Зависимость нейротропных эффектов ряда аналогов синтетических меланокортинов от структуры тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.13, кандидат биологических наук Глазова, Наталия Юрьевна

• Глазова, Наталия Юрьевна
• кандидат биологических наук
• 2004

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Глазова, Наталия Юрьевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Природные меланокортины

2. Рецепторы меланокортинов

3. Негормональные эффекты меланокортинов

3.1. Влияние меланокортинов на обучение и память

3.2. Нейротрофические эффекты меланокортинов

3.3. Действие меланокортинов на сердечно-сосудистую систему

3.4. Влияние меланокортинов на иммунную систему

3.5. Действие меланокортинов на двигательную активность животных

3.6. Влияние меланокортинов на уровень эмоциональной напряженности

3.7. Влияние меланокортинов на половое поведение

3.8. Роль меланокортинов в регуляции пищевого поведения

3.9. Влияние меланокортинов на болевую чувствительность

4. Синтетические аналоги фрагментов АКТГ

5. Аналог фрагмента АКТГ4.ю - Семакс

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

МАТРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 1. Исследование ноотропных эффектов фрагмента семакса гексапептида EHFPGP

1.1. Изучение влияния EHFPGP на ориентировочно-исследовательское поведение животных.

1.2. Изучение ноотропных эффектов EHFPGP при введении пептида за

15 мин до сеанса обучения.

1.3. Изучение ноотропных эффектов EHFPGP при введении пептида за

1 час до сеанса обучения.

1.4. Изучение ноотропных эффектов EHFPGP при введении пептида за

20 часов до сеанса обучения.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Зависимость нейротропных эффектов ряда аналогов синтетических меланокортинов от структуры»

В настоящее время показано, что вещества пептидной природы являются прямыми или опосредованными регуляторами многих важных физиологических \J процессов в организме. Область биологической активности регуляторных пептидов чрезвычайно широка. Вещества этой группы определяют состояние кровеносной, иммунной и других систем. Важную роль играют пептиды в регуляции состояния центральной нервной системы. Механизм действия большинства известных нейропептидов сложен и недостаточно изучен.

Одним из активно исследуемых классов эндогенных пептидных регуляторов являются АКТГ/МСГ-подобные пептиды, объединяемые в настоящее время термином меланокортины. Исследования эффектов меланокортинов, проводившиеся на протяжении последних 40 лет, показали, что спектр физиологической активности этих пептидов очень широк. Соединения этого класса, помимо ранее известной гормональной активности, оказывают Ф влияние на процессы обучения и памяти, рост и регенерацию нервов, иммунную регуляцию, сердечно-сосудистую систему, болевую чувствительность, пищевое и половое поведение и ряд других функций организма. Использование коротких фрагментов природных гормонов позволяет отделить гормональные (кортикотропные и меланотропные) свойства исходных молекул от их экстрагормонального действия. Доказательство широкого спектра физиологической активности меланокортинов и открытие семейства их рецепторов предоставило новые возможности для исследования веществ, потенциально применимых в клинике при различных патологиях.

Существенным недостатком природных меланокортинов является малая продолжительность их действия. Многими исследователями были предприняты попытки создания высокоэффективных аналогов фрагментов АКТГ путем различных модификаций первичной структуры молекулы. В ходе таких экспериментов были получены аналоги природных пептидов, лишенные гормональных эффектов и обладающие выраженной биологической активностью. В результате многолетних исследований был разработан аналог Ф

AKTTYio пролонгированного действия - семакс. Исследования активности этого пептида в экспериментах на животных показали, что он улучшает память и внимание, обладает антигипоксическим и антигеморрагическим эффектами, способствует уменьшению тяжести клинических и нейрофизиологических проявлений экспериментального ишемическиго инсульта. Клинические исследования показали высокую эффективность семакса при лечении интеллектуально-мнестических расстройств различного генеза, а также при профилактике и лечении постнаркозных мнестических нарушений. Введение семакса оказывает выраженное позитивное действие при лечении инсульта. На сегодняшний день этот пептид является единственным широко используемым в клинике лекарственным нейротропным препаратом, разработанным на основе фрагментов АКТГ. Исследования физиологических эффектов семакса, направленные на выяснение механизмов его действия и на расширение спектра клинического применения этого препарата, продолжаются.

Несмотря на то, что семакс уже более десяти лет используется в клинической практике, до настоящего времени не раскрыты механизмы, лежащие в основе его пролонгированного действия, не выявлено значения отдельных структурных элементов молекулы для сохранения его ноотропных эффектов, не определен спектр физиологической активности этого пептида.

Настоящая работа посвящена исследованию зависимости «структура -активность» в ряду синтетических аналогов фрагментов АКТГ и оценке влияния модификации N-концевой области молекулы семакса на выраженность и длительность его ноотропного действия, а также изучению кардиотропных эффектов ряда синтетических меланокортинов. Полученные данные позволяют выявить минимальную последовательность, необходимую для сохранения нейротропного действия меланокортинов, определить роль отдельных структурных элементов молекулы в сохранении активности. Кроме того, проведенные исследования способствуют определению зависимости спектра физиологической активности меланокортинов от их структуры. На основании проведенного исследования могут быть созданы аналоги природных фрагментов АКТГ с заданным спектром физиологической активности.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Природные меланокортины

К природным меланокортинам относятся гипофизарные гормоны адренокортикотропин (АКТГ) и меланоцитстимулирующие гормоны (а-, (3- и у-МСГ), синтезируемые преимущественно в аденогипофизе, а также их фрагменты. Общим структурным элементом этих гормонов является гептапептид Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly. Он может быть расположен в различных участках пептидной молекулы гормонов. В молекулах а-МСГ и АКТГ гептапептид локализован в 4-10-м положениях цепи, в Р- МСГ - в 7-13-м, а в свином липотропине в 47-53-м положениях. В у-МСГ аналогичный фрагмент присутствует, но в пятом положении вместо остатка Glu - Gly, а в 10-ом -вместо Gly - Asp (рис. 1). Наличие гептапептида в составе молекулы всех представителей этого семейства определяет общность их функциональных свойств, таких как влияние на накопление пигмента в меланоцитах (меланоцитстимулирующая активность) и жировой обмен в липоцитах (липотропная активность), стимуляцию синтеза и секреции кортикостероидов в коре надпочечников и пролиферацию ее клеток (кортикотропная активность). Таким образом, общность первичной структуры определенного участка пептидной цепи у этих гормонов дает возможность проявления трех видов активности. Сохраняя способность проявлять различные виды биологической активности, каждый гормон способен наиболее выражено выполнять одну из них. Так, кортикотропная активность АКТГ примерно на порядок выше, чем у МСГ. И наоборот, меланоцитстимулирующее действие МСГ выше, чем АКТГ [Розен, 1994].

Все природные меланокортины образуются из общего белка-предшественника - проопиомеланокортина (ПОМК). ПОМК состоит из 265 аминокислотных остатков и содержит в себе последовательности не только АКТГ и всех трех видов МСГ (а-, (3- и у-МСГ), но также и липотропина, а-, Р- и у-эндорфинов и Met-энквфалина [Nakanishi et al, 1979]. Синтез ПОМК осуществляется в рибосомах аркуатного ядра, а образование из него более коротких аминокислотных последовательностей происходит в процессе аксонального транспорта [Liotta et al, 1984]. Протеазы, действующие на ПОМК, не являются высокоспецифичными. Точное выщепление аминокислотных последовательностей обеспечивается наличием в пептиде-предшественнике парных остатков Arg-Arg, Lys-Arg, Arg-Lys и Lys-Lys, которые в первую очередь и атакуются протеазами, близкими по характеру действия к катепсину В и трипсину [Ашмарин, Стукалов, 1996]. Выщепляемые фрагменты часто подвергаются дальнейшему протеолизу с образованием новых пептидов. Так а-МСГ является фрагментом АКТГ, а (5-МСГ - фрагментом (5-липотропина [Li et al, 1965].

Молекула j\KTE—-состоит^ из 39 аминокислотных остатков. Участок молекулы с 4 по 10 аминокислоту, АКТГ4.10, является актоном гормона. Участок AKTTi5„2i, особенно тетрапептид АКТГ1518, обуславливает специфическое связывание молекулы гормона с рецептором, то есть является гаптоном. Роль усилителей меланоцитстимулирующей активности молекулы, по-видимому, выполняют N-концевой трипептид АКТГ].3 и трипептид АКТГц13. С-концевой фрагмент АКТГ25.33 наиболее вариабелен, он обуславливает иммуногенные свойства гормона, характерные для каждого вида животных. Функционально активные участки молекулы защищены от действия экзопептидаз фрагментом АКТГ20.24, который играет роль стабилизатора [Розен, 1994].

Фрагменты АКТГ обладают различной стероидогенной активностью. АКТГ 1.24, лишенный только иммуногена, сохраняет специфическую кортикотропную активность целого гормона. Его эффекты полностью идентичны эффектам АКТГ как по биологической активности, так и по продолжительности его действия в организме [Розен, 1994]. Фрагменты АКТП.п и АКТГ4.ю обладают значительно более низкой гормональной активностью [Schwyzer et al, 1980]. Стероидогенный эффект АКТГ5.24 в 100 раз ниже, чем у АКТГ4.23, что говорит о необходимости присутствия последовательности аминокислот с 4 по 10 для сохранения полной стероидогенной активности [Schwyzer et al, 1971]. В молекуле АКТГ можно выделить фрагменты с агонистическими и антагонистическими свойствами по отношению к целому гормону. Фрагмент АКТГ может быть полным агонистом (АКТГ1.24, АКТГ4-24Х частичным агонистом (АКТГ5.24), антагонистом (АКТГ7.24) или не иметь гормональной активности [Lin et al, 1991]. Таким образом, различные участки

АКТГ Ser-Tyr-Ser- jMet-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly|Lys-Pro-Val-. + 26 а.к. 1 j а-МСГ Ac-Ser-Tyr-Ser|Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly|Lys-Pro-Val-NH2

I •

I j

Р-МСГ Asp-Ser-Gly-Pro-Tyr-Lys lMet-GIn-His-Phe-Arg-Trp-Gly{Ser-Pro-Pro-Lys-Asp-OH I i ! i i

У-МСГ Lys-Tyr-Val fMet-G/v-His-Phe-Arg-Trp-^^Arg-Phe-Gly

Рис. 1. Аминокислотные последовательности природных меланокортинов. молекулы АКТГ обусловливают отдельные составляющие биологической активности гормона. Множественность участков АКТГ, обеспечивающих биологическую активность, определяет связывание его с различными рецепторами и как результат наличие спектра различных биологических эффектов АКТГ.

АКТГ является одним из основных гормонов стресса. В ответ на стрессирующее воздействие нервный импульс, поступащий в паравентрикулярное ядро гипоталамуса, стимулирует синтез и секрецию кортикотропин-релизинг фактора (КРФ). КРФ впервые был выделен и описан в 1981 году. Было показано, что этот пептид, состоящий из 41 аминокислотного остатка, способен вызывать секрецию АКТГ и (5-эндорфина в культуре клеток переднего гипофиза крыс. В настоящее время известно, что КРФ имеет два вида рецепторов - КРФ-Р1 и КРФ-Р2. Рецепторы первого типа расположены преимущественно в переднем и среднем гипофизе, а рецепторы второго типа - в неокортексе, мозжечке, вентромедиальном гипоталамусе и в очень небольшом количестве в переднем гипофизе [Engler et al, 1999]. КРФ, поступая в переднюю долю гипофиза, взаимодействует с КРФ-Р1, который, как и все мембранные рецепторы, связанные с G5 белками, стимулирует продукцию сАМР, что приводит к увеличению протеолиза ПОМК и выбросу АКТГ. КРФ является главным фактором вызывающим выброс АКТГ, но синтез этого гормона может повышаться в ответ и на действие вазопрессина, окситоцина, норадреналина, хотя и в меньшей степени [Owens, Nemeroff, 1991].

Образование АКТГ в основном происходит в хромофильных клетках, преимущественно локализованных в центральной зоне передней доли гипофиза [Афанасьев и др., 1999]. Из гипофиза АКТГ с током крови поступает в кору надпочечников и вызывает выброс глюкокортикоидов, которые осуществляют метаболические эффекты, помогающие организму справиться со стрессом, например стимулируют катаболизм белков и глюконеогенез. Глюкокортикоиды по принципу обратной связи тормозят синтез КРФ, ПОМК и АКТГ, и выделение этих гормонов возвращается к своему базовому уровню [Афанасьев и др., 1999].

Глюкокортикоиды способны тормозить синтез и выброс АКТГ, вызванные КРФ или цАМФ, но они не могут влиять (или влияют, но в небольшой степени) на базовый уровень АКТГ [Shipston, 1995]. У мышей с полным отсутствием КРФ, несмотря на пониженную концентрацию глюкокортикоидов, базовый уровень АКТГ в крови был нормальным, однако при стрессе этот уровень не изменялся [Muglia et al, 1995].

НЕРВНЫЙ ИМПУЛЬС

V V

ПАРАВЕНТРИКУЛЯРНЫЕ ЯДРА ГИПОТАЛАМУСА

Т синтез КРФ Т выбсос КРФ V

ПЕРЕДНИЙ ГИПОФИЗ

Т протеолиз ПОМК Т выбсос АКТГ V

НАДПОЧЕЧНИКИ о

ГЛЮКОКОРТИКОИДЫ

Различные виды стрессирующих воздействий вызывают неодинаковое повышение выброса АКТГ в кровь. При применении пяти различных стрессогенных факторов: иммобилизации, понижении внешней температуры до

-3 °С, болевого шока (подкожное введение 1% и 4% формалина) и гипогликемии (введение инсулина),- уровень АКТГ в плазме существенно различался. Наибольший выброс гормона происходил при иммобилизации животных. Концентрация АКТГ в артериальной крови составляла примерно 63000 пг/мл, в то время как у контрольных животных значение этого показателя составляло 2000 пг/мл. Наименьшие изменения содержания АКТГ в крови наблюдались при холодовом стрессе (концентрация гормона практически не отличалась от контрольных значений). Таким образом, при воздействии различных стрессогенных факторов концентрация АКТГ в крови может различаться более чем в 20 раз [Pacak, Palkovits, 2001].

Глюкокортикоиды - не единственные вещества, способные ингибировать синтез и выделение АКТГ. В 1983 году из гипоталамической ткани было выделено вещество, способное подавлять выделение кортикотропина. Оно было названо кортиконтропин-ингибитор фактором (КИФ). Внутривенное введение этого вещества значительно понижало содержание АКТГ в крови в ответ на болевое раздражение спустя 20 минут после введения. Позже было обнаружено, что КИФ не только подавляет секрецию АКТГ в ответ на физиологическую стимуляцию, но и влияет на его базовый уровень. Действие этого фактора на культуру клеток переднего гипофиза крысы понижало базовый уровень секреции АКТГ примерно на 48 %. В настоящее время известно, что КИФ способен снижать выделение КРФ и аргинин вазопрессина, а также подавлять экспрессию гена ПОМК, влияя на генную транскрипцию и, возможно, трансляцию. Показано, что действие КИФ осуществляется через специфические рецепторы переднего гипофиза. Эти рецепторы представляют собой семидоменные трансмембранные белки, связанные с одним или несколькими G-белками [Engler et al, 1999].

АКТГ-содержащие нейроны обнаружены не только в гипофизе, но и непосредственно в тканях мозга [Tonnaer et al, 1982]. АКТГ-содержащие нейроны локализованы в вентромедиальной части гипоталамуса на уровне аркуатного ядра и, в меньшей степени, в дорсальном гипоталамусе и амигдале. Гипоталамические нейроны образуют сеть разветвленных волокон, проникающих в различные структуры головного мозга. Самая высокая концентрация АКТГ обнаружена в медиальной субстанции. Эта область расположена в переднем перевентрикулярном гипоталамусе, от которого начинается гипофизарный портальный тракт, подходящий к передней доле гипофиза. Другие нервные волокна идут в амигдалу и лимбическую систему к околоводопроводному серому веществу, тегментуму, голубому пятну, гиппокампу и неокортексу. В мозге крыс высокие концентрации АКТГ обнаружены в нижних ядрах ствола мозга, околоводопроводном сером веществе, дорсальном ядре шва. Средние концентрации обнаружены в голубом пятне, парабронхиальных ядрах, большом ядре шва и ядре солитарного тракта. Предполагается, что АКТГ вырабатывается в ядре солитарного тракта, а в ретикулярную формацию поступает от нейронов гипоталамуса и продолговатого мозга [Глебов, Горячева, 1990].

По некоторым данным, при введении и, по-видимому, при эндогенном выбросе кортикотропин циркулирует в крови 3-5 минут, быстро захватывается тканями и разрушается [Sydnor, Sayers, 1953]. Деградация молекулы АКТГ начинается с N-конца, причем уже через 1 минуту после внутривенного введения гормона 50 % метки определяется в коже и мышцах, меньшее количество - в плазме, почках, кишечнике и печени. В коже и мышцах уже в этот период содержатся, главным образом, метаболиты АКТГ, а через 5 минут -во всех тканях обнаруживаются только фрагменты этого гормона [Ambler et al, 1982]. Однако по данным других авторов, повышенное содержание АКТГ в плазме крови сохраняется в течение нескольких часов после введения экзогенного гормона [Allen et al, 1974; Nicholson et al, 1978]. При этом меченый АКТГ регистрируется в спиномозговой жидкости, однако его концентрация там в 100 раз ниже, чем в плазме. Эти данные свидетельствуют о том, что АКТГ очень плохо проникает через гематоэнцефалический барьер. При системном введении только 1-2% гормона проникает в мозг [Mezey, 1978; Nicholson et al, 1978].

Рецепторы меланокортинов

Впервые рецепторы меланокортинов (МС) были клонированы 1992-1993 годах [Wikberg, 1999]. Различают пять подтипов данных рецепторов (МС1

МС5), которые способны взаимодействовать с разными меланокортинами, но при этом каждый подтип имеет большее сродство к какому-то определенному пептиду. Подтипы рецепторов различаются по аминокислотному составу. Наиболее схожи МС4 и МС5 рецепторы - их структуры одинаковы на 60%. Аминокислотный состав МС1 и МСЗ совпадает на 45%, а состав МС2 и МС4 -лишь на 38%. Рецептор меланокортинов относится к семи доменным трансмембранным белкам. Он имеет короткие С- и N-концы и небольшую вторую внеклеточную петлю [Schioth et al, 1998]. Все подтипы рецептора имеют несколько участков, способных к N-гликозилированию, и содержат цистеин на С-конце молекулы, который используется для ацетилирования жирных кислот и удержания рецептора в мембране клетки. Рецепторы меланокортинов связаны с G-белками, их действие осуществляется через активацию цАМФ или через фосфоинозитольный путь, описанный для МСЗ рецепторов [Wikberg et al, 2000]. Поскольку МС рецепторы имеют 7 гидрофобных участков, их разделяют на 7 сегментов: ТМ1-ТМ7. У всех подтипов рецепторов наиболее схожи сегменты ТМ1, ТМЗ и ТМ7, а самая низкая гомология наблюдается у сегментов ТМ4 и ТМ5. Это связано с тем, что ТМ4 и ТМ5 не участвуют в связывании с лигандом. Считается, что связующий центр рецептора состоит из двух доменов, расположенных рядом друг с другом. Один домен - это сегменты ТМ1, ТМ2 и ТМЗ, а другой домен - это ТМ7 и, возможно, ТМ6 [Schioth et al, 1998].

Существует природный антагонист МС рецепторов - агоути-протеин [Miller et al, 1993]. Это вещество было описано, как белок способный контролировать кожную пигментацию. Молекула агоути-протеина грызунов состоит из 131 аминокислоты, имеет гидрофобную сигнальную последовательность и экспрессируется только в коже. У человека агоути-протеин близок по строению к агоути-протеину грызунов, но более широко распространен. Он синтезируется в жировой ткани, семенниках, яичниках, сердце, нижних слоях кожи, почках и печени. Агоути-протеин является конкурентным антагонистом рецепторов меланокортинов. У него высокое сродство к МС1и МС4 рецепторам. Он также связывается с МСЗ, но с более низкой аффинностью, и с МС5 с еще более низким сродством [Dinulescu, Cone, 2000].

MCI рецепторы

Впервые MCI рецепторы были обнаружены в клетках меланомы [Chhajlani, Wikberg, 1992], но позже было показано, что они присутствуют и в мембранах нормальных меланоцитов млекопитающих [Loir, 1999]. Однако уровень экспресии МС1 рецепторов в меланоцитах в большинстве случаев был в 10-20 раз ниже, чем в злокачественных клетках [Loir, 1999]. Спустя некоторое время МС1 рецепторы были обнаружены в клетках других типов: нейронах ЦНС крыс и человека, клетках желтого тела, плаценты, фибробластах, клетках глиомы и астроцитах [Wikberg et al, 2000].

MCI рецепторы контролируют способность меланоцитов выделять пигмент меланин. Опыты показали, что активация рецепторов приводит к увеличению черно-коричневой пигментации животных, а уменьшение рецепторной активности к увеличению красно-желтой пигментации [Wikberg et al, 2000]. У человека активация МС1 рецепторов приводит к появлению загара. Увеличение ультрафиолетовой радиации вызывает повышение синтеза а-МСГ и АКТГ в эпидермисе, они связываются с МС1 рецепторами и, как следствие, повышается пигментация кожи [Wakamatsu et al, 1997]. Мутации MCI рецепторов могут приводить к нарушению их функций и появлению людей со светлой кожей различной степени и низкой способностью к загару [Healy et al, 2000].

В человеческом эпидермисе были обнаружены различные меланокортины, взаимодействующие с МС1 рецепторами: АКТГ^ю, АКТГ^п, АКТГ1.39, а-МСГ. Их способность связываться с данным подтипом рецепторов не одинакова и выражается следующим образом: АКТГ1.17>а-МСГ>АКТГ1.з9>АКТГ1.ю [Wakamatsu et al, 1997]. Следует отметить, что наряду с меланокортинами, некоторым сродством к МС1 рецепторам обладает ТРФ (тиреотропин-рилизинг-факгор) - гормон гипоталамуса, контролирующий выброс тиреоидных гормонов из щитовидной железы [Schioth et al, 1999].

МС2 рецепторы

В отличие от других подтипов МС рецепторов, которые способны связываться с различными меланокортинами, МС2 рецепторы взаимодействуют исключительно с АКТГ [Schioth et al, 1996]. Основная функция данных рецепторов - это регуляция выброса глюкокортикоидов из коры надпочечников. Большое количество этих рецепторов было найдено в коре надпочечников, причем именно в тех зонах, где осуществлялась продукция глюкокортикоидов [Xia, Wikberg, 1996]. Кроме того, мРНК МС2 рецепторов была обнаружена в коже человека [Slominski et al, 1996] и в адипоцитах мышей [Boston, Cone, 1996]. А поскольку адипоциты грызунов содержат МС2 рецепторы, то существует предположение, что липолиз, вызванный стрессом, осуществляется именно через этот подтип меланокортиновых рецепторов [Boston, 1999]. У людей же липолиз, вызванный стрессом, осуществляется через другие механизмы, поскольку адипоциты человека не содержат МС2 рецепторы и не совершают липолиз под действием АКТГ [Bousquet-Melou et al, 1995]. У цыплят МС2 рецепторы были обнаружены в селезенке и надпочечниках [Takeuchi et al, 1998], что говорит об увеличении функций этих рецепторов у птиц по сравнению с млекопитающими и о том, что один и тот же подтип рецептора может проявлять различные свойства у отдаленных видов.

Мутации гена, кодирующего МС2 рецепторы, часто вызывают ослабление рецепторных функций, что приводит к наследственной глюкокортикоидной недостаточности [Elias et al, 1999]. Однако иногда этот синдром проявляется у людей с нормальным МС2-геном, что говорит о существовании других нарушений, приводящих к этому заболеванию [Huebner et al, 1999].

МСЗ рецепторы

МСЗ рецепторы были обнаружены в мозге, плаценте, кишечнике, тимусе и сердце млекопитающих [Wikberg et al, 2000]. У птиц эти рецепторы не встречаются в мозге, зато они обнаружены в надпочечниках [Takeuchi, Takahashi, 1999]. Наибольшее количество рецепторов находится в ЦНС, особенно .в гипоталамусе и лимбической системе, также они встречаются в гиппокампе, таламусе и среднем мозге. Установлено, что в течение онтогенеза крыс экспрессия МСЗ рецепторов в ЦНС подвергается изменениям: при рождении экспрессия довольно низкая, затем она возрастает в течение 21 дня и далее остается неизменной [Xia, Wikberg, 1997]. Существует предположение, что большое распространение рецепторов в ЦНС говорит об их пресинаптическом расположении [Wikberg et al, 2000]. Кроме того, показано, что большое количество этих рецепторов находится в клетках аркуатного ядра, которое известно, как место продукции ПОМК [Roselli-Rehfuss et al, 1993]. На основании этого можно предположить, что МСЗ рецепторы функционируют как ауторецепторы и контролируют выброс меланокортинов из ПОМК-нейронов [Wikberg et al, 2000].

Как и большинство других рецепторов меланокортинов, МСЗ рецепторы способны связываться с различными МС пептидами, но наибольшее сродство они проявляют к у-МСГ [Wikberg et al, 2000].

Физиологические функции МСЗ рецепторов пока слабо изучены, однако существуют данные, что возможно они связаны с контролем полового поведения [Wikberg et al, 2000]. Изучение мутаций гена данного рецептора также не выявило его функций, поскольку мутации не были связаны фенотипическими характеристиками [Li et al, 2000].

МС4 рецепторы

МС4 рецепторы были обнаружены во многих областях мозга млекопитающих, включая кортекс, таламус, гипоталамус, ствол, спиной мозг. Распределение МС4 рецепторов в мозге даже более разнообразно, чем МСЗ рецепторов [Wikberg, 1999]. Кроме мозга, было исследовано еще 20 различных органов человека и показано, что в периферических органах МС4 рецепторы отсутствуют [Chhajlani, 1996]. Однако позже другие ученые установили, что МС4 рецепторы могут присутствовать в жировой ткани, что говорит о их возможной роли в регуляции веса [Chagnon et al, 1997]. В отличие от млекопитающих, у птиц МС4 рецепторы встречаются во многих периферических органах [Takeuchi, Takahashi, 1998].

МС4 рецепторы появляются в эмбриональном мозге задолго до МСЗ рецепторов. Они были обнаружены в эмбрионах крыс на 18 день, в то время как МСЗ рецепторы еще отсутствовали [Kistler-Heer et al, 1998]. Во время развития эмбриона эти рецепторы активно экспрессируются в нервной системе, что говорит об их возможном участии в развитии нервной системы [Wikberg et al, 2000].

Были изучены некоторые мутации гена, кодирующего последовательность МС4 рецептора, и показано, что нарушение активности рецептора приводит к развитию наследственных форм ожирения. Интересно, что некоторые мутации присутствовали как у тучных, так и у нормальных людей [Hinney et al, 1999].

Инактивация гена МС4 рецепторов у мышей приводит к выраженному увеличению потребления пищи и как следствие к увеличению веса тела [Huszar et al, 1997].

Основной функцией МС4 рецепторов является контроль веса тела и регуляция пищевого поведения [Wikberg, 1999]. Однако центральные МС4 рецепторы могут быть также вовлечены в регуляцию других эффектов МСГ-пептидов. В частности, есть предположения, что чрезмерный груминг и некоторые виды стереотипического поведения (синдром потягивания-зевания), вызванные введением АКТГ и а-МСГ, осуществляются именно через МС4 рецепторы [Wikberg et al, 2000].

МС4 рецепторы проявляют не одинаковое сродство к различным меланокортинам, которое выражается следующим образом: (3-МСГ>а-МСГ>у-МСГ. В литературе, к сожалению, очень мало данных о связывании АКТГ с МС рецепторами, однако, по всей вероятности, этот пептид способен взаимодействовать со всеми подтипами рецепторов меланокортинов [Wikberg et al, 2000].

МС5 рецепторы

Большое количество МС5 рецепторов было обнаружено в мозге млекопитающих и в периферических органах и тканях: надпочечниках, жировых клетках, почках, печени, легких, лимфоидной ткани, тимусе, грудных железах, семенниках, яичниках, матке, пищеводе, желудке, костном мозге, коже, скелетных мышцах и экзокринных железах (слезных, семенных, препунциальных, простате) [Wikberg et al, 2000]. Интересно, что эти рецепторы встречаются в скелетных мышцах мышей, но отсутствуют у крыс [van der Kraanet al, 1998].

У животных с дисфункцией МС5 рецепторов была понижена продукция сала из сальных желез, что приводило к затруднению отталкивания воды мехом и нарушению терморегуляции [Chen, 1997]. Есть данные, что МС5 рецепторы расположены на ацинарных клетках секреторного эпителия слезных желез, что говорит об их возможной роли в регуляции секреции слез [van der Kraan, 1998]. Кроме того, показано, что липолиз в адипоцитах, вызванный а-МСГ, осуществляется через МС5 рецепторы [Boston, 1999]. Есть также данные, что МС5 рецепторы принимают участие в физиологической регуляции стероидного гомеостаза [Wikberg et al, 2000].

Из всех меланокортинов МС5 рецепторы предпочтительнее связываются с а-МСГ, а наименьшее сродство они проявляют к у-МСГ [Wikberg et al, 2000].

Негормональные эффекты меланокортинов

Первые данные по влиянию АКТГ на поведение животных были получены в середине 50-х годов [Mirsky et al,. 1953; Murphy, Miller, 1955]. С тех пор было показано, что наряду со способностью оказывать действие на меланоциты и выброс глюкокортикоидов, меланокортины могут влиять на внимание и память, способность к обучению, моторные функции, половое поведение, потребление пищи, регенерацию нервной ткани и оказывать противовоспалительное действие [De Wied, Jolles, 1982; Wikberg, 1999; Strand, 1999]. В начале было высказано предположение о том, что некоторые из этих эффектов опосредованы через кору надпочечников и являются составной частью гормонального действия АКТГ. Однако вскоре выяснилось, что экстирпация надпочечников не приводит к исчезновению влияния АКТГ на поведение [Bohus et al, 1968; Miller, Ogawa, 1962]. Позже были обнаружены пять рецепторов меланокортинов [Wikberg, 1999] и доказано, что гормональные эффекты АКТГ осуществляются только через МС2 рецепторы [Schioth, 1996], а действие меланокортинов на другие функции организма, в том числе поведение, может иметь различные механизмы и осуществляться через другие подтипы рецепторов.

Влияние меланокортинов на обучение и память

Обучение и память являются существенной потребностью для любого животного. Эти функции помогают организму адаптироваться к изменениям окружающей среды. Любое воздействие, стимул или химический агент могут привести к физиологическому сбою или патологическим изменениям, поэтому адаптация к изменениям условий жизни необходима для выживания организма. В литературе встречаются многочисленные данные о влиянии меланокортинов на процесс обучения [De Wied, Jolles, 1982]. Большинство пептидов этого класса способно оказывать ноотропное действие — ускорять обучение, улучшать внимание и память.

Первые данные по влиянию АКТГ на обучение и память животных были получены в середине 50-х годов [Mirsky et al. 1953; Murphy, Miller, 1955]. В дальнейшем De Wied и его сотрудники исследовали влияние АКТГ и его фрагментов на обучение животных. Было показано, что удаление передней доли гипофиза приводит к нарушению выработки рефлекса активного избегания [De Wied, 1964]. Введение АКТГ нормализовало обучение животных. Кроме того, АКТГ улучшал обучение и у интактных животных [Bohus, Endroczi, 1965]. Авторы предположили, что этот эффект является составной частью гормонального действия АКТГ. Однако позже выяснилось, что это не так, поскольку отсутствие надпочечников у животных не приводило к исчезновению ноотропного действия пептида [Bohus et al, 1968]. Было также показано, что аналогичным действием на обучение обладают а- и (5-МСГ, хотя они содержат лишь часть аминокислотной последовательности АКТГ и проявляют низкую кортикотопную активность [Bohus, De Wied, 1966; De Wied, 1966; De Wied, 1969]. He смотря на это, не следует полностью отвергать влияние глюкокортикоидов на формирование памяти животных. Введение гормонов коры надпочечников гипофизэктомиованным крысам улучшает их способность к выработке навыка [De Wied, 1964], однако, поскольку адреналэкгомия не оказывает влияния на обучение [De Wied, 1969], то можно заключить, что АКТГ и глюкокортикоиды разными путями влияют на формирование навыка. При этом АКТГ стимулирует обучение более специфическим путем, чем гормоны коры надпочечников, которые, по-видимому, вызывают общее повышение уровня активности [Miller, Ogawa, 1962; Bohus, Lissak, 1968; Weiss et al, 1970; Bohus, 1974].

Имеющиеся в литературе данные по влиянию АКТГ и МСГ на выработку условных рефлексов не однозначны. В одних работах показано, что у интактных животных эти гормоны улучшают выработку рефлексов с болевым подкреплением [Beaty et al, 1970; Bohus,Lissak, 1968; Van Wimersma Greidanus, 1980], в других - не обнаружено влияние АКТГ на способность животных избегать болевой раздражитель [Murphy, Miller, 1955; Kelsey, 1975], в третьих -показано негативное действие фрагментов АКТГ на обучение животных с отрицательным подкреплением [Izquierdo, Dias, 1983]. Ввнутрибрюшинное введение АКТГЬ24 в дозах 0,2 и 2 мкг/кг оказывало разнонаправленное действие на обучение животных в зависимости от условий тестирования. В первой части эксперимента при выработке условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ) использовалась приподнятая на 5 см платформа (25x25 см), на пол установки подавалось постоянное напряжение 0,5 шА. Контрольные животные хорошо обучались, а введение АКТГ1.24 ухудшало обучение животных, причем этот эффект пептида снимался налоксоном. Во второй серии экспериментов использовалась платформа меньшей площади (7x25 см) и подавался переменный ток силой 0,3 шА. В данном случае контрольные животные обучались плохо, АКТП.24 улучшал обучение животных, а налоксон потенциировал ноотропный эффект пептида. Интересно, что совместное введение АКТГ1.24 и р-эндорфина приводило к ухудшению обучения [Izquierdo, Dias, 1983]. По-видимому, неоднозначность эффектов АКТГ при обучении животных в тестах с отрицательным подкреплением может быть связана с различным уровнем эндогенного АКТГ, в значительной степени зависящего от условий эксперимента.

Исследования влияние АКТГ и МСГ на выработку рефлексов с положительным подкреплением однозначно демонстрируют улучшающий эффект [Sandman et al, 1969; Guth et al, 1971; Stratton, Kastin, 1975; Garrud et al, 1974; Kastin et al, 1975]. В литературе также встречается множество данных о положительном действии АКТГ и МСГ на сохранение и угашение предварительно выработанных рефлексов. Торможение угашения под действием этих гормонов наблюдалось в самых различных модификациях опытов: в тестах активного [De Wied, 1966; Nyakas, Endroczi, 1980] и пассивного избегания болевого раздражителя [Dempsey et al, 1975; Levine, Jones, 1965; Mc Gaught et al, 1975; Wiegant, Gispen, 1977], с пищевым [Gray, 1977] и половым [Bohus, 1975] подкреплением, в тестах, основанных на вкусовом отвращении [Levine et al, 1977; Smotherman, Levine, 1978].

Более выраженное действие АКТГ на сохранение навыка по сравнению с его действием на выработку рефлексов, по-видимому, связано с тем, что во время обучения возникает стрессорная реакция и наблюдается выброс эндогенного АКТГ, что не дает возможности проявиться эффектам экзогенного гормона. Во время угашения рефлекса уровень эндогенного АКТГ ниже и на таком фоне заметно действие введенного извне гормона.

Исследование зависимости эффектов АКТГ от дозы показало, что малые дозы гормона улучшают, а высокие - ухудшают сохранение и воспроизведение предварительно выработанного навыка [Sands, Wright, 1979; Gold, Van Buskirk, 1976]. В работах нашей лаборатории было показано, что внутрибрюшинное введение крысам 0,15 мг/кг гормона за 5 минут или сразу после сеанса обучения в Т-образном лабиринте приводило к ускорению выработки навыка. При увеличении дозы до 0,5 мг/кг эффекты пептида изменялась: при введении за 5 минут наблюдалось торможение выработки, а при введении непосредственно после эксперимента влияния на обучение не наблюдалось [Антонова и др., 1988]. Введение оптимально действующих доз через 2 часа после обучения также не оказывало влияния на сохранение навыка [Gold, Van Buskirk, 1976]. Таким образом, эффекты АКТГ на обучение зависят от дозы и времени введения гормона.

Исследования зависимости структура-активность показали, что минимальным фрагментом, сохраняющим поведенческие эффекты целой молекулы АКТГ при полной потере гормональных свойств, является пептид АКТГ4.ю, который так же активен, как и целая молекула АКТГ. Несколько меньшей активностью обладает тетрапептид АКТГ4.7 (Met-Glu-His-Phe) [De Wied et al., 1975]. По данным некоторых авторов более короткий фрагмент гормона АКТГ5.7 (Glu-His-Phe) также оказывает действие на поведение животных, но его эффекты слабо выражены [De Wied et al., 1975; Greven, De Wied, 1973]. Остаток Phe в позиции 7 играет ключевую роль в проявлении поведенческих эффектов фрагментов АКТГ. Замена этой аминокислоты на D-энантиомер в АКТГ мо, АКТГ4.10 или АКТГ4.7 приводила к появлению противоположного эффекта замедлению выработки условной реакции избегания [Ашмарин и др., 1980; Garrud et al., 1974]. Аналоги (D-Phe7) АКТГ также способствовали угашению ранее выработанных условных реакций [Garrud et al., 1974].

Проведено много исследований по влиянию различных фрагментов АКТГ на процессы обучения. Так, было показано, что АКТГыо и АКТГ4.10, фрагменты, лишенные гормональной активности, влияют на обучение гипофизэктомированных животных также хорошо, как и АКТГ^, сохраняющий гормональную активность [De Wied, 1969]. Более поздние эксперименты показали положительное влияние фрагментов АКТГ на выработку условного рефлекса активного избегания (УРАИ) у интактных животных. АКТГ4.ю, вводимый подкожно за час до начала опыта, повышал число избеганий в челночной камере [Bohus, De Wied, 1981]. Другие фрагменты АКТГ (АКТГ4.7 и АКТГ5.10) также ускоряют выработку условного рефлекса [Виноградов, Медведев и др, 1980]. Причем более активным из исследованных пептидов является АКТГ4.7. Есть данные, что пептиды - фрагменты АКТГ способны оказывать облегчающее влияние и на выработку УРПИ. Так, улучшение запоминания было продемонстрировано при введении АКТГ4.7 или АКТГ4.10 за час до проверки сохранения рефлекса [Greven, De Wied, 1973]. В другом опыте проводили сравнительное исследование действия АКТГ и его фрагмента АКТГ4. ю на обучение крыс в тесте УРПИ при подкожном введении. Вещества вводились за 20 минут до начала эксперимента в дозах 10, 20 или 40 мкг/крыса (АКТГ) и 5, 10 или 20 мкг/крыса (АКТГ4.ю). Было показало, что введение обоих пептидов дозозависимо улучшало выработку условного рефлекса [Kumar, Karanth, 1995].

Фрагменты АКТГ положительно влияют на приобретение поведенческих навыков, основанных на положительном подкреплении. Показано, что пептиды, содержащие последовательность АКТГ4ю, заметно ускоряют выработку рефлекса в тестах с пищевым подкреплением [Kastin et al, 1975; Вознесенская, Полетаева, 1984]. В работах нашей лаборатории было показано, что введение фрагментов АКТГ4.ю сразу после сеансов обучения в Т-образном лабиринте с пищевым подкреплением приводит к ускорению обучения [Ашмарин, Каменский, Шелехов,1978].

Некоторые авторы полагают, что оценивать влияние различных препаратов на обучение в тестах с использованием животных довольно сложно, поскольку в данном случае могут быть задействованы различные поведенческие реакции. Опыты, проводимые на людях-добровольцах, позволяют более точно интерпретировать данные. Было показано, что АКТГ и МСГ повышают внимание и положительно влияют на способность выполнять повторяющиеся задания. Интересно, что введение АКТГ и МСГ улучшали различные нейрофизиологические тесты у всех испытуемых, кроме пожилых [Zager, Black, 1985]. Изучение влияния фрагментов АКТГ в опытах, проводимых на людях, также показало положительное действие пептидов на память человека. Так фрагмент АКТГ1.17 улучшал кроткосрочную память у людей через 5 минут после введения. Одновременно с этим у испытуемых было зарегестрировано повышение уровня кортизола в плазме крови, увеличение систолического и диастолического давления, а несколько позже (через 20 и 40 мин после инъекции) уменьшение уровня тревожности. На основании этих данных авторы делают вывод, что влияние АКТГ^п на кроткосрочную память связано с центральным действием пептида [Pancheri et al, 1984].

До сих пор неясно, какой из рецепторов принимает участие в ноотропном, нейротрофическом и нейропротекторном действии меланокортинов. Наиболее вероятными кандидатами являются МСЗ, МС4 и МС5 рецепторы, поскольку они экспрессируются в мозге и периферических тканях [Hoi et al, 1995]. Однако в литературе встречаются данные, противоречащие этому предположению. Так однократное (1мг) или хроническое (1мг ежедневно в течение 6 недель) интраназальное введение АКТГмо людям сильно улучшало краткосрочную амять. Кроме этого пептида, ученые использовали дезацетил-а-МСГ, пептид, способный с высокой степенью аффинности связываться со всеми типами МС рецепторов, находящихся в мозге. Опыты показали, что дезацетил-а-МСГ менее эффективно улучшал показатели памяти. Это говорит о том, что механизм ноотропных эффектов меланокортинов связан не только с МС рецепторами [Smolnik et al, 2000].

Нейротрофические эффекты меланокортинов С помощью электрофизиологических, морфологических, биохимических и функциональных тестов было показано, что введение меланокортинов при повреждениях или патологиях периферической нервной системы ускоряет регенерацию нервных волокон и положительно влияет на восстановление мышечной иннервации [Strand et al, 1993]. Так введение АКТГ крысам после разрушения периферических нервов значительно ускоряло восстановление чувствительности и двигательных функций организма по сравнению с контрольными животными. Действие АКТГ сохранялось и у адреналэктомированных животных, что говорит о негормональной природе этого эффекта [Strand, Kung, 1980].

Изучение действия АКТГ/МСГ-пептидов на развитие нервно-мышечной системы показало, что АКТГ4.ю и а-МСГ положительно влияют на рост и созревание мышечных и нервных волокон как в эмбриональный, так и в постнатальный период. Следует отметить, что данные пептиды также способны непосредственно влиять на рост и развитие мышечной ткани, но только в ранний эмбриональный период. Введение пептидов на более поздних сроках беременности влияло только на рост и созревание нервных волокон, а ускорение развития мышечной системы происходило за счет увеличения иннервации мышц. В течение первых двух недель жизни крыс введение фрагментов АКТГ или а-МСГ ускоряло дальнейшие созревание нервно-мышечной системы. Восприимчивость нервно-мышечной системы к АКТГ/МСГ-пептидам исчезало, когда ее развитие завершалось [Strand et al, 1993].

МСГ-пептиды также способны оказывать положительное действие на восстановление функций организма при различных повреждениях центральной нервной системы. Было показано, что АКТГ способен ускорять восстановление поврежденного гиппокампа, но не неокортекса, и нормализовать поведение животных после повреждения или трансекции свода [Antonawich et al, 1994].

Нейротрофическое действие меланокортинов было показано на животных с нарушением дофаминэргической (ДА) системы. После разрушения черной субстанции мозга у крыс наблюдались признаки, характерные для болезни Паркинсона (нарушения поведения и расстройства моторных функций).

Восстановление всех этих функций значительно ускорялось при введении меланокортинов [Strand et al, 1993].

АКТГ и МСГ пептиды играют позитивную роль при восстановлении моторных функций животных после повреждения мозга. Опыты, проведенные на обезьянах [Igaraski et al, 1985] и лягушках [Luneburg, Flohr, 1988], показали, что восстановление чувства равновесия после лабиринтэктомии проходило быстрее у тех животных, которым вводили фрагменты АКТГ (АКТГ4.7, АКТГ4.10, АКТГ м о) или а-МСГ.

Опыты, проведенные in vitro, показали, что развитие серотонинэргической системы очень восприимчиво к действию АКТГ-пептидов. Добавление различных фрагментов АКТГ в культуру серотонинэргических нейронов стимулировало созревание этих клеток и приводило к увеличению числа нервных отростков [Azmitia, De Kloet, 1987].

Изучение действия синтетического антагониста а-МСГ, [D-Trp7,Ala8,D-Phe10]a-MCr6jj, в течение первых 10 дней после разрушения седалищного нерва показало, что введение этого пептида значительно замедляло восстановление функции организма. Это свидетельствует, что эндогенные МСГ пептиды участвуют в регенерации нервной ткани и стимулируют рост нервных волокон [Plantinga et al, 1995].

Действие меланокортинов на сердечно-сосудистую систему В конце 80-х годов было показано, что меланокортины могут оказывать действие на кардиоваскулярную систему. Так, у-МСГ проявлял прессорные эффекты, повышал церебральный кровоток и частоту сердечных сокращений (ЧСС) при внутривенном введении [Gruber, Callahan, 1989]. Введение в желудочки мозга у-МСГ также вызывало длительное повышение артериального давления [Sun et al, 1992] . Однако эти эффекты не снимались введением блокатора МСЗ и МС4 рецепторов SHU9119 и, следовательно, не были связаны с рецепторами этого типа. Есть предположения, что действие у-МСГ на кардиоваскулярную систему опосредуется через центральный механизм, не связаный с известными видами МС рецепторов. Возможно, структуры, ответственные за кардиоэффекты у-МСГ, находятся в областях близких к третьему желудочку, поскольку повреждение этих областей приводит к снижению прессорных эффектов у-МСГ [Wikberg, 2000]. Есть данные, что эффекты у-МСГ на сердечно-сосудистую систему, хотя бы частично, связаны с активацией симпатической системы в сосудах и сердце [Versteeg et al, 1998]. В пользу этой точки зрения говорят исследования влияния блокаторов адренорецепторов на кардиоваскулярные эффекты у-МСГ. Предварительное введение антагониста pi-адренорецепторов, метопролола, уменьшало влияние у-МСГ на сердечный ритм, но не влияло на артериальное давление. Предварительное же введение антагониста а 1-адренорецепторов, празоцина, напротив снимало эффект у-МСГ на артериальное давление, но не на частоту сердечных сокращений. Таким образом, эффекты у-МСГ связаны с повышением симпатической активности, что в свою очередь приводит к увеличению активности а 1-адренорецепторов в сосудах и (И -адренорецепторов в сердце. Авторы также полагают, что действие у-МСГ может осуществляться и через центральную систему вазопрессина, поскольку внутрижелудочковое введение антагониста VIA рецепторов приводит к уменьшению эффектов у-МСГ на сердечно-сосудистую систему [Van Bergen et al, 1997].

В отличие от у-МСГ, внутривенное введение АКТП.24 вызывает понижение артериального давления, что сопровождается рефлекторной тахикардией. Однако более короткие пептиды, например АКТГ4.10, оказывают прессорное действие при периферическом введении, но их эффекты в 5-10 раз слабее, чем эффекты у-МСГ [Van Bergen et al, 1995]. Авторы полагают, что для вазопрессорного и тахикардического действия необходима последовательность His-Phe-Arg-Trp, расположенная близко к С-концевой области молекулы пептида.

Центральное введение а-МСГ и АКТГ вызывало выраженный гемодинамический эффект - увеличивалось артериальное давление. Этот эффект блокировался внутрижелудочковым введением агоути-протеина, антагониста МС рецепторов [Dunbar, Lu, 2000]. Таким образом, эффекты а-МСГ и АКТГ на кардиоваскулярную систему, в отличие от у-МСГ, осуществляются через МС рецепторы (возможно МС4) [Wikberg, 2000]. а-МСГ и некоторые фрагменты АКТГ (АКТГ1.24, АКТГ116 и АКТГ4-ю) проявляют восстанавливающее действие при экспериментальном геморрагическом шоке. Введение этих пептидов нормализует сердечный выброс и другие параметры сердечно-сосудистой системы, что приводит к увеличению времени жизни животного после острой кровопотери. Этот эффект АКТГ и МСГ- пептидов возможно связан с подавлением сверхпродукции фактора некроза опухоли-а (TNF-а) при шоке. Было показано, что при кровопотере у крыс сильно повышается уровень TNF-a в крови, который в норме отсутствует. АКТГ 1.24 выраженно понижает этот уровень и восстанавливает кардиоваскулярные функции [Wikberg, 2000].

Влияние меланокортинов на иммунную систему

В начале 1980-х годов появились сообщения о том, что центральное введение АКТГ1.24 и a-МСГ приводит к гипотермии и понижает уровень пирогенов, возросший при воспалении [Lipton, Glyn, 1980; Glyn, Lipton, 1981]. Связь между меланокортинами и иммунной системой стала окончательно ясна в 1985 году после открытия способности a-МСГ снимать воспаление, подавлять развитие кожной гиперчувствительности, понижать жар и влиять на другие факторы, вызванные действием интерлейкина-1 (5 [Daynes et al, 1987; Rheins et al, 1989]. Таким образом, стало понятно, что меланокортины играют важную роль в регуляции иммунной системы. Например, а-МСГ оказывает сильный эффект при экспериментальном воспалении печени, возникшем в результате введения эндотоксина. После инъекции пептида резко снижается количество нейтрофилов и моноцитов и уменьшается число плазматических маркеров нарушения печени [Chiao et al, 1996].

Действие меланокортинов на иммунную систему может осуществляться различными путями. Многие клетки иммунной системы содержат МС1 рецепторы. Это справедливо для нейтрофилов, макрофагов и моноцитов. В норме моноциты человека содержат небольшое количество МС1 рецепторов, которое возрастает при активации клеток различными агентами, такими как липополисахариды или комбинация цитокинов [Bhardwaj et al, 1997]. Для изучения механизмов действия меланокортинов на иммунную систему были исследованы эффекты селективных агонистов МС1 рецепторов: MS05 и MS09.

Оба этих вещества понижали сосудистую и клеточную адгезию и ингибировали nuclear factor-kB (NF-кВ) эндотелиальных клеток также, как и а-МСГ [Brzoka et al, 1999]. Ha основании этого можно сделать вывод, что именно МС1 рецепторы опосредуют эффекты меланокортинов на клетки иммунной системы. Это подтверждается еще и тем, что эндотелиальные клетки сосудов человека содержат МС1 рецепторы [Hartmeyer et al, 1997]. Однако это утверждение нельзя считать полностью верным, поскольку есть данные, что термальная последовательность а-МСГ (МСГП.13) также оказывает действие на иммунную систему, хотя этот пептид не способен связываться ни с одним из подтипов МС рецепторов [Wikberg, 2000]. Опыты, проведенные на мышах с генетически дефективными МС1 рецепторами, показали, что введение а-МСГ также, как и МСГ1МЗ, способно предупреждать активацию NF-kB при воспалительном процессе [Ichiyama et al, 1999]. Кроме того, есть данные, что макрофаги мышей содержат МСЗ рецепторы [Getting et al, 1999], а в мембране В-лимфоцитов были обнаружены МС5 рецепторы [Buggy, 1998]. Не следует также исключать возможность того, что иммунорегуляторные эффекты меланокортинов осуществляются через активацию адренергической системы. Есть данные, что антивоспалительное действие, которое проявляет а-МСГ при центральном введении, снимается блокатором (5-адренорецепторов [Ichiyama et al, 1999]. На основании сказанного выше можно предположить, что действие МСГ-пептидов на иммунную систему может осуществляться как через классические МС рецепторы (преимущественно МС1), так и минуя их.

Действие меланокортинов на двигательную активность животных При изучении поведенческих эффектов АКТГ было показано, что этот гормон оказывает влияние на двигательную активность и исследовательское поведение животных [Amir, 1980]. Внутрижелудочковая инъекция АКТГ приводит к резкому снижению двигательной активности, количества стоек и обследованных отверстий в тесте "норковая камера" через 15 минут после введения. При периферическом введении АКТГ также наблюдаются изменения двигательной активности и ориентировочно-исследовательского поведения животных. В данном случае влияние гормона определяется условиями, в которых находится животное во время эксперимента. Инъекция АКТГ перед помещением животного в новые условия приводит к усилению двигательной активности в том случае, когда крысу тестируют в отсутствие сильных внешних раздражителей. В таких условиях поведение в большей степени определяется исследовательской мотивацией. Увеличение двигательной активности свидетельствует, по-видимому, об усилении ориентировочно-исследовательской реакции под действием АКТЫ [Антонова и др., 1980]. В случае, когда животное помещается в стрессогенные условия (яркий свет, шум), введение гормона приводит к уменьшению двигательной активности. В этих условиях поведение крыс определяется в основном оборонительной мотивацией, проявлением которой является реакция затаивания [Denenberg et al, 1975]. Следовательно, введение АКТГ приводит к усилению оборонительной реакции. Таким образом, кортикотропин способен усиливать поведенческие реакции, характерные для той ситуации, в которой находится животное, что согласуется с его ролью адаптивного гормона.

Влияние меланокортинов на уровень эмоциональной напряженности

Показано, что МСГ и АКТГ способны увеличивать груминг у крыс. Груминг - это активное поведение животных, направленное на поверхность тела, т.е. умывание, лизание, чистка гениталий, почесывание. Усиление груминга наблюдается у грызунов при помещении в новую или стрессогенную ситуацию (в этом случае интенсивный груминг является примером так называемой "смещенной активности", которая возникает у животных при высокой эмоциональной напряженности [Spruijt, Gispen, 1983]). Поскольку наличие новых или стрессогенных условий активирует гипоталамо-гипофизарную систему, то, вероятно, чрезмерный груминг, вызванный стрессом, объясняется выбросом меланокортинов.

Чрезмерный груминг животных вызывается внутрижелудочковым введением а-МСГ и синтетических агонистов МС рецепторов, NDP-MSH и меланотаном-И [Wikberg et al, 2000]. Однако селективный агонист МСЗ рецепторов Nle-y-МСГ не оказывает влияния на груминг при этом введении [Adan et al, 1999]. Груминг крыс, вызыванный внутрижелудочковом введением а-МСГ и АКТГ, блокируется антагонистом МС рецепторов HS014 [Klusa et al, 1998]. АКТГ/МСГ-подобные пептиды способны оказывать влияние на груминг животных и при введении в другие области мозга, например, в паравентрикулярные ядра гипоталамуса и передний гипоталамус. Антагонист МС рецепторов HS014, введенный в те же области, дозозависимо ингибирует этот эффект [Wikberg et al, 2000].

Все эти данные свидетельствуют о том, что действие меланокортинов на груминг осуществляется через МС4 рецепторы.

Области мозга, в которых экзогенные меланокортины вызывают груминг животных, являются областями, иннервирующимися ПОМК-нейронами, что говорит о роли эндогенных меланокортинов в груминге животных. Это подтверждается также и тем, что внутрижелудочковое введение блокатора МС рецепторов SHU9119 или антител к АКТГ подавляет груминг у крыс [Wikberg et al, 2000].

Внутрижелудочковое введение АКТГ/МСГ-подобных пептидов способно вызывать у млекопитающих другой вид поведения, характеризующий эмоциональную напряженность, - это синдром стереотипического поведения, состоящего из чередования потягивания и зевания. Синдром потягивания и зевания, вызванный а-МСГ, снимается предварительным введением антагониста МС рецепторов HS014, что говорит об участии МС рецепторов (преимущественно МС4) в формировании этот процесса [Vergoni et al, 1998]. Этот синдром также возникает при введении АКТГ и а-МСГ в паравентрикулярные ядра гипоталамуса (PVH) [Argiolas et al, 2000].

Интересно, что внутрижелудочковое введение АКТГ^ 6-, 9-, и 15-недельным крысам показало, что вызванный синдром потягивания и зевания более выражен у молодых крыс, в то время как интенсивность груминга не зависит от возраста животных [De Wied, 1993].

Влияние меланокортинов на половое поведение

АКТГ/МСГ-подобные пептиды способны влиять на половое поведение самцов и самок животных. У самцов крыс, котов и кроликов внутрижелудочковое введение АКТГ^ или а-МСГ может усиливать эрекцию и эякуляцию даже в отсутствии самки [De Wied, Jolles, 1982]. а-МСГ в 10 раз повышает частоту эрекций в течение 60 минут после внутрижелудочкового введения. Антагонист МС4 рецепторов HS014 лишь частично блокирует этот ответ [Vergoni et al, 1998]. Есть данные, что увеличение полового поведения под действием меланокортинов ослабляется введением селективных МСЗ блокаторов. А поскольку HS014 является также частичным блокатором МСЗ рецепторов, то возможно влияние меланокортинов на половое поведение опосредовано именно через МСЗ рецепторы [Wikberg, 2000].

Синтетический агонист МС-рецепторов - меланотан-И, применяется в медицине при лечении половых расстройств у мужчин. Это соединение способно в несколько раз увеличить частоту эрекций [Wessells et al, 1998].

Есть данные, что действие АКТГ/МСГ пептидов на половое поведение осуществляется при участии N0. Так внутрижелудочковое введение блокатора NO-синтазы NAME понижает вызванную АКТГ эрекцию [Poggioli et al, 1995]. Кроме того, влияние меланокортинов на половое поведение меняется при действии блокаторов мускариновых рецепторов и блокаторов кальциевых каналов, что говорит о вовлечении в этот процесс большого количества различных нейро-медиаторных систем [Argiolas et al, 2000].

Роль меланокортинов в регуляции пищевого поведения Пищевое поведение регулируется комплексом нейрохимических систем, включая центральные и периферические механизмы. Лептин и инсулин - это важнейшие медиаторы, выделяющиеся на периферии. В контроль этой функции вовлечены также регуляторы ЦНС: нейропептид Y, КРФ, галанин, орексин, моноамины и многое другое. Эти факторы контролируют потребление пищи и, как следствие, вес тела и рост.

Первые сообщения о том, что меланокортины вовлечены в регуляцию пищевого поведения появились в конце 70-х годов, когда стало известно, что центральное введение а-МСГ уменьшает количество потребляемой пищи [Panskepp, 1976]. Позже было показано, что внутрижелудочковое введение цикличного гептапептида MTII, агониста МСЗ и МС4, также влияет на пищевое поведение грызунов [Hruby, 1995]. Увеличение экспрессии гена агоути-протеина в ЦНС приводит к ожирению и пониженному содержанию лептина и инсулина в крови. Поскольку агоути-протеин имеет высокое сродство к МС4 рецепторам то, по-видимому, именно эти рецепторы и участвуют в регуляции пищевого поведения [Wikberg, 1999]. Кроме того, инактивация гена МС4 рецептора у мышей приводит к выраженному увеличению аппетита и повышению роста и веса тела [Huszar et al, 1997].

Центральное введение АКТГ^ и а-МСГ приводило к анорексии, в то время как неселективный антагонист МС4 рецепторов SHU9119 и селективный антагонист этих рецепторов HS014 вызывали выраженный орексигенный эффект [Kask et al, 1998 С]. Было также показано, что селективный агонист МС4 рецепторов (5-МСГ выражено и дозозависимо уменьшает потребление пищи, а селективный агонист МСЗ рецепторов yl-МСГ - нет [Kask et al, 2000]. Таким образом, все эти данные доказывают, что МС4 рецепторы играют большую роль в регуляции пищевого поведения.

Изучение влияния внутрижелудочкового введения различных агонистов и антагонистов МС рецепторов на пищевое поведение голубей показало, что МС4 рецепторы регулируют потребление пищи и энергетический гомеостаз не только у млекопитающих, но и у птиц [Strader et al, 2003].

Механизмы действия МС4 рецепторов на количество потребляемой пищи до конца не изучены. Некоторые данные говорят о взаимодействии этих рецепторов с системой лептина. Так, блокатор МС4 рецепторов HS014 подавляет эффекты лептина на пищевое поведение [Kask, et al, 1998А]. Кроме того, животные с нокаутом МС4 рецепторов не реагировали на введение лептина [Marsh et al, 1999]. Таким образом, возможно действие лептина на пищевое поведение опосредуется через МС4 рецепторы.

Показано, что увеличение потребления пищи в ответ на введение HS014 может частично блокироваться введением антагониста Y \ -рецепторов нейропептида Y [Kask, et al, 1998 В]. Эти данные говорят о том, что действие меланокортинов на пищевое поведение может быть связано с системой нейропептида Y.

Внутрижелудочковое введение КРФ так же, как и AKTTi^ вызывает анорексический эффект. КРФ способен блокировать стимуляцию потребления пищи, вызванную голодом, инсулиновой гипогликемией, активацией норадренергической или опиоидной системы [Vergoni et al, 1990]. Интересно, что анорексический эффект КРФ не связан (или связан в небольшой степени) с действием АКТГ, поскольку не блокируется антагонистом МС4 рецепторов HS014 [Vergoni et al, 1999].

КРФ является важнейшим стрессовым гормоном, и уменьшение потребления пищи, вызванное стрессом, объясняется именно его действием, поскольку введение антагониста КРФ рецепторов блокирует этот эффект [Cone, 2000].

Влияние меланокортинов на болевую чувствительность

Роль АКТГ/МСГ-подобных пептидов в регуляции восприятия боли до настоящего времени не выявлена. В зависимости от дозы и способа введения эти пептиды могут проявлять противоположные эффекты. Было показано, что системное введение АКТГ вызывает анальгетический эффект как у крыс [Li et al., 1990], так и у человека [Kshatri, Foster, 1997]. Исследование влияния внутрибрюшинного введения АКТГ на болевую чувствительность крыс в тесте "отдергивания хвоста" показало, что инъекция пептида в дозе 0,25 мг/кг приводит к понижению болевой чувствительности, однако введение низких доз АКТГ (0,03-0,06 мг/кг) напротив вызывает гиперальгезию [Takeshige et al., 1991]. В литературе также встечаются работы, где не было выявлено влияния АКТГ на болевую чувствительность при системном введении [Gispen et al., 1976].

При внутримозговом введении направленность действия меланокортинов на болевую чувствительность зависит от места инъекции пептида. Показано, что введение АКТГ в область околоводопроводного серого вещества (ОСВ) вызывает повышение болевого порога [Li et al., 1990]. Предварительное введение блокатора опиоидных рецепторов - налоксона, не предотвращает снижения болевой чувствительности, вызванного введением АКТГ в ОСВ. Анальгетические эффекты также наблюдаются после введения в эту область а-МСГ [Walker, et al., 1980]. Микроинъекции АКТГ в дозах 0,2-1 мкг/кг в заднее аркуатное ядро гипоталамуса также вызывает анальгезию [Takeshige et al., 1991]. Введение АКТГ^ в дозе 5-10 мкг в боковые желудочки мозга вызывает гиперальгезию у крыс в тестах "отдергивания хвоста" и "горячая пластина". Предварительное введение морфина снижает, а налоксона потенциирует этот эффект [Bertolini et al., 1979; Fratta, et al., 1981]. Внутрижелудочковая инъекция АКТГ в дозе 1 мкг не влияет на болевую чувствительность в тесте "отдергивания хвоста" [Smock, Field, 1981]. Гиперальгетический эффект наблюдался в случае в/ж введения АКТГ кроликам в дозах 0,5 и 1 мкг [Williams et al., 1986]. Гиперальгетические эффекты также наблюдались при в/ж введении а-МСГ в дозах от 0,1 до 10 мкг в тесте "отдергивания хвоста" [Sandman, Kastin, 1981]. Однако при исследовании влияния в/ж инъекции а-МСГ на болевую чувствительность животных в тесте "горячая пластина" было показано, что введение пептида в дозах 0,1; 1 и 10 мкг оказывает анальгетическое действие [Ohkubo et al., 1985].

Изучение влияния интрацистернального введения а- и у-МСГ на болевую чувствительность мышей в тесте "отдергивания хвоста" показало, что у2-МСГ и yl-МСГ оказывают анальгетическое действие, в то время как введение а-МСГ вызывает гиперальгезию. Предварительное введение налоксона или блокатора МС3/МС4 рецепторов не влияло на анальгетические эффекты у2-МСГ, однако эти эффекты блокировались предварительным введением антагониста ГАМК-ергических рецепторов бикукулина [Klusa et al., 2001].

Таким образом, в зависимости от способа введения, дозы и структуры меланокортинов может наблюдаться как снижение, так и повышение болевой чувствительности. Гиперальгетическое действие меланокортинов, вероятно, осуществляется через опиоидную систему, а анальгетические эффекты этих веществ не связаны с опиоидными пептидами [Fratta, et al., 1981; Li et al., 1990].

Синтетические аналоги фрагментов АКТГ.

Как показано в предыдущих главах, АКТГ и его фрагменты обладают рядом эффектов, способствующих восстановлению функций организма и его адаптации к изменениям окружающей среды. Они ускоряют обучение, улучшают внимание и память [Bohus, Endroczi, 1965], проявляют нейротрофические и нейропротекторные эффекты [Strand et al, 1993], стимулируют половое поведение [De Wied, Jolles, 1982], обладают противовоспалительным и жаропонижающим действием [Lipton, Glyn, 1980; Glyn, Lipton, 1981]. Однако использование природных фрагментов гормона в медицине является проблематичным из-за короткого времени действия веществ и множественности их эффектов. Для решения этой проблемы отечественными и зарубежными учеными были разработаны синтетические аналоги фрагментов АКТГ, обладающие более выраженными эффектами и длительным действием, чем природные пептиды (рис. 2).

Org 2766 [(02)-Met-Glu-His-Phe-D-Lys-Phe-0H] - это устойчивый к действию пептидаз аналог природного фрагмента АКТГ4.9 Было показано, что этот пептид способен ускорять обучение и стимулировать память, причем он в 1000 раз более активен, чем АКТГ4.ю [De Wied, 1993]. Однако в тесте выработки УРПИ Org 2766 проявляет двойственный эффект: малые дозы аналога (0,5-1 нг) при внутрижелудочковом введении ускоряют обучение животных, в то время как инъекция пептида в большой дозе (5-10 нг) затрудняет обучение в этом тесте. Авторы полагают, что усиление и ухудшение обучения вызывают различные фрагменты пептида. Так трипептид Phe-D-Lys-Phe (т.е. три С-концевых аминокислотных остатка молекулы Org 2766) ухудшает обучение животных, а тетрапептид (02)-Met-Glu-His-Phe, соответствующий четырем N-концевым аминокислотным остаткам пептида, напротив, стимулирует выработку УРПИ. Интересно, что предварительное введение антагониста опиоидных рецепторов налтрексона снимает эффект ухудшения обучения и никак не влияет на ноотропное действие аналога. На основании этих данных авторы делают вывод, что эффект усиления обучения осуществляется N-концевой областью молекулы Org 2766 и не связан с опиатной системой мозга, а подавляющий обучение эффект вызывает С-концевая область молекулы пептида, и этот эффект зависит от налтрексон-чувствительных опиатных рецепторов мозга [Fekete, De Wied, 1982].

Org 2766 не проявляет многие эффекты, характерные для меланокортинов. Например, он обладает в 1000 раз меньшей меланоцитстимулирующей активностью, его стероидогенная активность также снижена в несколько раз. Это вещество не приводит к мобилизации липидов из жирового депо [Pitsikas, 1991].

Org 2766, как и другие АКТГ/МСГ-пептиды, способен положительно влиять на регенерацию нервной ткани. У животных, получавших в течение 8 дней Org 2766, восстановление чувствительности и двигательных функций после

АКТГ(4-10) Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly

ORG 2766 Met (02)-Glu-His-Phe-D-Lys-Phe-0H

ORG 31433 Met (02)-Glu-His-Phe-D-Lys-Phe-0-(CH2)9-CH3

Ebiratide Met (02)-Glu-His-Phe-D-Lys-Phe-NH^CH2)8-NH2

BIM 22015 D-Ala-Gln-Tyr-Phe-Arg-Trp-Gly

Семакс Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro

Рис. 2. Аминокислотные последовательности АКТГ4.ю и синтетических меланокортинов. разрушения седалищного нерва происходило на 20-40% быстрее [De Koning, Gispen, 1987]. Этот пептид стимулирует регенерацию не только периферических нервов, но и ткани центральной нервной системы. Например, он улучшает восстановление пространственной ориентации после билатеральной трансекции свода у крыс [Pitsikas et al, 1991]. Введение Org 2766 сокращает период, необходимый для спонтанного восстановления мезолибической дофаминэргической системы после ее билатерального повреждения [Strand et al, 1993]. Опыты, проведенные на лягушках, показали, что восстановление чувства равновесия после лабиринтоэктомии проходит быстрее у тех животных, которым вводили Org 2766 [Luneburg, Flohr, 1988]. У крыс введение этого пептида эффективно ускоряло восстановление нервных клеток после повреждения септума, в то время как АКТГ4.10 не оказывал действия на регенерацию нервной ткани в этих условиях [Strand et al, 1993]. Изучалось также влияние внутрижелудочковой инъекции Org 2766 на восстановление функций организма крыс с повреждением гиппокампа или неокортекса. Пептид вводился в дозе 1 мкг/кг ежедневно в течение недели после операции. Спустя неделю после окончания введения пептида у животных проводили выработку пищедобывательного навыка. Крысы с повреждением неокортекса очень плохо обучались, и предварительное введение Org 2766 не оказывало влияния на показатели обучения. Животные, у которых был поврежден гиппокамп, обучались быстро, но были гиперактивны и проявляли некоторый дефицит внимания, который не наблюдался у ложнооперированных крыс. Предварительное введение Org 2766 снимало дефицит внимания. Введение аналога положительно влияло на обучение и ложнооперированных животных [Hannigan, Isaacson, 1985].

Org 2766 ускоряет развитие нервно-мышечной системы крыс как в эмбриональный, так и в постнатальный период в течение 2-х недель после рождения. Спустя это время созревание нервно-мышечной ткани завершается, и введение пептида не оказывает действия на активность уже сформировавшейся системы [Strand et al, 1993].

Org 2766 способен положительно влиять на социальное поведение крыс. Хроническое подкожное введение аналога в дозе 10 мкг 16-месячным крысам предотвращало спад социального поведения животных. При этом не только увеличивалось число контактов крыс, но и изменялась реакция животных друг на друга. Введение Org 2766 более молодым животным (12-14 месяцев) приводило к временному усилению социального поведения, которое исчезало через одну неделю после последней инъекции. Авторы считают, что влияние на социальное поведение 16-месячных крыс связано с тем, что аналог противодействует морфологическим изменениям гиппокампа у стареющих животных [Spruijt, 1992].

Действие Org 2766 также исследовалось на моделях аутоиммунных заболеваний, при которых наблюдается деградация миелиновых оболочек и ослабление нейронных функций. Было показано, что аналог восстанавливает координацию движений животных и препятствует демиелинизации аксонов [Duckers et al, 1993].

Org 2766 предотвращает развитие невропатий различного происхождения. Так противоопухолевый препарат цисплатин, применяющийся в химиотерапии, вызывает значительное снижение скорости проведения в чувствительных нервных волокнах. Одновременное введение этого препарата и Org 2766 крысам позволяет предотвратить развитие невропатии [Hamers et al, 1993]. Исследование действия Org 2766 на цисплатин-вызванную невропатию у женщин, страдающих раком яичников, подтвердили способность пептида не только предотвращать эту патологию, но и положительно влиять на уже существующую невропатию. Восстановление чувствительности у больных, принимавших Org 2766, происходило в 4 раза быстрее, чем в контрольной группе пациентов. При этом аналог не оказывал влияния на результат химиотерапии [Gispen et al, 1992].

Эксперименты, проведенные на крысах, больных диабетом, показали, что четырехнедельное подкожное введение Org 2766 в дозе 10 мкг каждые 48 часов значительно улучшает проводимость чувствительных и двигательных нервных волокон [Bravenboer et al, 1993].

Путем замены СООН группы в молекуле Org 2766 были получены еще два синтетических аналога фрагментов АКТГ: Ное 427 (Met(02)-Glu-His-Phe-D-Lys-Phe-NH(CH2)8-NH2) и Org 31433 (Met(02)-Glu-His-Phe-D-Lys-Phe-o-(CH2)8-CH3). Эти пептиды были исследованы в тестах, где Org 2766 проявлял свою j РОССИЙСКАЯ ! ГОСУДАРСТВЕННАЯ А1 | БИБЛИОТЕКА активность. Опыты показали, что подкожное введение Ное 427 в дозе 0,5 нг/кг и Org 31433 в дозах 0,5-5 нг/кг ускоряло выработку УРПИ, а инъекции этих пептидов в дозах 25 нг/кг и 250 нг/кг, соответственно, затрудняли обучение. Кроме того, было показано, что Org 31433 способен ускорять регенерацию нервной ткани. Подкожное введение этого аналога ускоряло восстановление функций после разрушения nucleus accumbens. Таким образом, Ное 427 и Org 31433 проявляют те же эффекты, что и Org 2766, но они в 10-100 раз более активны. На основании этого авторы делают вывод, что замена СООН группы в молекуле Org 2766 приводит к усилению его функций [Wolterink et al, 1991].

Кроме влияния на обучение и память, Ное 427 обладает нейротрофической активностью. Добавление аналога в дозе 10-100 пмоль/мл в течение 5 дней в культуру клеток септума крыс предотвращало нейрональную дегенерацию [Matsumoto et al., 1995].

Как и Org 2766, Ное 427 влияет на выделение и метаболизм ацетилхолина. Содержание ацетилхолина было оценено в стриатуме, гипоталамусе и передней коре мозга крыс. Опыты показали, что внутрибрюшинное введение аналогов достоверно увеличивает содержание ацетилхолина в этих областях мозга. Эффект пептидов начинает проявляться через 30 минут после инъекции и длится 24 часа [Wiemer et al, 1988].

Более выраженное действие Ное 427 на обучение и память, его высокая устойчивость к действию пептидаз и способность оказывать влияние на метаболизм ацетилхолина позволили предположить, что этот аналог будет эффективен при лечении болезни Альцгеймера. В исследованиях участвовали пациенты с различной степенью когнетивных расстройств. Разовое введение Ное 427 группе пожилых людей с когнетивными расстройствами средней тяжести и пациентам, страдающим болезнью Альцгеймера, привело к небольшому, но достоверному улучшению внимания и настроения испытуемых. К сожалению, у больных этот эффект был менее выражен, чем у здоровых людей [Siedfried, 1991].

Ное 427 также способствует устранению амнезии, вызванной электрошоком, и восстанавливает память, нарушенную скополамином. Причем целая молекула АКТГ такими эффектами не обладает [Громов, 1992].

Как и природный фрагмент АКТГ4ю, Ное 427 способен достоверно снижать потребление этанола этанол-зависимыми крысами. Животным предлагался выбор между двумя поилками, содержащими 0,2% раствор сахарина и 10% раствор этанола. Как разовое, так и ежедневное, введение аналога значительно снижало потребление этанола и не влияло на потребление сахарина [Krishnan, Maickel, 1991].

Был синтезирован и исследован еще один аналог АКТГ4ю - BIM 22015 (D-Ala-Gln-Tyr-Phe-Arg-Trp-Gly-NH2). Этот пептид, как и Org 2766, способен поддерживать рост нервных окончаний в культуре нейронов и ускорять регенерацию нервных волокон при различных повреждениях и патологиях [Strand et al, 1993]. Исследовалось действие этого аналога на восстановление функций организма после повреждения фронтальной коры крыс. BIM 22015 вводился подкожно в дозах 1, 10 и 100 мкг ежедневно в течение 20 дней после операции. После этого животные подвергались тестированию в водном лабиринте Морриса. Введение этого аналога достоверно ускоряло обучение животных в этом тесте. Эффект вещества сохранялся даже через 30 дней после последней инъекции [Attella et al, 1992].

Несмотря на то, что все эти аналоги обладают более выраженными эффектами, чем природные меланокортины, в настоящее время ни один из них не прошел клинических испытаний и не используется в медицине.

Для выяснения механизма действия фрагментов АКТГ, а также с целью изучения зависимости активности пептида от структуры его молекулы был синтезирован аналог АКТГ5.7 трипептид ERP (Glu-Arg-Pro). Основанием для синтеза именно такой последовательности послужило предположение о важной роли последовательности Glu-His во взаимодействии с гипотетическим рецептором-мишенью. Результаты конформационного анализа позволили заключить, что замена His на Arg должна способствовать увеличению связывания с мишенью, а присоединение остатка Pro повысить устойчивость пептида к действию пептидаз [Ashmarin et al, 1994]. В результате исследования поведенческих эффектов ERP было обнаружено, что в отличие от исходного фрагмента гормона, он оказывает тормозящее влияние на выработку пищедобывательного навыка. Введение пептида за 5 минут до начала обучения вызывало снижение числа выполненных условнорефлекторных реакций у крыс, а число ошибок достоверно увеличивалось. При этом полного подавления способности к обучению не происходило, опытные животные лишь "отставали" в скорости выработки навыка от контрольной группы приблизительно на 2 дня. Также было показано, что введение ERP вызывало быстрое торможение раннее выработанного пищедобывательного рефлекса, что выражается в уменьшении числа выполненных реакций и в увеличении числа ошибок [Левицкая и др., 1993]. Дальнейшие эксперименты показали, что ERP затрудняет выработку рефлексов активного и пассивного избегания [Левицкая и др., 1995].

Кроме действия на обучение животных, ERP также способен изменять ориентировочно-исследовательскую реакцию и эмоциональное состояние животных в стрессогенных условиях в тесте "открытое поле". Было обнаружено существование значимой связи между выраженностью эффекта ERP и величиной локомоторной активности контрольных животных. Так, при высокой двигательной активности крыс введение 0,15 мг/кг пептида приводило к снижению пробега. В случае животных со средним уровнем локомоторной активности величина пробега в опытной и контрольных группах не отличались. Если животные обладали низкой двигательной активностью, то инъекция трипептида в той же дозе вызывала значимое повышение величины пробега. Также было обнаружено, что ERP, вводимый до инъекции АКТГ1.39, препятствует увеличению двигательной активности, обычно вызываемой этим гормоном [Ashmarin et al., 1994].

Итак, ERP, также как и природные фрагменты АКТГ, изменяет двигательную активность и эмоциональное состояние животных. Однако в отличие от нативных фрагментов он отрицательно сказывается на процессе обучения, а также вызывает амнезию ранее выработанного навыка. Таким образом, ERP является антагонистом физиологических эффектов АКТГ.

Аналог фрагмента АКТГ4.10 - Семакс

Как уже говорилось ранее, минимальным фрагментом, сохраняющим поведенческие эффекты целой молекулы АКТГ при полной потере гормональных свойств, является тетрапептид АКТГ4-7 (Met-Glu-His-Phe), который так же активен, как и целая молекула [De Wied et al., 1975]. Однако существенным недостатком АКТГ и его фрагментов является их быстрое разрушение пептидазами. При внутривенном введении уже через одну минуту в коже и мышцах определяется 50% метки. В плазме, почках, печени и кишечнике определяются еще меньшие количества. Уже через пять минут после введения гормона во всех тканях обнаруживаются только его фрагменты [Ambler et al, 1982].

Пролонгировать эффекты пептида и увеличить его устойчивость к действию пептидаз можно путем включения в структуру молекулы участков, обогащенных пролиновыми остатками. Известно, что в органах и тканях большинства теплокровных животных широко представлены экзо- и эндопептидазы с низкой специфичностью. Они не расщепляют связи -АА-Рго-, где АА — любая аминокислота, а также другие последовательности, обогащенные пролиновыми остатками. Специфические пролингидроксилазы сосредоточены главным образом в отдельных органах и тканях в небольшом количестве. На основании этого было высказано предположение, что присоединение к С-концу фрагмента АКТГ4.7 обогащенной пролином цепочки приведет как к усилению эффекта пептида, так и к его пролонгированию [Ашмарин и др., 1997]. Изучение нейротропной активности ряда аналогов АКТГ4ю с различными модификациями С-концевой области показало, что наибольшей активностью обладает аналог, в котором три С-концевые аминокислоты заменены на последовательность Pro-Gly-Pro [Пономарева-Степная М.А. и др., 1986; Ashmarin et al, 1995]. Исследования показали, что этот пептид (Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro) сохраняет свои эффекты в интервале доз от 0,015 до 0,15 мг/кг. Аминокислотную последовательность пептида избрали для создания лекарственного препарата "Семакс" [Ашмарин и др., 1997].

Исследование устойчивости семакса к действию протеаз сыворотки крови показало, что первым шагом деградации молекулы является отщепление N-концевого метионина. При этом образуется достаточно стабильный интермедиат Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro [Potaman et al, 1991 A; Potaman et al, 1993]. Было также показано, что длительность действия семакса при его введении в дозе 0,05 мг/кг составляет порядка 20-24 часов.

Исследование влияния семакса на обучение животных показало, что внутрибрюшинное введение этого пептида ускоряет выработку пищевого навыка в Т-образном лабиринте. Показано также, что этот аналог не изменяет уровень ориентировочной реакции и эмоциональное состояние животных в тесте «открытое поле». Кроме того, не было отмечено влияние семакса в дозе 0,05 мг/кг на частоту сердечных сокращений, частоту дыхания и температуру тела фиксированных животных [Пономарева-Степная и др., 1984].

Положительное действие семакса на обучение животных показано также в тесте выработки УРПИ. Внутрибрюшинное введение пептида в дозе 0,015 мг/кг за 1 час до начала эксперимента достоверно увеличивало латентный период захода в темный отсек во второй день обучения. Аналогичный эффект наблюдался при введении пептида за 6 часов до начала опыта [Ashmarin et al, 1995]. Было показано, что семакс стимулирует мнестические процессы не только у интактных животных, но и в условиях патологии: введение пептида значительно ослабляло амнезию, вызванную электрическим шоком [Ашмарин и др., 1997].

Исследование ноотропных эффектов семакса на людях-добровольцах показало, что интраназальное введение пептида в дозе около 16 мкг/кг достоверно повышало внимание и краткосрочную память испытуемых при тестировании как в начале, так и в конце рабочего дня [Kaplan et al, 1996]. Данные ЭЭГ показали, что интраназальное введение пептида в количестве 0,251,0 мг вызывает изменение энцефалографических параметров аналогичное изменениям, возникающим при введении типичных ноотропных препаратов [Kaplan et al, 1996].

Для сравнения эффектов семакса с эффектами других ноотропов были проведены исследования его антигипоксического действия. Опыты, проведенные на крысах, показали, что этот пептид в 2,5 раза увеличивает время жизни животных на экстримальной «высоте» (12000 м), а также положительно влияет на адаптацию организма к гипоксии. В исследованиях на людях-добровольцах обнаружена способность препарата купировать постгипервентиляционные ЭЭГ-эффекты, вызванные компенсаторным уменьшением мозгового кровотока [Каплан и др., 1992].

Семакс способен оказывать нейротрофическое действие. Большие дозы семакса (0,15-0,3 мг/кг) увеличивают выживаемость животных и уменьшают выраженность неврологического дефекта при экспериментальном ишемическом инсульте [Ашмарин и др., 1997]. Кроме того, опыты, проведенные на эмбриональных культурах клеток мозга крыс, показали, что семакс в дозе 0,1-10 мкМ увеличивает количество выживших нейронов в 1,5-3 раза по сравнению с контролем и при этом не влияет на пролиферацию глиальных клеток. Авторы предполагают, что семакс осуществляет свое нейротрофическое действие через регуляцию уровня экспрессии ряда известных нейротрофических факторов, таких как фактор роста нервов, нейротрофины-3,4 и 5 и др. [Гривенников и др., 1999].

Нейротрофические свойства семакса подтвердились во время исследования действия препарата при заболеваниях зрительного нерва различной этиологии. Введение семакса интраназально или в виде эндоназального электрофореза, особенно в острой стадии заболевания, эффективно защищало нервную ткань от последствий повреждений. При этом достоверно увеличивался прирост остроты зрения, расширялось суммарное поле зрения, повышалась электрическая чувствительности и проводимость зрительного нерва, улучшалось цветовое зрение [Полунин и др., 2000].

Обнаружено положительное действие семакса в остром периоде полушарного ишемического инсульта. Семакс вводился интраназально в суточной дозе 12, 18 и 24 мг в течение 5 дней. Первое введение осуществлялось через 3-4 часа после поступления больного в клинику, т.е. в первые часы заболевания. Совместно с введением семакса все больные подвергались комплексной базисной терапии. Клинические испытания показали, что интраназальное введение семакса совместно с интенсивной терапией острого полушарного ишемического инсульта оказывает благоприятное действие на выраженность и темпы восстановительных процессов, способствуя ускорению регресса общемозговых и очаговых нарушений [Гусев и др., 1997].

Для определения возможности использования семакса в коррекции постреанимационных неврологических нарушений были проведены исследования действия препарата на модели клинической смерти. Остановка общего кровообращения осуществлялась пережатием сосудистого пучка сердца крыс. Спустя 10 минут животных оживляли с помощью закрытого массажа сердца и искусственной вентиляции легких. Далее у крыс оценивали степень запоминания экспериментальной обстановки при повторном тестировании в «открытом поле». Ежедневное интраназальное введение семакса в дозе 0,05 мг/кг в течении двух недель нормализовало параметры ориентировочно-исследовательской реакции крыс, приближая их значения к интактному контролю [Геренко и др., 1991; Волков и др., 1992].

Данные о положительном действии семакса на восстановление мнестических функций мозга в постреанимационный период были получены и при клинических исследованиях. Изучалось влияние препарата на восстановление функций ЦНС у больных с тяжелыми формами постреанимационной патологии (интеллектуальными и мнестическими расстройствами). У 89% больных, получавших семакс, отмечалось значительное улучшение состояния. Нейропсихологическое исследование выявило улучшение внимания, запоминания, познавательных способностей, подвижности мышц, слухоречевой памяти. Данные энцефалографического обследования также подтвердили эффективность препарата - отмечалось улучшение показателей функционального состояния мозга [Алексеева и др., 1999].

В литературе встречаются данные о том, что семакс возможно обладает антистрессорным действием. Известно, что при эмоциональном стрессе наблюдается усиление экспресси гена c-Fos в разных структурах мозга. Наиболее выраженная экспрессия этого гена выявлена в мозге предрасположенных к эмоциональному стрессу животных. Предварительное внутрибрюшинное введение семакса вызывает снижение индуцированной стрессом экспрессии гена c-Fos в паравентрикулярном гипоталамусе и медиальных отделах перегородки у предрасположенных к эмоциональному стрессу крыс [Умрюхин и др., 2001].

Механизм действия семакса до настоящего времени не выяснен. Важнейшим аспектом для понимания центральных эффектов пептида является оценка его способности проникать через ГЭБ. Была проведена серия экспериментов с использованием меченного тритием семакса. Исследования показали, что после внутривенного введения в головной мозг экспериментальных животных проникает 0,01% введенного пептида [Potaman et al, 1991 В]. Эти данные сравнимы с величинами, описанными для другого аналога АКТГ4.ю- Org 2766 (0,004%) [Ашмарин и др., 1997].

Далее были предприняты попытки выявить рецепторное связывание семакса с препаратами плазматических мембран нейронов и глиальных клеток мозга крыс и целыми живыми клетками. До настоящего времени обнаружить специфические рецепторы пептида не удалось. Однако есть данные, что семакс способен связываться с мембранами нервных клеток базальных ядер переднего мозга крыс, причем это связывание специфично и обратимо. Возможно, что рецепторы к фрагментам АКТГ представлены в очень ограниченных количествах и немногих структурах мозга [Гривенников, Долотов, Гольдина, 1999].

Существует предположение, что эффекты семакса связаны с изменением активности ацетилхолинэргической системы. Введение пептида в дозе 0,150 мг/кг вызывает увеличение активности ацетилхолинэстеразы в гиппокампе и белом веществе головного мозга более чем в 2 раза. Действие препарата наблюдается в течение 2-3 часов после инъекции. В других отделах мозга активация не наблюдалась [Алексидзе и др., 1983].

Возможно также, терапевтическое действие семакса основано на изменении обмена моноаминов в мозге. Было показано, что при однократном внутрибрюшинном введении семакса в дозах 0,15 и 0,6 мг/кг увеличивается содержание дофамина, серотонина и его метаболита 5-оксииндолуксусной кислоты. Эффект наблюдался в течение 24 часов после введения пептида. При хроническом ежедневном введении семакса в дозе 0,6 мг/кг (1 раз в сутки) в течение 7 дней наблюдалась тенденция к снижению уровня дофамина и достоверное уменьшение содержания серотонина в гипоталамусе [Еремин и др., 2002].

В настоящее время препарат семакс широко используется в клинике для лечения различных заболеваний ЦНС. Однако создатели препарата считают, что лечебный потенциал семакса не исчерпан, и в будущем могут быть выявлены новые показания к его применению [Ашмарин и др., 1997]. В последние годы в печати появились работы об исследовании действия семакса на патологические состояния, не связанные с повреждением нервной системы. Например, опыты, проведенные на лабораторных животных показали, что семакс способен положительно влиять на течение острого панкреатита у крыс. Однократное внутрибрюшинное введение препарата в дозе 0,1 мг/кг уменьшало летальность животных, снижало гиперферментацию, активацию перекисного окисления липидов, сосудистую проницаемость, улучшало микроциркуляцию и ускоряло заживление зон деструкции в поджелудочной железе [Иванова, Яснецов, 2000]. Изучение влияния семакса на систему гемостаза показали, что семакс способен взаимодействовать с высокомолекулярным гепарином с образованием комплексного соединения, обладающего антикоагулянтными и фибринолитическими свойствами как в условиях in vitro, так и in vivo при внутривенном введении. Авторы предполагают, что семакс, особенно в комплексе с гепарином, может быть перспективным антитромботическим средством [Ляпина и др., 2000].

Есть данные о возможном противовоспалительном действии семакса. Было показано, что семакс обладает способностью изменять активность нейтрофилов человека, влияя на обмен ионов кальция [Асташкин и др., 2000].

На основании вышесказанного можно сделать вывод, что семакс обладает целым комплексом положительных эффектов на ЦНС. Препарат стимулирует функции переднего мозга: усиливает избирательное внимание в момент восприятия информации, улучшает консолидацию памяти, повышает способность к обучению. При этом, в отличие от большинства ноотропных препаратов непептидной природы, семакс не вызывает истощения соответствующих функций. Препарат увеличивает адаптационные возможности мозга, повышая его устойчивость к стрессорным повреждениям, гипобарической и сосудистой гипоксии, способствует уменьшению тяжести последствий экспериментального ишемического инсульта у животных. Клинические испытания показали высокую эффективность семакса при лечении интеллектуально-мнестических расстройств и астенических состояний различного генеза, а также при профилактике и лечении постнаркозных мнестических нарушений [Ашмарин и др., 1997; Ashmarin et al, 1995].

Несмотря на то, что семакс уже более десяти лет используется в клинической практике, до настоящего времени не исследованы механизмы, лежащие в основе его пролонгированного действия, не выявлено значения отдельных структурных элементов молекулы для сохранения его ноотропных эффектов, не определен спектр физиологической активности этого пептида.

Целью представленной работы являлось исследование влияния модификации N-концевой области молекулы семакса на ноотропную активность пептида и изучение кардиотропных эффектов семакса.

Перед нами были поставлены следующие задачи:

1. Исследование влияния модификации N-концевой области молекулы семакса на сохранение и длительность ноотропного действия его аналогов;

2. Изучение ноотропной активности продуктов ферментативной деградации семакса - аналогов пептида, укороченных с N-конца;

3. Оценка влияния семакса на параметры сердечного ритма крыс в покое и при действии сенсорных раздражителей;

4. Сравнение кардиотропного действия семакса и ряда других синтетических меланокортинов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа проводилась на самцах нелинейных белых крыс весом 200-250 г. Всего в работе было использовано 583 крысы (по 12-20 животных в каждой группе). Животные содержались в стандартных условиях вивария со свободным доступом к воде и пище. Все эксперименты проводились в период с 1100 до 1600.

В экспериментах применялись следующие препараты: фрагменты АКТГ4.ю и АКТГ5.10:

Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly (MEHFRWG),

EHFRWG),

Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly гептапептид семакс

Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro продукты деградации семакса:

Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro His-Phe-Pro-Gly-Pro Phe-Pro-Gly-Pro аналоги семакса:,

Lys-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro Trp-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro Ser-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro Ala-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro Thr-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro Gly-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro

MEHFPGP),

EHFPGP), (HFPGP), (FPGP),

KEHFPGP),

WEHFPGP),

SEHFPGP),

AEHFPGP),

TEHFPGP),

GEHFPGP), rMet-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro (rMEHFPGP), где r - остаток глюконовой кислоты,

Glu-Arg-Pro (ERP).

Все исследованные пептиды синтезированы в Секторе регуляторных пептидов Института Молекулярной генетики РАН.

Вещества вводились внутрибрюшинно в дозе 0,05 мг/кг. Объем инъецируемого раствора составлял 1 мл/кг. Контрольным животным вводили эквивалентный объем дистиллированной воды. Время введения препаратов указано отдельно для каждого теста.

Изучение ориентировочно-исследовательского поведения и двигательной активности крыс поводилось в тесте "открытое поле".

Тест "Открытое поле".

Используемое нами "открытое поле" [Hall, 1936; Титов, Каменский, 1980] представляет собой круглую арену диаметром 80 см с деревянным полом, расчерченным двумя концентрическими окружностями, находящимися на равном расстоянии друг от друга, и восемью диаметрами. Над ареной на высоте 80 см располагалась красная лампа мощностью 15 Вт. При тестировании животное помещали в центр арены и в течение двух минут визуально оценивали:

1) горизонтальную двигательную активность (длину пробега - число пересеченных сегментов);

2) вертикальную двигательную активность (число стоек - подъемов на задние лапы);

3) количество отходов от стенки арены (число радиальных перемещений с пересечением внешней окружности);

4) количество выходов в центр арены (число радиальных перемещений с пересечением внутренней окружности);

5) груминг (количество умываний - число касаний морды лапами).

Эксперименты в "открытом поле" проводились в "бесстрессорной" модификации - в тишине и при свете красной лампы.

Способность животных к обучению оценивали в экспериментальных моделях с различным знаком определяющего раздражителя.

Выработка условного пищедобывательного рефлекса на место в Т-образном лабиринте.

Выработку условной реакции с пищевым подкреплением проводили в Т-образном лабиринте (размер рукавов лабиринта - 30x10 см; размер стартовой камеры - 20x10 см). В первый день эксперимента крыс помещали в лабиринт на 20 минут для угашения ориентировочно-исследовательской реакции. Затем крыс не кормили в течение суток. В последующие 4 дня проводилось обучение: каждое животное помещали в стартовую камеру лабиринта 5 раз подряд каждый день. В качестве пищевого подкрепления использовали хлеб, который помещали в один из отсеков лабиринта. После взятия подкрепления или спустя 3 минуты животное извлекалось из лабиринта. Ежедневно регистрировали:

1) латентный период (среднее время выхода из стартовой камеры из 5 посадок животного в лабиринт);

2) время реакции (среднее из 5 посадок время от момента посадки в лабиринт до момента взятия подкрепления);

3) число ошибок (число заходов в неподкрепляемый отсек);

4) количество выполненных реакций (число заходов в подкрепляемый отсек и съедания подкрепления).

Кроме того, подсчитывали средний ЛП и среднее BP за весь период обучения, а также суммарное КВР и суммарное число ошибок за все дни эксперимента. В дни опыта животных кормили один раз в сутки, через час после обучения. Вещества проводили ежедневно в период обучения.

Выработка условного пищедобывательного рефлекса на место в сложном лабиринте.

Сложный лабиринт представляет собой квадратную камеру, разделенную пятью прозрачными перегородками на 6 коридоров. В каждой перегородке имелось прямоугольное отверстие. Перед экспериментом животных подвергали 24-часовой пищевой депривации.

1. Адаптация.

В первый день эксперимента крыс помещали в лабиринт на 30 мин с целью адаптации и угашения ориентировочно-исследовательской реакции.

2. Обучение.

В последующие 4 дня животное помещали в лабиринт по 5 раз подряд ежедневно, причем длительность каждой посадки не превышала 3-х минут. Животное помещалось в стартовый отсек, после чего визуально регистрировали следующие показатели:

1) число выполненных реакций (число случаев, когда животное находит подкрепление в течение 3-х минут пребывания в лабиринте);

2) количество ошибок (число любых отклонений от правильной траектории движения);

3) время реакции.

В дни опыта животных кормили один раз в сутки непосредственно после эксперимента. Препараты во время обучения не вводили.

3. Переучивание.

В произвольном порядке менялись местами перегородки в приборе, и животное вновь помещалось в стартовую камеру. Переучивание проводилось в течение 4 дней, при этом регистрировались те же параметры, что и при обучении.

Выработка условного рефлекса пассивного избегания.

Условный рефлекс пассивного избегания болевого раздражителя (УРПИ) вырабатывали в камере размером 30x22x35 см. Экспериментальная камера, подсоединенный к источнику тока (стимулятор ЭСЛ-2), разделялась на 2 равных отсека, соединенных переходом. Один отсек ярко освещался, второй был затемнен. В первый день эксперимента крысу помещали в освещенный отсек камеры и регистрировали время перехода в затемненный отсек (латентный период перехода). Затем переход закрывали и крысу подвергали неизбегаемому электроболевому раздражению в течение 3 секунд. Напряжение подбиралось индивидуально для каждого животного по вокализации (в диапазоне 60-90 В), частота составляла 50 Гц, длительность - 10 мсек. После отключения тока крысу оставляли в затемненном отсеке на 20 секунд. Через 3 суток проводили проверку выработки навыка пассивного избегания. Животное вновь помещали в светлый отсек камеры на 3 минуты и регистрировали латентный период перехода в затемненный отсек и общее время, проведенное крысой в светлой части камеры. Инъекции препаратов проводили только в первый день эксперимента.

Выработка условного рефлекса активного избегания.

Условный рефлекс активного избегания болевого раздражения (УРАИ) вырабатывали в камере (размер 30x22x35 см) с решетчатым полом, в углу которой на высоте 25 см находилась полка. На пол камеры подавали электрический ток со стимулятора ЭСЛ-2. Условным раздражителем служил звук звонка; безусловным - удар тока (напряжение подбиралось индивидуально для каждого животного в диапазоне 70-100 В, частота составляла 200 Гц, длительность - 1 мсек). Продолжительность звучания звонка составляла 3 сек. Через 2 сек после его выключения подавался безусловный раздражитель. Условной реакцией являлся прыжок на полку. Если избавление не наступало в течение 30 сек, то напряжение отключали. Длина временных интервалов между сочетаниями колебалась случайным образом в пределах 15-25 секунд.

В работе использовали четырехдневную схему выработки УРАИ. Каждое животное получало по 10 сочетаний условного и безусловного раздражителей в течение 4 дней. Инъекции препаратов проводили ежедневно перед сеансом обучения. В качестве показателей выработки УРАИ использовали:

1) количество выполненных реакций (КВР) - число избеганий болевого раздражителя, т.е. число прыжков на полку до включения тока, в ответ на условный сигнал;

2) число межсигнальных реакций (МСР) - число прыжков на полку до включения условного раздражителя.

Кроме того, подсчитывались среднее КВР и среднее число МСР за весь период обучения.

Кроме исследования влияния пептидов на поведение животных, исследовалось их действие на параметры сердечного ритма в покое и в ответ на стрессирующее воздействие различной интенсивности.

Регистрация ЭКГ крыс

Для регистрации ЭКГ животным под кожу вводили два проволочных электрода. Операция проводилась под легким эфирным наркозом за трое суток до основного эксперимента. Электроды изготавливались из мягкой стальной проволоки диаметром 1 мм. Они размещались на брюшной стороне крысы: один - на уровне верхних грудных позвонков ближе к передней левой конечности, другой - на уровне верхних поясничных позвонков ближе к правой нижней конечности. Электроды пропускались под кожей животного на участке около 5 мм, их концы загибались на наружной поверхности кожи. Подкожное введение отрезков проволоки не вызывало воспалительных явлений, и после окончания серии измерений электроды легко удалялись.

На следующий день после операции крысы адаптировались в камере регистрации в течение 30 минут при свете красной лампы в тишине. Животное помещалось в экранированную камеру размером 15x25x30 см, на дно которой были насыпаны опилки из клетки, где оно содержалось. Над камерой размещались красная лампа мощностью 15 Вт и яркая лампа мощностью 200 Вт.

Через двое суток после операции исследовалось влияние препаратов на ЭКГ крыс в покое. Регистрация ЭКГ проводилась с помощью программы CONAN на ЭВМ IBM РС/АТ-386, обработка данных осуществлялась с помощью программы для анализа и записей ЭКГ "RR". Крыса помещалась в экранированную камеру. Электроды через усилитель соединялись с аналого-цифровым преобразователем компьютера. Оцифровка аналоговых сигналов проводилась с частотой 300 Гц.

Регистрация ЭКГ начиналась через 5 минут после помещения крысы в экранированную камеру, условия регистрации были аналогичны условиям адаптации. Фоновая запись повторялась 3 раза с интервалом в 15 минут, при этом животное каждый раз извлекалось из камеры. После третьей записи животным вводили исследуемые пептиды: MEHFPGP, EHFPGP, R-MEHFPGP или ERP. Спустя 15, 30, 45 и 60 минут после инъекции вновь регистрировали ЭКГ. Длительность каждой записи составляла 150 сек.

На следующие сутки после записи ЭКГ в покое проводили исследование изменения ЭКГ в ответ на стрессирующее воздействие низкой интенсивности на фоне действия пептидов. В качестве стрессирующего воздействия использовали включение яркой лампы на 6 сек. До введения веществ трижды регистрировали фоновые значения ЭКГ. После третьей регистрации крысам вводили исследуемые пептиды (MEHFPGP, EHFPGP, R-MEHFPGP или ERP) и регистрировали ЭКГ еще 4 раза с интервалом в 15 минут. В ходе каждой регистрации запись ЭКГ проводилась в течение 150 сек, при этом в течение первых 6 секунд запись проводилась в тишине и при свете красной лампы, затем на 6 секунд включали яркий свет, после выключения которого регистрация продолжалась в бесстрессорных условиях. При обработке данных анализировались интервалы записи длительностью 3 сек.

В следующей серии экспериментов мы проводили ренистрацию ЭКГ крыс в покое и на фоне действия стрессогенных факторов высокой интенсивности. Стрессирующими стимулами в данном случае являлись включение яркого света и звук электрического звонка. Адаптация животных к экспериментальным условиям и регистрация ЭКГ в покое проводилась в тех же условиях, что и в первой части работы. На следующие сутки после записи ЭКГ в покое проводилось исследование изменения ЭКГ в ответ на стрессирующее воздействие высокой интенсивности на фоне действия пептидов (MEHFPGP или ERP). Каждую крысу помещали в камеру 3 раза с интервалом в 15 минут для регистрации фоновых значений ЭКГ. После третьей посадки проводили инъекции препаратов. Далее через каждые 15 минут снимали показания ЭКГ еще 4 раза. В ходе каждой регистрации запись ЭКГ проводилась в течение 120 сек, при этом в течение первых 20 секунд запись велась в тишине и при свете красной лампы, затем на 20 секунд включали яркий свет и звонок, после выключения которого регистрация продолжалась в бесстрессорных условиях. При обработке данным анализировались интервалы записи длительностью 3 сек.

Статистическая обработка данных.

При обработке результатов использовались стандартные методы статистического анализа. Вычислялись средние, стандартные отклонения и стандартные ошибки среднего массивов данных. При сравнении характеристик массивов применяли как параметрические (ANOVA), так и непараметрические л

Фишера, % ) критерии. Достоверность изменения показателей относительно фоновых значений внутри группы оценивалась с помощью парного критерия Стьюдента. Названные операции и оценка форм распределений массивов осуществлялись с помощью пакета статистических программ STATISTIKA.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Заключение диссертации по теме «Физиология», Глазова, Наталия Юрьевна

выводы

1. Аналог семакса, в котором отсутствует N-концевой метионин, -гексапептид EHFPGP - сохраняет выраженную ноотропную активность прототипа.

2. Удаление двух N-концевых аминокислот в молекуле семакса приводит к снижению ноотропной активности, отщепление трех аминокислотных остатков приводит к полной потере ноотропных свойств пептида.

3. Наблюдаемые при введении семакса ноотропные эффекты могут быть результатом действия как исходного гептапептида, так и продуктов его ферментативной деградации. Высокая активность и устойчивость фрагмента семакса гексапептида EHFPGP может обеспечивать пролонгированнось эффектов.

4. Модификация N-концевого метионина в молекуле семакса присоединением остатка глюконовой кислоты или его замена на лизин не влияет на выраженность эффектов, но приводит к снижению длительности ноотропного действия; замена на серин или триптофан вызывает ослабление ноотропных эффектов; замена на глицин, аланин или треонин приводит к потере ноотропной активности.

5. Модификация N-концевой области в молекуле семакса влияет на выраженность и длительность ноотропного действия пептида. Можно предположить, что это связано с изменением скорости и путей его протеолитической деградации.

6. Аналоги фрагментов АКТГ - семакс, rMEHFPGP, EHFPGP и ERP не оказывают влияния на параметры сердечного ритма крыс в покое. Исследованные пептиды воздействуют на изменение ЧСС в ответ на стимулы окружающей среды.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Исследование протеолитического расщепления АКТГ4.ю и семакса показало, что ключевым ферментом деградации этих пептидов в сыворотке крови является аминопептидаза; при этом первичным актом деградации является отщепление N-концевого метионина. Но если природный фрагмент довольно быстро деградирует далее, то семакс образует достаточно стабильный интермедиат со структурой EHFPGP. В ходе дальнейшего расщепления образуются пента- и тетрапептиды соответствующей структуры [Potaman et al., 1991; 1993]. Проведенными нами исследования показали, что аналог семакса, лишенный N-концевого метионина, обладает выраженной ноотропной активностью. При этом, в отличие от природных фрагментов АКТГ, в которых отсутствие N-концевого метионина приводит к резкому падению активности, отщепление N-концевой аминокислоты от молекулы семакса приводит к некоторому усилению ноотропного действия препарата. Вероятно, это объясняется наличием в молекуле С-концевой последовательности Pro-Gly-Pro, которая приводит к увеличению протеолитической устойчивости пептида.

Продукт дальнейшего расщепления семакса пентапептид HFPGP также способен улучшать обучение животных, однако его эффекты значительно менее выражены и не полностью совпадают с эффектами семакса. Введение тетрапептида FPGP не оказывало влияния на обучение животных ни в одном из использованных тестов, следовательно, тетрапептид не обладает нейротропной активностью. Таким образом, отщепление от N-конца молекулы семакса трех аминокислот приводит к полной потере нейротропных свойств. Исследования, проведенные ранее в нашей лаборатории, показали, что трипептид PGP также не обладает ноотропной активностью [Левицкая и др., 2000].

Несмотря на то, что отщепление N-концевой аминокислоты приводит к образованию гексапептида с высокой ноотропной активностью, наши дальнейшие исследования показали, что аминокислотный остаток, находящийся в первом положении гептапептида - аналога семакса, играет важную роль в сохранении и выраженности его ноотропных эффектов. Модификация метионина в молекуле семакса присоединением остатка глюконовой кислоты приводит к некоторым изменениям поведенческих эффектов препарата. Так, через 15 минут после введения эффекты обоих пептидов сопоставимы, через 1 час после инъекции rMEHFPGP проявляет большую поведенческую активность, а через 20 часов ноотропная активность rMEHFPGP проявляется в меньшей степени, чем активность семакса. Возможно, что усиление эффектов пептида через 1 час после введения объясняется тем, что использованная модификация увеличивает способность пептида проходить через ГЭБ, т.к. присоединение глюконовой кислоты к N-концевому метионину увеличивает гидрофобность молекулы. В случае замены метионина на лизин ноотропная активность аналога сохраняется через 15 мин после введения, однако через час эффекты пептида менее выражены, чем эффекты прототипа. Следовательно, модификация N-концевого метионина присоединением остатка глюконовой кислоты или замена его на лизин приводят к снижению длительности ноотропного действия аналогов семакса. Аналоги семакса, содержащие N-концевые серин или тирозин, проявляют более слабые ноотропные эффекты, чем семакс. Кроме того, пептид, содержащий N-концевой серин, улучшает обучение животных только в тестах с положительным подкреплением, a WEHFPGP, напротив, положительно влияет на обучение только в тесте с отрицательным подкреплением (УРАИ), т.е. спектр ноотропной активности этих пептидов сужается. Замена метионина в молекуле семакса на глицин, треонин или аланин проводит к полной потере ноотропных свойств препарата.

Пептиды в организме подвергаются деградации протеолитическими ферментами, что и является основным механизмом их инактивации. Однако существование различных протеаз и, следовательно, различных путей деградации пептидов может приводить к образованию разных пептидных последовательностей, которые могут действовать как синергисты или как антагонисты, модулируя ответ ЦНС [Lynch, Snyder, 1986]. Поэтому при изучении эффектов пептидов как эндогенного, так и экзогенного происхождения необходимо учитывать возможность того, что продукты протеолитической деградации этих веществ могут обладать собственной активностью.

Фрагмент АКТТУю оказывает ноотропное действие, хотя его активность составляет 0,5 активности АКТГ4ю. Нами показано, что продукты ферментативной деградации семакса - пептиды EHFPGP и HFPGP обладают поведенческой активностью и являются синергистами семакса в отношении его действия на процессы обучения. Следовательно, наблюдаемые при введении АКТГ4.10 и семакса эффекты могут быть результатом действия как исходных гептапептидов, так и их производных. При этом высокая активность и относительная устойчивость гексапептида EHFPGP может в значительной степени обеспечивать длительное действие семакса.

Полученные нами данные свидетельствуют о том, что аминокислотный остаток, находящийся в первом положении гептапептида - аналога семакса, играет важную роль в сохранении и выраженности его нейротропных эффектов. Мы предполагаем, что модификация N-концевой области молекулы пептида может влиять как на скорость, так и пути его протеолитической деградации. Как было сказано выше, основными ферментами деградации семакса в сыворотке крови являются аминопептидазы. Вклад карбокси- и эндопептидаз не очень высок [Potaman et al., 1991]. Однако в случае модифицированных пептидов вклад этих ферментов может изменяться. Так например, можно предположить участие эндопептидаз, которые осуществляют деградацию аналога АКТГ4.9 ORG 2766 - пептида, защищенного от N- и С- концевого расщепления [Verhoef, Witter, 1976]. В этом случае пептиды могут быстро деградировать с образованием малоактивных или неактивных (например, FPGP) фрагментов, что приведет к снижению или полной потере нейротропной активности. Кроме того, изучение путей деградации семакса в присутствии предполагаемых мишеней его действия - первичных культурах клеток нейронов и глии показало, что в этом случае деградация пептида происходит как с N, так и с С-конца с образованием 5-и и 4-х членных фрагментов [Долотов и др., 2004]. Можно предположить, что если в случае семакса при действии карбоксипептидаз будут образовываться фрагменты, содержащие в своей структуре последовательность АКТГ4.7 и сохраняющие нейротропную активность, то в случае аналогов семакса с модифицированной N-концевой областью аналогичные фрагменты могут быть мало активны или не активны.

Исследования кардиотропной активности семакса и ряда других синтетических меланокортинов показали, что введение семакса, продукта его деградации EHFPGP, его аналога rMEHFPGP и антагониста поведенческих эффектов семакса ERP не приводит к изменению параметров сердечного ритма крыс в покое. Известно, что некоторые природные меланокортины обладают действием на сердечно-сосудистую систему. Так, внутривенное введение у-МСГ может повышать артериальное давление, церебральный кровоток и частоту сердечных сокращений [Gruber, Callahan, 1989]. Фрагменты АКТГ также обладают кардиотропной аюивностью. Внутривенное введение АКТГ].24 вызывает понижение артериального давления, что сопровождается рефлекторной тахикардией. Однако более короткие пептиды, например АКТГ4.10, оказывают прессорное действие при периферическом введении, но их эффекты в 5-10 раз слабее, чем эффекты у-МСГ [Van Bergen et al, 1995]. Рядом авторов было высказано предположение, что для проявления кардиотропных эффектов необходима последовательность His-Phe-Arg-Trp, расположенная близко к С-концевой области молекулы пептида [Versteeg et al., 1998]. Ни семакс, ни другие исследованные нами меланокортины не содержат этой последовательности, вероятно, поэтому и не проявляют кардиотропных эффектов. Следовательно, полученные нами результаты согласуются с высказанным ранее предположением о необходимости сохранения в структуре аналогов фрагментов АКТГ/МСГ последовательности His-Phe-Arg-Trp для проявления кардиотропной активности.

Дальнейшие эксперименты показали, что введение семакса приводит к уменьшению брадикардической фазы ответа организма на изменения окружающей обстановки. Кардиотропные эффекты rMEHFPGP были близки к эффетам семакса. Известно, что у животных с выраженной активной реакцией на изменение обстановки наблюдается увеличение ЧСС, связанное с активацией симпатической системы [Sgoifo et al, 1994] Напротив, брадикардическая реакция коррелировала с пассивным поведением животных - реакцией замирания, затаивания [Nyakas et al, 1998]. Можно предположить, что наблюдаемые нами эффекты семакса и его аналога rMEHFPGP связаны с усилением активной реакции животного на изменение окружающей среды. Введение антагониста поведенческих эффектов семакса трипептида ERP приводит к усилению брадикардической фазы ответа на изменение освещенности, что может соответствовать поведенческой реакции затаивания. Наблюдаемые нами эффекты, возможно, связаны со снижением активной реакции животных на внешние стимулы.

На основании полученных нами данных можно сделать следующие заключения: ноотропные эффекты семакса могут быть результатом действия как исходного препарата, так и продуктов его деградации; модификация N-концевой области молекулы влияет на выраженность и длительность ноотропного действия аналогов семакса, что может быть связано с изменением скорости и путей деградации молекулы пептида; аналоги фрагментов АКТГ, улучшающие обучение животных, уменьшают брадикардическую фазу ответа на стрессогенное воздействие; введение антагониста поведенческих эффектов семакса ERP нарушает адекватную реакцию животных на стимулы внешней среды.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Глазова, Наталия Юрьевна, 2004 год

1. Алексеева Г.В., Боттаев Н.А., Горошкова В.В. Применение семакса в отдаленном периоде у больных с постгипоксической патологией мозга // Анестезиология и реаниматология, 1999, N1, с.40-43.

2. Антонова JI.B., Каменский А.А., Незавибатько В.Н. Сравнение поведенческих эффектов кортикотропина и его фрагментов, лишенных гормональной активности // тезисы докладов симпозиума "Физиология пептидов", 1988, Ленинград, с.7-8.

3. Асташкин Е.И., Беспалова Ю.Б., Гривенников И.А., Смирнов О.Н., Глезер М.Г., Грачев С.В., Мясоедов Н.Ф. Изучение влияния семакса на Са2+-ответы нейтрофилов человека //ДАН, 2000, т.374, N3, с.401-403.

4. Ашмарин И.П., Антонова JI.B., Титов С.А., Максимова JI.A., Каменский А.А. Возможные механизмы разнонаправленного действия АКТГ4-10 и его аналога, содержащего D-изомер фенилаланина, на поведение // Журнал ВНД, 1980, т.ЗО, вып.6, с. 1196-1202.

5. Ашмарин И.П., Каменский А.А., Шелехов C.JI. Действие фрагмента адренокортикотропного гормона АКТГ(4-10) на обучение белых крыс при положительном подкреплении //ДАН СССР, 1978, т.240, N 5, с. 1245-1247.

6. Виноградов В.М., Медведев В.И., Гречко А.Т., Бахарев В.Д., Пономарева-Степная М.А. Влияние на поведенческую активность крыс нейропептидовфрагментов АКТГ и вазопрессина // Физиологический журнал СССР, 1980, т. 66, с.409 -415.

7. Вознесенская В.В., Полетаева И.И. Влияние АКТГ(4-10) на поведение мышей // Журнал ВИД, 1984, т.34, с.32-37.

8. Геренко А.Н., Незавибатько В.Н., Волков А.В., Каменский А.А. Двигательная активность крыс в посреанимационном периоде // Вестн. МГУ, сер. 16, Биология, 1991, N3, с.24.

9. Гистология, цитология и эмбриология Под. ред. Афанасьева Ю.И., Юриной Н.А. //Москва: "Медицина", 1999

10. Глебов Р.Н., Горячева Т.В. АКТГ как нейропептид. Функциональная роль в мозге. // Патол. физиология и эксп. тер., 1990, N4, с.54-57.

11. Гривенников И.А., Долотов О.В., Гольдина Ю.И. Факторы пептидной природы в процессах пролиферации, дифференцировки и поддержания жизнеспособности клеток нервной системы млекопитающих // Молекулярная биология, 1999, т.ЗЗ, N1, с.120-126.

12. Громов Л.А. Нейропептиды // 1992, Киев, Здоровье, с.248.

13. Еремин К.О., Кудрин B.C., Андреева JI.A., Гривенников И.А., Мясоедов Н.Ф., Раевский К.С. Влияние семакса на содержание и обмен моноаминов в мозге мышей линии C57/BL // Нейрохимия, 2002, т.19, N3, с.202-205.

14. Замятнин А.А. Специализированный банк данных EROP-Moscow о регуляторных олигопептидах с Internet-доступом. // Тезисы докладов Российского симпозиума по химии и биологии пептидов. М., 2003.

15. Иванова Ю.В., Яснецов В.В. Влияние семакса и мексидола на течение острого панкреатита у крыс // Экспериментальная и клиническая фармакология, 2000, т.63, N1, с. 41-44.

16. Каплан А.Я., Кошелев В.Б., Незавибатько В.Н., Ашмарин И.П. Повышение устойчивости организма к гипоксии с помощью нейропептидного лекарственного препарата семакс // Физиология человека, 1992, т. 18, N5, с. 104-107.

17. Левицкая Н.Г., Антонова Л.В., Незавибатько В.Н., Каменский А.А., Дубынин В.А., Голубович В.П., Пономарева-Степная М.А., Ашмарин И.П. Новый антагонист функциональных эффектов стимулятора обучения АКТГ(4-7) // ДАН, 1993, т.331, № 4, с. 512-514.

18. Левицкая Н.Г., Латышева Н.В., Андреева Л.А., Каменский А.А. Поведенческие эффекты трипептида Pro-Gly-Pro // Вестник Москлвского Университета, сер. 16 Биология, 2000, № 2, с. 17-22

19. Нейрохимия Под ред. Ашмарина И.П., Стукалова П.В. // Москва, изд-во Института Биомедицинской химии РАМН, 1996.

20. Полунин Г.С., Нуриева С.М., Баяндин Д.Л., Шеремет Н.Л., Андреева Л.А. Определение терапевтической эффективности нового отечественного препарата «Семакс» при заболеваниях зрительного нерва // Вестник офтальмологии, т.116, N1, с. 15-18.

21. Пономарева-Степная М.А., Незавибатько В.Н., Антонова Л.В., Андреева Л.А., Потаман В.Н., Каменский А.А., Ашмарин И.П. Декапептид седативного действия // Хим.-фарм. Ж., 1986, N10, с. 1195-1199.

22. Пономарева-СтепнаяМ.А., Незавибатько В.Н., Антонова Л.В., Андреева Л.А., Алфеева Л.Ю., Потаман В.Н., Каменский А.А., Ашмарин И.П. Аналог АКТГ4.10- стимулятор обучения пролонгированного действия // Хим.-Фарм. Ж., 1984, N7, с.790-795.

23. Розен В.Б. Основы эндокринологии // М.: Изд-во МГУ, 1994

24. Титов С.А., Каменский А.А. Роль ориентировочного и оборонительного компонентов в поведении белых крыс в условиях "открытого поля" // Журнал ВНД, 1980, т.30, вып.4, с.704-715

25. Allen J.P., Kendall J.W., McGilvra R., Vancura C. Immunoreactive ACTH in cerebrospinal fluid // J. Clin. Endocrinol, 1974, v.38, p.486-493.

26. Ambler.L., Bennet H.P., Hudson A.M, McMartin C. Fate of human corticotropin immediately after intravenous administration to the rat // J. Endocrinol., 1982, v.93, N2, p. 287-292.

27. Amir S., Galina Z.H., Blaiz R., Brown Z.W., Amit Z. Opiate receptors may mediate the suppressive but not the excitatory action of ACTH on motor activity in rats // Eur. J. Pharmacol, 1980, v.66, p.307-313.

28. Antonawich FJ, Azmitia EC, Kramer HK, Strand FL. Specificity versus redundancy of melanocortins in nerve regeneration // Ann NY Acad Sci, 1994, v. 739, p. 60-73.

29. Argiolas A, Melis MR, Murgia S, Schioth HB. ACTH- and a-MSH-induced grooming, stretching, Yawning and penile erection in male rats: site of action in the brain and role of melanocortin receotors // Brain Res Bull, 2000, v. 51, p. 425-31.

30. Ashmarin IP, Levitskaya NG, Antonova LV, Nezavibatko VN, Alfeeva LYu, Dubinin VA, Golubobich VP, Ponomareva-Stepnaya MA, Kamensky AA. The neurotropic activity of a structural analog of ACTH(5-7) // Regulatory Peptides, 1994, v. 51, p.49-54.

31. Ashmarin IP, Nezavibatko VN, Levitskaya NG, Koshelev VB, Kamensky AA. Design and investigation of an ACTH(4-10) analogue lacking D-amino acids and hydrophobic radicals // Neurosci. Res. Commun., 1995, v. 16, p. 105-112.

32. Attella MJ, Hoffman SW, Piotte MP, Stein DG. Effects of BIM-22015, an analog of ACTH4-10, on functional recovery after frontal cortex injury // Behav Neural Biol, 1992, v.57, N2, p. 157-166.

33. Azmitia EC, De Kloet ER. ACTH neuropeptide stimulation of serotonergic neural maturation in tissue culture: modulation by hippocampal cell // Prog. Brain Res., 1987, v. 50, p. 689-697.

34. Beaty P.A., Beatty W.W., Bowman R.E., Gilchrist J.C. The effects of ACTH, adrenalectomy and dexametasone on the acquisition of an avoidance response in rats //Physiol. Behav, 1970, v.5, p.939-944.

35. Bertolini A., Poggioli R., Ferrari W. ACTH-induced analgesia in rats // Experientia 1979, v. 35, N9, p. 1216-1217.

36. Bhardwaj R, Becher E, Mahnke K, Hartmeyer M, Schwarz T, Scholzen T, Luger ТА. Evidence for the differential expression of the functional a-melanocyte-stimulating hormon receptor MC-1 on human monocytes // J Immunol, 1997, v.158, p. 3378-84.

37. Bohus B. Pituitary-adrenal hormones and forced extinction of a passive avoidance response in the rat // Brain Res., 1974, v.66, p.366-367.

38. Bohus В., De Wied D. Actions of ACTH- and MSH-like peptides on learning, performance, and retention // In: Endogenous peptides and learning and memory processes // Academic press, New York, London, 1981, p.60-74.

39. Bohus В., De Wied D. Inhibitory and facilitatory effect of two related peptides on extinction of avoidance behaviour // Science, 1966, v. 153, p. 318-320.

40. Bohus В., Endroczi E. The influence of pitutary-adrenocortical function on the avoiding conditioned reflex activity in rats // Acta Physiological Academiae Scientiarum Hungaricae, 1965, v.26, p.183-189.

41. Bohus В., Nyakas C.S., Endroczi E. Effects of adrenocorticotropic hormone on avoidance behaviour of intact and adrenalectomized rats // Inter. J. Neuropharmacol., 1968, v.7, p.307-314.

42. Boston В A, Cone RD. Characterization of melanocortin receptor subtype expression in murine adipose tissues and in the 3T3-L1 cell line // Endocrinology, 1996, v. 137, p. 2043-50.

43. Boston BA. The role of the melanocortins in adipocyte function // Ann NY Acad Sci, 1999, v. 885, p. 75-84.

44. Bousquet-Melou A,Galitzky J, Lafontan M, Berlan M. Control of lipolysis in intra-abdominal fat cells of nonhuman primates: comparison with humans // J Lipid Res, 1995, v. 36, p. 451-61.

45. Bravenboer B, Kappelle AC, van Buren T, Erkelens DW, Gispen WH. ACTH4-9 analogue ORG 2766 can improve existing neuropathy in streptozocin-induced diabetic rats. // Acta Diabetol, 1993, v. 30, N1, p.21-24.

46. Brzoka T, Kalden D-H, Fastrich M, Moller M, Schioth HB, Wikberg JES, Luger T. Two new a-melanocyte-stimulating hormon (a-MSH) analogues (MS05 and MS09) are potent immunomodulators in vivo and in vitro // J Invest Dermatol, 1999, v. 113, p. 482.

47. Buggy JJ. Binding of a-melanocyte-stimulating hormon to its G-protein-coupled receptor on B-lymphocytes activates the Jak/STAT pathway // Biochem J, 1998, v. 331, p. 211-6.

48. Chagnon YC, Chen WJ, Perusse L, Hagnon M, Nadeau A, Wilkinson W, Bouchard С // Linkage and association studies between the melanocortinreceptors 4 and 5 genes and obesity-related phenotypes in the Quebec family study // Mol Med, 1997, v. 3, p. 663-73.

49. Chen W, Kelly MA, Opitz-Araya X, Thomas RE, Low MJ, Cone RD. Exocrine gland dysfunction in MC5-R-deficient mice: evidence for coordinated regulation of exocrine gland function by melanocortin peptides // Cell, 1997, v. 91, p. 78998.

50. Chhajlani V, Wikberg JEC. Molecular cloning and expression of the melanocyte stimulating hormone receptor cDNA // FEBS Lett, 1992, v. 309, p. 417-420.

51. Chhajlani V. Distribution of cDNA for melanocortin receptor subtypes in human tissues // Biochem Mol Biol Int, 1996, v. 38, p. 73-80.

52. Chiao H, Foster S, Thomas R, Lipton J, Star RA. Alfa-melanocyte-stimulating hormone reduces endotoxin-induced liver inflammation // J Clin Invest, 1996, v.97, p. 2038-44.

53. Cone RD. Editoral: the corticotropin-releasing hormone system and feeding behavior a complex web being to unravel // Endocrinology, 2000, v. 141, N 8, p. 2713-14.

54. Daynes RA, Robertson В A, Cho BH, Burnham DK, Newton R. Alfa-melanocyte-stimulating hormone exhibits target cell selectivity in its capacity to affect interleukin 1-inducible responses in vivo and in vitro // J Immunol, 1987, v. 139, p. 103-9.

55. De Koning P, Gispen WH. Org2766 improves functional and electrophysiological aspects of regenerating sciatic nerve in the rat // Peptides, 1987, v.8, N3,p.415-422.

56. De Wied D, Jolles J. Neuropeptides derived from proopiocortin: Behavioural, physiological, and neurochemical effects // Physiol Rev, 1982, v.62, p.976-1059.

57. De Wied D, Witter A, Greven HM. Commentary: behaviourally active ACTH analogues // Biochemical Pharmacology, 1975, v. 24, p. 1463-1468.

58. De Wied D. Effects of peptide hormones on behaviour // Frontiers in Neuroendocrinology, 1969, p. 97-140.

59. De Wied D. Influence of anterior pitutary on avoidance learning and escape behavior // American Journal of Physiology, 1964, v. 7, p. 307-314.

60. De Wied D. Inhibitory effect of ACTH and related peptides on extinction of conditioned avoidance brhaviour in rats // Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 1966, v.122, p.28-32.

61. De Wied D. Melanotropins as neuropeptides // Ann NY Acad. Sci, 1993, v. 680, p. 20-28.

62. Dempsey G.L., Kastin A.I., Schally A.V. The effects of MSH on restructed passive avoidance response // Horm. Behav, 1975, v. 3, p. 333-337.

63. Denenberg V.H., Cartner I., Myers M. Absolute measurement of open-field activity in mice // Physiol, and Behav, 1975, v. 15, p. 505-509.

64. Dinulescu DM, Cone RD. Agouti and agouti-related protein: analogies and contrasts // J Biol Chem, 2000, v. 275, p. 6695-8.

65. Duckers H.J., Verhaagen J., Gispen W.H. The neurotropic analogue of ACTH(4-9), ORG 2766, protects against experimental allergic neurits // Brain, 1993, v.116, p.1059-1075.

66. Dunbar JC, Lu H. Proopiomelanocortin (POMK) products in the central regulation of sympathetic and cardiovascular dynamics: studies on melanocortin and opioid interaction // Peptides, 2000, v.21, p.211-7.

67. Endocsi E., Lissak K., Fekete Y., De Wied D. Effects of ACTH on EEG habitation in human subjects // Pituitary, Adrenal and Brain: Progress in Brain Research / Ed. by D. De Wied, J.A.W.M., Weijnen, 1970, v. 57, p. 297-307.

68. Fratta W., Rossetti Z.L., Poggioli R., Gessa G.L. Reciprocal antagonism between ACTH 1-24 and beta-endorphin in rats // Neurosci. Lett. 1981, v. 24, p. 71-74.

69. Garrud P., Gray I.A., De Wied D. Pituitary-adrenal hormones and extinction of rewarded behaviour in the rat / / Physiol. Behav, 1974, v.5, p. 109-119.

70. Garrud P., Gray J.A., De Wied D. Pituitary-adrenal hormones and effects of partial reinforcement of appetitive behavior in rats // Physiology and Behavior, 1974, v.18, p.813-818.

71. Gispen W.H., Buitelaar J., Wiegant V.M., Terenius L., De Wied D. Interaction between ACTH fragments, brain opiate receptors and morphine-induced analgesia // Eur. J. Pharmacol. 1976, v. 39, p. 393-397.

72. Gispen WH, Hamers FP, Vecht CJ , Jennekens FG, Neyt JP. ACTH/MSH like peptides in the treatment of cisplatin neuropathy // J Steroid Biochem Mol Biol, 1992, v. 43, N1-3, p.179-183.

73. Glyn JR, Lipton JM. Hypotermic and antipyretic effects of centrally administered ACTH (1-24) and alfa-melanotropin // Peptides, 1981; v.2, p. 177-87.

74. Gold P.E., van Buskirk R. Effects of posttrial injections on memory processes // Hormones and behavior, 1976, v.7, p.509-517.

75. Gray J.A. Effects of ACTH on extinction of rewarded behaviour is blocked by previous administration of ACTH //Nature, 1977, v.229, p.52-54.

76. Greven HM, De Wied D. The influence of peptides derived from corticotrophin (ACTH) on performance. Structure activity studies // Progress in Brain Research, 1973, v. 39, p.429-442.

77. Gruber KA, Callahan MF. ACTH-(4-10) through y-MSH: evidence for a new class of central autonomic nervous system-regulating peptides // Am J Physiol, 1989, v.257, p.R681-94.

78. Guth S., Levine S., Seward J.P. Appetitive acquisition and extinction effects with exogenous ACTH // Physiology and Behavior, 1971, v.7, p. 195-200.

79. Hall С. Emotional behavior in the rat // J. Сотр. Psychol, 1936, v.22, p.345-349.

80. Hamers FP, Pette C, Bravenboer B,Vecht CJ, Neijt JP, Gispen WH. Cisplatin-induced neuropathy in mature rats: effects of the melanocortin-derived peptide ORG2766 // Cancer Chemother Pharmacol, 1993, v. 32, N2, p. 162-166.

81. Hannigan JH, Isaacson RL. The effects of Org 2766 on the performance of sham, neocortical and hippocampal lesioned rats in a food search task // Pharmacology Biochemistry and behavior, 1985, v. 23, p. 1019-1027.

82. Healy E, Flannagan N, Ray A, Todd C, Jackson IJ, Matthew JN, Birch-Machin MA, Rees JL. Melanocortin -1-receptor gene and sun sensitivity in individuals without red hair // Lancet, 2000, v. 355, p. 1072-3.

83. Hoi EM, Gispen WH, Bar PR. ACTH-related peptides: receptors and signal transduction systems involved in their neurotrophic and neuroprotective actions // Peptides, 1995, v.16, p.979-993.

84. Huebner A, Elias LLK, Clark AJL. ACHT resistance syndromes // J Pediatr Endocrinol Metab, 1999, v. 12 (Suppl. 1), p. 277-93.

85. Ichiyama T, Sakai T, Catania A, Barsh GS, Furukawa S, Lipton JM. Systemically administered alfa-melanocyte stimulating peptides inhibit NF-kB activation in experimental brain inflammation // Brain Res, 1999, v.836, p. 31-37.

86. Ichiyama T, Sakai T, Catania A, Barsh GS, Furukawa S, Lipton JM. Inhibition of peripheral NF-kB activation by central action of alfa-melanocyte stimulating hormone // J Neuroimmunol, 1999, v. 99, p. 211-217.

87. Igaraski M, Ishikawa K, Ishii M, Schmidt K. Effect of АСТЩ4-10) on equilibrium compensation after unilateral labyrinthectomy in the squirrel monkey // Eur. J. Pharmacol, 1985, v.l 19, p. 239-242.

88. Izquierdo I, Dias RD. Effect of ACTH, epinephrine, beta-endorphin, naloxone and of the combination of naloxone or beta-endorphin with ACTH or epinephrine on memory consolidation // Psychoneuroendocrinology, 1983, v. 8, N.l, p. 81-7.

89. Kaplan AYa, Kochetova AG, Nezavibatko VN, Rjasina TV, Ashmarin IP. Synthetic ACTH analogue semax displays nootropic-like activity in human // Neuroscience research communications, 1996, v.19, N2, p.115-123.

90. Kask A, Rago L, Korrovits P, Wikberg JES, Schioth HB. Evidence that orexigenic effects of melanocortin 4 receptor antagonist HS014 are mediated by neuropeptide Y // Biochem Biophys Res Commun, 1998B, v. 248, p. 245-249.

91. Kask A, Rago L, Mutulis F, Pahkla R, Wikberg JES, Schioth HB. Selective antagonist for the melanocortin 4 receptor (HS014) increases food intake in free-feeding rats // Biochem Biophys Res Commun, 1998 C, v. 245, p. 90-93.

92. Kask A, Rago L, Wikberg JES, Schioth HB. Differential effect of melanotropin peptides on feeding in rats: Evidence against the involvement of melanocortin MC3 receptor in the regulation of food intake // Neurosci Lett, 2000, v. 283, p. 1-4.

93. Kask A, Rago L, Wikberg JES, Schioth HB. Evidence for involvement of the melanocortin 4 receptor in the effects of leptin on food intake // Eur J Pharmacol, 1998A, v. 360, p. 15-19.

94. Kastin A.I., Plotnikoff N.P., Sandman C.A. et al. The effects of MSH and MIF on the brain // In: Anatomical Neuroendocrinology, Basel, 1975, p.290-297.

95. Kelsey J.E. Role of pituitary-adrenocortical system in mediating avoidance behavior of rats with septal lessions // J. Сотр. Psichol, 1975, v.88, p.271-280.

96. Kistler-Heer V, Lauber ME, Lichtensteiger W. Different developmental patterns of melanocortin MC3 and MC4 receptor mRNA: predominance of MC4 in fetal rat nervous system // J Neuroendocrinol, 1998, v. 10, p. 133-46.

97. Klusa V, Svirskis S, Opmane B, Muceniece R, Skujins A, Mutulis F,Wikberg JES, Schioth HB. Evaluation of behavioural effects of neural melanocortin receptor antagonists injected icv and VTA in rats // Neuropeptides, 1998, v. 32, p. 573-80.

98. Klusa V., Germane S., Svirskis S., Wikberg J.E. The gamma(2)-MSH peptide mediates a central analgesic effect via a GABA-ergic mechanism that is independent from activation of melanocortin receptors // Neuropeptides 2001, v. 35, N1, p. 50-57.

99. Krishnan S, Maickel RP. The effect of Hoe-427 (an ACTH4.9 analog) on free-choice ethanol consumption in male and female rats // Life Sci, 1991, v.49, p.2005-2011.

100. Kshatri A.M., Foster P.A. Adrenocorticotropic hormone infusion as a novel treatment for postdural puncture headache. // Reg Anesth 1997, v. 22, p. 432-434

101. Kumar KB, Karanth KS. Effects of ACTH and ACTH 4-10 on aversive memory retrieval in rats // J Neural Transm Gen Sect, 1995, v. 101, N 1-3, p.223-9.

102. Levine S., Jones L.E. Adrenocorticotropic hormone (ACTH) and passive avoidance learning // J. Сотр. Physiol. Psichol, 1965, v.59, p.357-360.

103. Levine S., Smotherman W.P., Hennessy J.W. Pituitary-adrenal hormones and learned taste aversion // In: Neuropeptide influences on the brain and behavior.-N.Y., Paven. Press., 1977, p.163-179.

104. Li C.H., Barnafi L., Chretien M., Chung D. Isolation and amino-acid sequence of b-LPH from sheep pituitary glands // Nature, 1965, v.208, p. 1093-1094.

105. Li WD, Joo EJ, Furlong EB, Golvin M, Abel K, Bell CJ, Price RA. Melanocortin 3 receptor (MC3R) gene variants in extremely obese women // Int J Obes Relat Metab Disort, 2000, v. 24, p. 206-10.

106. Li X.C., Li H.D., Zhao B.Y. Serotonin of hippocampus and hipotalamus taking part in the analgesic effect of adrenocorticotropic hormone in rats // Zhongguo Yao Li Xue Bao 1990, v. 11, N1, p. 89-92

107. Lin C., Sarath G., Frank J.A., Krueger R.J. Bivalent ACTH antagonists: Influence of peptide and spacer components on potency enhancement // Beochem. Pharmacol., 1991, v.41, p.789-795.

108. Liotta A.S., Advis J.P., Krause J.E., McKelly J.F., Krieger D.T. Demonstration of in vivo synthesis of proopiomelanocortin, beta-endorphin and alfa-melanotropin-like species in the adult rat brain // Neuroscience, 1984, v.4, p.956-965.

109. Lipton JM, Glyn JR. Central administration of peptides alters thermoregulation in the rabbit // Peptides, 1980, v. 1, p. 15-8.

110. Luneburg U, Flohr H. Effects of melanocortins on vestibular compensation // In Progress in Brain Research, 1988, v. 76, p. 421-429.

111. Lynch D.K., Snyder S.H. Neuropeptides: multiple molecular forms, metabolic pathways and receptors // Ann. Rev. Biochem., 1986, v. 55, p. 773-799.

112. Marsh DJ, Hollopeter, Yagaloff KA, Fisher SL, Burn P, Palmiter RD. Response of melanocortin-4 receptor-deficient mice to anorectic and orexigenic peptides // Nat Genet, 1999, v. 21, p. 119-22.

113. Matsumoto T, Tsuda S, Nakamura S. The neurotrophic effects of ebiratide, an analog of ACTH4-9, on cultured septal cells and aged rats // J Neural Transm Gen Sect, 1995, v.100, N1, p.1-15.

114. Mc Gaught J.L., Gold P.E., Van Buskirk R., Haycock J. Modulating influences of hormones and catecholamines on memory storage processen // Prog. Brain Res, 1975, v.42,p.l51-162.

115. Mezey E., Palcovitz M., De Kloet E.R., Velhoef J., De Wied D. Evidince for pituitary-brain transport of a behaviorally potent ACTH analog // Life Sci., 1978, v.22, p.831-838.

116. Miller MW, Duhl DM, Vrieling H, Cordes SP, Ollmann MM, Winkers BM, Barsh GS. Cloning of the mouse agouti gene predicts a secreted protein ubiquitously expressed in mice carrying the lethal yellow mutation // Genes Dev, 1993, v. 7, p. 454-67.

117. Miller R.E., Ogawa N. The effect of adrenocorticotropic hormone (ACTH) on avoidance conditioning in the adrenalectomized rat // J. Сотр. Physiol. Psichol., 1962, v.55,p.211-213.

118. Mirsky J.A., Miller R., Stein M. Relation of adrenocortical activity and adaptive behaviour//Psychosomatic Medicine, 1953, v.15, p.574-584.

119. Muglia LJ, Jacobsen L, Dikkes P, Majzoub J. Corticotropin-releasing hormone deficiency reveals major fetal but not adult glucocorticoid need // Nature, 1995, v. 373, p. 427-432.

120. Murphy J.V., Miller R.E. The effect of ACTH on avoidance conditioning in the rat // J. Сотр. Physiol. Psychol, 1955, v.48, p.47-49.

121. Murphy J. V., Miller R.E. The effect of ACTH on avoidance conditioning in the rat // J. Сотр. Physiol. Psychol, 1955, v.48, p.47-49.

122. Nakanishi S., Inoue A., Kita Т., Nakamura M., Chang A., Cohen S.N., Numa S. Nucleotide sequence of cloned cDNA for bovine corticotropin-beta-lipotropin precursor // Nature, 1979, v.278, p.423-427.

123. Nicholson W.E., Liddle R.A., Puett D., Liddle G.W. Adrenocorticotropic hormone biotransformation, clearance, and catabolism // Endocrinology, 1978, v.103, p.1344-1351.

124. Nyakas C., Endroczi E. Effect of ACTH-peptides given at an early postnatal age an adult adaptive behavior of rats // Acta Med. Acad. Sci. Hung, 1980, v.36, p.321-323.

125. Ohkubo Т., Shibata M., Takahashi H., Naruse S. Naloxone prevents the analgesic action of alpha-MSH in mice // Experientia 1985, v. 41, N5, p. 627-628.

126. Owens MJ, Nemeroff CB. Physiology and pharmacology of corticotropin-releasing foctor //Pharmacol Rev, 1991, v. 43, p. 425-473.

127. Pacak K, Palkovits M. Stressor specificity of central neuroendocrine responses: implications for stress-related disorders // Endocrine Reviews, 2001, v. 22, N 4, p. 502-548.

128. Pancheri P, Biondi M, Chiaie RD, Marchini AM, Fierro A, Giovannini C. ACTH 1-17 and short-term memory, anxiety, heart rate, blood pressure // Ric Clin Lab, 1984, v.14, N2, p.221-9.

129. Panskepp J, Reilly P, Bishop P, Meeker RB, Vilberg TR, Kastin AJ. Effects of alfa-MSH on motivation, vigilance and brain respiration // Pharmacol Biohem Behav, 1976, v. 5, p. 59-64.

130. Pitsikas N, Spruijt BM, Josephy M, Algeri S, Gispen WH. Effect of Org2766, an ACTH(4-9) analogue, on recovery after bilateral transection of the fimbia fornix in the rat // Pharmacol Biochem Behav, 1991, v. 38, N4, p.931-934.

131. Plantinga LC, Verhaagen J, Edwards PM, Hali M, Brakkee JH, Gispen WH. Pharmacological evidence for the involvement of endogenous a-MSH-like peptides in peripheral nerve regeneration // Peptides, 1995, v. 16, N2, p.319-324.

132. Poggioli R, Benelli A, Arletti R, Cavazzuti E, Bertolini A. Nitric oxide is involved in the ACTH-induced behavioral syndrome // Peptides, 1995, v. 16, p. 1263-8.

133. Potaman VN, Alfeeva LY, Kamensky AA, Levitzkaya NG, Nezavibatko VN. N-terminal degradation of ACTH(4-10) and its synthetic analog semax by the rat blood enzymes // BBRC, 1991, v. 176, N2, p.741-746 A.

134. Potaman VN, Alfeeva LY, Kamensky AA, Nezavibatko VN. Degradation of ACTH/MSH(4-10) and its synthetic analog Semax by rat serum enzymes: an inhibitor study // Peptides, 1993, v.14, N3, p.491-495.

135. Potaman VN, Antonova LV, Dubynin VA et al. Entry of the synthetic ACTH(4-10) analogue into the rat brain following intravenous injection // Neurosci. Lett., 1991, v.127, N1, p.133 B.

136. Rheins LA, Cotleur AL, Kleier RS, Hoppenjans WB, Saunder DN, Nordlund JJ. Alfa-melanocyte-stimulating hormone modulates contact hypersensitivity responsiveness in C57/BL6 mice // J Invest Dermatol, 1989, v.93, p.511-7.

137. Sandman С.A., Kastin A.G. Intraventricular administration of MSH induces hiperalgesia in rats // Peptides 1981, v. 2, p. 231-233.

138. Sandman C.A., Kastin A.J., Schally A.V. Melanocite-stimulating hormone and learned appetitive behavior // Experimentia, 1969, v.25, p. 1001-1002.

139. Sands S.F., Wright A.A. Enhancement and disruption of retention performance by ACTH in a chois task // Behav. Neurol. Biol., 1979, v.-27, p.413-422.

140. Schioth HB, Chhajlani V, Muceniece R, Klusa V, Wikberg JEC. Major pharmacological distinction of the ACTH receptor from other melanocortin receptors // Life Sci, 1996, v. 56, p. 797-801.

141. Schioth HB, Prusis P, Muceniece R, Mutulis F, Mutule I, Wikberg JES. Thyrotropin releasing hormone (TRH) selectively binds and activates the melanocortin 1 receptor//Peptides, 1999, v. 20, p. 395-400.

142. Schioth HB, Yook P, Muceniece R, Wikberg JES, Szardenings M. Chimeric melanocortin MCI and MC3 receptors: identificatin of domains participating in binding of melanocyte-stimulating hormone peptides // Molecular Pharmacology, 1998, v. 54, p. 154-161.

143. Schwyzer R. Organization and transduction of peptide information // Trends Pharmacol. Sci., 1980, v.2, p.327-331.

144. Schwyzer R. Structure and function in neuropeptides // Proc. R. Soc. Lond., 1971, v.210, p.5-20.

145. Shipston MJ. Mechanism(s) of early glucocorticoid inhibition of ACTH secretion from anterior pituitary corticotropes // Trends Endocrinol Metab, 1995, v.6, p. 261-266.

146. Siedfried KR. First clinical impression with an ACTH analog (HOE 427) in the treatment of Alzheimer's disease // Ann NY Acad Sci, 1991, v.640, p.280-283.

147. Slominski A, Ermak G, Mihm M. ACTH receptor, CYP11A1, CYP17 and CYP21A2 genes are expressed in skin // J Clin Endocrinol Metab, 1996; v. 81, p. 2746-9.

148. Smock Т., Fields H.L. ACTH1-24 blocks opiate induced analgesia in the rat // Brain Res. 1981, v. 212, p. 202-206.

149. Smotherman W.P., Levine S. ACTH and ACTH(4-10) modification of neophobia and taste aversion responses in the rat // J. Сотр. Physiol. Psychol, 1978, v.92, p.22-23.

150. Spruijt B, Gispen W.H. Hormones and behaviour in higher vertibrates // Springer-Veriag, 1983, Berlin, p.l 18-136.

151. Spruijt BM. Effects of the ACTH4.9 analog Org2766 on brain plasticity: modulation of excitatory neurotransmission? // Psychoneuroendocrinology, 1992, v. 17,N4, p.315-325.

152. Strader AD, Schioth HB, Buntin JD. The role of the melanocortin system and the melanocortin 4 receptor in ring dove (Streptopelia risotia) feeding behavior // Brain Res, 2003, v. 960(1-2), p. 112-21.

153. Strand FL, Kung TT. ACTH accelerates recovery of neuromuscular function following crushing of peripheral nerve //Peptides, 1980, v. 1, p. 135-138.

154. Strand FL, Zuccarelli LA, Williams FLA, Lee SJ, Lee TS, Antonawich FJ, Alves SE. Melanotropins as growth factors // Ann NY Acad Sci, 1993, v.680, p. 29-50.

155. Strand FL. New vistas for melanocortins. Finally, an explanation for their pleiotropic functions // Ann NY Acad Sci, 1999, v. 897, p. 1-16.

156. Stratton O.L., Kastin AJ. Increased acquisition of a complex appetitive task after MSH and MIF // Pharmacology, 1975, v.3, p.901-904.

157. Sun XY, Feng QP, Gong QL, Edvinsson L, Hedner T. Cardiovascular and renal effects of gamma-MSG in spontaneously hypertensive and normotensive Wistar Kyoto rats // Am J Physiol, 1992, v. 262, p. R77-84.

158. Sydnor K.L., Sayers G. Biological half-life of endogenous ACTH // Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 1953, v.83, p.729-733.

159. Takeshige C., Tsuchiya M., Zhao W., Guo S. Analgesia produced by pituitary ACTH and dopaminergic transmission in the arcuate // Brain Res Bull 1991; v. 26, p. 779-788.

160. Takeuchi S, Kudo T, Takahashi S. Molecular cloning of the chicken melanocortin 2 (ACTH)-receptor gene // Biochim Biophys Acta, 1998, v. 1403, p. 102-8.

161. Takeuchi S, Takahashi S. A possible involvement of melanocortin 3 receptor in the regulation of adrenal gland function in the chicken // Biochim Biophys Acta, 1999, v. 1448, p. 512-8.

162. Takeuchi S, Takahashi S. Melanocortin receptor genes in the chicken-tissue distributions // Gen Comp Endocrinol, 1998, v. 112, p. 220-31.

163. Tonnaer J ADM, Weigant VM, De Jong W, De Wied D. Centraleffects of angiotensins on drinking and blood pressure: structure-activity relationships // Brain Res., 1982, v. 236, N2, p. 417-428.

164. Van Wimersma Greidanus Tj.B. Effects of MSH and related peptides on avoidance behavior in rats // In Tj.B. Van Wimersma Greidanus (ed) Frontiers in Hormone Research, 1980, Basel, Karger, v.4, p.129-139.

165. Vergoni AV, Bertolini A, Mutulis F, Wikberg JES, Schioth HB. Differential influence of a selective melanocortin MC4 receptor antagonist (HS014) on melanocortin-induced behavioural effects in rat // Eur J Pharmacol, 1998, v. 362, p. 95-101.

166. Vergoni AV, Bertolini A, Wikberg JES, Schioth HB. Corticotropin-releasing factor (CRH) induced anorexia is not influenced by a melanocortin 4 receptor blockade // Peptides, 1999, v. 20, p. 509-13.

167. Vergoni AV, Poggioli R, Marrama D, Bertolini A. Inhibition of feeding by ACTH(l-24): behavioral and pharmacological aspects // Eur J Pharmacol, 1990, v. 179, p. 347-355.

168. Verhoef J., Witter A. // Pharmacol. Biochem. Behav., 1976, v. 4, p. 583-590.

169. Versteeg DH, Van Bergen P, Adan RA, De Wildt DJ. Melanocortins and cardiovascular regulation // Eur J Pharmacol, 1998, v. 360, N 1, p. 1-14.

170. Wakamatsu K, Graham A, Cook D, Thody AJ. Characterisation of ACTH peptides in human skin and their activation of the melanocortin-1 receptor // Pigment Cell Res, 1997, v. 10, p. 288-97.

171. Walker J.M., Akil H., Watson S.J. Evidence for homologous actions of proopiomelanocortin products // Science 1980; v. 210, p. 1247-1249.

172. Weiss J.M., Mc Even B.S., Silva M., Kalkut M. Pituitary-adrenal alteration and fear responding // Amer. J. Physiol, 1970, v.218, p.864-868.

173. Wiegant V.M., Gispen W.H. ACTH-induced excessive grooming in the rat: latent activity of ACTH(4-10) // Behav. Biol, 1977, v.19, p.554-558.

174. Wiemer G, Gerharhs HJ, Hock FJ, Using P, Van Rechenberg W, Geiger R. Neurochemical effects of the synthetic ACTH4.9 analog Hoe 427 (Ebiratide) in rat brain // Peptides, 1988, v.9, № 5, p.1081-1087.

175. Wikberg JEC, Muceniece R, Mandrika I, Prusis P, Lindblom J, Post C, Skottner A. New aspects on the melanocortins and their receptors // Pharmacological Research, 2000, v. 42, N 5, p. 393-420.

176. Wikberg JEC. Melanocortin receptors: perspectives for novel drugs // Eur J Pharmacol, 1999, v. 375, p. 295-310.

177. Williams D.W.Jr., Lipton J.M., Giesecke A.H.Jr. Influence of centrally administered peptides on ear withdrawal from heat in the rabbit // Peptides, 1986, v. 7, N6, p. 1095-1100.

178. Wolterink G, van Ree JM, van Nispen JW, de Wied D. Structural modifications of the ACTH(4-9) analog Org2766 yields peptides with high biological activity // Life Sci., 1991, v.48, N2, p.155-161.

179. Xia Y, Wikberg JEC. Postnatal expression of melanocortin-3 receptor in rat diencephalon and mesencephalon // Neuropharmacol, 1997, v. 36, p. 217-24.

180. Xia Y, Wikberg JEC. Localizatin of ACTH receptor mRNA by in situ hybridization in mouse adrenal gland // Cell & Tissue Res, 1996, v. 286, p. 6368.

181. Zager EL, Black PM. Neuropeptides in human memory and learning processes // Neurosurgery, 1985, v. 17, N2, p.355-69.