Ферментативное определение цинка и магния на основе их действия на щелочные фосфатазы различного происхождения тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.02, кандидат химических наук Жаворонкова, Анна Михайловна

• Жаворонкова, Анна Михайловна
• кандидат химических наук
• 2004

Оглавление диссертации кандидат химических наук Жаворонкова, Анна Михайловна

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Источники, структура, физико-химические характеристики и механизм действия щелочных фосфатаз бактериального и животного происхождения.

1.1. Источники щелочных фосфатаз.

1.2. Структура и аминокислотный состав щелочных фосфатаз. II

1.3. Роль ионов металлов в структуре и каталитической активности щелочных фосфатаз.

1.4. Механизм действия щелочных фосфатаз.

1.5. Субстратная специфичность щелочных фосфатаз.

Глава 2. Влияние ионов металлов на каталитическую активность щелочных фосфатаз различного происхождения и их апоферментов.

2.1. Влияние ионов металлов на активность бактериальных и животных щелочных фосфатаз.

2.2. Влияние ионов металлов на апоферменты бактериальных и животных щелочных фосфатаз.

Глава 3. Роль цинка и магния в биологических объектах и методы их определения.

3.1. Значение цинка для организма человека, контроль его содержаний.

3.1.1. Биологическая роль цинка.

3.1.2. Методы определения цинка (II) в биологических жидкостях.

3.2. Значение магния для организма человека, контроль его содержаний.

3.2.1. Биологическая роль магния.

3.2.2. Методы определения магния (II) в биологических жидкостях 67 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 4. Исходные вещества, посуда, аппаратура, методика 4 эксперимента, обработка результатов измерений. щ 4.1. Исходные вещества.

4.2. Посуда и аппаратура.

4.3. Методика эксперимента.

4.4. Обработка результатов измерений.

Глава 5. Выбор фермента, индикаторной реакции и оптимальных условий ее проведения.

5.1. Выбор фермента.

5.2. Выбор индикаторной системы.

5.3. Выяснение оптимальных условий проведения индикаторной реакции.

Глава 6. Влияние ионов металлов на каталитическую активность щелочных фосфатаз, выделенных из различных источников

6.1. Влияние ионов цинка на каталитическую активность щелочных фосфатаз, выделенных из трех различных источников.

6.1.1. Выяснение типа ингибирования щелочных фосфатаз ионами цинка.

• 6.1.2. Влияние ионов металлов на каталитическую активность щелочных фосфатаз различного происхождения.

6.2. Влияние ионов цинка на каталитическую активность щелочной фосфатазы из кишки тюленя в различных буферных растворах.

6.3. Влияние ионов магния на каталитическую активность трех щелочных фосфатаз.

6.4. Совместное влияние ионов металлов на каталитическую активность щелочной фосфатазы из кишки тюленя в различных буферных растворах.

Глава 7. Выбор оптимальных условий получения апоферментов щелочных фосфатаз.

7.1. Влияние ЭДТА на каталитическую активность щелочных фосфатаз.

7.2. Влияиис органических соединений различных классов на каталитическую активность щелочной фосфатазы из кишки тюленя.

7.3. Получение истинного апофермента щелочной фосфатазы из кишки тюленя с использованием диализа.

7.3.1. Выбор оптимальных условий получения апофермента щелочной фосфатазы из кишки тюленя.

Глава 8. Реактивирование апоферментов щелочных фосфатаз из кишечника цыпленка и кишки тюленя ионами металлов.

8.1. Реактивирование апоферментов, полученных с использованием ЭДТА.

8.1.1. Изучение влияния на апоферменты ионов цинка и ряда других металлов.

8.1.2. Изучение влияния ионов магния и кальция на апофосфатазу из кишки тюленя.

8.1.3. Реактивирование апофосфатазы из кишки тюленя, полученной диализом.

8.2. Реактивирование апоферментов, полученных с использованием нитрилотриметиленфосфоновой кислоты

Глава 9. Разработка методики определения цинка (II) по его • реактивирующему действию на апофосфатазу из кишки тюленя.

Глава 10. Ферментативные методики определения цинка (II) и магния

II) в биологических объектах.

10.1. Определение цинка (II) в сыворотке крови по реактивированию апофермента щелочной фосфатазы из кишки тюленя.

10.2. Определение магния (II) в моче по его активирующему действию на каталитическую активность щелочной фосфатазы из кишечника цыпленка.

10.2.1. Подготовка проб мочи к анализу.

10.2.2. Методика определения магния в моче.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Ферментативное определение цинка и магния на основе их действия на щелочные фосфатазы различного происхождения»

Одной из многих медико-биологических проблем, стоящих перед современными методами химического анализа, является контроль содержания в организме человека определенных макро- и микроэлементов, особенно магния и цинка, необходимых для нормального протекания многих биохимических реакций и физиологических процессов. В связи с этим актуальна разработка высокочувствительных и высокоселективных методов определения ионов указанных металлов в биологических объектах, в частности крови и моче.

Для решения этой задачи весьма перспективно использование ферментов, выделенных из различных источников и содержащих в активных центрах одновременно ионы обоих металлов - цинка и магния. Использование различий в доступности металлсвязывающих центров, в аминокислотной последовательности и каталитических свойствах металлоферментов различного происхождения может позволить направленно изменять чувствительность и селективность ферментативных методов определения ионов металлов-кофакторов в различных биологических объектах.

В этом плане особенно интересны гидролазы, в частности щелочные фосфатазы из Е.соН, кишечника цыпленка и тонкой кишки гренландского тюленя, как активные, стабильные, коммерческие препараты ферментов, содержащие в каталитических и аллоетерических центрах ионы цинка и магния соответственно. Сравнительное изучение влияния ионов металлов, в особенности цинка и магния, на каталитическую активность этих ферментов с целью разработки ферментативных методик определения ионов металлов-кофакторов до настоящего времени не проводилось. Щелочная фосфатаза, выделенная из тонкой кишки гренландского тюленя, в аналитических целях ранее не использовалась.

Систематическое исследование действия ионов металлов на каталитическую активность указанных щелочных фосфатаз может позволить не только выявить ферменты, наиболее перспективные для разработки чувствительных и селективных методик определения цинка и магния в различных объектах, особенно биологических, но и использовать подходы, выработанные на примере щелочных фосфатаз различного происхождения, для расширения областей использования в химическом анализе других металлоферментов, содержащих в каталитическом и аллостерическом центрах ионы металлов различной природы.

Все сказанное дает основание считать создание и развитие ферментативных методов определения металлов-кофакторов актуальным и перспективным направлением.

Цели настоящей работы:

- установление характера и степени влияния ионов цинка и магния на каталитическую активность щелочных фосфатаз, выделенных из трёх различных источников: кишечной палочки Е. coli, кишечника цыпленка, тонкой кишки гренландского тюленя;

- выбор препаратов ферментов, наиболее перспективных с аналитической точки зрения;

- разработка с их использованием высокочувствительных и селективных методик определения цинка и магния на основе их различного действия на каталитическую активность щелочных фосфатаз и их апоферментов;

- применение разработанных методик в анализе биологических объектов.

Научная новизна заключается в том, что впервые на примере щелочных фосфатаз различного происхождения предложены приемы многопланового использования в химическом анализе ферментов, содержащих в каталитическом и аллостерическом центрах ионы различных металлов (цинка и магния); впервые в аналитических целях использована щелочная фосфатаза, выделенная из тонкой кишки гренландского тюленя; выяснены оптимальные условия получения и реактивирования ее апофермента; с целью выяснения перспектив использования в химическом анализе бактериальной и животных щелочных фосфатаз различного олигомерного состава проведено систематическое сравнительное изучение каталитических свойств этих ферментов: чувствительности к действию эффекторов (ионов металлов и органических соединений разных классов); стабильности в буферных растворах различной природы: неорганической - боратном и карбонатном, и органической - глициновом и трис-HCl; разработаны приемы направленного изменения чувствительности и селективности определения цинка и магния: применение щелочных фосфатаз, выделенных из различных источников; проведение ферментативного гидролиза л-нитрофенилфосфата в буферных растворах различной природы; использование различных эффектов: ингибирования (для определения цинка) и активирования фермента (для определения магния), реактивирования апофермента (для определения цинка в присутствии магния); применение либератавного действия ионов металла на фермент, ингибированный органическим лигандом (для определения магния).

Практическую значимость имеют

• селективные методики определения цинка по его ингибирующему действию на каталитическую активность щелочной фосфатазы из тонкой кишки гренландского тюленя в реакции гидролиза л-нитрофенилфосфата в боратном (с„=10 нг/мл) и трис-НС1 (с„=1 мкг/мл) буферных растворах;

• селективная и высокочувствительная методика определения магния по его активирующему действию на каталитическую активность щелочной фосфатазы из кишечника цыпленка в реакции гидролиза п-нитрофенилфосфата (с„=0.6 нг/мл);

• методика получения апофермента щелочной фосфатазы из тонкой кишки гренландского тюленя с использованием ЭДТА;

• селективная и высокочувствительная методика определения цинка по его реактивирующему действию на апофосфатазу из тонкой кишки гренландского тюленя (сн= 10 нг/мл);

• методика определения цинка в сыворотке крови человека;

• методика определения магния в моче человека;

• рекомендации по выбору препарата щелочной фосфатазы для определения ферментативным методом магния в присутствии цинка и цинка в присутствии магния; цинка в присутствии ионов кобальта, меди, кадмия и никеля; магния в присутствии кальция.

Автор выносит на защиту:

1. Результаты систематического сравнительного изучения каталитических свойств щелочных фосфатаз разного происхождения в буферных растворах различной природы (органической и неорганической) в реакции гидролиза л-нитрофенилфосфата в отсутствие и в присутствии ионов металлов: цинка и магния, а также кобальта, никеля, кадмия, меди, железа, свинца, ртути, кальция, бария, натрия, калия, цезия (при индивидуальном и совместном с цинком присутствии).

2. Результаты, полученные в ходе: исследования влияния широкого круга органических соединений на каталитическую активность щелочной фосфатазы из тонкой кишки гренландского тюленя с целыо выявления ее наиболее эффективных ингибиторов; выбора подходов к получению апоферментов щелочных фосфатаз из трех источников и выяснения оптимальных условий проведения диализа щелочной фосфатазы из топкой кишки гренландского тюленя; изучения возможности реактивирования апофосфатаз животного происхождения, полученных с использованием ЭДТА, ионами цинка и магния, а также кобальта, меди, никеля', кадмия и кальция; исследования действия магния и кальция на щелочную фосфатазу из тонкой кишки гренландского тюленя в присутствии нитрилтриметиленфосфоновой кислоты.

3. Ферментативные методики определения: цинка по его ингибирующему действию на каталитическую активность щелочной фосфатазы из тонкой кишки гренландского тюленя в различных буферных растворах; магния по его активирующему действию на каталитическую активность щелочной фосфатазы из кишечника цыпленка; цинка по его реактивирующему действию на апофосфатазу из тонкой кишки гренландского тюленя.

4. Результаты определения магния в образцах мочи; цинка - в образцах сыворотки крови человека.

Апробация работы. Основные результаты работы доложены на VII Международном симпозиуме «Kinetics in Analytical Chemistry» (Румыния, 2001), Международной конференции «Biocatalysis-2002» (Москва, 2002), Международном симпозиуме «Разделение и концентрирование в аналитической химии» (Краснодар, 2002), Международном форуме «Аналитика и аналитики» (Воронеж, 2003).

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 3 статьи и 4 тезисов докладов.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 211 стр. машинописного текста, включая 26 рисунков, 32 таблицы, 9 схем; состоит из введения, обзора литературы (главы 1-3), экспериментальной части (главы 410), заключения, выводов, списка литературы, включающего 172 наименования, и приложения.

Заключение диссертации по теме «Аналитическая химия», Жаворонкова, Анна Михайловна

выводы

1. Обоснована целесообразность исследования и использования в химическом анализе нативных щелочных фосфатаз, выделенных из различных источников: Е. coli, кишечника цыпленка, тонкой кишки гренландского тюленя, для определения цинка и магния — металлов-кофакторов этих ферментов.

2. В результате сравнительного изучения каталитических свойств щелочных фосфатаз, выделенных из трех источников, в реакции гидролиза п-нитрофенилфосфата в разных буферных растворах (боратном, карбонатном, глициновом и трис-IIC1) установлено, что природа буферного раствора значительно влияет на каталитическую активность ферментов и позволяет направленно изменять их чувствительность к действию различных эффекторов в зависимости от решаемой аналитической задачи.

3. Изучение влияния на каталитическую активность трех щелочных фосфатаз ионов ряда щелочных, щелочно-земельных, переходных и тяжелых металлов показало, что: ; .*

• обратимым бесконкурентным ингибитором всех трех щелочных фосфатаз является цинк в диапазоне его концентраций 0.01-10 мкг/мл; наибольшей чувствительностью к действию .цинка отличается щелочная фосфатаза из тонкой кишки гренландского тюленя при проведении реакции гидролиза п-нитрофепилфосфата в боратном буферном растворе;

• щелочную фосфатазу из кишечника цыпленка в значительной степени активирует магний в диапазоне его концентраций 2 нг/мл - 0.02 мг/мл (степень активирования А = 600% при c.Mg = 0.02 мг/мл); при более высоких концентрациях (0.02-0.2 мг/мл) ион магния слабо активирует фермент из т

E.coli (А = 20% при cMg = 0.2 мг/мл) "и не влияет на каталитическую активность фермента из тонкой кишки гренландского тюленя;

• активность всех трех щелочных фосфатаз незначительно активируют ионы калия (при концентрации 0.3-7 мг/мл), а ферментов из E.coli и кишечника цыпленка - и ионы цезия (при концентрации 7-70 мг/мл); каталитическая активность всех исследованных фосфатаз не изменяется в присутствии Со(П), Си(П), Сс!(П), N¡(11), Ре(Ш), Н§(П) при их концентрациях 0.01-10 мкг/мл, а также Са(П), Ва(П) при их концентрациях 0.01-0.5 мг/мл и < 0.006 мг/мл соответственно; РЬ(П) в диапазоне концентраций 0.1-10 мкг/мл ингибирует только щелочную фосфатазу из кишечника цыпленка.

4. При изучении влияния широкого круга органических соединений различных классов (кислород- и фосфорсодержащих комплексонов, гидроксихинолинов и их производных, аминокислот и др.) установлено, что наиболее эффективным ингибитором щелочных фосфатаз животного происхождения является ЭДТА, й щелочной фосфатазы из тонкой кишки 9 гренландского тюленя - еще и нитрилотриметилепфосфоповая кислота. Щелочная фосфатаза из Е.соИ наименее чувствительна к действию органических соединений.

5. Различная степень ингибирующего действия ионов цинка, ЭДТА и активирующего действия ионов магния на каталитическую активность щелочных фосфатаз из трех источников указывает на существенные различия в пространственном строении их молекул.

6. Разработаны методики получения апофосфатаз из кишечника цыпленка и топкой кишки гренландского тюленя с использованием ЭДТА в качестве хелатирующего агента.

7. Установлено, что только апофосфатазу из тонкой кишки гренландского тюленя ионы цинка реактивируют селективно, в то время как апофосфатазу из кишечника цыпленка помимо цинка реактивируют ионы металлов, имеющие близкий к цинку ионный радиус (кобальта, меди, кадмия и никеля).

8. Показана принципиальная возможность использования обнаруженного либеративного действия ионов магния на щелочную фосфатазу из тонкой кишки гренландского тюленя,, ингибированную нитрилотриметилен-фосфоиовой кислотой, для определения магния в диапазоне его концентраций 0.15-15 мкг/мл.

9. С использованием щелочной фосфатазы из тонкой кишки гренландского тюленя и индикаторной реакции гидролиза л-нитрофенилфосфата разработаны ферментативные методики определения цинка:

• по его ингибирующему действию' на каталитическую аетивность фермента в трис-НС1 и боратном буферных растворах (рН 9.8) с с„=1 и 0.01 мкг/мл соответственно (8Г=0.03 и 0.04; п=5; Р=0.95);

• по его реактивирующему действию на апофермент с с„=0.01 мкг/мл (^=0.04; п=5; РЮ.95).

10. Разработана методика определения . магния по его активирующему действию на каталитическую активность щелочной фосфатазы из кишечника цыпленка в ш/?мс-НС1-буферном растворе (рН 9.8) с с„=0.06 нг/мл (бг=0.04; п=5; Р=0.95).

11. Разработаны чувствительные и высокоселективные ферментативные методики определения цинка в сыворотке крови, магния - в моче.

12. Даны рекомендации по выбору щелочной фосфатазы, выделенной из определенного источника, для решения ряда конкретных аналитических задач: например, для определения магния в присутствии цинка следует использовать щелочную фосфатазу из кишечника цыпленка; для определения ионов цинка в присутствии ионов кобальта, меди, никеля, магния, кальция, бария - щелочную фосфатазу из тонкой кишки гренландского тюленя.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенное нами впервые систематическое сравнительное .изучение каталитических свойств щелочных фосфатаз, выделенных из трех различных источников: кишечной палочки (Е. coli), кишечника цыпленка, топкой кишки гренландского тюленя, — металлоферментов, содержащих в своей структуре ионы цинка и магния в каталитическом и аллостерическом центрах соответственно, позволило получить ряд важных результатов, представляющих ценность, как с теоретической, так и практической точек зрения.

При изучении влияния ряда ионов металлов на каталитическую активность в реакции гидролиза я-нитрофенилфосфата щелочных фосфатаз разного происхождения выявлены . различия в их чувствительности к воздействию одних и тех же неорганических эффекторов; в частности" получены данные, свидетельствующие о разной доступности аллостерических центров щелочных фосфатаз. Так, установлено, что из широкого круга изученных ионов переходных и тяжелых металлов только ионы цинка эффективно ингибируют каталитическую активность трех щелочных фосфатаз, причем чувствительность к действию этих ионов понижается в ряду ферментов, выделенных из тонкой кишки гренландского тюленя > кишечника цыпленка > E.coli (табл. 29).

Обнаруженный нами факт, что ионы магния эффективно активируют только щелочную фосфатазу из кишечника цыпленка; бактериальный фермент менее чувствителен к действию этих Ионов даже при высоких их концентрациях, а каталитическая активность щелочной фосфатазы из тонкой кишки гренландского тюленя вообще не меняется в присутствии ионов магния (табл. 29), свидетельствует, очевидно, о том, что структура щелочной фосфатазы из кишечника цыпленка в наибольшей степени способствует образованию ионами магния в молекуле этого фермента дополнительных мест связывания субстрата, что облегчает перераспределение ионов цинка по «существенным» позициям. Кроме того, эта фосфатаза отличается, по-видимому, повышенным содержанием лиофильной части, присоединяясь к которой, ионы магния способствуют лучшему связыванию субстрата.

Выявление ингибирующего действия цинка (II) на щелочнун? фосфатазу из тонкой кишки гренландского тюленя и активирующего эффекта магния (II) на

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Жаворонкова, Анна Михайловна, 2004 год

1. Фредер Дж. Фосфатазы. / В кн.: Фосфор в окружающей среде. М.: Мир, 1978. С. 516-551.

2. Кретович B.JI. Введение в энзимологию. М.: Наука, 1967. 350 с.

3. Neumann Н. Phosphoryl Transfer from s-substituted monoesters of phosphorothiolic acid to various acceptors catalyzed by alkaline phosphatase from Escherichia coli. И Eur. J. Biochem. 1969. V. 8. P. 164-173.

4. Wilson LB., Dayan J., Cyr K. Some properties of alkaline phosphatase from Escherichia coli. И J. Biol. Chem. 1964. V. 239. № 12. P. 4182-4185.

5. Snyder S.L., Wilson L.B. Investigations on the alkaline phosphatase catalyzed hydrolysis of phosphoramidates. Substituent effects and transphosphorylation. // Biochem. 1972. V. 11. № 17. P. 3220-3223.

6. Reynolds J.A., Schlesinger M.J. Formation and properties of a tetrameric form of Escherichia coli alkaline phosphatase. // Biochem. 1969. V. 8. № 11. P. 4278-4282.

7. Reynolds J.A., Schlesinger M.J. Alterations in the structure and function of Escherichia coli alkaline phosphatase due to Zn binding. // Biochem. 1969. V. 8.№ 11. P. 588-593.

8. Csopak H., Falk K.-E., Szajn H. Effect of EDTA on Escherichia coli alkaline phosphatase. // Biochim. biophys. acta. 1972. V. 258. P. 466-472.

9. Snyder S.L., Wilson I., Bauer W. The subunit composition of Escherichia coli alkaline phosphatase in 1 M TRIS. // Biochim. biophis. acta. 1972. V. 258. P. 178-187.

10. Dong G., Zeikus J.G. Purification and characterization of alkaline phosphatase from Thermotoga neapolitana. II Enz. Microb. Technol. 1997. V. 21. P. 335340.

11. Hauksson J.B., Andresson O.S., Asgeirsson B. Heat-labile bacterial alkaline phosphatase from a marine Vibrio sp. II Enz. Microb. Technol. 2000. V. 27. P. 66-73.

12. Tuleva B„ Vasileva-Tonkova E., Galabova D. A specific alkaline phosphatase from Saccharomyces cerevisiae with protein phosphatase activity. // FEMS Microb. Lett. 1998. V. 161. P. 139-144.

13. Say J.C., Furriel R.P.M., Ciancaglini P., Jorge J.A., Lourdes M., Polizeli T.M., Pizauro J.M., Terenzi H.F., Leone F.A. Conidial alkaline phosphatase from Neurospora crassa. II Phytochem. 1996. V. 41. № 1. P. 71-75.

14. Xiao R., Xie L.-P., Lin J.-Y., Li C.-H., Che Q.-X. Purification and enzymatic characterization of alkaline phosphatase from Pinctada fucata. II J. Mol. Catalysis. Section B: Enzymatic. 2002. V. 17. P. 65-74.

15. Lan W.G., Wong M.K., Chen Ni, Sin Y.M. Effect of combined copper, zinc, chromium and selenium by orthogonal array design on alkaline phosphatase activity in liver of the red sea bream, Chrysophrys major. II Aquaculture. 1995. V. 131. P. 219-230.

16. Zhang R.-Q., Chen Q.-X., Xiao R., Xie L.-P., ZengX.-G., Zhou H.-M. Inhibition kinetics of green crab (Scylla serrata) alkaline phosphatase by zinc ions: a new type of complexing inhibition. // Biochim. biophys. acta. 2001. V. 1545. P. 6-12.

17. Ding S., Li Y., Zhu L. Indentification of histidine residues at the active site of Megalobatrachus japonicus alkaline phosphatase by chemical modification. //

18. Biochim. biophys. acta. 2002. V. 1594. P. 100-108.

19. PetitClerc C., Delisle M., Martel M., Fecteau C., Briere N. Mechanism of action of Mg2+ and Zn2+ on rat placental alkaline phosphatase. I. Studies on the soluble Zn2+ and Mg2+ alkaline phosphatases. // J. Biochem. 1975. V. 53. № 10. P. 89100.

20. Femandes S.S., Furriel R.P.M., Petenuscit S.O., Leone F.A. Streptozotocin-induced diabetes: significant changes in the kinetic properties of the soluble form of rat bone alkaline phosphatase. // Biochem. Pharmacology. 1999. V. 58. P. 841-849.

21. Leone F.A., Rezende L.A., Ciancaglini P., Pizauro J.M. Allosteric modulation of pyrophosphatase activity of rat osseous plate alkaline phosphatase by magnesium ions. // Int. J. Biochem & Cell Biology. 1998. V. 30. P. 89-97.

22. Ciancaglini P., Pizauro J.M., Leone F.A. Dependence of divalent metal ions on phosphotransferase activity of osseous plate alkaline phosphatase. // J. Inorg. Biochem. 1997. V. 66. P. 51-55.

23. Leone F.A., Ciancaglini P., Pizauro J.M. Effect of calcium ions on rat osseous plate alkaline phosphatase activity. // J. Inorg. Biochem. 1997. V. 68. P. 123127.

24. Ciancaglini P., Pizauro J.M., Leone F.A. Mechanism of action of cobalt ions on rat osseous plate alkaline phosphatase. // J. Inorg. Biochem. 1995. V. 60. P. 155-162.

25. Kunitz M. Chicken Intestinal Alkaline Phosphatase. I. The kinetics and thermodynamics of reversible inactivation. II. Reactivation by zinc ions. // J. General Physiol. 1960. V.43. P.l 149-1169.

26. Fernley H.N. Mammalian alkaline phosphatases / In: Boyer P.D., The Enzymes. New-York—London: Academic Press. 3-d ed., 1971. V. 4. P. 417-447.

27. Zhang Y.-X., Zhu Y., XiH.-W., Liu Y.-L., ZhouH.-M. Refolding and reactivationof calf intestinal alkaline phosphatase with excess magnesium ions. // Int. J. Biochem & Cell Biology. 2002. V. 34. P. 1241-1247.

28. Zhang Y.-X., Zhu Y„ Zhou H.-M. Conformational changcs and inactivation of calf intestinal alkaline phosphatase in trifluoroethanol solutions. // Int. J. Biochem & Cell Biology. 2000. V. 32. P. 887-894.

29. Dabich D., Neuhaus O.W. Purification and properties of bovine synovial fluid alkaline phosphatase. //J. Biol. Chem. 1966. V. 241. № 2. P. 415-420.

30. Morton R.K. The Kinetics of Hydrolysis of Phenyl Phosphate by Alkaline Phosphatases. // Biochem. J. 1957. V. 65. P. 674-681.

31. Сахаров И.Ю., Макарова И.Е., Лахтин B.M., Арбатский Н.П. Изоформы, аминокислотный и углеводный состав щелочной фосфатазы из слизистой тонкого кишечника тюленя. // Биохимия. 1989. Т. 54. № 2. С. 250-255.

32. Сахаров И.Ю., Мечетнер Е.Б., Ефремов Е.Е., Степанова И.Е., Шехонин Б.В., Плетюшкина О.Ю. Получение и применение моноклональных антител против щелочной фосфатазы тюленя. // Биохимия. 1991. Т. 56. № 10. С. 1900-1906.

33. Сахаров И.Ю., Макарова И.Е., Ермолин Г.А. Физико-химические свойства щелочной фосфатазы из топкого кишечника тюленя. // Биохимия. 1988. Т. 53. №6. С. 974-978.

34. Sakharov I.Yu. Purification of alkaline phosphatase from the intestinal content of common seal (Phoca vitulina larga) by immunoaffinity chromatography. // Сотр. Biochem. Physiol. 1991. V.99 B. № 3. P. 509-511.

35. Sakharov I.Yu., Mechetner E.B., Stepanova I.E., Shekhonin B.V., Pletyushkina O. Yu. Monoclonal antibody to alkaline phosphatase from the intestinal mucosa of the harp seal, phoca groenlandica. П Сотр. Biochem. Physiol. 1992. V. 101 B. № 4. P. 677-682.

36. Sakharov I.Yu., Makarova I.E., Ermolin G.A. Chemical modification andcomposition of tetrameric isozyme К of alkaline phosphatase from harp seal intestinal mucosa. //Сотр. Biochem. Physiol. 1989. V. 92 B. № 1. P. 119-122.

37. Уайт А., Хендлер Ф., Смит Э„ Хилл Р., Леманн И. Основы биохимии. М.: Мир, 1981. Т. 1.535 с.4S.Schlesinger M.J., Olsen R. A new, simple, rapid procedure for purification of Escherichia coli alkaline phosphatase. // Anal. Biochem. 1970. V. 36. P. 86-90.

38. Диксон M., Уэбб Э. Ферменты. M.: Мир, 1982. В 3-х т.

39. McComb R.B., Posen S. Alkaline Phosphatase. / Plenum Press. 1979. 279 P.

40. Полторак O.M., Атякшева Л.Ф., Чухрай E.C., Торшин И.Ю. Роль конформационного замка в стабилизации димеров щелочной фосфатазы различного происхождения. // Журн. физ. химии. 1998. Т. 72. № 8. С. 14931496.

41. Schlesinger M.J., Barret К. The reversible dissociation of the alkaline phosphatase of Escherichia coli. I Formation and reactivation of subunits. // J. Biol. Chem. 1965. V. 240. № 11. P. 4284-4292.

42. Fourniere L., Nosjean O., Buchet R., Roux B. Thermal and pH stabilities of alkaline phosphatase from bovine intestinal mucosa: a FTIR study. // Biochim. biophys. acta. 1995. V. 1248. P. 186-192.

43. Атякшева Л.Ф., Чухрай E.C., Полторак O.M. Ассоциация щелочной фосфатазы из E.coli в растворе. // Журн. физ. химии. 1998. Т. 72. № 8. С. 1490-1492.

44. Asgeirsson В., Artdresson O.S. Primary structure of cold-adapted alkaline phosphatase from a Vibrio sp. as deduced from the nucleotide gene sequence. // Biochim. biophys. acta. 2001. V. 1549. P. 99-111.

45. Martin D.C., Pastra-Landis S.C., Kantrowitz E.R. Amino acid substitutions at the subunit interface of dimeric Escherichia coli alkaline phosphatase cause reduced structural stability. // Protein Sci. 1999. V. 8. P. 1152-1159.

46. МакОлифф К. Методы и достижения бионеорганической химии. М.: Мир, 1978.416 с.

47. Неорганическая биохимия. / Под ред. Г. Эйхгорна М.: Мир, 1978. Т. 1.711 с.

48. Gottesman М., Simpson R.T., Vallee B.L. Kinetic properties of cobalt alkaline phosphatase. //Biochem. 1969. V. 8. № 9. P. 3776-3783.

49. Ma L., Kantrowitz E.R. Kinetic and X-Ray structural studies of a mutant Escherichia coli alkaline phosphatase (His-412 —» Gin) at one of the zinc binding sites. //Biochem. J. 1996. V. 35. P. 2394-2402.

50. Plocke D.J., Levintahal C., Vallee B.L. Alkaline phosphatase of Escherichia coli: A zinc metalloenzyme. // Biochem. 1962. V. 1. № 3. P. 373-378.

51. Simpson R.T., Vallee B.L. Two differentiable classes of metal atoms in alkaline phosphatase of Escherichia coli. II Biochem. 1968. V. 7. № 12. P. 4343-4350.

52. Holtz K.M., Kantrowitz E.R. The mechanism of the alkaline phosphatase reaction: insights from NMR, crystallography and site-specific mutagenesis. // FEBS Lett. 1999. V. 462. P. 7-11.

53. Gettins P., Coleman J. Zn-113Cd and Zn(II)-Mg(II) hybrids of alkaline phosphatase. 31P- and 113Cd NMR. III. Biol. Chem. 1984. V. 259. P. 4991-5003.

54. Sl.Applebury M.L., Coleman J.E. Escherichia coli Alkaline phosphatase. Metalbinding, protein conformation, and quaternary structure. // J. Biol. Chem. 1969. V.244. №2. P.308-318.

55. Zl.Zukin R.S., Hollis D.P. Role of metal ions in Escherichia coli alkaline phosphatase. A study of the metal-water interaction by nuclear relaxation rate measurements on water protons. // J. Biol. Chem. 1975. V. 250. № 3. P. 835842.

56. Petitclerc C., Lazdunski C, Chappelet D., Moulin A., and Lazdunski M. The functional properties of the Zn2+ and Co2+ - alkaline phosphatases of Escherichia coli. И Eur. J. Biochem. 1970. V. 14. № 2. P. 301-308.

57. M.Simpson R.T., Vallee B.L. Two differentiable classes of metal atoms in alkaline phosphatase of Escherichia coli. II Biochem. 1968. V. 7. № 12. P. 4343-4350.

58. Zl.Heppel L.A., Harkness D.R., Hilmoe R.J. A study of the substrate specificily and other properties of the alkaline phosphatase of Escherichia coli. II J. Biol. Chem. 1962. V. 237. № 3. P. 841-846.

59. W.Salomon L.L., James J., Weaver P.R. Assay of phosphatase activity by direct spectrophotometric determination of phenolate ion. II Anal. Chem. 1964. V. 36. №6. P. 1162-1164.

60. S9.AumapuH И.П. Молекулярная биология. JI.: ЛГУ, 1974. 367 с.

61. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика. М.: Мир, 1991.544 с.91 .Лурье Ю.Ю. Справочник по аналитической химии. М.: Химия, 1989. 447 с.

62. Kreuzer М.Р., O'Sullivan С.К., Guilbault G.G. Alkaline phosphatase as a label for immunoassay using amperometric detection with a variety of substrates and an optimal buffer system. II Anal. chim. acta. 1999. V. 393. P. 95-102.

63. Thiel Т., Liczkowski L., Bissen S.T. New zwitterionic butanesulfonic acids that extend the alkaline range of four families of good buffers: evaluation for use in biological systems. //J. Biochem. Biophys. Methods. 1998. V. 37. P. 117-129.

64. Guilbault G., Sadar M., Zimmer M. Analytical applications of the phosphataseenzyme system. Determination of bismuth, beryllium and pesticides. // Anal, chim. acta. 1969. V. 44. P. 361-367.

65. Кучеряева B.B. Методы определения соединений эффекторов щелочной и кислой фосфатаз. . дисс. к.х.н. М.: МГУ, 1987. 230 с.

66. Жмаева Е.В. Ферментативное определение кофактора (иона цинка) и ингибиторов алкогольдегидрогеназы из пекарских дрожжей. . дисс. к.х.н. М.: МГУ. 2002. 223 с.

67. Hofstee B.H.J. Alkaline phosphatase. I. Mechanism of action of Zn, Mg, glycine, versene and hydrogen ions. // Arch. Biochem. Biophys. 1955. V. 59. P. 352-365.

68. Thowshend A., Vaughan A. Applications of enzyme-catalysed reactions in trace analisis. 4: Determination of berylium and zinc by their inhibition of calcificational alkaline phosphotase // Talanta. 1969. V. 16. №. 7. P. 929-937.

69. Townshend A., Vaughan A. Applications of enzyme-catalysed reactions in trace analysis. V. Determination of zinc and calcium by their activation of the apo-enzyme of calf-intestinal alkaline phosphatase. // Talanta. 1970. V. 17. P. 289298.

70. SanjaiD., Rajiv D. И Mater. Sci. 1995. V. 3. № 2. P. 79.

71. Cho H.-Y, Tanizawa K., Soda K. Role of divalent metal ions on activity and stability of thetmostable dipeptidase from Bacillus stearothermophilus. И Biosci. Biotech. Biochem. 1997. V. 61. № 10. P. 1688-1692.

72. MildvanA. Metalls in Enzyme Catalisis. / In: Boyer P.D. The Enzymes. 1971. New-York—London: Academic Press. 3-d ed., V. 2. P. 448-450.

73. Арене Э.А., Веселова M.H., Чухрай E.C., Полторак О.М. Диссоциативная термоинактивация щелочной фосфатазы в растворе. // Вестник МГУ. Сер. 2. Химия. 1981. Т. 22. № 6. С. 555-558.

74. Чухрай Е.С., Кучеряева В.В., Долманова И.Ф., Шеховцова Т.Н. Термоинактивация щелочной фосфатазы // Журн. физ. химии. 1989. Т. 63. № 12. С. 3354-3358.

75. Крупянко В.Н. Распределение ингибирующей активности среди катионов двухвалентных металлов. //Биохимия. 1988. Т. 53. № 6. С. 905-911.

76. IUPAC-Stability Constants Database. 1994. Version 2.6.3. Academic Software Royal Society Chemistry - IUPAC.

77. Никольская Е.Б. Применение ферментов для изучения состава некоторых гидроксокомплексов. //Журн. аналит. химии. 1983. Т. 38. № 1. С. 5-11.

78. Csopak Н The specific binding of zinc (II) to alkaline phosphatase of Escherichia coli. II Eur. J. Biochem. 1969. V. 7. № 2. P. 186-192.

79. Lazdunski C., Lazdunski M. Zn2+ and Co2+-Alkaline phosphatase of E.coli. A comparative kinetic study. // Eur. J. Biochem. 1969. V. 7. № 2. P. 294-300.

80. Lazdunski M„ Petitclerc C., Chappelet D., Lazdunski C. Flip-flop mechanisms in enzymology. A model: the alkaline phosphatase of Escherichia coli. II Eur. J. Biochem. 1971. V. 20. P. 124-139.

81. Trotman C. Greenwood C. Effects of zinc and other metal ions on the stability and activity of Escherichia coli alkaline phosphatase. // Biochem. J. 1971. V. 124.№ i.p.25-30.

82. Jasaitis J.J., Razumas V.J., Kulys J.J. Amperometric determination of zinc with an apoenzyme-treated graphite electrode. //Anal. chim. acta. 1983. V. 152. P. 271-274.

83. Cloetens R. Uber den Aktivierungesmechanismus der alkalischen phosphatase • II durch metallionen. //Biochem. Z. 1941. Bd. 307. S. 352-365.

84. Cloetens R. Reversible abspaltung des zweiten metalles der alkalischen phosphatase II. II Biochem. Z. 1941. Bd. 308. S. 37-39.

85. Sanjai D., Rajiv D. II Anal. Chem. 1996. V. 68. P. 216.

86. Щеплягина Л.А., Легопькова Т.Н., Моисеева Т.Ю. Клиническое значение дефицита цинка для здоровья детей: новые возможности лечения и профилактики. // Рус. мед. журн. 2002. № 11.

87. Junker М., Rodgers К.К., Coleman J.E. Zinc as a structural and folding element of proteins which interact with DNA. // Inorg. chim. acta. 1998. V. 275276. P. 481-492.

88. AntonucciA., Baldassarre A., Giacomo F. Detection of apoptosis in peripheral blood cells subjects affected by Down syndrome before and after zinc therapy. // Ultrastruct. Pathol. 1997. V. 21. № 5. P. 449- 452.

89. Шейбак М.П., Шейбак JJ.H. Недостаточность цинка у детей. // Российский вестник перинатологии и педиатрии. 2000. № 1. С. 48-51.

90. Емельянова Т.П. Витамины и минеральные вещества. СПб.: Весь, 2000. 368 с.

91. Folwaczny С. Zinc and diarrhea in infants. // J. Trace Elem. Med. Biol. 1997. V. 11. №2. P. 116-122.

92. Kirsten G.F., Heese V., Villiers S. Serum zinc and cooper levels in the 1-st year of life. // S. Afr. Med. J. 1985. V. 67. №11. P. 414-418.

93. LansdownABG. Zinc in the healing wound. // Lancet. 1996. V. 347. № 16. P. 706-707.

94. Scholmerich J., Wietholtz H., Buchsel R. Zink und vitamin A magel bei gastroenterologischen erkrankungen. // Leber Magen Darm. 1984. Bd. 14. № 6. S. 288-295.

95. Коршунова H. Вездесущий цинк. // Рус. деловой вестник. 2003. № 9.

96. Карпинский М.В., Вендланд И.О. Профилактика дефицита цинка. // Вопросы охраны матери и детей. 1987. № 10. С. 57-61.

97. Цыганенко А.Я., Жуков В.И., Мясоедов В.В., Завгородский И.В. Клиническая биохимия. М.: Триада-Х, 2002.497 с.

98. Майстренко В.Н., Хамитов Р.З., Будников Г.К Эколого-аналитический мониторинг супертоксикантов. М.: Химия, 1996. 320 с.

99. Школышкова М.А., Чупрова С.Н., Калинин Л.А., Березницкая В.В., Абдулатипова И.В. Метаболизм магния и терапевтическое значение его препаратов. М.: Медпракгика-М, 2002. 28 с.

100. Greensmith L. Magnesium ions reduce motoneuron death following nerve injury or exposure to N-methyl-D-aspartate in the developing rat. // Neuroscience. 1995. V. 68. № 3. P. 807-812.

101. Bruno V. Antidegcnerative effecs of Mg2+-valproate in cultured cerebellar neurons. // Funct. Neurol. 1995. V. 10. № 3. P. 121-130.

102. Коломиец В.В., Боброва Е.В. Физиологические механизмы регуляции метаболизма магния. // Укр. кардюл. журн. 1988. № 4. С. 54-58.

103. Чекман И.С., Горчакова Н.А., Николай C.JT. Магний в медицине. Кишинев. 1992. 101 с.

104. Городецкий В.В., Талибов О.Б. Препараты магния в медицинской практике. М.: Медпрактика, 2003. 44 с.

105. Постникова C.JI. Магний и здоровье человека. // Здоровье. 2000. № 1.

106. Добрынина В.И. Биологическая химия. М.: Медицина, 1976. 504 с.

107. Биохимические методы исследования в клинике. / Под ред. А.А. Покровского М.: Медицина, 1969. 652 с.

108. Немелова Ю.М. Методы лабораторных клинических исследований. М.: Медицина, 1972.424 с.141 .Колб В.Г., Камышников B.C. Клиническая биохимия. Минск: Беларусь, 1976. С. 200.

109. Mann С.К., Joe J.H. И Anal. Chem. V. 28.

110. Bohuon С. II Clin. Chem. Acta. 1964. V. 7. P. 811-817.

111. Veselova LA., Shekhovtsova T.N. Visual determination of lead (II) by inhibition of alkaline phosphatase immobilized on polyurethane foam. // Anal, chim. acta. 2000. V. 413. P. 95-101.

112. Живописцев В.П., Селезнева E.A. Аналитическая химия цинка. М.: Наука, 1975. 200 с.

113. Келети Т. Основы ферментативной кинетики. М.: Мир, 1990. 234 с.

114. БейлиДж., Оллис Д. Основы биохимической инженерии. М.: Мир, 1989. В 2-х ч.

115. Dolmanova I.F., Shekhovtsova T.N., Kutcheryaeva V.V. Assay of enzyme effectors. //Talanta. 1987. V. 34. № 1. P. 201-205.

116. Miki Y„ Toshima N., Tanaka K. Alkaline phosphatase reaction activators containing cesium salts and solutions for determination of the enzyme. // Jpn. Kohai Tokkyo Koho. 1998. Patent CA Section: 7 (Enzymes). JP 96-203357 11. Aug 1996.

117. Happold F.C., Beeckey R.B. Univalent metals and other loose or non-specific activations. / The 15-th Biochem. society symposium at the university of leeds. 1958. P. 52-63.

118. Armas G., Cladera A., Becerra E., Estela J.M., Cerda V. Fluorimetric sequential injection determination of magnesium using 8-hydroxiquiniline-5-sulfonic acid in a micellar medium. // Talanta. 2000. V. 52. P. 77-82.

119. Шеховцова Т.Н., Чернецкая C.B., Белкова Н.В., Долманова И.Ф. Использование иммобилизованных ферментов для определения ионов металлов. // Жури, аналит. химии. 1994. Т. 49. № 8. С. 789-795.

120. Дятлова Н.М., Темкина В.Я., Попов К.И. Комплексоны и комплексонаты металлов. М.: Химия, 1998. 544 с.

121. Виноградов A.B., Елинсон C.B. Оксихинолин. М.: Наука, 1979. 328 с.

122. Тихонов В.Н. Аналитическая химия магния. М.: Наука, 1973. 252 с.

123. Хванг С.Т., Каммермайер К. Мембранные процессы разделения. М.: Химия, 1981.464 с.

124. Яцимирский К.Б. Введение в неорганическую биохимию. Киев: Наукова думка, 1976. С. 96-103.

125. Васильев В.П., Шорохова В.И., Катровцева A.B., Гудина Л.Г. Устойчивость соединений Zn (II) с нитрилотриметиленфосфоновой кислотой. //Журн. неорг. химии. 1988. Т. 33. № 12. С. 3076-3079.

126. Морозова С.С., Никитина Л.В., Дятлова Н.М., Серебрякова Т.В. Изучение комплексообразования НТФ с некоторыми переходными металлами. //Журн. неорг. химии. 1975. Т. 20. № 2. С. 413-418.

127. Ригин В.И. Хемилюминесцентный метод определения микроколичеств цинка с применением иммобилизованного фермента. // Журн. фналит. химии. 1979. Т. 34. № 4. С. 680-687.

128. Применение магния и оротовой кислоты в кардиологии. Метод, реком. / Под ред. А.П. Юренева. М.: Типогр. № 9, 1997. 22 с.

129. Шилов A.M., Рабинович Ж.Г., Мельник М.В., Святое И.С., Максимова Л.А., Соколинская И.Ю. Дефицит магния и артериальная гипертония. // Рос. мед. вести. 2000. № 2. С. 62-65.

130. Степура O.E., Мельник О.О., Шехтера А.Б., Пак Л.С., Мартынов А.И.

131. Результаты применения магниевой соли оротовой кислоты «Магнерот» при лечении больных с идиопатическим пролапсом митрального клапана. // Рос. мед. вести. 1999. № 2. С. 64-69.

132. Шилов A.M., Мельник М.В., Кравченко В.В., Святов И.С., Космодемьянский Л.В., Максимова JJ.A. Синдром удлинения интервала Q-Т у больных острым инфарктом миокарда: диагностика и лечение. // Рос. мед. вести. 2000. № 1. С. 45-48.

133. Шилов A.M., Мельник М.В., Санодзе И.Д., Святов И.С., Максимова JJ.A. Врожденный синдром удлинения интервала Q-T. // Рос. мед. вести. 2000. №3. С. 60-63.

134. Black М.М. Zinc deficiency and child development. // Am. J. Clin. Nutr. 1998. V. 68. №2. P. 464-469.

135. Лаврова A.E., Волков A.M. Дефицит цинка у детей с пищевой аллергией и его коррекция препаратом цинктерал. // Нижегород. мед. журн. 1998. № 2. С. 25-29.

136. Quamme G.A., Rabkin S.fV. Cytosolic free magnesium in cardiac myocytes: identification of a Mg2+ influx pathway. // Biochem. Biophys. Res. Comm. 1990. P. 167.

137. Фримантл M. Химия в действии. M.: Мир, 1991. Ч. 2. С. 119.

138. Биофизическая химия. Химия биогенных элементов. / Под ред. Ю.А. Ершова. М.: Высш. шк., 2000. 560 с.

139. Каупе L.H., Lee D.B. Intestinal magnesium absorption. // Min. Electr. Metab. 1993. P. 210.