Аффинные сорбенты для лечения сердечно-сосудистых заболеваний тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.06, доктор биологических наук Покровский, Сергей Николаевич

• Покровский, Сергей Николаевич
• доктор биологических наук
• 2004

Оглавление диссертации доктор биологических наук Покровский, Сергей Николаевич

Список сокращений.

I ВВЕДЕНИЕ.

II ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

III МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

1. Выделение антигенов.

1.1. Выделение липопротеидов.

1.1.1. Выделение ЛНП из плазмы крови человека.

1.1.1.1. Ультрацентрифугирование в ступенчатом градиенте плотности нейтральной соли бромида натрия.

1.1.1.2. Зональное ультрацентрифугирование.

1.1.1.3. Аффинная хроматография.

1.1.2. Выделение Лп(а).

1.1.2.1. Трехступенчатое ультрацентифугирование в ступенчатом градиенте плотности с последующей гель-фильтрацией.

1.1.2.2. Аффинная хроматография.

1.1.3. Получение ЛВП и делипидированной плазмы.

1.2. Очистка препарата IgG человека.

2. Получение антител.

2.1. Получение поликлональных антител.

2.1.1. Иммунизация животных.

2.1.2. В ыделение ПкАт к ЛНП.

2.1.3. Выделение ПкАт к Лп(а).

2.1.3.1. Получение моноспецифической антисыворотки.

2.1.3.2. Очистка антител.

2.1.4. Препаративная очистка ПкАт.

2.2. Получение моноклональных антител (МкАт).

2.2.1. Гибридизация и скрининг гибридомных клеток.

2.2.2. Выделение моноклональных антител из асцитной жидкости.

2.2.3. Выделение МкАт из культуральной жидкости.

2.2.4. Препаративная очистка МкАт.

3. Синтез аффинных сорбентов.

3.1. Активация матриц.

3.1.1. Активация бромцианом.

3.1.2. Периодатное окисление.

3.2. Иммобилизация белков.

3.2.1. Иммобилизация липопротеидов

3.2.2. Иммобилизация антител.

3.3. Синтез сорбентов для процедур терапевтического афереза.

4. Определение сорбционной емкости иммуносорбентов.

4.1. Метод колоночной хроматографии.

4.2. «Batch» метод.

5. Анализ чистоты и специфичности белков.

5.1. Электрофоретические методы.

5.1.1. Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия.

5.1.2. Электрофорез в геле агарозы.

5.2. Иммунологические методы.

5.2.1. Метод двойной радиальной иммунодиффузии.

5.2.2. Иммуноэлектрофорез.

5.2.3. Иммуноблотинг.

5.3. Аналитическое ультрацентрифугирование.

6. Методы определения концентрации белков липидов.

6.1. Иммуноферментные методы.

6.1.1. Синтез конъюгатов антител с пероксидазой.

6.1.2. Определение концентрации антител к ЛНП.

6.1.3. Определение концентрации антител к Лп(а).

6.1.4. Определение концентрации антител к

6.1.5. Определение концентрации Лп(а) в плазме (сыворотке) крови человека.

6.1.6. Определение титра антител к иммуноглобулинам барана или мыши в плазме крови человека.

6.2. Определение концентрации Лп(а) методом радиальной иммунодиффузии по Манчини.

6.3. Определение концентрации апоВ в плазме крови.

6.4. Определение концентрации иммуноглобулинов G в плазме крови человека.

6.5. Определение концентрации суммарного белка.

6.6. Определение концентрации холестерина.

6.7. Определение концентрации холестерина в клетках.

7. ЛНП аферез in vitro на клеточной модели.

7.1. Получение образцов органных и клеточных культуры аорты человека.

7.2. Культивирование короткоживущей органной и клеточной культур из аорты человека.

7.3. ЛНП аферез in vitro на клеточной модели.

8. Микроскопическое исследование матриц.

9. Контроль качества при производстве колонок для клинического применения.

9.1. Определение стерильности.

9.2. Испытание на пирогенность.

9.2.1. Испытание на пирогенность на кроликах.

9.2.2. Испытание на пирогенность с использованием ЛАЛ теста.

9.3. Контроль частиц сефарозы в смывах с колонок.

9.4. Определение свободного белка в смывах с сорбента.

10. Проведение процедуры афереза с использованием иммуносорбционных колонок.

IV РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Иммуносорбенты для ЛНП афереза.

1.1. Выделение и характеристика антигена - ЛНП плазмы крови человека.

1.2. Иммуносорбент с ПкАт к ЛНП.

1.2.1. Получение ПкАт к ЛНП.

1.2.2. Характеристика ПкАт к ЛНП.

1.2.3. Синтез и характеристика иммуносорбента с ПкАт для ЛНП афереза.

1.3. Иммуносорбент с моноклональными антителами к ЛНП.

1.3.1. Получение и характеристика МкАт к ЛНП.

1.3.2. Свойства иммуносорбентов с МкАт к ЛНП.

1.3.3. Синтез иммуносорбента с МкАт для клинического применения.

1.4 Доказательство эффективности ЛНП афереза в опытах in vitro.

1.5. Синтез и характеристика иммуносорбента для гемосорбции.

1.5.1. Выбор матрицы для гемосорбции.

1.5.2. Синтез и характеристика гемосовместимого сорбента для ЛНП афереза.

1.6. Сравнение сорбентов для ЛНП афереза.

1.6.1. Сравнение сорбентов, применяемых для ЛНП афереза в процедурах плазмосорбции.

1.6.2. Сравнение сорбентов, применяемых для ЛНП афереза в процедурах гемосорбции.

1.7. Результаты использования иммуносорбентов для ЛНП афереза в клинике.

2. Иммуносорбент для Лп(а) афереза.

2.1. Выделение и характеристика препарата Лп(а).

2.2. Получение и характеристика ПкАт барана к Лп(а) человека.

2.3. Синтез и свойства иммуносорбента с ПкАт к Лп(а) человека.

2.4. Специфический Лп(а) аферез — новый подход к экстракорпоральной коррекции повышенного уровня Лп(а).

2.5. Проведение процедур сочетанного ЛНП и Лп(а) афереза.

3. Сорбент с иммобилизованными ЛНП плазмы крови человека.

3.1. Изучение эффекта «атерогенности» при помощи сорбента с иммобилизованными ЛНП плазмы крови человека.

3.2. Клиническое применение сорбента с иммобилизованными

ЛНП плазмы крови человека.

4. Иммуносорбент для афереза иммуноглобулинов у больных дилатационной кардиомиопатией.

4.1. Выделение и характеристика препарата человека.

4.2. Получение и характеристика ПкАт барана против человека.

4.3. Синтез и характеристика иммуносорбента с ПкАт против человека.

4.4. Разработка дизайна процедур ^ афереза с использованием колонок с анти-^ сорбентом.

4.5. Первый опыт лечения больных ДКМП методом иммуносорбции на колонках Адсопак»®.

5. Вопросы безопасности и технология производства аффинных колонок для терапевтического афереза.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Аффинные сорбенты для лечения сердечно-сосудистых заболеваний»

История вопроса и актуальность проблемы. Появление и накопление в крови человека различных патогенных веществ приводит к возникновению и развитию многих заболеваний. Такими веществами могут быть: аутоантитела, циркулирующие иммунные комплексы, атерогенные липопротеиды, эндогенные и экзогенные токсины, прионы, вирусы, и микроорганизмы. Их полное удаление или снижение концентрации, как правило, дает положительный клинический эффект. В частности, одной из задач терапии атеросклероза, связанного с нарушением липидного обмена, является снижение концентрации атерогенных апоВ10о-содержащих липопротеидов в крови пациента. Основное направление терапии при аутоиммунных заболеваниях - удаление патогенных аутоантител или антигенов.

Традиционным подходом к лечению в ситуациях, когда необходимо снизить концентрацию тех или иных веществ, является лекарственная терапия. Однако, в ряде случаев, она имеет ограничения в применении. Кроме того, для некоторых патологий, лекарства, эффективно снижающие концентрацию патогенных веществ в крови, отсутствуют. Поэтому поиск и разработка новых эффективных способов снижения концентрации и выведения их из крови больных с использованием современных методов биохимии, иммунологии, молекулярной биологии и биотехнологии до сих пор остается актуальной задачей.

Существует много методов экстракорпорального очищения крови. Согласно классификации, предложенной в 1990 году ВогЬе^, указанные методы можно разделить по степени специфичности удаления патогенного компонента. Значительная часть методов относится к сорбционным технологиям, то есть базируется на использовании различных сорбентов.

Рис. /. Иерархия специфичности различных методов терапевтического афереза.

Наиболее простым методом является плазмаферез, при котором часть циркулирующей плазмы больного удаляется и замещается раствором альбумина, донорской плазмой или кристаллоидньши растворами.

11лазмаферез широко и успешно используется и в настоящее время, особенно при острых ситуациях. Вместе с тем, специфичностью этот метод не обладает. На рисунке 1 представлена иерархия специфичности различных экстракорпоральных методов. Следующие в пирамиде специфичности методы, основанные на принципах фильтрации, осаждения или ионообменной хроматографии, используются достаточно широко, но тоже имеют высокий процент неспецифического удаления различных компонентов крови. Максимальную специфичность можно достичь при использовании аффинных сорбентов, особенно при использовании высокоспецифичных белок-белковых взаимодействий типа: фермент-субстрат, лиганд-рецептор, пептид-лиганд, антиген-антитело. В основе работы аффинных сорбентов используется принцип хроматографии по сродству. Работа в области создания высокоспецифичных аффинных сорбентов привела к созданию иммуносорбентов (ИС) для клинического применения, которые занимают место на вершине иерархии специфичности (рис. 1).

В русскоязычной литературе существует много терминов, которые определяют область медицины, в которой используются различные технологии очищения крови. Это «гемосорбция» и «гравитационная хирургия крови» [Лопухин, 1978-1985], «эфферентная терапия» [Костючепко, Гуревич, Соколов 2003], «гемокоррекция» или «экстракорпоральная гемокоррекция» (те же авторы), «экстракорпоральные методы лечения» [Коновалов, 2001]. В настоящей работе мы будем пользоваться термином «терапевтический аферез», потому что за годы становления этой области термин «Therapeutic apheresis» стал общепризнанным в международной литературе.

Методы терапевтического афереза находят широкое применение в современной медицине. Накоплено немало примеров успешного применения сорбционных технологий для лечения сердечно-сосудистых и аутоиммунных заболеваний, печеночной недостаточности, в акушерстве и гинекологии, при трансплантации органов, в дерматологии, онкологии, ревматологии, при острой интоксикации и инфекции организма (рис.2.)

Трансплантация органов

Сердечно-сосудистые заболевания

Инфекции тоиммунный заболевания /

Акушерство и гинекология

Онкология

Интоксикация

Нарушение микроциркуляции

Клетки

Дерматология

Рис. 2. Показания к применению сорбционных технологий терапевтического афереза. ДАЛ диализ ассоциированный амшоидоз.

В результате становления и развития этого направления медицины, стало очевидным, что разработка высокоспецифичных сорбентов для клинического применения, которые могут быть успешно, безопасно и эффективно использованы для очистки крови имеет большое научнопрактическое значение. Наша работа посвящена созданию аффинных сорбентов для лечения больных с рефрактерными к иным видам терапии формами нарушений липидного обмена и дилатационной кардиомиопатией [ Покровский, 2004].

Пионерами в области сорбционных технологий очистки крови в России были Юрий Михайлович Лопухин и созданный им коллектив II МОЛГМИ им. Пирогова [ Лопухин, 1978; Лопухин и Молоденков, 1985]. В последнем абзаце книги «Холестериноз», вышедшей в 1983 году Юрий Михайлович Лопухин и соавторы писали: «Создание такого рода сорбентов (специфичных к ЛНП — примечание автора) позволит одномоментно удалять из крови почти полностью липопротеиды низкой плотности и таким образом способствовать выходу холестерина из клеток и тканевых депо. Эффективность подобного рода методов подтверждают и данные по использованию иммуносорбентов на апопротеиды липопротеидов низкой плотности в некоторых зарубежных клиниках. Вероятно, в ближайшем будущем именно на этом пути терапии атеросклероза клиницистов ждут наибольшие успехи» [Лопухин и др., 1983]. Фактически в то же время, в 1982 году, в КНЦ РАМН и была начата наша работа.

Цель и задачи работы. Цель настоящей работы — создать новое поколение высокоспецифичных аффинных сорбентов для экстракорпорального удаления из крови человека патогенных веществ и исследовать особенности их применения при лечении больных с сердечно-сосудистыми заболеваниями, резистентными к лекарственной терапии.

Экспериментальные задачи:

1. Синтезировать, характеризовать и апробировать в клинике сорбент с моноспецифическими поликлональными (ПкАт) барана против липопротеидов низкой плотности (ЛНП) человека. Исследовать эффективность и безопасность использования такого сорбента в процедурах экстракорпорального удаления ЛНП (ЛНП аферез).

2. Получить и характеризовать панель моноклональных антител (МкАт) против ЛНП человека. Показать принципиальную возможность использования МкАт для синтеза иммуносорбентов с целью их применения в терапевтическом аферезе.

3. Создать in vitro модель ЛНП афереза и с помощью такой модели исследовать его эффективность на органной и клеточной культурах аорты человека.

4. Сравнить различные типы сорбентов для ЛНП афереза. Изучить особенности их взаимодействия с плазмой крови человека.

5. Исследовать связь липопротеида(а) [Лп(а)] с наличием и тяжестью атеросклеротических поражений артерий различных локализаций.

6. Синтезировать, характеризовать и провести клинические испытания иммуносорбента для специфического удаления из плазмы крови человека Лп(а). Изучить возможность и эффективность использования такого сорбента для лечения больных ИБС с повышенным содержанием Лп(а).

7. Изучить возможность и особенности синтеза аффинных сорбентов с иммобилизованными антигенами на примере сорбента с ЛНП человека.

8. Синтезировать, характеризовать и показать принципиальную возможность использования иммуносорбента для удаления патогенных аутоантител из крови больных дилатационной кардиомиопатией в процедурах эктракорпорального удаления иммуноглобулинов человека (Ig аферез).

9. Разработать технологию создания колонок с аффинными сорбентами для процедур терапевтического афереза.

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Сорбционные технологии влечении сердечно-сосудистых заболеваний.

Сердечно-сосудистые заболевания занимают одно из первых мест в ряду причин смертности населения в развитых странах среди которых Россия, к сожалению, лидирует по этому показателю. (Рис.3.). Безусловно, основной причиной этих заболеваний является атеросклероз, на понимание механизмов возникновения которого и поиск методов борьбы направлены усилия ученых всего мира.

1000 к 1—1 X X ф

Рис.3. Смертность от сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ) и ИБС в ряде стран мира.

Гипотеза об основополагающей роли холестерина в возникновении и развитии атеросклероза, выдвинутая в начале XX века Аничковым Н.Н. и Халатовьш С.Н. [Anitschkow, 1913], воплотилась в настоящее время в практически общепризнанную «липидную теорию» патогенеза атеросклероза [Kannel et aL 1971, Myant 198!. Assmann et al. 1992,]. Основное положение этой теории базируется на утверждении, что повышение уровня холестерина атерогенных классов липопротеидов в крови приводит к возникновению. развитию и прогрессированию атеросклеротических поражений сосудов и является причиной возникновения сердечно-сосудистых заболеваний и преждевременной смерти от осложнений атеросклероза, даже в отсутствии других факторов риска.

Убедительным доказательством справедливости липидной гипотезы возникновения атеросклероза является семейная гиперхолестеринемия (СГХС). Это заболевание связано с мутацией гена, расположенного в 19 хромосоме и кодирующего белок-рецептор ЛНП [Goldstein and Brown, 1982, 1983]. В норме рецептор ЛНП играет основную роль в их катаболизме. Дефицит рецепторов приводит к накоплению ЛНП в плазме крови, что и наблюдается у больных СГХС практически с рождения. Уровень общего холестерина (ОХС) у гомозигот составляет 18.4-20.3 ммоль/л [Томпсон, 1989]. Если дефект гена имеется у одного родителя, то у детей возникает гетерозиготная форма СГХС - она встречается у 2 - 3 человек на тысячу среди населения развитых стран. Если генетический дефект присутствует у обоих родителей, то рождаются дети с гомозиготной формой СГХС, частота встречаемости которой - 1 на миллион населения. СГХС IIa типа - это природой созданная модель атеросклероза на человеке. Прогноз течения этого заболевания - неблагоприятный. Больные с гомозиготной формой обычно погибают в I - II декадах жизни от тягчайшего атеросклероза, а с гетерозиготной формой - во II — III декадах. Современная, даже агрессивная, гиполипидимическая лекарственная терапия, часто оказывается малоэффективной для нормализации уровня ОХС у таких больных. Гомозиготная форма СГХС характеризуется появлением уже в детском возрасте кожных ксантом и ксантом сухожилий, быстро прогрессирующим атеросклерозом и внезапной смертью в возрасте до 30 лет, как правило, от острой коронарной недостаточности.

Именно попытка решить проблему снижения уровня холестерина у больных СГХС, привела в 80-х годах прошлого века к возникновению области медицины, названной впоследствии терапевтическим аферезом. Все методы терапевтического афереза, разработанные для удаления ЛНП, их авторы и исследователи, которые внесли наибольший вклад в их развитие, представлены в таблице 1.

Таблица 1. Лферез липидов. Хронология

Автор, год Метод

De Gennes, 1967 Плазмообмен

Turnberg et al., 1972 Плазмообмен

Thompson et al., 1975 Плазмообмен

Lupien et al., 1976 Плазмосорбция на гепарин-сорбенте

Agishi et al., 1980 Каскадная плазмофильтрация

Stoffel et al., 1981 Плазмосорбция на иммуносорбенте с поликлональными антителами к ЛНП

Kikkawa etal., 1981 Каскадная плазмофильтрация

Baeyer, 1983 Каскадная плазмофильтрация

Armstrong et al., 1983 Преципитация ЛНП гепарином

Покровский и др., 1985 Иммуносорбция с поликлональными антителами

Yokoyama et al., 1985 Плазмосорбция на декстрансульфат целлюлозе

Mabuchi et al., 1987 Двойная фильтрация

Pokrovsky et al., 1987 Иммуносорбция с моноклональными антителами

Pokrovsky et al, 1991 Иммуносорбция липопротеида (а)

Bosh et al., 1997 Гемосорбция на полиакрилатном сорбенте (DALI)

Otto et al., 2003 Гемосорбция на декстрансульфат- сорбенте

Pokrovsky et al, 2004 Иммуносорбент для цельной крови

Первым и старейшим методом терапевтического афереза, не потерявшим однако свою актуальность до наших дней, является плазмаферез. Считается, что приоритет создания метода плазмафереза принадлежит группе американских ученых из Балтимора под руководством J. Abel, опубликовавших статью «Plasma removal with return of corpuscles

Plasmapheresis) в журнале «Journal Pharmacology», 5 том за 1913-1914 годы [Abel et a I., 1913-1914]. Однако, первой работой, описывающей принцип плазмафереза, была статья профессоров военно-медицинской академии Санкт-Петербурга Вадима Александровича Юревича и Николая Константиновича Розенберга: «К вопросам о промывании крови вне организма и о жизненной стойкости красных кровяных шариков», опубликованная годом раньше, в журнале «Русский врач» № 14 стр. 6. (Рис.4). Это - типичный пример, когда приоритет принадлежит авторам, которые публикуют работу в англоязычных журналах, в то время как бесспорно более ранние аналогичные работы наших ученых, опубликованные в русских журналах, к сожалению не цитируются [Соколов А.А., 2003[. ¡WirpAjj»». mm щз

Отдать {Й5орудооан1я лойораторШ

Водим Юревич (1872 -1963) vt> '1ЧКмм«<< Htli»« Щ

ТЕРАШИ ГОИНОРРЕМ I J htfb ki* lu b^vdnk | ^

TîQa. k>pcVh4v, и|м>ф. и M, к. Роэсиберп» Kt. тмцхку ^ n игючиынш 11КЛМ nul. onrattuwi.i it о aii wciiiioIi imilKKIH hpit'HUlb крОИИИШЬ Jil-IfiHht>ItЬ

Николой Роэеиберг (1876-1933) iwi I «tit пли «г«ш bm Dpr" v, tmaamittwt ммп Г1. А. НЛИЛСС KUHA

П**» |«a**eiiH IL llaiWaJiHHIl»

Рис. 4. Пионерская работа по плазмаферезу В.А.Юревича и Н.К.Розенберга.

Возможность использования плазмафереза для лечения больных СГХС была впервые показана во Франции, профессором De Germes [De Germes et al., 1967]. Впоследствии Thompson G.L. в Лондоне добился хороших результатов в лечении плазмаферезом больных гомозиготной СГХС [Thompson et al., 1975, 1980, 1985].

Однако невозможность удаления большого количества плазмы пациента ограничивала эффективность плазмафереза, а проблема замещения удаленной плазмы донорской или альбумином, по мере распространения заболеваний, передающихся с кровью, представляла все большую опасность для пациента. Тем не менее, успехи применения плазмафереза стимулировали развитие новых подходов и технологий терапевтического афереза. В течение короткого промежутка времени, чуть больше 10 лет, возник целый ряд разработок, который обеспечил новый виток развития этой области медицины. Новые разработки устраняли один из основных недостатков плазмообмена — необходимость использовать замещающие растворы альбумина или донорской плазмы и, в той или иной степени, решали проблему селективности удаления липопротеидов низкой плотности (ЛНП).

ЛНП аферез. Возникновение и развитие.

Новая эра в развитии терапевтического афереза ознаменовалась в начале 80-х годов появлением сообщений об использовании в клинике аффинного сорбента с иммобилизованным гепарином [Lupien et al., 1976], каскада из двух плазмофильтров [Agichi et al., 1980], сорбента с поликлональными антителами барана против апо В белка ЛНП [Stoffel et al., 1981], системы, позволяющей удалять ЛНП из плазмы путем осаждения их гепарином (HELP) [Wieland and Seidel, 1983], сорбента с иммобилизованным декстрансульфатом [Yokoyama et al, 1984].

Три из перечисленных методик были основаны на использовании сорбентов и стали прототипами современных сорбционных технологий, применяемых для очистки крови. В их основе лежит взаимодействие компонентов крови с лигандом, иммобилизованным на нерастворимую, инертную, биосовместимую матрицу. Лиганд обладает специфичностью в отношении одного или нескольких компонентов крови и обеспечивает специфичность работы сорбента. Матрица выполняет функции гемосовместимого носителя, удерживающего лиганд и обеспечивающего ток плазмы или крови. Помещенный в стеклянный или пластиковый корпус сорбент, представляет собой иммуносорбционную колонку - изделие медицинского назначения класса III, согласно классификации Комитета по медицинским изделиям стран Европейского сообщества (ЕС). [ЕС Council directive 93/42/ЕЕС].

Исторически, приоритет в создании сорбента для селективного удаления ЛНП принадлежит канадскому врачу-исследователю Dr. Paul Lupien. Основываясь на известном факте способности частиц ЛНП взаимодействовать с гепарином [Burstein, 1970; Burgstaler 1980], он синтезировал гепарин-агарозу и впервые использовал ее для лечения пациентов с гомозиготной формой СГХС [Lupien, 1976]. Метод был очень сложен технически и имел мало общего с тем, что сейчас называют терапевтическим аферезом. Кровь пациентов забиралась порциями, ex vivo инкубировалась с сорбентом, затем отфильтровывалась и возвращалась пациенту. Такая обработка проводилась многократно. Конечно, с современной точки зрения, эта процедура выглядела не просто технически несовершенной, но и опасной для пациента. Однако это была первая попытка лечения гомозиготных больных и Dr. Lupien получил весьма обнадеживающие результаты [Lupien, 1980]. По сравнению с общепринятым в то время методом лечения СГХС плазмаферезом, впервые был использован селективный метод, и в этом смысле первое применение гепарин-сорбента безусловно являлось серьезным шагом вперед. Однако его создание опередило возможности технической базы терапевтического афереза, и поэтому гепарин-сорбент не нашел в свое время широкого применения [Graisely et al., 1980; Lupien et al., 1980]. Одним из недостатков гепарин-сорбента был высокий вклад неспецифической сорбции. Помимо ЛНП он эффективно связывал такие важные компоненты как антиатерогенные липопротеиды высокой плотности (ЛВП), антитромбин III и ряд других [Stoffel et al., 1981].

Позднее, попытки сделать сорбент на основе гепарина были предприняты у нас в стране. В НИИ физико-химической медицины МЗ СССР был синтезирован гемосовместимый сорбент, содержащий гепарин, иммобилизованный на макропористом кремнеземном носителе [Лопухин и др., 1986; Lopukhin et al., 1990]. Сорбент для плазмасорбции на основе иммобилизованного гепарина был также разработан в НИИ экспериментальной кардиологии ВКНЦ АМН СССР Синицыным В.В. [Sinitsyn et al.,1990] и показал хорошие результаты при клинических испытаниях [Коновалов и др., 1988]. Однако во второй половине 80-х развитие экстракорпоральных методов проходило столь бурно, что гепарин-сорбент уже не мог соперничать с новыми методами [Адамова и др., 1988]. Тем не менее, идея использования сродства гепарина к ЛНП для целей экстракорпоральной терапии не пропала даром и была с успехом использована для создания другого метода, основанного на осаждении ЛНП в присутствии гепарина при рН 5.2. Метод получил название «Heparin Extracorporeal Lipoprotein Precipitation» (HELP) [Armstrong, 1983] и нашел широкое применение в клинической практике [Armstrong, 1989; Schuff-Werner et al., 1994, Susca, 2001].

Развитие сорбционных технологий шло в направлении поиска и создания высокоспецифичных лигандов. Объяснялось это тем, что метод экстракорпорального удаления ЛНП в 80-е годы по-прежнему разрабатывался как метод лечения гомозиготных больных СГХС и оставался для них лечением выбора. Снижение уровня ЛНП у таких больных требовало постоянного и частого, не реже одного-двух раз в неделю, проведения процедур. Очевидно, что удаление других, кроме ЛНП компонентов плазмы могло привести к нарушению гомеостаза у этих пациентов, поэтому проблема специфичности была очень актуальна. Задача создания специфичного метода удаления ЛНП была решена с появлением сорбента с иммобилизованными антителами к основному белку ЛНП - аполипопротеину Вюо- Именно разработчики этого метода, профессора Кельнского Университета W.Stoffel, K.Oette и H.Borberg, впервые, в 1981 году, предложили термин «ЛНП аферез» («аферез» в переводе с греческого — удаление), который впоследствии стал общепринятым для всего семейства методов удаления ЛНП [Stoffel et al., 1981]. Метод, в котором удаление компонента плазмы происходит за счет связывания его со специфическими антителами, получил название «иммуносорбция» (ИС).

Создатели ЛНП афереза впервые использовали принцип аффинной хроматографии с использованием иммуноглобулинов в клинической практике и открыли дорогу многим последующим разработкам. ' Интересно, что в то же время, в параллельном независимом исследовании, аналогичный метод был предложен для удаления антигенов групп крови, который однако не имел столь бурного дальнейшего развития, как ЛНП аферез [Bensinger et al., 1981].

Лабораторная разработка и доклинические испытания метода проводились с использованием животной модели - мини свиней [Stoffel et al., 1981]. ЛНП, выделенные из сыворотки крови свиньи были использованы для иммунизации баранов, с целью получения поликлональной иммунной сыворотки. Этот же препарат ЛНП был использован для приготовления аффинной колонки с иммобилизованными ЛНП, на которой путем хроматографии сыворотки крови барана были выделены специфические поликлональные антитела свиньи к ЛНП. Выделенные антитела иммобилизовали на агарозную матрицу.Таким образом, получали анти-ЛНП иммуносорбент - сорбент, специфически взаимодействующий с ЛНП свиньи. Сорбент был помещен в стеклянную колонку со стеклянным фильтром, обеспечивающим ток плазмы крови и буферов и препятствующий утечке сорбента. При пропускании плазмы крови через колонку, ЛНП сорбировались на колонке благодаря взаимодействию антиген-антитело, что приводило к их удалению из плазмы. Несмотря на проблемы этого эксперимента, связанные с малой производительностью и плохим качеством сепарации крови, эти испытания впервые продемонстрировали принципиальную возможность использования такого подхода.

В том же, 1981 году, Stoffel W. с соавторами опубликовали первые результаты использования анти-ЛНП иммуносорбента для лечения трех пациентов - одного с гомозиготной и двух с гетерозиготной формами СГХС. Для каждого пациента, по аналогичной схеме с использованием ЛНП человека в качестве антигена, были изготовлены две персональные колонки. Кровь пациента поступала в плазмасепаратор ценрифужного типа, который в непрерывном режиме разделял клетки и плазму. Плазма крови поступала в колонку, где происходила сорбция ЛНП. Насыщение колонки определяли визуально, по изменению цвета сорбента. Интересно отметить, что авторы использовали простой и эффективный способ для улучшения визуализации сорбции ano В содержащих липопротеидов на колонку: они рекомендовали больным накануне выпить морковный сок, что приводило к контрастированию желтым цветом частиц липопротеидов. После насыщения ток плазмы переключался на другую колонку. Колонки использовались поочередно и подвергались регенерации в процессе процедуры. После насыщения остатки плазмы вытеснялись из колонки физиологическим раствором. Затем через колонку пропускали глициновый буфер с pH 2,8 - 3,0, который диссоциировал комплекс антиген-антитело и регенерировал колонку. Таким образом, было проведено по 3-4 хроматографии на двух колонках каждому пациенту. Объем обработанной плазмы составил, в среднем? 7 л, продолжительность процедуры - 3-4 часа. Колонки использовались многократно. Уровень ОХС у трех пациентов был снижен за одну процедуру: у первого - с 290 мг/дл до 130 мг/дл; у второго - с 470мг/дл до 112 мг/дл; у третьего - с 450 мг/дл до 170 мг/д. Это было, безусловно, огромным достижением в лечении СГХС.

Работы Stoffel W., и Borberg H., показали, что комбинирование сорбционной колонки с плазмасепаратором, позволяющем вести процедуру в непрерывном режиме, дает возможность обрабатывать большой объем плазмы, удаляя из нее только заданный компонент, эффективно снижая его концентрацию в крови.

В своей статье, посвященной результатам первого применения ЛНП-афереза на трех больных СГХС, Stoffel W., Borberg Н. и Greve V. написали: « The evidence for these sings of reversal of the atherosclerotic progress in patients with long-standing hypercholesterolaemia has not yet been convincing with any mode of management. Our technique offers an attractive and feasible test of the lipid hypothesis.» [Stoffel et.al., 1981]. Именно эта статья и эти слова послужили толчком для начала нашей работы в Москве. В 1982 году в НИИ экспериментальной кардиологии ВКНЦ АМН СССР по инициативе профессора В.Н. Смирнова была создана новая научная группа «Аффинные сорбенты для медицины».

В том же году первые попытки использования иммуносорбентов для ЛНП афереза в клинике были предприняты в США, в Рогозинском институте, Нью-Йорк. В 1982 году, там была проведена первая процедура ЛНП-афереза. [Saal et al., 1986]. ЛНП аферез проводился с использованием иммуносорбционных колонок, выпущенных австрийской компанией «Immuno». Это был первый опыт промышленного производства колонок для ЛНП афереза. Впоследствии, работы по выпуску таких колонок в Германии проводились компанией «Baxter» GmbH, позднее «TheraSorb» GmbH, далее «PlasmaSelect» GmbH и сегодня «Miltenyi Biotec» GmbH.

В 1982 году в Кардиологическом Научном центре, Москва, Россия, нами были начаты работы по созданию иммуносорбентов для процедур ЛНП афереза. Уже в декабре 1983 года были проведены первые процедурыс использованием разработанных нами сорбентов и получены первые клинические результаты [Покровский и др., 1985].

Начиная с 80-х, применение ЛНП афереза активно расширялось в Германии [Borberg et al, 1983, 1988, 1990]. Так в 1983 году, в клинике Кельнского Университета, на лечении находилось 8 пациентов, а в 1986 уже 30. В 1989 в Германии были проведены многоцентровые клинические испытания метода, в которых участвовали клиники Бонна, Кельна и Мюнхена [Borberg et al., 1990, А. du Moulin, 1990]. В СССР в 1985 году ЛНП аферез с использованием наших иммуносорбционных колонок проводили 4 пациентам [Покровский и др, 1985], а к 1990 году на программном лечении находилось уже 24 пациента [Pokrovsky et al, 1995].

Использование метода в различных клиниках мира, рост числа пациентов, получающих лечение методом иммуносорбции, увеличение продолжительности лечения, позволили получить достаточное количество информации для того, чтобы объективно оценить результаты использования метода. Было показано, что при лечении гомозиготных больных регрессия ксантом может наблюдаться уже после 6-12 месяцев проведения ЛНП афереза, прекращаются приступы стенокардии, существенно улучшается самочувствие и качество жизни. Уровень ОХС в результате проведения процедуры удается снизить до 100-150 мг/дл, что позволяет поддерживать средний уровень ОХС в течение курса лечения 200-250 мг/дл даже у гомозиготных больных без применения медикаментов [Borberg et al, 1988, 1990]. Тогда же впервые было показано, что в результате такой стратегии лечения удается не только предотвратить дальнейшее образование атеросклеротических поражений сосудов, но и достичь их регрессии [Borberg et al, 1990, Pokrovsky et al, 1993].

В 1984 году в Японии был создан новый сорбент для ЛНП афереза. Этот сорбент представлял собой декстрансульфат, иммобилизованный на шариках целлюлозы. Как и в случае гепарин-сорбента, в основе связывания этим сорбентом ЛНП лежит принцип ионнообменного взаимодействия и сродство апоВ-содержащих липопротеидов к полианионитам. На животной модели, в качестве которой использовали кроликов Ватанабе, было показано, что при пропускании плазмы крови через колонку с сорбентом, ЛНП эффективно связываются с сорбентом, [Yokoyama et al., 1984]. Следует заметить, что более позднее изучение in vitro свойств сорбентов на основе полианионитов, таких как декстрансульфат целлюлоза (ДС) и гепарин-сорбент, показало, что их специфичность зависит от концентрации ЛНП в плазме [Pokrovsky et al., 1990]. Очевидно, что в плазме гомозиготных больных, где уровень ОХС может достигать 1000 мг/дл, ЛНП являются мажорным компонентом, несущим положительный заряд. Поэтому отрицательно заряженный сорбент будет достаточно селективно связывать ЛНП согласно принципу ионообменной хроматографии. По мере снижения концентрации ЛНП в плазме, селективность такого сорбента снижается, и при уровне ОХС 250 мг/дл, апоВ составляет не более 30% удаляемого белка , в то время как 70% приходится на другие белки плазмы [Pokrovsky et al., 1993]. Это свойство сорбентов на основе полианитов существенно ограничивает их применение, так как современный опыт ЛНП афереза доказывает, что для достижения регрессии атеросклероза необходимо, чтобы уровень ОХС в плазме больного после процедуры составлял < 100 мг/дл, а целевой уровень ХС ЛНП в 2004 году снижен до< 70 мг/дл.

Клинические испытания метода, в котором использовались колонки с декстрансульфатом (ДС), начались в 1984 году в Национальном центре сердечно-сосудистых заболеваний в Осаке, Япония [Yokoyama et al., 1985]. Сначала в методе использовалась одна колонка объемом 400 мл, которая, как оказалось, очень быстро насыщалась ЛНП и не решала задачи эффективного снижения уровня ОХС у пациента. В процессе развития метода одна колонка была заменена на две, объемом 150 мл, в результате чего возникла весьма эффективная одноразовая система, в которой 2 колонки используются многократно в одной процедуре. [ Mabuchi et al., 1987]. Регенерация колонок проводилась 0,7 М раствором NaCl. Колонки на основе ДС, названные

ЫроБОгЬег»® были первой одноразовой системой для ЛНП афереза, которая в и настоящее время успешно используется во многих клиниках [Higashikata е1 а1., 2003].

В 1976 году были открыты статины - ингибиторы гидроксиметил глутарил коэнзим А редуктазы, одного из ключевых ферментов синтеза холестерина (ХС). [Епс1о е1 а1., 1976]. Благодаря этому открытию, в 90-х годах на фармацевтическом рынке появились новые эффективные гиполиподемические препараты, что несколько снизило накал соперничества ученых, работающих в области создания сорбентов для ЛНП афереза. Но проблема не утратила своей актуальности. Медикаменты по-прежнему не решали задачу эффективного снижения уровня холестерина у больных с гомозиготной формой СГХС. Хотя использование статинов позволило в ряде случаев увеличить интервал между процедурами ЛНП афереза у этих больных от 3-4 дней до двух недель. Использование ЛНП афереза для больных гетерозиготной формой СГХС, устойчивой к действию медикаментов, для больных, которым противопоказаны по тем или иным причинам гиполипидемические препараты, по-прежнему остается актуальным вопросом терапии нарушений липидного обмена.

Логика развития ЛНП афереза ставила задачу создания сорбентов, не уступающих иммуносорбентам по специфичности, но более технологичных в производстве. В 1984 году в ВКНЦ АМН СССР была начата работа по созданию сорбента для ЛНП афереза на основе моноклональных антител (МкАт) [Трахт и др., 1985]. Было показано, что использование нативных ЛНП при гибридизации и последующем скрининге гибридом, синтезирующих моноклональные антитела к апоВюо, позволяет получить клоны, которые эффективно взаимодействуют с ЛНП не только в растворе, но и после иммобилизации [РокгоУБку е1 а1. 1987]. Полученные гибридомные клоны были адаптированы к выращиванию в биореакторе [Рокгоуэку ег а1., 1989]. Сорбент на основе МкАт обладал высокой ЛНП-связывающей активностью в процедурах ЛНП афереза. Применение данного сорбента в клинике для лечения 4 пациентов с различными формами СГХС впервые продемонстрировало принципиальную возможность, безопасность и эффективность использования сорбентов на основе моноклональных антител в клинике [Pokrovsky et al, 1995].

Дальнейшее развитие сорбционных технологий в области терапевтического афереза ознаменовалось появлением селективных сорбентов для ЛНП афереза, пригодных для перфузии цельной крови. В 1993 году были опубликованы результаты in vitro и ex vivo тестирования гемосовместимого сорбента на основе полиакрилата [Bosch et al, 1993]. Сорбент представлял собой полиакриламидные шарики, покрытые полиакрилатом с экспонированными на поверхности карбоксильными группами. Сорбция ЛНП на такой носитель также происходит по принципу ионообменной хроматографии, поэтому, как и в случае гепарин-сорбента или ДС не является специфической. Данный сорбент был использован немецкой фирмой «Fresenius» для создания первой системы для ЛНП афереза, пригодный для перфузии цельной крови - гемосорбции, получившей название «DALI»® -«Direct Adsorbtion and Lipoprotein Ilimination». Сначала, для проведения процедуры была разработана система, включающая одну колонку объемом 500 мл («DALI»®-500) [Bosch et al, 1997; Drager et al, 1998] . Однако, использование колонок DALI в клинике сразу продемонстрировало низкую сорбционную емкость системы, особенно в случаях, когда концентрация ОХС >300 мг/дл. Поэтому, были выпущены колонки большего объема 750 и 1000 мл («DALI»®-750 и «DALI»®-1000) [Jansen et al, 2000]. Колонки «DALI»® являются одноразовыми и не подлежат регенерации в процессе процедуры. Система «DALI»® прошла клинические испытания и достаточно широко используется в клинике, несмотря на: ограниченную сорбционную емкость, высокий вклад неспецифической сорбции, высокую стоимость процедуры и возникающие осложнения [Jansen et al, 2000, Baumbauer et al, 2003].

Как альтернатива системе «DALI»® в 2001 году для проведения ЛНП афереза в Японии были разработаны колонки для цельной крови на основе декстрансульфата, позволяющие проводить процедуры без плазмасепарации. Так называемый «Liposorber D»®, был апробирован для лечения пациентов [Otto et al., 2003], однако данных, позволяющих провести его сравнение с другими системами в настоящее время недостаточно.

Использование одноразовых колонок для гемосорбции упрощает проведение процедуры ЛНП афереза с технической точки зрения, так как не требует дорогостоящего оборудования для плазмасепарации крови и регенерации колонок, однако ограничивает ее возможности. В частности, количество ЛНП, которое можно удалить за процедуру, определено объемом колонки и объемом обработанной крови, и не может быть увеличено за счет увеличения числа хроматографических циклов. Кроме того, существующие системы содержат селективные, но не специфичные сорбенты, поэтому проблема неспецифического удаления «хороших» компонентов плазмы, которую мы обсудим далее, становится актуальной.

Помимо рассмотренных нами методов, основанных на сорбционных технологиях, начиная с 80-х годов в ЛНП аферезе достаточно широко используется система HELP и каскадная (двойная) плазмафильтрация позволяющая селективно фильтровать компоненты плазмы, размер которых меньше диаметра пор капиллярного плазмофильтра [Thompson, 2003; Bambauer et al., 2003]. Мы не будем подробно рассматривать эти системы, т.к. они не относятся к сорбционным.

Сравнительная характеристика методов ЛНП афереза.

Все методы, разработанные для ЛНП афереза с начала 80-х годов до последнего времени суммированы нами в Таблице 2. Часть методов использует строго одноразовые системы (HELP, каскадная плазмофильтрация, «DALI»®, «Liposorber DL-75»®), часть - одноразовые с возможностью регенерации в процессе процедуры (ДС), часть- многоразовые иммуносорбенты таблица 2). Для широкого клинического применения различных методов, прошедших все стадии клинических испытаний и регистрации, и перешедших в разряд рутинного лечения, рядом биотехнологических компаний налажен промышленный выпуск колонок. Производство колонок и других продуктов для экстракорпоральной терапии во всех странах является сложным, наукоемким производством, которое должно соответствовать международным требованиям ISO и национальным требованиям, предъявляемым к изделиям медицинского назначения.

Таблица 2. Системы для ЛНП афереза / статус ноябрь 2004.

Метод Название продукта для клинического применения и фирма-производитель

Неселективные Плазмоаферез

Селективные Гепарин-сорбент В настоящее время не производится

Декстрансульфат целлюлоза для плазмосорбции «Liposorber»® LA -15, LA-40, «Kaneka», Япония

Декстрансульфат сорбент для гемосорбции «Liposorber»® DL-75, «Kaneka», Япония

Полиакрилатный сорбент для гемосорбции «DALI»®, «Fresenius», Германия

Каскадная фильтрация «Kuraray», Kaneka, Япония

Осаждение гепарином HELP, «B.Braun», Германия

Специфичные Иммуносорбент на основе ПкАт к ЛНП. «ЛНП Липопак»®, «НПФ ПОКАРД», Россия; «LDL Therasorb»®, «Miltenyi Biotec» , Германия

Иммуносорбент на основе МкАт к ЛНП. "Иммунолипосорбер"МкАт, в настоящее время не производится

Каждый из методов терапевтического афереза, перешедших в разряд рутинного лечения, имеет достоинства и недостатки. Полемика между приверженцами различных методов ЛНП афереза идет вокруг вопросов об эффективности, специфичности, безопасности, простоты, времени использования, а также экономической целесообразности этих методов.

Работы многих авторов посвящены сравнению используемых методов [Knisel et al, 1994; Shaumann et al, 1996; Richter et al, 1999; Schaldienst et al, 2000, Parhofer et al, 2000; Bambauer et al, 2000, Bambauer 2002, Ritter 2003, Thompson 2003]. Объективно сравнить эффективность процедур ЛНП афереза, проведенного разными авторами с использованием различных методов, довольно сложно. Данные по снижению уровня ОХС, ХС-ЛНП и ХС-ЛВП, приводимые в научных публикациях, получены авторами in vivo, при лечении пациентов. Анализ этого материала показывает, что эти результаты отражают не столько эффективность методов, сколько различия в особенностях методик проведения процедур и обусловлены, в основном, различиями в объеме обработанной плазмы, степени разбавления плазмы при проведении антикоагуляционной терапии, составом крови больного и др. Более объективный in vitro анализ эффективности различных сорбентов, используемых в ЛНП аферезе, приведенный нами в «Экспериментальной части» данной работы показывает, что все сорбенты обладают близкими значениями сорбционной емкости в отношении ЛНП. Мета-анализ данных, полученных в 5 клиниках при проведении в общей сложности почти 7000 процедур, сделанный Thompson, подтверждает это. По данным Thompson, различные методы позволяют удалять, в среднем, около 60 % ХС-ЛНП за процедуру [Thompson, 2003]. Эффективность удаления ЛНП зависит, главным образом, от возможности регенерировать сорбент во время процедуры. Этой особенностью обладают, в первую очередь иммуносорбенты на основе ПкАт. Поэтому системы для ЛНП афереза с использованием двух иммуносорбционных колонок имеют практически неограниченную сорбционную емкость. Процедуры ИС позволяют достичь заданного конечного уровня ЛНП за счет проведения необходимого количества циклов сорбции [Borberg et al, 1990; Pokrovsky et al, 1995]. Необходимо подчеркнуть, что эффективность современных гемосовместимых систем для ЛНП афереза пока недостаточна, особенно в случаях лечения больных с высоким уровнем ОХС и ХС-ЛНП >300 нг/дл, резистентных к лекарственной терапии [Thompson, 2003].

Большое количество работ посвящено анализу специфичности методов ЛНП афереза, в частности их воздействия на систему гомеостаза. Пристальное внимание к вопросам специфичности объясняется тем, что они тесно связаны с безопасностью применения ЛНП афереза. Поскольку ЛНП аферез для больных с тяжелыми формами гиперлипедимии, подобно диализу, является продолжительным систематическим лечением, неспецифическое удаление компонентов плазмы может привести к серьезным нарушениям в организме пациента.

При сравнении различных методов ЛНП афереза анализируется, как правило, их воздействие на концентрацию антиатерогенных липопротеидов высокой плотности (ЛВП), иммуноглобулинов, на компоненты и показатели работы системы коагуляции, концентрацию электролитов, реологию крови.

Все авторы, вне зависимости от используемого ими метода ЛНП афереза, отмечают падение общего белка плазмы и концентрации всех анализируемых компонентов в среднем на 10-20% за процедуру. Этот эффект обусловлен техническими особенностями проведения процедуры: разведением плазмы раствором антикоагулянта, потерей некоторого количества плазмы при неполном вытеснении ее из колонок, при регенерации, разведением плазмы физиологическим раствором, заполняющим колонку. Эти потери зависят от типа плазмасепаратора (центрифужный или фильтрационный), опыта персонала, проводящего процедуру и количества циклов сорбции-десорбции за одну процедуру. Поэтому изменение в пределах 20% концентрации ряда параметров, обнаруживаемое различными авторами, является характерным для всех методов ЛНП афереза и не связано с характеристикой и свойствами сорбционных материалов. Сюда относится некоторое снижение уровня суммарного белка, уровня ХС-ЛВП и anoAI, иммуноглобулинов. Различия в степени падения концентрации этих компонентов, полученные в разных работах, объясняются различиями в методике проведения процедур, количестве обработанной плазмы и другими техническими особенностями.

Специфические различия, связанные с типом сорбента, использованного в процедуре, отмечены для показателей системы коагуляции, реологии крови и ряда других показателей.

Общим для всех методов ЛНП афереза является удаление анти-оксидантов, транспорт которых в организме осуществляют ЛНП. Показано, что ЛНП аферез снижает уровень витамина Е и |3-каротина на 50-60% [Assogba et al., 1995]. Причем снижение уровня этих антиоксидантов пропорционально уменьшению концентрации ОХС, при этом соотношение витамин Е/ОХС и (3-каротин/ОХС не меняется. В связи с этим, в литературе содержатся рекомендации относительно приема антиоксидантов пациентами, находящимися на длительном лечении ЛНП аферезом [Lepage et al, 1996]. Однако, с другой стороны, в ряде работ достоверно показано, что ЛНП аферез снижает уровень окисленных ЛНП и их способность к окислению [Tamai et al., 1997; Leitinger et al., 1996; Napoli et al., 1997]. Очевидно, что удаление окисленных ЛНП, которые обладают более выраженными, по сравнению с нативными ЛНП свойствами, является положительным, хотя клиническая значимость этого эффекта пока не доказана.

Проблема специфичности тесно связана с проблемой побочных эффектов при ЛНП аферезе. В настоящее время накоплено большое количество данных, и статистика показывает, что число побочных эффектов в процедурах ЛНП афереза в разных клиниках и на разных системах составляет от 4 до 12,5%. Большая их часть связана с техническими проблемами при проведении процедур: различными дисфункциями автоматических систем, осуществляющих плазмасепарацию и регенерацию, плохим венозным доступом у пациента. Как специфические, связанные непосредственно с сорбентами, авторами отмечаются следующие побочные эффекты: брадикардия и падение давления, гипогликемия, головная боль, тошнота, аллергические реакции. Количество таких реакций по данным разных авторов колеблется от 0 до 4% от общего числа проведенных процедур [Knisei et al., 1994; Liposorber study group, 1998; Richter et al., 1999; Schmaldienst et al, 2000; Baumbauer, 2003, Thompson, 2003, Ritter et al, 2003]. Наиболее тяжелые побочные реакции были отмечены при использовании сорбента с декстрансульфатом. При лечении пациентов, получающих ингибиторы АПФ ЛНП аферезом на колонках с декстансульфатом, были отмечены тяжелые анафилактические реакции [Olbricht et al, 1992; Kroon et al, 1992]. Эти реакции были вызваны нарушениями в работе кинин-брадикининовой системы вследствие контакта плазмы крови с отрицательно заряженной поверхностью сорбента, и выбросом в кровоток брадикинина. Побочные реакции возникали из-за влияния ингибиторов АПФ на катаболизм брадикинина [Kroon et al, 1992].

Много лет в литературе обсуждался вопрос о возможном смыве антител с иммуносорбентов в процессе их использования. Большое количество работ было посвящено проблеме поиска аутоантител к иммуноглобулинам барана в плазме крови пациентов, длительное время находящихся на лечении ЛНП-аферезом с использованием иммуносорбции [Richter et al, 1990; Keller, 1990; Gordon et al, 1990; Pokrovsky et al.,1993; Richter et al, 1993]. В настоящее время эта проблема потеряла свою актуальность, поскольку за более чем 20 летний опыт использования иммуносорбентов не было отмечено ни одного побочного эффекта, связанного с возможной иммунизацией пациентов антителами барана [ Ritter et al, 2003; Thompson, 2003].

Клинические аспекты применения ЛНП афереза. Известно, что все факторы риска возникновения и развития сердечнососудистых заболеваний делятся на две группы: - модифицируемые, к которым, в частности, относится уровень ОХС, ХС-ЛНП, ТГ, ХС-ЛВП, и немодифицируемые, такие как наследственная предрасположенность к сердечно-сосудистым заболеваниям, пол, возраст. Модифицируемые факторы риска подлежат коррекции. Попытки разработать общие подходы к коррекции нарушений липидного обмена привели к тому, что была определена последовательность введения терапевтических мер при лечении гиперхолестеринемии. Общепринятый сегодня алгоритм коррекции параметров липидного спектра пациента включает, в общем виде, проведение немедикаментозных мероприятий, таких как изменение образа жизни, соблюдение диеты, коррекция веса, повышение физической активности, отказ от курения. На следующем этапе проводится медикаментозная терапия. Если с помощью медикаментов не удается достичь целевых значений показателей липидного спектра, обсуждается вопрос о начале инвазивных методов лечения, включая методы плазматерапии, ангиопластики или реваскуляризации миокарда (коронарного шунтирования (КШ)) (Рис 5).

I Диета 300 мг холестерина/день

II Медикаменты: ингибирование абсорбции ингибирование синтеза, усиление катаболизма III Инвазивные методы плазмотерапия ангиопластика, КШ

Рис. 5. Основные этапы лечения гиперхолестеринемии.

Необходимо отметить, что вклад алиментарного холестерина в общий пул холестерина в организме человека не превышает 10-15%, поэтому с помощью даже самой строгой диеты можно достичь максимально 10-15% снижения концентрации ОХС в крови больного. Если с помощью диеты не удается скорректировать уровень ОХС и ХС-ЛНП, то назначается лекарственная гиполипидемическая терапия.

Применение современных гиполипидемических препаратов, таких как статины, позволяет снизить ХС-ЛНП на 20-60%. Из других, применяемых в настоящее время гиполипидемических препаратов, используются: фибраты, никотиновая кислота, секвестранты желчных кислот. Эти препараты менее эффективны, снижение ХС-ЛНП при их применении составляет 10-30%. Статины практически вытеснили ранее используемые антиоксиданты, гормонально-заместительные препараты. Длительный прием всех гиполиподемических средств, особенно в больших дозах, сопряжен с побочными эффектами. Часто применение этих препаратов вообще противопоказано больному. Кроме того, даже максимальные дозы лекарств не всегда приводят к желаемому результату - уровень холестерина не удается снизить до рекомендуемых значений.

Эпидемиологические исследования, проводимые в различных странах, позволили выработать концепцию лечения и профилактики атеросклероза и дислипидимий, основанную на достижении и поддержании в крови пациента целевых значений показателей липидного спектра. Такие работы были начаты в США под эгидой Национального института сердца, легких и крови в рамках «National Cholesterol Education Programm» (NCEP). Периодически, на основе результатов крупномасштабных исследований, группа экспертов вносила предложения по рекомендуемым «целевым» уровням ОХС, ХС-ЛНП и других параметров липидного спектра («Adult Treatment Panel» -ATP). После достижения консенсуса рекомендованные нормы становились правилом. Обычно спустя несколько лет аналогичные решения принимались и в Европе. На рис.6 представлена динамика снижения целевых уровней ХС-ЛНП, которых необходимо достигать для эффективного лечения сердечнососудистых заболеваний, у категории больных с диагнозом ИБС.

150 с ct

1 100 с: х с; 50 о х о

США

Европа

Рис 6 . Динамика «целевого» уровня ХС-ЛНП, принятого в США и в Европе, достижение которого рекомендуется при лечении сердечно-сосудистых заболеваний, ATP-Adult Treatment Panel.

Как видно из рисунка 6, на протяжении последних 3 декад целевые уровни ХС-ЛНП постоянно ужесточались, и все время пересматривались в сторону понижения. Сегодня, когда получены данные по снижению смертности от ССЗ и возникновению осложнений атеросклероза в виде фатальных инсультов и инфарктов в группах больных, получающих гиполипидемическую терапию по сравнению с группами сравнения, сделан принципиальный вывод о необходимости назначения гиполипидемической терапии всем больным ИБС вне зависимости от уровней ОХС и ХС-ЛНП.

Однако существует категория больных, которые по тем или иным причинам устойчивы к действию даже агрессивной лекарственной гиполипидемической терапии, или не могут ее получать в силу возникающих осложнений. К таким больным относятся: больные с гомозиготной и часть — с гетерозиготной формами СГХС ( в России около 300 тысяч больных с этим генетическим дефектом); больные с первичными и/или вторичными гиперлипидемиями, резистентные к лекарственной терапии; дети, которым противопоказан прием статинов и других гиполипидемических лекарств;

1988 1993 2001 ATP I ATP II ATP III 1994 1998 2003

2004 беременные женщины и др. Поэтому для перечисленных категорий больных методы ЛНП афереза остаются актуальным и сегодня.

ЛНП аферез по-прежнему остается единственным надежным и результативным методом лечения гомозиготных больных СГХС, а также больных гиперхолестеринемией резистентных к лекарственной терапии. Проведение ЛНП афереза с 1-2 недельным интервалом на фоне приема аторвастатина до 80 мг/день позволяет поддерживать уровень ОХС у гомозигот в пределах 6-10 ммоль/л [Thompson, 2003]. Лечение гомозиготных больных ЛНП аферезом рекомендуется начинать в возрасте до 7 лет. Опыт по лечению детей с СГХС показал, что проведение процедур с самого раннего возраста позволяет предотвратить образование стенозов и гарантировать жизнь этим пациентам. В настоящее время в мире имеется достаточно большой опыт лечения таких пациентов [Gordon et al, 1993; Zwiener et al, 1995; Gordon et al, 1998; Pokrovsky et al, 1995; Stefanutti et al, 1995; Коновалов и др., 2001; Konovalov, et al, 2002; Коновалов и др, 2004; ]. Максимальная продолжительность лечения ЛНП аферезом с использованием ИС составляет 18 лет. Лечение пациентки с гомозиготной СГХС было начато в 1985 году в Институте Клинической Кардиологии им. А.П. Мясникова в КНЦ АМН СССР, а в настоящее время проходит в ОБП МЦ УДП РФ. Наблюдение за развитием пациента не выявило никаких отклонений в развитии [Konovalov et al, 2002, Konovalov et. al, 2004]. Характерно, что для лечения детей, наиболее пригодными являются системы, использующие ИС и ДС, поскольку позволяют достичь максимальной эффективности при минимальном объеме экстракорпорального кровообращения.

Показания к применению ЛНП афереза в настоящее время расширены в связи с использованием этого метода для лечения пациентов, нуждающихся в коррекции уровня ЛНП во время беременности. Прием статинов противопоказан во время беременности и периода лактации. Результаты применения ЛНП афереза во время беременности показывают, что этот метод позволяет эффективно и безопасно снижать уровень ЛНП, избежать обострения ИБС в этот период даже без приема медикаментов [Кгооп, 1996; Cashin-Hemphil et al., 2000, Klingel et al., 2003].

Начиная с 90-х годов, активно проводились исследования с целью доказательства регрессии атеросклеротических поражений при агрессивном снижении уровня ЛНП у пациентов. Одно из первых сообщений о возможности регрессии коронарного атеросклероза появилось в Германии [Hombach et al., 1986; Oetto et al., 1988]. В настоящее время опубликованы данные 10 таких исследований, которые убедительно доказывают, что ЛНП аферез является терапией, позволяющей не только предотвратить развитие, стабилизировать, но и вызвать регрессию коронарного атеросклероза (таблица 3). Сравнение групп, получавших только лекарственную терапию и лекарственную терапию + ЛНП аферез показало достоверно более высокое снижение уровня ЛНП и достоверно более хорошие результаты при обследовании коронарографией.

Механизм, посредством которого ЛНП аферез улучшает прогноз при коронарном атеросклерозе обсуждается авторами с момента получения первых положительных результатов его применения. Еще в 1997 году была предложена гипотеза о положительном воздействии даже одной процедуры ЛНП афереза на эндотелий-зависимую функцию артерий [Tamai et al., 1997].

В данном исследовании, проведенном с использованием колонок с ДС, было показано также, что удаление окисленных ЛНП вследствие процедуры ЛНП афереза коррелирует с восстановлением функции эндотелия.

Другой механизм был предложен Кгооп et al, показавшими, что ЛНП аферез, проводимый в течение 2 лет, повышает толерантность к физической нагрузке благодаря улучшению региональной перфузии миокарда [Кгооп et al., 1996; Aegenvaeren et al., 1996]. В ряде работ было показано наличие корреляции между степенью улучшения кровотока сердечной мышцы и снижением уровня ЛНП [Mellwig et al., 1998; Kobayashi et al., 2002].

Таблица 3. Результаты коронарографических исследований, полученные при проведении JIi ЧП афереза в различных клиниках.

Автор [ссылка] Количество пациентов, включении х в исследован ие Метод ЛНП афереза + Медикаментозная терапия Период наблюд ения Результаты (по данным ангиографии)

LARS [Tatami, 1992] Hinz -7 Htz-25 Non FH-5 ДС + пробукол, правастатин 3 года Регрессия у 4 Ьтг и 10 Ыг.

HELP-study [Schuff-Werner, 1994] Htz -33 HELP + Секвестанты желчных кислот, фибраты 2 года Регрессия у 23 пациентов

LDL apheresis study, [Waidner, 1994] Htz-25 ИС 3 года Регрессия в 8 участках из 111 анализированных пораженных сосудов, прогресс в 11.

Osaka LDL apheresis Multicenter group. [Kitabatake, 19941 Htz-13 ДС + Пробукол, правастатин, секвестанты желчных кислот 1 год Регрессия в 33% анализированных пораженных сосудов, прогресс в 13%; 54% -без изменений.

FHRS [Thompson, 1995] Htz-20. ДС+ симвастатин, секвестанты желчных кислот 2,1 года Регрессия в 25% анализированных пораженных сосудов, прогресс в 10%; 65% -без изменений.

Htz-19. Симвастатин, секвестанты желчных кислот Регрессия в 21% анализированных пораженных сосудов, прогресс в 21%; 58% -без изменений.

LAARS [Kroon, 1996] Htz+non FH -21; ДС+ симвастатин 2 года Результаты схожи в обеих группах.

Htz+non FH -21; Симвастатин

Munich study [Richter, 1998] Htz -34 ИС, HELP, ДС + Симвастатин 8,6 года Регрессия - 4 пациентов, отсутствие прогрессии — 29 пациентов.

Duisburg study [Park, 1998] Гиперлипи демия -44 HELP + гиполипидемически е препараты 1,3 года Улучшение у 32 пациентов

Liposorber study [Gordon, 1998] Htz-39 Hmz-10 ДС 5 лет Улучшение клинической картины заболевания у всех пациентов

Таблица 3 (продолжение). Результаты коронарографических исследований, полученные при проведении ЛНП афереза в различных клиниках.

Нокипки-РН- ЬОЬ-арЬегез18 зШёу [МаЬисЫ, 1998] тг-130 ДС + гиполипидемиче ские препараты 6 лет Улучшение в 72% случаев

Ь-САРБ [МзЫтига, 1999] П&-25 ДС + Пробукол, симвастатин, секвестанты желчных кислот 2,1 года Регрессия в 16% анализированных пораженных сосудов, прогресс в 8%; 65% -без изменений.

2-11 Пробукол, симвастатин, секвестанты желчных кислот Регрессия в 0% анализированных пораженных сосудов, прогресс в 64%; 36% -без изменений.

Шт. - гетерозиготная форма СГХС, Нтг - гомозиготная форма СГХС, поп РНненаследственная СГХС.

Суммируя современные представления по вопросу механизма действия ЛНП афереза можно сказать, что помимо прямого воздействия на уровень атерогенных липопротеидов, ЛНП аферез воздействует на ряд других факторов. В числе этих факторов в настоящее время обнаружены: улучшение реологии крови, восстановление функции эндотелия, улучшение вазодилатации и ремоделирование стенки сосуда, удаление окисленных ЛНП, воздействие на кинин-брадикининовую систему [ТаБакь, 2003]. Благодаря действию этих механизмов достигается наблюдаемое при ЛНП аферезе улучшение функции эндотелия и увеличение резерва коронарного кровотока. Поэтому пришло время, когда помимо прямого эффекта ЛНП-афереза на снижение в крови ЛНП, можно говорить о его дополнительном - плейотропном действии, результатом которого является улучшение прогноза тяжелых больных ИБС, рефрактерных к другим видам терапии.

К атерогенным апоВ100 содержащим липопротеидам, помимо ЛНП, относятся также липопротеиды очень низкой плотности (ЛОНП) и липопротеид (а), о котором пойдет речь в следующем разделе.

Липопротеид(а) и сердечно-сосудистые заболевания.

Jln(a), как фактор риска возникновения и развития атеросклероза различных локализаций.

Липопротеид(а) [Лп(а)] был обнаружен норвежским ученым К. Berg в 1963 г. с помощью иммунологических методов как новый антиген плазмы крови [Berg, 1963]. На протяжении двух десятилетий ему не уделялось существенного внимания, однако в 1980-е годы было опубликовано несколько работ, установивших связь между концентрацией Лп(а) в крови и повышенным риском развития инфаркта миокарда [Kostner et al., 1981; Utermann, 1989]. Лп(а) представляет собой сферическую частицу диаметром около 260 Ä, состоящую из ЛНП-подобной частицы и одной молекулы апобелка(а), которая связана с апоВюо ковалентной дисульфидной связью [Utermann, 1989]. Уникальность белка апо(а) состоит в том, что он не обнаруживается более ни в одном из классов липопротеидов и имеет высокую степень гомологии (до 90%) с молекулой плазминогена [MacLean et al., 1987]. Ген, ответственный за синтез белка апо(а), локализован в длинном колене шестой хромосомы рядом с геном плазминогена [Frank et al., 1988]. Уровень Лп(а) выше 30 мг/дл встречается у 25-40% больных ИБС и признается пороговым, так как по данным ряда авторов, у пациентов с такой концентрацией Лп(а) в крови возрастает риск развития сердечно-сосудистых заболеваний [Seed , 1996].

В 90-е годы были представлены результаты 26 проспективных исследований связи Лп(а) с развитием ИБС или ее осложнений [Danesh et al., 2000]. Мета-анализ этих исследований показал, что риск возникновения не фатального инфаркта миокарда (ИМ) или смерти от ИБС при наличии высокой концентрации Лп(а) увеличивается на 60-70% [Danesh et al., 2000]. Результаты 7-летних наблюдений в Великобритании, в которые были включены 21520 мужчин, показали, что повышенный уровень Лп(а), аналогично повышенной концентрации апоВ10о и пониженной - anoAI, связан с риском возникновения ИМ [Wald et al., 1994]. Наблюдения за здоровыми мужчинами с повышенным

РОССИЙСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ БИБЛИОТЕКА уровнем ХС-ЛНП (>4,9 ммоль/л) в течение 7 лет показали, что после исключения влияния возраста, курения, АД, массы тела, ХС-ЛНП и ХС-ЛВП, Лп(а) является независимым фактором риска развития ИБС [Schaefer et al., 1994]. Исследование Gottingen Risk Incidence and Prevalence Study (GRIPS) продемонстрировало, что наряду с общепризнанными факторами, такими как ХС-ЛНП, семейный анамнез ИМ, пониженный ХС-ЛВП и высокий уровень фибриногена, Лп(а) является фактором риска ИМ [Wald et al., 1994]. У лиц с низким ХС-ЛНП повышенный уровень Лп(а) (>30 мг/дл) также был связан с увеличением риска ИМ [Cremer et al., 1995]. Однако существуют исследования, где не подтверждается связь Лп(а) с ИБС и ее проявлениями. В частности, при наблюдении за 15000 американскими врачами в течение 5 лет - Physicians" Health Study- (PHS) не показано связи между уровнем Лп(а) и развитием фатального и не фатального ИМ [Ridker et al., 1993]. Интерпретация результатов этого исследования затруднена в связи с применением обследованными аспирина. Противоречия в результатах при исследовании связи Лп(а) и риска сердечно-сосудистых заболеваний были обнаружены также в случае, когда исследование были включены группы пациентов с невысоким (5,6 ммоль/л) и сильно повышенным уровнем ХС-ЛНП [Mäher et al., 1995]. Проспективное исследование среди больных с имеющейся ИБС - Scandinavian Simvastatin Survival Study (SSS Study) установило, что. Лп(а) является независимым предиктором как коронарных осложнений, так и общей смертности (относительный риск - 1,3) [Berg et al., 1997]

В многоцентровом европейском исследовании с участием 2587 больных было установлено, что у обоих полов все липидные показатели, включая Лп(а), связаны с ангиографически доказанным коронарным атеросклерозом, причем связь эта количественная, т.е. с увеличением концентрации ОХС, ХС-ЛНП и апоВ или снижением ХС-ЛВП и апо AI, возрастает количество пораженных артерий. Причем, было показано, что Лп(а) связан с ИБС в такой же степени, как и ОХС и ХС-ЛНП [Bolibar et al., 1995]. При исследовании 118 мужчин без

ИМ в анамнезе установлена положительная связь Jln(a) с коронарными индексами сосудов, стенозов и протяженности поражения коронарных артерий [Budde et al., 1994]. Корреляция концентрации Лп(а) в крови с наличием гемодинамически незначимых бляшек, обнаруженная в исследовании японских ученых позволяет предполагать, что Лп(а) участвует в атеросклеротическом процессе на ранней стадии его возникновения. Эти данные свидетельствуют о том, что Лп(а) может способствовать развитию нарушенного тонуса сосуда, действуя, вероятно, через факторы гемостаза на том этапе, когда видимые изменения в коронарных артериях еще отсутствуют.

W.Terres и соавт. (1995) с помощью повторных ангиографических исследований, проведенных с интервалом в 66 дней, продемонстрировали, что только концентрация Лп(а) связана с быстрым прогрессированием коронарного атеросклероза: у 21 больного с прогрессированием поражения, медиана уровня Лп(а) была в 4,5 раза выше, чем у 58 больных без прогрессирования (66 мг/дл и 13 мг/дл соответственно, р=0,01). Наблюдение за 85 больными ИБС в течение 2 лет с проведением повторной коронарографии показало, что прогрессирование атеросклероза без ИМ (группа 48 человек) связана с более высоким уровнем Лп(а) и более низкой концентрацией ХС-ЛВП [Tamura et al., 1995]. При изучении состава бляшек, полученных при атероэктомии, было обнаружено более высокое содержание Лп(а) при нестабильной, чем при стабильной стенокардии [Dangas et al., 1998], что позволяет предположить участие Лп(а) в росте бляшки. Итак, большая часть результатов современных исследований демонстрирует прямую связь уровня Лп(а) с наличием, прогрессированием и степенью выраженности коронарного атеросклероза. Существует предположение, что повышенный уровень Лп(а) может служить одним из предикторов смерти от ИБС мужчин в молодом и среднем возрасте [Sutton-Tyrrell et al., 1996]. Известно, что у этой категории больных первым клиническим проявлением коронарного атеросклероза становятся фатальный ИМ или внезапная смерть, которая в 50% случаях приводит к летальному исходу на догоспитальном этапе. Мы разделяем эту точку зрения [Лякишев и др,. 1991; Лякишев и др, 2001; Ежов и др, 1999; Ежов и др., 2000].

Гомология первичной структуры молекулы белка апо(а) с плазминогеном позволяет предполагать участие частицы Лп(а) в процессах тромбообразования. В экспериментальных работах показано, что Лп(а) подавляет связывание плазминогена с его рецепторами на клетках эндотелия, конкурирует с тканевым активатором плазминогена за связывание с фибрином [Loscalzo et al., 1990]. В предыдущих исследованиях была установлена связь высокого уровня Лп(а) с перенесенным ИМ у мужчин [Kostner et al, 1981; Kark et al, 1993]. Клинические данные свидетельствуют о связи Лп(а) с самыми начальными изменениями в коронарных артериях [Budde et al, 1994; Tsurumi et al, 1995; Takami et al, 1995]. В нескольких клинико-анатомических исследованиях показано, что примерно в половине случаев ИМ развивается в артериях, имевших стенозы диаметром менее 50%. [Fishbein, Siegel, 1996]. Кроме того, у больных с развивающимся ИМ и исходно повышенным уровнем Лп(а), вероятность спонтанной реперфузии пораженной коронарной артерии ниже по сравнению с больными с нормальным уровнем Лп(а) [Moliterno et al, 1993]. Учитывая эти данные, можно предполагать, что развитию инфаркта миокарда со стойкой окклюзией способствуют протромботические свойства апо(а) [Hervio et al, 1993]. Результаты британского проспективного 3-х летнего наблюдения за 266 больными с диагнозом острого ИМ [Stubbs et al, 1998] показали, что Лп(а) > 30 мг/дл связан с увеличением на 62% сердечной смертности в сравнении с группой с нормальным уровнем Лп(а). Многофакторный анализ выявил, что относительный риск смерти от кардиальных причин у больных с ИМ и Лп(а)>30 мг/дл составляет 2,16.

Таким образом, Лп(а), вероятно, участвует в развитии тромбоза коронарных артерий, и его высокий уровень связан с увеличением риска смерти у больных, перенесших ИМ. Строение частицы Лп(а) и ее схожесть с ЛНП, а также с плазминогеном, позволяет сделать предположение о том, что частица

Jln(a) может играть роль своеобразного «моста» между холестериновой гипотезой и процессами тромбообразования, т.е. активно участвовать в процессах атеротромбогенеза.

Существуют противоречивые данные о связи Лп(а) с наличием и развитием инсультов. В крупном популяционном исследовании Atherosclerosis Risk in Communities (ARIC), концентрация Лп(а) была выше у больных, перенесших инсульты или транзиторные ишемические атаки. При этом риск развития цереброваскулярных осложнений при Лп(а)>30 мг/дл повышался на 17% [Schreiner et al., 1993]. Во французском исследовании среди 90 больных молодого возраста, перенесших инсульт, уровень Лп(а) был достоверно выше, чем в контрольной группе [Peynet et al., 1999], что подтвердило данные предыдущего исследования [Nagayama et al., 1994].

Корреляция между повышенной концентрацией Лп(а) и утолщением слоя интима-медиа сонных артерий была показана в исследовании ARIC [Schreiner et al., 1994]. Причем было показано, что на связь Лп(а) с бессимптомным каротидным атеросклерозом не влияют другие общепризнанные факторы риска [Schreiner et al., 1993]. Связь Лп(а) с тяжестью каротидного атеросклероза была показана в двух крупных исследованиях - the Bruneck Study ( в случайной выборке из 885 мужчин и женщин 40-79 лет [Willeit J et al., 1995]), и Systolic Hypertension in the Elderly Program (SHEP) [Sutton-Tyrrell et al., 1996]. Наши исследования также подтвердили связь между концентрацией Лп(а) и атеросклерозом сонных артерий [Nomira et al., 1993; Варакин и др., 1993; Покровский и др., 1999].

В исследовании SHEP было также выявлено, что только уровень Лп(а), независимо от других факторов риска, связан с наличием и тяжестью атеросклероза артерий нижних конечностей у пожилых мужчин и женщин [Sutton-Tyrrell et al., 1996]. Это наблюдение было подтверждено для молодых мужчин в возрасте до 45 лет с хронической ишемией нижних конечностей [Valentine et al., 1996] и ангиографически доказанным поражением нижних конечностей [Prior et al., 1995]. Итак, повышенный уровень Jln(a) является независимым фактором риска атеросклероза сонных и периферических артерий [Бритарева и др., 2002].

За последнее десятилетие была показана взаимосвязь Лп(а) с процессами рестенозирования у больных, перенесших операции коронарного шунтирования (КШ) или транслюминальной баллонной коронарной ангиопластики (ТБКА). Обнаружено повышенное содержание апо(а) и апоВюо в венозных шунтах [Cushing et al., 1989] и стенке восходящей аорты [Rath et al., 1988]. Отношение апо(а)/апоВюо в ткани было в 3 раза выше, чем в плазме у тех же пациентов [Cushing et al., 1989]. Накопление апо(а) в артериальной стенке позитивно коррелирует с уровнем Лп(а) сыворотки, что позволило сделать вывод о вкладе Лп(а) в развитие атеросклероза венозных шунтов и в формирование бляшки в стенке артерии [Rath et al., 1988]. Достоверная связь между окклюзией венозных шунтов после операции КШ и повышенным уровнем Лп(а) подтверждена и в клинических исследованиях [Hoff et al., 1988, Solymoss et al., 1993; Ильина и др., 1999; Pokrovsky et al., 2003].

Результаты клинических исследований роли Лп(а) в развитии рестеноза после стандартной коронарной ангиопластики можно суммировать следующим образом: 1) уровень Лп(а) достоверно выше в группах больных с рестенозом [Hearn et al., 1992; Tenda et al., 1993; Yamamoto et al., 1995]; 2) рестеноз достоверно чаще встречается в группе больных с уровнем Лп(а) более 30 мг/дл [Yamamoto et al., 1995]; 3) между уровнем Лп(а) и степенью рестеноза существует положительная корреляция [Tenda et al., 1993]; 4) другие липиды крови не связаны с частотой рестеноза [Hearn et al., 1992; Tenda et al., 1993]; 5) повышенный уровень Лп(а) коррелирует с возвратом клинических проявлений (стенокардии) после проведения ТБКА [Desmarais et al., 1995].

Таким образом, результаты проспективных популяционных исследований, опубликованные в 90-е годы, указывают на увеличение на 70% риска развития ИБС у лиц с высокой концентрацией Лп(а) [Danesh et al., 2000].

Также установлена связь Лп(а) с атеросклеротическим поражением коронарных, сонных и периферических артерий, окклюзией аутовенозных шунтов после операции КШ и баллонной ангиопластики.

Возможности коррекция повышенного уровня Jln(a).

Несмотря на структурное сходство между Лп(а) и ЛНП, ни диета [Lichtenstein et al. 1999, Vessby et al. 2001], ни основные, даже самые современные гиполипидемические лекарственные средства, применяемые в клинической практике, не влияют на уровень Лп(а). Это показано в клинических исследованиях действия статинов: симвастатина [Nishikawa et.al., 1999], ловастатина, [Alaupovic et.al., 1999] и флувастатин [Sasaki et.al., 1995].

Однако, по некоторым данным, длительное применение (в течение 3 лет) ловастатина, а также комбинированная терапия ловастатином и холестироламином приводит к незначительному снижению исходного уровня Лп(а) [Lener et.al., 1992]. Сообщение о влиянии правастатина на уровень Лп(а) [Schmidt et.al., 1992, 1993], не было подтверждено в дальнейшем [Hunninghake et.al., 1993]. Кроме того, в литературе имеются данные о том, что что прием статинов не только не снижает концентрацию Лп(а), но и приводит к ее умеренному повышению [Klausen et al., 1993]. Пробукол не влияет на уровень Лп(а) [Maeda et al., 1989].

Такие же противоречивые результаты были получены и для влияния высоких доз - N-ацетилцистеина [Gavish, Breslow, 1991; Kroon et.al., 1991; Wiklund, et.al., 1996]. Результаты исследований указывали, что уровень Лп(а) оставался резистентным к длительному приему N-ацетил-цистеина в дозах от 2,4 до 6 г в день у 2/3 больных. Для остальных 1/3 больных, включенных в исследование, удавалось снизить Лп(а), однако недостаточно эффективно (примерно на 20%).

Данные, представленные M.Rath, о снижении повышенной концентрации Лп(а) на 27%, достигаемой при приеме высоких доз аскорбиновой кислоты [Rath, Pauling, 1990] не нашли подтверждения ни в наших собственных исследованиях [Ежов 1996], ни в работах других авторов [Bostom et.al., 1995, Jenner, et.al., 2000].

Достоверно показано, что мегадозы никотиновой кислоты и ее производных могут снижать уровень Лп(а) на 30% [Tanaka, et.al., 1997], причем снижение Лп(а) достигается за счет уменьшения скорости его синтеза [Seed et.al., 1993].

Наиболее эффективным в настоящее время является снижение уровня Лп(а) методами терапевтического афереза.

Благодаря присутствию молекулы апоВюо в составе Лп(а), большинство методов ЛНП афереза позволяют снижать уровень Лп(а) за счет сочетанного удаления обеих частиц ЛНП и Лп(а). Такие широко применяемые методы терапевтического афереза как HELP, «DALI»®, иммуносорбция на анти-ЛНП колонках позволяют добиться снижения Лп(а) на 30-60 % [Thompson 2003, Bambauer R 2002; Pokrovsky, 1999] (Рис. 7).

HELP

Jlп(а) Липопак

DALI У

ЛНП-Липопак ZZZ1

LDL-TheraSorb

71

Liposorber

ПФ 0

20

40

60

80

100

Удаление (%)

Рис. 7. Снижение Jln(a) на различных системах для ЛНП афереза.

Armstrong с соавторами, показали, что уровень Лп(а) снижается более чем на 50% на процедуре HELP, основанной на преципитации апоВ-содержащих липопротеидов гепарином в кислой среде [Armstrong et.al, 1992, 1994]. ЛНП аферез на колонках с декстрансульфат целлюлозой «Liposorber»® снижает уровень Лп(а) в течении 1 процедуры почти на 40-60 % [Stefanutti et.al, 1995; Olbricht, 1996]. Использование системы «DALI»® для перфузии цельной крови позволяло снизить уровень Лп(а) до 60 % [Bosch et.al., 2001].

ЛНП-аферез, основанный на мембранной фильтрации, позволял снизить уровень Лп(а) на 50%. Однако при использовании этого метода наблюдается существенное удаление таких жизненно важных компонентов плазмы крови, как IgM (на 55%), IgG (на 27%), альфа 2-макроглобулина (на 49%), а также достоверное снижение антиатерогенных ЛВП (на 27%) за год проводимого лечения [Yamamoto et. al, 1989; Geiss et.al, 1999]. Это является существенными недостатками и ограничивает применение данного метода.

Проведение ЛНП афереза при помощи иммуносорбционных колонок «LDL TheraSorb»® и «ЛНП Липопак»® существенно повышает специфичность удаления апоВюо-содержащих липопротеидов, и увеличивает эффективность снижение уровня Лп(а), однако количественные данные о падении концентрации Лп(а) за процедуру достаточно противоречивы. Так Bambauer пишет, что уровень Лп(а) снижался на процедурах иммуносорбции на колонках «LDL TheraSorb»® на 26% [Bambauer et.al, 1996], тогда как Banyai опубликовал данные о возможности снижения Лп(а) этим методом на 74% [Banyai et.al, 1998]. Thompson в своем последнем обзоре существующих методов ЛНП афереза приводит следующие результаты среднего снижение Лп(а) различными методами: иммуносорбция - на 53%, HELP - 68%, DAL.I - 63%, «Liposorber» -51% [Thompson, 2003].

Существует мнение о нецелесообразности снижения уровня Лп(а), в случаях когда концентрация ХС-ЛНП снижена до 130 мг/дл том [Kitano et.al.

1997]. Однако существуют данные, опровергающие правильность этого мнения.

В частности, результаты исследования Low-Density Lipoprotein Apheresis Angioplasty Restenosis Trial. (L-ART), проведенного для выяснения эффективности снижения уровней Лп(а) и ХС-ЛНП при профилактике рестеноза после ТБКА. Было показано, что в группах больных после ТБКА, получавших и не получавших лечение методами ЛНП афереза, частота возникновения рестенозов составила 38% и 37% соответственно. Тогда как в группе, для которой ЛНП аферез сочетался с терапией никотиновой кислотой и правастатином, количество рестенозов было существенно меньше. При снижении уровня Лп(а) на 50%, частота возникновения рестенозов составила 21%, а в подгруппе больных с Лп(а)<30 мг/дл - только 12%. В случаях, когда не удавалось добиться снижения концентрации Лп(а) частота возникновения рестенозов составляла 50% [Daida et al., 1994].

Необходимым условием эффективности методов терапевтического афереза, и в частности ЛНП афереза, является снижения концентрации удаляемого компонента до нормального уровня. При уровне Лп(а) превышающем нормальное значение более чем в 2 раза (>60 мг/дл) использование методов ЛНП афереза не являются эффективным способом снижения Лп(а). Также не оправдано применение ЛНП афереза в тех в случаях, когда уровень ХС-ЛНП у больного не превышает границы нормы или корригируется при помощи гиполипидемической медикаментозной терапии [Pokrovsky, 1994; Pokrovsky, 1995].

Подводя итог, можно сказать, что обширная работа, проведенная по всему миру в последнее десятилетие, свидетельствует о том, что уровень Лп(а)>30 мг/дл является независимым фактором риска возникновения и развития сердечно-сосудистых заболеваний. Несмотря на отсутствие единого мнения о необходимости коррекции повышенного уровня Лп(а), снижение концентрации данного фактора, может быть полезным и целесообразным у больных ИБС. До настоящего времени не найдено способов эффективного снижения концентрации Лп(а).

Таким образом, разработка новых подходов для специфического удаления Лп(а) у пациентов с уровнем этого липопротеида, значительно превышающим верхнюю границу нормы является актуальной задачей. Поэтому нами была предпринята попытка создания специфического иммуносорбента для удаления Лп(а) из крови больных ИБС с повышенным уровнем Лп(а) и нормальными показателями других липидов.

Сорбционные технологии в лечении больных дилатационной кардиомиопатией.

Проблема лечения больных дилатационной кардиомиопатией (ДКМП) чрезвычайно актуальна. К сожалению, в настоящее время не существует эффективной терапии этого заболевания. Прогноз ДКМП, как правило, неблагоприятный - смертность достигает 50% на 5-7 год после установления диагноза ДКМП (Рис 8). До недавнего времени единственное, чем можно было помочь таким больным - это дорогостоящая, мало доступная во многих странах, в том числе и в России, и высоко рискованная операция по пересадке сердца. Однако очевидно, что хирургический метод может быть использован для очень ограниченного числа больных. В частности в России в последние годы были проведены лишь единичные операции по пересадке сердца. Это связано с общим уровнем медицины в стране, этическими нормами, проблемами поиска донора, типирования, наличия необходимой инфраструктуры, высокой стоимости операции и лечения по предупреждению отторжения пересаженного органа. Поэтому во всем мире ведутся интенсивные работы по исследованию причин возникновения данного заболевания и поиску новых эффективных способов его лечения.

0,25

0-1-1-1

5 /О

Время (годы)

Рис. 8. Смертность при кардиомиопатии (КМ). Идиопатическая КМ; — Ишемическая КМ (по данным Felker et al., 2000).

ДКМП представляет собой неоднородную группу хронических заболеваний миокарда, значительной частью которых является так называемая идиопатическая ДКМП - заболевание невыясненной этиологии [Амосова, 1999]. Возникновение ДКМП связывают с генетическими факторами [Komajda et al., 1999; Dec and Fuster, 1994], вирусной инфекцией [Liu and Mason, 2001], беременностью и родами, токсическими факторами, некоторыми алиментарными дефицитами [Амосова, 1999]. На стадии развития заболевания возникает воспалительный процесс, который, как правило, удается подавить применением медикаментов, однако явления нарушения сократительной функции сердечной мышцы продолжают нарастать. В настоящее время установлено, что этот период развития заболевания сопровождается аутоиммунными процессами, которые, как полагают, и приводят к проявлениям острой дисфункции сердечной мышцы.

Известно, что аутоиммунные процессы характеризуются, как правило, наличием целого спектра аутоантител к различным антигенам, состав которого варьирует у разных пациентов и у одного пациента, на разных стадиях развития заболевания. Исследованию различных типов аутоантител при ДКМП посвящено немалое количество работ. При этом усилия ученых концентрируются, главным образом, на вопросах, какие аутоантитела могут служить маркером этого заболевания, и какова их роль в патофизиологических механизмах развития ДКМП.

Наиболее изученными, из обнаруживаемых в крови некоторых больных ДКМП аутоантител, в настоящее время являются аутоантитела к G-белок рецепторам — семейству мембраносвязанных белков, имеющих трансмембранные домены и участки полипептидной цепи, экспонированные на поверхности клеток. [Wallukat, 2002]. В крови больных ДКМП найдены аутоантитела к двум белкам из этого семейства - ßi-адренорецептору и М2 мускариновому рецептору [Wallukat et al., 1991; Fu et al., 1993]. Изучение специфичности аутоантител к ß 1-адренорецептору показало, что аутоантитела образуются, как правило, против второй петли молекулы ßl-адренорецептора (Рис.9). [Magnusson et al., 1990]. Значительная часть исследований возможного патофизиологического механизма действия этих аутоантител была сделана с использованием полуколичественного метода, опубликованного в 1980 году [Wallukat et al., 1980]. Метод заключался в добавлении IgG фракции сыворотки крови больных к культуре неонатальных кардиомиоцитов крысы и последующей регистрации числа сокращений клеток в культуре. Позднее, благодаря разработке иммуноферментного метода определения аутоантител к ßl-адренорецептору с использованием синтетических пептидов, исследования расширились. Скрининг большого числа пациентов показал наличие этих антител у 80% пациентов с ДКМП [Wallukat et al., 1991]. Следует заметить, что авторы, используя разные методы, обнаруживают высокий титр аутоантител к ßl-адренорецептору, как правило, у 50-90% больных с ДКМП. Причем этот процент выше при использовании ELISA с синтетическими пептидами, соответствующими внеклеточным участкам полипептидной цепи рецептора. Однако, при использовании других методов, в частности с нативным рецептором, антитела были зафиксированы только у 20% пациентов [Jahns R. Et al, 1999]. В последние годы появилось мнение, что пациенты, у которых зафиксированы аутоантитела к ßl-адренорецептору, составляют отдельную группу больных ДКМП [Felix et al, 2000]. Таким образом, вопрос о том, являются ли аутоантител к ßl-адренорецептору биохимическим маркером этого заболевания пока нельзя считать окончательно решенным. 1

- г I .

Рис 9. Взаимодействие аутоантител со второй петлей внеклеточной полипептидной цепи Щ-адренорецептора ¡\УаНикаХ е1 а/., 2002/.

Среди множества других аутоантител, обнаруженных при обследовании больных с ДКПМ, наиболее изученными являются антитела к белку мускаринового М2 рецептора, являющегося другим представителем семейства С-белков рецепторов, адениннуклеотидному транслокатору, миозину, тропомиозину, актину (таблица 4), Каждый из перечисленных видов аутоантител найден у определенного процента больных ДКМП, но, как видно из таблицы 4, ни один не может считаться 100% маркером этого заболевания, хотя антитела к р1 адренорецептору могут служить неплохим маркером.

Еще в 80-е годы, когда только начиналось изучение связи ДКМП и различных аутоантител, высказывались предположения о том, что наличие и концентрация аутоантител свидетельствует о стадии развития заболевания. В частности, наблюдения, сделанные при обследовании семей с наследственной формой ДКМП [Graber et al., 1986] впоследствии показали, что уровень аутоантител к ß 1-адренорецептору у членов семей с развившимся заболеванием в 2 раза выше, чем у здоровых [Limas and Limas, 1993].

Таблица 4. Частота встречаемости аутоантител различной специфичности у больных ДКМП.

Антиген Частота встречаемости у пациентов с ДКМП (%) Источник аир цепи миозина 20-50 Caforio А. et al.„ 1992 Lauer В, et al., 1995 J.Goldman, 1995

Тропомиозин 76 Konstadoulakis M. et al., 1993

Ламинин 78 Wolff P. et al., 1989

Актин 66 Konstadoulakis M. et al., 1993

Адениннуклеотидный транслокатор 30-95 Liao Y, 1996 Schulze K. et al., 1990 Schultheiss H., 1989 i - адренорецептор 30-98 Limas C. Et al., 1989 Magnusson Y. Et al., 1994

Мускариновый М2 рецептор 28-94 Wallukat G, et al., 1999 Fu M. et al, 1996

Много исследований посвящено вопросу о том, способствует ли наличие антител развитию ДКМП и по какому механизму. Существующие на сегодня гипотезы носят спекулятивный характер и являются наиболее обоснованными для предполагаемых патофизиологичеких механизмов действия аутоантител к адениннуклетидному транслокатору и к Р1 -адренорецептору.

Предполагается, что аутоантитела к адениннуклетидному транслокатору способны ингибировать транспорт АТФ из митохондрий к сократительным белкам миокарда, что ведет к уменьшению потребления миокардом кислорода, снижению коронарного кровотока и сердечного выброса. [Schulze et al., 1990].

Л I

Обнаружено также взаимодействие этих аутоантител с белками Ca каналов, что вызывает увеличение поступления Са2+ внутрь миоцитов, их кальциевое повреждение этих клеток и лизис [Chen et.al, 1995].

Аутоантитела к к ß 1-адренорецептору, обладая свойствами ß агонистов, способны вызывать стойкую стимуляцию рецептора, ведущую к тахикардии и способствующую развитию аритмий. Таким образом, положительный хронотропный эффект, оказываемый аутоантителами к ßl -адренорецептору на кардиомиоциты, предположительно, и составляет их патофизиологическую роль в развитии ДКМП [Magnusson, 1994]. Однако эта гипотеза противоречит наблюдению, сделанному при обследовании пациентов, подключенных к аппарату «искусственное сердце». Уровень аутоантител к ß 1-адренорецептору этих пациентов существенно снижался после улучшения функции сердечной мышцы [Muller et al., 1997], что свидетельствует о том, что данный вид аутоантител является не более, чем маркером функционального статуса сердца.

Таким образом, роль различных аутоантител в возникновении и развитии ДКМП пока окончательно не выяснена, а вопрос о их участии в течении болезни остается открытым и мало изученным.

Несмотря на то, что данные о частоте встречаемости различных аутоантител и корреляции между их присутствием и тяжестью заболевания достаточно противоречивы, показано, что эти антитела не встречаются или встречаются достоверно реже в крови здоровых доноров и больных другими сердечно-сосудистыми заболеваниями. Таким образом, эти исследования косвенно свидетельствуют о многочисленных аутоиммунных процессах, которые, возможно, в конечном счете, и формируют фенотип ДКМП и дают основание полагать, что аутоантитела являются важным звеном патологического процесса.

Поэтому попытка вмешаться в течение этого процесса при помощи методов терапевтического афереза, впервые предпринятая в 1996 году в

Германии, является вполне обоснованной [Wallukat et al., 1996]. Приоритет в использовании метода Ig афереза для лечения больных с ДКМП принадлежит группе ученых из German Heart Zentrum, Берлин, Германия. В исследование были включены 8 пациентов с диагнозом ДКМП, в крови которых методом на клеточных культурах были обнаружены аутоантитела к ßl-адренорецептору. Удаление IgG из крови пациентов проводили методом плазмосорбции на колонках с иммобилизованными ПкАт барана против IgG человека («Ig Therasorb» , «Therasorb», Германия). Согласно разработанному протоколу, процедуры проводили ежедневно в течение 4-5 дней, при этом удаляли до 90% суммарной фракции иммуноглобулинов, включая IgG, IgM, IgA. Уровень аутоантител к ßl-адренорецептору при этом также значительно снижался.

Клиническая картина заболевания у пациентов, получавших Ig аферез, значительно улучшилась. В 7 случаях из 8 снизился функциональный класс сердечной недостаточности пациентов по NYHA. В течении 2-3 месяцев уровень аутоантител к ßl-адренорецептору у части пациентов восстановился, что сопровождалось увеличением класса NYHA. На основании этого, в целом успешного, опыта был сделан осторожный вывод о том, что Ig аферез может служить поддерживающей терапией в период ожидания трансплантации сердца, т.е. использоваться как «мост».

В течение последующих 6 лет опыт использования Ig афереза существенно расширился, было проведено 7 исследований, в том числе и у нас, в общей сложности примерно на 200 пациентах. Общая характеристика проведенных испытаний приведена в таблице 5. В России первые процедуры Ig афереза были проведены в 2000 году [Коновалов и др., 2001]. Получены предварительные данные, свидетельствующие о перспективности такого метода лечения больных ДКМП [Коновалов и др., 2002; Коновалов и др., 2004].

Ссылка Тип исследования Кол-во пациентов Время наблюдения Результаты

Wallukat et al., 1996 Неконтролируемое 8 4 месяца Снижение функционального класса сердечной недостаточности по ЫУНА, восстановление уровня аутоантител к Р1 -адренорецептору у части пациентов.

Dorffei et al., 1997 Неконтро лируемое 9 6 дней Улучшение функциональных параметров сердца, сердечного индекса, ударного индекса, общего периферического сопротивления.

Felix et al., 2000 Контролируемое 9/9 3 месяца Увеличение сердечного индекса, ударного индекса , ФВ ЛЖ*. Уровень аутоантител к р 1 -адренорецептору после лечения не восстановился.

Muller et al., 2000 Частично контролируемое 17/17 12 месяцев Увеличение ФВ ЛЖ, КДР ЛЖ**, снижение класса по ЫУНА. Уровень аутоантител к Р1 -адренорецептору после лечения не восстановился

Staudt et al., 2001 Рандомизированное Контролируемое 12/13 3 месяца Увеличение ФВ ЛЖ, снижение показателя инфильтрации лейкоцитов в биопсийном материале. Уровень аутоантител к Р1-адренорецептору после лечения не восстановился.

Felix et al., 2002 Неконтролируемое 11 3 дня Увеличение сердечного индекса, удаление аутоантител к Р1-адренорецептору.

Коновалов и др., 2002 Неконтролируемое 3 20 месяцев Уменьшение объема и полости ЛЖ, улучшение сократимости переднего отдела межжелудочковой перегородки и переднебоковой стенки ЛЖ, увеличение ФВ ЛЖ, уменьшение класса ИУНА.

ФВ ЛЖ - фракция выброса левого желудочка; КДР ЛЖ - конечный диастолический размер левого желудочка.

К сожалению, протоколы лечения в различных исследованиях отличались. Процедуры проводили ежедневно в течение 3-5 дней курсами, с перерывом от 1 месяца до полугода. По окончании курса процедур в части исследований пациентам вводили препарат IgG для предотвращения иммунодефицита [Felix et al., 2000]. Однако в той части исследований, где IgG не вводили, не сообщалось о каких-либо осложнениях.

По данным некоторых исследований аутоантител а к ßl-адренорецептору не детектировались в крови пациентов после 5 процедур иммуносорбции, и их уровень не восстанавливался в течение всего периода лечения [Felix et al., 2000; Muller et al., 2000] . Это наблюдение противоречит ранее полученным данным [Wallukat et al., 1996] и нашим собственным данным [Коновалов и др., 2002].

В результате во всех исследованиях показано, что состояние и параметры сердечной функции пациентов после лечения улучшались. В ряде случаев, улучшение состояния позволило снять пациентов с листа ожидания на пересадку сердца [Muller et al., 2000].

Наибольший объем исследования с периодом наблюдения 12 месяцев был сделан в немецком Центре Сердца Muller et al. Результаты лечения 17 пациентов Ig аферезом при сопоставлении с контрольной группой выявили продолжительный положительный эффект терапии. В группе пациентов, получавших Ig аферез, наблюдалось значительное увеличение фракции выброса левого желудочка по сравнению с контрольной группой после 9 и 12 месяцев наблюдения.

Наш опыт максимально длительного наблюдения одного пациента составляет 20 месяцев [Коновалов и др., 2002], и по неопубликованным данным того же исследования уже > 3 лет наблюдения свидетельствует о дальнейшем улучшении субъективного и объективного состояния пациента.

Положительный эффект, достигнутый при удалении IgG из плазмы крови пациента, подтвержденный наблюдениями разных авторов в различных клиниках, подтвердил факт, что аутоантитела участвуют в патологических процессах при ДКМП. Однако вопрос о том как, и в какой мере, по прежнему остается открытым.

В последние годы были предприняты попытки создания специфических сорбентов для удаления аутоантител к ßl-адренорецептору. Немецкая фирма "Affina", Берлин, Германия, разработала и в настоящее время проводит клинические испытания двух типов колонок с сорбентом на основе синтетических пептидных лигандов [Ronspeek, 2003]. Первый тип — колонки «Globaffin» на основе пептида PGAM146, который, как показано при взаимодействии с плазмой крови человека, связывает IgG, иммунные комплексы и частично, IgM и IgA. То есть данный сорбент по своим характеристикам идентичен анти-IgG сорбентам на основе антител и обладает широкой специфичностью по отношению к иммуноглобулинам человека. Колонка «Globaffin» содержит 250 мг пептида, иммобилизованного на Сефарозу CL-4B при помощи бромциана. Колонки «Globaffin» являются регенерируемой системой, использующей твиновую технологию. То есть в процедуре используются попеременно две колонки. Две колонки «Globaffin» предназначены для проведения одной процедуры.

Другой тип колонок - «Coraffin»- представляет принципиально новое направление в Ig аферезе. В качестве лиганда в колонках «Coraffin» используются два пептида, один из которых (PDCM349) соответствует первой внеклеточной петле ßl-адренорецептора, а второй (PDCM075) второй внеклеточной петле этого рецептора. То есть данный тип сорбента строго специфичен к аутоантителам к ßl-адренорецептору. Колонка содержит суммарно 7,5 мг иммобилизованных пептидов и предназначена для однократного применения при проведении одной процедуры.

В клиническое исследование колонок «Globaffin» и «Globaffin» были включены в общей сложности 40 пациентов. Из них 8 - получали лечение на колонках «Coraffin», 15 - на колонках «Globaffin». Контрольная группа из 17 пациентов находилась на консервативном лечение. Каждому пациенту был проведен один курс из 5 ежедневных процедур. Данных о режиме проведения процедур и объеме обработанной плазмы не сообщается. В настоящее время опубликованы предварительные результаты данного исследования [КопБреск е1 а1, 2003]. Показано, что в результате курса процедур, аутоантитела к Р1-адренорецептору удаляются на 95% с одинаковой эффективностью на колонках обоих типов. Клиническое обследование пациентов до начала лечения и спустя 12 месяцев после проведенной терапии показало, что ФВ ЛЖ у пациентов контрольной группы не изменилась, у пациентов получавших лечение на колонках «Coraffin», специфичных к аутоантителам к Р1-адренорецептору - увеличилась на 7% (р<0,05), у пациентов на колонках «Globaffín» - на 15 % (р<0,001). Побочных эффектов, связанных с использованием колонок, отмечено не было. Таким образом, в данном исследовании использование узкоспецифического сорбента не имело явных преимуществ по сравнению с обычным аферезом.

Таким образом, проведение работ по применению процедур афереза позволяет оптимистично оценивать возможности их использования для лечения больных ДКМП.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для выделения липопротеидов человека и тестирования сорбентов использовали кровь здоровых доноров и плазму крови, полученную при проведении процедур плазмафереза в лаборатории гемодиализа и плазмафереза Института клинической кардиологии (руководитель профессор Кухарчук B.B.) PK НПК МЗ и CP РФ, а также отделения экстракорпоральных методов лечения ОБП Медицинского центра УД президента РФ (руководитель профессор Коновалов Г.А.).

В работе использовали следующие реагенты.

При приготовлении сорбентов: матрицы Sepharose CL-2B, CL-4B, CL-6B, 6МВ, 4 Fast Flow («Amercham Bioscience», Швеция) и реактивы: бромциан, этаноламин, натрия метапериодат, натрия боргидрид («Fluka», Германия).

В культуральной работе: среды №199, RPMI1640, глутамат натрия, антибиотики (пенициллин, стрептомицин и фунгизон), фетальную телячью сыворотку - реактивы фирмы «Gibco», Англия.

При проведении электрофореза и иммуноблотинга: акриламид, бисакриламид - препараты «Serva», Германия; агароза IFI («Amercham Bioscience», Швеция); трисгидроксиаминометан - реактив «Sigma», США; этилморфолин - «Fluka», Германия; кумасси R-250, бромфеноловый синий -реагенты фирмы «Serva», Германия; нитроцеллюлозные фильтры (150X150 мм, 0,45 мкм) -« Schleicher & Schuell», Германия.

Для жидкостной хроматографии применяли носители: Sepharose CL-4B, Sephadex G-25 («Amercham Bioscience», Швеция) и целлюлозу DE-52 («Wathman», Англия).

В работе были использованы препараты белков: бычий сывороточный альбумин - продукт предприятия БелНИИЭМ, г. Минск; антисыворотка против сыворотки человеческого донора - производство Института Вакцин и

Сывороток, г.Санкт-Петербург; иммуноглобулины кролика к иммуноглобулинам мыши, иммуноглобулины кролика к иммуноглобулинам барана, конъюгированные с пероксидазой - производство «Имтек», Москва.

Общий холестерин, холестерин ЛВП и триглицериды измеряли с помощью энзиматических наборов фирмы «Boehringer», Германия. Белок по Лоури определяли с 2N реагентом Фолина ( «Sigma», США).

Тестирование пирогенности растворов и антител проводили с помощью реактивов « Associates of CAPE COD, Inc.», США.

В работе также использовали: соли, кислоты, щелочи - продукты «Sigma», США; «Analar», Англия; «Reanal», Венгрия; «Реахим», Россия (марок «хч», «осч»). Консерванты и антисептики: этилендиамин тетрауксусной кислоты натриевая соль - препарат фирмы «Analar», Англия; фенилсульфонид фторид («Мегск», Германия); азид натрия, тимеразол, апротинин - препараты фирмы «Sigma», США.

В качестве животных - доноров при получении поликлональных антител использовали баранов фермерского хозяйства НПФ «ПОКАРД». В качестве иммуностимуляторов использовали полный и неполный адъювант Фрейнда («Sigma», США). При продуцировании асцитной жидкости для выделения моноклональных анитител использовали мышей линии BALB/c из биоклиники РК НПК МЗ и CP РФ.

Заключение диссертации по теме «Кардиология», Покровский, Сергей Николаевич

VI. выводы.

1. Синтезирован иммуносорбент с поликлональными антителами к ЛНП, на основе которого созданы высокоспецифичные колонки для ЛНП афереза («ЛНП Липопак»®). На примере данного сорбента сформулированы основные принципы получения сорбентов с заданными свойствами, обеспечивающими их эффективное применение в экстракорпоральной терапии. Результаты длительного (более 18 лет) использования данного сорбента в клинической практике для лечения больных СГХС доказали эффективность и безопасность экстракорпоральной терапии с применением специфичных сорбентов.

2. Получена и охарактеризована панель моноклональных антител против ЛНП человека, с их помощью проведено картирование эпитопов экспонированных на поверхности частицы ЛНП участков молекулы апол ипопротеинаВ юо

3. Синтезирован сорбент с МкАт к ЛНП. Показана принципиальная возможность использования одного МкАт для синтеза иммуносорбентов с высокой сорбционной емкостью. Сформулированы основные подходы к созданию сорбентов на основе МкАт для клинического применения. Доказана эффективность и безопасность использования данного сорбента в клинической практике.

4. Создана модель ЛНП афереза in vitro, с помощью которой показано снижение концентрации липидов в пораженных атеросклерозом участках аорты человека. Показана принципиальная возможность регрессии (обратного развития) атеросклеротических бляшек в коронарных артериях больных СГХС после длительного курса ЛНП афереза с использованием колонок «ЛНП Липопак»® и «Иммунолипосорбер МкАт».

5. В результате сравнения различных плазмо- и гемо - совместимых сорбентов для ЛНП афереза, показано, что сорбенты на основе антител максимально специфичны, биосовместимы и стабильны при многократном применении, такие сорбенты являются оптимальными в случае проведения длительного курса экстракорпоральной терапии больным с высоким содержанием ЛНП и резистентными к лекарственной терапии.

6. Показано, что концентрация Лп(а) в крови прямо связана с наличием и степенью выраженности атеросклероза в коронарных, сонных артериях, а также с частотой окклюзии аутовенозных шунтов после операции реваскуляризации миокарда. Лп(а) может рассматриваться как независимый фактор риска и биохимический маркер атеросклероза.

7. Синтезирован сорбент с поликлональными антителами к Лп(а), на основе которого созданы колонки «Лп(а) Липопак»®. Длительное применение (более 12 лет) этого сорбента для лечения больных ИБС с повышенным уровнем Лп(а) и нормальным уровнем других липопротеидов продемонстрировало эффективность процедур специфичного Лп(а) афереза. Получены доказательства участия Лп(а) в атерогенезе.

8. Синтезирован сорбент с иммобилизованными ЛНП человека. Доказана возможность использования в экстракорпоральной терапии сорбентов на основе иммобилизованных антигенов. Получены данные о наличии в крови некоторых больных ИБС фракции иммуноглобулинов класса в, имеющих сродство к ЛНП что может свидетельствовать о вкладе аутоиммунных процессов в патогенез атеросклероза.

9. Создан и характеризован сорбент с ПкАт к человека, способный высокоэффективно связывать различные аутоантитела. Получены предварительные результаты возможности использования коротких курсов афереза для лечения тяжелых форм ДКМП. Созданы аффинные колонки для терапевтического афереза Адсопак»®.

10. Разработана универсальная технология производства колонок с аффинными сорбентами для терапевтического афереза, соответствующая международным требованиям к качеству производства продуктов медицинского назначения (GMP). Система качества разработки и производства таких колонок сертифицирована на соответствие стандартам ISO 9001. Трем продуктам, выпускаемым по данной технологии в России - колонкам «ЛНП Липопак»®, «Лп(а) Липопак»® и «Ig Адсопак»® присвоен знак соответствия Европейским стандартам качества — «СЕ mark».

БЛАГОДАРНОСТИ.

Настоящая работа не могла быть проделана и завершена без активного участия многих экспериментаторов и клиницистов. Поэтому в заключении я хотел бы выразить слова глубокой благодарности: академикам В.Н.Смирнову и Е.И.Чазову за инициацию настоящей работы, интерес к ней, внимание и поддержку; моим сотрудникам и коллегам: Адамовой И.Ю., Афанасьева О.И.,

Афанасьевой М.И., Беневоленской Г.Ф., Ивановой Н.И., [Тертову В.В.|, Орехову А.Н., Янушевской Е.В., Чичинадзе О.М., Горбатюк Е.В., Разовой O.A.

Клиническая часть работы была выполнена совместно с замечательными врачами: [Арабидзе Г.Г|., Акчурину P.C., Кухарчуку В.В., Коновалову Г.А., Ежову М.В., Ильиной Л.Н., Сусекову A.B., Лякишеву A.A., Чебышеву А.Н., Звездкину П.В.

Освоение и налаживание технологии производства колонок с сорбентами было бы невозможно без активного участия Кипор С.Г., Кошелевой H.A., Люлиной Н.В., Сусековой И.В., Тимонина И.М., Гитинова М.М., Вихровой Е.Б.

Я признателен коллегам из-за рубежа с кем удалось организовать и провести совместные работы: Stoffel W., Oette К., Borberg H. из Кельнского университета; Yamamoto A., Yamamura Т. из национального центра сердечнососудистых заболеваний (Осака, Япония); Shmitz G., Ulrich H. из Университета Регенсбурга; Fruchart J.-C. и Bard J.-M. из Университета г. Нанси (Франция); Rubin A., Levine D., Gordon В., Saal S. Рогозинский институт (Нью-Йорк, США); Thompson G. Хаммерсмин госпиталь (Лондон, Англия).

Регистрация русских колонок в Европе была бы невозможна без помощи

Dr. H.P.Franck,

V. ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Таким образом, в результате проделанной работы удалось получить новые знания и результаты, которые имеют практическое значение.

Научная новизна. Создано новое направление в отечественной биохимии и биотехнологии - «Аффинные сорбенты для медицины», которое в настоящее время успешно развивается. Впервые в стране разработаны и внедрены в клиническую практику аффинные сорбенты для лечения больных с нарушениями липидного обмена и ДКМП, резистентных к лекарственной терапии. Все сорбенты, представленные в работе, созданы впервые в России, а сорбенты для ЛНП афереза с МкАт, Лп(а) афереза и ЛНП сорбент получены впервые в мире и не имеют аналогов. Разработаны подходы к созданию высокоспецифичных аффинных сорбентов для процедур терапевтического афереза. Определены основные принципы, позволяющие синтезировать сорбенты с заданными свойствами для лечения различных патологий. Сорбенты для ЛНП, Лп(а) и Ig афереза успешно апробированы в клинике и разрешены к клиническому применению в России и за рубежом.

На примере больных СГХС На типа; гиперлипидемиями, устойчивыми к лекарствам; ИБС и повышенным уровнем Лп(а); ИБС и аутоантителами к ЛНП; ДКМП с высоким титром аутоантител к (31 -адренорецептору показана возможность эффективного удаления как патогенных антигенов [ЛНП и Лп(а)], так и антител (анти-ЛНП и анти-IgG) с помощью высокоспецифичных аффинных сорбентов.

Использование аффинных сорбентов открыло новые возможности исследования in vivo вопросов участия различных компонентов крови человека (антигены и/или антитела) в патогенезе различных заболеваний. Проведение процедур Лп(а) афереза позволило продемонстрировать атерогенность Лп(а) и открыло новые перспективы изучения различных аспектов метаболизма частиц Лп(а) in vivo, что было невозможно ранее.

Получены новые данные о клинической эффективности изолированного высокоспецифичного удаления Лп(а) у больных ИБС с повышенным уровнем Лп(а) и нормальным ХС-ЛНП и ОХС. Внедрение Лп(а) афереза позволило получить первые прямые доказательства участия частиц Лп(а) в формировании и развитии атеросклеротических поражений коронарных артерий.

Испытания колонок ЛНП сорбента позволили впервые получить экспериментальные данные о наличии в крови некоторых больных ИБС фракции иммуноглобулинов класса G, имеющих сродство к ЛНП, что может свидетельствовать о вкладе аутоиммунных процессов в патогенез атеросклероза.

Практическая значимость работы. Все сорбенты, описанные в работе, успешно прошли клинические испытания. Колонки на основе сорбентов с ПкАт и МкАт к ЛНП зарегистрированы МЗ СССР и разрешены к широкому применению в медицинской практике. Создана и внедрена в практику современная уникальная технология производства колонок с аффинными сорбентами, соответствующая правилам GMP (Good Manufacturing Practice). Впервые на территории бывшего СССР создан продукт, разработка и производство которого соответствуют международным требованиям, предъявляемым к Системе качества (получен сертификат ISO 9001). Колонкам «ЛНП Липопак»®, «Лп(а) Липопак»® и «Ig Адсопак»® присвоен «СЕ mark», что открывает возможность их использования без ограничений в странах Европейского сообщества. Созданные в результате настоящей работы колонки были апробированы и используются для лечения тяжелых, рефрактерных к другим способам терапии больных с нарушениями липидного обмена в клиниках России, Германии, США, Японии, Англии, Италии, Болгарии, Чехии, Турции, ОАЕ и Китая под зарегистрированными торговыми марками: «LDL Lipopak»®, «Lp(a) Lipopak»® и «Ig Adsopak»®.npn длительном использовании колонок с сорбентами для ЛНП афереза удалось продемонстрировать возможность не только стабилизации, но и обратного развития (регрессии) коронарного атеросклероза у больных СГХС. Доказано улучшение состояния больных тяжелыми формами атеросклероза при длительном курсе афереза липидов.

Показано, что Лп(а) может быть использован как биохимический маркер возникновения атеросклероза. Данные о концентрации Лп(а) в крови пациента могут в ряде случаев облегчить диагностику нарушений липидного обмена.

Использование колонок Адсопак»® в процедурах афереза для лечения больных с тяжелыми формами ДКМП открыло новые перспективы лечения.

На основе антител, полученных в ходе выполнения работы, разработан целый ряд иммунохимических методов количественного определения концентрации различных компонентов крови, таких как: аполипопротеинВюо -турбодиметрия; Лп(а) - радиальная иммунодиффузия и иммуноферментный анализ (ИФА); антитела человека против иммуноглобулинов барана и/или мыши - ИФА; суммарной фракции ^О-турбодиметрия. Все перечисленные методы успешно используются для определения концентрации указанных веществ в образцах крови человека.

Список литературы диссертационного исследования доктор биологических наук Покровский, Сергей Николаевич, 2004 год

1. Агапов A.A., Власова Э.Е., Акчурин P.C., Ширяев A.A., Савченко А.П., Покровский С.Н. Результаты коронарного шунтирования на фоне дислипопротеидемии.// Ангиология и сосудистая хирургия.-1996.-№ 1.-С. 88-97.

2. Адамова И.Ю., Афанасьева О.И., Беневоленская Г.Ф. и др. Получение поликлональных антител, специфичных к липопротеиду Лп(а) плазмы крови человека// Иммунология.-1990, N.4.-C.71-73.

3. Амосова E.H. Кардиомиопатии. Киев: Книга Плос. 1999.

4. Афанасьева О.И., Адамова И.Ю., Беневоленская Г.Ф., Покровский С.Н. Сравнение трех методов выделения липопротеида (а) из плазмы крови человека.// Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. -1992. N 3. - С.268-270.

5. Болдырев А.Г., Соколов A.A. и др. Разработка аффинных сорбентов для экстракорпоральной гемокоррекции.// Фундаментальные и прикладные проблемы биотехнологии и медицины. Спб.: Б.и., 2000,- стр. 78-79.

6. Варакин Ю.Я., Ощепкова Е.В., Скворцов A.B., Адамова И.Ю., Джибаладзе Д.Н., Арабидзе Г.Г., Покровский С.Н. Атеросклероз магистральных артерий головы и содержание липопротеида(а) в плазме крови.// Терапевтический архив. 1993.-Т.65.-№3.-С. 54-56.

7. Государственная фармакопея СССР. Общие методы анализа. Лекарственное растительное сырье.- 11-е изд.— М.: Медицина, 1987, 1989,- Вып. 1,2.

8. Ежов М.В., О. И. Афанасьева, О. И. Кононова, И. Ю. Миронова, А. А. Лякишев, С. Н. Покровский. Влияние аскорбиновой кислоты и лизина на повышенный уровень липопротеида(а) сыворотки крови больных ИБС. Кардиология № 9.- 1996.- С. 31-33.

9. Ежов М.В., Афанасьева О.И., Беневоленская Г.Ф., А.П. Савченко, А. А. Лякншев, Покровский С. Н. Липопротеид(а) как биохимический маркер коронарного атеросклероза. // Терапевтический архив-1997-№ 9.-С. 3134.

10. Ежов М.В., Афанасьева О.И., Лякишев A.A., Покровский С.Н. Связь фенотипа апобелка (а) с наличием ишемической болезни сердца у мужчин в молодом возрасте.// Кардиология.-1999.-N« 4.-С.12-15.

11. Ильина Л.Н., Афанасьева О.И., Покровский С.Н., Акчурин P.C. Изменение липидного профиля в течении двух первых месяцев после операции коронарного шунтирования.// Ангиология и сосудистая хирургия.-1999.-Т. 5.-№ 3:С.5-10.

12. Коновалов Г.А., Синицин В.В., Ведерников А.Ю. Плазмосорбция липопротеидов низкой плотности на колонках с гепарин-сефарозой. // Терапевтический apxHB.-1988.-T.60.-N 12.-С.16-21.

13. Коновалов Г.А., Филоненко И.В., Акопян B.C., Карнеева О.В., Дорощенко Н.Э., Звездкин П.В., Хаютина Т.Л., Петухова Е.В.,

14. Курганская Т.С., Покровский С.Н. Реоферез в клинической практике.// Кремлевская Медицина.-2004.-Т.3.-С.48-53.

15. Лопухин Ю.М., Молоденков М.Н. Гемосорбция. Издание второе. -1985.-"Медицина".

16. Лопухин Ю.М., Андрианова И.П., Рабовский A.B., Наливайко Е.С., Кулаев Д.В., Петрунин Д.Д., Зуевский В.В., Маркин С.С. Аффинный сорбент для связывания атерогенных липопротеидов.// Кардиология .-1986.-T.XXVI.-C. 54-60.

17. Олофинская И.Е., Волкова Е.И., Сусеков A.B., Лякишев A.A., Покровский С.Н. Липопротеид (а) у больных коронарным атеросклерозом.// Кардиология.-1991.-№10.-С. 36-38.

18. Остерман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых.// Москва, Наука.- 1985.- С. 376-379.

19. Покровский С.Н., Чичинадзе О.М., Адамова И.Ю., Хашимов Х.А., Бабий A.B. Специфический иммуносорбент для афереза атерогенных классов липопротеидов. // Международная конференция по профилактической кардиологии. Тезисы докл.-М., 1985.- С. 133.

20. Рулева Н.Ю., Комолов И.С. и др. Количественная оценка аутоантител к ß 1-адренорецепторам в сыворотке крови человека на основе синтетического фрагмента рецептораю.// Биотехнология. 2000. — №3. -стр. 83-92.

21. Российские рекомендации. Диагностика и коррекция нарушений липидного обмена с целью профилактики и лечения атеросклероза.// Москва, ВНОК.- 2004.

22. Тертов В.В., Орехов А.Н., Репин B.C., Смирнов В.Н. Эффект dibuturyl-сАМР на холестерин, содержащийся в клетах атеросклеротической аорты человека.// Бюллютень «Экспериментально-биологическая медицина». 1983. - стр. 92-93.

23. Томпсон Г.Р. Руководство по гиперлипидемии.// MERCK&CO, Inc.,-1989.

24. Adamova I., Pokrovsky S. Comparison of LDL removal selectivity by two types of affinity chromatography: with immunosorbents and with heparin sepharose. Proceedings of the 6th International Dresden lipid Symposium.-1988.-P.595-598.

25. Agishi Т., Kaneko J., Hasuo Y., et al. Double filtration plasmapheresis with no or minimal amount of blood derivative for substitution. // In: Sieberth HG, ed. Stuttgart:Schattauer, -1980.-P.53-57.

26. Agishi Т., Wood W., Gordon B. LDL apheresis using the Liposorber® LA-15 system in coronary and peripheral vascular disease associated with severe hypercholesterolemia.// Curr Ther Res. 1994. - Vol. 55. - P. 879-904.

27. Anitshkow N., Chalatov S. Ueber experimentelle cholesterin-steatose und ihre bedeutung fur die entstehung einiger pathologischer prozesse // Centrbl Allg Pathol Pathol Anat. 1913.-Vol.24.-P.l-9.

28. Apstein C.S., Zilversmith D.B., Lees R.S., George P.K. Effect of intensive plasmapheresis on the plasma cholesterol concentration with familial hypercholesterolemia.// Atherosclerosis. 1978. - Vol. 31. -P. 105-115.

29. Armstrong V.W., Windisch M., Wieland H. et al. Selective continuous extracorporal elimination of low-density lipoproteins with heparin at acidic pH.// Trans Am Soc Artif Intern Organs. 1983. - Vol. 29. -P. 323-328.

30. Armstrong V.W., Schleef J., Thiery J. et al. Effect of HELP LDL apheresis on serum concentrations of human lipoprotein (a): kinetic analysis of the post-treatment return to baseline levels.// Eur J Clin Invest. 1989. - Vol. 19. -P. 235-240.

31. Armstrong V.W., Schuff-Werner P., Eisenhauer T., Helmhold M., Stix M., Seidel D. Heparin extracorporeal LDL precipitation (HELP): an effective apheresis procedure for lowering Lp(a) levels.// Chem Phys Lipids.-1994.-Vol.67-68.-P.315-321.

32. Assmann G., Schulte H. Relation of high-density lipoprotein cholesterol and triglycerides to incidence of atherosclerotic coronary artery disease (The PROCAM experience). //Am. J. Cardiovasc.- 1992.-Vol. 70.- P. 733-737.

33. Assogba U., Lepage S., Bruckert E., et al. Blood antioxidants (vitamin Y and beta-carotene) in long-term low density lipoprotein apheresis.// Clin.Chim. Acta.-1995 .-Vol.23 5 .-P147-157.

34. Bambauer R., Keller H.E., Latza R. et al. Three years experience with the liposorber system in hypercholesterolemia. In: Agishi T, Kawamura A. Mishima A, eds. // Therapeutic Plasmapheresis, XII edn. Tokyo: VSP. -1993.-P.415-420.

35. Bambauer R., Keller H.E., Latza R., Schiel R. LDL apheresis in hypercholesterolemia with the liposorber system and immunoadsorption.// Artif Organs.- 1994.-Vol. 18.-P. 121.

36. Bambauer R., Schiel R., Keller H.E., Latza R. LDL apheresis in two patients with extremely elevated lipoprotein (a) levels.// Int J Artif Organs. 1995. — Vol. 18.-P. 286-290.

37. Bambauer R., Schiel R., Keller H.E., Klinkmann J., Latza R. Low-density lipoprotein apheresis in the treatment of two patients with coronary heart disease and extremely elevated lipoprotein (a) levels.// Artif Organs. 1996. -Vol. 20.-P. 340-343.

38. Bambauer R., Schiel R., Latza R. Low density lipoprotein apheresis in treatment of hyperlipidemia: experience with four different technologies.// Ther Apher. 2000. - Vol. 4. - P. 213-217.

39. Bambauer R. Low-density lipoprotein apheresis: clinical results with different methods.// Artif Organs. 2002. - Vol. 26. - P. 133-139.

40. Bambauer R., Schiel R., Latza R. Low-density Lipoprotein Apheresis: An Overview.// Ther. Apher. & Dial. 2003.-Vol. 7.-N. 4.- P.382-390.

41. Banyai S., Streicher J., Strobl W, Gabriel H, Gottsauner-Wolf M, Rohac M, Weidinger F, Horl W.H., Derfler K. Therapeutic efficiency of lipoprotein(a) reduction by low-density lipoprotein immunoapheresis.// Metabolism.-1998.-Vol.47.-P. 1058-1064

42. Bensinger W.I., Baker D.A., Buckner C.D., Clift R.A., Thomas E.D. Immunoabsorption for removal of A and B blood group antibody. // N.Eng.J.Med.-1981.- Vol.304.-P.160-162.

43. Bekaert E.D., Ayrauet-Jarrier M., Petit E., Betourne C., Robin H., Polonovski J. Competitive enzyme inhibition immunoassay of apolipoprotein AI: use of monoclonal antibodies. // Clin.Chem.-1988.-Vol.34. -N.6.-P. 1030-1035.

44. Berg K.// A new serum type system in man. Acta Pathol. Microbiolog. Scand. 1963. - Vol. 59.-P. 369-382.

45. Berg K., Dahlen G., Christophersen B. et al. Lp(a) lipoprotein level predicts survival and major coronary events in the Scandinavian Simvastatin Survival Study. Clin. Genet.-1997.-Vol. 52.-P. 254-261.

46. Berglund L. Diet and drug Ttherapy for Lp(a).// Curr. Opin. Lipidol. -1995.- Vol. 6. OP. 48-56.

47. Boldyrev A.G., Gurevich K.Ya., et. al.// Novel adsorbent to selectively remove cholesterol and atherogenous lipoproteins from plasma. XXVII Congress European Society fog Artificial Organs Intern. J. Artif. Org. — 2000.- Vol. 23, № 58. P.536

48. Borberg H., Stoffel W., Oette K. The development of specific plasma immunoabsorption. // Plasma Ther. Transfus. Technol.- 1983.- Vol.4.- P.459.

49. Borberg H., Gaczkowski A., Hombach V., Oette K., Stoffel W. Treatment of familial hypercholesterolemia by means of specific immunoadsorption. // J. Clin. Apheresis.- 1988.-Vol. 4.- P.59-65.

50. Borberg H., Kadar J., Oette K. The Current Status of Low-Density Lipoprotein Apheresis.// Curr.Stud. Hematol.Blood.Trans.// Basel., Karger.-1990.-Vol.57.-P.239-248.

51. Bosch t., Schmidt B. Kleophas W. , et al. LDL hemoperiusion a new procedure for LDL apheresis : first clinical application of an LDL adsorber compatible with human whole blood. // Artif. Org.-1993.- Vol.l7.-P.977-982.

52. Bosch T., Schmidt B., Blumenstein M., Gurland H.J. Lipid apheresis byhemoperfusion: in vitro efficacy and ex vivo biocompatibility of a new low-density lipoprotein adsorber compatible with human whole blood.// Artif. Org.- 1993.-Vol. 17.- P. 1060-1065.

53. Bosch T., Lennertz A., Samtleben W. High-efficiency DALI apheresis using 1,250 ml adsorbers in a hypercholesterolemic obese patient: a case report. // Ther Apher.- 2001.-Vol.5.-P.358-363

54. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.// Anal Biochem.- 1976.- Vol.72.- P.248-254.

55. Burgstaler E.A., Pineda A.A., Ellefson R.D. Removal of plasma lipoproteins from circulation blood with a heparin-agarose column.// Mayo. Clin.Proc.-1980.-Vol.55.-P. 180-184.

56. Burstein M., Scholnick H.R., Morfin R. Rapid method for the isolation of lipoproteins from human serum by precipitation with polyanions.// J// Lipid Res// -1970.-Vol. 11 .-P.583-595.

57. Burstein M., Scholnick H.R. On the precipitation of serum lipoproteins by heparin.// Nouv.Revue Fr. Hemat.-1974.-Vol.14.-P.131-136.

58. Byrne R.E., Scanu A.M. Apolipoprotein B-100 of plasma low density lipoprotein undergoes proteolysis by contact activation factors when plasma is treated with dextran sulfate -500-MgCL2. J of Lipid Research.-1989.-Vol.30.-P.109-120.

59. Cashin-Hemphill L., Noone M., Abbot J., Waksmonski C.A., Lees R. Low-density lipoprotein apheresis therapy during pregnancy.// Am.J.Cardiol.2000.-Vol.86.-P. 1160.

60. Chen L. X., Liao Y. H., Tu Y.S., et al. Effects of auto-antibodies against ADP// ATP carrier in sera of patients with dilated cardiomyopathy on cytosolic free calcium in cultured rat heart cells J. Clin. Cardiol.- 1995.-Vol. 11.-P.335.

61. Cleeman J. Executive summary of the Third Report of the National Cholesterol Education Program (NCEP) Expert Panel on Detection Evaluation. And Treatment of High Blood Cholesterol in Adults. // JAMA.2001.- Vol. 285.- P. 2486 2497.

62. Council directive 93// 42// EEC of 14 June 1993 concerning medical devices.// Official Journal of the European Communities. 1993,- N. L 169, 12.7.93.- P.l

63. Craig W.Y., Neveux L.M., Palomaki G.E., Cleveland M.M., Haddow J.E. Lipoprotein(a) as a risk factor for ischemic heart disease: metaanalysis of prospective studies.// Clin Chem. 1998. - Vol. 44. - P. 2301-2306.

64. Cremer P., Nagel D., Mann H. et al. Ranking of Lp(a) as a cardiovascular risk factor: results from a 10-year prospective study. In Atherosclerosis X. Elsevier Science.- 1995.- 903-907.

65. Dahlen G. The pre-beta lipoprotein phenomenon in relation to serum cholesterol and triglyceride levels, the Lp(a) lipoprotein and coronary heart disease.// Acta Med Scand Suppl. 1974. - Vol. 570. - P. 1-45.

66. Danesh J., Collins R., Peto R. Lipoprotein(a) and coronary heart disease: meta-analysis of prospective studies.// Circulation.- 2000.-Vol. 102.-P. 10821085.

67. Dangas G., Mehran R., Harpel P.C. et al. Lipoprotein(a) and inflammation in human coronary atheroma: association with the severity of clinical presentation.// J Am Coll Cardiol.- 1998.-Vol. 32.-P. 2035-2042.

68. Dashti N., Alaupovic P., Knight-Gibson C., Koren E. Identification and partial characterization of discrete apolipoprotein H containing lipoprotein particles produced by human hepatoma cell line HepG2+.// Biochemistry.-1987,-Vol.26.-P.3837-4846.

69. Dec G.W., Fuster V. Idiopathic dilated cardiomyopathy // New Engl. J. Med. 1994; 331: 1564-1575.

70. Desmarais R.L., Sarembock I.J., Ayers C.R. et al. Elevated serum Lp(a) is a risk factor for clinical recurrence after coronary balloon angioplasty. Circulation.-1995 .-Vol.91 .-P. 1403 -1409.

71. Dorffel W.V., Felix S.B., Wallukat G., Brehme S., Bestvater K., Hofmann T., Kleber F.X., Baumann G., Reinke P. Short-term hemodynamic effects ofimmunoadsorption in dilated cardiomyopathy // Circulation.- 1997.- Vol.95.-P. 1994-1997.

72. Drager L.J., Julius U., Kraenzle K., et al. DALI-the first human whole blood low-density lipoprotein and lipoprotein (a) apheresis system in clinical use: procedure and clinical results.// Eur.J.Clin.Invest.-1998.-Vol.28.-P.944-1002.

73. Endo A., Kuroda M., Tsujita Y. ML-236A, ML-236B, and ML- 236C, new inhibitors of cholesterogenesis produced by Pénicillium citrinium. // J. Antibiot. (Tokyo).- 1976.- Vol. 29.- P. 1346-1348.

74. Farr G.A., Nakane P.K. Immunohistochemistry with enzyme labeled antibodies: a breif review.// J. Immunol. Methods.- 1981.- Vol. 47,- P. 129144.

75. Felix S.B., Staudt A., Landsberger M., Gross Y., Stangi V., Spielhagen T. et al. Removal of cardiodepressant antibodies in dilated cardiomyopathy by immunoadsorption.// J.Am.Coll.Cardiol.-2002.-Vol.39.-P.646-652.

76. Fishbein M.C., Siegel R.J. How big are coronary atherosclerotic plaques that rupture?// Circulation .-1996.-Vol.94.-P. 2662-2666.

77. Fless GM, Rolih CA, Scanu AM. Heterogeneity of human plasma lipoprotein (a). Isolation and characterization of the lipoprotein subspecies and their apoproteins.// J Biol Chem. 1984// - Vol. 25. - P. 11470-11478.

78. Frank S.L., Klisak I., Sparkes R.S. et al. The apolipoprotein(a) gene resides onhuman chromosome 6q2.6-2.7 in close proximity to the homologous gene for plasminogen.// Hum. Genet.- 1988.-Vol.-79.-P.352-356.

79. Friguet B.L., Chaffotte A.F., Djavadi-Ohaniance L., Goldberg H.E. Measurement of the true affinity constant in solution of antigen-antibody complexes by enzyme-linked immunosorbent assay.// O. of Immunol.Methods.-1985.-Vol.77.-P.305-319.

80. Fu M.L. Anti M2 muscarinic receptor autoantibodies and idiopathic dilated cardiomyopathy.// Int. Cardiol. -1996.- Vol.54.-P.127-135.

81. Gajdusek D.C. Unconventional viruses and origin and disappearance of kuru.// Science. 1977. - P. 943-960.

82. Gavish D, Breslow JL. Lipoprotein(a) reduction by N-acetylcysteine.// Lancet.-1991 .-Vol.337.-P.203-204.

83. Geiss HC, Parhofer KG, Donner MG, Schwandt P. Low density lipoprotein apheresis by membrane differential filtration (cascade filtration).// Ther Apher.-1999.-Vol.3.-P. 199-202

84. Goldman J.F., Keeling P.J., Warraisch R.S., BAig M.K., Redwood S.R., Dalla Libera L., Sanderson J.E., Caforio A.L., McKenna W.J. Autoimmunity to alpha myosin in a subset of patients with dilated cardiomyopathy.// Br. Heart J.-1995.-Vol.74.-P.598-603.

85. Goldman J.F., McKenna W.J., Immunopathogenesis of dilated cardiomyopathy.// Cur. Sci.-1995.- Vol.l0.-P.306-311.

86. Goldstein J.L., Brown M.S. The LDL receptor defect in familial hypercholesterolemia.// Med. Clins. N.Am.-1982.-V.66.-P.335.

87. Goldstein J.L., Brown MS. Familial hypercholesterolemia. In: Stanbury JB., Wyngaarden JB., Fredrickson DS., Goldstein JL., and Brown MS (eds.).//

88. The Metabolic Basis of Inherited Diseases, 5th edn., McGraw-Hill Book Co., Ne York. 1983.- P.622-730.

89. Goldstein B.L., Hofshire P.J., Sears T.D., Rayburn W.F. Longterm plasmapheresis in the homozygous hyperlipemic patient.// Am Heart J.1991.-Vol. 122.-P. 1465-1466.

90. Gordon B.R., Sloan B.J., Parker T.S., Saal S.D., Levine D.M., Rubin A.L. Humoral immune response following extracorporeal immunoadsorption therapy of patients with hypercholesterolemia.// Transfusion.-I990.-Vol 30.-P.327.

91. Gordon B.R., Kelsey S.F., Bilheimer D.W.et al. Treatment of refractory familial hypercholesterolemia by low-density lipoprotein apheresis using an automated dextran sulfate cellulose adsorption system.// Am J Cardiol.1992.- Vol.70.-P.1010-1016.

92. Gordon B.R., Saal S.D. Immunoadsorption and dextran sulfate cellulose LDL-apheresis for severe hypercholesterolemia:the Rogosin institute experience 1982-1992.// Transfus.Sci.-1993.-Vol.l4.-P.261-268.

93. Gordon B.R.,Kelsey S.F., Dau P.C., Gotto A.M. Jr., Graham K., Illingworth R., et al., Long-term effect of low-density lipoprotein apheresis using an automated dextran sulfate cellulose adsorption system.// Am. J. Cardiol.-1998.-Vol.81.- P.407-411.

94. Grabar P., Willienus C.A. Methode permettant l'etude conjuguce des propriétés electrophoretiques d'un melange de proteines. Application on serum sanguin.// Biochim. et Biophys. Acta.- 1953.- Vol. 10.- P. 193-194.

95. Graber H.L., Unverferth D.V., Baker P.B., Ryan J.M., Baba N., Wooley C.F. Evolution of a hereditary cardiac conduction and muscle disorder: A study of involving a family with six generations affected.// Circulation.-1986.-Vol.74.-P.21-35.

96. Graisely B., Cloarec M., Salmon S., Polonovski J., Polonovski C.L., Delacotte J.M., Gardent J., Cavalier J., Vergoz D., Salmon Ch. Extracorporeal plasmatherapy for homozygous familial hypercholesterolemia J I Lancet.-1980.-Vol.2.- P.1147

97. Gurvich A.E., Lechtzind E.V.// High capacity immunoadsorbents based on preparations of reprecipitated cellulose.// Mol. Immunol. 1982.- Vol. 19. -P. 637- 640.

98. Hearn J.A., Donohue B.C. et al. Usefulness of serum Lp(a) as a predictor of restenosis after percutaneous transluminAL CORONARY ANGIOPLASTY.// Am. J. Cardiol. -1992. Vol. 69. - P. 736-739.

99. Hervio L., Chapman M.J., Thillet J. et al. Does apolipoprotein(a) heterogeneity influence lipoprotein(a) effects on fibrinolysis? Blood.- 1993.-Vol.82.-P. 392-397.

100. Higashikata T., Mabuchi H. Long-term Effect of Low-density Lipoprotein Apheresis in Patients with Heterozygous Familial Hypercholesterolemia.// Ther.Apher.&Dial.-2003.-Vol.7.-N.4.-P.402-407.

101. Hoff H.F., et.al. Serum Lp(a) as a predictor of vien grafts stenosis after coronary bypass sergury.// Circulation. 1988. - Vol.77. - P. 1238-1244.

102. Hombach V., Borberg H., et. al. Extracorporeal nlmmunospecific LDL elimination in severe vhypercholesterolemia effects on plasma lipoproteins and atherosclerosis.// Jahrgang. 1986. - Vol. 45. -P. 1709-1715.

103. Horiuchi M, Tasaki H, Takatsu H et al. Effect of LDL apheresis on patients with coronary artery disease and severe hypercholesterolemia —FUKUOKA LDL apheresis STUDY. Jpn Circulation J 2000;64:642.

104. Hunninghake DB, Stein EA, Mellies MJ. Effects of one year of treatment with pravastatin, an HMG-CoA reductase inhibitor, on lipoprotein (a). J Clin Pharmacol.-1993.-Vol.33.-P.574-580.

105. Irwin D., O'Looney P.A., Quinet E., Vahonny G.V. Application of SDS gradient polyacrylamide slab gel electrophoresis to analysis of apolipoprotein mass and radioactivity of rat lipoproteins.// Atherosclerosis.-1984.-Vol.53.-P. 162-172.

106. Jahns R., Boivin V., Siegmund Ch., Inselmann G., Lohse M., Boege F. Autoantibodies activating human pi-adrenergic receptors are associated with reduced cardiac function in chronic heart failure.//Circulation.-1999.-Vol.99.-P.649-654.

107. Jenner J.L., Jacques P.F., Seman L.J., Schaefer E.J. Ascorbic acid supplementation does not lower plasma lipoprotein(a) concentrations.// Atherosclerosisio-2000.-Vol. 151 .-P.541 -544.

108. Julius U., Siegert G., Gromeier S. Intraindividual comparison of the impact of two selective apheresis methods (DALI and HELP) on the coagulation system.// Int J Art Org. 2000. - Vol. 3. - P. 199- 206.

109. Kannel W.B., Casteli W.P., Gtordon T., McNamanra P.M. Serum cholesterol, lipoproteins, and the risk of coronary heart disease. The Framingham Study. // Ann. Intern. Med.,- 1971.- Vol.74,- P. 1-12.

110. Kark J.D. Sandholzer C., et.al. Lp(a) alipoprotein (a) isoforms and acute myocardial infarction in men and wemen a case -control study in THE Jerusalem POPULATION.// Atherosclerosis. 1992. - Vol. 98. - P. 139-151.

111. Keller Ch. LDL-apheresis: results of long-term treatment and vascular outcome// Atherosclerosis.-1991 .-Vol.86.-P. 1 -8.

112. Kitabatake A., Sato H., Hori M., et al. Coronary atherosclerosis reduced in patients with familial hypercholesterolemia after intensive cholesterol lowering with low-density lipoprotein-apheresis: 1 year follow-up study. The

113. Osaka LDL -Apheresis Multicenter Trial Group.// Clin. Invest.-1994.-Vol.16.-P. 416-428.

114. Kitano Y, Thompson GR. The familial hypercholesterolemia regression study: a randomized comparison of therapeutic reduction of both low-density lipoprotein and lipoprotein(a) versus low-density lipoprotein alone. Ther Apher.- 1997,-Vol. 1 .-P. 187-190

115. Kiseleva E.A., O.I.Afanasieva, N.A.Kosheleva, S.N.Pokrovsky. Immunosorbent for IgG apheresis: synthesis and characteristics. // Japanese Journal of Apheresis, 1996. V. 15, Supplement, P. 50.

116. Kiseleva E.A., Afanasieva O.I., Kosheleva N.A., Pokrovsky S.N. Synthesis and Characteristics of Immunosorbent for Immunoglobulins Apheresis.// Japanese Journal of Apheresis.-1997.-№1.-V.16.-P.246-247.

117. Klingel R., Göhlen B., Schwarting A., Himmelsbach F., Straube R. Differential Indication of Lipoprotein Apheresis DuringPregnancy.// Ther. Aph. & Dial. -2003.-Vol. 7.-N.3.- P.359-364.

118. Knisei W., Pfohl M., Muller M. et al. Comparative long-term experience with immunoadsorption and dextran sulfate cellulose adsorption for extracorporeal elimination of low-density lipoproteins.// Clin.Invest.-1994.-Vol.72.-P.660-668.

119. Kobayashi K., Tasaki H., Suzuka H. et al. Improvement of coronary flow velocity reserve evaluated by transthoracic Doppler echocardiography after single LDL apheresis.// Circulation J.- 2002.-Vol.-66.- P.760

120. Kohler G., Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibodies of predetermined specificity// Nature.-1975.-Vol. 256.-P.495-497.

121. Komajda M, Charron P, Tesson F. Genetic aspects of heart failure Eur J Heat Failure 1999; 1(2) 121-126.

122. Konovalov G.A., Chebyshev A.N., Adamova I.Yu., Smolnikov V.S., Pokrovsky S.N. Efficacy and safety of the long-term LDL-apheresis with "LDL-Lipopak" columns.// 9th Congress of the World Apheresis Assosiation, France, Paris 7-10 September, 2002.

123. Konstadoulakis M.M., Kroumbouzou H., Tsiamis E., Trikas A., Toutouzas P. Clinical significance of antibodies against tropomyosin, actin and myosin in patients with dilated cardiomyopathy.// J.Clin.Lab.Immunol.-1993.-Vol.40.-P.61-67.

124. Kostner G.M., Avogaro P., et.al.// Lp(a) and risk for myocardial infarction. Atherosclerosis. 1981. - Vol. 38.- P. 51 -61.

125. Kraft H.G., Deiplinger H., et al. Lp(a) phenotiping by immunoblotting with polyclonal and monoclonal antibodies.// Atherosclerosis. 1988. - Vol. 8. -P. 212-216.

126. Krauss RM, Burke DJ. Identification of multiple subclasses of plasma low density lipoproteins in normal humans.// J Lipid Res.- 1982. Vol. 23. - P. 97-104.

127. Kroon A.A., Demacker P.N., Stalenhoef A.F. N-acetylcysteine and serum concentrations of lipoprotein(a).// J Intern Med.-1991.- Vol.230.-P.519-526.

128. Kroon A.A., Swinkels D.W., van Dongen P.W.J., Stalenhoef A.F.H. Pregnancy in a patient with homozygous familial hypercholesterolemia treated with long-term low-density lipoprotein apheresis. // Metabolism.-1994.-Vol.43.-P.l 164-1170.

129. Kroon A.A., Aengevaeren W.R., van der Werf T., et al., LDL-Apheresis

130. Atherosclerosis Regression Study (LAARS). Effect of aggressive versus conventional lipid lowering treatment on coronary atherosclerosis.// Circulation.- 1996.-Vol.93 .-P. 1826-1835.

131. Kukharchuk V.V., Konivalov G.A., Vedernikov A.Yu., et.al. Long-term application of three types of sorbents for LDL-apheresis.// Plasma Ther. Transfus. Technol.- 1988.- Vol. 9.- P. 45-47.

132. Laemli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of head of bacteriofage T4.// Nature.- 1970.- Vol. 227.-P. 680-224.

133. Lauer B., Padberg K., Schultheiss H.P., Strauer B.E. Autoantibodies against cardiac myosin in patients with myocarditis and dilated cardiomyopathy.// Z.Kardiol. -1995.-Vol.84.-P.301-310.

134. Lepage S., Bonnefont-Rousselot D., Bruckert E., et al. Antioxidant status of hypercholesterolemic patients treated with LDL apheresis.// Cardiovasc.Drugs Ther.-1996.-Vol.l0.-P.567-571.

135. Li H., Zhang Y., Chen X., Shi X., Shi K., Yuan Z., Liu B., Shen B., He B. Synthesis and adsorption aspect of crosslinked PVA-based blood compatible adsorbents for LDL apheresis.// Reactive and functional polymers.-2004.-Vol.58.-P.53-63.

136. Liao Y. H. Functional analysis of autoantibodies against ADP// ATP carrier from dilated cardiomyopathy // Int. J. Cardiol. 1996, 54: 165 -169

137. Lichtenstein, A. H., Ausman, L. M., Jalbert, S. M., Schaefer, E. J. Effects of Different Forms of Dietary Hydrogenated Fats on Serum Lipoprotein Cholesterol Levels.// N Engl J Med.-1999.-Vol.340.-P. 1933-1940

138. Limas C.J., Goldenberg I.F., Limas C. Autoantibodies against beta-adrenoreceptors in human idiopatic dilated cardiomyopathy.// Circ. Res.1989.-Vol .64.-P.97-103.

139. Limas C.J. and Limas C. Immune-mediated modulation of p-adrenoreceptor function in human dilated cardiomyopathy.// Clin. Immunology and immunopathology.-1993.-Vol.68.-N.2.-P.204-207.

140. Lindgren F.T. Análisis of lipids and lipoproteins.// American Oil Chemical Society, Amsterdam.- 1975.- Vol. 1.- P. 204-224.

141. Liu P., Mason J. Advances in the Understanding of Miocarditis. // Circulation.-2001 .-Vol. 104.-P. 1076-1082.

142. Liposorber study Group, Gordon B.R., Kelsey S.F., Dau P.C. et al. Long-term effects of low-density lipoprotein apheresis using an automated dextran sulfate cellulose adsorption system.// Am.J.Cardiol.-1998.-Vol.81.-P.407-411.

143. Lopuchin Yu.M., Zuevzky V.V., et. al. LDL-apheresis on affine haemosorbents.// Art. Org. 1990. - Vol. 18. - P. 571-578.

144. Loscazlo J., Weinfeld M., Fless O.P., et. al. Lp(a) fibrin building, and plazminogen activation.// Atherosclerosis. — 1990. Vol. 10. - P. 240 - 245.

145. Lowry O.H., Rosenbourgh N.Y., Farr A.L., et.al. Protein measurement with the folin phenol reagent.// J.Biol. Chem.-1951.-Vol. 193.-P. 256-275.

146. Lupien P.J., Moorjani S., Awad J. A new approach to the management of familial hypercholesterolaemia: Removal of plasma-cholesterol based on the principle of affinity chromatography.// Lancet.- 1976.-Vol.1.-P. 1261-1265.

147. Lupien P.J., Moorjani S., Lon., Brun D., Gagne C.L. Removal of cholesterol from blood by affinity binding to heparin agarose: evaluation on treatment in homozygous familial hypercholesterolemia.// Pediatr.Res.-1980.-Vol. 14.-P.113

148. Mabuchi H., Michishita I., Takeda M. et al. A new low density lipoprotein apheresis system using two dextran sulfate cellulose columns in an automated column regenerating unit (LDL continuous apheresis). // Atherosclerosis.-1987.- Vol.68.-P. 19-25.

149. Mabuchi H, Koizumi J, Shimizu M et al. Long-term efficacy of low-density lipoprotein apheresis on coronary heart disease in familial hypercholesterolemia. Hokuriku-FH-LDL apheresis Study Group.// Am J Cardiol.- 1998.- Vol. 82. P. 1489-95.

150. Maeda S., Abe. A., et. al. Transient changes in serum Lp(a) as an acute phase protein.// Atherosclerosis.- 1989.-Vol. 78.-P. 148-150.

151. Magnusson Y., Wallukat G., Waagstein F., Hjalmarson A., Hoebeke J. Autoimmunity in idiopathic dilated cardiomyopathy. Characterization of antibodies against the (31 -adrenoceptor with positive chronotropic effect// Circulation. 1994, 89: 2760-2767.

152. Maher V.M.G., Brown B.G., et. al. The adverse effect of Lp(a) on coronary atherosclerosis and clinical events is eliminated by substantial lowering LDL cholesterol.// JAMA.- 1995. Vol. 274. - P. 1771 - 1774.

153. Makino H., Harada-Shiba M. Long-term effect of low-density lipoprotein apheresis in patients with homozygous familial hypercholesterolemia.// Ther.Apher. and Dial.-2003.-Vol.7.-N.4.-P.397-401.

154. Mancini G., Nash D.R., Heremans J.F. Futher studies on single radial immunodiffusion.// Immunochemistry.- 1970.- N. 7.-P. 261-264.

155. Mao S., Patton J.G., Badimon J.J., Kottke B. A., Alley M.C., Cardin A.O. Monoclonal antibodies to human low density lipoproteins.// Clin.Chem.-1983 .-Vol.29.-P. 1890-1897.

156. Matsuzaki M., Hiramori K., Imaizumi T. et.al. Intravascular ultrasound evaluation of coronary plaque regression by low density lipoprotein-apheresis in familial hypercholesterolemia. // J. Am. Coll. Cardiol. 2002. - Vol. 40. -P. 220-227.

157. McLean J.W., Tomlinson J.E., et.al. cDNA sequence of human apolipoprotein (a) in homologous to plazminogen.// Nature. 1987. - Vol. 330.-P. 132-137.

158. Mellwig K.P., Bailer D., Gleichmann U., et al. Improvemant of coronaryvasodilatati on capacity through single LDL apheresi.// Atherosclerosis.1998.-Vol.139.-P. 173-178.

159. Mills G.E., Lane P.A. A guidebook to lipoprotein technique. Amsterdam: Elsevier.// -1984. -P.7

160. Mora C., Teruel J.L., Navarro J.F. Low-density lipoprotein apheresis in homozygous familial hypercholesterolemia.// Am J Cardiol.— 2001. — Vol. 88.-P. 202-203.

161. Morozkin A.D., Medvedeva N.V., Valentinova N.V.// Analysis of the distribution of low density lipoprotein flotation coefficients using an analytical centrifuge equipped with adsorption optics.// Biofizika. 1989. -Vol. 34.-P. 958-964.

162. Axel du Moulin. LDL immunoapheresis technique.// Proc 2nd Int. Symp., Munich.- 1990.-P. 170-174.

163. Muller J., Wallukat G., Wenig Y-G., et al., Weaning from mechanical cardiac support in patients with idiopathic dilated cardiomyopathy.// Circulation.-1997.-Vol.96.-P.542-549.

164. Muller J., Wallukat G., Dandel M., Bieda H., Brandes K., Spiegelsberger S., Nissen E., Kunze R., Hetzer R. Immunoglobulin adsorption in patients with idiopathic dilated cardiomyopathy// Circulation. -2000.- Vol. 101.- P. 385391

165. Nagayama M., Shinohara Y., Nagayama T. Lipoprotein(a) and ischemic cerebrovascular disease in young adults. Stroke.-1994.-Vol.25.-P. 74-78.

166. Nilsson I.M., Sundqvist S.B., Freiburghaus C. Extracorporeal protein A-sepharose and specific affinity chromatography for removal of antibodies.// Prog Clin Biol Res. 1984. - Vol. 150. - P. 225-241.

167. Nishikawa O., Mune M., Miyano M., Nishide T., Nishide I., et. al. Effect of simvastatin on the lipid profile of hemodialysis patients.// Kidney Int Suppl.1999.-Vol. 71 .-P.S219-221

168. Oette K., Borberg H. Variables involved in regression of atherosclerosis in familial hypercholesterinemic patients under long-term LDL-apheresis.// Plasma Ther. Transfus. Technol. -1988. Vol. 9. - P. 17-23.

169. Oette K., Borberg H., Godehardt E., et.al. Extracorporeal nlmmunospecific LDL elimination in severe vhypercholesterolemia effects on plasma lipoproteins and atherosclerosis.// Proc 2nd Int. Symp., Munich. 1990. - P. 170-174.

170. Olbricht C.J. Extracorporeal removal of lipids by dextran sulfate cellulose adsorption.// ArtifOrgans.-l996.-Vol.20.-P.332-5

171. Otto C., Kern P., Bambauer R., Kallert S., Schwandt P., Paehofer K.G. Efficacy and safety of a new whole-blood lipoprotein apheresis system (Liposorber D) in severe hypercholesterolemia.// Artif. Organs.- 2003.-Vol.27.-P.l 116-1122.

172. Orekhov A.N., Khashimov Kh.A., Mukhin D.N., Tertov V.V., Adamova I.Yu., Pokrovsky S.N., Smirnov V.N. Low-density lipoprotein apheresis and regression of atherosclerotic plaque in vitro.// Artificial Organs.-1986.-Vol. 10.-N.6.-P .466-469.

173. Ouchterlony O. Diffusion in gel methods for immunological analysis.// Prog. Allergy.- 1958.- Vol. 5.- P. 1-78.

174. Parhofer KG, Geiss HC, Schwandt P. Efficacy of different low-density lipoprotein apheresis methods.// Ther Apher. 2000. - Vol. 4. - P. 382-385.

175. Park J.W., Merz M., Braun P. Effect of HELP-LDL-apheresis on outcomes in patients with advanced coronary atherosclerosis and severe hypercholesterolemia.// Atherosclerosis.-1998.-Vol. 139.-P.401 -409.

176. Phillips A.P., Martin K.L., Horton W.H. The Choice of Methods forimmunoglobulins IgG purification: yield and purity of antibody activity.// J. of Immunol. Methods.-1984.-Vol.74.-P.385-393.

177. Pokrovsky S.N., Adamova I.Yu., Afanasieva O.I., et.al. Immunosorbent for selective removal of lipoprotein(a) from human plasma (in vitro study).// Artificial Organs.- 1989.-Vol. 15.-P. 136-140.

178. Pokrovsky S.N., Adamova I.Yu., Trakht I.N. Large scale purification of monoclonal antibodies (McAb) for preparation of "IMMUNOLIPOSORBER McAB" for LDL apheresis.// 2nd Cuban and International seminar of Biotechnology:Abstracts.-Havana. 1989.-P.58.

179. Pokrovsky S.N., Adamova I.Y., Benevolenskaya G.F. Immunosorbents for LDL apheresis. //Biomater. Artif. Cells Artif. Organs.- 1990.-Vol.18.-P. 623628.

180. Pokrovsky S.N., Adamova I.Y., Afanasieva O.Y., Benevolenkskaya G.F. Immunosorbent for selective removal of lipoprotein (a) from human plasma: in vitro study//Artif. Organs.-1991.-Vol. 15.- P.-136-139.

181. Pokrovsky S.N., Adamova I.Yu., Afanasieva O.I., Susekov A.V., Kukharchuk V.V. Affinity chromatography in the treatment of lipid metabolism disorders. //Therapeutic Plasmapheresis.-1992.-№ XII.- P.407-410.

182. Pokrovsky S.N., Sussekov A.V., Afanasieva O.I., Adamova I.Y., Laykishev

183. A.A., Kukharchuk V.V. Extracorporeal Immunoadsorption for the specific removal of lipoprotein (a) (Lp (a) apheresis): preliminary clinical data.// Chem. Phys. Lipids.-1994.-Vol. 67// 68.- P. 323-330.

184. Pokrovsky S.N., Sussekov A.V., Adamova I.Yu., et al. Development of immunosorbents for apoB-containing lipoproteins apheresis. // Artif.Organs.-1995.-Vol. 19.-P.500-505.

185. Porath J. Conditions for biospecific adsorbtion.// Biochimie.- 1973.-Vol. 55.- P. 943-951.

186. Prior M., Arosio E., Ferrari M., et al. Lipoprotein(a) and general risk factors in patients with angiographically assessed peripheral arterial disease. Int. Angiol.-1995.-Vol. 14.-P.357-363.

187. Rath M., Niendorf A., Reblin T. et al. Detection and quantification of lipoprotein(a) in arterial wall of 107 coronary bypass patients. Arteriosclerosis.-1988.-Vol.9.-P.579-592.

188. Rath M., Pauling L. Hypothesis: lipoprotein (a) is a surrogate for ascorbate.// Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1990. - Vol. 87. - P. 6204 - 6207.

189. Rhoads G.G., Blackwelder W.C., Stemmermann G.N., Hayashi T., Kagan A. Coronary risk factors and autopsy findings in Japanese-American men.// Lab Invest. 1978. - Vol. 38. - P. 304-311.

190. Richter W.O., Donner M.G., Schwandt P. Three low density lipoprotein apheresis techniques in treatment of patients with familial hypercholesterolemia: a long-term evaluation.// Ther. Apher.- 1999.- Vol.3.-P.203-208.

191. Ridker P.M., Hennekens C.H., Stampfer M.J. A prospective study of lipoprotein(a) and risk of myocardial infarction JAMA.-1993.-Vol.270.-P.2195-2199.

192. Ritter M., Parhofer K. Extracorporeal Low-density Lipoprotein Elimination by immunoadsorption.//Ther.Apher.&Dial.-2003.-Vol.7.-N.3-P.370-372.

193. Ronspek W., Brinckmann R., Egner R., Gebauer F., Winkler D., Jekow P., Wallukat G., Muller J., Kunze R. Peptide based adsorbers for therapeutic immunoadsorption.// Ther.Apher. and Dial.-2003.-Vol.7.-P.91-97.

194. Saal S.D., Parker T.S., Gordon B.R. et al. Removal of low-density lipoproteins in patients by extracorporeal immunoadsorption.// Am. J. Med.,-1986.- Vol.80.-P.583-589.

195. Scanu A.M. Lipoprotein(a). A genetic risk factor for premature coronary heart disease.// JAMA. 1992. -Vol. 24. - P. 3326-3329.

196. Schaefer E.J., Lamon-Fava S., Jenner J.L. et al. Lipoprotein(a) levels and risk of coronary heart disease in men. JAMA.-1994.-Vol.271.-P. 999-1003.

197. Schamberger B.M., Geiss H.C., Ritter M.M., Schwandt P., Parhofer K.G. Influence of LDL apheresis on LDL subtypes in patients with coronary heart disease and severe hyperlipoproteinemia.// J Lipid Res. 2000. — Vol. 41. — P. 727-732.

198. Schmidt H.H., Wagner S., et al. Pravastatin lowers significantly thy ^3(4>) level in a normocholesterolemic patient. // The Second nternational Conference on Lipoprotein (a), New Orlean, Louisiana, USA. 1992. - P. 127.

199. Schmidt HH, Wagner S, Manns MP. Elevated lipoprotein(a) is lowered by a cholesterol synthesis inhibitor in a normocholesterolaemic patient with premature myocardial infarction. Blood Coagul Fibrinolysis.-1993.-Vol.4.-P.173-175.

200. Schreiner P.J., Morriset J.D., Sharret A.R., et. al. Lipoprotein (a) as a risk factor for preclinical atherosclerosis.// Atherosclerosis. Thromb. 1993. -Vol. 13.-P. 826-833.

201. Schreiner P J., Chambless L.E., Brown S.A. et al. Lipoprotein(a) as a correlate of stroke and transient ischemic attack prevalence in a biracial cohort: the ARIC Study. Ann. Epidemiol.- 1994.-Vol. 4.-P. 351-359.

202. Schuff-Werner P., Armstrong V.W., Eisenhauer T., Thiery J., Seidel D. Treatment of severe hypercholesterolemia by heparin- induced extracorporeal LDL precipitation (HELP).// Beitr Infusionsther . 1988. - Vol. 23. - P. 118-126.

203. Schultheiss H.P. The significance of autoantibodies against the ADP// ATP carrier for the pathogenesis of myocarditis and dialted cardiomyopathy -clinical and experimental data.// Springer semin. Immunopathol. 1989.-Vol.ll.-P. 15-30.

204. Seed M., O'Connor B., et. al. The effect of nicotinic asid and acipimox on Lp(a) concentration and turnover.// Atherosclerosis. 1993. - Vol. 101.- P.161.168.

205. Seed M. Lipoprotein(a) its role in cardiovascular disease. In: Betteridge D.J. (Ed.), Lipids and lipoproteins. Martin Dunitz Ltd. 1996.- l.-P. 69-88.

206. Schulze K., Becker B.F., Schauer R., Schultheiss H.P. Antibodies to ADP-ATP carrier -an autoantigen in myocarditis and dilated cardiomyophaty -andom cardiac function.// Circulation.- 1990.-Vol.81.-P.959-969.

207. Sinitsyn V.V., Metlitscaya L.M., Mamontova A.G., et.al. Heparin-sorbent for low density lipoproteins removal in hypercholesterolemia.// Art. Org.- 1990.-Vol. 18.-P. 629-635.

208. Smith G.D., Shipley M.J., Marmot M.G., Rose G.R. Plasma cholesterol concentration and mortality.// The Whitehall Study. JAMA. - 1992. - Vol. 267. - P.70-76.

209. Solymoss B.C., Marcil M., Wesolowska E. et al. Risk factors of venous aortocoronary bypass graft disease noted at late symptom-directed angiographic study. Can. J. Cardiol.-1993.-Vol.9.P.80-84.

210. Staudt A., Schaper F., Stangl V., Plagemann A., Bohm M., Merkel K. et al. Immunological changes in dilated cardiomyopathy induced by immunoadsorption therapy and subsequent immunoglobulin substitution.// Circulation.-2001 .-Vol. 103.-P.2681-2686.

211. Stefanutti C., Vivenzio A., Colombo C., et al., Treatment of homozygous and double heterozygous familial hypercholesterolemic children with LDL-apheresis.// Int. J. Artif. Organs.-1995.-Vol.l8.,P.103-l 10.

212. Stoffel W., Demant T. Selective removal of apolipoprotein B containing serum lipoproteins from blood plasma.// Proc. Natl. Acad. Sci US A.-1981.1. Vol.78.- P.611-615.

213. Stoffel W., Borberg H., Greve V. Application of specific extracorporeal removal of low density lipoprotein in familial hypercholesterolaemia. // Lancet.- 1981.- Vol.2.-P. 1005-1007.

214. Stubbs P., Seed M., Lane D. et al. Lipoprotein(a) as a risk predictor for cardiac mortality in patients with acute coronary syndromes. Eur Heart J.-1998.-Vol. 19.-P. 1355-1364.

215. Straube R., Kingreen H. Lipoprotein (a) immunoapheresis in the treatment of familial lipoprotein (a) hyperlipoproteinemia.// Therapeutic Apheresis. -1998.-Vol. 2.-P. 243-245.

216. Susca M. Heparin-induced extracorporeal low-density lipoprotein precipitation andom, a new modification of HELP apheresis: technique and first clinical results.// Ther.Apher. 2001.-Vol.5.-N.5-P.387-393.

217. Sutton-Tyrrell K., Evans R.W., et. al. Lipoprotein (a) and peripheral atherosclerosis in older adults.// Atherosclerosis. 1996. -Vol. 122.- P. 1119.

218. Swaney J.B., Kuehl K.S. Separation of apolipoproteins by an acrylamide gradient sodium dodecyl sulfate gel electrophoresis system.// Biochim. Biophys. Acta.-1976.- Vol. 446.-P.561-571.

219. Takami S., Kubo M., Yamashita S. et al. High levels of serum lipoprotein(a) in patients with ischemic heart disease with normal coronary angiogram and thromboangiitis obliterans. Atherosclerosis.- 1995.-Vol.l 12.-P. 253-260.

220. Tamai O., Matsuoka H., Itabe H., Wada Y., Kohno K., Imaizumi T. Single LDL-apheresis improves endothelium-dependent vasodilatation in hypercholesterolemic humans.// Circulation.- 1997.-Vol.95.-P.76-82.

221. Tamura A., Watanabe T., Mikuriya Y., Nasu M. Serum lipoprotein(a) concentrations are related to coronary disease progression without new myocardial infarction. Br. Heart J.- 1995.-VoI. 74.-P. 365-369.

222. Tanaka K., Hayashi K., Shingu T., Kuga Y., et al. Pentaerythritoltetranicotinate (niceritrol) decreases plasma lipoprotein(a) levels.// Metabolism.-1997.-Vol.46.-P.355-358

223. Tasaki H. Low-density Lipoprotein Apheresis in the Prevention of

224. Recurrent Coronary Heart Disease: A Review// Therapeutic Apheresis and Dialysis.- 2003.- Vol. 7.- N.- 4.- P. 408-412

225. Tenda K., Saikawa T., Maeda T. et al. The relationship between serum lipoprotein(a) and restenosis after initial elective percutaneous transluminal coronary angioplasty. Jpn. Circ. J.-1993.-Vol.57.-P.789-796.

226. Terres W., Tatsis E., Pfalzer B. et al. Rapid angiographic progression of coronary heart disease in patients with elevated lipoprotein(a). Circulation.-1995.-Vol. 91.-P. 948-950.

227. Tertov V.V., Khashimov Kh.A, Orekhov A.N., Mukhin D.N., Kurdanov Kh.A., Chichinadze O.M., Pokrovsky S.N. LDL-apheresis and regression of atherosclerosis. Lancet.-1985.-№8437.-V. l.-P.l 108-1109.

228. Thiery J., Seidel D. LDL-apheresis: Clinical experience and indications in the treatment of severe hypercholesterolaemia.// Transfiis Sci.- 1993. Vol. 14. - P. 249-259.

229. Thompson G.R., Lowenthal R., Myant N.B. Plasma exchange in the management of homozygous familial hypercholesterolaemia.// Lancet.-1975.- Vol.31. P. 1208-1211.

230. Thompson G.R., Myant N.B., Kilpatrick D., Oakley C.M., Raphael M.J.„ Steiner R.E. Assesment of long-term plasma exchange for familial hypercholesterolaemia.// Br. Heart.J.-1980.- Vol.43.-P.680-688.

231. Thompson G.R., Miller J.P., Breslow J.L. Improved survival of patients with homozygous familial hypercholesterolaemia treated with plasma exchange.//

232. Br. Med. J. (Clin. Res. Ed.).-1985.-Vol. 291.- P. 1671-1673.

233. Thompson G.R., Barbir M., Okabayashi K., Trayner I., Larkin S., Plasmapheresis in familial hypercholesterolaemia.// Arteriosclerosis.- 1989.-Vol.9. (Suppl I).- P. 1152-7.

234. Thompson GR. Progression and regression of coronary artery disease.// Curr Opin Lipidol. 1992. - Vol. 3. - P. 263-267.

235. Thompson G.R., Naoumova R., Sidhu P., Underwood R. Predicting coronary heart disease.// Lancet. 1994. - Vol. 343. - P. 670-671.

236. Thompson G.R., Maher V.M., Matthews S. et al. Familial Hypercholesterolaemia Regression Study: a Randomized trial of low density-lipoprotein apheresis.// Lancet. 1995. - Vol. 345. - P. 811-816.

237. Thompson G.R. and Sussekov A. Radical therapy of atherosclerosis by apheresis or liver transplantation. In: Woodford F.P., Davignon J., Sniderman A. (eds.) Elsevier Science B.V.// Atherosclerosis X. 1995.

238. Thompson G.R., Kitano Y. The role of low-density lipoprotein apheresis in the treatment of familiar hypercholesterolemia.// Ther Apher. 1997. - Vol. l.-P. 113-116.

239. Thompson G.R. LDL apheresis // Atherosclerosis.- 2003.-Vol.167.-P.l-13.

240. Tsao B.T., Curtiss I.K., Edgington T.S. Immunochemical heterogeneity of human plasma apolipoprotein B. Expression of apolipoprotein B epitopes onnative lipoproteins. //J.of.Biol.Chem.-1982.- Vol.257.-P. 15222-15228.

241. Tsurumi Y., Nagashima H., Ichikawa K. et al. Influence of plasma lipoprotein(a) levels on coronary vasomotor response to acetylcholine.// J Am Coll Cardiol.- 1995.-Vol.26.-P. 1242-1250.

242. Ulrich H., Lackner K., Schmitz G. Lipoprotein (a) apheresis in severe coronary heart disease: an immunoadsorbtion method.// Art. Org. 1998. -Vol. 22.-P. 135- 139.

243. USP 24, United states pharmacopeial convention, inc2001. 1206 Twinbrook Parkway, Rockville, MD 20852

244. Utermann G. The mysteries of lipoprotein (a).// Science. 1989. - Vol. 246. -P. 904-910.

245. Valentine R.J., Kaplan H.S., Green R. et al. Lipoprotein(a), homocysteine, and hypercoagulable states in young men with premature peripheral atherosclerosis: a prospective, controlled analysis. J.Vase. Surg.-1996,-Vol. 23.-P.53-63.

246. Vessby B., Unsitupa M., Hermansen K., Riccardi G., et al. Substituting dietary saturated for monounsaturated fat impairs insulin sensitivity in healthy men and women: The KANWU Study.// Diabetologia.-2001.-Vol.44.-P.312-319.

247. Wallukat G., Reinke P., Dorfell W.V., Luther H.P., Restvater K., Felix S.B. et al. Removal of autoantibodies in dilated cardiomyopathy by immunoadsorption // Int.J.Cardiol.-1996.-Vol.54.-P.191-195.

248. Wallukat G., Fu H.M., Matsui S., Hjalmarson A., Fu M.L. Autoantibodies against M2 muscarinic receptors in patients with cardiomyophathy display non-desensitized agonist-like effects.//Life Sci.-1999.-Vol.64.-P.465-469.

249. Wendt G.G. International Lp-Workshop.// Humangenetik.- 1967.- Vol. 3.- P. 269-272.

250. Wieland H, Seidel D. A simple specific method for precipitation of low density lipoproteins.// J. Lipid. Res.- 1983.- Vol.24.- P. 904.

251. Wiklund O., Fager G., Andersson A., Lundstam U., Masson P., Hultberg B. N-acetylcysteine treatment lowers plasma homocysteine but not serum lipoprotein(a) levels.// Atherosclerosis.-1996.-Vol.l 19.-P.-99-106

252. Willeit J., Kiechl S., Santer P. et al. Lipoprotein(a) and asymptomatic carotid artery disease. Evidence of a prominent role in the evolution of advanced carotid plaques: the Bruneck Study. Stroke.- 1995.-Vol.26.-P. 1582-1587.

253. Wolff P.G., Kühl U., Schultheiss H.P. Laminin distribution and autoantibodies to laminin in dilated cardiomyopathy and miocarditis.// Am.Heart.J.-1989.-Vol. 111 .-P. 13 03-1309.

254. Yamamoto A., Kojima S., Kishino B., et al. Dextran sulfate adsorbtion as a potent tool for the treatment of refractory hypercholesterolemia.// 4th Int.

255. Symp, Munich.-1992.-P. 158-166.

256. Yamamoto H., Imazu M., Yamabe T. et al. Risk factors for restenosis after percutaneous transluminal coronary angioplasty: role of lipoprotein(a).// Am. Heart J .-1995.-Vol.l30.-P.l 168-1173.

257. Yokoyama S., Hayashi R., Kikkawa T. et al. Specific sorbent of apolipoprotein B-containing lipoproteins for plasmapheresis. Characterization and experimental use in hypercholesterolemic rabbits.// Arteriosclerosis.-1984.-Vol. 4.-P.276-82.

258. Yokoyama S., Hayashi R., Satani M., Yamamoto A. Selective removal of low density lipoprotein by plasmapheresis in familial hypercholesterolemia. // Arteriosclerosis.- 1985.- Vol. 5.- P. 613-22.

259. Yokoyama S. Brief History of Low-density Lipoprotein Apheresis// Therapeutic Apheresis and Dialysis.- 2003.- Vol. 7.- N.4.- 378-381.

260. Young S.G., Smith R.S., Hogle D.H., Curtiss L.K., Witztum J.L. Two new monoclonal antibodies-based enzyme linked assay of apolipoprotein B. // Clin.Chem.-1986.-Vol.32.-P. 1484-1490.

261. HAEMAPHERESIS and HAEMOTHERAPYhonors the scientific work of1. Dr. Sergei Pokrovskywith the