Альфа-субъединица РНК-полимеразы Е.coli как потенциальный модулятор транскрипции тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Пуртов, Юрий Александрович

• Пуртов, Юрий Александрович
• кандидат биологических наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Пуртов, Юрий Александрович

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Общая характеристика структурных и функциональных свойств ДНК-зависимой РНК-полимеразы Е. coli

2. Особенности нуклеотидной последовательности промотора

3. Образование транскрипционных комплексов

РНК-полимеразы с промотором

4. Структурные и функциональные свойства а-субъединицы РНК-полимеразы

5. Топология мест связывания а-субьединиц с промоторной ДНК

6. Участие а в формировании тройных комплексов с белками-активаторами.

7. Общая характеристика структуры комплекса а-субъединицы с промоторной ДНК

8. Взаимодействие свободной а-субъединицы РНК-полимеразы E.coli с ДНК 30 а-субъединица РНК-полимеразы как потенциальный модулятор транскрипции (заключение и постановка задачи) 32 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 3 5 РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Свободная а-субъединица РНК-полимеразы может взаимодействовать с промотором T7D и влиять на его матричные свойства.

2. Комплексообразование свободной а-субьединицы с ДНК зависит от нуклеотидной последовательности в области контакта.

3. Избыток в клетках E.coli а-субъединицы, способной взаимодействовать с ДНК, влияет на экспрессию многих генов. S

4. Свободные димеры а-субъединицы влияют на активность промоторов fcs vifep&-V2 in vitro.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Альфа-субъединица РНК-полимеразы Е.coli как потенциальный модулятор транскрипции»

У E.coli известно множество различных по своей природе механизмов, адаптирующих экспрессию генома к изменяющимся условиям среды. Тем не менее, детальное изучение способов регуляции индивидуальных генов все еще продолжает вскрывать принципиально новые механизмы. Так, например, относительно недавно была обнаружена пост-транскрипционная регуляция экспрессии с помощью антисмысловых РНК. Интерес к механизмам, осуществляющим регуляцию транскрипции, обоснован тем, что именно транскрипция является первым этапом в реализации генетической информации. В настоящее время накоплен фактический материал, описывающий структурно-функциональные особенности промоторов и РНК-полимеразы, а регуляцию транскрипции принято подразделять на несколько уровней. Одним из важнейших факторов, определяющих эффективность транскрипции конкретного гена, является РНК-полимераза нужного полипептидного состава. В условиях вегетативного роста наиболее представлен фермент, содержащий белковый продукт гена rpoD- Такая полимераза способна взаимодействовать с большинством бактериальных промоторов и транскрибировать почти все гены. Кроме нее, у Е. coli известны еще шесть а-субъединиц: os, 0й, оЕ, с/, а" и о ес. Они заменяют сти в комплексе с кор-ферментом и узнают характерные для них последовательности оснований. Альтернативные о нужны клетке на определенных этапах развития (cts) и в условиях различных стрессов (0е, 0й и os), но и во время нормального роста содержащие их полимеразы транскрибируют ряд оперонов. Относительное содержание разных а определяется эффективностью транскрипции соответствующих генов, стабильностью мРНК и белка и присутствием анти-о-факторов. Гены, высокий уровень экспрессии которых необходим при разных условиях, обычно содержат промоторы нескольких типов.

Помимо альтернативных о, на эффективность транскрипции индивидуальных генов влияют специальные регуляторные белки, которые связываются с РНК-полимеразой и/или со специальными нуклеотидными последовательностями в промоторах. Таких белков у К coli более 200, а набор используемых ими молекулярных механизмов чрезвычайно разнообразен. Он включает простую конкуренцию с полимеразой или другими регуляторными белками за места специфического контакта; стабилизацию образованных комплексов; модификацию структурно-конформационного состояния промотора и др. Уровень синтеза специфических регуляторов транскрипции без индукции обычно низок. При необходимости он возрастает в сотни раз, а размеры контролируемых регулонов варьируют от одного до сотен генов. Причем в их состав могут входить промоторы разных а. Один и тот же регуляторный белок может активировать синтез РНК с одних промоторов и ингибировать с других, взаимодействуя с а-, а-, 0- или (З'-субъединицами РНК-полимеразы или вообще с ними не взаимодействуя.

Продуктивность транскрипции зависит от множества различных по своей природе небелковых соединений (ppGpp, тРНКрше1), от солевого состава цитоплазмы, суперскрученности ДНК, а также от 10-20 ДНК-связывающих белков, упаковывающих ее в относительно компактный нуклеоид. Часть из них обладает специфичностью к определенным последовательностям оснований, другие - к структурным особенностям двойной спирали, а некоторые взаимодействуют с ДНК только неспецифически. Изменяя конформационное состояние ДНК, белки нуклеоида влияют на все ее функциональные свойства. Это влияние может как активировать, так и ингибировать транскрипцию. Белки нуклеоида содержатся в клетке в больших количествах и необходимы для адекватной экспрессии многих генов.

Очевидно, что эффективность регуляторного воздействия зависит от прочности полимераза-промоторного комплекса. Кроме ст-субъединиц, взаимодействующих с консервативными элементами промоторов, эта прочность зависит от ДНК-белковых контактов, формируемых двумя а-субъединицами РНК-полимеразы. Эти субъединицы способны в свободном состоянии избирательно связываться с ДНК, олигомеризоваться и взаимодействовать с регуляторами транскрипции. Мы обратили внимание на эти свойства а-субъединицы и высказали предположение о том, что свободная а сама по себе может влиять на транскрипцию таких генов, которые в своих промоторах имеют мишени для взаимодействия с этими субъединицами. От специфических регуляторов транскрипции а в таком случае будет отличать высокий уровень экспрессии в клетке. От регулирующих транскрипцию структурных белков нуклеоида - специфичность к функциональным участкам промоторов. Настоящая работа посвящена проверке этого предположения.

Актуальность предпринятого нами исследования обусловлена ключевой ролью транскрипции в регуляции клеточного метаболизма и фундаментальной значимостью принципов ДНК-белкового взаимодействия для эффективного управления процессами транскрипции. Полноценное понимание целостной картины невозможно без всестороннего учета всех потенциально значимых регулирующих транскрипцию факторов, одним из которых, как оказалось, является а-субъединицы РНК-полимеразы.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ СТРУКТУРА И СВОЙСТВА а-СУБЪ ЕДИ Н И ЦЫ РНК-ПОЛИМЕР АЗЫ E.coli

Адекватная реализация генетической информации опосредована множеством регуляторных механизмов, оптимизирующих протекание жизненного цикла клетки в соответствии с окружающими условиями. В настоящее время накоплен большой фактический материал, отражающий разнообразие механизмов, контролирующих транскрипцию конкретных генов, стабильность РНК-продукта и трансляцию мРНК. Наибольший интерес традиционно представляют механизмы, действующие на ранних этапах, т.е. влияющие на инициации транскрипции. За счет них происходит избирательная утилизация конкретного гена или группы генов из всего массива генетической информации.

Эффективность регуляторной системы обусловлена, с одной стороны, наличием универсальных механизмов, координировано влияющих на активность генных ансамблей, а с другой- вариабельностью их функциональных проявлений в случае каждого конкретного гена. Одни и те же регуляторные белки на разных генах или в зависимости от кофакторов могут быть как ингибиторами, так и активаторами транскрипции, т.е. выполнять принципиально разную роль. Максимально полная информация о действующих в клетке регуляторных элементах необходима для реконструкции сети функциональных взаимоотношений. Поэтому изучение свойств уже известных регуляторов транскрипции, так же как идентификация новых регуляторных элементов, являются актуальными задачами.

Инициация транскрипции является сложным и многостадийным процессом, начинающимся с обнаружения ДНК-зависимой РНК-полимеразой промоторной последовательности гена и заканчивающимся синтезом первых фосфодиэфирных связей и диссоциацией фактора промоторной специфичности (о-субъединицы) из инициирующего комплекса. Помимо РНК-полимеразы в инициации синтеза РНК задействован целый набор регуляторов различной природы, которые контролируют частоту копирования гена, но специфичность взаимодействия РНК-полимеразы с промотором, т.е. выбор стартовой точки транскрипции, определяется в первую очередь свойствами двух субъединиц фермента (а и о) и особенностями нуклеотидной последовательности промотора. Исходя из этого, целесообразно кратко рассмотреть имеющиеся в настоящее время данные, отражающие особенности строения и функционального взаимодействия промоторов с РНК-полимеразой.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Пуртов, Юрий Александрович

выводы

1. Свободные димеры а-субъединицы РНК-полимеразы E.coli способны взаимодействовать с UP-элементом промотора Т7 D и влиять на формирование транскрипционного комплекса.

2. Характер взаимодействия с аг зависит от нуклеотидной последовательности в области контакта; мишенями для избирательного связывания аг могут быть содержащие C/G-пары участки.

3. Суперпродукция в клетках Exoli а-субъединицы, способной взаимодействовать с ДНК, изменяет экспрессию многих генов.

4. Свободные димеры а-субъединицы могут избирательно связываться с ранней транскрибируемой областью гена fes. Это взаимодействие влияет на формирование комплексов РНК-полимеразы с промоторами /ерА?2 и fes и ингибирует транскрипцию fes. Таким образом, выявлен дополнительный механизм регуляции экспрессии генов, контролирующих транспорт железа в клетках Exoli.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Основной целью данной поисковой работы была оценка регуляторного потенциала свободной а-субъединицы РНК-полимеразы E.coli. Способность а-субъединицы взаимодействовать с ДНК впервые была обнаружена для промотора рибосомного оперона rrnBPl. К моменту начала этой работы были установлены вступающие в контакт структурные модули а-субъединицы и промотора, обнаружена способность аг связываться с rrnBPl и сформулировано представление о том, что распознаваемой мишенью для них являются протяженные А(Т)-треки, создающие особую конфигурацию двойной спирали.

В ходе выполнения данной работы установлено, что свободные димеры а могут избирательно взаимодействовать с UP-элементом промотора Т7Д который не содержит структурообразующих гомонуклеотидных А/Т-треков. Показано, что введение C/G-пары в UP-элемент rrnBPl не препятствует взаимодействию с ферментом. Установлено, что а влияет на связывание РНК-полимеразы с Т7Д причем эффект зависит от того, в каком порядке добавлены а-субъединица и РНК-полимераза. Это указывало на регуляторную функцию свободных димеров а, поэтому была предпринята попытка оценить размер возможного регулона с использованием технологии кДНК-микроматриц.

Около 200 генов Е. coli проявило зависимость от свойств рекомбинантной а, суперпродуцированной в клетках E.coli W3110. Среди них оказалось много генов, транскрибируемых полицистронно. Так как сигналы гибридизации были зарегистрированы с каждого из них независимо, данные о влиянии а на экспрессию таких генов можно считать особенно достоверными. Перспективные для дальнейшего исследования гены fes и fepA были выбраны именно из их числа. Доказано влияние аг на взаимодействие РНК-полимеразы с промоторами этих генов и инициацию синтеза fes-мРНК. В регуляторной области этих генов найден участок избирательного связывания аг (от стартовой точки fes до, по-видимому, конца ААААА-трека, хотя документирована защита только до позиции +22). Его расположение типично для мест связывания репрессоров. Так, например, операторный участок Fur находится в ранней транскрибируемой области ингибируемого им промотора fepAP2 (от -4 до +15, см. Рис. 14), но взаимодействуя с ним, Fur ингибирует экспрессию как fepA, так и fes, а а-субъединицы, в соответствии с полученными данными, дифференцированно влияют на транскрипцию дивергентных генов.

Ген а-субъединицы (гроА) входит в состав оперона, кодирующего рибосомные белки. Он является одним из наиболее экспрессирумых в бактериальной клетке, а содержание аг адаптировано к скорости роста клеток. Содержание rpoA-мРНК в бактериальной клетке составляет 0.18±0.07%. Это больше, чем процентное содержание равных по размеру мРНК cbpA (0.068%), cbpB (0.045%), кодирующих белки нуклеоида, присутствующие в клетках в количестве 150000 и 10000 мономеров, соответственно [Azam et al., 1999]. Таким образом, число свободных димеров а, по-видимому, больше 10000. Приблизительно такую же величину дают иммунные методы анализа [А.Ишихама, персональное сообщение]. Это значит, что один димер аг приходится на ~500 пар оснований в бактериальном геноме, т.е. значительно меньше эффективных концентраций, которые были использованы в опытах in vitro. Тем не менее, способность а взаимодействовать со многими регуляторами транскрипции и олигомеризоваться может повысить ее локальную концентрацию вблизи регуляторных участков генов. Все это позволяет нам думать, что свободная а может быть регулятором транскрипционной активности многих генов.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Пуртов, Юрий Александрович, 2005 год

1. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. (1984) Методы генной инженерии. Молекулярное клонирование, М.: Мир.

2. Озолинь О. Н., Деев А. А. (1998) Неканонические структурные элементы промоторной ДНК и их роль в образовании комплекса с РНК-полимеразой. Молекулярная биология, 32,358-362.

3. Часов В.В., Деев А.А., Масулис И.С., Озолинь О.Н. (2002) А/Т-трек в структуре бактериальных промоторов Ecoli: характер распределения и функциональное значение. Молекулярная биология, 36,682-688.

4. Atlung Т., Ingmer Н. (1997) H-NS: a modulator of environmentally regulated gene expression. Mol. Microbiol., 24,7-17.

5. Azam T.A., Ishihama A. (1999) Twelve species of the nucleoid-associated protein from Escherichia coli. Sequence recognition specificity and DNA binding affinity. J. Biol. Chem., 274,33105-33113.

6. Azam T. A., Iwata A., Nishimura A., UedaS., Ishihama A. (1999) Growth phase-dependent variation in protein composition of the Escherichia coli nucleoid. J. Bacteriol. 1999, 181, 6361-6370.

7. Benoff В., Yang H., Lawson C., Parcinson G., Liu J., Blatter E., Ebright Y., Berman H., Ebright R. (2002) Structural basis of transcription activation: the CAP-aCTD-DNA complex. Science, 297, 1562-1566.

8. Berg D., Barret K., Chamberlin M., (1971) Purification of two forms of E. coli RNA polymerase and of sigma component. In: Meth. Enzymol. Moldave K., Grossmann L. Eds., 21, 506-519, Academic Press, New York.

9. Buc H., McClure W.R. (1985) Kinetic of open complex formation between Escherichia coli RNA polymerase and the lacUVS promoter. Evidence for a sequential mechanism involving three steps. Biochemistry, 24,2712-2723.

10. Campbell EA, Masuda S, Sun JL, Muzzin O, Olson CA, Wang S, Darst SA. (2002) Crystal structure of the Bacillus stearothermophilus anti-sigma factor SpoIIAB with the sporulation sigma factor sigmaF. Cell., 108(6), 795-807.

11. Campbell E. A., Muzzin O., Chlenov M., Sun J. L., Olson A., Weinman O., Trester-Zedlitz M. L., Darst S. A. (2002) Structure of the bacterial RNA polymerase promoter specificity sigma subunit. Mol. Cell, 9,527-539.

12. Cowing D.W., Mecsas J., Record M.T.Jr., Gross C.A. (1989) Intermediates in the formation of the open complex by RNA polymerase holoenzyme containing the sigma factor sigma-32 at the groE promoter. J. Mol. Biol. 210,521-530.

13. Darst S. A., Polyakov A., Pichter C., Zhang G. (1998). Insight into Escherichia coli RNA polimerase 2 of 16 A resolution, Cell, 66,121-128.

14. Dombroski A.J., Walter W.A., Record M.TJr., Siegele D.A. Gross C.A. (1992) Polypeptides containing highly conserved regions of transcription factor cf° exhibit specificity of binding to promoter DNA. Cell, 70, 501-512.

15. Dombroski A. J. (1997) Recognition of the -10 promoter sequence by a partial polypeptide of W° in vitro. J. Biol. Chem. 272,3487-3494.

16. Dombroski A. J., Johnson B.D., Lonetto M., Gross C.A. (1996) The sigma subunit of Escherichia coli RNA polymerase senses promoter spacing. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 8858-8862.

17. Escolar L., Perez-Martin J., de Lorenzo V. (1998) Coordinated repression in vitro of the divergent fepA-fes promoters of Escherichia coli by the iron uptake regulation (Fur) protein. J. Bacteriol., 180,2579-82.

18. Estrem S. Т., Gaal Т., Ross W., Gourse R. L. (1998). Identification of an UP element consensus sequence for bacterial promoters, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95,9761-9766.

19. Fujita N., Ishihama A. (1996). Reconstruction of RNA polimerase, Metods in Enzimology, 273, 121-130.

20. Fujita N, Endo S, Ishihama A. (2000) Structural requirements for the interdomain linker of alpha subunit of Escherichia coli RNA polymerase. Biochemistry. 39, 6243-6249.80

21. Gaal Т., Ross W,. Blatter E. E., Hong Tang, Hin Jia, Krishnan V. V., Assa-Munt N., Ebright R. H., Gourse R. L. (1996). DNA-binding determinations of the a-subunit of RNA-polimerase: novel DNA-binding domain architecture, Genes & Development, 10, 16-26.

22. Geszvain K., Gruber Т., Mooney R., Gross A., Landick R. (2004) A hydrophobic patch on the Flap-tip helix of £ coli RNA polymerase mediates a70 region 4 function, J. Mol. Biol., 343, 569-587.

23. Glass R. E., Jones S. Т., Ishihama A. (1986). Genetic studies on the (3-subunit of Escherichia coli RNA polimerase. IX. The role of carboxy-terminus in enzyme assembly, Mol. Gen. Genet., 203,492-495.

24. Gourse R. L., Ross W., Gaal T. (2000) UPs and downs in bacterial transcription initiation: the role of the alpha subunit of RNA polymerase in promoter recognition, Molecular Microbiology, 37(4), 687-695.

25. Harley C.B., Reynolds R. (1987) Analysis of Escherichia coli promoter sequences. Nucl. Acids Res., 15,2343-2361.

26. Hayward R. S., Igrashi K., Ishihama A. (1991). Functional specialization within the a-subunit of Escherichia coli RNA polimerase, J. Mol. Biol., 221,23-29.

27. Heyduk E., Baichoo N., Heyduk T. (2001) Interaction of the a-subunit of Escherichia coli RNA polymerase. J. Biol Chem., 276,44598^4603.

28. Heyduk Т., Heyduk E., Severinov K., Tang H., Ebright R. (1996) Determinants of RNA polymerase a subunit for interaction with J3, (Г and о subunits: Hydroxyl-radical protein footprinting. Proc. Natl. Acad. Sci USA, 93, 10162-10166.

29. Huang X., Lopes de Saro F.J., Hehnan, J.D. (1997) Sigma factor mutations affecting the siquence-selective interaction of RNA polymerase with -10 region single-stranded DNA. Nucl. Acids Res., 25,2603-2609.

30. Jeon Y. H., Negishi Т., Shirokawa M., Yamazaki Т., Fujita N., Ishihama A., Kyogoky Y. (1995). Solution structure of the activator contact domain of the RNA polymerase alpha subunit, Science, 270, 1495-1497.

31. Kimura M., Ishihama A. (1995). Functional map of the alpha subunit of Escherichia coli RNA polimerase: amino acid substitution within the Amino-terminal assembly domain, J. Mol. Biol, 254,342-349.

32. Knaus, R., Bujard, H. (1988) Pi of coliphage lambda an alternative solution for an efficient promoter. EMBOJ., 7,2919-2923.

33. Kolb A., Igarashi K., Ishihama A., Lavigne M., Bucle M., Buc H. (1993). E. coli RNA polimerase, deleted in the C-terminal part its a-subunits, interacts with the camp-CRP complex at the lacPl and at the galPl promoter, Nucl. Acids Res., 21,319-326.

34. Kubori Т., Shimamoto N. (1996) A branched pathway in the early stage of transcription by Escherichia coli RNA polymerase. J. Mol. Biol., 256,449-57.

35. Maeda H., Fujita N., Ishihama A. (2000) Competition among seven Escherichia coli a subunits: relative binding affinities to the core RNA polymerase Nucl. Acids Res., 28, 3497-3503.

36. Malhotra A., Severinova E., Darst S.A. (1996) Crystal structure of a a70 subunit fragment from Escherichia coli RNA polymerase. Cell, 87, 127-136.

37. Mukheijee K. and Chatteqi D. (1997) Studies of omega subunit of E. coli RNA polymerase- its role in the recovery of denatured enzyme activity, Eur. J. Biochem., 247,884-889.

38. Murakami K., Fujita N., Ishihama A. (1996) Transcription factor recognition surface on the RNA polymerase alpha subunit is involved in contact with the DNA enhancer element. EMBO J. 15,4358-4367.

39. Murakami K., Kimura M., Owens J. Т., Meares C. F., Ishihama A. (1997). The two a subunits of Escherichia coli RNA polimerase are asymmetrically arranged and contact different halves of the DNA upstream element, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94,1709-1714.

40. Murakami K. S., Masuda S., Darst S. A. (2002). Structural basis of transcription initiation: T. aquaticus RNA polimerase holoenzime at 4 A resolution, Science, 296,1280-1284.

41. Murakami K. S., Masuda S., Campbell E. A., Muzzin O., Darst S. A, (2002) Structural basis of transcription initiation: an RNA polymerase holoenzyme-DNA complex. Science, 296, 1285-1290.

42. Negishi Т., Fujita N., Ishihama A., (1995) Structural map of the alpha subunit of E. coli RNA polymerase: structural domains identified by proteolytic cleavage, J. Mol. Biol., 248, 723728.

43. Newlands J.T., Josaitis C.A., Ross W., Gourse R. (1992) Both F/s-dependent and factor independent upstream activation of the rrnBPl promoter are face of the helix dependent. Nucl. Acids Res., 20,719-726.

44. Newman E., Lin R. (1995) Leucine-responsive regulatory protein: a global regulator of gene expression in E. coli. Ann. Rev. Microbiol49,747-775.

45. Niu W., Kim Y., Tau G., Heyduk Т., Ebright R. (1996) Transcription activation at class II CAP-dependent promoters: two interactions between CAP and RNA polymerase. Cell, 87, 11231134.

46. Ozoline O. N., Deev A. A., Arkhipova M. V. (1997) Non-canonical sequence elements in the promoter structure. Cluster analysis of promoters recognased by Escherichia coli RNA polimerase, Nucl. Acids Res., 25,4703-4709.

47. Ozoline O. N., Deev A. A., Arkhipova M. V., Chasov V. V., Travers A. (1999). Proximal transcribed regions of bacterial promoters have a non-random distribution of A/T tracts, Nucl. Acids Res., 27,4768-4774.

48. Ozoline O. N., Fujita N., Murakami K., Ishihama A. (1998). Monitoring of RNA polimerase-DNA UP element interaction by a fluoriscent probe conjugated to a a-subunits, Eur. J. Biochem., 253, 371-381.

49. Ozoline O. N., Fujita N., Ishihama A. (2000), Transcription activation mediated by the Carboxil-terminal domain of the RNA polymerase a-subunit, J. of Biological Chemistry, 275, 11191127.

50. Ozoline O. N., Fujita N. and Ishihama A. (2001). Mode of DNA-protein interaction between the C-terminal domain of Escherichia coli RNA-polimerase a-subunit and T7D promoter UP element, Nucl. Acids Res., 29,4909-4919.

51. Ozoline O. N., Fujita N. and Ishihama A. (2002). Genome-wide expression profiling of Escherichia coli W3110: microarray and statistic analysis of heat shock regulons. In: Bioinformatics of genome regulation and structure, Novosibirsk., 2, 189-191.

52. Ozoline O. Uteshev T. A., Masulis I. S. N., Kamzolova S. G. (1993) Interaction of bacterial RNA-polymerase with two different promoters of phage T7 DNA. Conformational analysis. Biochem. Biophis. Acta., 1172,251-261.

53. Ozoline O. N., Tsyganov M. A. (1995). Structure of open promoter complexes with Escherichia coli RNA polimerase as revealed by the DNAse I footprinting technuque compilation analisys, Nucl. Acids Res., 23,4533-4541.

54. PolyakovA., Severinova E., Darst S.A. (1995) Three-dimensional structure of E.coli RNA polymerase: promoter binding and elongation conformations of the enzyme. Cell, 83, 365373.

55. Pruss G.J.,Drlica K. (1989) DNA supercoiling and prokaryotic transcription. Cell, 56,521-523.

56. Roberts C.W., Roberts J.W. (1996) Base-specific recognition of the nontemplate strand of promoter DNA by Ecoli RNA polymerase. Cell, 86,495-501.

57. Rosenberg S., Kadesch T.R., Chamberlin M.J. (1982) Binding of Escherichia coli RNA polymerase holoenzyme to bacteriophage T7 DNA. Measurements of the rate of open complex formation at T7 promoter Al. J. Mol. Biol., 155, 31-51.

58. Ross W., Gosink К. K., Salomon J., Igarashi K., Zou C., Ishihama A., Severiniv K., Gourse R. L. (1993) A therd recognition element in bacterial promoters: DNA binding by the alpha subunit RNA polymerase, Science, 262,1407-1413.

59. Savery N., Lloyd G., Busby S., Thomas M., Ebright R., Gourse R. (2002) Determinants of the C-terminal domain for transcription at class I cyclic AMP receptor protein-dependent promoters. J. of Вас., 184,2273-2280.

60. Sen R., Nagai H., Shimamoto N. (2000) Polymerase arrest at the lambdaP(R) promoter during transcription initiation. J. Biol. Chem., 275, 10899-10904.

61. Sen R., Nagai H., Shimamoto N. (2001) Conformational switching of Escherichia coli RNA polymerase-promoter binary complex is facilitated by elongation factor GreA and GreB. Genes Cells, 6,389-401.

62. Severinov K., Mustaev A., Severinova E., Bass I., Kashlev M., Landick R., Nikiforov V., Goldfarb A., Darst S.A. (1995) Assembly of functional Escherichia coli RNA polymerase containing beta subunit fragments. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92,4591-4595.

63. Severinova E., Severinov K., Fenew D., Магг M., Brody E. N., Roberts J. W., Chait В. Т., Darst S. A. (1996) Domain organization of the E. coli RNA polymerase sigma subunit, J. Mol. Biol., 263, 637-647.

64. Shao X., Grishin N. V. (2000). Common fold in helix-hairpin-helix proteins, Nucl. Acids Res., 28,2643-2650.

65. Spassky A., Kirkegaard К., Buc H. (1985) Changes in the DNA structure of the lac UV5 promoter during formation of an open complex with Escherichia coli RNA polymerase. Biochemistry, 24,2723-2731.

66. Stefano J.E., Gralla J.D. (1980) Kinetic investigation of the mechanism of RNA polymerase binding to mutant lac promoters. J. Biol. Chem., 255,10423-10430.

67. Straney D.C., Crothers D.M. (1985) Intermediates in transcription initiation from the Escherichia coli lacUVS promoter. Cell, 43,449-459.

68. Susa M, Sen R, Shimamoto N. (2002) Generality of the branched pathway in transcription initiation by Escherichia coli RNA polymerase. J. Biol. Chem., 277, 15407-15412.

69. Tsujikawa L., Tsodikov O., deHaseth P. (2002) Interaction of RNA polymerase with forced DNA: Evidence for two kinetically significant intermediates on the pathey to the final complex. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99,3493-3498.

70. Vassylyev D. G., Sekine S., Laptenko O., Lee J., Vassylyeva M. N., Borukhov S., Yokoyama S. (2002) Crystal structure of a bacterial RNA polymerase holoenzyme at 2.6 A resolution. Nature, 417, 712-719.

71. Wada Т., Yamazaki Т., Kyogoku Y. (2000). The structure and the characteristic DNA binding property of the C-terminal domain of the RNA polimerase a subunit from Thermus thermophilus, NytJornal of Biological Chemistry, 275, 16057-16063.

72. Zaychikov E., Denissova L., Meier M., Gotte M., Heumann H. (1997) Influence of Mg2+ and temperature on formation of the transcription bubble. J. Biol. Chem., 272,2259-2267.

73. Zhang G., Dars, S.A. (1998) Structure of the Escherichia coli RNA polymerase alpha subunit amino-terminal domain. Science, 281,262-266.

74. Zhang G., Campbell E. A., Minachim L., Richter C., Severiniv K., Darst S. (1999). Crystal Structure of Thermus aquaticus core RNA polimerase at 3.3 A Resolution, Cell, 98, 811824.

75. Zillig W., Palm R., Hell A. (1976) Function and reassembly of subunits of DNA-dependent RNA-polymerase. In: RNA polymerase (ed Losick and Chamberlin), Cold Spring Harbor., 101-125.

76. Также хотелось бы высказать благодарность сотрудникам нашей группы Масулис Ирине Станиславовне и Часову Виталию Васильевичу за поддержку и бесценные советы при освоении методик и написании этой работы.

77. Хотелось бы отдельно поблагодарить всех сотрудников нашей группы за ту необыкновенную атмосферу в коллективе, делающую работу в нем настолько приятной и плодотворной.

78. Особую благодарность хотелось бы выразить Смолихиной Татьяне Ивановне за внимательное отношение и четкую организацию при защите этой работы.

79. Отдельно хотелось бы поблагодарить всех моих друзей за сопереживание и поддержку.