Активация и транспорт в ядро МАР-киназы под действием эпидермального фактора роста (ЭФР) в клетках с различными мутациями рецептора ЭФР тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.25, кандидат биологических наук Арнаутов, Алексей Михайлович

• Арнаутов, Алексей Михайлович
• кандидат биологических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Арнаутов, Алексей Михайлович

2.7.1. Классический путь

2.7.2. Альтернативные пути транспорта

2.7.3. Регуляция транспорта в ядро

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1. Культивирование клеток

3.2. Обработка клеток нокодазолом, цитохалазином Д,

колхицином, таксолом и циклогексимидом

3.3. Антитела

3.4. Иммунофлуоресцентное окрашивание клеток

3.5. Конъюгация пероксидазы с антителами

3.6. Получение антител

3.7. Иммунопреципитация

3.8. Субклеточное фракционирование

3.9. Аффинная хроматография

4. РЕЗУЛЬТАТЫ

4.1. МАР-киназа активируется различными агонистами

4.2. Исследование роли тирозинкиназы и С-терминального домена рецептора в активации и ядерном транспорте МАР-киназы

4.3. Влияние нокодазола и цитохалазина на активацию и транспорт МАР-киназы в ядро

4.4. МАР-киназа ассоциирована с эндоплазматическим ретикулумом

4.5. Транспорт МАР-киназы в ядро не

опосредуется кариоферином а

5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

6. ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Активация и транспорт в ядро МАР-киназы под действием эпидермального фактора роста (ЭФР) в клетках с различными мутациями рецептора ЭФР»

1. ВВЕДЕНИЕ

Действие эпидермального фактора роста (ЭФР) на клетки реализуется через специфический рецептор - крупный трансмембранный белок, обладающий тирозинкиназной (ТК) активностью и несколькими сайтами автофосфорилирования, находящимися на С-конце рецептора. Связывание ЭФР с рецептором приводит к стимуляции ТК и инициирует два ряда событий: активацию сигнальных путей и интернализацию ЭФР-рецепторных комплексов. Среди сигнальных путей, стимулируемых ЭФР, особое место занимает МАР-киназный каскад, которому в последнее время отводится едва ли не самая главная роль в опосредовании клеточного ответа на внешний стимул. Этот каскад включает ряд серин-треониновых протеинкиназ и состоит из двух способов активации МАР-киназы (МАРК) разных субклассов. В настоящее время выделяют три субкласса МАР-киназ: ERK, JNK(SAPK) и р38МАРК (Marshall, 1994). Активация так называемого ERK-пути происходит посредством активации малой ГТФазы Ras. Сигнал с активированного Ras передается на каскад серин-треониновых протеинкиназ, первой из которых явялется c-Raf киназа. Сигнал с c-Raf передается на киназу МАРК (МАРКК или МЕК), которая в свою очередь активирует фосфорилированием МАР-киназу. Активная форма МАР-киназы транслоцируется затем в ядро, где фосфорилирует белки Elk-1 и Elf-1, входящие в тернарный комплекс транскрипционных факторов, а также транскрипционный фактор Sapla. В настоящее время описано семь различных изоформ ERK, две из которых являются основными - р42 и р44 МАР-киназа (или ERK1, 2). Другие два субкласса МАРК активируются клеточным стрессом по

механизму "стресс - Rho - МАРКК4.6 - р38МАРК; SAPK ". Активные формы этих киназ также регулируют работу генов раннего ответа через Elk-1 (Landeret al., 1996).

Известно, что связывание лиганда с рецептором ЭФР приводит к димеризации рецепторов и активации тирозинкиназы, которая фосфорилирует пять тирозинов, расположенных на карбоксильном конце рецептора (Никольский и др., 1987). Эти фосфорилированные тирозины являются сайтами для ассоциации с сигнальными белками. Различные изменения (точечные мутации и делеции в регуляторных и функциональных зонах рецептора) приводят к нарушению работы этой цепочки. Проводимые исследования на клетках линии К721, экспрессирующих рецептор ЭФР с неактивной ТК, продемонстрировали отсутствие активации таких важнейших клеточных регуляторов, как белки STAT1, р62, Gap, однако, вопрос о статусе фосфорилирования МАРК остается открытым. О роли С-конца рецептора в процессе активации сигнальных каскадов можно судить по данным, полученным на клеточных линиях, экспрессирующих рецепторы, лишенные 123, 165, 196 и 214 С-концевых аминокислот. Эти результаты свидетельствуют о том, что отсутствие или замена всех сайтов автофосфорилирования не снимают лиганд-зависимое активирование МАР-киназ, которые, возможно, используют некоторые клеточные белки, фосфорилированные по тирозину, как суррогат (Li et al., 1994).

Несмотря на определенные успехи в идентификации белков, участвующих в активации ERK, существует мало сведений о ядерной транслокации этой протеинкиназы. Было показано, что транспорт ее в ядро при стимуляции клеток эмбриональной сывороткой достигает максимума через 3 ч, в то

время как стимуляция клеток ростовыми факторами или непосредственными активаторами МАРК приводит к быстрому ее накоплению в ядре уже к 15-ой минуте (Sano et al., 1995). Была продемонстрирована способность ERK активироваться и перемещаться в ядро под действием TGF в пролиферативной части цикла и не активироваться в ответ на тот же митоген в процессе дифференцировки фибробластов (Sauma et al., 1995). Безусловно, небольшое количество данных о ядерной транслокации МАР-киназы объясняется тем, что в настоящий момент совершенно неизвестен механизм ядерного импорта этого фермента. Поскольку у ERK не обнаружена ни одна из известных последовательностей ядерного импорта (NLS), существует несколько предположений относительно способов транспорта МАР-киназы в ядро. Так как известно, что только фосфорилированная форма МАРК способна к ядерной транслокации, был предложен механизм ассоциации МАРК и МАРКК, как необходимое условие для импорта в ядро. Однако этот механизм не может быть универсальным, поскольку он не объясняет, например, процесс транспорта микроинъецированной активной МАРК (Fukuda et al., 1997). Но какими бы ни были разногласия относительно механизмов транслокации ERK в ядро, все исследователи единодушны в одном - для этого процесса необходимо наличие фосфорилированнной ERK.

Регуляция транспорта в ядро белковых молекул может происходить на нескольких уровнях, в том числе и на уровне заякоривания комплекса на ядерной поре и его транслокации в ядро. Следует отметить, что именно этот способ регуляции может зависеть от целостности клеточного цитоскелета, поскольку белки ядерного порового комплекса тесно связаны как

с ядерными ламинами (промежуточные филаменты), так и с цитоплазматическим актином и, возможно, с тубулином.

В настоящее время существует мало данных о роли как актинового, так и тубулинового цитоскелета в регуляции активации и транспорта в ядро различных сигнальных молекул. Недавно было продемонстрировано, что ядерный транспорт протеинкиназы С, не имеющей последовательности ядерной локализации, требует наличия интактного цитоскелета (Schmalz et al., 1996). Также показана роль микротрубочек в транспорте капсидов вируса герпеса от плазматической мембраны в ядро (Sodeiketal., 1997).

Следует отметить, что ни в одной из работ, касающихся активации МАР-киназы в клетках, экспрессирующих мутантный рецептор ЭФР, не исследовался ее транспорт в ядро, то есть на вопрос требуется ли для транспорта в ядро МАР-киназы активация всех (или некоторых) сигнальных путей, стимулируемых ЭФР, ответа пока не получено. Таким образом, очевидно, что процессы ЭФР-стимулированной активации и ядерного транспорта МАР-киназы в клетках, несущих рецептор ЭФР с различными мутациями рецептора либо противоречивы, либо слабо изучены, а механизм ее ядерной транслокации остается неизвестным.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Эпидермальный фактор роста (ЭФР) и его рецептор.

Сигнальная сеть, которую образуют рецепторы ЭФР-семейства, регулирует пролиферацию и дифференцировку множества типов тканей. Нарушения регуляции этой сети являются причиной возникновения и прогрессии многих онкозаболеваний (Hynes, Stern, 1994). Исследования, проведенные на клетках с трансформированными рецепторами ЭФР-семейства позволили сделать выводы о том, каким образом эта сигнальная сеть регулируется, и как регуляция и взаимодействие различных белков нарушены при малигнизации.

Существует по крайней мере 8 различных гормонов, принадлежащих к семейству ЭФР: сам ЭФР, TGFa, HB-EGF, амфирегулин, эпирегулин, бетацелулин, неорегулины, глиальный фактор роста и другие (Riese, Stern, 1998). Большинство белков этого семейства синтезируются как трансмембранные предшественники, которые могут образовывать растворимую форму гормона после протеолиза или функционировать в мембране. Растворимые гормоны могут состоять всего из 50 аимнокислотных остатков и имеют общий домен. Особенностью этого домена является наличие 6 цистеинов, образующих 3 дисульфидных мостика, формируя таким образом вторичную структуру молекулы гормона. Этот домен необходим и достаточен для связывания с ErbB семейством рецепторов (Chang et al., 1997).

В настоящее время описаны 4 типа рецепторов, относящиеся к семейству ErbB: ЭФР-Р (HER), ErbB2 (HER2); ЕгЬВЗ (HER3) и ErbB4 (HER4), структуру которых мы рассмотрим

на примере рецептора ЭФР. Это трансмембранный гликозилированный белок, состоящий из 1186 аминокислотных остатков (АО) и 10-12 олигосахаридных цепей, ковалентно связанных с белковым остовом. Некоторые авторы считают, что гликозилирование рецепторов ErbB семейства важно для обеспечения связывания с лигандом и тирозинкиназной активности (Soderquist, Carpenter, 1984). Экстраклеточный домен рецептора обогащен цистеинами, которые образуют два кластера. На основании функционального анализа лиганд-связывающего (экстраклеточного) домена в опытах с "химерными" рецепторами и электронно-микроскопического изучения очищенного рецептора было выдвинуто предположение о четырехдоменной организации внешнего участка молекулы рецептора ЭФР (Ullrich, Schlessinger, 1990). Согласно этой модели субдомены 2 и 4 содержат участки, богатые цистеинами, а последовательности, которые ответственны за связывание с лигандом, локализованы в субдоменах 1 и 3.

Трансмембранный домен рецептора выполняет пассивную функцию в проведении сигнала, что было подтверждено многочисленными заменами аминокислотных остатков в результате точечных мутаций (Kashles et al., 1988). Можно предположить, что трансмембранный участок обеспечивает лишь "заякоривание" рецептора в плазматической мембране (Heldin, 1995).

Трансмембранный домен рецептора отделяется от цитоплазматического так называемым подмембранным участком. Полагают, что подмембранный домен участвует в модуляции функций рецептора. Так, треонин 654, который локализован в этом районе, является сайтом

фосфорилирования протеинкиназой С (РКС), что в конечном счете приводит к ингибированию собственной киназной активности рецептора и потере им способности связывать ЭФР (Davis, 1988). Также были идентифицированы несколько других остатков серина и треонина, которые локализованы в подмембранном домене и являются дополнительными сайтами фосфорилирования РКС (Carpenter, 1992).

Отличительной особенностью цитоплазматического домена рецептора ЭФР является участок, обладающий ферментативной тирозинкиназной активностью. Этот участок имеет высокую гомологию с белками Src-семейства, которые также являются тирозиновыми протеинкиназами (Downward et al., 1984). Связывание ЭФР с рецептором приводит к активации ТК самого рецептора. Наиболее важную роль для стимуляции ТК активности рецептора ЭФР играет лизин 721. Было показано, что при замене лизина 721 на фенилаланин наблюдалось полное нарушение ТК активности рецептора как in vitro, так и in vivo (Honneger et al., 1987; Chen et al., 1987). На концевом участке цитоплазматического домена рецептора ЭФР расположены пять сайтов ЭФР-зависимого автофосфорилирования по тирозину: три основных (Y1068, Y1148 и Y1173) и два минорных (Y992 и Y1086). Этот участок имеет молекулярный вес около 20 кДа и легко отщепляется под действием протеаз (Margolis et al., 1989). По-видимому, в результате автофосфорилирования рецептор приобретает особую конформацию, при которой облегчается его взаимодействие с внутриклеточными субстратами.

Также было обнаружено, что в цитоплазматическом домене рецептора локализованы еще два функциональных участка. Один, состоящий из 164 АО (1022-1186), можно охарактеризовать как ингибиторный домен, поскольку его

делеция приводит к увеличению ЭФР-зависимого фосфорилирования внутриклеточных субстратов рецептора ЭФР. Этот домен взаимодействует с ТК рецептора, маскируя при этом последовательность с 973 по 1022 АО, составляющих второй домен -"домен интернализации". Автофосфорилирование трех тирозинов в ингибиторном домене приводит к конформационным изменениям, при которых освобождается ТК домен и домен интернализации. Кроме того, в домене интернализации была обнаружена последовательность из 18 АО (973 - 991), необходимая как для интернализации, так и для увеличения концентрации цитозольного кальция. Авторы назвали этот участок "Cain", подчеркивая его связь с регуляцией потоков кальция и интернализацией (Chen et al., 1989).

2.2. Связывание с лигандами и активация ErbB рецепторов.

Несколько механизмов вносят свой вклад в образование и взаимодействие сигнальной сети, образуемой ErbB семейством рецепторов. Например, бетацеллулин, HB-EGF и эпирегулин активируют как рецептор ЭФР, так и ЕгЬВ4; а неорегулины 1 и 2 типов связываются с ЕгЬВЗ и ЕгЬВ4. Каждый из этих рецепторов (за исключением ЕгЬВ2) способен связывать множество гормонов. С рецептором ЭФР связывается как сам ЭФР, так и TGF-a, HB-EGF, бетацеллулин и эпирегулин (Sliwkowski et al., 1994; Lemmon et al., 1997). Здесь необходимо отметить, что связывание лиганда с рецептором не всегда означает активацию последнего. Гормоны этой группы различаются по их способности связывать и активировать различные участки индивидуальных рецепторов.

Рецепторы, не способные к связыванию одиночного гормона, могут быть кросс-активированы, при условии присутствия компетентного рецептора для связывания. Например, ЭФР не способен связываться с ЕгЬВ2, но способен индуцировать автофосфорилирование как ЭФР-Р, так и ЕгЬВ2 посредством образования гетеродимеров (Stern, Kamps, 1988). Однако существует возможность и трансктивации рецепторов, например, через Src. Подобные гетеротипические взаимодействия характерны для всех рецепторов этой группы. Таким образом можно заключить, что присутствия одиночного рецептора, способного связываться с гормоном вполне достаточно для активации почти всех членов ErbB семейства. Такие отношения характерны, по-видимому, только для этого семейства, так как до сих пор в литературе нет данных о трансактивации между ErbB и PDGF-рецептором или рецептором инсулина (Graus-Porta et al., 1997).

Следует отметить, что в большинстве клеток экспрессируются почти все члены семейства ErbB, что подразумевает достаточно сложные конкурентные взаимоотношения, которые недостаточно хорошо изучены к настоящему времени и представляют несомненный интерес и перспективное поле для исследований.

Каждый рецептор этой группы имеет уникальную способность к активации сигнальных каскадов, что впервые было показано при исследовании передачи сигнала через ЭФР-Р и ЕгЬВ2, при котором активация этих рецепторов приводила к синергичному действию на трансформацию фибробластов (Alimandi et al., 1995; Cohen et al., 1996). Весьма показательными явились работы по исследованию клеточного ответа в Ba/F3 линии, для которой "естественным" эффектором является IL-3.

Данные, представленные на схеме 1 демонстрируют, что активация рецептора ЭФР ведет к IL-3-независимому "выживанию" клеток, а образование комплексов (ЭФР-Р)-НЕР2 или (ЭФР-Р)-НЕР4 приводило к IL-3-независимой пролиферации (Riese et al., 1996). Более того, ингибирование HER2 рецептора приводило к отсутствию эффекта ЭФР-опосредованной активации ERK каскада, что подчеркивает важность образования комплекса (ЭФР-Р)-ЕгЬВ2 для Ras активации (Karunagaran et al., 1996).

пролиферация выживание нет эффекта

Схема 1. Действие ЭФР и неорегулина на основные клеточные функции, реализующиеся через рецепторы ЕгЬВ-семейства.

Но самой интересной и важной особенностью рецепторов ErbB семейства является их способность служить сайтами связывания субстратов других рецепторов (Klemm et al., 1998).

Суммируя изложенные выше факты можно заключить, что действие ЭФР на клетку вызывает не только активацию рецептора ЭФР, но и всех остальных членов этого семейства, экспрессирующихся в клетке, а биологический эффект ЭФР определяется, по-видимому, количеством и уровнем активности образовавшихся гетеродимеров.

В дальнейшем, для простоты изложения, мы будем говорить про ЭФР-индуцированную активацию только рецептора ЭФР.

2.3. Передача сигнала с ЭФР-Р.

В последние годы было накоплено большое количество данных по идентификации белков и их взаимодействий, активируемых плазматическими рецепторами и установлено более 30 основных сигнальных каскадов. Для простоты изложения мы остановимся только на сигнальных путях, активируемых ЭФР-Р. К тому же, остальные рецепторы факторов роста, цитокинов и рецепторы к белкам внеклеточного матрикса имеют достаточно сходные тенденции к управлению внутриклеточными сигналами.

Одним из первых установленных сигнальных путей, активируемых ЭФР явилось катализирование PIP2 с помощью PLCy до ДАГ и И-З-Ф. ДАГ является активатором ПКС, а И-З-Ф стимулирует высвобождение Са++ из внутриклеточного депо, что приводит к активации кальмодулин-зависимой (САМ)-киназы. Следующим открытием в этой области явились данные о том, что образование активной формы Ras стимулируется рецепторной ТК.

Схема 2. Основные сигнальны пути, запускаемые с рецептора ЭФР. Показаны одиночные рецепторы.

Дальнейшее изучение субстратов рецептора привело к установлению основных закономерностей в аминокислотных последовательностях белков, способных связываться с рецептором. Так были идентифицированы 8Н2 и РТВ домены, ответственные за связывание с фосфотирозинами рецепторов факторов роста, и ЭНЗ домен, с помощью которого белки способны взаимодействовать с пролин-богатыми участками других белков (в частности, белков цитоскелета). С открытием 5Н2 домена был установлен целый ряд субстратов рецептора

ЭФР. Среди них основными являются She, Grb2, Nek, являющиеся адапторами для других белков (и не несущими, скорее всего, какой-либо иной функции), р85 субъединица PI3-киназы, ras-GAP, SH-PTP2 фосфатаза и STAT белки, причем последние два субстрата (также, как и PLCy) активируются последующим фосфорилированием тирозинкиназой рецептора, а р85 и Ras-GAP активируются простым присоединением к фосфотирозинам рецептора (Downward et al., 1984; Carpenter, 1992; Gale et al., 1993; Avruch et al., 1994; Heldin, 1995).

Значение активированных сигнальных молекул различно. Так, PLCy стимулирует, как уже было отмечено, накопление внутриклеточного Са++ и, как следствие, деполяризацию мембраны, а также фосфорилирование (через ПКС и САМ-киназу) целого ряда важнейших белков MARCKS-семейства. Образование фосфоинозитидов с помощью Р13-киназы и PI4-киназы регулирует цитоскелетные белки (профилин) и МАР-киназы (Schmidt, Hall, 1998). РТР2 фосфатаза инактивирует по принципу обратной связи ЭФР-рецептор и другие субстраты, а STAT белки, как известно, являются транскрипционными факторами (Coffer, Kruijer, 1994; Klemm et al., 1998).

Мы сознательно не указываем сайтов рецептора ЭФР, с которыми происходит взаимодействие всех этих белков-субстратов, поскольку другие рецепторы факторов роста обладают структурой, отличающейся от ЭФР-Р, и, тем ни менее, способны к лиганд-зависимой активации всех перечисленных каскадов.

Приведенная схема сигнальных путей существенно упрощена и не отражает истинной локализации белков в клетке.

2.4. МАР-киназный каскад.

2.4.1. Активация МАР-киназного каскада рецептором ЭФР.

В настоящее время описано 3 класса МАР-киназ: ERK (или собственно МАР-киназа), JNK (SAPK) и р38 (р38МАРК) у млекопитающих и FUS3 (KSS1), МРК1 и HOG1, соответственно, у дрожжей (Davis, 1993; Marshall, 1994).

Активация рецептора ЭФР приводит к его ассоциации с адапторными белками Grb2 и She, которые рекрутируют GEF (фактор обмена GDP на GTP) для Ras-белкэ - Sos к плазматической мембране (Gale et al., 1993; Segal et al., 1993). Sos, соответственно, стимулирует образование RasGTP, что приводит к активации последнего (Porfiri, McCormick, 1996). Активная форма Ras и является триггером МАРК каскада (Kyriakis et al., 1992).

Встречавшееся в литературе понятие "Ras-путь" к настоящему времени устарело, так как идентифицировано уже несколько путей, стимулируемых Ras и независимых от МАРК каскада, такие как образование активных форм кислорода и активация Rho-семейства GTP-аз.

Активная форма Ras связывается с c-Raf киназой (МЕКК), МЕКК1 и МЕКК2 с последующей активацией этих киназ. МЕКК ответственна за активацию ERK; МЕКК1 активирует JNK и, что интересно, транскрипционный фактор NFkB, а МЕКК2 - р38 (Avruch et al., 1994; Hirano et al., 1996; Rosette, Karin, 1996; Lee et al., 1997).

Таким образом, как видно из схемы 3, существует очень консервативный модуль МАРК, сохранившийся на всем протяжении филогенетического древа.

В чем же заключается особенность этого каскада и почему он является таким важным для клетки? Ответ на этот вопрос лежит в структурных и биохимических характеристиках МАР-киназ, которые можно продемонстрировать на примере ERK1.

Как известно, ферментативная реакция описывается уравнением Михаэлиса-Ментен и константой Хилла, определяющих, соответственно, 50% насыщение фермента и отношение log(ECgo/ECio)/log81. Для обычной ферментативной реакции кривая Михаэлиса-Ментен является параболой, а коэффициент Хилла равен 1. ERK же относится к классу "ультрачувствительных" ферментов (Huang, Ferrell, 1997), обладающих следующими свойствами. Во-первых, кривая Михаэлиса-Ментена для них является сигмоидальной, а во-вторых, коэффициент Хилла достигает 45 ! То есть на уровне активации ERK происходит фильтрация "несущественных" (или слабых) сигналов, и активация ERK идет скачкообразно, при достижении порогового значения стимула. Такой эффект образуется с помощью двойного фосфорилирования ERK, то есть сначала образуется ERK-P, а затем ERK-P-P, причем очевидно, что количество ERK-P-P будет возрастать в квадрате. Если учесть тот факт, что МЕК также активируется двойным фосфорилированием, то становится понятным наличие такого высокого коэффициента Хилла у ERK.

2.4.2. Регуляция МАРК каскада.

Как и любой внутриклеточный сигнальный механизм, МАРК каскад должен иметь положительную и отрицательную регуляцию для своего нормального функционирования. Отрицательная регуляция достигается по принципу обратной

связи, в результате которой активная форма ERK инактивирует МЕК и рецептор ЭФР, и активирует свою фосфатазу. Причем ERK, как и JNK, усиливает транскрипцию МКР-3 и МКР-1 соответственно, и, таким образом, ингибирование самой ERK идет по нескольким путям (Bokemeyer et al., 1996; Brunei et al., 1998). Собственно,

ЭФР ЭФР

Схема 3. МАР-киназный (ЕРК) каскад и основные сигнальные пути, регулирующие его функцию.

из вышесказанного ясно, что инактивировать ERK значительно сложнее, чем активировать, а многочисленные

экспериментальные результаты лишь подтверждают теоретические расчеты.

Так, продемонстрирована способность к активации ERK следующими стимулами: факторами роста, цитокинами, ультрафиолетовым облучением, осмолярным стрессом, клеточным шоком при повышении или понижении температуры, изменением мембранного потенциала, shear-стрессом, церамидами и многими другими (Gotoh et al., 1990; Kolch et al., 1993; Guyton et al., 1996; Huang et al., 1997). Сложно привести пример экстраклеточного стимула, не приводящего к активации ERK. Подобное утверждение не голословно и публикуемые в этом году обзорные работы лишь подтверждают наши наблюдения.

2.4.3. Мишени МАР-киназы.

Ведущая роль МАРК каскада в клетке подтверждается обилием мишеней, регулируемых ERK (Cowley et al., 1994; Mansour et al., 1994; Frost et al., 1997). Следует отметить такие цитоплазматические белки, как MBP, МАР2, ПКС, ФЛ-А2, STAT1, STAT3, el4F, p90rsk. В ядре основными мишенями ERK являются факторы Elf-1, Elk-1 (входящих в транскрипционный комплекс TCF (ternary complex factors) и Sapla, отвечающие за связывание с SRE и запускающими таким образом гены раннего ответа. Интересно, что ядерные мишени ERK, JNK и р38 являются идентичными, а утверждение некоторых авторов о том, что ERK фосфорилирует Sap1 в три раза сильнее, чем JNK и р38 является недостаточно убедительными (Strahl et al., 1996).

Взаимодействие путей внутри МАРК каскадов, представленных на схеме 4 практически исключают возможность

специфического ответа TCF на какой-либо экстраклеточный стимул (разумеется, клетки, трансформированные, например Mos-протоонкогеном, будут активировать TCF только по ERK-зависимому механизму). Тогда ответ на вопрос о значении такого многообразия эффекторов с одной мишенью должен находиться в компетенции структуры генов. Как известно, SRE присутствуют на промоторах многих генов, а не только на c-fos, хотя в литературе существуют данные только по изучению связи МАРК и TCF. Кроме того, продолжительность активации ERK и р38 или JNK принципиально различна. То есть различия существуют, скорее всего, не в мишенях, а во времени действия и природе внешнего стимула.

Таким образом, исходя лишь из знания активаторов и мишеней ERK можно сделать вывод о ведущей роли этой протеинкиназы в активации пролиферации клетки в ответ на внешний стимул.

В дополнение к вышеописанным мишеням, определяющим основную пролиферативную функцию МАРК и обеспечивающим митогенное действие факторов роста и других агентов, нельзя не упомянуть весьма необычную роль МАР-киназ, заключающуюся в ингибировании клеточного цикла и опосредовании Fas-индуцируемого апоптоза. Оказалось, что продолжительное действие NGF на NIH3T3 клетки приводило к ERK-опосредованному ингибированию CDK4 и CDK2 и индуцированию p21waf. Таким образом, продолжительная активация ERK каскада ведет к гибели клетки (Pumiglia, Decker, 1997). Более того, индукция Fas-рецепторэ также приводила к апоптозу через ERK и JNK каскады (Goillot et al., 1997). Впрочем, этот факт также может объясняться лишь продолжительной активацией ERK каскада.

2.4.4.Субклеточное распределение участников ERK каскада.

Для активации любого сигнального каскада необходимо не только наличие активного звена, регулирующего скорость образования конечного продукта сигнального пути, но и непосредственная близость участников этого пути внутри клетки. Очевидно, что если один белок находится в ядре, а другой на ПМ, то быстро встретиться им будет затруднительно. Поскольку большинство сигнальных цепей, в том числе и ERK, активируются в течение нескольких минут после действия лиганда, разумно предположить, что все участники этой цепочки должны находиться либо на каком-нибудь одном компартменте, либо в непосредственной близости друг от друга.

Для ERK каскада показано, что Ras является мембранным белком, МЕКК ассоциирована с цитоскелетом, а МЕК локализована в цитоплазме (Zheng, Guan, 1994; Carraway, Carraway, 1995). Несмотря на достигнутые успехи в определении последовательности событий, происходящих при активации ERK, ее внутриклеточное распределение изучено весьма слабо. К настоящему времени идентифицировано несколько "мест локализации" неактивной МАР-киназы (за исключением цитоплазмы): актиновый и тубулиновый цитоскелет и фокальные контакты (Reszka et al., 1997; Schlaepfer et al., 1998). Также давно известно, что некий пул МАР-киназы (до 20 %) ассоциирован с мембранами (Chen et al., 1992), однако идентификация этих мембран до настоящего времени не была произведена. Кроме того, показано, что активная форма ERK может находиться в различных клеточных компартментах и органеллах: локализоваться на микротрубочках (в нервных клетках всегда присутствует ~10% связанной с микротрубочками

формы), в ядре и в цитоплазме. На первый взгляд существует противоречие при сравнении локализации белков, необходимых для активации ERK, однако эта проблема решается просто. Во-первых, количество ERK и МЕК в клетке чрезвычайно высоко и, во-вторых, быстрая активация осуществляется как за счет избытка ферментов, так и ультрачувствительным способом.

2.5. Участие цитоскелета в проведении сигнала.

Поскольку при ответе на внешний стимул клетка может изменять свою форму, то в этом случае происходят перестройки в цитоскелетном аппарате. Более того, специфический внешний сигнал, используя консервативные сигнальные каскады, вызывает необходимые изменения в цитоскелете клетки.

Достаточно давно известен эффект миграции фибробластов в ответ на действие факторов роста или в ответ на экспрессию тирозинкиназного протоонкогена, например Src. Также хорошо изучены последовательные изменения в актиновом и тубулиновом цитоскелете во время прохождения клеткой фаз клеточного цикла. Однако последовательность биохимических реакций, происходящих при этих событиях установлена совсем недавно. Кроме того, исследования последних трех лет показали, что не только сигнальные каскады вызывают перестройку цитоскелета, но и изменения в цитоскелете могут вызвать увеличение синтеза ДНК и активацию специфических протеинкиназ. Гораздо лучше изучена регуляция актинового цитоскелета, в которой ведущую роль играют малые ГТФ-азы суперсемейства Ras - Rho-белки. К настоящему времени идентифицировано более 10 видов этих белков, которые можно разделить на подсемейства Rho, Rae и Cdc42,

управляющих образованием стресс-фибрилл, ламеллоподий и филоподий, соответственно (Watanabe et al., 1997). Более того, продемонстрировано, что активация этих ГТФ-аз идет по иерархическому принципу: Cdc42 - Rae - Rho и каждая последующая реакция может ингибироваться (или не активироваться) в зависимости от природы стимула (или группы

Схема 4. Участие цитоскелета в передаче сигнала.

стимулов) (Nobes, Hall, 1995; Kozma et al., 1996; Vincent, Settleman, 1997). Для нас же представляет несомненный интерес тот факт, что установление последовательностей в

активации/регуляции цитосклета позволило четко разграничить МАРК каскады по их функциям, поскольку схемы, в которых активный Ras способен непосредственно активировать все три МАРККК казались нелогичными (Coso et al., 1995; Hill et al., 1995). Схема 4 отражает современные представления о структуре и иерархии сигнальных каскадов, приводящих к перестройкам актинового цитоскелета (Ishizaki et al., 1997; Leblanc et al., 1998; Schmidt, Hall, 1998).

Таким образом, можно сделать несколько важных выводов. Во-первых, активация JNK и р38 управляется Rae или Cdc42, то есть стресс-киназы управляются непосредственными регуляторами цитоскелета. Во-вторых, ERK каскад не управляет перестройками цитоскелета, так как оверэкспрессия Ras и доминантно-негативного Rae не приводит к изменениям в актиновом цитоскелете, но стимулирует ERK, а при инактивации Ras в условиях оверэкспрессии Rae не происходит передачи сигнала на ERK. Более того, существует своеобразная иерархия и внутри МАРК каскадов: ERK, по-видимому, управляет тубулиновым цитоскелетом, JNK - активируется Rae, а р38 -Cdc42 (Frostetal., 1997).

Изучение регуляции образования филоподий, ламелл и стресс-фибрилл с помощью Rho ГТФ-аз не входило в задачи нашего исследования, поэтому подробно останавливаться на этом мы не будем. Стоит лишь упомянуть о том, что профилин, гельзолин и винкулин являются актин-связывающими белками, а MLC фосфатаза, переходя в активное состояние, способствует образованию стресс-фибрилл и полимеризации актина (Vincent, Settleman, 1997; Watanabe et al., 1997).

Таким образом, описанная схема 4 устанавливает четкое разграничение МАРК каскадов и позволяет объяснить

наблюдаемые эффекты различной регуляции мишеней, имеющих одинаковый мотив для регуляции их МАР-киназами. Кроме того, работы, основанные только на исследовании активных/неактивных мутантов, с использованием, например, МКК4+ или МЕКК+, не отражают истинного положения вещей.

Каким же образом может осуществляться обратный процесс - то есть регуляция сигнальных каскадов в случае изменения структуры цитоскелета? Классические представления о функционировании каскадов приводят к соображению о существовании обратной связи. Тем не менее, как это ни странно, существует лишь несколько работ по исследованию этой темы. С достоверностью можно говорить об активации NFkB и ERK при разрушении тубулинового цитоскелета. Механизм этого эффекта неясен, но предполагают, что при деполимеризации тубулинового цитоскелета активируется Rho и Rae с последующей активацией МЕКК (Perona et al., 1997).

Результаты этих исследований можно суммировать в следующий вывод: практически все ингибиторы полимеризации цитоскелета активируют RhoA (Liu et al., 1998; Ren et al., 1999).

Несколько лучше изучено действие цитоскелет-деполимеризующих агентов на процессы лиганд-индуцированной активации сигнальных каскадов. Мы говорим о тех рецепторах, чья активность зависит от связывания их с цитоскелетом. Показано, что активация FAK киназы в фокальных контактах полностью ингибируется цитохалазином D (агент, разрушающий микрофиламенты) и, соответственно, не происходит активации сигнальных путей, запускаемых с фокального контакта (Tsakiridis et al., 1997; Kim, Feldman, 1998).

На основании данных, изложенных выше, можно заключить, что регуляторы полимеризации цитоскелета играют

важную роль в управлении генетическим аппаратом клетки. Однако многие вопросы остаются пока без ответов. Так, например, не ясно, каким образом осуществляется передача сигнала с Cdc42 на Rae и Rho, и совсем уж не объяснены на сегодняшний день взаимодействия между GAPs, GEFs, и GDIs (белки, модулирующие функционирование G-белков) для Ras, Rho, Rae и Cdc42 ГТФ-аз. Мы предполагаем, что именно "таймерная" функция или совокупность каких-либо других функций этих регуляторов активности G-белков и позволяет последовательно "включать" ГТФ-азы Rho семейства.

2.6. Взаимодействие сигнальных путей.

1. Большинство описанных выше сигнальных механизмов получены при изучении in vitro или in vivo с использованием специфических ингибиторов ферментов или

оверэкспрессии/нокаута активных/неактивных форм протеинкиназ. К сожалению, в клетке наблюдаются не только "прямые" (downstream) пути, но и перекресты между сигнальными каскадами, существующие практически на каждом этапе любого сигнального пути. Для простоты изложения рассмотрим только МАРК каскады, стимулируемые рецептором ЭФР. Из схемы 4 видно, что только р38 и JNK не обладают регуляторной функцией. То есть для них не существует регуляция по принципу "обратной связи" своих активаторов и не существует данных в пользу взаимодействия между JNK/p38 и ERK каскадом. В настоящее время в литературе встречается только одна работа о влиянии РАК на активацию МЕК (Frost et al., 1997). И если этот факт в дальнейшем подтвердиться и другими авторами, то опять возникает вопрос о специфичности

внутри семейства МАР-киназ (см. выше). Кооперативное действие ERK и МККЗ,4 с последующей активацией p38/JNK вызывает определенные сомнения, поскольку доказанный факт диссоциации Grb2-Sos комплексов при активации ERK должен приводить к инактивации Ras и, следовательно, к инактивации p38/JNK пути (собственно, как и ERK-пути). Впрочем, наблюдаемая ассоциация ERK/MKK3.4 может объясняться синергичным действием этих эффекторов на мишени (Zanke et al., 1996). Тем не менее, даже если предложенная схема и далека от действительности, она отражает всю сложность проведения сигнала через МАР-киназы (Kolch et al., 1993; Dhanasekaran et al., 1998; Soh et al., 1999).

2. He менее интересным и сложным является недавно открытый способ пересечения сигнальных путей на уровне рецепторов, получивший в литературе название "узурпирующего" или трансактивирующего (Daub et al., 1997). Смысл его заключается в том, что различные рецепторы, не имеющие собственной ТК активности, в частности рецепторы, связанные с тримерными G-белками, используют фосфотирозины рецептора ЭФР (а, возможно и других) для выполнения своих функций (этим объясняется всплеск интереса к рецептору ЭФР в последние два года) (Daub et al., 1996; Chen et al., 1998). Подобная передача сигнала осуществляется за счет тирозинкиназы Src (или других), способной как in vitro, так и in vivo фосфорилировать рецептор ЭФР (Luttrell et al., 1997). Особенность такого способа передачи сигнала заключается в селективной активации каскадов. Так, для GPy субъединицы, связанной с LPA рецептором показано, что добавление LPA ведет к фосфорилированию ЭФР-Р только по тем сайтам, с которыми способны взаимодействовать She и Grb2. Более того,

наблюдается полное ингибирование STAT-активации и взаимодействия р85-субъединицы PI3-K с рецептором ЭФР. Скорее всего, другие рецепторы, лишенные ТК активности, также способны к Src-зависимому фосфорилированию тех сайтов ЭФР-Р, которые необходимы для эффективного выполнения задач этих рецепторов. Таким образом, рецептор ЭФР может служить своеобразным пристанищем не только для лигандов многих групп, но и для субстратов других рецепторов.

2.7. Транспорт в ядро сигнальных молекул.

2.7.1. Классический путь.

Поскольку большинство белков синтезируется в цитоплазме, то должна существовать специфическая машина, доставляющая белки из цитоплазмы в различные мембранные компартменты. Транспорт в митохондрии, эндоплазматический ретикулум (ЭПР), аппарат Гольджи требует наличия специфических сигналов в аминокислотных

последовательностях транспортируемых молекул, обычно отрезающихся после процесса импорта. Так как многие белки должны рекрутироваться в ядро много раз, то существует необходимость наличия такого транспортного аппарата, который позволял бы не отрезать сигнальные последовательности (Gorlich, 1998). Построение классической модели транспорта в ядро было достигнуто благодаря работам Адама, Блобеля и Герлиха и основные этапы импорта/экспорта отображены на схеме 5 (Adam et al., 1990; Fornerod et al., 1997; Gorlich, 1998).

Белки, несущие NLS-последовательность (nuclear localization sequence) взаимодействуют с NLS-рецептором (импортин/кариоферин а). Образующийся комплекс способен

связываться с кариоферином {3, в аминокислотной последовательности которого есть сайт взаимодействия с ядерной порой (Gorlich et al., 1994, Radu et al., 1995). После заякоривания на поре тримерный комплекс способен переноситься через нее с помощью гидролиза GTP белка Ran. На внутренней мембране ядра комплекс разрушается и NLS-

Схема 5. Транспорт в ядро NLS-содержащих белков.

содержащий белок выполняет свою функцию и кариоферины а и р возвращаются в цитоплазму с помощью различных механизмов: кариоферин р возвращается в комплексе с RanGTP, а кариоферин а - с помощью экспорта CAS и RanGTP (Adam et al., 1990, Rexach, Blobel, 1995, Fornerod et al., 1997; Gorlich, 1998). Подобная схема принята многими

исследователями, однако существуют принципиальные разногласия о роли RanGTP в процессе импорта/экспорта.

Большинство авторов считают, что RanGTP необходим для разрушения тримера NLS - кариоферин а - кариоферин ß внутри ядра и для экспорта кариоферинов а и ß из ядра, а в цитоплазме RanGTP гидролизуется до RanGDT формы и неизвестным образом транспортируется в ядро, где белок RCC1 конвертирует его обратно в GTP-связанную форму (Gorlich, Mattaj, 1996). Однако существует и другая точка зрения. Согласно ей, транспорт все же зависит от RanGTP, поскольку кариоферин ßi способен связываться с NPC в присутствии RanGTP, а комплекс кариоферин а - кариоферин ß - Ran - р10 -NPC стабилен in vitro. Более того, локализация RanBPI и RanGEF с разных сторон ядерной поры позволяет рассматривать Ran как особый челночный белок внутри поры (Pemberton et al., 1998). Как бы то ни было, до установления точной функции Ran в процессе импорта еще далеко (Floer et al., 1997; Seedorf, Silver, 1997; Nakielny, Dreyfuss, 1998; Gorlich, 1998).

2.7.2. Альтернативные пути транспорта.

"Классический" альтернативный путь транспорта белковых молекул в ядро мало чем отличается от классического пути. Исключение составляет начальный этап импорта, при котором "груз" связывается напрямую с кариоферином ß. Однако в данном случае это не кариоферин ßi, а кариоферин ß2 или ему подобные (Siomi et al., 1997). Подобным образом транспортируются hn RNP А1, mRNA-связывающие белки, белки

СПИДа и, как ни странно, белок HOG1 (аналог р38). Причем транспорт белков, вовлеченных в образование или экспорт mRNA (Кар104 и Кар111 - опосредованные пути) не имеет точек пересечения, что указывает на существование очень четкой регуляции этих, казалось бы, сходных процессов (Kutay et al., 1997, Ferrigno et al., 1998).

В этом году опубликованы данные, свидетельствующие в пользу существования Ran-независимого импорта некоторых белков в ядро. Если это действительно так, то функция Ran в процессе транспорта в ядро становится малопонятной (Englmeieretal., 1999, Ribbeck et al., 1999).

Однако не ясно как белки, не имеющие NLS, способны транспортироваться в ядро. Однозначного ответа тут, по-видимому, быть не может, так как два идентифицированных способа транслокации двух белков STAT1 и p38HOG (через кариоферин си и кариоферин р2, соответственно) указывают на то, что для каждого белка, не имеющего NLS, существует собственный механизм ядерной транслокации.

Из сказанного выше можно сделать вывод о том, что отсутствие NLS у белка еще не означает невозможность его транспортировки в ядро. В последнее время в литературе появились данные о транспорте некоторых факторов роста или их рецепторов в ядро, вызывающие некоторые сомнения (Mahler, 1996). Однако, в связи с последним замечанием хочется упомянуть о достоверных фактах, указывающих на присутствие белка Grb2 в ядре (Romero et al., 1998). Если вспомнить, что это адапторный белок рецепторов факторов роста, то есть над чем задуматься (хотя, бесспорно, транспорт в ядро ЭФР-Р кажется нам довольно маловероятным событием).

Существует мало сведений о ядерной транслокации активированной ERK. Было показано, что транспорт ее в ядро при стимуляции клеток 10% эмбриональной сывороткой достигает максимума через 3 ч, в то время как стимуляция клеток ростовыми факторами или непосредственными активаторами МАРК приводит к быстрому ее накоплению в ядре уже к 15-ой минуте (Sano et al., 1995). Также известна зависимость процесса ядерного импорта от стадий клеточного цикла и физиологического состояния клеток. Так, была продемонстрирована способность ERK активироваться и перемещаться в ядро под действием TGF (трансформирующий фактор роста) в пролиферативной части клеточного цикла и не активироваться в ответ на тот же митоген в процессе дифференцировки фибробластов (Saumaetal., 1995).

В то же время существует мало данных о механизме транспорта в ядро ERK. Поскольку у нее не обнаружена ни одна из известных последовательностей ядерного импорта, существует несколько предположений относительно этого процесса. Так как известно, что только фосфорилированная форма МАРК способна к ядерной транслокации, был предложен механизм ассоциации МАРК и МАРКК, как необходимое условие для импорта в ядро. Была показана транслокация комплексов МАРК-МАРКК в ядро, где происходила их диссоциация и ядерный экспорт МАРКК. Однако этот механизм не может быть универсальным, поскольку он не объясняет, например, процесс транспорта микроинъецированной активной МАРК (Fukuda et al., 1997; Jaaroet al., 1997).

Какими бы ни были разногласия относительно механизмов транслокации ERK в ядро, все исследователи единодушны в

одном - для этого процесса необходимо наличие фосфорилированнной ERK.

2.7.3.Регуляция транспорта в ядро

Регуляция транспорта в ядро NLS-содержащих белковых молекул может происходить на нескольких уровнях. Во-первых, некоторые мутации в самой структуре NLS могут приводить к эффективной блокировке импорта. Во-вторых, поскольку существует несколько механизмов активации связывания NLS-содержащих белков с кариоферином а, регуляция может осуществляться путем их ингибирования. Наконец, сам процесс заякоривания комплекса на ядерной поре и его транслокация в ядро имеет достаточно сложную и пока еще практически неизученную регуляцию. Следует отметить, что именно последний способ регуляции может зависить от целостности клеточного цитоскелета, поскольку белки ядерного порового комплекса тесно связаны как с ядерными ламинами (промежуточные филаменты), так и с цитоплазматическим актином и, возможно, с тубулином. Мы не упоминаем регуляцию транспорта в ядро с помощью биохимических сигналов, так как для каждого белка они различны (Lee et al., 1996).

Весьма любопытными являются данные о регуляции локализации белка CAS, играющего важнейшую роль в экспорте белков из ядра. Показано, что киназа МАР-киназы (МЕК) фосфорилирует этот белок, что приводит к его перераспределению в цитоплазму. То есть, активация МАР-киназного каскада, с последующей транслокацией МЕК в ядро служит и для ингибирования экспорта белков из ядра (Scherf et al., 1998).

Как уже было отмечено, в настоящее время существует мало данных о роли как актинового, так и тубулинового цитоскелета в регуляции активации и транспорта в ядро

Схема 6. ЭФР активирует МАР-киназу с помощью различных механизмов, способ транслокации МАРК в ядро - неизвестен.

различных сигнальных молекул. Недавно было убедительно продемонстрировано, что ядерный транспорт протеинкиназы Ca, не имеющей последовательности ядерной локализации, требует наличия интактного цитоскелета (Schmalz et al., 1996).

Также показана роль микротрубочек в транспорте капсидов вируса герпеса от плазматической мембраны в ядро

(Эос1е'|к а1., 1997). В то же время, Ы1-8-зависимый транспорт, как это ни странно, не опосредуется цитоскелетом.

Что касается регуляции транспорта ЕРК в ядро, то на сегодняшний день существует только одна работа по этой теме. Показано, что активная форма МКР-3 (фосфатаза ЕРК) локализуется в цитоплазме и дефосфорилирует ЕРК, не изменяя при этом ее протеинкиназной активности. Это, соответственно, приводит к отсутствию транспорта в ядро ЕРК, поскольку для транспорта ее в ядро, как уже упоминалось, требуется присутствие именно фосфорилированной формы ЕРК. Так как эти данные получены при оверэкспрессии МКР-3, то достаточно сложно сказать, насколько такая регуляция может существовать в естественных условиях (Вгипе! е! а1., 1998).

Подводя итог, мы можем сделать вывод о том, что хотя механизмы активации ЕРК изучены со всей скурпулезностью, процесс ядерного импорта - этого важнейшего регулятора пролиферации - совершенно неизвестен. Поэтому в нашей работе мы попытались с помощью разносторонних подходов выянить как механизмы этого процесса, так и его возможную регуляцию.

З.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1. Культивирование клеток.

В работе использовали клетки эпидермальной карциномы человека линии А431, полученные из Российской коллекции клеточных культур (Институт цитологии РАН), и клетки NIH3T3, трансфецированные плазмидой, которая содержала кДНК, кодирующую человеческий рецептор ЭФР полной длины (HER14), или рецептор с делецией 126 аминокислотных остатков с С-конца молекулы рецептора (клетки CD126), или рецептор, в котором лизин в положении 721 был заменен на аланин, что привело к потере его тирозинкиназной активности (клетки К721). Все три клеточные линии были любезно предоставлены доктором Дж. Шлессинджером (Нью-Йоркский Университет, США).

Клетки культивировали в среде ДМЕМ с добавлением глютамина и 10% эмбриональной сыворотки (Sigma). Для субклеточного фракционирования клетки сеяли на пластиковые чашки диаметром 100 мм или 150 мм (Corning Costar) из расчета 50 тыс. клеток на 1 см2. В опыт брали монослойные культуры на 3 сут после посева, переводя их на среду, содержащую 0.25% эмбриональной сыворотки, за 24 ч до начала эксперимента.

Для опытов по иммунофлуоресценции в пластиковые чашки Петри диаметром 35 мм (Corning Costar) помещали покровные стекла 8x8 мм (Flow). Клетки выращивали до 50-70% конфлюэнта, за 24 ч до опыта переводя на среду, содержащую 0.25% эмбриональной сыворотки.

ЭФР выделяли из подчелюстных желез самцов мыши, как описано в работе Никольского с соавторами (1985).

3.2. Обработка клеток нокодазолом, цитохалазином Д, колхицином, таксолом и циклогексимидом.

В культуру клеток добавляли нокодазол в концентрации 20 мкг/мл, колхицин (20 мкг/мл), таксол (10 мкг/мл) или цитохалазин Д в концентрации 3 мкг/мл и выдерживали 20 мин при 4°С. Затем клетки переносили в СОг - инкубатор и инкубировали 60 мин при 37°С. После этого к клеткам добавляли ЭФР в концентрации 100 нг/мл и инкубировали в течение различного времени при 37°С в С02 - инкубаторе. Опыты в присутствии циклогексимида проводили по следующей схеме. Клетки предварительно инкубировали в течение 4 ч при 37°С в рабочей среде, содержащей 30 мкг/мл циклогексимида (Sigma). Все дальнейшие инкубации проводили с постоянным присутствием циклогексимида в инкубационной среде.

3.3. Антитела.

Поликлональные антитела против специфического белка эндоплазматического ретикулума СаВРЗ были любезно предоставлены И. Мажуль (Университет Геттингена) и использовались для иммуноблоттинга в разведении 1:3000. Для специфического выявления МАР-киназы использовали поликлональные антитела против ERK (ERK1, Santa Cruz) в разведении 1:3000 для иммуноблоттинга и 1:300 для иммунофлуоресценции. Для специфического выявления фосфорилированного STAT1 использовали поликлональные антитела против pSTATI (New England Biolabs). В качестве маркера эндоплазматического ретикулума использовали конъюгат Конканавалин А - FITC (Sigma) в разведении 1:200. В качестве вторых антител при иммуноблоттинге использовали козьи антитела, полученные против иммуноглобулинов кролика,

сконъюгированные с пероксидазой (GAR-HRP) (Sigma) в разведении 1:150000. Для иммунофлуоресценции в качестве вторых антител использовали конъюгаты GAR-Fluorolink Су2, (Molecular Probes) в разведении 1:1000.

3.4. Иммунофуоресцентное окрашивание клеток.

Для исследования внутриклеточного распределения белков проводили обработку по следующей методике: покровные стекла с клетками переносили в пластиковые чашки диаметром 35 мм, дважды промывали фосфатно-солевым буфером (ФСБ, рН 7,4), а затем фиксировали 4%-ным раствором формалина (Sigma) в ФСБ при комнатной температуре в течение 15 мин. После интенсивной промывки ФСБ (5 раз по 2 мин) клетки пермеабилизировали 0.5%-ным раствором Тритона Х-100 (Serva) в ФСБ в течение 15 мин. Затем клетки промывали ФСБ (3 раза по 5 мин) и помещали на 30 мин в 1%-ный раствор БСА (Sigma) в ФСБ. Клетки инкубировали последовательно с первыми и вторыми антителами по 30 мин при комнатной температуре. После каждой инкубации с антителами клетки интенсивно промывали ФСБ (3 раза по 5 мин). Распределение флуоресцентно-меченой МАРК в клетках изучали с помощью люминисцентного микроскопа Zeis (Германия) с апохроматическим объективом 63x1.25 (масляная иммерсия) и стандартным набором возбуждающих и запирающих светофильтров. Фотографирование проводили на фотопленку KODAK-T-MAX400.

Для исследования внутриклеточного распределения МАРК в условиях обработки цитохалазином или нокодазолом покровные стекла с клетками переносили в чашки диаметром 35 мм, дважды промывали ФСБ и инкубировали с 2 мл буфера А

(20 мМ HEPES, 300 мМ сахарозы, 3 мМ MgCI, 78 мМ KCI, 2 мМ ЭГТА, 0.5 мМ фенилметилсульфонил фторида, 1 мкг/мл лейпептина, апротинина, пепстатина), содержащего 0,05% сапонина в течение 5 мин. После этого клетки промывали дважды по 5мин буфером А и фиксировали 4% формалином на буфере А. После фиксации клетки промывали 5 раз по 5мин ФСБ и помещали на 30 мин в 1%-ный раствор БСА (Sigma) в ФСБ. Далее следовали вышеописанной методике.

3.5. Конъюгация пероксидазы с антителами.

Растворяли 5 мг пероксидазы (Реанал) в ЮОмкл 0.1М фосфатного буфера, рН 7.0, содержащего 6 г/л глутарового альдегида. Через 18 ч инкубации при 24°С смесь наносили на колонку с сефадексом G-25 (Pharmacia), уравновешенным '150мкМ NaCI. Фракции, содржащие активированную пероксидазу объединяли и к этому раствору добавляли 5 мг IgG в смеси, состоящей из 1мл 150мкМ NaCI и ЮОмкл 0.1М карбонатного буфера. Через 24 ч инкубации при 4°С добавляли Юмкг NaBH4 и через 2 ч инкубации диализировали против ФСБ. Меченые антитела осаждали сульфатом аммония (30% насыщения) и диализировали против ФСБ, содержащего 0.01% NaN3 в течение 12 ч при 4°С с трехкратной сменой буфера. Полученные конъюгаты аликвотировали и хранили при -70°С.

3.6. Получение антител.

Для получения антител, способных узнавать все идентифицированные кариферины а, мы использовали пептид KEAAWAISNLTISG, соответствующий аминокислотной последовательности (387-400) IMA 3,4. Для получения антител, специфически узнающих ERK 1, ERK 2, мы использовали пептид

4i РОССИЙСКАЯ

. reCtMPCTBEHM''>

FAMELDDLPKERL, соответствующий аминокислотной последовательности (348-360) ERK 1, ERK 2 человека. Для иммунизации кроликов мы конъюгировали эти пептиды с гемоцианином (KHL) с помощью глутарового альдегида по стандартной методике. Иммунизацию кроликов проводили по стандартному протоколу: 1 иммунизация - подкожно с полным адъювантом Фрейнда (Sigma), последующие - подкожно или внутримышечно с неполным адъювантом Фрейнда. Во всех случаях количество инъецированного конъюгата было 1 мг. Методику получения конъюгатов KLH-пептид и протоколы иммунизации можно получить через Интернет по адресу http://www2.perkin-elmer.com/pa/340913/html/index.html.

3.7.Иммунопреципитация.

Иммунопреципитацию, электрофорез и иммуноблоттинг проводили по стандартному методу, описанному в работе Соколовой с соавторами (1998).

3.8.Субклеточное фракционирование.

3.8.1.Субклеточное фракционирование в градиенте плотности

Перколла

Проводили по методу, описанному в работе Корниловой с соавторами (1987).

3.8.2. Получение мембранной, цитоскелетной, цитоплазматической и ядерной фракций.

Фракционирование проводили по оригинальному методу (Maloney et al., 1998). Клетки дважды промывали холодным ФСБ и соскребали в буфере Б (25 мМ Трис-HCI, pH 7,4, 2 мМ ЭДТА, 1 мМ PMSF, 10 мМ ß-меркаптоэтанола, 10% глицерина, 1 мкг/мл

апротинина и 1 мкг/мл лейпептина). Все дальнейшие процедуры проводили при 4 °С. Затем клетки инкубировали 10 мин в буфере Б и разрушали с помощью 30 ходов пестика в гомогенизаторе Даунса. Полученный лизат центрифугировали 10 мин при 1500 д для осаждения ядер. Супернатант Б1 переносили в нитроцеллюлозные пробирки и центрифугировали 20 мин при 15000 д. Полученный осадок Р2 содержал митохондрии. Супернатант Э2 центрифугировали на бакетном роторе Б\/40 на центрифуге вртко 1.2-65К (Весктап) 30 мин при 100000 д. Полученный супернатант ЭЗ содержал цитоплазматическую фракцию. Осадок РЗ трижды промывали буфером Б и инкубировали в буфере Б, содержащем 1% Тритон Х-100, в течение 60 мин. Компоненты, растворимые в Тритоне отделяли от нерастворимых в Тритоне центрифугированием при 100000 д в течение 15 мин. В супернатанте 84 содержатся экстракты плазматических мембран, мембран эндоплазматического ретикулума (ЭПР), мембран аппарата Гольджи, эндосом, лизосом и пероксисом (мембранная фракция). Осадок Р4 трижды промывали буфером Б и ресуспендировали (цитоскелетная фракция). Осадок Р1 ресуспендировали в 1 мл буфера В (25 мМ Трис-НС1, рН 7,4, 3 мМ МдС12, 1 мМ РМЭР, 10 мМ р-меркаптоэтанола, 1 мкг/мл апротинина и 1 мкг/мл лейпептина), содержащим 0.05% Тритон Х-100, гомогенизировали 10 ударами пестика в гомогенизаторе Даунса и центрифугировали 5 мин при 500 д. Полученный осадок ресуспендировали в буфере В, наслаивали на 45% сахарозу (приготовленную на буфере В) и центрифугировали 30 мин при 1900д. Очищенные ядра ресуспендировали в буфере Б, содержащим 1% Тритон Х-100 и инкубировали 30 мин с последующим осаждением нерастворимых компонентов в

течение 15 мин при 4500д. Полученный супернатант является ядерной фракцией. Фракции цитоплазмы, ядер, цитоскелета и мембран инкубировали 5 мин при 100 °С с буфером для фореза.

3.8.3. Получение фракции ЭПР.

Фракционирование проводили по методу Флейшера и Кервиной (Fleischer, Kervina, 1974) с модификациями Юна с соавторами (Yoon et al., 1998). После проведения эксперимента клетки дважды промывали холодным ФСБ и все дальнейшие процедуры проводили при 4°С. Клетки соскребали в буфере Г (ТЭС-буфер (рН 7,6), содержащий 1 мМ ЫазУОд; 0.5 мМ PMSF и по 1 мкг/мл лейпептина, апротинина и пепстатина), пропускали 20 раз через иглу 25 g и центрифугировали 10 мин при 1500 д. Полученный осадок Р1 ресуспендировали в буфере Г, гомогенизировали с помощью 30 ходов пестика в гомогенизаторе Даунса для разрушения структур, ассоциированных с ядрами, и центрифугировали при 1500 g в течение 10 мин. Полученный осадок Р2 содержал чистые ядра. Супернатант S2 центрифугировали 20 мин при 15000 д. Полученный супернатант S3 осаждали 30 мин при 100000 g и полученный осадок Р4 ресуспендировали, инкубировали 30 мин в буфере Г, содержащем 1% Тритона Х-100 и центрифугировали 20 мин при 100000 g для разделения осадка Р5 (цитоскелет, ранее ассоциированный с ЭПР и ядрами) и супернатанта S5, содержащего мембраны ЭПР. Фракцию мембран ЭПР инкубировали 5 мин при 100°С с буфером для фореза.

3.9. Аффинная хроматография.

Для аффиной очистки антител мы проводили конъюгирование пептидов с С1-4В-сефарозой (Pharmacia) с помощью суберата (suberic acid bis(N-hydroxy succinimide ester)) в следующих условиях: 1 мл геля промывали 1М Na-борэтным буфером (NaB03, рН 8.0) и добавляли суберат в конечной концентрации 10 мМ и инкубировали 30 мин при 37°С на шейкере. После активации сефарозу промывали 1М боратным буфером, смешивали с 3 мг пептида, растворенного в 200 мкл ДМСО и инкубировали в течение 12 ч при 24°С. Непрореагировавшие активные группы сефарозы блокировали 1М Трис-HCI, рН 8.0 в течение 1 ч при 37°С. Полученный конъюгат промывали на колонке карбонатным буфером (100 мМ NaHC03, 0.5 M NaCI, рН 8.0) и ацетатным буфером (100 тМ СНзСООН, 0.5 M NaCI, рН 4.0). Смену буферов проводили 4 раза для эффективной отмывки неспецифически связанного пептида. После этого, колонку промывали ФСБ в течение 30 мин и использовали для аффинной хроматографии. К 1 мл конъюгированной сефарозы добавляли 10 мл ФСБ и 200 мкл соответствующей сыворотки и инкубировали в течение 4 ч при 4°С. Колонку промывали ФСБ до тех пор, пока ОД элюата не была равна 0. Элюцию специфически связавшихся антител проводили буфером Д, содержавшем 100 мМ глицин-HCI, рН 2.5, 150 мМ NaCI и 5% диоксана. Профиль элюированных белков регистрировали с помощью ячейки на 280 нм, подсоединенной к самописцу. Элюированные антитела немедленно нейтрализовали 1M Трис в соотношении 1 мл элюата : 88 мкл 1M Трис и при необходимости концентрировали с помощью осаждения сульфатом аммония (50% насыщения). Осадок диализовали против ФСБ, содержащего 0.01% NaN3 в течение

12 ч при 4°С с трехкратной сменой буфера. Полученные антетела хранили при 4°С. Конъюгирование антител с С1_4В-сефарозой проводили как это описано выше, за исключением того, что отмывку сефарозы от несвязавшихся иммуноглобулинов осуществляли только карбонатным буфером, содержавшем 0.5% Тритон Х-100. Инкубацию конъюгированной сефарозы с клеточным лизатом проводили в буфере Е (Р1РА-буфер, не содержащий РТТ) в течение 1 ч при 4°С. После связывания иммобилизованных антител с белками клеточного лизата поводили отмывку тем же буфером путем осаждения комплексов при 500 д и стадию отмывки повторяли 5 раз. Диссоциацию комплексов сефароза- (анти-кара)-кара с ассоциированными белками проводили путем инкубации осадка с 1 мл буфера Д, содержащего 1 М МдС12 в течение 15 мин при 4°С. После осаждения при 500 д супернатант собирали и диализовали против буфера Е в течение 2 ч с 5-кратной сменой буфера с последующей инкубацией при 100°С в течение 5 мин с буфером Лэммли. После отмывки сорбент с антителами использовался для следующего раута связывания. Протоколы аффинной хроматографии можно получить через Интернет по адресу: http://vize222.zo.utexas.edu/Marker_pages/methods_pages/ affinity_col.html

4. РЕЗУЛЬТАТЫ

4.1. МАР-киназа активируется различными агонистами.

Первым доказательством ведущей роли МАР-киназного пути в процессе передачи сигнала от внешних стимулов на клеточный геном явилась серия исследований, показавших, что МАРК является единственным активатором транскрипции

к 15°С Н202 №С1 сАМР ЭФР у/ф ТРА 1ВХ

ЭФР-Р р¥

Заключение диссертации по теме «Гистология, цитология, клеточная биология», Арнаутов, Алексей Михайлович

6. ВЫВОДЫ.

1. Для транспорта в ядро МАР-киназы под действием ЭФР необходимо присутствие активной тирозинкиназы рецептора ЭФР, поскольку динамика активации и ядерного импорта в клеточных линиях, экспрессирующих как рецептор ЭФР полной длины (НЕР14), так и рецептор ЭФР, лишенный основных сайтов автофосфорилирования (С0126) является одинаковой, а клетки, несущие рецептор ЭФР, лишенный ТК-активности, не обладают способностью к ЭФР-зависимой активации и транспорту в ядро МАР-киназы.

2. Для эффективного транспорта в ядро МАР-киназы требуется присутствие интактного актинового цитоскелета.

3. Деполимеризация тубулинового цитоскелета стимулирует активацию и ядерный импорт МАР-киназы и усиливает транспорт в ядро МАРК в клетках, обработанных ЭФР.

4. Неактивная форма МАР-киназы частично локализуется на мембранах эндоплазматического ретикулума, и именно ЭПР-ассоциированная МАР-киназа участвует в транспорте в ядро

5. МАР-киназа не ассоциируется с кариоферином а, следовательно, механизм ее ядерной транслокации отличается от классического.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Арнаутов, Алексей Михайлович, 1999 год

7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.

Корнилова Е.С., Соркин А.Д., Никольский Н.Н. 1987. Динамика компартментализации эпидермального фактора роста в клетках А431. Цитология. 29: 904-910.

Никольский Н.Н., Соркин А.Д., Сорокин А.Б. 1987. Эпидермальный фактор роста. Л.: Наука. 200 с.

Никольский Н.Н., Богданова Н.П., Виноградова Н.А., Нестеров A.M., Соркин А.Д., Сорокин А.Б. 1985. Стимулирующее действие эпидермального фактора роста и инсулина на фосфорилирование уридина в клетках ЗТЗ и ЗТ6. Цитология. 27(12): 1367-1373.

Соколова И.П., Арнаутов A.M., Никольский Н.Н., Корнилова Е.С. 1998. Исследование ассоциации малой ГТФ-азы Rab7 с эндосомами клеток, экспрессирующих нормальный и мутантные формы рецептора эпидермального фактора роста. Цитология. 40(10): 862-868.

Adam S.A., Sterne Marr R., Gerace L. 1990. Nuclear protein import in permeabilized mammalian cells requires soluble cytoplasmic factors. J. Cell. Biol. 111: 807-816.

Alimandi M., Romano A., Curia M.C., Murano R., Fedi P., Aaronson S.A., DiFiore P.P., Kraus M.H. 1995. Cooperative signalling of ЕгЬВЗ and ErbB2 in neoplasmic transformation and human mammary carcinomas. Oncogene. 10:1813-1821.

Avruch J., Zhang X.F., Kyriakis J.M. 1994. Raf meets Ras: complet-ing the framework of a signal transduction pathway. Trends Biochem. Sci. 19: 279-283.

Bokemeyer D., Sorokin A., Yan M., Ahn N.G., Templeton D.J., Dunn M.J. 1996. Induction of mitogen-activated protein kinase phosphatase 1 by the stress-activated protein kinase signalling

pathway but not by extracellular signal-regulated kinase in fibroblasts. J. Biol. Chem. 271: 639-642.

Brunet A., Roux D., Lenormand P., Dowd S., Keyse S., Pouyssegur J. 1998. Nuclear translocation of p42/p44 mitogen-activated protein kinase is required for growth factor-induced gene expression and cell cycle entry. EMBO J. 18: 664-674.

Carpenter G. 1992. Receptor tyrosine kinase substrates: src homology domains and signal transduction. FASEB J. 6: 3283-3289.

Carraway K.L., Carraway C.A. 1995. Signaling, mitogenesis and the cytoskeleton: where the action is. Bioessays. 17: 171-175.

Chang H., Riese D.J., Gilbert W., Stern D.F., McMahan U.J. 1997. Ligands for ErbB family receptors encoded by a newly-characterized neuregulin-like gene. Nature. 387: 509-512.

Charlesworth A., Rozengurt E. 1997. Bombesin and neuromedin B stimulate the activation of p42(mapk) and p74(raf-1) via a protein kinase C-independent pathway in Rat-1 cells. Oncogene. 14: 2323-2329.

Chen Q., Kinch M.S., Lin T.H., Burridge K., Juliano R.L. 1994. Integrin-mediated cell adhesion activates mitogen-activated protein kinases. J. Biol. Chem. 269: 26602-26605.

Chen R.H., Sarnecki C., Blenis J. 1992. Nuclear localization and regulation of erk- and rsk-encoded protein kinases. Mol. Cell. Biol. 12:915-927.

Chen W.S., Lazar C.S., Poenie M„ Tsien R.Y., Cill G.N., Rosenfeld M.G. 1987. Requirement for intrinsic protein tyrosine kinase in the immediate and late action of the EGF-receptor. Nature. 328: 820-823.

Chen W.S., Lazar C.S., Lund K.A., Weish J.B., Chang C.P., Walton G.M., Der C.J., Wiley T.S., Gill G.N., Rosenfeld M.G. 1989. Functional independence of the epidermal growth factor receptor

from a domain required for ligand-induced internalization and calcium regulation. Cell. 59: 33-43.

Chen W., Martindale J.L., Holbrook N.J., Liu Y. 1998. Tumor promoter arsenite activates extracellular signal-regulated kinase through a signalling pathway mediated by epidermal growth factor receptor and She. Mol. Cell. Biol. 18: 5178-5188.

Chintala S.K., Sawaya R., Aggarwal B.B., Majumder S., Giri D.K., Kyritsis A.P., Gokaslan Z.L., Rao J.S. 1998. Induction of matrix metalloproteinase-9 requires a polymerized actin cytoskeleton in human malignant glioma cells. J. Biol. Chem. 273:13545-13551.

Coker K.J., Staros J.V., Guyer C.A. 1994. A kinase-negative epidermal growth factor receptor that retains the capacity to stimulate DNA synthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 6967-6971.

Coffer P.J., Kruijer W. 1995. EGF receptor deletions define a region specifically mediating STAT transcription factor activation. Biochem. Biophys. Res. Comm. 210: 74-81.

Cohen B.D., Green J.M., Foy L., Fell H.P. 1996. HER4-mediated biological and biochemical properties in NIH3T3 cells. J. Biol. Chem. 271:4813-4818.

Coso O.A., Chiariello M., Yu J.C., Teramoto H., Crespo P., et al. 1995. The small GTP-binding proteins Rac1 and Cdc42 regulate the activity of the JNK/SAPK signaling pathway. Cell. 81: 11371146.

Cowley S., Paterson H., Kemp P., Marshall C.J. 1994. Activation of MAP kinase kinase is necessary and sufficient for PC 12 differentiation and for transformation of NIH 3T3 cells. Cell. 77: 841852.

Daub H., Wallasch C., Lankenau A., Herrlich A., Ulrich A. 1997. Signal characteristic of G protein-transactivated EGF receptor. EMBO J. 16: 7032-7044.

Daub H., Weiss F.U., Wallasch C., Ullrich A. 1996. Role of transactivation of the EGF receptor in signalling by G-protein-coupled receptors. Nature. 379: 557-560.

Davis R.J. 1988. Independent mechanism account for the regulation by PKC of the EGFR affinity and tyrosine kinase activity. J. Biol. Chem. 263: 9462-9469.

Davis R.J. 1993. The mitogen-activated protein kinase signal transduction pathway. J. Biol. Chem. 268: 14553-14556.

Dhanasekaran N., Reddy E., Premkumar P. Signaling by dual specificity kinases. 1998. Oncogene. 17:1447-1455.

Downward J., Parker P., Waterfield M.D. 1984. Autophosphorylation sites on the epidermal growth factor receptor. Nature. 311:483-485.

Elliott G., O'Hare P. 1997. Intercellular trafficking and protein delivery by a herpesvirus structural protein. Cell. 88: 223-233.

Englmeier L., Olivo J.C., Mattaj I.W. 1999. Receptor-mediated substrate translocation through the nuclear pore complex without nucleotide triphosphate hydrolysis. Curr. Biol. 9: 30-41 .

Ferrigno P., Posas F., Koepp D., Saito H., Silver P.A. 1998. Regulated nucleo/cytoplasmic exchange of HOG1 MAPK requires the importin J3 homologs NMD5 and XP01. EMBO J. 17: 5606-5614.

Fleischer S., Kervina M. 1974. Subcellular fractionation of rat liver. Methods Enzymol. 31: 6-41.

Floer M., Blobel G., Rexach M. 1997. Disassembly of RanGTP-karyopherin beta complex, an intermediate in nuclear protein import. J. Biol. Chem. 272: 19538-19546.

Fornerod M., Ohno M., Yoshida M., Mattaj I.W. 1997. Crmlp is an export receptor for leucine rich nuclear export signals. Cell. 90: 1051-1060.

Frost J.A., Steen H., Shapiro P., Lewis T., Ahn N.. Shaw P.E., Cobb M.H. 1997. Cross-cascade activation of ERKs and ternary complex factors by Rho family proteins. EMBO J. 16: 6426-6438.

Fukuda M., Gotoh Y., Nishida E. 1997. Interaction of MAP kinase with MAP kinase kinase: its possible role in the control of nucleocytoplasmic transport of MAP kinase. EMBO J. 16: 19011908.

Gale N.W., Kaplan S., Lowenstein E.J., Schlessinger J. Bar-Sagi D. 1993. Grb2 mediates the EGF-dependent activation of guanine nucleotide exchange on Ras. Nature. 363: 88-92.

Goillot E., Raingeaud J., Ranger A., Tepper R.I., Davis R.J., Harlow E., Sanchez I. 1997. Mitogen-activated protein kinase-mediated Fas apoptotic signalling pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 3302-3307.

Gorlich D. 1998. Transport into and out of the cell nucleus. EMBO J. 17: 2721-2727.

Gorlich D., Mattaj I.W. 1996. Nuclearcytoplasmic transport. Science. 271: 1513-1518.

Gorlich D., Prehn S., Laskey R.A., Hartmann E. 1994. Isolation of a protein that is essential for the first step of nuclear protein import. Cell. 79: 767-778.

Gotoh Y., Nishida E., Sakai H. 1990. Okadaic acid activates microtubule-associated protein kinase in quiescent fibroblastic cells. Eur. J. Biochem. 193: 671-674.

Graus-Porta D., Beerli R.R., Daly J.M., Hynes N.E. 1997. ErbB2, the preferred heterodimerization partner of all erbB receptors, is a mediator of lateral signalling. EMBO J. 16:1647-1655.

Guyton K.Z., Liu Y., Gorospe M„ Xu Q., Holbrook N.J. 1996. Activation of mitogen-activated protein kinase by H202. Role in cell survival following oxidant injury. J. Biol. Chem. 271: 4138-4142.

Heldin C.H. 1995. Dimerization of cell surface receptors in signal transduction. Cell. 80: 213-223.

Hill C.S., Wynne J., Treisman R. 1995. The Rho family GTPases RhoA, Rac1, and CDC42Hs regulate transcriptional activation by SRF. Cell. 81: 1159-1170.

Hirano M., Osada S., Aoki T., Hirai S., Hosaka M., Inoue J., OhnoS. 1996. MEK kinase is involved in tumor necrosis factor alpha-induced NF-kB activation and degradation of IkB-a. J. Biol. Chem. 71: 13234-13238.

Honneger A.M., Dull T.J., Felder S., Van Obberghen E., Bellot F., Szapary D., Schmidt A., Ullrich A., Schlessinger J. 1987. Point mutation at the ATP-binding site of EGF receptor abolishes proteintyrosine kinase activity and altered cellular routing. Cell. 51: 199-209.

Huang C-X.F., Ferrell J.E. 1997. Ultrasensitivity in the mitogen-activated protein kinase cascade. Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 10078-10083.

Huang R.P., Wu J.X., Fan Y., Adamson E.D. 1996. UV activates growth factor receptors via reactive oxygen intermediates. J. Cell Biol. 133:211-220.

Hynes N.E., Stem D.F. 1994. The biology of erbB2/neu/HER2 and its role in cancer. Biochem. Biophys. Acta. 1198: 165-184.

Ishizaki T., Naito M., Fujisawa K., Maekawa M., Watanabe N., et al. 1997. p160ROCK, a Rho-associated coiled-coil forming protein kinase, works downstream of Rho and induces focal adhesions. FEBS Lett. 404:118-124.

Jaaro H., Rubinfeld H., Hanoch T., Seger R. 1997. Nuclear translocation of mitogen-activated protein kinase kinase (MEK1) in response to mitogenic stimulation. Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 37423747.

Kalab P., Kubiak J.Z., Verlhac M.H., Colledge W.H., Maro B. 1996. Activation of p90rsk during meiotic maturation and first mitosis in mouse oocytes and eggs: MAP kinase-independent and -dependent activation. Development. 122: 1957-1964.

Karunagaran D., Tzahar E., Beerli R., Chen X., Graus-Porta D., Ratzkin B.J., Seger R., Hynes N.E., Yarden Y. 1996. ErbB-2 is a common auxiliary subunit of NDF and EGF receptors: Implications for breast cancer. EMBO J. 15: 254-264.

Kashles 0., Szapary D., Bellot F., Ullrich A., Schlessinger J., Schmidt A. 1988. Ligand-induced stimulation of epidermal growth factor receptor mutants with altered transmembrane regions. Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 9567-9571.

Kim B., Feldman E.L. 1998. Differential regulation of focal adhesion kinase and mitogen-activated protein kinase tyrosine phosphorylation during insulin-like growth factor-l-mediated cytoskeletal reorganization. J. Neurochem. 71: 1333-1336.

Klemm J.D., Schreiber S.L., Crabtree G.R. 1998. Dimerization as a regulatory mechanism in signal transduction. Annu. Rev. Immunol. 16: 569-592.

KolchW., Heidecker G., Kochs G., Hummel R., Vahidi H., Mischak Finkenzeller G., Marme D., Rapp U.R. 1993. Protein kinase C alpha activates RAF-1 by direct phosphorylation. Nature. 364: 249-252.

Kozma R., Ahmed S., Best A., Lim L. 1996. The GTPase-activating protein n-chimaerin cooperates with Rac1 and Cdc42Hs to induce the formation of lamellipodia and filopodia. Mol. Cell. Biol. 16: 5069-5080.

Kutay U„ Bischoff F.R., Kostka S., Kraft R., Gorlich D. 1997. Export of importin a from the nucleus is mediated by a specific nuclear transport factor. Cell. 90: 1061-1071.

Kyriakis J.M., App H., Zhang X-F., Banerjee P., Brautigan D.L., Rapp U.R., Avruch J. 1992. Raf-1 activates MAP kinase-kinase. Nature. 358:417-421.

Lander H.M., Jacovina A.T., Davis R.J., Tauras J.M. 1996. Differential activation of mitogen-activated protein kinases by nitric oxide-related species. J. Biol. Chem. 271: 19705-19709.

Leblanc V., Tocque B., Delumeau I. 1998. Ras-GAP controls Rho-mediated cytoskeletal reorganization through its SH3 domain. Mol. Cell. Biol. 18: 5567-5578.

Lee F.S., Hagler J., Chen Z.J., Maniatis T. 1997. Activation of the IkBa kinase complex by MEKK1, a kinase of the JNK pathway. Cell. 88: 213-222.

Lee S., Chen D.Y.T., Humphrey J.S., Gnarra J.R., Linehan W.M., Klausner R.D. 1996. Nuclear/cytoplasmic localization of the von Hippel-Landau tumor supressor gene product is determined by cell density. Proc. Natl. Acad. Sci. 93:1770-1775.

Lemmon M.A., Bu Z., Ladburry J.E., Zhou M., Pinchasi D., Lax I., Engelman D.M., Schlessinger J. 1997. Two EGF molecules contribute additively to stabilization of the EGFR dimer. EMBO J. 16: 281-294.

Li N., Schlessinger J., Margolis B. 1994. Autophosphorylation mutants of the EGF-receptor signal through auxiliary mechanisms involving SH2 domain proteins. Oncogene. 9: 3457-3465.

Liu B.P., Chrzanowska-Wodnicka M., Burridge K. 1998. Microtubule depolymerization induces stress fibers, focal adhesions, and DNA synthesis via the GTP-binding protein Rho. Cell Adhes. Commun. 5: 249-255.

Luttrell L.M., Delia Rocca G.J., van Biesen T., Luttrell D.K., Lefkowitz R.J. 1997. Gpy subunits mediate Src-dependent phosphorylation of the epidermal growth factor receptor. J. Biol. Chem. 272: 4637-4644.

McCawley L.J., Li S., Wattenberg E.V., Hudson L.G. 1999. Sustained activation of the mitogen-activated protein kinase pathway. A mechanism underlying receptor tyrosine kinase specificity for matrix metalloproteinase-9 induction and cell migration. J. Biol. Chem. 274: 4347-4353.

Maher P.A. Nuclear translocation of fibroblast growth factor (FGF) receptors in response to FGF-2. J. Cell Biol. 1996. 134: 529536.

Maloney J.A., Tsygankova O., Szot A., Yang L., Li Q., Williamson J.R. 1998. Differential translocation of protein kinase C isoformes by phorbol ester, EGF, and ANGII in rat liver WB cells. Am. J. Cell Phisiol. 274: 974-982.

Mansour S.J., Matten W.T., Hermann A.S., Candia J.M., Rong S., Fukasawa K., Vande W.G., Ahn N.G. 1994. Transformation of mammalian cells by constitutively active MAP kinase kinase. Science. 265: 966-970.

Margolis B., Rhee S.G., Felder S., Mervic M., Lyall R., Levitzki A., Ullrich A., Zilberstein A., Schlessinger J. 1989. EGF induces tyrosine phosphorylation of phospholipase C—II: a potential mechanism for EGF receptor signaling. Cell. 57: 1101-1107.

Marshall K. 1994. The MAPK cascade. Curr. Op. Gen. Devel. 4: 82-90.

Mizukami Y., Yoshioka K., Morimoto S., Yoshida K. 1997. A novel mechanism of JNK1 activation. Nuclear translocation and activation of JNK1 during ischemia and reperfusion. J. Biol. Chem. 272: 16657-16662.

Nakielny S., Dreyfuss G. 1998. Import and export of the nuclear protein import receptor transports by a mechanism independent of GTP hydrolysis. Curr. Biol. 8: 89-95.

Nobes C.D., Hall A. 1995. Rho, rac, and cdc42 GTPases regulate the assembly of multimolecular focal complexes associated with actin stress fibers, lamellipodia, and filopodia. Cell. 81: 53-62.

Pemberton L.F., Blobel G., Rosenblum J.S. 1998. Transport routes through the nuclear pore complex. Curr. Op. Cell Biol. 10: 392-399.

Perona R., Montaner S., Saniger L., Sanchez-Perez I., Bravo R., Lacal J.C. 1997. Activation of the nuclear factor NFkB by Rho, CDC42, and Rac-1 proteins. Genes Dev. 11: 463-475.

Porfiri E., McCormick F. 1996. Regulation of epidermal growth factor receptor signaling by phosphorylation of the ras exchange factor hSOS1. J. Biol. Chem. 271: 5871-5877.

Pumiglia K.M., Decker S.J. 1997. Cell cycle arrest mediated by the MEK/mitogen-activated protein kinase pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 448-452.

Radu A., Blobel G., Moore M.S. 1995. Identification of a protein complex that is required for nuclear protein import and mediates docking of import substrate to distinct nucleoporins. Proc. Natl. Acad. Sci. 92: 1769-1773.

Ray L.B., Sturgill T.W. 1987. Rapid stimulation by insulin of a serine/threonine kinase in 3T3-L1 adipocytes that phosphorylates microtubule-associated protein 2 in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 1502-1506.

Ren X.D., Kiosses W.B., Schwartz M.A. 1999. Regulation of the small GTP-binding protein Rho by cell adhesion and the cytoskeleton. EMBO J. 18: 578-585.

Renshaw M.W., Ren X-D., Schwartz M.A. 1997. Growth factor activation of MAP kinase requires cell adhesion. EMBO J. 16: 55925599.

Reszka A.A., Bulinski J.C., Krebs E.G., Fischer E.H. 1997. Mitogen-activated protein kinase/etracellular signal-regulated kinase

2 regulates cytoskeletal organization and chemotaxis via catalytic and microtubule-specific interactions. Mol. Biol. Cell. 8: 1219-1232.

Rexach M., Blobel G. 1995. Protein import into nuclei: association and dissociation reactions involving transport substrate, transport factors and nucleoporins. Cell. 83: 683-692.

Ribbeck K., Kutay U., Paraskeva E., Gorlich D. 1999. The translocation of transportin-cargo complexes through nuclear pores is independent of both ran and energy. Curr. Biol. 9: 47-50.

Riese D.J., Bermingham Y., van Raaij T.M., Buckley S., Plowman G.D., Stern D.F. 1996. Betacellulin activates the epidermal growth factor receptor and ErbB4, and induces cellular response patterns distinct from those stimulated by epidermal growth factor or neuregulin-p. Oncogene. 12: 345-353.

Riese D.J., Stern D.F. 1998. Specificity within the EGF family/ErbB receptor family signalling network. BioEssays. 20: 41-48. J Cell Biol 1995 Mar; 128(6): 1111-9

Romero F., Ramos-Morales F., Domínguez A., Rios R.M., Schweighoffer F., Tocque B., Pintor-Toro J.A., Fischer S., Tortolero M. 1998. Grb2 and its apoptotic isoform Grb3-3 associate with heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C, and these interactions are modulated by poly(U) RNA. J. Biol. Chem. 273: 7776-7781.

Rosette C., Karin M. 1995. Cytoskeletal control of gene expression: depolymerization of microtubules activates NF-kappa B. J. Cell Biol. 128: 1111-1119.

Rosette C., Karin M. 1996. Ultraviolet light and osmotic stress: activation of the JNK cascade through multiple growth factor and cytokine receptors. Science. 274: 1194-1197.

Sano M., Kohno M., Iwanaga M. 1995. The activation and nuclear translocation of extracellular signal-regulated kinases (ERK-1 and -2) appear not to be required for elongation of neurites in PC12D cells. Brain Res. 688: 213-218.

Sauma S., Huang F., Winawer S., Friedman E. 1995. Colon goblet cells lose proliferative response to TGF alpha as they differentiate. Int. J. Cancer. 61: 848-853.

Scherf U., Kalab P., Dasso M., Pastan I., Brinkmann U. 1998. The hCSE1/CAS protein is phosphorylated by HeLa extracts and MEK-1: MEK-1 phosphorylation may modulate the intracellular localization of CAS. Biochem. Biophys. Res. Commun. 250: 623-628.

Schlaepfer D.D., Jones K.C., Hunter T. 1998. Multiple Grb2-mediated integrin-stimulated signalling pathways to ERK2/mitogen-activated protein kinase: summation of both c-Src- and FAK-initiated tyrosine phosphorylation events. Mol. Cell. Biol. 18: 2571-2585.

Schmalz D., Hucho F., Buchner K. 1998. Nuclear import of protein kinase C occurs by a mechanism distinct from the mechanism used by proteins with a classical nuclear localization signal. J. Cell Sci. 111: 1823-1830.

Schmalz D., Kalkbrenner F., Hucho F., Buchner K. 1996. Transport of protein kinase C alpha into the nucleus requires intact cytoskeleton while the transport of a protein containing a canonical nuclear localization signal does not. J. Cell Sci. 109: 2401-2406.

Schmid-Alliana A., Menou L., Manie S., Schmid-Antomarchi H., Millet M.A., Giuriato S.( Ferrua B., Rossi B. 1998. Microtubule integrity regulates src-like and extracellular signal-regulated kinase activities in human pro-monocytic cells. Importance for interleukin-1 production. J. Biol. Chem. 273: 3394-3400.

Schmidt A., Hall M.N. 1998. Signalling to the actin cytoskeleton. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 14: 305-338.

Seedorf M., Silver P.A. 1997. Importin/karyopherin protein family members required for mRNA export from the nucleus. Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 8590-8595.

Segal M., Willumsen B.M. Levitzki A. 1993. Residues crucial for Ras interaction with GDP-GTP exchangers. Proc. Natl. Acad. Sci. 90: 5564-5568.

Seufferlein T., Withers D.J., Mann D., Rozengurt E. 1996. Dissociation of mitogen-activated protein kinase activation from p125 focal adhesion kinase tyrosine phosphorylation in Swiss 3T3 cells stimulated by bombesin, lysophosphatidic acid, and platelet-derived growth factor. Mol. Biol. Cell. 7:1865-1875.

Shtil A.A., Mandlekar S., Yu R„ Walter R.J., Hagen K., Tan T.H., Roninson I.B., Kong A.N. 1999. Differential regulation of mitogen-activated protein kinases by microtubule-binding agents in human breast cancer cells. Oncogene. 18: 377-384.

Siomi M.C., Eder P.S., Kataoka N.. Wan L., Liu Q., Dreyfuss G. 1997. Transportin-mediated nuclear import of heterogeneous nuclear RNP proteins. J. Cell Biol. 138: 1181-1192.

Sliwkowski M.X., Schaefer G., Akita R.W., Lofgren J.A., Fitzpatrick V.D., Nuijens A., Fendly B.M., Cerione R.A., Vandlen R.L., Carraway K.L. 1994. Coexpression of erbB2 and erbB3 proteins reconstitutes a high affinity receptor for heregulin. J. Biol. Chem. 269: 14661-14665.

Sodeik B., Ebersold M.W., Helenius A. 1997. Microtubule-mediated transport of incoming herpes simplex virus 1 capsids to the nucleus. J. Cell. Biol. 136: 1007-1021.

Soderquist A.M., Carpenter G. 1984. Glycosylation of the epidermal growth factor receptor in A-431 cells. The contribution of carbohydrate to receptor function. J. Biol. Chem. 259: 12586-12594 .

Soh J.W., Lee E.H., Prywes R., Weinstein I.B. 1999. Novel roles of specific isoforms of protein kinase C in activation of the c-fos serum response element. Mol. Cell. Biol. 19: 1313-1324.

Spencer W., Kwon H., Crepieux P., Leclerc N., Lin R., Hiscott J. 1999. Taxol selectively blocks microtubule dependent NF-kappaB

activation by phorbol ester via inhibition of IkappaBalpha phosphorylation and degradation. Oncogene. 18: 495-505.

Stern D.F., Kamps MP. 1988. EGF-stimulated tyrosine phosphorylation of p185neu: A potentional model for receptor interactions. EMBO J. 7: 995-1001.

Strahl T., Gille H., Shaw P.E. 1996. Selective response of ternary complex factor Sapla to different mitogen-activated protein kinase subgroups. Proc. Natl. Acad. Sci. 93:11563-11568.

Tsakiridis T., Wang Q., Taha C., Grinstein S., Downey G., Klip A. 1997. Involvement of the actin network in insulin signalling. Soc. Gen. Physiol. Ser. 52: 257-271.

Truant R., Cullen B. R. 1999. The arginine-rich domains present in human immunodeficiency virus type 1 Tat and Rev function as direct importin -dependent nuclear localization signals. Mol. Cell. Biol. 19: 1210-1217.

Ullrich A., Schlessinger J. 1990. Signal transduction by receptors with tyrosine kinase activity. Cell. 61: 203-212.

Villa A., Podini P., Panzeri M.C., Seling H.D., Volpe P., Meldolesi J. 1993. The endoplasmic-sarcoplasmic reticulum of smooth muscle: immunocytochemistry of vas deferens fibers reveals specialized subcompartments differently equipped for the control of Ca2+ homeostasis. J. Cell Biol. 121: 1041-1051.

Vincent S., Settleman J.. 1997. The PRK2 kinase is a potential effector target of both Rho and Rac GTPases and regulates actin cytoskeletal organization. Mol. Cell. Biol. 17: 2247-2256.

Wang X., Flynn A., Waskiewicz A.J., Webb B.L., Vries R.G., Baines I.A., Cooper J.A., Proud C.G. 1998. The phosphorylation of eukaryotic initiation factor elF4E in response to phorbol esters, cell stresses, and cytokines is mediated by distinct MAP kinase pathways. J. Biol. Chem. 273: 9373-9377.

Watanabe N.. Madaule P., Reid T., Ishizaki T., Watanabe G., et al. 1997. p140mDia, a mam-malian homolog of Drosophila diaphanous, is a target protein for Rho small GTPase and is a ligand for profilin. EMBO J. 16: 3044-3056.

Wright J.D., Reuter C.W., Weber M.J. 1995. An incomplete program of cellular tyrosine phosphorylations induced by kinase-defective epidermal growth factor receptors. J. Biol. Chem. 270: 12085-12093.

Yin M.-J., Christerson L.B., Yamamoto Y., Kwak Y.-T., Xu S., Mercurio F., Barbosa M., Cobb M.H., Gaynor R.B. 1998. HTLV-1 Tax protein binds to MEKK1 to stimulate IkB kinase activity and NF-kB activation. Cell. 93: 875-884.

Yoon Y., Pitts K.R., Dahan S„ McNiven M.A. 1998. A novel dynamin-like protein associates with cytoplasmic vesicles and tubules of the endoplasmic reticulum in mammalian cells. J. Cell Biol. 140: 779-793.

Zanke B.W., Rubie E.A., Winnett E., Chan J., Randall S., Parsons M., Boudreau K., Mclnnis M., Yan M., Templeton D.J., Woodgett J.R. 1996. Mammalian mitogen-activated protein kinase pathways are regulated through formation of specific kinase-activator complexes. J. Biol. Chem. 271: 29876-29881.

Zheng C.F., Guan K.L. 1994. Cytoplasmic localization of the mitogen-activated protein kinase activator MEK. J. Biol. Chem. 269: 19947-19952.

В заключение хочу выразить искреннюю благодарность моему научному руководителю - Николаю Николаевичу Никольскому за чуткое руководство и помощь в написании этой работы, а также за внесение здорового пессимизма в мой нездоровый оптимизм.

Особую благодарность и признательность хочу выразить моей жене и другу Ире Арнаутовой за моральную поддержку и чувство русского языка.

Также хочу поблагодарить всех сотрудников лаборатории физиологии клеточного цикла за помощь в работе.

Огромное спасибо хочу сказать моим родителям и всем близким за их заботу и понимание сложностей работы в науке.