Исследование структуры и свойств флуоресцентных химер малых белков теплового шока человека тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, кандидат наук Дацкевич, Петр Николаевич

• Дацкевич, Петр Николаевич
• кандидат наук
• 2014

Оглавление диссертации кандидат наук Дацкевич, Петр Николаевич

Введение

I. Обзор литературы

1. Малые белки теплового шока (sHsp)

1.1 Структура малых белков теплового шока

1.2 Фосфорилирование малых белков теплового шока

1.3 Малые белки теплового шока человека

1.4 Некоторые функции малых белков теплового шока человека

1.4.1 Предотвращение накопления белковых агрегатов

1.4.2 Защита клеток от апоптоза

1.4.3 Взаимодействие малых белков теплового шока с элементами цитоскелета

1.4.4 Внеклеточные функции малых белков теплового шока

2. Флуоресцентные белки

3. Использование флуоресцентных белков для исследования малых белков теплового шока

4. Линкерные последовательности в химерных белках

II. Цели и задачи

III. Материалы и методы

1. Получение молекулярно-генетических конструктов

2. Получение химически компетентных клеток Е. coli

3. Экспрессия химерных белков

3.1 Выращивание бактериальных культур

3.2 Тестовая экспрессия

3.3 Препаративная экспрессия

4. Выделение и очистка рекомбинантных белков

4.1 Выделение и очистка химерных белков

4.2 Выделение и очистка белков из телец включения с последующей ренатурацией

5. Исследование олигомерного состояния

5.1 Исследование гомоолигомеров химерных белков

5.1.1 Динамическое лазерное светорассеяние

5.1.2 Гель-хроматография

2

5.1.3 Электронная микроскопия

5.2 Исследование гетероолигомеров химерных белков

6. Флуоресцентные методы исследования

6.1 Измерение спектров возбуждения и флуоресценции химерных белков

6.2 Исследование взаимодействия химерных белков и белков дикого типа с использованием явления фёрстеровского резонансного переноса энергии (FRET)

6.2.1 Измерение фёрстеровского резонансного переноса энергии между разными флуоресцентными белками (гетеро-FRET)

6.2.2 Измерение фёрстеровского резонансного переноса энергии между одинаковыми флуоресцентными белками (гомо-FRET)

6.2.3 Исследование взаимодействия белков посредством измерения гетеро-FRET

6.2.4 Исследование взаимодействия белков посредством измерения гомо-FRET

7. Исследование шапероноподобной активности

8. Некоторые аналитические методы

8.1 SDS-электрофорез по методу Леммли

8.2 Иммунохимическое окрашивание (Western Blotting)

8.3 Спектрофотометрическое определение концентрации белка

IV. Результаты и их обсуждение

1. Подбор условий экспрессии химерных белков

2. Выделение и очистка белков

2.1 Выделение и очистка химерных белков

2.2 Выделение химерных белков из телец включения

3. Исследование олигомерного состояния химерных белков

3.1 Исследование гомоолигомеров химерных белков

3.2 Исследование гетероолигомеров химерных белков

4. Шапероноподобная активность химерных белков

V. Заключение

Выводы:

Список литературы:

Список сокращений:

ДТТ - дитиотрейтол

(З-МЭ - р-меркаптоэтанол

ДСН - додецилсульфат натрия

ПААГ - полиакриламидный гель

Трис - трис(гидроксиметил)аминометан

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

Amp - ампициллин

АР - антипараллельный интерфейс

eCFP - улучшенный циановый флуоресцентный белок (enhanced cyan fluorescent protein)

eYFP - улучшенный желтый флуоресцентный белок (enhanced yellow fluorescent protein)

FRET - Фёрстеровский резонансный перенос энергии

GSH - восстановленный глутатион

Hsp - белки теплового шока (Heat shock proteins)

IPTG - изопропил-Р"0-1-тиогалактопиранозид

LB - питательная среда Луриа-Бертани

PI3K - фосфоинозитид-3-киназа

РКС - протеинкиназа С

PMSF - фенилметансульфонил фторид

sHsp - малые белки теплового шока (small heat shock proteins) WT - белки дикого типа (wild type)

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование структуры и свойств флуоресцентных химер малых белков теплового шока человека»

Введение

Малые белки теплового шока (small heat shock proteins, sHsp) - АТФ независимые шапероны, ключевой ролью которых является поддержание белкового гомеостаза за счет предотвращения накопления агрегатов неправильно свернутых или частично денатурированных белков. Кроме этого sHsp способны выполнять множество функций, затрагивающих практически все стороны жизнедеятельности клетки, например, транспорт везикул и органелл, деление, подвижность, программируемая гибель и многие другие.

В геноме человека идентифицировано 10 генов, кодирующих 10 разных малых белков теплового шока. Некоторые из этих белков экспрессируются только в определенных типах тканей, в то время как другие обнаруживаются повсеместно. Малые белки теплового шока постоянно синтезируются в клетках, однако в условиях стресса может происходить существенное увеличение уровня экспрессии определенных членов этого семейства. Кроме того, уровень экспрессии некоторых sHsp изменяется в зависимости от стадии клеточного цикла и/или этапа развития организма в процессе онтогенеза.

Интерес к малым белкам теплового шока в последние десятилетия неуклонно растет, что обусловлено важными функциями, выполняемыми этими белками в ключевых процессах жизнедеятельности. Нарушение функций sHsp и потеря их способности поддерживать гомеостаз зачастую приводят к развитию патологий. На сегодняшний день установлена связь sHsp со многими заболеваниями, такими как различные виды миопатий и невропатий, онкологические заболевания, болезни Альцгеймера, Паркинсона и др.

sHsp обладают крайне подвижной структурой и способны образовывать сложно построенные динамичные олигомеры, что существенно затрудняет изучение их свойств. Эти особенности вынуждают использовать различные методы для изучения sHsp. Одним из подходов в исследовании sHsp является создание химер малых белков теплового шока и флуоресцентных белков. Использование подобных химер предоставляет уникальную возможность для изучения локализации и взаимодействий sHsp непосредственно в живых клетках, а также делает доступным новые методы исследования белок-белковых взаимодействий в условиях in vitro. Однако прежде чем использовать химеры в исследованиях, проводимых на клеточном уровне, необходимо изучить их структуру и свойства и провести подробное сравнение флуоресцентных химер с белками дикого типа.

I. Обзор литературы

Существование живых организмов в изменяющихся условиях окружающей среды делает необходимым наличие механизмов защиты от действия неблагоприятных факторов. В протеоме практически всех клеток есть специальные белки, обеспечивающие протекание нормальной жизнедеятельности в условиях стресса.

В 1974 году Тиссиерисом и соавт. было обнаружено, что под действием теплового шока в тканях личинок дрозофилы происходит повышение экспрессии неизвестной группы белков [167]. Позднее эти белки были отнесены к большой и гетерогенной группе белков теплового шока (Heat shock proteins, Hsp), представители которой, как оказалось, присутствуют в клетке не только в условиях стресса, но и в нормальном состоянии [93]. Hsp принимают участие в регуляции и протекании разнообразных процессов, заметная часть которых связана с поддержанием белкового гомеостаза, то есть с регуляцией синтеза, правильного сворачивания (фолдинга), созревания, направленного транспорта и предотвращения агрегации и преждевременной деградация белков [72, 133]. Белки теплового шока по современной классификации разделяют на несколько больших групп на основании молекулярных масс их представителей. Принято выделять следующие группы белков теплового шока: HspllO (HspH), Hsp 105 (ClpB), Hsp90 (HspC), Hsp70 (HspA), Hsp60 (HspD), Hsp40 (DnaJ), Hsp 10 (HspE), CCT (TriC) и sHsp (HspB) [120, 175].

1. Малые белки теплового шока (sHsp)

Малые белки теплового шока принадлежат к чрезвычайно широко распространенному семейству белков. Представители этого семейства встречаются во всех царствах живых организмов [120], включая некоторые вирусы [111]. Отдельные виды обычно содержат в своем геноме несколько генов, кодирующие sHsp, при этом количество генов варьирует от 2-3 у бактерий до нескольких десятков у некоторых растений [76, 145]. Как уже отмечалось, в геноме человека выявлено 10 генов малых белков теплового шока [96].

Главной характерной чертой sHsp является наличие в их структуре высоко консервативного а-кристаллинового домена в С-концевой части молекулы [17]. Мономеры белков этого семейства имеют малую молекулярную массу (от 12 до 43 кДа), и

склонны к образованию крупных гомо- и гетероолигомеров. sHsp обладают так называемой шапероноподобной активностью, то есть способны связывать частично денатурированные или неправильно свернутые белки, предотвращая их агрегацию [17], и не требуют для своего функционирования гидролиза АТР [89]. Как уже отмечалось, sHsp млекопитающих участвуют в реализации многочисленных жизненно важных процессов. Вероятно, это связано с их способностью взаимодействовать с разнообразными белками-партнерами, находящимися как в нативном [9, 10], так и в частично денатурированном состоянии. Рассмотрим подробнее главные характерные черты представителей этого семейства белков и их функции.

1.1 Структура малых белков теплового шока

Для представителей семейства малых белков теплового шока характерен общий план строения. В С-концевой части молекулы находится высоко консервативный а-кристаллиновый домен, образованный 6-8 (3-складками, собранными в два листа (рис. 1 Б) [13, 91]. а-Кристаллиновый домен, получивший название благодаря высокой степени гомологии с аналогичным доменом а-кристаллина хрусталика глаза быка [86], рассматривается как главная характерная черта семейства sHsp [76, 95]. Этот домен, состоящий из 90-100 аминокислот, фланкирован с N-конца менее консервативным N-концевым участком, а с С-конца - короткой (10-15 аминокислотных остатков) и высокоподвижной С-концевой последовательностью (рис. 1 А) [102].

N-концевой участок малых белков теплового шока (-60 остатков) часто содержит характерный WDPF мотив, играющий важную роль в олигомеризации, а также несколько участков фосфорилирования [1, 102, 107]. Удаление N-концевой последовательности сопровождается диссоциацией крупных олигомеров sHsp, но при этом сохраняются олигомеры меньших размеров [71, 91]. С-концевая последовательность, обладает высокой подвижностью, и у большинства малых белков теплового шока содержит в своем составе консервативный I-X-I мотив, которому также приписывается важная роль в формировании крупных олигомеров [51]. Считается, что I-X-I мотив, связывается с гидрофобной бороздой, образованной складками р4 и 08 а-кристаллинового домена того же или соседнего мономера. При этом из-за своей палиндромности указанный фрагмент может укладываться в гидрофобной борозде в двух противоположных направлениях, благодаря чему становится возможным формирование

полидисперсных олигомерных комплексов [107, 153]. Кроме того, все участки молекулы вНвр могут содержать центры взаимодействия с субстратами и белками-партнерами, необходимые для выполнения их разнообразных функций [10, 68].

1X1 - мотив

М-концевой домен

□-кристаллиновыи домен

С-концевой фрагмент

Рис. 1. Строение малых белков теплового шока. А) Основные структурные элементы мономера зНвр. Б) Димер Н8р16.9 пшеницы (ТгШсит аеяйуит) РОВ: ЮМЕ. Димеризация за счет обмена рб складками. В) Димер аВ-кристаллина человека (Н8рВ5) РОВ: 2У22. Димеризация за счет взаимодействия антипараллельных Р7 складок. Цветом отмечены разные мономеры зНвр, подписаны р складки, формирующие а-кристаллиновый домен. Для изображения структуры димеров использована программа РуМо1.

а-Кристаллиновый домен малых белков теплового шока обеспечивает образование димеров - базовых элементов структуры эНвр, на основе которых происходит поэтапная сборка крупных олигомеров [57]. Механизм димеризации существенно отличается у зНвр из разных царств живых существ. Так вНзр архей, бактерий, растений, и некоторых беспозвоночных содержат в а-кристаллиновом домене короткую складку рб, которая локализована на подвижной и длинной петле (рис. 1 Б). Складка рб одного мономера оказывается способной взаимодействовать со складкой Р2 другого мономера, и таким образом за счет "обмена" участками а-кристаллинового домена двух субъединиц становится возможным образование димера [100, 170].

а-Кристаллиновый домен sHsp животных не имеет в своей структуре выступающей петли и складки рб. Вместо этого димеризация обеспечивается удлиненными р7 складками (обозначаемыми в некоторых источниках как (36+7). Димеризация происходит за счет образования ионных и водородных связей между антипараллельно расположенным Р7 складками (рис. 1 В) [119]. Взаимодействующие поверхности в зоне контакта двух мономеров получили название антипараллельного интерфейса (АР). Существуют различные конфигурации АР, при которых Р7 складки "скользят" друг относительно друга на несколько аминокислотных остатков [104, 153]. Предполагается, что наличие вариабельного интерфейса создает дополнительные возможности для существования гигантского количества различных форм олигомеров sHsp млекопитающих [82]. При этом следует отметить, что образование динамичных олигомеров, имеющих множество различных конформаций, является существенным препятствием для изучения структуры sHsp млекопитающих.

За счет взаимодействия N- и С-концевых последовательностей димеры собираются в крупные гомо- или гетероолигомерные комплексы, содержащие до нескольких десятков субъединиц и имеющих молекулярные массы 800 - 1000 кДа [120]. Если олигомеры sHsp млекопитающих динамичны и полидисперсны, и поэтому не поддаются кристаллизации [104], то в других случаях такие олигомеры представлены структурами с определенным числом субъединиц и архитектурой, свойственной отдельным представителям этого семейства (рис. 2 А-В). Так в случае термофильной археи Methanocaldococcus jannaschii белок Hspl6.5 образует сферические полые олигомеры, состоящие из 24 субъединиц [100], Hspl6.9 из пшеницы Triticum aestivum формирует 12-субъединичные комплексы из двух соединенных N- и С-концевыми доменами гексамерных "дисков" [170]. Всего на настоящий момент получено 6 кристаллических структур малых белков теплового шока, кроме уже упомянутых это XaHspA из Xanthomonas axonopodis [80], Tsp36 из плоского червя Taenia saginata [156], StHspl4.0 из археи Sulfolobus tokodaii [74] и SpHspl6.0 из дрожжей Schizosaccharomyces pombe [73].

Для изучения структуры sHsp млекопитающих исследователи вынуждены применять комбинированные подходы [14] и пользоваться такими методами как ядерный магнитный резонанс [27], крио-электронная микроскопия [130], малоугловое рентгеновское рассеяние [91], компьютерное моделирование [27] или подвергать кристаллизации и рентгено-структурному исследованию изолированные а-кристаллиновые домены sHsp [13, 16, 43]. Изолированные кристаллиновые домены не способны формировать крупные олигомеры, характерные для интактных белков, однако

изучение укороченных фрагментов малых белков теплового шока позволяет получать информацию о третичной структуре белков и, в том числе, о влиянии мутаций на эту структуру [43]. Сегодня, вероятно, наиболее подробно изучена структура аВ-кристаллина (НврВ5) человека.

Рис. 2. Строение олигомеров малых белков теплового шока [120]. A) Hspl6.5 из Methanocaldococcus jannaschii, 24 субъединицы образуют полую сферу. Б) Hspl6.9 из Triticum aestivum, 12 субъединиц формируют два гексамерных кольца. В) Tsp36 из Taenia saginata, димер, в котором каждая субъединица содержит два а-кристаллиновых домена, формирует тетрамерные комплексы. Субъединицы отмечены разным цветом.

Комбинирование нескольких экспериментальных подходов позволило выяснить, что "базовой" олигомерной формой этого белка является структура из 24 субъединиц - 4 гексамерных кольца, соединенных вместе N- и С-концевыми участками мономеров (рис. 3 А) [27, 52, 91]. Этот олигомер может диссоциировать на промежуточные комплексы или наращивать число субъединиц модульным путем, присоединяя к специальным участкам узнавания дополнительные димеры HspB5. Таким образом, могут образовываться комплексы, включающие до 40 субъединиц [27]. При этом могут образовываться олигомеры, как с четным, так и с нечетным числом субъединиц. Это становится возможным из-за диссоциации мономеров sHsp, процесса, зависящего от перемещения С-концевых последовательностей HspB5 между связанным и экспонированным в растворитель состояниями [15, 81].

Многие малые белки теплового шока животных способны образовывать гетероолигомерные комплексы с sHsp других типов. Формирование гетероолигомеров происходит в клетках тканей, экспрессирующих сразу несколько типов этих белков [162]. Причем в состав гетероолигомеров входят даже те белки, которые в изолированном состоянии преимущественно формируют только малые олигомерные комплексы. Например, HspB6 человека, склонный в изолированном состоянии образовывать только димеры, может взаимодействовать с другими малыми белками теплового шока человека

>

Б

В

(HspBl, HspB5) и образовывать с ними крупные гетероолигомеры [30]. Пока нет точного понимания механизма формирования гетероолигомеров sHsp, однако установлено, что в условиях in vitro этот процесс происходит путем обмена мономеров указанных белков [121]. Предполагается, что благодаря формированию гетероолигомеров становится

Рис. 3. Компьютерная модель строения аВ-кристаллина человека [27). А)

Олигомер, состоящий из 24 субъединиц (4 гексамера). На переднем плане - гексамерное кольцо, звездами отмечены скопления массы по данным электронной микроскопии. Б) Участок соединения трех гексамеров. Цветными сферами отмечены фосфорилируемые остатки серина на Ы-конце аВ-кристаллина. Красный - Бег 19, синий - 5ег45, циановый -8ег59. Модификация этих остатков способствует диссоциации крупных олигомеров.

возможным образование новых конформационных состояний вНвр, что позволяет им распознавать большее количество субстратов и белков-клиентов. Таким образом, разнообразие функций может обеспечиваться разнообразием состава и олигомерного состояния малых белков теплового шока [10, 151].

Функциональная активность малых белков теплового шока зависит от их четвертичной структуры. Считается, что при диссоциации крупных олигомеров многих вНБр происходит увеличение их шапероноподобной активности [148]. В этом случае крупные олигомеры выступают лишь в качестве "хранилища" активных элементов и могут диссоциировать вплоть до димеров [1]. Согласно другим представлениям рассматривается иной механизм действия - укрупнение олигомерных комплексов, как было показано на примере а-кристаллина человека, сопровождается увеличением шапероноподобной активности [123]. Вероятно, оба механизма могут в равной степени участвовать в регуляции функционирования разных представителей семейства зНвр или в функционировании одного и того же малого белка теплового шока с разными белками-субстратами. Так, например, Нвр 18.1 из гороха при повышении температуры образует

А

Б

олигомеры как большего, так и меньшего размера [157]. По отношению к прочим функциям олигомерное состояние sHsp рассматривается как некий "триггер", изменение состояния которого приводит к "включению" или "выключению" определенных функций, например, способности взаимодействовать с тем или иным белком [10, 128].

Малые белки теплового шока могут изменять свое олигомерное состояние под действием различных факторов, например, при повышении температуры, появлении большого количества денатурированных белков или в результате фосфорилирования [1]. При этом фосфорилирование является одним из наиболее эффективных способов регуляции олигомерного состояния sHsp.

1.2 Фосфорилирование малых белков теплового шока.

Большинство sHsp имеет в своей последовательности несколько участков фосфорилирования. Эти участки преимущественно расположены в N-концевом домене, в составе элементов, обеспечивающих формирование четвертичной структуры малых белков теплового шока (рис. 3 Б) [6, 120]. Таким образом, фосфорилирование может влиять на олигомерное состояние и на функциональную активность sHsp [18, 27]. Малые белки теплового шока могут фосфорилироваться под действием различных протеинкиназ, в том числе, участвующих в регуляции клеточного цикла и пролиферации [120]. Так HspBl и HspB5 человека фосфорилируются под действием МАРКАР2 киназы [97, 159], HspB6 модифицируется при активации Р13-киназного пути, а также под действием циклонуклеотид-зависимых протеинкиназ [178]. Установлено, что некоторые sHsp человека содержат участки, фосфорилируемые циклонуклеотид-зависимыми протеинкиназами [56], а также протеинкиназой С (ПКС) и тирозиновыми киназами [21, 141].

Фосфорилирование, как правило, приводит к изменению четвертичной структуры, реорганизации олигомерных комплексов [10, 128] и модуляции активности sHsp [69]. Фосфорилирование некоторых представителей семейства sHsp, в норме не склонных к образованию крупных олигомеров (HspB6, HspB8), не сопровождается существенными изменениями четвертичной структуры, но может влиять на шапероноподобную активность [11, 56].

1.3 Малые белки теплового шока человека

Малые белки теплового шока человека по современной номенклатуре обозначаются как HspB с порядковым номером от 1 до 10. Несмотря на то, что все эти белки относятся к одному семейству, они обладают различными свойствами. Так четыре представителя этого семейства (HspBl, HspB5, HspB6 и HspB8) экспрессируются практически во всех тканях человека. В то же время для остальных белков характерна экспрессия только в определенных тканях. sHsp человека отличаются по уровню экспрессии и ее зависимости от неблагоприятных факторов окружающей среды, а также по ряду выполняемых функций. Некоторые свойства sHsp человека приведены в таблице 1.

Как уже отмечалось, малые белки теплового шока обеспечивают поддержание гомеостаза [51]. Осуществление этой главной функции предполагает, что малые белки теплового шока так или иначе участвуют в многочисленных и существенных внутриклеточных процессах, таких как синтез [32] и деградация белков [23, 32], апоптоз [128] и пролиферация [46], регуляция динамики цитоскелета [98, 179] и мышечного сокращения [28], контроль активности многих сигнальных путей [115], регуляция окислительно-восстановительного состояния клетки [39], функционирования иммунной системы [171] и др. Вследствие такой многофункциональности мутации sHsp коррелируют с развитием ряда заболеваний человека, таких как катаракта, различные виды миопатий и невропатий, а также некоторые виды злокачественных перерождений [49].

Можно выделить два основных механизма возникновения указанных патологий. Нарушение функций в результате недостатка или мутаций sHsp может приводить к накоплению агрегатов неправильно свернутых или частично денатурированных белков. Такого рода процессы происходят при некоторых нейродегенеративных заболеваниях, таких как болезни Хантингтона, Альцгеймера, Паркинсона. С другой стороны избыточный синтез малых белков теплового шока коррелирует с повышением выживаемости клеток в неблагоприятных условиях. По этой причине малые белки теплового шока могут препятствовать гибели перерожденных клеток под действием элементов иммунной системы или химиопрепаратов и провоцировать развитие онкологических заболеваний [9]. Рассмотрим более подробно некоторые функции sHsp человека.

Таблица 1. Некоторые свойства малых белков теплового шока человека [120].

Белок Альтернативные названия Номер в базе данных UniProtKB Расположение на хромосоме Количество аминокислот Тканевое распределение Индукция тепловым шоком Коррелирующие заболевания*

HspBl Hsp27 Р04792 7ql 1.23 205 Широкое Да СМТ II, dHMN

HspB2 MKBP, myotonic dystrophy protein kinase binding protein Q16082 Ilq22-q23 182 Сердечная и скелетная мускулатура Нет Миотоническая дистрофия, различные невропатии

HspB3 - Q12988 5ql 1.2 150 Сердечная и скелетная мускулатура Нет Моторные невропатии

HspB4 aA-crystallin P02489 21q22.3 173 Хрусталик Нет Катаракта

HspB5 aB-crystallin P02511 1 Iq22.3-q23.1 175 Широкое Да Катаракта, десмин- связанные и миофибриллярные миопатии

HspB6 Hsp20, p20 014558 19ql3.12 157 Широкое Нет Дилятационная кардиомиопатия (пред)

HspB7 cvHsp, cardiovascular heat shock protein Q9UBY9 Ip36.23-p34.3 170 Сердечная и скелетная мускулатура Нет данных Содержание повышено при мышечной дистрофии

HspB8 Hsp22, HI 1 protein kinase, product of E2IG1 gene Q9UKS3 12q24.23 196 Широкое Зависит от типа клеток СМТ II, dHMN

HspB9 - Q9BQS6 17q21.2 159 Семенники Нет данных Содержание повышено в некоторых опухолях

HspBlO ODF1, outer dense fiber protein Q14990 8q22.3 250 Семенники Нет данных Нет данных

*- заболевания, возникновение которых коррелирует с мутациями в sHsp. СМТ II - болезнь Шарко-Мари-Ту II типа; dHMN - дистальная наследственная моторная невропатия; пред - предположительно.

1.4 Некоторые функции малых белков теплового шока человека

1.4.1 Предотвращение накопления белковых агрегатов

Классическим примером шапероноподобной активности малых белков теплового шока человека является поддержание прозрачности хрусталика на протяжении всей жизни человека, т.е. на протяжении десятков лет [42]. В состав а-кристаллина входят аА- и аВ-кристаллины, которые связывают потерявшие нативную структуру белки хрусталика [83]. Хрусталик не содержит элементов, обеспечивающих эффективный рефолдинг или деградацию поврежденных белков, поэтому sHsp должны постоянно препятствовать накоплению агрегатов денатурированных белков и оставаться в связанном состоянии с поврежденными субстратами [42]. В прочих же тканях "холдазная" функция sHsp сводится к тому, что они препятствуют агрегации денатурированных белков в нормальных или стрессовых условиях, а затем передают свои субстраты на "машины" рефолдинга (Hsp70, Hsp90) или участвуют в обеспечении деградации белков в протеасомах или аутофагосомах. Стимулирование деградации может происходить как непосредственно при передаче субстрата на протеосомы [23, 126], так и опосредованно, путем активации убиквитинилирования [53]. Кроме того, один из представителей семейства малых белков теплового шока, HspB8, после связывания денатурированного субстрата может образовывать комплекс с белками Hsc70, Bag3 и CHIP. Это в свою очередь стимулирует процесс макроаутофагии в клетке и деградации поврежденных белков [45].

Члены семейства sHsp проявляют различную специфичность к субстратам, и их вклад в защиту клетки от стресса может различаться. Считается, что HspBl и HspB5 играют главную роль в защите клеток от накопления денатурированных белков [9].

sHsp в основном локализованы в цитоплазме клетке. При этом показано, что в условиях стресса многие малые белки теплового шока переходят на различные элементы цитоскелета [105], а также в ядро (HspBl, HspB5) [24]. Там они также предотвращают агрегацию белков и стабилизируют ядерный цитоскелет, образованный ламином [2].

Одна молекула sHsp может содержать несколько участков связывания субстрата. Так, например, в структуре аВ-кристаллина выявлено семь центров связывания субстратов [68, 90]. Тем не менее, остается открытым вопрос о стехиометрии комплексов

sHsp:cy6cTpaT и олигомерном состоянии sHsp, обеспечивающим связывание белков-субстратов. Показано, что в некоторых условиях это соотношение может достигать одной молекулы субстрата на молекулу sHsp [149]. Как уже обсуждалось, олигомерное состояние и фосфорилирование белков имеет огромное влияние на шапероноподобную активность sHsp. Так активация холдазной функции может происходить как при диссоциации крупных "олигомеров-хранилищ" на промежуточные комплексы (HspBl), так и при укрупнении и реструктуризации поверхности существующих олигомеров (а-кристаллин). Вероятно, эти параметры зависят от природы и размера субстрата, а также от свойств индивидуальных представителей семейства sHsp.

Логично предположить, что холдазная функция sHsp лежит в основе всех прочих функций этих белков, так как взаимодействия с белками-клиентами, но уже в нативном состоянии, определяют участие sHsp в широком спектре процессов жизнедеятельности клетки.

1.4.2 Защита клеток от апоптоза

Важной и не однозначной функцией sHsp является защита клеток от апоптоза. sHsp препятствуют гибели клетки, находящейся в стрессовых условиях, таким образом, способствуя нормальному функционированию организма. Характерным примером является антиапоптотическая активность HspBl, который ингибирует апоптоз на разных стадиях этого процесса (рис. 4). При индукции апоптоза за счет выхода цитохрома С из митохондрий в цитоплазму и активации ряда каспаз, белок Вах (Bcl-2 associated X protein) перемещается на мембрану митохондрий и формирует в ней поры, что делает возможным выход цитохрома С из митохондрий. HspBl взаимодействует с Р13-киназой, активирующей киназу Akt, которая в свою очередь фосфорилирует Вах и препятствует его связыванию с мембраной митохондрий [77]. Кроме того, HspBl непосредственно связывается с активной Akt, препятствуя ее инактивации [139]. На следующих этапах развития апоптоза HspBl может напрямую связываться с цитохромом С в цитоплазме [29]. Это препятствует формированию апоптосомы, комплекса, состоящего из прокаспазы-9, Apafl (Apoptotic protease activating factor 1) и dATP, и ингибирует активацию последующих индукторов апоптоза - каспазы-9 и каспазы-3 [125]. Каспаза-3, являющаяся одним из главных участников апоптоза, в форме неактивной прокаспазы-3

также может быть мишенью HspBl. Взаимодействуя с прокаспазой-3, HspBl препятствует ее активации [44, 125].

Активность каспаз в клетке также находится под контролем специальных регуляторных белков - белков, ингибирующих апоптоз (inhibitor of apoptosis proteins, IAP). Белок SMAC (second mitochondria-derived activator of caspases) может подавлять активность этих белков и тем самым способствовать апоптозу. В клетках множественной миеломы HspB 1 препятствует выходу SMAC в цитоплазму и, таким образом, ингибирует активность каспаз и препятствует развитию апоптоза [37].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Дацкевич, Петр Николаевич, 2014 год

Список литературы:

1. Панасенко, О.О., Ким, М.В., Гусев, Н.Б., Структура и свойства малых белков теплового шока. Успехи биологической химии, 2003. 43: р. 59-98.

2. Adhikari, A.S. et al., Heat stress-induced localization of small heat shock proteins in mouse myoblasts: intranuclear lamin A/C speckles as target for alphaB-crystallin and Hsp25. Exp. Cell Res., 2004. 299(2): p. 393-403.

3. Almeida-Souza, L. et al., Small heat-shock protein HSPB1 mutants stabilize microtubules in Charcot-Marie-Tooth neuropathy. J. Neurosci., 2011. 31(43): p. 15320-8.

4. Almeida-Souza, L. et al., HSPB1 facilitates the formation of non-centrosomal microtubules. PLoS ONE, 2013. 8(6): p. e66541.

5. Almeida-Souza, L., Timmerman, V., and Janssens, S., Microtubule dynamics in the peripheral nervous system: A matter of balance. Bioarchitecture, 2011. 1(6): p. 267-270.

6. Aquilina, J.A. et al., Phosphorylation of alphaB-crystallin alters chaperone function through loss of dimeric substructure. J. Biol. Chem., 2004. 279(27): p. 28675-80.

7. Arai, H. and Atomi, Y., Chaperone activity of alpha B-crystallin suppresses tubulin aggregation through complex formation. Cell Struct. Funct., 1997. 22(5): p. 539-44.

8. Arai, R. et al., Design of the linkers which effectively separate domains of a bifunctional fusion protein. Protein Eng., 2001. 14(8): p. 529-32.

9. Arrigo, A.P., Pathology-Dependent Effects Linked to Small Heat Shock Proteins Expression: An Update. Scientifica (Cairo), 2012. 2012.

10. Arrigo, A.P., Human small heat shock proteins: protein interactomes of homo- and hetero-oligomeric complexes: an update. FEBS Lett., 2013. 587(13): p. 1959-69.

11. Arrigo, A.P. and Gibert, В., Protein interactomes of three stress inducible small heat shock proteins: HspBl, HspB5 and HspB8. Int. J. Hyperthermia, 2013. 29(5): p. 409-22.

12. Arya, R., Mallik, M., and Lakhotia, S.C., Heat shock genes - integrating cell survival and death. J Biosci, 2007. 32(3): p. 595-610.

13. Bagneris, C. et al., Crystal structures of alpha-crystallin domain dimers of alphaB-crystallin and Hsp20. J. Mol. Biol., 2009. 392(5): p. 1242-52.

14. Baldwin, A.J. et al., The polydispersity of alphaB-crystallin is rationalized by an interconvertingpolyhedral architecture. Structure, 2011. 19(12): p. 1855-63.

15. Baldwin, A.J. et al., Probing dynamic conformations of the high-molecular-weight alphaB-crystallin heat shock protein ensemble by NMR spectroscopy. J. Am. Chem. Soc., 2012. 134(37): p. 15343-50.

16. Baranova, E.V. et al., The taming of small heat-shock proteins: crystallization of the alpha-crystallin domain from human Hsp27. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun, 2009. 65(Pt 12): p. 1277-81.

17. Basha, E., O'Neill, H., and Vierling, E., Small heat shock proteins and alpha-crystallins: dynamic proteins with flexible functions. Trends Biochem. Sci., 2012. 37(3): p. 106-17.

18. Benesch, J.L. et al., Small heat shock protein activity is regulated by variable oligomeric substructure. J. Biol. Chem., 2008. 283(42): p. 28513-7.

19. Bennardini, F., Wrzosek, A., and Chiesi, M., Alpha B-crystallin in cardiac tissue. Association with actin and desmin filaments. Circ. Res., 1992. 71(2): p. 288-94.

20. Benndorf, R. et al., Phosphorylation and supramolecular organization of murine small heat shock protein HSP25 abolish its actin polymerization-inhibiting activity. J. Biol. Chem., 1994. 269(32): p. 20780-4.

21. Benndorf, R. et al., HSP22, a new member of the small heat shock protein superfamily, interacts with mimic of phosphorylated HSP27 ((3D)HSP27). J. Biol. Chem., 2001. 276(29): p. 26753-61.

22. Bhat, S.P. and Gangalum, R.K., Secretion of alphaB-Crystallin via exosomes: New clues to the function of human retinal pigment epithelium. Commun. Integr. Biol., 2011. 4(6): p. 739-41.

23. Boelens, W.C., Croes, Y., and de Jong, W.W., Interaction between alphaB-crystallin and the human 20Sproteasomal subunit C8/alpha7. Biochim. Biophys. Acta, 2001. 1544(1-2): p. 311-9.

24. Borrelli, M.J. et al., Stress protection by a fluorescent Hsp27 chimera that is independent of nuclear translocation or multimeric dissociation. Cell Stress Chaperones, 2002. 7(3): p. 281-96.

25. Bova, M.P. et al., Subunit exchange of alphaA-crystallin. J. Biol. Chem., 1997. 272(47): p. 29511-7.

26. Bova, M.P. et al., Subunit exchange of small heat shock proteins. Analysis of oligomer formation of alphaA-crystallin and Hsp27 by fluorescence resonance energy transfer and site-directed truncations. J. Biol. Chem., 2000. 275(2): p. 1035-42.

27. Braun, N. et al., Multiple molecular architectures of the eye lens chaperone alphaB-crystallin elucidated by a triple hybrid approach. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2011. 108(51): p. 20491-6.

28. Brophy, C.M. et al., Small heat shock proteins and vasospasm in human umbilical artery smooth muscle. Biol. Reprod., 1997. 57(6): p. 1354-9.

29. Bruey, J.M. et al., Hsp27 negatively regulates cell death by interacting with cytochrome c. Nat. Cell Biol., 2000. 2(9): p. 645-52.

30. Bukach, O.V. et al., Heterooligomeric complexes formed by human small heat shock proteins HspBl (Hsp27) and HspB6 (Hsp20). Biochim. Biophys. Acta, 2009. 1794(3): p. 486-95.

31. Bukach, O.V. et al., Some properties of human small heat shock protein Hsp20 (HspB6). Eur. J. Biochem., 2004. 271(2): p. 291-302.

32. Carra, S. et al., Different anti-aggregation and pro-degradative functions of the members of the mammalian sHSP family in neurological disorders. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci., 2013.368(1617).

33. Carver, J.A. and Lindner, R.A., NMR spectroscopy of alpha-crystallin. Insights into the structure, interactions and chaperone action of small heat-shock proteins. Int. J. Biol. Macromol., 1998. 22(3-4): p. 197-209.

34. Chalfie, M. et al., Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science, 1994. 263(5148): p. 802-5.

35. Chan, F.T., Kaminski, C.F., and Kaminski Schierle, G.S., HomoFRET fluorescence anisotropy imaging as a tool to study molecular self-assembly in live cells. Chemphyschem, 2011. 12(3): p. 500-9.

36. Charette, S.J. and Landry, J., The interaction of HSP27 with Daxx identifies a potential regulatory role ofHSP27 in Fas-induced apoptosis. Ann. N. Y. Acad. Sci., 2000. 926: p. 126-31.

37. Chauhan, D. et al., Hsp27 inhibits release of mitochondrial protein Smac in multiple myeloma cells and confers dexamethasone resistance. Blood, 2003. 102(9): p. 3379-86.

38. Chen, X., Zaro, J.L., and Shen, W.C., Fusion protein linkers: property, design and functionality. Adv Drug Deliv Rev, 2013. 65(10): p. 1357-69.

39. Christians, E.S., Ishiwata, T., and Benjamin, I.J., Small heat shock proteins in redox metabolism: implications for cardiovascular diseases. Int. J. Biochem. Cell Biol., 2012. 44(10): p. 1632-45.

40. Chudakov, D.M. et al., Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues. Physiol. Rev., 2010. 90(3): p. 1103-63.

41. Chung, C.T., Niemela, S.L., and Miller, R.H., One-step preparation of competent Escherichia coli: transformation and storage of bacterial cells in the same solution. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 1989. 86(7): p. 2172-5.

42. Clark, A.R., Lubsen, N.H., and Slingsby, C., sHSP in the eye lens: crystallin mutations, cataract andproteostasis. Int. J. Biochem. Cell Biol., 2012. 44(10): p. 1687-97.

43. Clark, A.R. et al., Crystal structure of R120G disease mutant of human alphaB-crystallin domain dimer shows closure of a groove. J. Mol. Biol., 2011. 408(1): p. 118-34.

44. Concannon, C.G., Gorman, A.M., and Samali, A., On the role of Hsp27 in regulating apoptosis. Apoptosis, 2003. 8(1): p. 61-70.

45. Crippa, V. et al., A role of small heat shock protein B8 (HspB8) in the autophagic removal of misfolded proteins responsible for neurodegenerative diseases. Autophagy, 2010. 6(7): p. 958-60.

46. Crowe, J. et al., Heat shock protein bl-deficient mice display impaired wound healing. PLoS ONE, 2013. 8(10): p. e77383.

47. Cubitt, A.B., Woollenweber, L.A., and Heim, R., Understanding structure-function relationships in the Aequorea victoria green fluorescent protein. Methods Cell Biol., 1999. 58: p. 19-30.

48. Datskevich, P.N., Mymrikov, E.V., and Gusev, N.B., Utilization of fluorescent chimeras for investigation of heterooligomeric complexes formed by human small heat shock proteins. Biochimie, 2012. 94(8): p. 1794-804.

49. Datskevich, P.N. et al., Mutations of small heat shock proteins and human congenital diseases. Biochemistry (Mosc.), 2012. 77(13): p. 1500-14.

50. Deane, C.M. et al., Protein interactions: two methods for assessment of the reliability of high throughput observations. Molecular & cellular proteomics : MCP, 2002. 1(5): p. 349-56.

51. Delbecq, S.P., Jehle, S., and Klevit, R., Binding determinants of the small heat shock protein, alphaB-crystallin: recognition of the 'lxl' motif. EMBO J., 2012. 31(24): p. 4587-94.

52. Delbecq, S.P. and Klevit, R.E., One size does not fit all: the oligomeric states of alphaB crystallin. FEBS Lett., 2013. 587(8): p. 1073-80.

53. den Engelsman, J. et al., The small heat-shock protein alpha B-crystallin promotes FBX4-dependent ubiquitination. J. Biol. Chem., 2003. 278(7): p. 4699-704.

54. Depre, C. et al., Program of cell survival underlying human and experimental hibernating myocardium. Circ. Res., 2004. 95(4): p. 433-40.

55. Doshi, B.M., Hightower, L.E., and Lee, J., The role of Hsp27 and actin in the regulation of movement in human cancer cells responding to heat shock. Cell Stress Chaperones, 2009. 14(5): p. 445-57.

56. Dreiza, C.M. et al., The small heat shock protein, HSPB6, in muscle function and disease. Cell Stress Chaperones, 2010. 15(1): p. 1-11.

57. Dudich, I.V. et al., Dimer structure as a minimum cooperative subunit of small heat-shock proteins. Biochim. Biophys. Acta, 1995. 1253(2): p. 163-8.

58. Elliott, J.L. et al., The specificity of the interaction between alphaB-crystallin and desmin filaments and its impact on filament aggregation and cell viability. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci., 2013. 368(1617): p. 20120375.

59. Enomoto, Y. et al., alphaB-crystallin extracellularly suppresses ADP-induced granule secretion from human platelets. FEBS Lett., 2009. 583(15): p. 2464-8.

60. Evgrafov, O.V. et al., Mutant small heat-shock protein 27 causes axonal Charcot-Marie-Tooth disease and distal hereditary motor neuropathy. Nat. Genet., 2004. 36(6): p. 602-6.

61. Fan, G.C., Chu, G., and Kranias, E.G., Hsp20 and its cardioprotection. Trends Cardiovasc. Med., 2005. 15(4): p. 138-41.

62.

63.

64.

65.

66.

67.

68.

69.

70.

71.

72.

73.

74.

75,

76

77.

78

79

80

81

82

83

Fan, G.C. et al., Small heat-shock protein Hsp20 phosphorylation inhibits beta-agonist-induced cardiac apoptosis. Circ. Res., 2004. 94(11): p. 1474-82.

Fan, G.C. et al., Novel cardioprotective role of a small heat-shock protein, Hsp20, against ischemia/reperfusion injury. Circulation, 2005. 111(14): p. 1792-9. Fan, G.C. et al., Small heat-shock protein Hsp20 attenuates beta-agonist-mediated cardiac remodeling through apoptosis signal-regulating kinase 1. Circ. Res., 2006. 99(11): p. 1233-42.

Fan, G.C. et al., Heat shock protein 20 interacting with phosphorylated Akt reduces doxorubicin-triggered oxidative stress and cardiotoxicity. Circ. Res., 2008. 103(11): p. 1270-9.

Fontaine, J.M. et al., Interactions ofHSP22 (HSPB8) with HSP20, alphaB-crystallin, and

HSPB3. Biochem. Biophys. Res. Commun., 2005. 337(3): p. 1006-11.

Fontaine, J.M. et al., Abnormal small heat shock protein interactions involving

neuropathy-associated HSP22 (HSPB8) mutants. FASEB J., 2006. 20(12): p. 2168-70.

Ghosh, J.G., Estrada, M.R., and Clark, J.I., Interactive domains for chaperone activity in

the small heat shock protein, human alphaB crystallin. Biochemistry, 2005. 44(45): p.

14854-69.

Gibert, B. et al., Peptide aptamers: tools to negatively or positively modulate HSPB1(27) function. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci., 2013. 368(1617): p. 20120075. Gordon, G.W. et al., Quantitative fluorescence resonance energy transfer measurements using fluorescence microscopy. Biophys. J., 1998. 74(5): p. 2702-13. Guo, Z. and Cooper, L.F., An N-terminal 33-amino-acid-deletion variant ofhsp25 retains oligomerization and functional properties. Biochem. Biophys. Res. Commun., 2000. 270(1): p. 183-9.

Gupta, C.S. et al., Heat shock proteins in toxicology: How close and how far? Life Sci., 2010. 86: p. 377-384.

Hanazono, Y. et al., Nonequivalence observed for the 16-meric structure of a small heat shock protein, SpHspl6.0, from Schizosaccharomyces pombe. Structure, 2013. 21(2): p. 220-8.

Hanazono, Y. et al., Structural studies on the oligomeric transition of a small heat shock protein, StHspl4.0. J. Mol. Biol., 2012. 422(1): p. 100-8.

Hase, M. et al., H1I has dose-dependent and dual hypertrophic and proapoptotic functions in cardiac myocytes. The Biochemical journal, 2005. 388(Pt 2): p. 475-83. Haslbeck, M. et al., Some like it hot: the structure and function of small heat-shock proteins. Nat. Struct. Mol. Biol., 2005. 12(10): p. 842-6.

Havasi, A. et al., Hsp27 inhibits Bax activation and apoptosis via a phosphatidylinositol 3-kinase-dependent mechanism. J. Biol. Chem., 2008. 283(18): p. 12305-13. Hayes, D. et al., Phosphorylation dependence of hsp27 multimeric size and molecular chaperone function. J. Biol. Chem., 2009. 284(28): p. 18801-7.

Heim, R., Prasher, D.C., and Tsien, R.Y., Wavelength mutations and posttranslational autoxidation of green fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 1994. 91(26): p. 12501-4.

Hilario, E. et al., Crystal structures of Xanthomonas small heat shock protein provide a structural basis for an active molecular chaperone oligomer. J. Mol. Biol., 2011. 408(1): p. 74-86.

Hilton, G.R. et al., C-terminal interactions mediate the quaternary dynamics of alphaB-crystallin. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci., 2013. 368(1617): p. 20110405. Hilton, G.R. et al., Small heat-shock proteins: paramedics of the cell. Top. Curr. Chem., 2013. 328: p. 69-98.

Horwitz, J. et al., Lens alpha-crystallin: function and structure. Eye (Lond), 1999. 13 ( Pt 3b): p. 403-8.

84. Houck, S.A. and Clark, J.I., Dynamic subunit exchange and the regulation of microtubule assembly by the stress response protein human alphaB crystallin. PLoS ONE, 2010. 5(7): p. el 1795.

85. Huot, J. et al., HSP27 phosphorylation-mediated resistance against actin fragmentation and cell death induced by oxidative stress. Cancer Res., 1996. 56(2): p. 273-9.

86. Ingolia, T.D. and Craig, E.A., Four small Drosophila heat shock proteins are related to each other and to mammalian alpha-crystallin. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 1982. 79(7): p. 2360-4.

87. Islamovic, E. et al., Importance of small heat shock protein 20 (hsp20) C-terminal extension in cardioprotection. J. Mol. Cell. Cardiol., 2007. 42(4): p. 862-9.

88. Jacob, F. and Monod, J., Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins. J. Mol. Biol., 1961.3: p. 318-56.

89. Jakob, U. et al., Small heat shock proteins are molecular chaperones. J. Biol. Chem., 1993. 268(3): p. 1517-20.

90. Jaya, N., Garcia, V., and Vierling, E., Substrate binding site flexibility of the small heat shock protein molecular chaperones. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2009. 106(37): p. 15604-9.

91. Jehle, S. et al., Solid-state NMR and SAXS studies provide a structural basis for the activation of alphaB-crystallin oligomers. Nat. Struct. Mol. Biol., 2010. 17(9): p. 103742.

92. Jehle, S. et al., N-terminal domain of alphaB-crystallin provides a conformational switch for multimerization and structural heterogeneity. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2011. 108(16): p. 6409-14.

93. Kampinga, H.H. et al., Guidelines for the nomenclature of the human heat shock proteins. Cell Stress Chaperones, 2009. 14(1): p. 105-11.

94. Kamradt, M.C., Chen, F., and Cryns, V.L., The small heat shock protein alpha B-crystallin negatively regulates cytochrome c- and caspase-8-dependent activation of caspase-3 by inhibiting its autoproteolytic maturation. J. Biol. Chem., 2001. 276(19): p. 16059-63.

95. Kappe, G., Boelens, W.C., and de Jong, W.W., Why proteins without an alpha-crystallin domain should not be included in the human small heat shock protein family HSPB. Cell Stress Chaperones, 2010. 15(4): p. 457-61.

96. Kappe, G. et al., The human genome encodes 10 alpha-crystallin-related small heat shock proteins: HspBl-10. Cell Stress Chaperones, 2003. 8(1): p. 53-61.

97. Kato, K. et al., Phosphorylation of alphaB-crystallin in mitotic cells and identification of enzymatic activities responsible for phosphorylation. J. Biol. Chem., 1998. 273(43): p. 28346-54.

98. Kayser, J. et al., The Small Heat Shock Protein Hsp27 Affects Assembly Dynamics and Structure of Keratin Intermediate Filament Networks. Biophys. J., 2013. 105(8): p. 177885.

99. Ke, L. et al., HSPB I, HSPB6, HSPB7 and HSPB8 protect against RhoA GTPase-induced remodeling in tachypaced atrial myocytes. PLoS ONE, 2011. 6(6): p. e20395.

100. Kim, K.K., Kim, R., and Kim, S.H., Crystal structure of a small heat-shock protein. Nature, 1998. 394(6693): p. 595-9.

101. Kozawa, O. et al., HSP20, low-molecular-weight heat shock-related protein, acts extracellularly as a regulator ofplatelet functions: a novel defense mechanism. Life Sci., 2002. 72(2): p. 113-24.

102. Kriehuber, T. et al., Independent evolution of the core domain and its flanking sequences in small heat shock proteins. FASEB J., 2010. 24(10): p. 3633-42.

103. Laemmli, U.K., Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 1970. 227(5259): p. 680-5.

104. Laganowsky, A. et al., Crystal structures of truncated alphaA and alphaB crystallins reveal structural mechanisms of polydispersity important for eye lens function. Protein Sci., 2010.19(5): p. 1031-43.

105. Larkins, N.T., Murphy, R.M., and Lamb, G.D., Influences of temperature, oxidative stress, and phosphorylation on binding of heat shock proteins in skeletal muscle fibers. Am. J. Physiol. Cell Physiol., 2012. 303(6): p. C654-65.

106. Launay, N. et al., Serine 59 phosphorylation of {,alpha}B-crystallin down-regulates its anti-apoptotic function by binding and sequestering Bcl-2 in breast cancer cells. J. Biol. Chem., 2010. 285(48): p. 37324-32.

107. Lelj-Garolla, B. and Mauk, A.G., Roles of the N- and C-terminal sequences in Hsp27 self-association and chaperone activity. Protein Sci., 2012. 21(1): p. 122-33.

108. Liang, P. and MacRae, T.H., Molecular chaperones and the cytoskeleton. J. Cell Sci., 1997. 110 ( Pt 13): p. 1431-40.

109. Lidke, D.S. et al., Imaging molecular interactions in cells by dynamic and static fluorescence anisotropy (rFLIM and emFRET). Biochem. Soc. Trans., 2003. 31(Pt 5): p. 1020-7.

110. Liu, J.P. et al., Human alphaA- and alphaB-crystallins prevent UVA-induced apoptosis through regulation ofPKCalpha, RAF/MEK/ERK and AKT signaling pathways. Exp. Eye Res., 2004. 79(3): p. 393-403.

111. Maaroufi, H. and Tanguay, R.M., Analysis and phylogeny of small heat shock proteins from marine viruses and their cyanobacteria host. PLoS ONE, 2013. 8(11): p. e81207.

112. Mairesse, N. et al., Antisense inhibition of the 27 kDa heat shock protein production affects growth rate and cytoskeletal organization in MCF-7 cells. Cell Biol. Int., 1996. 20(3): p. 205-12.

113. Mao, Y.W. et al., Human alphaA- and alphaB-crystallins bind to Box and Bcl-X(S) to sequester their translocation during staurosporine-induced apoptosis. Cell Death Differ., 2004. 11(5): p. 512-26.

114. Matsuno, H. et al., A peptide isolated from alpha B-crystallin is a novel and potent inhibitor of platelet aggregation via dual prevention of PAR-1 and GPIb/V/IX. J. Thromb. Haemost., 2003. 1(12): p. 2636-42.

115. Matsushima-Nishiwaki, R. et al., Direct Association of Heat Shock Protein 20 (HSPB6) with Phosphoinositide 3-kinase (PI3K) in Human Hepatocellular Carcinoma: Regulation of the PI3K Activity. PLoS ONE, 2013. 8(11): p. e78440.

116. Milner, D.J. et al., Desmin cytoskeleton linked to muscle mitochondrial distribution and respiratory function. The Journal of cell biology, 2000. 150(6): p. 1283-98.

117. Miron, T. et al., A 25-kD inhibitor of actin polymerization is a low molecular mass heat shock protein. The Journal of cell biology, 1991. 114(2): p. 255-61.

118. Miroux, B. and Walker, J.E., Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels. J. Mol. Biol., 1996. 260(3): p. 289-98.

119. Mymrikov, E.V. et al., The pivotal role of the beta 7 strand in the intersubunit contacts of different human small heat shock proteins. Cell Stress Chaperones, 2010. 15(4): p. 36577.

120. Mymrikov, E.V., Seit-Nebi, A.S., and Gusev, N.B., Large potentials of small heat shock proteins. Physiol. Rev., 2011. 91(4): p. 1123-59.

121. Mymrikov, E.V., Seit-Nebi, A.S., and Gusev, N.B., Heterooligomeric complexes of human small heat shock proteins. Cell Stress Chaperones, 2012. 17(2): p. 157-69.

122. Oshita, S.E. et al., The small heat shock protein HspB2 is a novel anti-apoptotic protein that inhibits apical caspase activation in the extrinsic apoptotic pathway. Breast Cancer Res. Treat., 2010. 124(2): p. 307-15.

123. Palmieri, V. et al., alpha-Crystallin Modulates its Chaperone Activity by Varying the Exposed Surface. Chembiochem : a European journal of chemical biology, 2013. 14(17): p. 2362-70.

124. Panasenko, O.O. et al., Interaction of the small heat shock protein with molecular mass 25 kDa (hsp25) with actin. Eur. J. Biochem., 2003. 270(5): p. 892-901.

125. Pandey, P. et al., Hsp27 functions as a negative regulator of cytochrome c-dependent activation of procaspase-3. Oncogene, 2000. 19(16): p. 1975-81.

126. Parcellier, A. et al., HSP27 is a ubiquitin-binding protein involved in I-kappaBalpha proteasomal degradation. Mol. Cell. Biol., 2003. 23(16): p. 5790-802.

127. Paul, C. et al., Hsp27 as a negative regulator of cytochrome C release. Mol. Cell. Biol., 2002. 22(3): p. 816-34.

128. Paul, C. et al., Dynamic processes that reflect anti-apoptotic strategies set up by HspBl (Hsp27). Exp. Cell Res., 2010. 316(9): p. 1535-52.

129. Perng, M.D. et al., Intermediate filament interactions can be altered by HSP27 and alphaB-crystallin. J. Cell Sci., 1999. 112 ( Pt 13): p. 2099-112.

130. Peschek, J. et al., Regulated structural transitions unleash the chaperone activity of alphaB-crystallin. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2013. 110(40): p. E3780-9.

131. Piston, D.W. and Kremers, G.J., Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. Trends Biochem. Sci., 2007. 32(9): p. 407-14.

132. Pivovarova, A.V. et al., Effects of small heat shock proteins on the thermal denaturation and aggregation of F-actin. Biochem. Biophys. Res. Commun., 2005. 331(4): p. 154853.

133. Pockley, A.G., Heat shock proteins as regulators of the immune response. Lancet, 2003. 362(9382): p. 469-76.

134. Prasher, D.C. et al., Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein. Gene, 1992. 111(2): p. 229-33.

135. Qian, J. et al., Blockade of Hsp20 phosphorylation exacerbates cardiac ischemia/reperfusion injury by suppressed autophagy and increased cell death. Circ. Res., 2009. 105(12): p. 1223-31.

136. Raju, 1. and Abraham, E.C., Congenital cataract causing mutants of alphaA-crystallin/sHSP form aggregates and aggresomes degraded through ubiquitin-proteasome pathway. PLoS ONE, 2011. 6(11): p. e28085.

137. Raju, I. and Abraham, E.C., Mutants of human alphaB-crystallin cause enhanced protein aggregation and apoptosis in mammalian cells: influence of co-expression of HspBI. Biochem. Biophys. Res. Commun., 2013. 430(1): p. 107-12.

138. Raju, I., Kumarasamy, A., and Abraham, E.C., Multiple aggregates and aggresomes of C-terminal truncated human alphaA-crystallins in mammalian cells and protection by alphaB-crystallin. PLoS ONE, 2011. 6(5): p. el9876.

139. Rane, M.J. et al., Heat shock protein 27 controls apoptosis by regulating Akt activation. The Journal of biological chemistry, 2003. 278(30): p. 27828-35.

140. Rembold, C.M. et al., cGMP-mediated phosphorylation of heat shock protein 20 may cause smooth muscle relaxation without myosin light chain dephosphorylation in swine carotid artery. J. Physiol., 2000. 524 Pt 3: p. 865-78.

141. Rikova, K. et al., Global survey of phosphotyrosine signaling identifies oncogenic kinases in lung cancer. Cell, 2007. 131(6): p. 1190-203.

142. Robinson, C.R. and Sauer, R.T., Optimizing the stability of single-chain proteins by linker length and composition mutagenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 1998. 95(11): p. 5929-34.

143. Saha, S. and Das, K.P., Unfolding and refolding of bovine alpha-crystallin in urea and its chaperone activity. Protein J., 2007. 26(5): p. 315-26.

144.

145.

146.

147.

148.

149.

150.

151.

152.

153.

154.

155.

156

157.

158

159

160

161

162

163

Salari, S. et al., Extracellular HSP27 acts as a signaling molecule to activate NF-kappaB in macrophages. Cell Stress Chaperones, 2013. 18(1): p. 53-63.

Scharf, K.D., Siddique, M., and Vierling, E., The expanding family of Arabidopsis thaliana small heat stress proteins and a new family of proteins containing alpha-crystallin domains (Acdproteins). Cell Stress Chaperones, 2001. 6(3): p. 225-37. Schmitt, E. et al., Intracellular and extracellular functions of heat shock proteins: repercussions in cancer therapy. J. Leukoc. Biol., 2007. 81(1): p. 15-27. Seit-Nebi, A.S., Datskevich, P., and Gusev, N.B., Commentary on paper: Small heat shock proteins and the cytoskeleton: an essential interplay for cell integrity? (Wettstein et al.). Int. J. Biochem. Cell Biol., 2013. 45(2): p. 344-6.

Shashidharamurthy, R. et al., Mechanism of chaperone function in small heat shock proteins: dissociation of the HSP27 oligomer is required for recognition and binding of destabilized T4 lysozyme. J. Biol. Chem., 2005. 280(7): p. 5281-9.

Shi, J. et al., Cryoelectron microscopy analysis of small heat shock protein 16.5 (Hspl6.5) complexes with T4 lysozyme reveals the structural basis of multimode binding. J. Biol. Chem., 2013. 288(7): p. 4819-30.

Shimomura, O., Johnson, F.H., and Saiga, Y., Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea. J Cell Comp Physiol, 1962. 59: p. 223-39.

Simon, S. et al., Analysis of the dominant effects mediated by wild type or R120G mutant of alphaB-crystallin (HspB5) towards Hsp27 (HspBl). PLoS ONE, 2013. 8(8): p. e70545.

Singh, B.N. et al., Association of alphaB-crystallin, a small heat shock protein, with actin: role in modulating actin filament dynamics in vivo. J. Mol. Biol., 2007. 366(3): p. 756-67.

Slingsby, C., Wistow, G.J., and Clark, A.R., Evolution of crystallins for a role in the vertebrate eye lens. Protein Sci., 2013. 22(4): p. 367-80.

Song, S. et al., Protein-protein interactions between lens vimentin and alphaB-crystallin using FRET acceptor photobleaching. Mol. Vis., 2008.14: p. 1282-7. Sreekumar, P.G. et al., alphaB crystallin is apically secreted within exosomes by polarized human retinal pigment epithelium and provides neuroprotection to adjacent cells. PLoS ONE, 2010. 5(10): p. el2578.

Stamler, R. et al., Wrapping the alpha-crystallin domain fold in a chaperone assembly. J. Mol. Biol., 2005. 353(1): p. 68-79.

Stengel, F. et al., Quaternary dynamics and plasticity underlie small heat shock protein chaperone function. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2010. 107(5): p. 2007-12. Stepanenko, O.V. et al., [Fluorescent proteins: physical-chemical properties and application in cell biology]. Tsitologiia, 2007. 49(5): p. 395-420.

Stokoe, D. et al., Identification of MAPKAP kinase 2 as a major enzyme responsible for the phosphorylation of the small mammalian heat shock proteins. FEBS Lett., 1992. 313(3): p. 307-13.

Studier, F.W., Protein production by auto-induction in high density shaking cultures. Protein Expr. Purif., 2005. 41(1): p. 207-34.

Studier, F.W. and Moffatt, B.A., Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J. Mol. Biol., 1986. 189(1): p. 113-30. Sugiyama, Y. et al., Muscle develops a specific form of small heat shock protein complex composed of MKBP/HSPB2 and HSPB3 during myogenic differentiation. J. Biol. Chem., 2000. 275(2): p. 1095-104.

Sun, X. et al., Induction ofHsp22 (HspB8) by estrogen and the metalloestrogen cadmium in estrogen receptor-positive breast cancer cells. Cell Stress Chaperones, 2007. 12(4): p. 307-19.

164. Sun, X. et al., Interaction of human HSP22 (HSPB8) with other small heat shock proteins. J. Biol. Chem., 2004. 279(4): p. 2394-402.

165. Sun, Y. et al., Three-color spectral FRET microscopy localizes three interacting proteins in living cells. Biophys. J., 2010. 99(4): p. 1274-83.

166. Sun, Y. et al., FRET microscopy in 2010: the legacy of Theodor Forster on the 100th anniversary of his birth. Chemphyschem, 2011. 12(3): p. 462-74.

167. Tissieres, A., Mitchell, H.K., and Tracy, U.M., Protein synthesis in salivary glands of Drosophila melanogaster: relation to chromosome puffs. J. Mol. Biol., 1974. 84(3): p. 389-98.

168. Tsien, R.Y., The green fluorescent protein. Annu. Rev. Biochem., 1998. 67: p. 509-44.

169. van Ham, T.J. et al., Towards multiparametric fluorescent imaging of amyloid formation: studies of a YFP model of alpha-synuclein aggregation. J. Mol. Biol., 2010. 395(3): p. 627-42.

170. van Montfort, R.L. et al., Crystal structure and assembly of a eukaryotic small heat shock protein. Nat. Struct. Biol., 2001. 8(12): p. 1025-30.

171. van Noort, J.M. et al., Alphab-crystallin is a target for adaptive immune responses and a trigger of innate responses in preactive multiple sclerosis lesions. J. Neuropathol. Exp. Neurol., 2010. 69(7): p. 694-703.

172. van Noort, J.M. et al., The link between small heat shock proteins and the immune system. Int. J. Biochem. Cell Biol., 2012. 44(10): p. 1670-9.

173. Vanhoudt, J. et al., Native quaternary structure of bovine alpha-crystallin. Biochemistry, 2000. 39(15): p. 4483-92.

174. Vicart, P. et al., A missense mutation in the alphaB-crystallin chaperone gene causes a desmin-related myopathy. Nat. Genet., 1998. 20(1): p. 92-5.

175. Vos, M.J. et al., Structural and functional diversities between members of the human HSPB, HSPH, HSPA, and DNAJ chaperone families. Biochemistry, 2008. 47(27): p. 7001-11.

176. Wachter, R.M., The family of GFP-like proteins: structure, function, photophysics and biosensor applications. Introduction and perspective. Photochem. Photobiol., 2006. 82(2): p. 339-44.

177. Wang, X. et al., Overexpression of Hsp20 prevents endotoxin-induced myocardial dysfunction and apoptosis via inhibition of NF-kappaB activation. J. Mol. Cell. Cardiol., 2009. 47(3): p. 382-90.

178. Wang, Y. et al., Insulin and insulin antagonists evoke phosphorylation of P20 at serine 157 and serine 16 respectively in rat skeletal muscle. FEBS Lett., 1999. 462(1-2): p. 2530.

179. Wettstein, G. et al., Small heat shock proteins and the cytoskeleton: an essential interplay for cell integrity? Int. J. Biochem. Cell Biol., 2012. 44(10): p. 1680-6.

180. Yang, Z. et al., Highly efficient production of soluble proteins from insoluble inclusion bodies by a two-step-denaturing and refolding method. PLoS ONE, 2011. 6(7): p. e22981.

181. Zhang, J. et al., Design and optimization of a linker for fusion protein construction. Progress in Natural Science, 2009. 19(10): p. 1197-1200.