Функциональная экспрессия кДНК и иммуногистохимическое исследование гуанилатциклазы в сетчаткe быка тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, кандидат химических наук Соловьева, Ольга Владимировна

• Соловьева, Ольга Владимировна
• кандидат химических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат химических наук Соловьева, Ольга Владимировна

ВВЕДЕНИЕ

1. РАЗЛИЧНЫЕ ТИПЫ ГУАНИЛАТЦИКЛАЗ: СТРУКТУРА И ФУНКЦИИ

(ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

1.1. Введение

1.2. ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКАЯ ФОРМА ГУАНИЛАТЦИКЛАЗЫ

1.2.1. Структура растворимых гуанилатциклаз

1.2.2. Роль гема - простетической группы гуанилатциклаз

1.2.3. Взаимосвязь состояния олигомеризации с ферментативной активностью белка

1.3. МЕМБРАННЫЕ ФОРМЫ ГУАНИЛАТЦИКЛАЗ

1.3.1. Полипептидрегулируемые гуанилатциклазы

1.3.1.1. GC - рецепторы натрийуретических пептидов

1.3.1.2. GC, активируемая бактериальными термостабильными энтеротоксинами

1.3.1.3. GC, активируемая пептидами из икры морского ежа

1.3.2. Гуанилатциклазы, стимулируемые кальцием

1.3.2.1. Гуанилатциклазы фоторецепторных клеток

1.3.2.2. Белки - активаторы гуанилатциклаз фоторецепторных клеток

1.3.2.2.1. Гуанилатциклаз-активирующие белки (GCAP)

1.3.2.2.2. Кальций зависимый гуанилатциклаз-активирующий белок

1.3.2.3. GC из Tetrahymena и Paramecium

1.3.3. GC, регулируемые G- белками

1.3.3.1. Мускарин-регулируемая GC

1.4. СТРУКТУРА МЕМБРАННОЙ ФОРМЫ ГУАНИЛАТЦИКЛАЗЫ

1.4.1. Зависимость каталитической активности мембранных форм гуанилатциклаз от состояния олигомеризации

1.4.2. Регуляция каталитической активности мембранных форм гуанилатциклаз

1.4.2.1. Функционирование протеинкиназоподобного домена мембранных гуанилатциклаз

1.4.3. Фосфорилирование мембранных форм гуанилатциклаз

2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

2.1. Введение

2.2. Экспрессия фрагмента кДНК гена гуанилатциклазы В в клетках Escherichia coli

2.2.1. Получение экспрессирующих конструкций, содержащих фрагмент к ДНК гена гуанилатциклазы В

2.2.2. Экспрессия фрагмента кДНК гена гуанилатциклазы В в клетках Е. соИ, идентификация и выделение рекомбинантного продукта

2.2.3. Рефолдинг солюбилизированного рекомбинантного белка гуанилатциклазы В

2.2.4. Определение ферментативной активности рекомбинантного белка

2.2.5. Аналитическая гель-фильтрация рекомбинантного белка

2.3. Экспрессия фрагментов кДНК гена гуанилатциклазы В в эукариотической системе РгсЫа ро81ош

2.3.1. Создание конструкций на основе челночного вектора рН1Ь-81, экспрессирующих ОС-В

2.3.2. Селекция и отбор трансформантов

2.3.3. Анализ рекомбинантных клонов РгсЫараз1ош

2.3.4. Отбор мультикопийных клонов

2.3.5. Выявление мРНК рекомбинантной гуанилатциклазы В

2.3.6. Экспрессия фрагментов кДНК гена гуанилатциклазы В в дрожжах РюЫа рах^пь, выделение и очистка рекомбинантных белков

2.4. Свойства рекомбинантных белков ОС-Вр и ОС-В§

2.4.1. Определение гуанилатциклазной активности рекомбинантных белков

2.4.2. Гуанилатциклаза В является представителем семейства Бег/ТИг протеинкиназ

2.5. Локализация гуанилатциклазы В в клетках сетчатки глаза быка

2.5.1. Получение поликлональных антител к гуанилатциклазе В

2.5.2. Иммуногистохимическое исследование срезов сетчатки глаза быка

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 73 3.1. Материалы

3.1.1. Реактивы

3.1.2. Ферменты

3.1.3. Штаммы и плазмидные векторы

3.1.4. Микробиологические среды и буферы

3.1.4.1. Микробиологические среды

3.1.4.2. Буферные растворы для ферментов модификации ДНК

3.1.5. Другие растворы

3.1.6. Фотографические растворы

3.2. Методы

3.2.1. Приготовление агарозного геля

3.2.2. Выделение плазмидной ДНК клетокЕ. coli

3.2.3. Рестрикция фрагментов ДНК

3.2.4. Получение компетентных клетокЕ. coli

3.2.5. Трансформация компетентных клетокЕ. coli

3.2.6. Определение нуклеотидной последовательности кДНК секвенированием по методу Сэнгера

3.2.6.1. Приготовление препаратов плазмид-матриц для секвенирования

3.2.6.2. Реакция секвенирования

3.2.7. Электрофорез белков

3.2.7.1. Приготовление образца

3.2.7.2. Условия проведения электрофореза

3.2.8. Электроблотинг белков

3.2.9. Клонирование кДНК гуанилатциклазы В и определение ее нуклеотидной последовательности

3.2.10. Экспрессия фрагмента кДНК гуанилатциклазы В в клетках Е. coli

3.2.11. Очистка рекомбинантного белка

3.2.12. Аналитическая гель-фильтрация

3.2.13. Выделение тотальной РНК из сетчатки глаза быка

3.2.13.1. Синтез первой цепи к ДНК

3.2.14. Приготовление компетентных клеток Р. pastoris

3.2.15. Трансформация клеток Р. pastoris методом электропорации

3.2.16. Выделение геномной ДНК дрожжей Р. pastoris

3.2.17. Анализ рекомбинантных клонов Р. pastoris методом ПЦР

3.2.18. Выделение тотальной РНК дрожжей Р. pastoris

3.2.19. Синтез первой цепи кДНК

3.2.19.1. Постановка полимеразной цепной реакции на гибридной матрице мРНК/ДНК

3.2.20. Экспрессия фрагмента кДНК гуанилатциклазы В в дрожжах Р. pastoris, очистка рекомбинантного белка

3.2.21. Измерение ферментативной активности

3.2.22. Реакция фосфорилирования

3.2.23. Обработка мембраны

3.2.24. Фосфоаминокислотный анализ

3.3. Иммуноферментный анализ

3.3.1. Получение коньюгата для иммунизации животных

3.3.2. Получение поликлональных антител к гуанилатциклазе В

3.3.3. Анализ тканевых срезов

4. ВЫВОДЫ

5. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Функциональная экспрессия кДНК и иммуногистохимическое исследование гуанилатциклазы в сетчаткe быка»

ВВЕДЕНИЕ

Выживание каждой клетки и организма в целом зависят от того, насколько они адекватно и своевременно реагируют на внешние сигналы, передача которых опосредуется специальными рецепторами белковой природы. Помимо белковых посредников в передачу сигнала внутри клетки во многих случаях вовлекаются и относительно небольшие молекулы - вторичные мессенджеры. К числу наиболее важных вторичных мессенджеров относится циклический гуанозин-3',5'-монофосфат (сОМР). Ферментом, который катализирует биосинтез сОМР из гуанозинтрифосфата (ОТР), является гуанилатциклаза (ОС).

В различных клетках обнаружены как растворимые, так и мембраносвязанные гуанилатциклазы. Установлено, что эти белки не только отличаются по структуре, но и имеют различные механизмы активации. В сетчатке глаза обнаружены мембраносвязанные гуанилатциклазы, названные гуанилатциклазами А, В, Е, Б (ОС-А, ОС-В, ОС-Е, ОС-Б). Несмотря на достигнутые успехи в их изучении, молекулярный механизм функционирования этих ферментов и их роль в передаче зрительного сигнала до конца не ясны.

Содержание ОС-В в сетчатке быка незначительно, что не позволяет получить белок в количествах, достаточных для структурно-функциональных исследований. Выделение гуанилатциклазы затруднено также в связи с ее высокой нестабильностью и плохой растворимостью. Клонирование и экспрессия кДНК ОС-В позволили бы преодолеть эти трудности и перейти к более детальному изучению процессов световой адаптации, происходящих в клетках сетчатки позвоночных.

Данная работа является частью исследований, проводимых в ИБХ им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН в рамках структурно-функциональных

исследований ферментов, участвующих в метаболизме сОМР в клетках сетчатки позвоночных. Цель работы состояла в получении функционально активного рекомбинантного белка, изучении его структурно-функциональных свойств и локализации фермента в клетках сетчатки глаза позвоночных.

Автор выражает признательность своему научному руководителю, доктору химических наук, профессору Н. Г. Абдулаеву и зав. лабораторией белков гормональной регуляции доктору химических наук, профессору В. М. Липкину за внимание к данной работе, кандидату химических наук М. А. Кутузову, Д. Л. Какуеву и Ю. В. Корольковой за постоянную помощь, внимание, многочисленные дисскуссии и ценные советы в работе. Автор так же признателен С. В. Новоселову за проведение световой микроскопии срезов сетчатки глаза быка, кандидату химических наук И. А. Костанян за внимание и помощь в оформлении диссертации, кандидату химических наук Н. С. Быстрову за синтез олигонуклеотидных зондов и кандидату химических наук А. Ф. Фрадкову за предоставленные плазмиды.

1. РАЗЛИЧНЫЕ ТИПЫ ГУАНИЛАТЦИКЛАЗ: СТРУКТУРА И ФУНКЦИИ

(Обзор литературы)

1.1. Введение

Гуанилатциклаза (КФ 4.6.1.2.) - фермент, катализирующий биосинтез циклического гуанозин-3',5'-монофосфата (cGMP) из гуанозинтрифосфата. cGMP - мощный регулятор метаболизма клетки, в значительной степени определяющий ее функции. В настоящее время доказано, что cGMP, как и сАМР, является низкомолекулярным посредником (вторичным мессенджером) во многих внутриклеточных процессах.

Впервые cGMP был обнаружен как компонент мочи в 1963 году сразу же после появления работ Shutherland и Rail, в которых они выдвинули гипотезу о существовании вторичных мессенджеров. Впоследствии появились данные о наличии гуанилатциклазной и фосфодиэстеразной активностей практически во всех тканях [1, 2]. В тоже время было показано, что концентрация cGMP изменяется под действием широкого спектра различных агентов, включая гормоны и нейротрансмиттеры [3]. Открытие факта, что гуанилатциклаза работает как рецептор, генерирующий cGMP в ответ на связывание с лигандом, привело к созданию новой концепции передачи сигналов через вторичные мессенджеры.

В середине 70-х годов две группы исследователей установили наличие гуанилатциклазной активности как в растворимой, так и в нерастворимой фракциях тканевых гомогенатов млекопитающих. Был сделан вывод, что белок существует в двух формах: мембраносвязанной и растворимой [4, 5].

В настоящее время установлено, что это не только структурно-отличающиеся белки, но и ферменты с различным механизмом активации. Однако детально молекулярный механизм функционирования этих ферментов не выяснен [6].

1.2. ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКАЯ ФОРМА ГУАНИЛАТЦИКЛАЗЫ 1.2.1. Структура растворимых гуанилатциклаз

Растворимая форма ОС была впервые выделена из легких крысы и быка. Она представляет собой гетеродимер, состоящий из двух различных субъединиц: «-субъединицы с массой от 73 до 88 кДа и /?-субъединицы с массой 70 кДа. Субъединицы ОС легких крысы и быка обладают 84.6% гомологией аминокислотных остатков. Сравнение аминокислотных последовательностей а1 (73 кДа) и /?/ (70 кДа) субъединиц ОС из легких быка выявило идентичность между ними (32%), при этом наименьшей гомологией (20%) обладает И-концевой участок (около 300 аминокислотных остатков), следующие за ним 54 аминокислотных остатка гомологичны на 70%, а 231 аминокислотных остатка С-концевой области ОС идентичены на 40% [7].

Позднее в тканях почек и печени быка была обнаружена ^-субъединица растворимой ОС. Новая субъединица по структуре высоко гомологична /?у-субъединице, но имеет делецию 62 аминокислотных остатков в 1М-концевой области ОС [7]. Кроме того, /??-субъединица в непосредственной близости от С-концевого аминокислотного остатка имеет консенсусную последовательность (-СУУЬ) для изопренилирования и карбокси-метилирования.

Основываясь на известных аминокислотных последовательностях как растворимых, так и мембраносвязанных ОС, можно выделить три домена, которые являются практически одинаковыми для всех форм этого белка: 1Ч-концевой лиганд-связывающий, протеинкиназоподобный и каталитический домены.

Каталитические домены всех форм ОС имеют очень высокую степень гомологии, благодаря чему вырожденные праймеры, соответствующие консервативным участкам

каталитического домена были использованы при амплификации и клонировании ряда формОС [8].

1.2.2. Роль гема - простетической группы гуанилатциклаз

Характерной особенностью растворимых GC является наличие в молекуле гема - простетической группы фермента [9]. Известно, что непосредственным предшественником гема является протопорфирин IX - сильный активатор гуанилатциклазы [10]. Введение железа в порфириновое кольцо приводит к образованию ферропротопорфирина IX или гема, который является ингибитором фермента [11]. Роль гема в функционировании этих ферментов связывают в основном с активацией его эндогенным оксидом азота (N0) и соединениями, содержащими или образующими свободнорадикальную группу N0. Лечебный эффект наиболее распространенных нитровазодилятаторов, таких как нитроглицерин, нитросорбид, нитропруссид натрия и др., обусловлен активацией GC и накоплением cGMP. В результате взаимодействия свободнорадикальной группы N0 этих соединений с гемом GC и происходящих при этом структурных изменений в геме [11] происходит активация белка. Накапливающийся cGMP активирует cGMP-зависимую протеинкиназу, а также Са2+-АТФазу, участвующих, в свою очередь, в дефосфорилировании легких цепей миозина, что приводит к выходу Са2+ из мышечных клеток и, в конечном итоге, к расслаблению/(расширению) сосудов [12].

Важная роль гема в регуляции GC получила особую значимость после открытия Moneada [13], установившего в 1987 году эндогенную природу N0. Было известно, что в эндотелиальных клетках в ответ на взаимодействие гормонов и нейротрансмиттеров (ацетилхолина, брадикинина, гистамина и др.) с соответствующими рецепторами образуется эндотелиальный фактор, расширяющий сосуды (EDRF-endothelium-derived

relaxing factor) [14]. В 1987 году EDRF был идентифицирован как NO [13], образующийся из L-аргинина за счет окисления азота аминогруппы гуанидиновой группировки ферментом Ь-аргинин-1\Ю-синтазой [15]. В настоящее время NO-синтазы найдены в самых различных частях нервной системы и подразделяются на три подкласса в зависимости от ингибиторов [16] и кофакторов [17, 18]. Вопрос об идентичности EDRF и N0 окончательно не решен. Не исключено, что EDRF является NO-содержащим соединением [19]. В то же время не вызывает сомнений тот факт, что физиологический эффект N0 обусловлен активацией GC за счет нитрозилирования ее гема и последующего накопления cGMP. Таким образом, эндогенный N0 - не только важный участник регуляции GC, но и мощный фактор регуляции гомеостаза, рассматривающийся сейчас как эндогенный вазодилятатор.

При сравнении первичных структур а- и /?- субъединиц GC с аминокислотными последовательностями двух других известных групп гемсодержащих белков -переносчиков кислорода и участников электротранспортных цепей - не было обнаружено никакого заметного сходства в последовательностях аминокислот [20]. Гем-связывающий сайт этих белков представляет собой либо часть каталитического центра (цитохром-с-оксидаза), либо место связывания кислорода (миоглобин, гемоглобин). Поскольку в отношении функций гемовой области GC существует предположение, что гем, играющий роль сайта связывания N0 или родственных ему агентов, необходим для регуляции, то, различия в функциях могут, по крайней мере, частично, объяснить отсутствие сходства первичных структур между этими классами гемсвязывающих белков. Опираясь на эти данные, сейчас выделяют третий класс гем-связывающих белков, к которым принадлежат белок FixL и растворимые гуанилатциклазы (рис. 1).

Fix L белок

Растворимая форма гуанилатциклазы

Мембранная форма iy анил атцикл азы

Рис. 1. Сравнение структур растворимой и мембранной гуанилатциклаз с Fix L белком, где тм - трансмембранный домен, лсд - лигандсвязывающий домен.

Белки FixL вовлечены в каскад реакций, ведущих к фиксации азота, и их протеинкиназный каталитический домен ингибируется посредством связывания кислорода гемом.

В FixL-белках гемсвязывающий регион находится в N-концевой области белка. В субъединицах GC участок связывания гема еще не установлен, но известно, что мутация His-105 на Phe в /?-субъединице нарушает связывание гема aifii формой растворимой GC без потери базальной каталитической активности [21, 22, 23].

Хотя природа связи гема с белковой молекулой GC не установлена, но известно, что она лабильна. При понижении рН (5.0), хранении, очистке фермента гем может диссоциировать с молекулы GC, чем, и обусловлена определенная степень гемдефицитности фермента in vitro [24]. Прочность связи гема в молекуле GC различна в зависимости от источника фермента [25, 26]. Данных о существовании в тканях растворимой GC изначально в гемдефицитной форме в литературе нет. Гемдефицитность GC - приводит не только к нарушению эндогенной регуляции фермента, но и к снижению эффективности действия сосудорасширяющих препаратов и к нарушению тонуса сосудов.

Механизм, посредством которого связывание гемом N0 активирует гуанилатциклазу, неизвестен. Предполагается, что между циклазным и потенциальным гемсвязывающим доменами фермента расположен участок, представляющий собой амфипатическую а- спираль. Этот регион возможно и есть та структура [27, 28], которая может участвовать в передаче сигнала связывания N0 на каталитический домен.

1.2.3. Взаимосвязь состояния олигомеризации с ферментативной

активностью белка

Для определения влияния олигомеризации фермента на его активность был проведен ряд исследований. До сих пор не было показано формирование активных гомодимерных форм растворимых GC. При индивидуальной экспрессии генов

а- и ß- субъединиц каталитическая активность не наблюдалась. Это говорит о том, что обе субъединицы GC необходимы для проявления каталитических свойств фермента и его регуляции N0. Возможны различные объяснения этого факта. Одно из них предполагает существование неизвестного белка, ингибирующего активность а- и ß- субъединиц при независимой экспрессии, в то время, как совместная экспрессия генов обеих субъединиц предотвращает ингибирование. Вторым объяснением может быть необходимость коэкспрессии для правильного сворачивания белка [29, 30]. Однако, более привлекательной, является гипотеза о том, что димеризация необходима для формирования единого каталитического участка. Как образуется один каталитический сайт посредством димеризации неизвестно, но недавние исследования показали, что единственная точечная мутация в «у-субъединице может привести к исчезновению ферментативной активности при коэкспрессии ее гена с геном ßr субъединицы дикого типа. Это служит подтверждением концепции перекрывающихся субъединичных каталитических участков.

1.3. МЕМБРАННЫЕ ФОРМЫ ГУАНИЛАТЦИКЛАЗ

Все известные к настоящему времени мембраносвязанные GC могут быть классифицированы в три группы в соответствии с механизмом их активации и регуляции. Первая группа - это полипептид-регулируемые GC, включающие подгруппы: GC-A, являющаяся рецептором для АКР {Atrial natriuretic peptide) и BNP (Brain natriuretic peptide) пептидов [31]; GC-B, активируемая CNP (C-type natriuretic peptide) пептидом [32]; GC-C, активируемая термостабильным энтеротоксином Е. coli и новым гуанилин-пептидом [33], а так же GC из спермы морского ежа, активируемая такими пептидами как резакт и сперакт [34]. Вторая группа - это GC, стимулируемые кальцием, включая GC фоторецепторов [35], GC инфузории [36] и GC тетрахимены [37] посредством кальций-

связывающих белков, таких как рековерин и кальмодулин СаМ. И третья, новая группа - это GC, регулируемые G-белками, включает GC Dictyostelium discoideum [38] и мускарин-регулируемую GC [39-41].

1.3.1. Полипептидрегулируемые гуанилатциклазы

1.3.1.1. GC - рецепторы натрийуретических пептидов Натрийуретические пептиды - семейство гормонов, которые регулируют различные физиологические функции, включая тонус гладких мышц сосудов и клеточную пролиферацию [42-44]. ANP {Atrial natriuretic peptide), первый из трех натрийуретических пептидов, секретируется сердечными мышцами - миоцитами в ответ на увеличение артериального давления и протеводействует увеличивающемуся объему стимуляцией натрийуреза, диуреза [43, 44]. BNP (Brain natriuretic peptide), хотя первоначально и был очищен из мозга, экспрессируется, главным образом, в сердце. Он вызывает такие же физиологические ответы, как и ANP, но при определенных патологических условиях, таких как закупорка сосудов сердца, он высвобождается в значительно более высоких концентрациях [44]. В 1990 году был открыт третий пептид с натрийуретическими свойствами (C-type natriuretic peptide) CNP. Этот пептид имеет высокую межвидовую консервативность [45]. CNP так же был обнаружен в мозгу, но в больших концентрациях присутствует в клетках эндотелия и семенной жидкости [46].

Натрийуретические пептиды из различных организмов обладают в значительной мере сходной структурой, в частности каждый из них содержит два остатка цистеина, образующие дисульфидную связь, необходимую для взаимодействия с рецептором [47]. Структуры пептидов ANP и BNP из различных организмов являются чрезвычайно консервативными (табл. 1.).

Таблица. 1. Сравнение аминокислотных последовательностей натрийуретических

пептидов из различных организмов.

Лиганд Последовательность Источник

АКР 8ЬКК88СР00И0А<380Ь0СК8РК-У крыса, свинья

АКР 8Ыт88СР001Ш0Ад80Ь0СК8Р11-У человек, собака

ВКР КЗКМАШ 8 8 СРОдктЯЮАУ8КЬОСВОЬ11ЬР крыса

ВКР 8РКМ УС> 08 ОСРОШ<С1УПЖ(28888ОЬОСКУЪШШ свинья

ВКР 8РКТМЮЭ 8 ОСРОШШ0ЮО8Ь8ОЬОСК\ТЛ1КУ человек

ВКР 8РКММНК80СР0ККЬБК108Ь80Ь0СКУЬККУ собака

Сравнение натрийуретических пептидов различных типов между собой позволяет выделить общие черты (рис. 2). Так все они образуют 17-членное кольцо за счет образования дисульфидной связи между остатками цистеинов, содержащихся в структурах всех известных на сегодняшний день натрийуретических пептидов. 12 из 17 аминокислотных остатков, образующих кольцо, чрезвычайно консервативны и присутствуют во всех типах пептидов [48]. Все три натрийуретических пептида вызывают гипотензивные эффекты, однако, СИР хуже стимулирует выделение почечного натрия и воды [44]. Показано, что АКР и СКР уменьшают клеточную пролиферацию [42, 49] и, что трансформирующий фактор роста-/? (ТОР-/?) плохо стимулирует экспрессию мРНК СКР [46].

Было показано, что ОС-А активируется АКР пептидом не только в нативных препаратах [50, 51], но и его экспрессированная форма связывает АКР с последующим

ЗРКТМРОЭССРС Р.Р I й К I ЗивКССРСЬ К1 Р И I

САОЗСЬССМЗРР У а-АЫР в ЭЛ SG1.GCNV.LRRY ВЫР-32 в Э М Э в Ь в С СЫР

Б

н,ы-

сс-АЫР

ноос- V У

Н2Ы \

к

м

Рис. 2. (А) Аминокислотные последовательности натрийуретических пептидов а-АИР, В№-32, СИР из свиньи. Внутримолекулярные дисульфидные связи образованы двумя остатками цистеинов в каждом пептиде. Консервативные аминокислотные остатки заштрихованы. (Б) Схематическое изображение структур а-АЫР, ВЫР-32, СИР пептидов. Идентичные аминокислотные остатки обозначены пустыми кружочками [48].

повышением уровня cGMP [52]. Однако на CNP в физиологических концентрациях GC-A не отвечает. Существование множества различных пептидов с натрийуретическими свойствами и наличие гуанилатциклазной активности во многих клеточных препаратах стимулировало поиск новых членов семейства мембранных GC. Таким образом, была получена полноразмерная кДНК GC-B [53]. GC-A и GC-B имеют 98% гомологию по аминокислотной последовательности внутриклеточной части, но только 43% гомологию внеклеточных доменов [53, 54].

Хотя BNP более эффективен при стимуляции активности этого фермента, чем ANP, но оба эти лиганда не являются активными при концентрациях менее 10"7М [53]. Следовательно, эти пептиды не являются специфическими лигандами для GC-B. Поскольку CNP активирует GC-B при более низких концентрациях, чем ANP и BNP, то это позволяет предположить, что он является настоящим лигандом для этого типа ферментов [32]. Все три пептида также различаются по локализации в тканях: ANP и BNP обнаружены преимущественно в тканях сердца [43], a CNP - в мозговой и нервной тканях [45]. Предположительно CNP представляет собой нейротрансмиттер [45], но его точная внутриклеточная локализация еще не установлена. Тканевая локализация GC-A и GC-B значительно совпадает, но некоторые ткани избирательно экспрессируют лишь один рецептор. Например, предполагают, что GC-A является главным натрийуретическим рецептором почки [55], a GC-B - основной сигнальный рецептор мозга [56, 57]. Поскольку большинство эффектов натрийуретического пептида подобно действиям клеточно-проницаемых cGMP аналогов, то GC-A и GC-B являются сигнальными рецепторами для этих гормонов [43]. Механизмы, с помощью которых рецепторы натрийуретических пептидов активируются, в настоящее время выясняются.

1.3.1.2. вС, активируемая бактериальными термостабильными

энтеротоксиыами

ОС-С - рецептор, преимущественно синтезирующийся ворсинками энтероцитов в толстом и тонком кишечнике [58]. ОС-С специфично связывается и активируется термостабильными энтеротоксинами (БТа), а также другим эндогенным лигандом, названным гуанилин [59]. 8Та представляют собой семейство 18 или 19 членных пептидов, продуцируемых многочисленными энтеротоксичными штаммами Е. соИ (ЕТЕС) и многими другими бактериями. Энтеротоксиновые пептиды содержат шесть цистеинов и три дисульфидных мостика, необходимых для проявления активности. Обнаруженный в последствии гуанилин, найденный в слизистой оболочке кишечника состоит из 15 аминокислотных остатков с четырьмя цистеинами, образующими дисульфидные мосты. Гуанилин для проявления биологической активности требует окисления, последующее восстановление окисленного пептида устраняет эффект действия сОМР, указывая необходимость образования дисульфидных связей. Структура дисульфидных связей для обоих пептидов была установлена, и определен порядок важности каждой из них в связывании с кишечными рецепторами и в появлении диареи у молочных мышей. Оба пептида высокогомологичны [59]:

Таблица. 2. Первичная структура яигапдов гуанин am цикл аз ы С.

Лигапд Последовательность Источник

гуанилин PNTpiC AYAA (pTGC 1 человек

Sta NTFYCCEL !| CCNPACAG f ' CY Е. coli

Для поиска гуанилина использовали культуру раковых клеток прямой кишки человека Т84. Исследования показали, что синтезированный гуанилин конкурирует с термостабильным энтеротоксином в этих клетках. Эти данные позволили предположить, что гуанилин - активатор ОС-С и стимулирует ее так же через рецептор-связывающий участок, как и БТ [59-61]. Взаимодействие токсин-рецептор вызывает увеличение внутриклеточного сОМР, который приводит к фиброзно-кистозной дегенерации хлоридного канала, что, в конечном счете, и вызывает диарею [62]. Механизм кишечного выделительного ответа на БТ, всецело вызванный взаимодействием токсина с ОС-С рецепторным белком, не ясен. Однако биохимические и фармакологические данные наводят на мысль, что могут существовать и другие 8Т рецепторы [63, 64]. Результаты химического сговв-сшивания 1125-меченного БТ с белком указывают на то, что БТ связывающие белки кишечника (БТВР) - гетерогенны и имеют меньшую молекулярную массу, чем, нежели предсказанная ОС-С (с молекулярной массой 120 кДа) [65]. Однако последующие исследования показали, что рекомбинантная ОС-С так же дает гетерогенную картину сгоэз-сшивки, позволяющую предположить, что многие БТВР - результат процессинга ОС-С [66]. Механизм процессинга ОС-С требует изучения.

Поскольку ОС-С - кишечный рецептор, то была исследована роль питания на экспрессию ОС-С, ее структуру и локализацию с помощью биохимических и гистохимических методов, а так лее возможность воздействовать на синтез, сборку и движение кишечных белков с помощью специальных диет. ОС-С находится на поверхности ворсинок, которые содержат многочисленные специализированные гликопротеины, участвующие в расщеплении, усвоении пищи и транспорте электролитов. Эта поверхность ворсинок доступна только для частично расщепленной пищи, находящейся в полости кишечника. Перемещение пищи из этого места у голодных

животных модулирует экспрессию генов многочисленных кишечных белков [67]. Исследования показали, что такие пищевые выходы - результат активации ОС-С, потому что кишечник человека и крысы становится гиперчувствительным к БТ при недоедании и голодании [68-70]. При этом как амплитуда, так и длительность секреторного ответа на БТ увеличивается. Известно, что от иннервации целых нервных сплетений слизистой оболочки зависят изменения в продолжительности, а не в амплитуде [71]. Поэтому можно предположить, что повышение амплитуды ответа на БТ вызывается специфическими клеточными механизмами. ОС-С из мембран сытых и голодных крыс солюбилизировали при 4°С в невостанавливающих условиях. Электрофорез этих ферментов в 7% в БОБ-ПААТ показал, что белки из обоих видов крыс мигрируют, как два больших агрегата. Восстановление дисульфидных связей фермента вызывало дезагрегацию ОС-С только у сытых, а не голодных крыс, что приводило к появлению форм с меньшей массой (220 и 240 кДа). Хотя агрегаты ОС-С голодных крыс и устойчивы к дезагрегационному эффекту /?-меркаптоэтанола, через 90 минут после кормления они быстро восстанавливают способность к дезагрегации. Солюбилизация же при температуре 95°С, но в востанавливающих условиях приводит к последующей диссоциации агрегатов ОС-С с образованием небольших белков (140, 131, 85 и 65 кДа) [72, 73]. Однако гликопротеин с молекулярной массой 131 кДа увеличивается в мембранах голодных крыс не пропорционально. Субклеточное фракционирование и иммуногистохимические исследования показали мажорное перераспределение ОС-С с поверхности во внутриклеточные места энтероцитов при голодании [74].

1.3.1.3. ОС, активируемая пептидами из икры морского ежа Два пептида сперакт и резакт секретируются в икре иглокожих и активируют испускание и подвижность спермы видоспецифическим способом [75].

Таблица. 3. Первичная структура пептидов, секретируемых в икре иглокожих.

Лиганд Последовательность Источник

сперакт ОББЬШООУО Я. ригригаШз

резакт СУТОАРОСУОООИЬ-Ш2 А. рипсШШа

Первым биохимическим событием, следующим за связыванием пептидов с рецептором, является повышение внутриклеточной концентрации сОМР. Этот ответ клетки на наличие во внеклеточном пространстве пептида-активатора может быть объяснен активацией мембранной формы ОС, находящейся в плазматической мембране клетки [76]. Для выявления влияния этих пептидов были проведены эксперименты на целых клетках спермы, проинкубированных с пептидами и лишь затем гомогенизированных в детергенте, и оказалось, что активность ОС уменьшилась на 10% по отношению к ОС-активности необработанных пептидами клеток. Пептиды не ингибируют ферментативную активность солюбилизированного в детергенте белка. Другие агенты (Мопепвт А, 1МН4С1), стимулирующие эрекцию и влияющие на подвижность сперматозоидов, также уменьшали ОС-активность целых, но не солюбилизированных в детергенте сперматозоидов. Максимальное уменьшение ОС-активности происходит через 5-10 минут после добавления этих агентов.

Взаимосвязь изменения в подвижности сперматозоидов морского ежа и активации мембранной формы ОС была так же продемонстрирована в экспериментах по обработке сперматозоидов сгоэз-сшивающими агентами в присутствии активирующего пептида -резакт [77]. Оказалось, что данный пептид ковалентно пришивается к белку клеточной стенки, иммуно логически и по другим параметрам идентифицированному как мембранная форма гуанилатциклазы.

Мембранная форма гуанилатциклазы из спермы морского ежа - это гликопротеин с М -135 кДа [78]. Впоследствии из другого вида морского ежа была выделена ОС с М -150-160 кДа. Разница молекулярных масс объясняется различной степенью фосфорилирования белка [79]. В нормальных условиях данный фермент содержит на остатках серина до 17 молей фосфатных групп на моль фермента, но после обработки клеток активирующим пептидом количество фосфатных групп, ассоциированных с ОС, падает до значения менее 2 М/М фермента [80]. Также, имеются данные о том, что пептид активирует гуанилатциклазу до потери фосфатных групп, а последующее дефосфорилирование приводит к снижению активности фермента.

В 1988 году впервые [81] была клонирована кДНК мембранной формы ОС из спермы беспозвоночных. Основываясь на аминокислотной последовательности этого белка, было предложено существование трансмембранного домена, разделяющего белок примерно на две равные части. Кроме того, протяженный участок ОС, следующий за предполагаемым трансмембранным доменом оказался чрезвычайно гомологичным каталитическому домену протеинкиназ [82]. Сначала именно этому домену и были приписаны каталитические функции, но позднее стало ясно, что это не так [52, 83].

Были проведены исследования, целью которых было установить наличие в клетках млекопитающих рецепторов, сходных с обнаруженными в икре морского ежа. Кодирующая 3'-область этого гена ОС была использована в качестве зонда для гибридизации библиотеки кДНК человека [84]. Были выделены клоны, содержащие полноразмерный ген из тканей крысы (ОС-А) [52] и человека (АКР-А рецептор) [84]. Белки, кодируемые этими ДНК, имеют 90% гомологии.

1.3.2. Гуанилатциклазы, стимулируемые кальцием

Вторая группа циклаз не имеет известных внеклеточных лигандов и регулируется внутриклеточными Са2+-связывающими белками. Известно, что Са2+ является одним из универсальных регуляторов многочисленных процессов, происходящих в клетке. В процессе эволюции некоторые системы приобрели способность регулировать клеточную концентрацию свободного Са2+, выводя его во внеклеточное пространство и поддерживая его концентрацию с помощью специальных Са2+-связывающих белков. Связывание Са2+ сопровождается изменением пространственной ориентации определеннных групп белка и приводит к изменению его свойств. В зависимости от концентрации Са2+ кальций-связывающие белки по-разному взаимодействуют со своими белками-мишенями и регулируют их активность. Ярким примером такой регуляции являются палочки и колбочки фоторецепторных клеток [85].

1.3.2.1. Гуанилатциклазы фоторецепторных клеток Са2+ проникает в наружные сегменты фоторецепторных клеток позвоночных через сОМР-зависимые №7Са2+ каналы в плазматической мембране [86-88]. В темноте эти каналы позволяют Са2+ проникать в клетку, однако на свету они закрываются, и уровень свободного внутриклеточного Са2+ снижается. Са2+ продолжает непрерывно выходить из наружных сегментов благодаря независимому от света №7к', Са2+ обменнику. В результате происходит снижение концентрации свободного внутриклеточного Са2+ по сравнению с темновым уровнем в 10 раз (с 500нМ до 50нМ) [89]. Это уменьшение концентрации свободного Са2+ приводит к активации мембранной гуанилатциклазы с помощью растворимых белков [90-96]. В библиотеке кДНК сетчатки человека первоначально были идентифицированы две формы мембранных гуанилатциклаз:

RetGCl [35, 91, 97-99] и RetGC2 [100, 101] или GC-E и GC-F соответственно, которые классифицируются как фоторецепторные GC на основании гибридизационных исследований in situ. Впоследствии также были клонированы их гомологи из сетчатки быка (ROS-GC1 и ROS-GC2) [99, 101, 102] и доказано их присутствие в фоторецепторных клетках. ROS-GC1 обладает очень высокой (80%) гомологией с GC, клонированной ранее, и обозначенной как RetGCl [98]. Первоначально считали, что RetGCl и ROS-GC1 это разные белки, но принадлежащие к одному семейству не поверхностных рецепторов [99, 103], поскольку 4 сегмента клонированной ROS-GC1 дикого типа отсутствовало в RetGCl [99]. Впоследствии последовательность RetGCl была тщательно выверена и установлено, что это аналог ROS-GC1 в сетчатке человека. Аналоги ROS-GC1 и RetGCl были клонированы из глаз крысы, хотя их непосредственное присутствие в сетчатке или фоторецепторных клетках не показано [101]. Таким образом, к настоящему времени было установлено, что ROS-GC1, как и RetGCl составляют подсемейство с двумя независимыми членами. Отличительными особенностями гуанилатциклаз этого подсемейства являются: (1) отсутствие регуляции внеклеточным механизмом; (2) как правило, локализация в нейрочувствительных клетках, таких как клетки сетчатки; (3) и, главное, ROS-GC1 и RetGC2 регулируются внутриклеточными сигналами, генерируемыми кальцием, подобно сигналам возникающим при передаче зрительного сигнала.

Исследования мембран наружных сегментов фоторецепторных клеток показали, что циклазная активность в них стимулируется белками, названными гуанилатциклаз активирующими белками - GCAP [90], которые могут изменять активность GC сетчатки Са2+"зависимым образом (рис. 3). Первым кандидатом в GCAP был белок, предположительно обуславливающий чувствительность активности гунилатциклазы к концентрации Са2+ [96]; с молекулярной массой 26 кДа, названный в последствии

рековерином [104]. Высокоочищенные препараты рековерина активировали гуанилатциклазу в отмытых мембранах наружных сегментов палочек (НСП) и активность гуанилатциклазы ингибировалась Са2+. Тем не менее, последующие работы с очищенным рекомбинантным рековерином не подтвердили этих наблюдений [105], и возвращение

оо.

ШйС

гл

GTP

cGMP

+

PPi

mm

шя

G^O

iRet GC

Ca2*

jRet GC .

Рис. 3. Регуляция сетчаточной гуанилатциклазы Ret GC гуанилатциклазактивирующим белком GCAP.

НСП в интактное состояние сильно замедляется под действием рековерина [106]. Впоследствии выяснилось, что рековерин участвует в процессах регуляции активности фосфодиэстераз сетчатки быка двух других гомологичных гуанилатциклаз-активирующих белков: GCAP1 [90, 92] и GCAP2 [91, 93]. Результаты иммуноблота и иммуноцитохимического анализов показали, что GCAP1 [94] и GCAP2 [93] специфичны

для сетчатки и присутствуют в фоторецепторных клетках. Независимыми группами ученых было показано, что GCAP1 и GCAP2 могут активировать RetGC в наружных сегментах мембран in vitro в пределах концентраций свободного Са2+, соответствующих физиологическим концентрациям [90-95, 100, 109]. В отличие от пептидных лигандов, регулирующих другие известные мембранные GC через внеклеточные домены циклаз [103], оба GCAP взаимодействуют с RetGC через внутриклеточный домен циклаз [110, 111]. GCAP1 способен стимулировать только рекомбинантную RetGC 1 [94, 111], в то время как GCAP2 стимулирует как RetGC 1, так и RetGC2 [91, 100, 110]. Однако вопрос какая из двух циклаз является мишенью для каждого GCAP in vivo еще не установлено. В регуляцию RetGC могут быть также вовлечены дополнительные факторы такие как: концентрация натрия во внутриклеточной среде [112], фосфорилирование [112, 113], связывание АТР [110, 114], или связывание актина [115]. Был идентифицирован S100 белок подобный фактор (CD-GCAP) Са2+- зависимый гуанилатциклаз активирующий белок [116], однако он стимулирует RetGC in vitro при концентрациях свободного Са2+ более высоких, чем его физиологическая концентрация. Среди всех факторов, которые оказывают громадное влияние на активность RetGC, только GCAP1 и GCAP2, как было показано, стимулируют RetGC при низких концентрациях Са2+ и придают Са2+-чувствительность циклазам in vitro в ряду физиологических концентраций свободного Са2+ 50-500нМ.

1.5.2.2. Белки - активаторы гуанилатциклаз фоторецепторных клеток 1.3.2.2.1. Гуанилатциклаз-активирующие белки (GCAP) Гуанилатциклаз-активирующие белки (GCAP) принадлежат к подсемейству рековерин-подобных белков, которые включены в многообразное семейство Са2+-связывающих белков нервных тканей, таких как нейрокальцин, гипокальцин и

других [92, 93, 117]. GCAP - высококонсервативны, аминокислотная последовательность состоит из 201 (человек), 202 (мышь) и 205 (бык) остатков. Сходство аминокислотных последовательностей между GCAP млекопитающих составляет более 90%, а расчетное значение молекулярных масс 21-23 кДа. На участке 1-180 аминокислотной последовательности GCAP быка, мыши и человека имеется только одна или две неконсервативные аминокислотные замены. Показано, что именно, N-концевая область (аминокислотные остатки 2-57) вовлечена в активацию GC [92]. Анализ аминокислотной последовательности предполагает, что гуанилатциклаз-активирующие белки позвоночных - растворимые, кислые белки, лишенные гидрофобных доменов. Нативный GCAP, тем не менее, ассоциирован с мембранной и гидрофобен. Вероятнее всего, нерастворимости GCAP способствуют другие структурные элементы [117]. Одной из таких особенностей является N-концевое ацилирование [92] в позиции 2 (Gly). По аналогии с другими белками можно предположить, что эта посттрансляционная модификация, по крайней мере, частично, ответственна за ассоциацию с мембраной [118-120]. Для белков сетчатки млекопитающих характерно гетерогенное ацилирование (С14:0, С14:1, С14:2 и С12:0). В то время как, все С14 производные могут составлять до 75% от общего количества ацилированных жирнокислотных остатков, миристоилирование не превышает 25% [121-123]. Ацилирование жирнокислотным остатком миристиновой кислоты, как было показано, придает рековерину и нескольким рековерин-подобным белкам способность к компартментализации около мембран в присутствии Са2+ [124-128]. Это сродство рековерин-подобных белков к мембранам возрастает в результате экспозиции жирной ацильной группы при переходе белка в Са2+-связывающую конформацию [125, 126], механизм объясняется как "Са2+ миристоилированный переключатель" [125]. Этот механизм в рековерине был продемонстрирован измерением доступности N-концевого ацилированного жирной

кислотой остатка протеолитическому расщеплению [126] и

NMR [129, 130]. Как GCAP1, так и GCAP2 имеет консенсусную последовательность в области кДНК, кодирующей N-миристоилирование [92, 93, 131]. Опубликовано, что GCAP1 ацилирован жирнокислотным остатком [92] и, что N-концевая жирная ацильная группа может быть важна для регуляции RetGC; не ацилированный GCAP1 имеет более низкое сродство к RetGC и более низкую Са2+ чувствительность, чем ацилированный GCAP1 [132, 133].

Гуанилатциклаз-активирующие белки члены широкого и разнообразного семейства Са2+-связывающих белков, в которое включены кальмодулин, фрекенин (из синаптических окончаний Drosophila), визинин (из сетчатки цыплят), рековерин (из фоторецепторных клеток позвоночных) и еще 100 других [121]. Анализ аминокислотной последовательности рековерина (HREC), фрекенина (DFREQ) и кальмодулина (HCaMl) показал, что все они имеют центры связывания Са2+, получившие название EF-рука (hand) (рис. 4). 31 консервативных аминокислотных остатков группируются вокруг четырех EF-hand структур, что указывает на происхождение этих белков от общего предшественника.

Однако сходство последовательности между двумя фоторецепторными Са2+-связывающими белками: рековерином и GCAP1 составляет только 36%, даже принимая во внимание консервативные замены [122]. Подобно рековерину, в GCAP1 имеются два инвариантных цистеина, предположительно необходимых для образования вторичной структуры и предсказывающих три структуры EF- hand петель, вовлеченных в связывание Са2+. Единственный отличный домен, содержащий включения/удаления, локализован в вариабельной С-концевой области GCAP1. Он состоит из 20 аминокислотных остатков и отвечает за изменения в длине GCAP человека, мыши, быка [117].

Заключение диссертации по теме «Биоорганическая химия», Соловьева, Ольга Владимировна

4. ВЫВОДЫ

1. В клетках Е. coli экспрессирован фрагмент гена гуанилатциклазы В сетчатки быка, содержащий каталитический, димеризующий и часть протеинкиназоподобного домена. Продукт экспрессии получен в виде телец включения и переведен в активную растворимую форму с помощью солюбилизации и ренатурации.

2. Показано, что полученный фрагмент гуанилатциклазы В обладает димерной структурой, что ранее было установлено лишь для GC-A.

3. Осуществлена функциональная экспрессия фрагментов гена гуанилатциклазы В в метилотрофных дрожжах Pichia pastoris. Подобраны условия, обеспечивающие секрецию функционально активных рекомбинантных белков в культуральную среду.

4. Установлено, что гуанилатциклаза В обладает способностью к аутофосфорилированию. Показано, что фермент относится к семейству Ser/Thr протеинкиназ и аутофосфорилируется по остаткам серина.

5. Получены поликлональные антитела к гуанилатциклазе В, с помощью которых проведено иммуногистохимическое исследование локализации фермента в ганглиозных клетках сетчатки глаза быка.

5. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ATP - аденозин-5'-трифосфат сАМР - циклический аденозин - 3',5'-монофосфат

GC - гуанилатциклаза

GTP - гуанозин-5'-трифосфат cGMP - циклический гуанозин - 3',5'-монофосфат

БСА - бычий сывороточный альбумин

DAB - 3,3'-диаминобензидин тетрагидрохлорид

ДНК, к ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота, комплементарная ДНК ДТТ - дитиотрейтол DMSO - диметилсульфоксид

EDRF - эндотелиальный фактор, расширяющий сосуды

ЕДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

IPTG - из о пр о пил-/Ш -тио гал актопир аноз ид

KLH - гемоцианин из виноградной улитки

РНК - рибонуклеиновая кислота

PMSF - фенилметилсульфонилфторид

SDS - додецилсульфат натрия

Трис - трис(гидроксиметил)аминометан

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

ИФА - иммуноферментный анализ

М - молекулярный вес

MALDI - масс-спектрометрия с ионизацией лазерной дисорбцией

SDS-ПААГ - электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ТСХ - тонкослойная хроматография ед.акт. - единица активности а. о. - аминокислотный остаток п. о. - пара оснований

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Соловьева, Ольга Владимировна, 1999 год

6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Ishikawa, Е., Ishikawa, S., Davis, J. W., Sutherland, E. W., (1969), Determination of guanosine 3',5'-monophosphate in tissues and of guanyl cyclase in rat intestine. J. Biol. Chem., V. 244, 6371-6376.

2. White, A. A., Aurbach, G. D., (1969), Detection of guanyl cyclase in mammalian tissues. Biochim. Biophys. Acta, V. 191, 686-697.

3. Goldberg, N. D., Haddox, M. K., (1977), Cyclic GMP metabolism and involvement in biological regulation. Annu. Rev. Biochem., V. 46, 823-896.

4. Kimura, H., Murad, F., (1974), Evidence for two different forms of guanylate cyclase in rat heart. J. Biol. Chem., V. 249, 6910-6916.

5. Chrisman, T. D., Garbers, D. L., Parks, M. A., Hardman., (1975), Characterization of particulate and soluble guanylate cyclases from rat lung J. G. J. Biol. Chem., V. 250, 374-381.

6. Tremblay, J., Gerzer, R., Hamet, P., (1988), Cyclic GMP in cell function. Adv. Second Messenger and PhosphoproteinRes., V. 22, 319-385.

7. Stone, J. R., Sands, R. H., Dunham, W. R., and Marietta, M. A., (1996), Spectral and ligand-binding properties of an unusual hemoprotein, the ferric form of soluble guanylate cylase. Biochemistry, V. 35, 3258-3262.

8. Yuen, P. S., Potter, L. R., et al., (1990), A new form of guanylyl cyclase is preferentially expressed in rat kidney. Biochemistry, V. 29, 10872-10878.

9. Gerzer, R., Bohme, E., Hofmann, F., Schultz, G., (1981), Soluble guanylate cyclase purified from bovine lung contains heme and copper. FEBS Letters, V. 132, 71-74.

10. Ignarro, L. J., Wood, K. S., Wolin, M. S., (1982), Activation of purified soluble guanylate cyclase by protoporphyrin IX. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, V. 79, 2870-2873.

11. Ignarro, L. J., Wood, K. S., Wolin, M. S., (1984), Regulation of purified soluble guanylate cyclase by porphyrins and metalloporphyrins: a unifying concept. Adv. Cycl. Protein Phosphor., V. 17, 267-274.

12. Ignarro, L. J., (1987), Haem-dependent activation of guanylate cyclase and cyclic GMP formation by endogenous nitric oxide: a unique transduction mechanism for transcellular signaling. Pharmacol. Toxicol., V. 67, 1-7.

13. Palmer, R. M., Ferrige, A. G., Moncado, S., (1987), Nitric oxide releaseaccounts for the biological activity of endothelium-derived relaxing factor. Nature, V. 327, 524-526.

14. Furchgott, R. F., Zawadski, J. V., (1980), The obligatory role of endothelial cells in the relaxation of arterial smooth muscle by acetylcholine. Nature, V. 288, 373-376.

15. Palmer, R. M., Ashton, D. S., Moncado, S., (1988), Vascular endothelium cells synthesize nitric oxide from L-arginine. Nature, V. 333, 664-666.

16. Moncada, S., Palmer, R. M., Higgs, E. A., (1989), Biosynthesis of nitric oxide from L-arginine. A pathway for the regulation of cell function and communication. Biochem. Pharmacol., V. 38, 1709-1715.

17. Bredt, D. S., Snyder, S. H., (1989), Nitric oxide mediates glutamate-linked enhancement of cGMP levels in the cerebellum. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, V.86, 9030-9033.

18. Garthwaite, J., Charles, S. L., Chess-Williams, R., (1988), Endothelium-derived relaxing factor release on activation of NMDA receptors suggests role as intercellular messenger in the brain. Nature, V.336, 385-388.

19. Myers, P. M., Minor, R. J., Guerra, R., Bates, J. N., Harrison, D. G., (1990),Vasorelaxant properties of the endothelium-derived relaxing factor more closely resemble S- nitrososysteine than nitric oxide. Nature, V. 345, 161-163.

20. Gerzer, R., Bohme, E., Hoffman, F., Schultz, G., (1981), Soluble guanylate cyclase purified from bovine lung contains heme and copper. FEBS Lett., V. 132, 71-74.

21. David, M., Daveran, M-L., Batut, J., Dedieu, A., Domergue, O., Ghai, J., Hertig, C., Boistard, P., and Kahn, D., (1988), Cascade regulation of nif gene expression in Rhizobium meliloti. Cell, V.54, 671-683.

22. Gilles-Gonzalez, M. A., Gonzalez, G., Perutz, M. F., Kiger , L., Marden, M. C., and Poyart, C., (1994), Heme-based sensors, exemplified by the kinase FixL are a new class of heme protein with distinctive ligand binding and autoxidation. Biochemistry, V. 33, 8067-8073.

23. Wedel, B., Humbert, P., Harteneck, C., Foerster, J., and Koesling, D., (1994), Mutation of His-105 in the beta 1 subunit yields a nitric oxide- insensitive form of soluble guanylyl cyclase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, V. 91, 2592-2596.

24. Craven, P., DeRubertis, F., (1983), Requirement for heme in the activation of purified guanylate cyclase by nitric oxide. Biochim. Biophis. Acta, V.745, 310-321.

25. Gerzer, R., Hofman, F., Schultz, G., (1981), Purification of a soluble, sodium-nitroprusside-stimulated guanylate cyclase from bovine lung. Europ. J. Biochem., V. 116, 479-486.

26. Tsai, S. E, Adamik, R. A., Manganiello, V., Vaughan, M., (1983), Regulation of activity of purified guanylate cyclase from liver that is unresponsive to nitric oxide. Biochem. J., V.215, 447-455.

27. Garbers, D. L., (1992), Guanylyl cyclase receptors and their endocrine, paracrine, and autocrine ligands. Cell, V. 71, 1-4.

28. Garbers, D. L., Koesling, D., and Schultz, G., (1994), Guanylyl cyclase receptors. Mol. Biol. Cell, V. 5, 1-5.

29. Buechler, W. A., Nakane, M., Murad, F., (1991), Expression of soluble guanylate cyclase activity requires both enzyme subunits. Biochem. Biophis. Res. Commun., V. 174, 351-357.

30. Harteneck, C., Koesling, D., Soling, A., Schultz, G., Bohme, E., (1990), Expression of soluble guanylyl cyclase. Catalytic activity requires two enzyme subunits. FEBS Lett., V. 272, 221-223.

31. Stephen, J. F., Wong, F., and Garbers, D. L., (1992), Receptor guanylyl cyclases. J. Clin. Invest., V. 90, 299-305.

32. Koller, K. J., Lowe, D. J., Bennett, G. L., Minamino, N., Kangawa, K., Matsuo, H., Goeddel, D. V., (1991), Selective activation of the B natriuretic peptide receptor by C - type natriuretic peptide (CNP). Science, V. 252, 120-123.

33. Parkinson, S. J., Waldman, S. A., (1996), An intracellular adenine nucleotide binding site inhibits guanyly cyclase C by a guanine nucleotide-dependent mechanism. Biochemistry,V. 35, 3213-3221.

34. Ramarao,C. S., Garbers, D. L., (1985), Receptor-mediated regulation of guanylate cyclase activity in spermatozoa. J. Biol. Chem., V. 260, 8390-8396.

35. Koch, K. W., (1991), Purification and identification of photoreceptor guanylate cyclase. J. Biol. Chem., V. 266, 8634-8637.

36. Klumpp, S., Kleefeld, G., Schultz, J. E., (1983), Calcium/calmodulin-regulated guanylate cyclase of the excitable ciliary membrane from Paramecium. Dissociation of calmodulin by La3+: calmodulin specificity and properties of the reconstituted guanylate cyclase. J. Biol. Chem., V. 258, 12455-12459.

37. Schultz, J. E., Schonefeld, U., Klumpp, S., (1983), Calcium/calmodulin-regulated guanylate cyclase and calcium- permeability in the ciliary membrane from Tetrahymena. Eur. J. Biochem., V. 137, 89-94.

38. Oyama, M., Kubota, K., Okamoto, K., (1991), Regulation of guanylate cyclase by a guanine nucleotide binding protein, G alpha 2, in Dictyostelium discoideum. Biochem. Biophys. Res. Commun., V.176, 1245-1249.

39. Lippo de Becemberg, I., Herrera, V., Perez Ayuso, E., Alfonzo, M., (1982), Effects of cholinergic agents on rat liver plasma membrane guanylate cyclase. FEBS Lett., V. 137, 303-306.

40. Lippo de Becemberg, I., Pena de Aguilar, E., Camarillo, I., Gonzalez de Alfonzo, R., Alfonzo, M., (1989), Muscarinic agents modify kinetics properties of membrane-bound guanylyl cyclase activity. FEBS Lett., V. 253, 16-22.

41. Lippo de Becemberg, I., Correa de Adjounian, M. F., Sanchez de Villaroel, S., Pena de Aguilar, E., Gonzalez de Alfonzo, R., Alfonzo, M., (1995), G-protein-sensitive guanylyl cyclase activity associated with plasma membranes. Arch. Biochem. Biophys., V.324, 209-215.

42. Appel, R. G., (1992), Growth-regulatory properties of atrial natriuretic factor. Am. J. Physiol., V. 262, F911-F918.

43. Brenner, B. M., Ballermann, B. J., Gunning, M. E., Zeidel, M. L., (1990), Diverse biological actions of atrial natriuretic peptide. Physiol. Rev., V. 70, 665-699.

44. Ruskoaho, H., (1992), Atrial natriuretic peptide: synthesis, release, and metabolism. Pharmacol. Rev., V. 44, 479-602.

45. Arimura, J. J., Minamino, N., Kangawa, K., Matsuo, H., (1991), Isolation and identification of C - type natriuretic peptide in chicken brain. Biochem. Biophys. Res. Commun., V.174, 142-148.

46. Crisman, T. D., Schultz, S., Potter, L. R, and Garbers, D. L., (1993), Seminal plasma factors that cause large elevations in cellular cyclic GMP are C - type natriuretic peptides. J. Biol. Chem., V. 268, 3698-3703.

47. Misono, K. S., Fukumi, H., Grammer, R. T., Inagami, T., (1984), Rat atrial natriuretic factor: complete amino acid sequence and disulfide linkage essential for biological activity. Biochem. Biophys. Res. Commun., V.119, 524-529.

48. Sudoh, T., Minamino, N., Kangawa, K., and Matsuo, H., (1990), C - type natriuretic peptide (CNP): a new member of natriuretic peptide family identified in porcine brain. Biochem. Biophis. Res. Commun., V. 168, 863-870.

49. Hagiwara, H., Sakaguchi, H., Itakura, M., Yoshimoto, T., Furuya, M., Tanaka, S., and Hirose, S., (1994), Autocrine regulation of rat chondrocyte proliferation by natriuretic peptide C and its receptor, natriuretic peptide receptor-B. J. Biol. Chem., V. 269, 10729-10733.

50. Kuno, T., Andresen, J. W., Kamisaki, Y., Waldman, S. A., Chang, L. Y. et al., (1986), Molecular cloning and expression of murine guanylate cyclase/atrial natriuretic factor receptor cDNA. J. Biol. Chem., V. 261, 5817-5823.

51. Meloche, S., McNicoll, N., Lui, B., Ong, H., De Lean, A., (1988), Atrial natriuretic factor R1 receptor from bovine adrenal zona glomerulosa: purification, characterization, and modulation by amiloride. Biochemistry, V. 27, 8151-8158.

52. Chinkers, M., Garbers, D. L., Chang, M. S., Lowe, D. G., Chin, H. et al., (1989), A membrane form gyanylat cyclase is an atrial natriuretic peptide receptor. Nature, V. 338, 78-83.

53. Schultz, S., Singh, S., Bellet, R. A., Singh, G., Tubb, D. J., Garbers, D. L., (1989), The primary structure of a plasma membrane guanylate cyclase. Cell, V. 58, 1155-1162.

54. Chang, M. S., Lowe, D. G., Lewis, M., Helmiss, R, Chen, E., Goeddel, D. V., (1989), Differential activation by atrial and brain natriuretic peptids of two different receptor gyanylat cyclase. Nature, V. 341, 68-72.

55. Yamamoto, T., Feng, L., Mizuno,T., Hirose, S., Kawasaki, K., Yaoita, E., Kichara, I., and Wilson, C. B., (1994), Expression of mRNA for natriuretic peptide receptor subtypes in bovine kidney. Am. J. Physiol., V. 267, F318-324.

56. Wilcox, J. N., Augustine, A., Goeddel, D.V., and Lowe, D. G., (1991), Differential regional expression of three natriuretic peptide receptor genes within primate tissues. Mol. Cell Biol., V. 11, 3454-3462.

57. Herman, J. P., Dolgas C. M., Rucker, D., and Langub, M. C., (1996), Localization of natriuretic peptide-activated guanylate cyclase mRNAs in the rat brain. J. Comp. Neurol., V. 369, 165-187.

58. Schulz, S., Green, C. K. Yuen, P. S., Garbers, D. L., (1990), Guanylyl cyclase is a heat-stable enterotoxin receptor. Cell, V.63, 941-948.

59. Currie, M. G., Fok, K. F., Moore, R. J., Hamra, F. K, Duffin, K. L. and Smith, C. E., (1992), Guanylin: an endogenous activator of intestinal guanylate cyclase. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., V. 89, 947-951.

60. de Sauvage, F. J., Keshav, S., Kuang, W. J., Gillett, N., Henzel, W., Goeddel, D. V., (1992), Precursor structure, expression, and tissue distribution of human guanylin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., V. 89, 9089-9093.

61. Schulz, S., Chrisman, T. D., Garbers, D. L., (1992), Cloning and expression of guanylin. Its existence in various mammalian tissues. J.Biol.Chem., V. 267, 16019-16021.

62. Chao, A. C., de Sauvage, F. J., Dong, Y. J., Wagner, J. A, Goeddel, D. V., and Gardner, P., (1994), Activation of intestinal CFTR CI- channel by heat-stable enterotoxin and guanylin via cAMP-dependent protein kinase. EMBO J., V. 13, 1065-1072.

63. Drewett, J.G., and Garbers, D. L., (1994), The family of guanylyl cyclase receptors and their ligands. ENDOCRINE REVIEWS, V. 15, 135-162.

64. Mann, E. A., Cohen, M. B., and Giannella, R. A., (1993), Comparison of receptors for Escherichia coli heat-stable enterotoxin: novel receptor present in IEC-6 cells. Am. J. Physiol., V. 264, G172-G178.

65. Ivens, K., Gazzano, H., O'Hanley, P., and Waldman, S. A., (1990), Heterogeneity of intestinal receptors for Esherichia coli heat-stable enterotoxin. Infect. Immun., V. 58, 1817-1820.

66. de Sauvage, F. J., Camerato, T. R, andGoeddel, D. V., (1991), Primary structure and functional expression of the human receptor for Escherichia coli heat-stable enterotoxin. J. Biol. Chem, V. 266, 17912-17918.

67. Hodin, R. A., Graham, J. R., Meng, S., and Upton, M. P., (1994), Temporal pattern of rat small intestinal gene expression with refeeding. Am. J. Physiol., V. 266, G83-G89.

68. Levin, R. J., (1992), The diarrhoea of famine and severe malnutrition - is glucagon a major culprit? GUT, V. 33, 432-434.

69. Young, A., and Levin, R. J., (1990), cAMP levels stimulated by secretagogues are greater in ileal enterocytes isolated from starved compared to fed rats. J. Physiol. Lond., V. 355, 449-456.

70. Young, A., and Levin, R. J., (1992), Intestinal hypersecretion of the refed starved rat: a model for alimentary diarrhoea. GUT, V. 33, 1050-1056.

71. Nzegwu, H. C., and Levin, R. J., (1994), Role of the enteric nervous system in the maintained hypersecretion induced by enterotoxin Sta in the nutritionally deprived intestine. GUT, V. 35., 1327-1343.

72. Vaandrager, A. B., van der Wiel, E., and De Jonge, H. R, (1993), Heat-stable enterotoxin activation of immunopurified guanylyl cyclase C. Modulation by adenine nucleotides. J. Biol. Chem., V. 268, 19598-19603.

73. Vaandrager, A. B., Schulz, S., De Jonge, H. R., and Garbers D. L., (1993), Guanylyl cyclase C is an N-linked glycoprotein receptor that accounts for multiple heat-stable enterotoxin -binding proteins in the intestine. J. Biol. Chem., V. 268, 2174-2179.

74. Scheving, L. A., Russell, W. E., Chong, K. M., (1996), Structure, glycosylation, and localization of rat intestinal guanylyl cyclase C: modulation by fasting. Am. J. Physiol., V. 271, G959-G968.

75. Chodavarapu, R. S., and Garbers, D. L., (1985), Receptor-mediated regulation of guanylate cyclase activity in spermatozoa. J. Biol. Chem., V. 260, 8390-8396.

76. Bentley, J. K., Tubb, D. J., Garbers, D. L.,(1986), Receptor-mediated activation of spermatozoan guanylate cyclase. J. Biol. Chem., V. 261, 14859-14862.

77. Shimomura, H., Dangott, L. G., Garbers, D. L., (1986), Covalent coupling of a Resact analogue to guanylate cyclase. J. Biol.Chem. V. 261, 15778-15782.

78. Garbers, D. L., (1976), Sea urchin sperm guanylate cyclase. Purification and loss of cooperativity. J. Biol. Chem., Y. 251, 4071-4077.

79. Ward, G. L., Garbers, D. L., Vacquier, V. D., (1985), Effects of extracellular egg factors on sperm gyanylat cyclase. Science, Y. 227, 768-770.

80. Vacquier, V. D., Moy, G. V., (1986), Stoichiometry of phosphate loss from seaurchin sperm guanylate cyclase during fertilization. Biochem. Biophis. Res. Commun., V. 137, 1148-1152.

81. Singh, S., Lowe, D. G., Thorpe, D. S., Rodrigues, H., Kuang, W., Dangott, L. J., Chinkers, M., Goeddel, D.V., Garbers, L., (1988), Membrane guanylate cyclase is a cell-surface receptor with homology to protein kinases. Nature, V. 334, 708-712.

82. Hanks, S. K., Quinn, A. M., Hunter, T., (1988), The protein kinase famile conserved features and deduced phylogeny of the catalytic domains. Science, V. 241, 42-52.

83. Thorpe, D. S., Morkin, E., (1990), The carboxyl region contains the catalytic domain of the membrane form of guanylate cyclase. J. Biol. Chem., 1990, V. 265, 14717-147120.

84. Lowe, D. G., Chang, M. S., Hellmiss, R., Chen, E., Singh, S., Garbers, D. L., and Goeddel, D. V., (1989), Human atrial natriuretic peptide receptor defines a new paradigm for second messenger signal transduction. EMBO. J., V. 8, 1377-1384.

85. Rudnicka-Nawrot, M., Surgucheva, I., Hulmes, J. D., Haeseleer, F., Sokal, I., Crabb, J. W., Baehr, W., Palczewski, K., (1998), Changes in biological activity and folding of guanylate cyclase-activating protein 1 as a function of calcium. Biochemistry, V. 37, 248-257.

86. Baylor, D., (1996), How photons start vision. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., Y. 93, 560-565.

87. Koutalos, Y., and Yau, K. W., (1996), Calcium regulation of rod sensitivity. Trends Neurosci., V. 19, 73-81.

88. Yarfitz, S., and Hurley J. B., (1994), Transduction mechanisms of vertebrate and inverbrate photoreceptors. J. Biol. Chem., V. 269, 14329-14332.

89. Gray-Keller, M. P., and Detwiler, P. B., (1994), The calcium feedback signal in the phototransduction cascade of vertebrate rods. Neuron, V. 13, 849-861.

90. Gorczyca, W. A., Gray-Keller, M. P., Detwiler, P. B., and Palczewski, K., (1994), Purification and physiological evaluation of a guanylate cyclase activating protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., V. 91, 4014-4018.

91. Dizhoor, A. M., Lowe, D. G., Olshevskaya, E. V., Laura, R. P., Hurley, J. B., (1994), The human photoreceptor membrane guanylyl cyclase, RetGC, is present in outer segments and is regulated by calcium and a soluble activator from retinal rods. Neuron, V. 12, 1345-1352.

92. Palczewski, K., Subbaraya, I., Gorczyca, W. A., Helekar, B., Ruiz, C., Ohguro, H., Huang, J., Zhao, X., Crabb, J. W., Johnson, R. S., Walsh, K. A., Gray-Keller, M.P., Detwiler, P. B and Baehr, W., (1994), Molecular cloning and characterization of retinal photoreceptor gyanylyl cyclase - activating protein. Neuron, V. 13, 395-404.

93. Dizhoor, A. M., Olshevskaya, E. V., Henzel, W. J., Wong, S. C., Stults, J. T., Ankoudinova, I., and Hurley, J.B., (1995), Cloning, sequencing, and expression of 24 kDa Ca plus-binding protein activating photoreceptor guanylyl cyclase. J. Biol. Chem., V. 270, 25200-25206.

94. Gorczyca, W. A., Polans, A., Surgucheva, I., et al., (1995), Gyanylat cyclase activating protein. J. Biol. Chem., V. 270, 22029-22036.

95. Lolley, R. N., and Racz, E., (1982), Calcium modulation of cyclic GMP synthesis in rat visual cells. Vision Res., V. 22, 1481-1486.

96. Koch, K. W., and Stryer, L., (1988), Highly cooperative feedback control of retinal rod guanylate cyclase by calcium ions. Nature, V. 334, 64-66.

97. Hayashi, F., and Yamazaki, A., (1991), Polymorphism in purified guanylate cyclase from vertebrate rod photoreceptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., V. 88, 4746-4750.

98. Shyjan, A. W., de Sauvage, F. J., Gillett, N. A., Goeddel, D. V., and Lowe, D. G., (1992), Molecular cloning of a retina-specific membrane guanylate cyclase. Neuron, V. 9, 727-737.

99. Goraczniak, R. M., Duda, T., Sitaramayya, A., and Sharma, R. K J., (1994), Structural and functional characterization of the rod outer segment membrane guanylate cyclase. Bichem. J., V. 302, 455-461.

100. Lowe, D. G., Dizhoor, A. M., Lui, K., Gu, O., Laura, R, Lu, L., and Hurley, J. B., (1995), Cloning and expression of a second photoreceptor-specific membrane retina guanylate cyclase (RetGC), RetGC-2. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., V. 92, 5535-5539.

101. Yang, R. B., Foster, D. C., Garbers, D. L., and Fulle, H. J., (1995), Two membrane forms of guanylate cyclase found in the eye. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., V. 92, 602-606.

102. Margulis, A., Goraczniak, R. M., Duda, T., Sharma, R. K ., Sitaramayya, A., (1993), Structural and biochemical identity of retinal rod outer segment membrane guanylate cyclase. Biochem. Biophys. Res. Comm., V. 194, 855-861.

103. Garbers, D. L., Lowe, D. G., (1994), Guanylat cyclase receptors, J. Biol. Chem., V. 269, 30741-30744.

104. Dizhoor, A. M., Ray, S., Kumar, S., Neimi, G., Spencer, M., Brolley, D., Walsh, K. A., Philipov, P. P., Hurley, J. B., and Stryer, L., (1991), Recoverin: a calcium sensitive activator of retinal rod guanylate cyclase. Science, V. 251, 915-918.

105. Hurley, J. B., Dizhoor, A. M., Ray, S., and Stryer, L., (1993), Recoverin's Role: Conclusion Withdraun. Science, V. 260, 740.

106. Gray-Keller, M. P., Polans, A. S., Palczewski, K., and Detwiler, P., (1993), The effect of recoverin-like calcium-binding proteins on the photoresponse of retinal rods. Neuron, V. 10, 523-531.

107. Kawamura, S., Hisatomi, O., Kayada, S., Tokunaga, F., Kuo, C. H., et al., (1993), Recoverinhas S-modulin activity in frog rods. J. Biol. Chem., V. 268, 14579-14582.

108. Nikonov, S. S., Filatov, G. N.. and Fesenko, E. E., (1993), On the activation of phosphodiesterase by a 26 kDa protein. FEBS Lett., V. 316, 34-36.

109. Dizhoor, A. M., and Hurley, J. B., (1996), Inactivation of EF-hands makes GCAP-2 (p24) a constitutive activator of photoreceptor guanylyl cyclase by preventing a Ca2+ induced "activator-to-ingibitor" transition. J. Biol. Chem., V. 271, 19346-19350.

110. Laura, R. P., Dizhoor, A. M., and Hurley, J. B., (1996), The membrane guanylate cyclase. Retinal guanylate cyclase-1, is activated through its intracellular domain. J. Biol. Chem., V. 271, 11646-11651.

111. Duda, T., Goraczniak, R. M., Surgucheva, I., Rudnicka-Nawrot, M., Gorczyca, W. A., Palczewski, K., Sitaramayya, A., Baehr, W., and Sharma, R. K., (1996), Calcium modulation of bovine photoreceptor guanylate cyclase. Biochemistry, V. 35, 8478-8482.

112. Wolbring, G., and Schnetkamr, P. P., (1996), Activation by PKC of the Ca2+ - sensitive guanylate cyclase in bovine retinal rod outer segments measured with an optical assay. Biochemistry, V. 35, 11013-11018.

113. Aparicio, J. G., and Applebury, M. L., (1995), The bovine photoreceptor outer segment guanylate cyclase: purification, kinetic properties, and molecular size. Protein Expression & Purification., V. 6, 501-511.

114. Sitaramayya, A., Duda, T., and Sharma, R. K., (1995), Regulation of bovin rod outer segment membrane guanylate cyclase by ATP, phosphodiesterase and metal ions. Mol. Cell. Biochem., V. 148, 139-145.

115. Hallet, M. A., Defeat, J. L., Arikawa, K., Schlamp, C. L., Kong, F. S., and Williams, D. S., (1996), Distribution of guanylat cyclase within photoreceptor outer segment. J. Cell Sci., V. 109, 1803-18012.

116. Pozdnyakov, N., Yoshida, A., Cooper, N. G., Margulis, A., Duda, T., Sharma, R. K., and Sitaramayya, A., (1995), A novel calcium-dependent activator of retinal rod outer segment membrane guanylate cyclase. Biochemistry, V. 34, 14279-14283.

117. Subbaraya, I., Ruiz, C. C., Helekar, B. S., Zhao, X., Gorczyca, W. W., Pettenati, M. J., Rao, P. N., Palczewski, K., and Baehr, W., (1994), Molecular characterization of human and mouse photoreceptor guanylate cyclase-activating protein (GCAP) and chromosomal localization of the human gene. J. Biol. Chem. V.269, 31080-31089.

118. Neubert, T. A., Johnson, R. S., Hurley, J. B., and Walsh, K. A., (1992), The rod transducin alpha subunit amino terminus is heterogeneously fatty acylated. J. Biol. Chem., V. 267, 18274-18277.

119. Yang, Z., Wensel,T. G., (1994), Inorganic pyrophosphatase from bovine retinal rod outer segments. J. Biol. Chem., V. 267, 24634-24640.

120. Resh, M. D., (1994), Myristylation and palmitylation of Src family members:the fats of the matter. Cell, V. 76, 411-413.

121. Nakayama, S., Moncrief, N. D., and Kretsinger, R. H., (1992), Evolution of EF-hand calcium-modulated proteins. II. Domains of several subfamilies have diverse evolutionary histories. J. Mol. Evol., V. 34, 416-448.

122. Flaherty, K. M., Zozullya, S., Stryer, L., and McKay, D., (1993), Three-Dimension structure of recoverin, a calcium sensor in vision. Cell, V. 75, 709-716.

123. Bagby, S., Harvey, T. S., Kay, L. E., Eagle, S. G., Inouye, S., and Ikura, M., (1994), Unisual helix-containing Greek key in development-specific Ca2+ -binding protein S. 'H, 15N, and

13C assignment and secondary structure determined with the use of multidimensional double and trple resonance heteronuclear NMR spectroscopy. Biochemistry, V.33, 2409-2421.

124. Kawamura, S., and Murakami, M., (1991), Calcium-dependent regulation of cyclic GMP phosphodiesterase by a protein from frog retinal rods. Nature, V. 349, 420-423.

125. Zozulya, S., and Stryer, L., (1992), Calcium-myristoyl protein switch. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., V. 89, 11569-11573.

126. Dizhoor, A. M., Chen, C.-K., Olchevskaya, E. V., Sinelnikova, V. V., Phillipov, P., and Harley, J. B., (1993), Role of the acylated amino terminus of recoverin in Ca2+-dependent membrane interaction. Science, V. 259, 829-832.

127. Kobayashi, M., Takamatsu, K., Saitoh, S., and Noguchi, T., (1993), Myristoylation of hippocalcin is linked to its calcium-dependent membrane association properties. J. Biol. Chem., V. 268, 18898-18904.

128. Ladant, D., (1995), Calcium and membrane binding properties of bovine neurocalcin 5 expressed in Escherichia coli. J. Biol. Chem., V. 270, 3179-3185.

129. Hughes, R. E., Brzovic, P. S., Klevit, R. E., and Hurley, J. B., (1995), Calcium-dependent solvation of the myristoyl group of recoverin. Biochemistry, V. 34, 11410-11416.

130. Ames, J. B., Tanaka, T., Ikura, M., and Stryer, L., (1995), Nuclear magnetic resonance evidence for Ca2+" induced extrusion of the myristoyl group of recoverin. J. Biol. Chem., V. 270, 30909-30913.

131. Surgucheva, I., Subbaraya, I., Palczewski, K., and Baehr, W., (1996), Invest. Ophthalmol.& Visual Sci., V. 37, S215.

132. Frins, S., Bonigk, W., Muller, F., Kellner, R., and Koch, K.-W., (1996), Functional characterization of a guanylyl cyclase-activating protein from vertebrate rods. Cloning, heterologous expression, and localization. J. Biol. Chem., V. 271, 8022-8027.

133. Olshevskaya, E. V., Hughes, R. E., Hurley, J. B., and Dizhoor, A. M., (1997), Calcium binding, but not a calcium-myristoil switch, controls the ability of guanylyl cyclase-activating protein GCAP-2 to regulate photoreceptor guanylyl cyclase. J. Biol. Chem., V. 272, 14327-1433.

134. Pongs, O., Lindemeier, J., Zhu, X. R., Theil, T., Engelkamp, D., Krah-Jentgens, I., Lambrecht, H. G., Koch, K. W., Schwemer, J., Rivosecchi, R., et al, (1993), Frequenin~a novel calcium-binding protein that modulates synaptic efficacy in the Drosophila nervous system. Neuron, V. 11(1), 15-28.

135. SenGupta, B., Friedberg, F., Detera-Wadleigh, S. D., (1987), Molecular analysis of human and rat calmodulin complementary DNA clones. Evidence for additional active genes in these species. J. Biol. Chem., V. 262, 16663-70.

136. Zimmer, D. B., and Van Eldik, L. J., (1987), Tissue distribution of rat S100 alpha and S100 beta and SlOO-binding proteins. Am. J. Physiol. V. 252, 285-289.

137. Suzuki, F., Nakajima, T., and Kato, K., (1982), Peripheral distribution of nervous system-specific S-100 protein in rat. J. Biochem. V. 92, 835-838.

138. Hilt, D. C., and Kligman, D., (1991) in Novel Calcium-Binding Proteins (Heizmann, C. W., Ed.), 65-103, Springer-Verlag, New York.

139. Donato, R., (1986), S-100 proteins. Cell calcium, V. 7, 123-145.

140. Van Eldik, L. J., and Zimmer, D. B., (1988), in Calcium and Calcium Binding Proteins (Gerday, C. L., Gilles, R., and Boils, L., Eds.), 114-127, Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg.

141. Szebenyi, D. M. E., Obendorf, S. K., and Moffat, K., (1981), Structure of vitamin D-dependent calcium-binding protein from bovine intestine. Nature, V. 294, 327-332.

142. Baudier, J., Glasser, N., and Gerard, D., (1986), J. Biol. Chem. V. 261, 8192-8203.

143. Kudo, S., Muto, Y., Inagaki, M., Hidaka, H., and Nozawa, Y., (1985), Interaction of calcium-binding proteins with calmodulin- dependent guanylate cyclase in Tetrahymena plasma membrane. Comp. Biochem. Physiol., V. 80B, 495-498.

144. Kligman, D., and Marshak, D., (1985), Purification and characterization of a neurite extension factor from bovine brain. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., V. 82, 7136-7139.

145. Pozdnyakov, N., Goraczniak, R., Margulis, A., Duda, T., Sharma, R. K ., Yoshida, A., and Sitaramayya, A., (1997), Structural and functional characterization of retinal calcium-dependent guanylate cyclase activator protein (CD-GCAP): identity with SlOOe protein. Biochemistry, V. 36, 14159-14166.

146. Kudo, S., Nakazawa, K., Nagao, S., and Nozawa, Y., (1982), Calmodulin alters the cation requirement of membrane-bound guanylate cyclase in Tetrahymena. Jpn. J. Exp. Med., V. 52, 193-200.

147. Schultz, J. E. and Klumpp, S., (1980), Guanylate cyclase in the excitable ciliary membrane of Paramecium, FEBS Lettr., V.122, 64-66.

148. Schultz, J. E. and Klumpp, S, (1982), FEMS Microbiol. Lett., V. 13, 303-306.

149. Kakiuchi, S., Sobue, K., Yamazaki, R., Nagao, S., Umeki, S., Nozawa, Y., Yazawa, M., and Yagi, K., (1981), Ca2+-dependent modulator proteins from Tetrahymena pyriformis, sea anemone, and scallop and guanylate cyclase activation. J. Biol. Chem., V. 256, 19-22.

150. Klumpp, S., and Schultz, J. E., (1982), Characterization of a Ca2+"dependent guanylate cyclase in the excitable ciliary membrane from Paramecium. Eur. J. Biochem., V. 124, 317-324.

151. Thiele, J., Klumpp, S., Schultz, J. E., and Bardele, C. F., (1982), Differential distribution of voltage-dependent calcium channels and guanylate cyclase in the excitable ciliary membrane from Paramecium tetraurelia. Eur. J. Cell. Biol., V. 28, 3-11.

152. Lagace, L., Chandra, T., Woo, S. L. C., and Means, A. R., (1983), Identification of multiple species of calmodulin messenger RNA using a full length coplementary DNA. J. Biol. Chem., V. 258, 1684-1688.

153. Kudo, S., Muto, Y., Nagao, S., Naka, M., Hidaka, H., Sano, M., and Nozawa, Y., (1982), Specificity of Tetrahymena calmodulin in activation of calmodulin-regulated enzymes. FEBS Lettr., V. 149, 271-276.

154. Chinkers, M., Garbers, D. L., (1989), The protein kinase domain of the ANP receptor is reguired for signaling. Science, V. 245, 1392-1394.

155. Chinkers, M., and Wilson, E. M., (1992), Ligand-independent oligomerization of natriuretic peptide receptors. Identification of heteromeric receptors and a dominant negative mutant. J. Biol. Chem., V. 267, 18589-18597.

156. Ullrich, A., and Schlessinger, J., (1990), Signal transduction by receptors with tyrasine kinase activity. Cell, V. 61, 203-212.

157. Cunningham, B. C., Ultsch, M., De, V. A., Mulkerrin, M. G., and Wells, J. A., (1991), Dimerization of the extracellular domain of the human growth hormone receptor by a single hormone molekule. Science, V. 254, 821-825.

158. Gill, G. N., Bertics, P. J., and Santon, J. B., (1987), Epidermal growth factor and its receptor. Mol. Cell. Endocrinol., V. 51, 169-186.

159. Iwata, T., Uchida-Mizuno, K., Katafuchi, T., Ito, T., Hagiwara, H., and Hirose, S., (1991), Bifunctional atrial natriuretic peptide receptor (type A) exists as a disulfide-linked tetramer in plasma membranes of bovine adrenal cortex. J. Biochem. (Tokyo), V. 110, 35-39.

160. Lowe, D. G., (1992), Human natriuretic peptide receptor-A guanylyl cyclase is self-associated prior to hormone binding. Biochemistry, V. 31, 10421-10425.

161. Thompson, D. K., and Garbers, D. L., (1995), Dominant negative mutations of the guanylyl cyclase-A receptor. Extracellular domain deletion and catalytic domain point mutations. J. Biol. Chem., V. 270, 425-430.

162. Vaandrager, A., van der Weil, E., Horn, M. L., Luthjens, L. H., and Jong, H., (1994), Heat-stable enterotoxin receptor guanylat cyclase-C is an oligomer consisting of functionally

distinet subunits, which are non-covalently linked in the intestine. J. Biol. Chem., V.269, 16409-16415.

163. Chinkers, M., Singh, S., and Garbers, D. L., (1991), Adenine nucleotides are required for activation of rat atrial natriuretic peptide receptor/guanylyl cyclase expressed in a baculovirus system. J. Biol. Chem., V. 266, 4088-4093.

164. Roller, K. J., de Sauvage, F. J., Lowe, D. G., and Goeddel, D. V., (1992), Conservation of the kinaselike regulatory domain is essential for activation of the natriuretic peptide receptor guanylyl cyclases. Mol. Cell. Biol., V. 12, 2581-2590.

165. Koller, K. J., Lipari, M. T., and Goeddel, D. V., (1993), Proper glycosylation and phosphorylation of the type A natriuretic peptide receptor are required for homone-stimulated guanylyl cyclase activity. J. Biol. Chem., V. 268, 5997-6003.

166. Aparicio, J. G., and Applebury, M. L., (1996), The bovine photoreceptor outer segment guanylate cyclase: purification, kinetic properties, and molecular size. J. Biol. Chem., V. 271, 27083-27089.

167. Chinkers, M., (1994), Targeting of a distinctive protein-serine phosphatase to the protein kinase-like domain of the atrial natriuretic peptide receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., V. 91, 11075-11079.

168. Garbers, D. L., (1989), Molecular basis of fertilization. Annu. Rev. Biochem., V. 58, 719-742.

169. Bottari, S. P., King, I. N., Reichlin, S., Sahlstroem, I., Lydon, N., and Gasparo, M., (1992), The angiotensin AT2 receptor stimulates protein tyrosine phosphatase activity and mediates inhibition of particulate guanylate cyclase. Biochem. Biophys. Res. Commun., V. 183, 206-211.

170. Duda, T., and Sharma, R. K., (1990), Regulation of guanylate cyclase activity by atrial natriuretic factor and protein kinase C. Mol. Cell. Biochem., V. 93, 179-184.

171. Yasunari, K., Kohno, M., Murakawa, K. I., Yokokawa, K., and Takeda, T., (1992), Phorbol ester and atrial natriuretic peptide receptor response on vascular smooth muscle. Hypertension, V. 19, 314-319.

172. Potter, L. R., and Garbers, D. L., (1992), Dephosphorylation of the guanylyl cyclase-A receptor causes desensitization. J. Biol. Chem., V. 267, 14531-14534.

173. Potter, L. R., and Garbers, D. L., (1994), Protein kinase C- dependent desensitization of the atrial natriuretic peptide receptor is mediated by dephosphorylation. J. Biol. Chem., V. 269, 14636-14642.

174. Gorczyca, W. A., Van Hooser, J. P., and Palczewski, K., (1994), Nucleotide inhibitors and activators of retinal guanylyl cyclase. Biochemistry, V. 33, 3217-3222.

175. Sitaramayya, A., Marala, R. B., Hakki, S., and Sharma, R. K., (1991), Interactions of nucleotide analogues with rod outer segment guanylate cyclase. Biochemistry, V. 30, 6742-6747.

176. Wolbring, G., and Schnetkamp, P. P. M., (1995), Activation by PKC of the Ca2+-sensitive guanylyl cyclase in bovine retinal rod outer segments measured with an optical assay. Biochemistry, V. 34, 4689-4695.

177. Chang, C., Kohse, K. P., Chang, B., Hirata, M., Jiang, B., Douglas, J. E., and Murad, F., (1990), Characterization of ATP-stimulated guanylate cyclase activation in rat lung membranes. Biochem. Biocphys. Acta, V. 1052, 159-165.

178. Duda, T., Goraczniak, R. M., Sitaramayya, A., and Sharma, R. K., (1993), Cloning and expression of an ATP-regulated human retina C - type natriuretic factor receptor guanylate cyclase. Biochemistry, V. 32, 1391-1395.

179. Gaidarov, I. O., Suslov, O. N., and Abdulaev, N. G., (1993), Enzymes of the cyclic GMP metabolism in bovin retina. 1. Cloning and expression of the gene for guanilate kinase. FEBS Letters, V. 35, 81-84.

180. Abdulaev, N. G., Karaschuk, G. N., Ladner, J. E., Kakuev, D. L., Yakhyaev, A. V., Tordova, M., Gaidarov, I. O., Popov, V. I., Fujiwara, J. H., Chinchilla, D., Eisenstein, E., Gilliland, G. L., Ridge, K. D., (1998), Nucleoside diphosphate kinase from bovine retina: purification, subcellular localization, molecular cloning, and three-dimensional structure. Biochemistry, V. 40, 13958-13967.

181. Шмуклер Б. E., Зубов Д. В., Абдулаев Н. Г., (1993), Обнаружение экспрессии мембранной формы гуанилатциклазы типа GC-B в сетчатке быка. Биоорган, химия, Т. 9, 682-685.

182. Ефимов В. А., Фрадков А. Ф., Калинкина А. Л., Чахмахчева О. Г., (1995), Экспрессирующие векторы, обеспечивающие синтез рекомбинантных белков в виде гибридов с металлсвязывающими пептидами. Биоорган, химия, Т. 21, 9-16.

183. Studier, F., Moffatt, В., (1986), Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J. Mol. Biol., V. 189, 113-130.

184. Hockney, R., (1994), Recent developments in heterologous protein production in Escherichia coli. Trends Biotechnol., V. 12, 456-463.

185. Ausubel, F. M., Brent, R, Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K., (1990), Current Protocols in Molecular Biology. Publiched by Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience, John Wiley & Sons, Inc.

186. Fischer, В., Sumner, I., and Goodenough, P., (1993), Isolation, renaturation, and formation of disulfide bonds of eukaryotic proteins expressed in Escherichia coli as inclusion bodies. Biotechnology & Bioengineering, V. 41, 3-13.

187. Saxena, V. P., Wetlaufer, D. В., (1970), Formation of three-dimensional structure in proteins. Biochemistry, V. 9, 5015-5022.

188. Catty, P., Deterre, P., (1991), Activation and solubilization of the retinal cGMP-specific phosphodiesterase by limited proteolysis. Role of the C-terminal domain of the beta-subunit. Eur. J. Biochem., V. 199, 263-269.

189. Kutuzov, M., Pfister, C., (1994), Activation of the retinal cGMP-specific phosphodiesterase by the GDP-loaded alpha-subunit of transducin. Eur. J. Biochem., V. 220, 963-971.

190. Wilson, E., Chinkers, M., (1995), Identification of sequences mediating guanylyl cyclase dimerization. Biochemistry, V. 34, 4696-4701.

191. Cregg, J. M., Tschopp, J. F., Stillman, C., Siegel, R, Akong, M., Craig, W. S., Buckholtz, R. G., Madden, K. R, Kellaris, P. A., Davis, G. R, Smiley, B. L., Cruze, J., and al., (1987), High-level expression and efficient assembly of hepatitis B surface antigen in the methylotrophic yeast, Pichiapastoris. Bio/Technology, V. 5, 479-485.

192. Romanos, M. A., Scorer, C. A., and Clare, J. J., (1992), Foreign gene expression in yeast: a Review. Yeast, V. 8, 423-488.

193. Goraczniak, R. M., Duda, T. and Sharma, R. K., (1997), Structural and Functional Characterization of a Second Subfamily Member of the Calcium-Modulated Bovine Rod Outer Segment Membrane Guanylate Cyclase, ROS-GC2. Submitted (31-MAR-1997) Cell Biology, UMDNJ, 2 Medical Center Drive, Stratford, NJ 08084, USA.

194. Yamaguchi, M., Rutledge, L. J. and Garbers, D. L., (1990), The primary structure of the rat guanylyl cyclase A/atrial natriuretic peptide receptor gene. J. Biol. Chem., V. 265, 20414-20420.

195. Fenrick, R, Babinski, K., McNicoll, N., Therrien, M., Drouin, J., and De Lean, A., (1994), Cloning and functional expression of the bovine natriuretic peptide receptor-B (Natriuretic factor Ric subtype. Mol. Cell. Biochemistry, V. 137, 173-182.

196. Azeredo, F. A. M., Lust, W. D., and Passonneau, J. V., (1981), Light-induced change in energy metabolites, guanine nucleotides, and guanylate cyclase within frog retinal layers. J. Biol. Chem. 256, 2731-2735.

197. Tabor, S., and Richardson, C. C., (1987), DNA sequenceanalysis with amodified bacteriophag T7 DNA polymerase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., V. 84, 4767-4771.

198. Sambrook J., Fritsch E., Maniatis T., (1989), Molecular Cloning. N. Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press., Cold Spring Harbor, NY.

199. Bradford M., (1976), A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem., Y. 72, 248-254.

200. Laemmli U. K., (1970), Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, V. 227, 680-685.

201. Guthrie, C., Fink, G.R., (1991), Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology.

202. Kamps, M. P., and Sefton, B. M., (1989), Acid and base hydrolysis of phosphoproteins bound to immobilon facilitates analysis of phosphoamino acids in gel-fractionated proteins. Anal. Biochem., V. 176, 22-27.

203. Boyle, W. J., Van der Greer, P., and Hunter, T., (1991), Methods Enzymol., V. 201, 110-149.

204. Harlow, E., Lane, D., (1988), Antibodies: Cold Spring Harbor Laboratory Press., Cold Spring Harbor, NY.