были выполнены его внутрибрюшинные инъекции в дозе 5 мг/кг через 24 ч после каждого интраназального введения ЛЦ, а также через 7 дней после последнего введения ЛЦ в модели доклинической стадии БП (рис. 30).

Рисунок 30. Схема эксперимента по изучению эффектов Ш33 при моделировании доклинической стадии БП у пожилых крыс. ЛЦ - лактацистин.

Системное введение Ш33 привело к ослаблению процесса нейродегенерации в ДА-ергической нигростриатной системе, на что указывало увеличение в 2.4 раза количества выживших ДА-ергических нейронов в кчЧС, при этом, количество ДА-ергических аксонов в дорсальном стриатуме возросло незначительно (рис. 31). В обонятельных луковицах нейропротективный эффект препарата не наблюдался, что может быть следствием отсутствия Нвр70-индуцирующего ответа в этой структуре при введении Ш33. Таким образом, несмотря на возрастное ослабление молекулярных механизмов мобилизации шаперона №р70 в головном мозге, фармакологическая активация синтеза №р70 с помощью Ш33 в модели доклинической стадии БП у пожилых крыс оказывает нейропротективный эффект в нигростриатной системе, которая наиболее подвергается деструктивным изменениям при БП.

Рисунок 31. Изменение количества ДА-ергических нейронов в обонятельной луковице, компактной части черной субстанции (а, б) и ДА-ергических аксонов в дорсальном стриатуме (а, в) у пожилых крыс в модели доклинической стадии БП (ЛЦ и/наз) при введении Ш33. Световая микроскопия (а): ТГ-иммунореактивные нейроны в обонятельной луковице (Обон. лук.; масштаб 20 мкм), компактной части черной субстанции (кчЧС; масштаб 50 мкм) и ТГ-иммунореактивные аксоны в дорсальном стриатуме (масштаб 10 мкм). Достоверность различий в опыте относительно: контроля * - р < 0.05; ЛЦ + Ш33 по сравнению с действием ЛЦ и/наз # - р < 0.05.

При оценке влияния Ш33 на функциональное состояние ДА-ергической нигростриатной системы установлено, что у пожилых крыс через две недели после последнего введения ЛЦ содержание ТГ в выживших нейронах кчЧС возрастает на 18% по сравнению с контролем, а в обонятельных луковицах, напротив, происходит снижение содержание ТГ на 22%. Проведение терапии с Ш33 не привело к изменению уровня ТГ в ДА-ергических нейронах кчЧС, однако препятствовало снижению содержания ТГ в нейронах обонятельных луковицы и даже восстановило уровень ТГ до контрольных значений, что свидетельствует о нормализации функциональной активности этих нейронов под действием Ш33.

Таким образом, показано, что, несмотря на возрастное ослабление молекулярных механизмов мобилизации Ивр70 в нигростриатной системе головного мозга, проведение терапии с Ш33 в модели доклинической стадии БП у пожилых крыс повышает содержание Ивр70 в кчЧС и стриатуме; в результате увеличения содержания Ивр70 уменьшается прогрессирование нейродегенерации в регионах головного мозга, значимых для БП. В обонятельных луковицах при введении индуктора шаперонов Ш33 возрастания уровня Ивр70 не происходит, что предполагает высокую уязвимость этого региона головного мозга к нейродегенеративной патологии.

3.5 Исследование влияния препарата Ш33 на а-синуклеиновую патологию и микроглиоз в головном мозге крыс при моделировании болезни Паркинсона

Данные полученные в предыдущем разделе свидетельствуют, что малая молекула, производное эхинохрома Ш33 обладает нейропротективным потенциалом при БП-подобной патологии, т.е. способна значительно замедлить гибель нейронов в кчЧС и продлить период доклинической стадии БП. Важным представлялось выяснить механизмы защитного действия И133. Одним из основных признаков БП является формирование в нервных клетках токсичных амилоид-подобных агрегатов белка а-синуклеина, вызывающих гибель нейронов в кчЧС, обонятельной луковице и других структурах головного мозга [340, 346]. В последние годы показано, что протофибриллы а-синуклеина могут распространяться между нейронами по прион-подобному механизму, «заражая» здоровые нервные клетки и индуцируя процесс хронического нейровоспаления [347]. Хроническое нейровоспаление в нигростриатной и экстранигральных структурах - патогенетический признак БП [348]; оно способствует развитию и поддержанию процесса нейродегенерации и проявляется возрастанием количества активированных микроглиоцитов. Известно, что белок теплового шока №р70 способен связываться с а-синуклеином и другими амилоидными белками в олигомерных состояниях, подавлять образование фибрилл и оказывать противовоспалительное действие [349]. Поэтому следующей задачей исследования стало изучение влияния индуктора №р70 малой молекулы и133 на развитие а-синуклеиновой патологии и нейровоспалительного процесса в нигростриатной и ольфакторной системах у крыс среднего и пожилого возраста в модели БП.

3.5.1 Исследование влияния Ш33 на а-синуклеиновую патологию в компактной части черной субстанции и обонятельных луковицах в модели болезни Паркинсона у крыс

С помощью антител против а-синуклеина и световой микроскопии установлено, что в контрольных условиях а-синуклеин распределен диффузно в цитоплазме нейронов кчЧС (рис. 32), что согласуется с исследованиями других авторов [350, 351]. При моделировании доклинической стадии БП у пожилых крыс через две недели после двукратного введения ЛЦ в телах нервных клеток кчЧС обнаруживаются тельца Леви. Они имеют характерную морфологию: плотное ацидофильное ядро с бледным ореолом вокруг него (рис. 32 а). Тельца Леви сходной морфологии наблюдаются у пациентов БП [228].

Для того чтобы выявить, способна ли Ивр70-индуцирующая терапия с помощью Ш33 в модели доклинической стадии БП у пожилых крыс повлиять на процесс формирования агрегатов белка а-синуклеина, были исследованы нейроны обонятельной луковицы и кчЧС. Морфологический анализ показал, что индукция синтеза №р70 с помощью соединения Ш33 привела к резкому сокращению количества агрегатов а-синуклеина в ДА-ергических нейронах кчЧС (рис. 32 в), при этом в обонятельных луковицах этого не наблюдалось (рис. 32 б).

Рисунок 32. Влияние терапии с индуктором белков теплового шока U133 на агрегирование а-синуклеина в дофаминергических нейронах обонятельной луковицы (б) и компактной части черной субстанции (в) при моделировании доклинической стадии болезни Паркинсона у пожилых крыс. (а) Локализация агрегатов а-синуклеина в нейронах кчЧС: световая и конфокальная микроскопия нейронов кчЧС после иммуногистохимического окрашивания антителами против а-синуклеина; стрелками показано тельце Леви; масштаб 5 мкм; (б, в) Двойное иммуномечение с применением антител против тирозингидроксилазы (ТГ, зеленый сигнал) и а-синуклеина (красный сигнал); масштаб 10 мкм. Стрелками показаны агрегаты а-синуклеина.

Для оценки количества агрегатов а-синуклеина в кчЧС в модели БП у крыс при терапии с U133 мы применили метод ловушки на фильтре (Filter Trap Assay). Данное исследование проведено совместно с нашими коллегами из лаб. защитных механизмов клетки (рук. д.б.н. Гужова И.В.) на базе ИНЦ РАН. Установлено, что введение ЛЦ крысам характеризовалось формированием в кчЧС нерастворимых агрегатов а-синуклеина, которые идентифицировались через 1 и 21 день после первой инъекции ЛЦ (рис. 33), что согласуется с данными, полученными с помощью конфокальной микроскопии. Терапия с использованием U133 привела к регрессии агрегированной нерастворимой формы а-синуклеина в кчЧС у модельных животных, однако для проявления терапевтического эффекта требовалось пролонгированное применение U133: защитный эффект U133 не детектировался через сутки после первой микроинъекции ЛЦ (рис. 33).

□ Контроль 13 ЛЦ ■ Л Ц + и 13 3

Компактная часть черной субстанции 120 т

День 1 День 21

Рисунок 33. Изменение количества агрегатов белка а-синуклеина в компактной части черной субстанции у крыс в модели болезни Паркинсона при проведении терапии с U133. Слева представлены репрезентативные дот-блоты компактной части черной субстанции. Достоверность различий в опыте относительно: контроля * - p < 0.05; ЛЦ + U133 по сравнению с действием ЛЦ # - p < 0.05.

Таким образом, фармакологическая активация синтеза Hsp70 с помощью U133 способствует уменьшению количества агрегатов белка а-синуклеина в кчЧС в модели доклинической стадии БП у крыс.

3.5.2 Исследование влияния U133 на содержание фосфорилированного а-синуклеина (Ser129) в компактной части черной субстанции в модели болезни Паркинсона у крыс

Одной из основных патологических модификаций а-синуклеина является его фосфорилирование по Ser129, которое может влиять на растворимость этого белка и способствовать его патогенной агрегации [6, 185]. Поэтому важным представлялось исследовать влияние U133 на содержание фосфорилированного а-синуклеина (Ser129) в кчЧС крыс при моделировании БП.

Показано, что через две недели после введения ЛЦ содержание общей формы а-синуклеина у модельных крыс возросло в 1.4 раза (p < 0.01), а фракция фосфорилированного а-синуклеина (Ser129) увеличилась в 2.9 раза (p < 0.01) по сравнению с контролем (рис. 34). На конфокальных микрофотографиях фосфорилированный а-синуклеин (Ser129) обнаруживался в виде агрегатов в цитоплазме ТГ-иммунопозитивных нейронов кчЧС, что свидетельствует о переходе а-синуклеина в патологическую форму в модели БП у крыс (рис. 35). При терапии с U133 количество общего растворимого а-синуклеина в кчЧС имело явную тенденцию к возрастанию. Фосфорилированная форма а-синуклеина (Ser129) снижалась до контрольных значений (рис. 34). На конфокальных микрофотографиях видно, что в кчЧС а-синуклеин (Ser129) оказался гомогенно распределен в телах ДА-ергических нейронов у модельных крыс, получавших U133 (рис. 35).

Полученные результаты свидетельствуют о способности НБр70-индуцирующей терапии с помощью и133 уменьшать накопление в нейронах кчЧС фосфолированной формы а-синуклеина.

вАРОН

\j.\J\J -1—

а-чуп а-5уп (8ег-129)

Рисунок 34. Содержание общего и а-синуклеина (а-Буи) и его фосфорилированной по Ser129 фракции (а-Буи (Бег129)) в компактной части черной субстанции у крыс среднего возраста в модели клинической стадии болезни Паркинсона при терапии Ш33. Слева представлены репрезентативные иммуноблоты компактной части черной субстанции. Достоверность различий в опыте относительно: контроля * - р < 0.05, ** - р < 0.01; ЛЦ + Ш33 по сравнению с действием ЛЦ # - р < 0.05.

Рисунок 35. Влияние терапии с индуктором белков теплового шока Ш33 на содержание фосфорилированного а-синуклеина (Бег129) в дофаминергических нейронах компактной части черной субстанции (кчЧС) в модели болезни Паркинсона у крыс. Двойное иммуномечение с применением антител против тирозингидроксилазы (ТГ, зеленый сигнал) и пострансляционно модифицированной формы а-синуклеина, фосфорилированного по Ser129 (а-Буи (Бег129), красный сигнал); масштаб 10 мкм. Стрелками показаны агрегаты а-Буи (Бег129).

3.5.3 Влияние Ш33 на микроглиоз в модели болезни Паркинсона у крыс

Хроническое нейровоспаление - патологический признак БП. Его развитие способствует поддержанию процесса нейродегенерации и проявляется возрастанием количества клеток активированной микроглии [352]. Для того чтобы проверить наличие активированной микроглии в головном мозге мы применили антитела против ^-1, который является маркером активированной микроглии.

Выяснено, что после введения ЛЦ у пожилых крыс прирост количества микроглиоцитов в обонятельной луковице составил 30% ф < 0.05), а в кчЧС - 47% ф < 0.01) по сравнению с возрастным контролем, что указывает на развитие нейровоспаления в исследованых структурах мозга при моделировании доклинической стадии БП у пожилых крыс (рис. 36). Терапия с Ш33 уменьшила в 2.4 раза реактивный микроглиоз в кчЧС, что свидетельствует о противовоспалительном действии Ш33. Однако в обонятельных луковицах противовоспалительный эффект Ш33 не проявился (рис. 36).

Таким образом, системное введение Ш33 в модели доклинической стадии БП у пожилых крыс оказывает противовоспалительный эффект в кчЧС, но не корректирует воспалительную реакцию в обонятельных луковицах.

□ Контроль ИЛЦ НЛЦ+ 11133 Контроль ЛЦ ЛЦ + Г133 45 -| *

■2

о

С

5"

г а

Обон. лук. кчЧС

Рисунок 36. Изменение количества микроглиоцитов в обонятельной луковице (Обон. лук.) и компактной части черной субстанции (кчЧС) у пожилых крыс в модели доклинической стадии БП при введении Ш33. Световая микроскопия (слева): ТГ-иммунореактивные нейроны в обонятельной луковице и кчЧС (масштаб 20 мкм). Достоверность различий в опыте относительно: контроля * - p < 0.05; ЛЦ + Ш33 по сравнению с действием ЛЦ # - p < 0.05.

Данные, представленные в этом разделе, демонстрируют, что нейропротективный эффект соединения Ш33 реализуется через повышение уровня шаперона Hsp70, который уменьшает цитотоксичность аберрантных форм а-синуклеина и ослабляет процесс нейровоспаления в кчЧС в модели БП у крыс.

ГЛАВА IV ОБСУЖДЕНИЕ

Наше исследование выполнено на ранее разработанных в лаборатории валидных моделях БП у животных, созданных на основе угнетения активности протеасом в головном мозге. Причиной выбора этих моделей послужили данные литературы, свидетельствующие о ключевой роли УПС в патогенезе наследственной и спорадической форм БП. УПС препятствует неправильной укладке белков, обеспечивая сохранение здоровой популяции клеток за счет деградации аномальных белков (в первую очередь, мутантных, поврежденных и состарившихся) в цитоплазме, ядре и эндоплазматической сети [52, 353-355]. Ослабление работы УПС приводит к накоплению в нейронах аномальных белков, способных к агрегированию, в том числе токсичных олигомеров белка а-синуклеина, вызывающих гибель нейронов. У пациентов с БП в черной субстанции выявлено снижение уровня химотрипсин-, трипсин- и каспаза-подобных активностей протеасом (в среднем на 50%), а-субъединиц протеасом (на 40%), ответственных за их сборку и функционирование, экспрессии протеасомных активаторов РА700 и РА28 (до 33%), а также усиленное агрегирование а-синуклеина в клеточных включениях типа телец Леви и накопление в них убиквитина и паркина [11, 159, 356]. Использованный в работе специфический ингибитор ферментативной активности протеасом ЛЦ широко распространен в окружающей среде, так как синтезируется почвенными бактериями Б^ерЮтусез lactacystinaeus. ЛЦ может попадать в организм с водой, пищей и пылью, накапливаться в тканях внутренних органов, в т.ч. в головном мозге человека, и вызывать гибель нервных клеток в значимых для БП структурах головного мозга, в том числе ДА-ергических нейронов в кчЧС [14, 259, 357].

Для решения поставленных задач, на первом этапе работы мы использовали модель доклинической стадии БП, для воспроизведения которой крысам среднего возраста были выполнены микроинъекции ЛЦ (0.4 мкг/мкл и 4.0 мкг/мкл) в кчЧС. Такой способ введения ЛЦ был выбран нами как более точная методика, обеспечивающая повреждение нейронов только в этой значимой для БП области головного мозга без влияния на соседние структуры [12, 15, 358]. Исследование признаков нейродегенерации, показателей компенсаторных резервов ДА и моторного поведения выполнено в данной работе через две недели после второй микроинъекции ЛЦ.

Для того, чтобы выяснить роль стресс-индуцируемого белка теплового шока Шр70 в молекулярных механизмах нейропротекции и защиты функций мозга от нейротоксических факторов при БП на первом этапе работы важным представлялось изучить изменения патоморфологических признаков нейродегенерации и компенсаторных процессов в ДА-ергической нигростриатной системе в модели доклинической стадии БП у крыс в условиях снижения содержания №р70 в нейронах кчЧС. Для снижения содержания Шр70 мы применили

два методических подхода: 1) снижение содержания НБр70 с помощью лентивирусной конструкции, несущей ген шпилечной РНК к индуцибельному №р70 (shRNA-Hsp70); 2) использование в экспериментах крыс пожилого возраста (20 мес.), для которых характерно естественное возрастное снижение синтеза и содержания в нервных клетках стресс-индуцируемого №р70 [132, 160, 344].

Проведенный морфологический анализ признаков нейродегенерации в нигростриатной системе при введении ЛЦ крысам среднего возраста показал потерю около трети ДА-ергических нейронов в кчЧС и их аксонов в дорсальном стриатуме. Такой уровень нейродегенерации характерен для доклинической стадии БП по сравнению с 50-60% уровнем гибели нейронов в кчЧС в клинической стадии БП. Кроме того, нами обнаружено снижение содержания ВТМА 2, загружающего ДА в синаптические везикулы, в выживших нейронах кчЧС, что может являться начальным признаком ослабления компенсаторных процессов, направленных на поддержание синаптической ДА-ергической трансмиссии. Однако изменений в моторном поведении у животных в этой модели БП не отмечалось, что может быть следствием активации компенсаторных механизмов, например, снижения скорости обратного захвата ДА из синаптической щели. Активация этого процесса в дорсальном стриатуме в модели доклинической стадии БП у крыс может способствовать поддержанию уровня ДА во внеклеточной среде на уровне нормы и маскированию характерной для БП моторной симптоматики [36, 48].

На первом этапе работы необходимо было выяснить, происходит ли при нокдауне НБр70 изменение патоморфологических и нейрохимических признаков, характерных для модели доклинической стадии БП. Это позволит определить, является ли Шр70 ключевой молекулой, ответственной за поддержание устойчивости нейронов кчЧС к действию ЛЦ при развитии БП. Для решения поставленной задачи сотрудниками лаборатории защитных механизмов клетки ИНЦ РАН была собрана и апробирована на клеточных линиях лентивирусная конструкция, несущая ген шпилечной РНК к индуцибельному Шр70 (shRNA-Hsp70). Проведенное нами исследование показало, что через 14 дней после микроинъекции БИКМА-№р70 в кчЧС крысам среднего возраста содержание №р70 оказалось снижено на 64.8 % (р < 0.05) в кчЧС по сравнению с контролем. Этот срок был выбран нами для дальнейшего исследования роли №р70 в патогенезе нейродегенерации в нигростриатной системе в модели доклинической стадии БП у крыс среднего возраста. Установлено, что введение shRNA-Hsp70 животным в модели доклинической стадии БП увеличивало более чем в 2 раза потерю ДА-ергических нейронов в кчЧС и их терминалей в стриатуме по сравнению с контролем. Развитие обширной дегенерации нигростриатной системы сопровождалось угасанием компенсаторных и нейропротективных процессов в кчЧС (судя по низким уровням ТГ, ВТМА2 и шаперона №р70) и возникновением ряда моторных феноменов,

характерных для клинической стадии БП: нарушением тонкой моторики и появлением постуральной неустойчивости. В совокупности, такие изменения характерны для клинической (моторной) стадии БП. Таким образом, мы экспериментально доказали, что снижение содержания Hsp70 является одной из причин быстрой прогрессии нейродегенерации и истощения компенсаторных процессов в нигростриатной системе при моделировании БП у животных среднего возраста. Следовательно, шаперон Hsp70 является ключевой молекулой, сдерживающей развитие Паркинсон-подобной патологии.

Сходные результаты были получены на модели а-синуклеиновой патологии у Drosophila ¿р. [22]. Авторам удалось показать, что потеря функции Hsp70 вследствие наличия мутаций в АТФ-связывающем домене шаперона, приводит к прогрессированию патологического фенотипа. В другом исследовании нокдаун шаперона GRP78 (резидентный гомолог Hsp70) приводил к усилению а-синуклеиновой нейротоксичности в ДА-ергических нейронах кчЧС у крыс [359]. Основной причиной возрастания гибели ДА-ергических нейронов в кчЧС в условиях дефицита Hsp70 в модели доклинической стадии БП у крыс среднего возраста может быть ослабление конформационного контроля а-синуклеина со стороны системы №р70. Снижение экспрессии №р70 может привести к резкому усилению присущей а-синуклеину способности к агрегированию и к ускоренному формированию токсичных форм олигомеров этого белка, вызывающих дегенерацию клеток [18]. В генетической модели а-синуклеиновой патологии на мушке рода Drosophila ¿р. установлено, что Шр70 способен ингибировать образование фибрилл а-синуклеина за счет избирательного связывания с префибриллами, что приводит к ослаблению токсических свойств агрегатов а-синуклеина [22]. Кроме этого, немаловажным фактором, увеличивающим скорость развития дегенерации в нигростриатной системе, может быть усиление апоптоза вследствие низкого уровня №р70. Шаперон Шр70 продлевает жизнь не только белков, но и клетки, исполняя роль потенциального антиапоптозного фактора [32, 360].

Следующей моделью, которая могла бы дополнительно подтвердить важную роль шаперона Шр70 в механизмах нейропротекции, является старение. У людей и животных старение ассоциировано со снижением синтеза и содержания в нервных клетках индуцибельного №р70 и других шаперонов [132, 160, 344, 361]. Поэтому мы поставили перед собой цель выяснить, сопряжены ли возрастные изменения в нейродегенеративных и компенсаторных процессах в ДА-ергической нигростриатной системе с содержанием №р70 в нейронах кчЧС при моделировании доклинической стадии БП у крыс.

Для решения этой задачи в модели доклинической стадии БП у крыс молодого (6 нед.), среднего (6 мес.) и пожилого (20 мес.) возрастов сопоставлены 1) нейропротективные резервы №р70 в кчЧС, 2) показатели нейродегенерации и компенсаторных процессов в нигростриатной системе, 3) показатели моторного поведения.

Проведенное исследование показало, что в контрольных условиях у пожилых крыс, по сравнению с животными молодого и среднего возраста, наблюдались небольшие отклонения в моторном поведении, которые проявлялись преимущественно более быстрым развитием сенсомоторного дефицита конечностей. Морфологический анализ показателей нейродегенерации нигростриатной системы показал достоверное уменьшение числа ДА-ергических нейронов в кчЧС и их аксонов в дорсальном стриатуме у пожилых крыс по сравнению с животными молодого и среднего возраста, что свидетельствует о том, что по мере старения животных ДА-ергические нейроны кчЧС подвергаются нейродегенерации. При оценке косвенных показателей, отражающих функциональное состояние ДА-ергической системы, выявлено увеличение уровней ТГ и ВТМА 2 в нейронах кчЧС. Можно полагать, что наблюдаемые первые признаки моторного нарушения у пожилых крыс развиваются вследствие недостаточной активности компенсаторных процессов, направленных на поддержание уровня ДА. Увеличение содержания ТГ и ВТМА 2 в нейронах кчЧС может отражать как увеличение их синтеза, так и нарушение аксонального транспорта ТГ и ВТМА 2 и, возможно, ДА. Нарушение аксонального транспорта белков может привести к развитию дефицита ДА в стриатуме, участвующем в поддержании двигательной функции.

Полученные результаты согласуются с данными литературы. В ряде работ показано, что с возрастом уменьшается количество ДА-ергических нейронов в кчЧС у обезьян на 23-50% [362, 363] и у людей на 32-47% [213, 214]. После 40 лет у людей каждые последующие 10 лет погибает 5% клеток в кчЧС, и в возрасте 87 лет гибель ДА-ергических нейронов в кчЧС составляет 36,2% у пожилых людей по сравнению с молодыми (20 лет) [212]. Кроме того, ряд исследований показал у людей снижение с возрастом уровня ДА и скорость-лимитирующего фермента его синтеза ТГ в стриатуме, а также количества рецепторов ДА [212, 364]. У пожилых людей также отмечаются умеренно выраженные изменения в моторной функции, связанные с потерей ДА-ергических нейронов в кчЧС и низким уровнем ВТМА 2 в стриатуме [212, 365].

Проведенный нами анализ содержания №р70 в нейронах кчЧС у животных разных возрастных групп показал, что у пожилых крыс, по сравнению с животными молодого и среднего возраста, уровень №р70 ниже на 14% в нейронах кчЧС. Сходные результаты показаны у других грызунов, приматов и людей преклонного возраста [344, 366, 367]. Снижение конформационного контроля со стороны главного шаперона №р70 может способствовать накоплению в нейронах аномальных токсичных белков и повышению уязвимости клеток к нейротоксическим факторам, что может быть одной из причин гибели ДА-ергических нейронов при старении.

При моделировании доклинической стадии БП у крыс разных возрастных групп выяснено, что введение ЛЦ в кчЧС вызывает в 2.7 раза меньший прирост уровня №р70 в нейронах кчЧС у пожилых крыс в сравнении с животными молодого и среднего возраста, что сопровождается

уменьшением в 2.5 раза числа выживших ДА-ергических нейронов в кчЧС и в 2.3 раза их аксонов в дорсальном стриатуме. Это указывает на ослабление резистентности нигростриатной системы к токсическому действию ЛЦ при старении. Кроме того, в отличие от крыс молодого и среднего возраста, у которых в кчЧС наблюдалось компенсаторное возрастание ТГ и ВТМА 2 на начальных стадиях нейродегенерации, у пожилых крыс уровни ТГ и ВТМА 2 оказались ниже контрольных значений, что может указывать на снижение синтеза ДА у пожилых крыс при моделировании доклинической стадии БП, из-за чего развивается дефицит ДА в нигростриатной системе, на фоне которого у пожилых крыс проявляются нарушения в мелкой моторике передних конечностей, рта и языка в ответ на действие ЛЦ, чего не наблюдалось у модельных животных молодого и среднего возраста. Усиление нейродегенерации при старении в лактацистиновой модели БП показано и в недавнем исследовании, выполненном на молодых (2 мес.) и взрослых (12-14 мес.) мышах [368]. В данной работе также продемонстрировано более выраженное снижение содержания ТГ в ответ на действие ЛЦ у взрослых мышей по сравнению с молодыми, что согласуется с нашими результатами.

Мы полагаем, что одной из причин прогрессии нейродегенерации при БП в пожилом возрасте может являться усиление процесса агрегации белка а-синуклеина. Действительно, методами двойного иммуномечения и конфокальной микроскопии нами установлено, что при старении у крыс в модели БП ускоряется патологическое агрегирование а-синуклеина, о чем свидетельствует наличие многочисленных телец Леви, содержащих более крупные агрегаты белка а-синуклеина, по сравнению агрегатами у крыс среднего возраста. Наши данные согласуются с данными литературы, где показано, что у пациентов БП postmortem в нейронах кчЧС также обнаруживаются агрегаты а-синуклеина, локализованные как в цитоплазме, так и в ядре, причем у больных людей агрегаты а-синуклеина гораздо крупнее, чем в образцах ткани людей такого же возраста, не страдающих БП [344].

Усиление агрегирования а-синуклеина может происходить вследствие недостаточного контроля со стороны системы шаперонов, в том числе Hsp70 [226, 354]. Действительно, при старении ослабевают механизмы синтеза Hsp70 и, следовательно, механизмы защиты нейронов, что может являться одной из причин более прогрессивной дегенерации нигростриатной системы у пожилых крыс при введении ЛЦ. Отсутствие или низкий уровень экспрессии Hsp70 под действием стресса или теплового шока показан на клеточных культурах фибробластов, выделенных из старых крыс (24 мес.) по сравнению с молодыми (5 мес.), а также в головном мозге пожилых крыс [369, 370]. Причиной снижения синтеза индуцибельного Hsp70 и других шаперонов может быть понижение с возрастом активности фактора теплового шока HSF1, который запускает транскрипцию генов HSPs, в частности Hsp70, в ответ на повреждение белков клетки при действии цитотоксических факторов [160, 281].

В совокупности результаты двух этапов работы указывают на то, что шаперон №р70 является ключевой молекулой, сдерживающей развитие нейродегенеративной патологии в кчЧС, характерной для БП. Снижение экспрессии №р70 в ДА-ергических нейронах кчЧС в модели доклинической стадии БП у крыс с помощью РНК-интерференции или при старении является одной из причин быстрой прогрессии нейродегенерации и патофизиологических признаков, характерных для модели БП у животных. Следовательно, для выживания ДА-ергических нейронов при развитии Паркинсон-подобной патологии требуется увеличение внутриклеточного содержания №р70.

На следующем этапе работы перед нами стояла задача доказать нейропротективную значимость повышения уровня НБр70 в ДА-ергических нейронах кчЧС. Для решения поставленной задачи нами были использованы разработанные в лаборатории модели: 1) модель ингибирования функции протеасом в нигростриатной системе, имитирующая клиническую стадию БП у крыс и созданная на основе двукратных локальных микроинъекций высоких доз ЛЦ (4 мкг/мкл) в кчЧС крысам среднего возраста [12] и 2) модель ингибирования функции протеасом в головном мозге, имитирующая доклиническую стадию БП, созданная на основе двукратного интраназального введения ЛЦ (200 мкг/8 мкл) крысам пожилого возраста.

Для повышения уровня НБр70 в головном мозге, в том числе в кчЧС, мы применили: 1) интраназальное введение рекомбинантного НБр70 человека крысам среднего возраста в модели клинической стадии БП; 2) внутрибрюшинные инъекции низкомолекулярного хиноидного соединения, индуктора белков теплового шока Ш33 в моделях клинической и доклинической стадий болезни Паркинсона у крыс среднего и пожилого возраста.

Проведенный нами анализ признаков нейродегенерации нигростриатной системы и показателей функционального состояния ДА-ергической системы, выполненный через две недели после двукратных локальных микроинъекций ЛЦ, показал снижение более чем на 60% количества выживших ДА-ергических нейронов в кчЧС и на 65% - их аксонов в дорсальном стриатуме, а также снижение уровня ТГ и ВТМА 2 в нейронах кчЧС, что характерно для клинической стадии БП. Такой высокий уровень дегенерации нейронов и аксонов, происходящий на фоне снижения основного фермента синтеза ДА и ВТМА 2, может свидетельствовать о наличии дефицита ДА и недостаточности ДА-трансмиссии в дорсальном стриатуме. На это указывают также и моторные феномены, обнаруженные у крыс в модели БП по сравнению с контролем: развитие сенсомоторного дефицита конечностей, нарушение координации движений и мелкой моторики передних конечностей, рта и языка. Подобные моторные симптомы характерны для клинической стадии БП.

На сегодняшний день известно, что при внутривенном введении НБр70 быстро подвергается протеолизу в гепатоцитах, а после подкожного введения - накапливается в

лимфатических узлах вблизи места инъекции [303, 304], поэтому неинвазивный интраназальный способ доставки Hsp70 в головной мозг является приоритетным. Так, показано, что через 3 ч после интраназального введения меченый флуоресцентным маркером Hsp70 обнаруживается в цитоплазме обонятельных луковиц, неокортекса, гиппокампа и мозжечка мышей как в контрольных условиях, так и при моделировании болезни Альцгеймера у мышей [304, 305, 371]. Однако оставалось неясным, способен ли Hsp70, введенный интраназально, проникать в значимые для БП структуры головного мозга. В ходе нашего исследования с помощью конфокальной микроскопии установлено, что меченый флуоресцентным красителем Hsp70 обнаруживается в обонятельных луковицах, дорсальном стриатуме и ДА-ергических нейронах черной субстанции крыс уже через 4 ч после интраназального введения. Следовательно, данная методология введения Hsp70 при БП может быть оправдана.

При интраназальном введении основным механизмом перемещения белковых молекул по обонятельному нерву (n. olfactorius) к мозгу является внеклеточный транспорт, в основе которого лежит быстрое продвижение молекул между клетками назального эпителия. Введенные соединения обнаруживаются в обонятельных луковицах и других областях головного мозга менее чем через 30 мин после их интраназального применения [372]. Вероятно, такой тип транспорта главным образом осуществляется по периневральным каналам, образованным шванноподобными клетками [373]. Иным путем доставки веществ в мозг при интраназальном введении может быть транспорт по тройничному нерву (n. trigeminus), иннервирующему респираторный и обонятельный эпителии носовой полости. Особенностью этого нерва является то, что он имеет входы как в обонятельные луковицы, так и в область варолиева моста, что может обеспечивать быструю доставку вводимых веществ в стволовую часть головного мозга [374].

Нами установлено, что, достигнув среднего мозга, Hsp70 интернализуется ДА-ергическими нейронами кчЧС. Согласно данным литературы, Hsp70 может проникать в клетку различными способами. Так, установлено, что Hsp70 способен связываться с кислыми липидами плазматической мембраны посредством своего АТФ-связывающего домена, таким образом проникая сквозь мембрану [375]. Другими исследователями показано, что Hsp70 способен взаимодействовать с искусственными мембранами и формировать белок-проницаемые поры [376]. Также были открыты рецепторы (Lox-1, CD40, SREC1), которые связывают Hsp70 и способствуют его внутриклеточной интернализации [289]. Одной из конкретных аминокислотных последовательностей на поверхности Hsp70, ответственных за интернализацию этого белка нейронами, может быть положительно заряженный KST-домен, способный к активному взаимодействию с отрицательно-заряженными участками мембраны и переносу внутрь клетки белков, в 30 раз превышающих его собственный размер [377].

Наши исследования показали, что проведение терапии с Hsp70 в модели клинической стадии БП у крыс среднего возраста приводит к увеличению в 2 раза количества выживших ДА-ергических нейронов в кчЧС и их терминалей в стриатуме по сравнению с группой модельных животных, получавших растворитель Hsp70. При этом, в выживших нейронах кчЧС шаперон Hsp70 восстанавливает до контрольных значений уровень ТГ, что указывает на повышение их функциональной активности. Эти изменения сопряжены с нормализацией моторного поведения. Полученные факты указывают на нейропротективную значимость повышения уровня Hsp70 в ДА-ергических нейронах кчЧС. Проведение терапии с помощью интраназального введения Hsp70 останавливает процесс развития нейродегенерации на доклинической стадии БП и препятствует его переходу в тяжелую, клиническую форму. В совокупности представленные результаты выдвигают на первый план возможность использования Hsp70 для задержки развития процесса дегенерации ДА-ергических нейронов в кчЧС, сохранения компенсаторных резервов ДА в нигростриатной системе и возможности их активации при БП.

Сходные данные о нейропротективных эффектах Hsp70 были получены и другими авторами. Показано, что системное введение Hsp70, конъюгированного с Tat-пептидом, обладающим способностью проникать в клетки, предотвращает гибель ДА-ергических нейронов в кчЧС и увеличивает содержание ДА и его метаболитов в стриатуме в моделях МФТП-индуцированной токсичности in vitro и in vivo [302]. В недавней работе, где, для большей биодоступности и более пролонгированного эффекта, доставка Tat-конъюгированного Hsp70 в ткани осуществлялась в гидрогеле, подтверждены нейропротективные свойства Hsp70 в 6-OHDA модели БП у мышей [378]. При этом, авторы отмечали восстановление моторного поведения животных, в том числе, улучшение походки в тесте «сужающаяся дорожка».

Другим способом повышения уровня Hsp70 в значимых для БП структурах головного мозга может быть использование фармакологического подхода, направленного на мобилизацию шаперонов в головном мозге. Основным активатором транскрипции стресс-индуцируемых генов HSPs является транскрипционный фактор теплового шока HSF1 [306]. Старение организма и развитие нейродегенеративных заболеваний сопровождаются пониженным уровнем экспрессии и активности HSF1, а значит и сниженной способностью нейронов противостоять токсическим повреждениям и нейродегенерации [160]. Следовательно, для мобилизации защитных механизмов требуется активация HSF1. Поэтому поиск безопасных малых молекул-индукторов HSF1 является приоритетной задачей современной биомедицины. В связи с этим нами были проанализированы нейропротективные свойства нового индуктора HSF1 - нетоксичного низкомолекулярного хиноидного соединения U133. Это соединение получено из библиотеки низкомолекулярных веществ Тихоокеанского института биоорганической химии ДВО РАН. U133 является производным эхинохрома, основного пигмента дальневосточных морских ежей.

Показано, что Ш33 не обладает цитотоксическим действием и дозо-зависимо увеличивает содержание №р70 и его ко-шаперона Hsp40 в клетках линии ^937, а также повышает субстрат-связывающую активность Hsp70 [14, 324]. Цитопротективный эффект Ш33 был продемонстрирован в опытах с клеточными линиями человека, подверженными окислительному стрессу [326].

Наше исследование продемонстрировало, что через 24 ч после однократной внутрибрюшинной инъекции Ш33 в дозах 0.5 мг/кг и 5.0 мг/кг отмечается дозо-зависимое повышение содержания Hsp70 в дорсальном стриатуме и кчЧС крыс. Для исследования терапевтического потенциала Ш33 мы использовали модель клинической стадии БП у крыс среднего возраста, которая характеризуется обширной нейродегенерацией нигростриатной системы, ослаблением механизмов синтеза и транспорта ДА и появлением моторных феноменов. Показано, что проведение терапии с Ш33 в данной модели приводит к двукратному увеличению количества выживших ДА-ергических нейронов в кчЧС и восстановлению до контрольных значений количества аксонов в стриатуме. Для того чтобы оценить функциональное состояние выживших нейронов в кчЧС проанализировано содержание ТГ и ВТМА2. Определено, что Ш33 предотвращает падение уровней ТГ и ВТМА2, характерное для клинической стадии БП. При проведении поведенческих тестов установлено, что терапия с Ш33 препятствует появлению моторных нарушений у крыс, получавших микроинъекции ЛЦ. Таким образом, повышение содержания индуцибельного №р70 в кчЧС с помощью Ш33 в модели клинической стадии БП препятствует прогрессированию нейродегенерации, повышает функциональное состояние выживших нейронов и предотвращает развитие моторного дефицита у крыс среднего возраста.

При старении у человека и животных снижается активность механизмов экспрессии и синтеза Hsp70 и других шаперонов, обладающих нейропротективными свойствами [18, 160, 225, 226], поэтому важным было исследовать, способен ли Ш33 увеличить экспрессию Hsp70 в головном мозге у пожилых крыс в модели БП. Также необходимо было оценить эффективность терапии с препаратом Ш33 при моделировании БП у пожилых животных.

Нами продемонстрировано, что, в отличие от животных среднего возраста, у пожилых крыс возрастание содержания Hsp70 в кчЧС и дорсальном стриатуме происходит с временной задержкой; повышение уровня Hsp70 в этих структурах отмечалось лишь на 7 день после однократного введения Ш33. Это может быть связано с возрастным снижением скорости экспрессии генов И8Р70 и, соответственно, синтеза белка №р70 в головном мозге. №р70-индуцирующий эффект Ш33 был изучен также в обонятельных луковицах, где было показано отсутствие увеличения содержания №р70 через 1 и 7 суток с момента введения Ш33, что может быть связано с возрастным снижением уровня и активности транскрипционного фактора HSF1 [160]. Например, показано, что в старых Т-лимфоцитах человека по сравнению с молодыми

уровень транскрипционного белка HSF1 значительно ниже, и при действии теплового шока скорость транскрипции генов И8Р70 уменьшается на 66% в старых лимфоцитах в сравнении с молодыми [379].

БП - это заболевание всего мозга, при котором нейродегенеративный процесс охватывает не только ДА-ергическую нигростриатную систему, но и другие структуры, среди которых ДА-ергическая ольфакторная и мезокортиколимбическая системы, норадренергическая система голубого пятна, дорсальное двигательное ядро блуждающего нерва, ядро шва и т.д. [66]. Поэтому важным представлялось оценить терапевтическую значимость соединения Ш33 при системном развитии патологического процесса и на его ранней стадии. Для этого на следующем этапе исследований мы применили модель протеасомной дисфункции головного мозга, имитирующую доклиническую стадию БП у пожилых крыс. Эта модель была ранее разработана в лаборатории с помощью интраназального введения ингибитора протеасом ЛЦ [13, 266]. Модель протеасомной дисфункции головного мозга имитировала а) допороговый по сравнению с уровнем клинической стадии (60-70%) уровень гибели нейронов в кчЧС (27%) и их аксонов в стриатуме (18%); б) гибель нейронов в экстранигральных структурах: ДА-ергических нейронов в обонятельных луковицах (30%), ВТА (28%), НА-ергических нейронов голубого пятна (17%); в) возрастание содержания ТГ на 18% в кчЧС; г) отсутствие моторной дисфункции.

Терапия с Ш33 привела к увеличению в 2.4 раза количества выживших нейронов кчЧС и нормализации в них уровня ТГ. Однако Ш33 не оказал заметного влияния на процесс нейродегенерации в ольфакторной системе, что может быть связано с отсутствующим или слабым №р70-индуцирующим ответом в этих структурах при введении Ш33. Таким образом, несмотря на возрастное ослабление молекулярных механизмов мобилизации шаперона №р70 в головном мозге, фармакологическая активация синтеза №р70 с помощью Ш33 замедляет развитие нейродегенерации в нигростриатной системе головного мозга, тем самым продлевая период доклинической стадии. В обонятельных луковицах при введении индуктора шаперонов Ш33 возрастания уровня Hsp70 не происходит, что предполагает высокую уязвимость этого региона головного мозга к нейродегенеративной патологии.

Экспериментально доказано, что в основе защитного действия соединения Ш33 лежит повышение экспрессии именно Hsp70. Показано, что снижение экспрессии Hsp70 в клетках глиомы человека с помощью лентивирусной конструкции shRNA-Hsp70 препятствует индукции синтеза Hsp70 в ответ на инкубацию с Ш33, не влияя на индукцию Hsp40, в результате чего нейропротективный эффект Ш33 при введении ЛЦ подавляется [14]. С другой стороны, нейропротективные эффекты Ш33 в модели клинической стадии БП у крыс среднего возраста оказались сходными с эффектами экзогенного Hsp70. Эти факты свидетельствуют о том, что основным для защиты нейронов головного мозга при развитии Паркинсон-подобной патологии

является именно стресс-индуцируемый Hsp70, что согласуется с выводами других авторов, полученными генетических и фармакологических моделях БП и других нейродегенеративных заболеваний in vitro и in vivo [282, 319, 340, 380, 381]. Таким образом, можно заключить, что нейропротективный эффект U133 обусловлен его способностью активировать экспрессию индуцибельного Hsp70, который обладает нейропротективными свойствами. Точный механизм, по которому U133 активирует синтез и субстрат-связывающую способность Hsp70 остается до конца не изученным, однако известно, что U133 связывается с промотором генов индуцибельных белков теплового шока HSE (heat shock element), запуская их транскрипцию [14].

Для того чтобы выявить механизмы нейропротективного действия Hsp70, мы проанализировали его влияние на основные патогенетические звенья развития нейродегенерации при БП, а именно на а-синуклеиновую патологию и микроглиоз. Известно, что одним из основных патоморфологических признаков БП у пациентов postmortem является наличие в телах ДА-ергических нейронов белковых включений, содержащих а-синуклеин [344, 382]. Данные литературы свидетельствуют, что в ЛЦ моделях БП снижение активности УПС в нейронах также приводит к накоплению в них белковых включений, позитивных к а-синуклеину in vitro и in vivo [167, 168]. Результаты, полученные нами, согласуются с литературными данными. Так, при моделировании БП у крыс среднего и пожилого возраста в ДА-ергических нейронах кчЧС и обонятельных луковиц обнаруживаются тельца Леви, по морфологии сходные с описанными у человека при БП [228]: плотное ацидофильное ядро, ярко окрашенное антителами против а-синуклеина, с бледным ореолом вокруг него. Индукция синтеза Hsp70 с помощью U133 приводит к сокращению количества агрегатов а-синуклеина в ДА-ергических нейронах кчЧС, судя по анализу изображения на конфокальных микрофотографиях (см. рис. 32), что может указывать на дезагрегационную активность Hsp70. Важным доказательством дезагрегационной активности Hsp70 также являются результаты количественного биохимического анализа (метод ловушки на фильтре) в которых подтверждено, что терапия с U133 приводит к снижению количества агрегатов белка а-синуклеина в кчЧС крыс в модели БП. Сходные данные о способности Hsp70 взаимодействовать c уже сформировавшимися агрегатами а-синуклеина были получены на клеточной культуре человека [383, 384]. В другом исследовании in vitro установлено, что Hsp70 вместе с кошапероном Hsp40 и фактором обмена нуклеотидов HSP110 могут формировать дисагрегазный комплекс, способный к быстрому (в течение нескольких минут) АТФ-зависимому разрушению агрегатов а-синуклеина, что приводит к формированию в клетках его нетоксичных мономеров [20]. В генетической модели а-синуклеиновой токсичности у мышей продемонстрировано, что индуктор Hsp70, вещество растительного происхождения FLZ, вызывает возрастание транскрипционной активности и экспрессии Hsp70, способствует улучшению функциональной активности ДА-ергических нейронов в кчЧС, ослабляет моторные

нарушения и снижает степень агрегирования а-синуклеина и его токсичность, причем нокдаун гена HSP70 препятствует проявлению защитных свойств FLZ [319], что также согласуется с нашими результатами.

Одной из основных патологических модификаций а-синуклеина является его гиперфосфорилирование по Ser129, которое может влиять на растворимость белка и способствовать его патогенной агрегации [6, 185, 385]. Поэтому важным представлялось исследовать влияние Hsp70-индуцирующей терапии на содержание фосфорилированного а-синуклеина (Ser129) в кчЧС крыс при моделировании БП. Установлено, что в нашей модели БП у крыс среднего возраста содержание фосфорилированного по Ser-129 а-синуклеина почти в 3 раза выше, чем в контроле, а терапия с U133 снижает содержание этой формы а-синуклеина до контрольных значений. При этом отмечается явная тенденция к возрастанию общей растворимой формы а-синуклеина в кчЧС, что, в совокупности с данными, полученными с помощью метода ловушки на фильтре, может предполагать ослабление его агрегации. Известно, что около 90% а-синуклеина в тельцах Леви нейронов кчЧС у пациентов с БП находится в фосфорилированном состоянии, а у людей, не страдающих нейродегенеративными заболеваниями, содержание такой формы составляет менее 4% от уровня общего а-синуклеина [185]. Более того, установлено, что у больных БП postmortem фосфорилированный а-синуклеин (Ser129) обнаруживается в колокализации с мембранами митохондрий. В опытах in vitro установлено, что такое взаимодействие негативно влияет на процесс клеточного дыхания, внося вклад в развитие окислительного стресса [385]. При моделировании у крыс наследственной формы БП доказано, что накопление фосфорилированного а-синуклеина^ег129 токсично для клетки и сопряжено с усилением нейродегенеративного процесса в нигростриатной системе [386]. Можно полагать, что в наших опытах нейропротективный эффект HSP70-индуцирующей терапии с помощью U133 реализуется за счет способности шаперона противодействовать посттрансляционной модификации а-синуклеина, приводящей к его агрегированию и цитотоксичности.

Защитные свойства Hsp70 при а-синуклеиновой патологии могут проявляться и на уровне олигомеров а-синуклеина. В модели а-синуклеиновой токсичности на мушке рода Drosophila sp. установлено, что сверхэкспрессия Hsp70 ингибирует образование фибрилл а-синуклеина за счет избирательного связывания с префибриллами (олигомерами), что приводит к ослаблению их токсических свойств [22]. Кроме того, защитные свойства Hsp70 также связаны с его вовлечением в процесс деградации аномального а-синуклеина с помощью убиквитин-протеасомной системы [279]. Однако вследствие того, что созданная нами модель БП основана на ингибировании работы протеасом, повышенный уровень водорастворимой неагрегированной формы а-синуклеина в кчЧС сохраняется. Это указывает на то, что для полноценной терапии а-синуклеиновой патологии при БП нужен комплексный подход, нацеленный как на молекулярные

механизмы, противодействующие образованию конформационно дефектных белков (активация шаперонной системы белков теплового шока), так и на механизмы их утилизации (использование активаторов протеасом и шаперон-опосредованной аутофагии). Таким образом, данные, полученные нами и другими авторами, свидетельствуют, что одним из значимых молекулярных механизмов нейропротективного действия Hsp70 является способность шаперона предотвращать посттрансляционную модификацию а-синуклеина, что приводит к уменьшению цитотоксичности и замедлению формирования агрегатов а-синуклеина в черной субстанции.

Токсичные олигомеры а-синуклеина могут распространяться между нейронами по прион-подобному механизму и активировать нейровоспалительный процесс как у пациентов с БП, так и у модельных животных [120, 387, 388]. Хроническое нейровоспаление в нигростриатной и экстранигральных структурах - патогенетический признак БП [348]. Оно способствует развитию и поддержанию процесса нейродегенерации и проявляется возрастанием количества активированных микроглиоцитов.

Ряд данных литературы указывает на модулирующие свойства Hsp70 на иммунную систему [268, 389]. Нами показано, что что у крыс при физиологическом старении возрастает количество активированных микроглиоцитов в обонятельной луковице по сравнению с крысами среднего возраста. Эти изменения в мозге могут интерпретироваться как возрастные проявления нейронального воспаления. При моделировании доклинической стадии БП у пожилых крыс прирост количества микроглиоцитов в обонятельной луковице составляет 30%, а в кчЧС - 47% по сравнению с возрастным контролем, что указывает на прогрессирование нейровоспаления. Терапия с U133 уменьшает в 2.2 раза реактивный микроглиоз в кчЧС, что свидетельствует о противовоспалительном действии №р70-индуцирующей терапии с помощью соединения U133. Однако в обонятельных луковицах противовоспалительный эффект U133 не проявляется, что может быть следствием отсутствия Hsp70 индуцирующего ответа в этой структуре после введения соединения U133.

Снижение нейровоспаления, оцениваемого по количеству Ibal-иммунопозитивных микроглиоцитов, было также продемонстрировано в 6-гидроксидофаминовой модели БП у мышей при системном введении Tat-Hsp70, что согласуется с нашими результатами [378]. Противовоспалительный эффект Hsp70 связывают с его негативным влиянием на экспрессию транскрипционного фактора STAT3, активирующего транскрипцию провоспалительных цитокинов, и ингибированием JNK- и NF-кВ-опосредованного сигналлинга [390]. Так, в ротеноновой модели БП in vitro, инкубация клеток с Hsp70 приводила к дозо-зависимому повышению их выживаемости, которое авторы связывают со снижением уровня экспрессии транскрипционных факторов NF-kB и STAT-3, играющих активную роль в процессе нейровоспаления [360]. Более того, в литературе имеются данные, что Hsp70 может выступать в

роли цитокина, взаимодействуя с рецепторами CD14, CD91, CD40, Lox-1 и др. на поверхности макрофагов и модулировать их функцию [289, 290].

Важно отметить, что индуктор шаперонов Ш33 способен не только уменьшать патоморфологические и нейрохимические изменения в головном мозге, но и корректировать функциональные нарушения, включая сон, которые снижают качество жизни на доклинической стадии БП при старении. Фармакотерапия с Ш33 в модели доклинической стадии БП у пожилых крыс устраняет повышенную дневную сонливость и приводит к отчетливому увеличению глубокого медленноволнового сна [391]. Поскольку во время глубокого сна происходит ускорение синтеза белков [392], необходимых для восстановления структуры и функций нейронов, и активация работы глимфатической системы, отвечающей за элиминацию амилоидных белков в головном мозге [393], то увеличение представленности этого состояния можно рассматривать как развитие компенсаторных процессов, защищающих клетки от накопления белковых молекул с неправильной укладкой и как молекулярный механизм противодействия нейродегенерации.

Полученные результаты подтверждают терапевтическую значимость индукции №р70 для замедления БП-подобной нейродегенерации и восстановления функции выживших нейронов. Несомненно, что отечественный препарат Ш33 и другие индукторы шаперонов имеют перспективу использования в профилактической и превентивной терапии БП как в среднем возрасте, так и при старении.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Основные итоги выполненной работы

В работе экспериментально доказано, что снижение содержания стресс-индуцируемого шаперона №р70 в ДА-ергических нейронах кчЧС в модели доклинической стадии БП у крыс среднего возраста способствует прогрессии нейродегенерации и переходу нейропатологических симптомов от доклинической стадии БП к клинической, для которой характерно развитие обширной нейродегенерации в нигростриатной системе и появление моторных нарушений. Сходные данные о прогрессивном характере гибели ДА-ергических нейронов получены при моделировании доклинической стадии БП у крыс при старении. Продемонстрированная возрастная утрата компенсаторных механизмов, основанных на нейропротективных свойствах №р70, может являться одной из причин быстрой прогрессии БП у лиц пожилого возраста. Таким образом, результаты, полученные в первой части работы, свидетельствуют, что шаперон №р70 является ключевой молекулой, сдерживающей развитие БП-подобной нейродегенеративной патологии в кчЧС. Полученные данные стали фундаментальным обоснованием для изучения нейропротективных свойств шаперона №р70 в моделях БП.

Показано, что повышение содержания №р70 в нейронах кчЧС при развитии клинической стадии БП, путем его интраназального введения или с помощью соединения Ш33, замедляет переход процесса нейродегенерации от доклинической стадии, в которой сохраняются компенсаторные и нейропротективные резервы нигростриатной системы, к клинической стадии БП, для которой характерно истощение этих резервов. Временная отсрочка проявления симптомов клинической стадии признается перспективной целью современной фармакологической стратегии лечения БП [4]. Сопоставление с ранее полученными данными [29] позволяет предположить, что замедление гибели ДА-ергических нейронов происходит за счет увеличения содержания №р70 в тех нейронах, в которых оно было частично или полностью утрачено. Полученные результаты могут стать научным обоснованием разработки новой молекулярной технологии терапии БП, основанной на препаратах или индукторах №р70 и направленной на поддержание высокого нейропротективного потенциала шаперонов в головном мозге.

В работе установлено, что фармакологическая активация транскрипционного фактора HSF1 с помощью малой молекулы Ш33 способна вызывать №р70-индуцирующий ответ в основных регионах головного мозга, вовлеченных в патогенез БП, как у крыс среднего возраста, так и у пожилых животных, несмотря на возрастное ослабление молекулярных механизмов мобилизации шаперонов в стареющем мозге. В результате увеличения содержания Шр70 замедляется прогрессирование нейродегенерации в нигростриатной системе и улучшается

функциональная активность выживших нейронов в моделях БП у крыс среднего и пожилого возраста. Нейропротективный эффект U133, обусловленный повышением Hsp70, связан со способностью шаперона разбирать агрегаты а-синуклеина, снижать содержание фосфорилированной формы а-синуклеина и ослаблять нейровоспаление в кчЧС. В совокупности полученные факты свидетельствуют о терапевтическом потенциале соединения U133 при развитии Паркинсон-подобной патологии.

Рекомендации и перспективы дальнейшей разработки темы

Во всем мире отмечается неуклонный рост числа фатальных хронических нейродегенеративных заболеваний, к которым, помимо БП, относятся болезнь Альцгеймера, хорея Гентингтона, амиотрофический латеральный склероз и др. В нашем исследовании, а также в работах других авторов установлено, что индуцибельный Hsp70 является ключевым «защитником» нервных клеток от нейротоксических факторов при развитии болезней этого типа [340, 371, 394, 395]. Установлено, что нейропротективный потенциал Hsp70 обусловлен его дезагрегационной и противовоспалительной активностями. Тем не менее, при моделировании БП повышенный уровень водорастворимой неагрегированной формы а-синуклеина в кчЧС крыс сохраняется. Это указывает на то, что для полноценной терапии а-синуклеиновой патологии при БП нужен комплексный подход, нацеленный как на молекулярные механизмы, противодействующие образованию конформационно дефектных белков (активация шаперонной системы белков теплового шока), так и на механизмы их утилизации (использование активаторов протеасом и шаперон-опосредованной аутофагии). Известно, что шаперон Hsp70 способен проявлять антиапоптозную и антиоксидантную активности, поддерживать нормальную работу убиквитин-протеасомной и лизосомной систем [226, 371, 396, 397], поэтому интересным также представляется исследовать вклад этих функций Hsp70 в реализацию его нейропротективных эффектов в разработанных моделях БП у крыс разных возрастных групп.

В настоящее время активно исследуется участие глимфатической системы в развитии нейродегенеративных заболеваний. Известно, что при моделировании БП-подобной патологии in vitro и in vivo происходит нарушение экспрессии и активности основного компонента глимфатической системы - водного канала, образованного аквапорином 4, что влечет за собой активацию микро- и астроглии, продукцию провоспалительных цитокинов, развитие нейровоспалительного процесса [398], однако роль этого канала в патогенезе БП и других нейродегенеративных заболеваний пока остается неизвестной.

К настоящему моменту все еще остается недостаточно изученной роль других индуцибельных шаперонов, например, малых белков теплового шока (sHSP), при развитии нейродегенеративных заболеваний, хотя их нейропротективный потенциал показан некоторыми

авторами [399, 400]. Поэтому перспективным представляется оценка нейропротективных свойств этих белков и изучение молекулярных механизмов их действия в моделях нейродегенеративных заболеваний. Конститутивные белки семейства НБР70, например, резидент эндоплазматического ретикулума Огр78 или митохондриальный белок М1р70, также представляют интерес при разработке нейропротективной терапии. Ранее нами показан потенциал белка Огр78 в защите нейронов при моделировании доклинической стадии БП у крыс среднего возраста [401], а другими исследователями продемонстрирована связь дисфункции М{р70 с развитием нейродегенеративных болезней [152], поэтому интересным представляется изучение молекулярных механизмов действия этих белков, а также способов повышения их содержания в нервных клетках.

В настоящее время идет активное изучение нейропротективных свойств различных природных молекул, вызывающих повышение в нервных клетках содержания индуцибельного №р70 и других белков теплового шока (селастрол, гелданамицин и т.д.). Однако практически все изученные индукторы обладают нежелательными побочными эффектами, ограничивающими их применение в клинической практике [340]. Поэтому поиск безопасных индукторов шаперонов для лечения нейродегенеративных заболеваний активно продолжается. В связи с этим перспективным представляется дальнейшее изучение нейропротективных свойств малой молекулы И133 на других моделях БП, в которых нарушение функции убиквитин-протеасомной системы не является первичным.

107 ВЫВОДЫ

1. Снижение содержания стресс-индуцируемого белка №р70 в дофамин (ДА)-ергических нейронах компактной части черной субстанции (кчЧС) при моделировании доклинической стадии БП у крыс среднего возраста вызывает усиление нейродегенерации в нигростриатной системе, ослабление компенсаторных процессов, направленных на поддержание нормального уровня ДА, и развитие моторной дисфункции, характерной для клинической стадии БП. Полученные данные свидетельствуют о вовлечении шаперона №р70 в молекулярные механизмы нейропротекции и поддержания функции сохранившихся ДА-ергических нейронов при развитии Паркинсон-подобной патологии.

2. Возрастное снижение уровня №р70 в нейронах кчЧС в модели доклинической стадии БП у пожилых крыс сопряжено с более высокой подверженностью нигростриатной системы к нейродегенерации, с более выраженным снижением активности нейрохимических процессов, направленных на компенсацию функциональной недостаточности ДА-ергической системы, и с появлением признаков моторного дефицита по сравнению с животными молодого и среднего возраста в модели БП. Эти данные указывают на то, что возрастное ослабление синтеза №р70 является одним из молекулярных механизмов прогрессирования Паркинсон-подобной патологии в стареющем мозге.

3. Повышение содержания №р70 в ДА-ергических нейронах кчЧС путем его интраназальной доставки в мозг увеличивает количество выживших ДА-ергических нейронов в кчЧС и их аксонов в дорсальном стриатуме, способствует активации компенсаторных процессов в нигростриатной системе и препятствует развитию моторных феноменов при моделировании клинической стадии БП у крыс среднего возраста. По совокупности показателей №р70 предотвращает переход патологических признаков БП от доклинической к клинической стадии.

4. Проведение терапии препаратом Ш33, индуцирующим экспрессию белка теплового шока Шр70 в головном мозге, в моделях доклинической и клинической стадий БП у крыс среднего и пожилого возраста ослабляет развитие нейродегенеративного процесса в ДА-ергической нигростриатной системе, усиливает функцию сохранившихся нейронов и продлевает период доклинической стадии БП. Полученные данные подтверждают нейропротективную значимость фармакологической индукции синтеза шаперонов в головном мозге при Паркинсон-подобной патологии.

5. Защитный эффект соединения Ш33 в моделях БП у крыс реализуется через повышение содержания №р70 в нигростриатной системе, что приводит к уменьшению количества агрегатов а-синуклеина, содержания фосфорилированной по Ser129 формы белка а-синуклеина и реактивного микроглиоза в кчЧС.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

БП - болезнь Паркинсона

ВТМА 2 - везикулярный транспортер моноаминов 2 типа ДА - дофамин

кчЧС - компактная часть черной субстанции ЛЦ - лактацистин

МФТП - 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин

ТГ - тирозингидроксилаза

УПС - убиквитин-протеасомная система

ЭПР - эндоплазматический ретикулум

6-OHDA - 6-hydroxydopamine, 6-гидроксидофамин

DAT - dopamine transporter, транспортер дофамина

HSF - Heat shock factor, фактор теплового шока

Hsp70 - стресс-индуцируемый белок теплового шока массой 70 кДа

HSPs - Heat Shock Proteins, белки теплового шока

L-ДОФА - L-гидроксифенилаланин

PBS - 0.1 М фосфатный буфер, pH 7.4

shRNA-Hsp70 - лентивирусная конструкция shRNA-Hsp70, несущая ген шпилечной РНК к мРНК стресс-индуцируемого белка Hsp70

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Bernheimer H. et al. Brain dopamine and the syndromes of Parkinson and Huntington Clinical, morphological and neurochemical correlations // J. Neurol. Sci. 1973. Vol. 20, № 4. P. 415-455.

2. Poewe W. et al. Parkinson disease // Nat. Rev. Dis. Prim. 2017. Vol. 3, № 1. P. 1-21.

3. Dorsey E.R. et al. Projected number of people with Parkinson disease in the most populous nations, 2005 through 2030 // Neurology. 2007. Vol. 68, № 5. P. 384-386.

4. Угрюмов М.В. Трансляционная, персонализированная и профилактическая медицина как основа для борьбы с нейродегенеративными заболеваниями // Нейродегенеративные заболевания: от генома до целостного организма. 2014. С. 22-24.

5. Mingazov E.R. et al. MPTP Mouse Model of Preclinical and Clinical Parkinson's Disease as an Instrument for Translational Medicine // Mol Neurobiol. 2018. Vol. 55. P. 2991-3006.

6. Rocha E.M., De Miranda B., Sanders L.H. Alpha-synuclein: Pathology, mitochondrial dysfunction and neuroinflammation in Parkinson's disease // Neurobiology of Disease. 2018. Vol. 109. P. 249-257.

7. Verma M. et al. Molecular Interactions of a-Synuclein, Mitochondria, and Cellular Degradation Pathways in Parkinson's Disease // Quality Control of Cellular Protein in Neurodegenerative Disorders. 2020. P. 212-234.

8. Schwarzman A.L. et al. Prion Properties of Alpha-Synuclein // Mol. Biol. 2019. Vol. 53, № 3. P. 335-341.

9. Пчелина С.Н., Емельянов А.К. Альфа-синуклеин как биомаркер болезни Паркинсона // Нейродегенеративные заболевания - от генома до целостного организма: Часть I: Моторная функция и ее регуляция в норме и при патологии. 2014. С. 233-250.

10. Ciechanover A. et al. The ubiquitin-mediated proteolytic system: Involvement of molecular chaperones, degradation of oncoproteins, and activation of transcriptional regulators // Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 1995. Vol. 60. P. 491-501.

11. McNaught K.S.P., Jenner P. Proteasomal function is impaired in substantia nigra in Parkinson's disease // Neurosci. Lett. 2001. Vol. 297, № 3. P. 191-194.

12. Pastukhov Y.F. et al. Exogenous protein HSP70 blocks neurodegeneration in the rat model of the clinical stage of Parkinson's disease // Dokl. Biol. Sci. 2014. Vol. 457, № 1.

13. Plaksina D. V et al. Experimental modeling of a preclinical Parkinson's disease stage in rats by intranasal lactacystin administration // Neurodegen. Dis.(Suppl). 2017. Vol. 17, № 1. P. 1655.

14. Ekimova I.V. et al. New HSF1 inducer as a therapeutic agent in a rodent model of Parkinson's disease // Exp. Neurol. 2018. Vol. 306. P. 199-208.

15. Пастухов Ю.Ф. и др. Изменения сна при дегенерации нейронов черной субстанции, вызванной ингибитором протеасомы лактацистином // Российский физиологический журнал им. И. М. Сеченова. 2010. Т. 96, № 12. С. 1190-1195.

16. Bentea E., Verbruggen L., Massie A. The proteasome inhibition model of Parkinson's disease // J. Parkinsons. Dis. 2017. Vol. 7, № 1. P. 31-63.

17. Guzhova I., Margulis B. Hsp70 Chaperone as a Survival Factor in Cell Pathology // Int. Rev. Cytol. 2006. Vol. 254, № 06. P. 101-149.

18. Hartl F.U., Bracher A., Hayer-Hartl M. Molecular chaperones in protein folding and proteostasis // Nature. 2011. Vol. 475, № 7356. P. 324-332.

19. Пастухов Ю.Ф. и др. Экзогенный белок Hsp70 останавливает процесс нейродегенерации в условиях экспериментальной модели болезни Паркинсона у крыс // Доклады Академии Наук. 2014. Т. 457, № 6. С. 724-727.

20. Gao X. et al. Human Hsp70 Disaggregase Reverses Parkinson's-Linked а-Synuclein Amyloid Fibrils // Mol. Cell. 2015. Vol. 59, № 5. P. 781-793.

21. Ganguly U. et al. Alpha-synuclein, Proteotoxicity and Parkinson's Disease: Search for Neuroprotective Therapy // Curr. Neuropharmacol. 2018. Vol. 16, № 7. P. 1086-1097.

22. Auluck P.K. et al. Chaperone suppression of а-synuclein toxicity in a Drosophila model for Parkinson's disease // Science. 2002. Vol. 295, № 5556. P. 865-868.

23. Kustanova G.A. et al. Protective effect of exogenous 70-kDa heat shock protein during endotoxic shock (sepsis) // Doklady Biological Sciences. 2006. Vol. 411, № 1. P. 504-507.

24. Lapshina K. V., Ekimova I. V. Study of protective effects of exogenous heat shock protein 70 kDa in model of sleep deprivation in pigeon Columba livia // J. Evol. Biochem. Physiol. 2010. Vol. 46, № 5. P. 461-470.

25. Lapshina K. V, Ekimova I. V. Exogenous Heat Shock Protein 70 kDa Facilitates the Restoration of Sleep and Thermoregulatory Characteristics in Rat Endotoxemia Model // Sleep. 2019. Vol. 42. P. A28.

26. Пастухов Ю.Ф., Худик К.А., Екимова И.В. Шапероны в регуляции и восстановлении физиологических функций // Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова. 2010. Т. 96, № 7. С. 708-725.

27. Dong Z. et al. Hsp70 gene transfer by adeno-associated virusi inhibits MPTP-induced nigrostriatal degeneration in the mouse model of Parkinson disease // Mol. Ther. 2005. Vol. 11, № 1. P. 8088.

28. Jung A.E. et al. HSP70 and constitutively active HSF1 mediate protection against CDCrel-1-mediated toxicity // Mol. Ther. 2008. Vol. 16, № 6. P. 1048-1055.

29. Пастухов Ю.Ф. и др. Содержание шаперона Hsp70 в дофаминергических нейронах черной субстанции возрастает при протеасомной дисфункции // Российский физиологический журнал им. И М. Сеченова. 2011. Т. 97, № 7. С. 649-660.

30. Labbadia J., Morimoto R.I. The Biology of Proteostasis in Aging and Disease // Annu. Rev. Biochem. 2015. Vol. 84, № 1. P. 435-464.

31. Margulis B. et al. Molecular Chaperones and Proteolytic Machineries Regulate Protein Homeostasis In Aging Cells // Cells. 2020. Vol. 9, № 5. P. 1308.

32. Chu Y. et al. Alterations in lysosomal and proteasomal markers in Parkinson's disease: Relationship to alpha-synuclein inclusions // Neurobiol. Dis. 2009. Vol. 35, № 3. P. 385-398.

33. Parkinson J. An Essay on the Shaking Palsy. 1817.

34. Olesen J. et al. The economic cost of brain disorders in Europe // Eur. J. Neurol. 2012. Vol. 19, № 1. P. 155-162.

35. Bezard E. et al. Compensatory Mechanisms in Experimental and Human Parkinsonism: Potential for New Therapies // Handbook of Behavioral Neuroscience. 2010. Vol. 20, № C. 641-652 p.

36. Blesa J. et al. Compensatory mechanisms in Parkinson's disease: Circuits adaptations and role in disease modification // Exp. Neurol. 2017. Vol. 298, № September. P. 148-161.

37. Pifl C., Hornykiewicz O. Dopamine turnover is upregulated in the caudate/putamen of asymptomatic MPTP-treated rhesus monkeys // Neurochem. Int. 2006. Vol. 49, № 5. P. 519-524.

38. Rodriguez M. et al. Firing regulation in dopaminergic cells: effect of the partial degeneration of nigrostriatal system in surviving neurons // Eur. J. Neurosci. 2003. Vol. 18, № 1. P. 53-60.

39. Ballanger B. et al. Imaging dopamine and serotonin systems on MPTP monkeys: A longitudinal pet investigation of compensatory mechanisms // J. Neurosci. 2016. Vol. 36, № 5. P. 1577-1589.

40. Mingazov E. et al. Molecular mechanisms of neurodegeneration and neuroplasticity in the nigrostriatal system at modeling Parkinson's disease as an instrument for translational medicine // Parkinsonism Relat. Disord. 2018. Vol. 46. P. e43-e44.

41. Kozina E.A. et al. Tyrosine hydroxylase expression and activity in nigrostriatal dopaminergic

neurons of MPTP-treated mice at the presymptomatic and symptomatic stages of parkinsonism // J. Neurol. Sci. 2014. Vol. 340, № 1-2. P. 198-207.

42. Ugrumov M. V. et al. Dopamine synthesis by non-dopaminergic neurons expressing individual complementary enzymes of the dopamine synthetic pathway in the arcuate nucleus of fetal rats // Neuroscience. 2004. Vol. 124, № 3. P. 629-635.

43. Ugrumov M. V. Non-dopaminergic neurons partly expressing dopaminergic phenotype: Distribution in the brain, development and functional significance // Journal of Chemical Neuroanatomy. 2009. Vol. 38, № 4. P. 241-256.

44. Kozina E.A. et al. Cooperative synthesis of dopamine by non-dopaminergic neurons as a compensatory mechanism in the striatum of mice with MPTP-induced Parkinsonism // Neurobiol. Dis. 2017. Vol. 98. P. 108-121.

45. Cossette M., Lecomte F., Parent A. Morphology and distribution of dopaminergic neurons intrinsic to the human striatum // J. Chem. Neuroanat. 2005. Vol. 29, № 1. P. 1-11.

46. Mingazov E.R., Ugryumov M. V. Molecular Markers of Dopamine Transport in Nigrostriatal Dopaminergic Neurons as an Index of Neurodegeneration and Neuroplasticity // Neurochem. J. 2019. Vol. 13, № 1. P. 43-48.

47. Adams J.R. et al. PET in LRRK2 mutations: comparison to sporadic Parkinson's disease and evidence for presymptomatic compensation // Brain. 2005. Vol. 128, № 12. P. 2777-2785.

48. Wile D.J. et al. Serotonin and dopamine transporter PET changes in the premotor phase of LRRK2 parkinsonism: cross-sectional studies // Lancet Neurol. 2017. Vol. 16, № 5. P. 351-359.

49. Chefer S.I. et al. Estimation of D2-like receptor occupancy by dopamine in the putamen of hemiparkinsonian monkeys // Neuropsychopharmacology. 2008. Vol. 33, № 2. P. 270-278.

50. Sun J. et al. Regulation of dopamine presynaptic markers and receptors in the striatum of DJ-1 and pink1 knockout rats // Neurosci. Lett. 2013. Vol. 557, № PB. P. 123-128.

51. Ugrumov M.V. et al. Modeling of presymptomatic and symptomatic stages of parkinsonism in mice // Neuroscience. 2011. Vol. 181. P. 175-188.

52. Пастухов Ю., Екимова И., Чеснокова А. Молекулярные механизмы патогенеза болезни Паркинсона и перспективы превентивной терапии // Нейродегенеративные заболевания -от генома до целостного организма: Часть I: Моторная функция и ее регуляция в норме и при патологии. 2014. Т. 1. С. 316-355.

53. Olanow C.W., Schapira A.H. V. Therapeutic prospects for Parkinson disease // Ann. Neurol.

54

55

56

57

58

59

60

61

62

63

64

65

66

67

2013. Vol. 74, № 3. P. 337-347.

Fu Y.H. et al. A cytoarchitectonic and chemoarchitectonic analysis of the dopamine cell groups in the substantia nigra, ventral tegmental area, and retrorubral field in the mouse // Brain Struct. Funct. 2012. Vol. 217, № 2. P. 591-612.

Schultz W. Predictive reward signal of dopamine neurons // Journal of Neurophysiology. 1998. Vol. 80, № 1. P. 1-27.

Freeze B.S. et al. Control of basal ganglia output by direct and indirect pathway projection neurons // J. Neurosci. 2013. Vol. 33, № 47. P. 18531-18539.

Gerfen C.R., Surmeier D.J. Modulation of Striatal Projection Systems by Dopamine // Annu. Rev. Neurosci. 2011. Vol. 34, № 1. P. 441-466.

Calabresi P. et al. Direct and indirect pathways of basal ganglia: A critical reappraisal // Nature Neuroscience. 2014. Vol. 17, № 8. P. 1022-1030.

Blocq P., Marinesco G. Sur un cas de tremblement parkinsonien hémiplégique: symptomatique d'une tumeur du pédoncule cérébral. 1893.

Hostiuc S., Drima E., Buda O. Shake the Disease. Georges Marinesco, Paul Blocq and the Pathogenesis of Parkinsonism, 1893 // Front. Neuroanat. 2016. Vol. 10.

Luys J. Recherches sur le système nerveux cérébro-spinal: sa structure, ses fonctions et ses maladies. 1865.

Trétiakoff C. Contribution a l'etude de l'Anatomie pathologique du Locus Niger de Soemmering avec quelques deduction relatives a la pathogenie des troubles du tonus musculaire et de la maladie de Parkinson // Theses de Paris. 1919.

Parent M., Parent A. Substantia nigra and Parkinson's disease: A brief history of their long and intimate relationship // Canadian Journal of Neurological Sciences. 2010. Vol. 37, № 3. P. 313319.

Agid Y. Parkinson's disease: pathophysiology // Lancet. 1991. Vol. 337, № 8753. P. 1321-1324.

Fearnley J.M., Lees A.J. Ageing and Parkinson's disease: substantia nigra regional selectivity // Brain. 1991. Vol. 114, № 5. P. 2283-2301.

Braak H. et al. Staging of brain pathology related to sporadic Parkinson's disease // Neurobiol. Aging. 2003. Vol. 24, № 2. P. 197-211.

Doty R.L. Olfactory dysfunction in Parkinson disease // Nature Reviews Neurology. 2012. Vol. 8, № 6. P. 329-339.

68. Пастухов Ю.Ф., Чеснокова А.Ю. Альфа-синуклеин в патогенезе болезни Паркинсона и других нейродегенеративных заболеваний // Нейродегенеративные заболевания: фундаментальные и прикладные аспекты. 2010. С. 189-200.

69. Rey N.L. et al. Widespread transneuronal propagation of a-synucleinopathy triggered in olfactory bulb mimics prodromal Parkinson's disease // J. Exp. Med. 2016. Vol. 213, № 9. P. 1759-1778.

70. Zampese E. et al. Determinants of Selective Vulnerability of Dopamine Neurons in Parkinson's Disease // Handbook of Behavioral Neuroscience. 2016. Vol. 24. P. 821-837.

71. Tanner C.M. et al. The disease intersection of susceptibility and exposure: Chemical exposures and neurodegenerative disease risk // Alzheimer's Dement. 2014. Vol. 10. P. S213-S225.

72. Karpenko M.N. et al. An Infection Hypothesis of Parkinson's Disease // Neurosci. Behav. Physiol. 2019. Vol. 49, № 5. P. 555-561.

73. Matsuda W. et al. Single nigrostriatal dopaminergic neurons form widely spread and highly dense axonal arborizations in the neostriatum // J. Neurosci. 2009. Vol. 29, № 2. P. 444-453.

74. Bolam J.P., Pissadaki E.K. Living on the edge with too many mouths to feed: Why dopamine neurons die // Mov. Disord. 2012. Vol. 27, № 12. P. 1478-1483.

75. Pissadaki E.K., Bolam J.P. The energy cost of action potential propagation in dopamine neurons: clues to susceptibility in Parkinson's disease // Front. Comput. Neurosci. 2013. Vol. 7.

76. Gennerich A., Vale R.D. Walking the walk: how kinesin and dynein coordinate their steps // Current Opinion in Cell Biology. 2009. Vol. 21, № 1. P. 59-67.