Изучение иммуноцитохимическими методами локализации цитокинин-связывающего белка 70 кД в тканях и клетках этиолированных проростков кукурузы тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Васильева, Виктория Сергеевна

• Васильева, Виктория Сергеевна
• кандидат биологических наук
• 2007

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Васильева, Виктория Сергеевна

СПИСОК УПОТРЕБЛЯЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Передача гормонального сигнала в растениях.

1.2. Передача цитокининового сигнала в растении.

1.2.1. Физиологические функции цитокининов.

1.2.2. Биосинтез цитокининов.

1.2.3. Механизм трансдукции цитокининового сигнала.

1.2.3.1. Мембранные рецепторы цитокининов гибридные гистидиновые протеинкиназы.

1.2.3.2. Трансдукция сигнала внутри клетки: фосфотрансмиттеры.

1.2.3.3. Гены первичного ответа на цитокинин и их продукты - регуляторы ответа.

1.2.3.4. Передача цитокининового сигнала через мембранный рецептор, общая схема.

1.2.3.5. Цитоплазматическиерецепторы цитокинина.

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2.1 Материалы и методы исследования.

2.1.1. Объекты исследования.

2.1.2. Выделение растворимых растительных белков для подбора условий иммуноцитохимического анализа ЦСБ-70.

2.1.3. Выделение ЦСБ-70 для анализа специфичности моноклональных антител разных групп.

2.1.4. Измерение концентрации белка.

2.1.5. Проведение аналитического электрофореза и иммуноблоттинга ЦСБ-70.

2.1.6. Иммуноферментный анализ влияния фиксации и дегидратации на сохранение иммунореактивности ЦСБ-70.

2.1.7. Иммуноферментный анализ влияния химических реагентов на сохранение иммунореактивности ЦСБ-70.

2.1.8. Фиксация и заливка в смолу растительной ткани.

2.1.9. Выявление ЦСБ-70 на полутонких срезах для световой микроскопии с помощью иммуномечения.

2.1.10. Выявление ЦСБ-70 на ультратонких срезах для электронной микроскопии с помощью иммуномечения.

2.1.11. Количественная оценка выявления ЦСБ-70 с помощью электронной микроскопии в компартментах клеток проростка кукурузы.

2.2. Результаты и обсуждение.

2.2.1. Разработка методов иммуноцитохимического исследования локализации ЦСБ-70 в тканях и клетках проростка кукурузы.

2.2.1.1. Исследование воздействия наЦСБ-70 реагентов, используемых для обработки растительного материала.

2.2.1.2. Подбор условий для иммобилизации растительного материала в полимерную среду.

2.2.1.3. Подбор условий для иммуноцитохимического выявления ЦСБ-70 на срезах растительной ткани.

2.2.2. Подбор антител для дифференцированного выявления ЦСБ-70 в органеллах растительных клеток.

2.2.3. Иммуноцитохимическое исследование локализации ЦСБ-70 в цитоплазме и ядрах клеток проростка кукурузы.

2.2.4. Иммуноцитохимическое исследование локализации ЦСБ-70 в пластидах клеток проростка кукурузы.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение иммуноцитохимическими методами локализации цитокинин-связывающего белка 70 кД в тканях и клетках этиолированных проростков кукурузы»

Одна из самых существенных особенностей жизненных процессов заключается в способности организма самостоятельно регулировать и координировать свои метаболические реакции. У растений весьма эффективными биорегуляторами, оказывающими влияние на все этапы жизнедеятельности, включая рост и развитие, являются фитогормоны. В отличие от сигнальных веществ других многоклеточных организмов, растительные гормоны полифункциональны и способны воздействовать при определенных обстоятельствах на любые ткани организма, вызывая различные изменения физиологических процессов в зависимости от баланса фитогормонов и состояния клеток-мишеней. Большинство исследователей считает, что объяснение необычных свойств фитогормонов, нужно искать на уровне рецепции гормональных сигналов. Исследования в этой области важны не только для фундаментальной науки, на их основе возможно создание растений со свойствами, удовлетворяющими современным требованиям к урожайности и устойчивости к стрессовым условиям.

Фитогормонами являются природные органические соединения, которые в малых концентрациях могут проявлять регулирующее воздействие на процессы роста и развития, а также на многие другие физиологические программы растений. К растительным гормонам относят небольшие молекулы, с молекулярным весом до 1 кД, способные беспрепятственно проникать в клетку и транспортироваться (активно или пассивно) по растению, влияя на ткапь-мишень. Шестью основными гормонами растений являются ауксины, цитокинины, гиббереллины, брассиностероиды, этилен, и абсцизовая кислота. Цитокинины представляют собой гормоны растений, участвующие в регуляции таких важнейших процессов, как деление клеток, дифференцировка побегов, рост клеток листа, биогенез хлорогшастов, задержка старения листьев, устьичные движения, ответ растений на стресс и многие другие [Кулаева О.Н., 1973]. Однако каким образом выполняются столь различные функции до сих пор неясно. В связи с этим очевидна теоретическая и практическая значимость исследований механизма действия этого класса гормонов.

В настоящее время открыты гены первичного ответа на цитокинин. В 2001 г. [InoueT. et al., 2001; Ueguchi С. et al., 2001] был открыт мембранный рецептор цитокининов. Он относится к так называемой двухкомпонентной регуляторной системе, включающей в себя трансмембранный рецептор, который является сенсорной гистидин-киназой, она взаимодействует с цитоплазматическим белком - переносчиком фосфатной группировки в ядро на цитокинин-зависимый трансфактор, включающий гены первичного ответа на цитокинин. Таким образом, мембранный рецептор передает цитокининовый сигнал через сеть внутриклеточных мессенджеров. Показано, что подобная система трансдукции работает и в случае других гормонов растений, например, этилена [Stock A.M. et al., 2000]. Однако, в литературе есть данные о содержании цитокининов в цитоплазме, ядре и хлоропластах [Sossountzov L. et al., 1988; Ivanova M. et al., 1994; Benkova E. et al., 1999; Kasahara H. et al., 2004]. В связи с этим, можно предполагать существование альтернативных, внутриклеточных форм рецепторов для этих гормонов. Один из таких белков - цитокинин-связывающий белок (ЦСБ) 67 кД, был выделен из клеток листьев ячменя [Kulaeva O.N. et al., 1995]. Он способен регулировать транскрипцию в системе in vitro, содержащей цитокинин. В нашей лаборатории из этиолированных проростков кукурузы также был выделен цитокинин-связывающий белок со свойствами рецептора - ЦСБ-70 [Бровко Ф.А. и др., 1996]. К нему была получена панель моноклональных антител, с помощью которых было показано, что ЦСБ-70 имеет общие иммунодетерминанты с ЦСБ-67, и способен заменять его в опытах по активации транскрипции в системе из листьев ячменя [Kulaeva O.N. et al., 1998]. Внутриклеточный цитокинин-связывающий белок, связываясь с цитокинином, активируется и проникает в ядро или другие ДНК-содержащие органеллы, где принимает участие в регуляции транскрипции.

Применение методов иммунохимии с использованием высокоспецифичных моноклональных антител даст возможность установления внутриклеточной локализации ЦСБ-70. Исследование же корреляции между содержанием рецепториого белка в тканях и активностью в них гормон-регулируемых процессов, несомненно, помогло бы прояснить многие аспекты его функционирования.

Исходя из сказанного выше, цель данной работы - изучить тканевую и клеточную локализацию цитокинин-связывающего белка ЦСБ-70. Для ее достижения мы выделили следующие задачи:

1. Подобрать условия выявления с помощью моноклональных антител на срезах этиолированных проростков кукурузы.

2. Подобрать антитела для дифференцированного выявления ЦСБ-70 в органеллах растительных клеток.

3. Исследовать локализацию ЦСБ-70 в ядрах различных типов тканей этиолированных проростков кукурузы с помощью сочетания методов иммуноцитохимии, световой и электронной микроскопии.

4. С помощью сочетания методов иммуноцитохимии, световой и электронной микроскопии исследовать особенности локализации ЦСБ-70 в пластидах разных типов клеток этиолированных проростков кукурузы.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Васильева, Виктория Сергеевна

ВЫВОДЫ

1. Разработана методика иммуноцитохимического анализа с помощью моноклональных антител (мАТ) цитокинин-связывающего белка 70 кД (ЦСБ-70) на срезах органов этиолированных проростков кукурузы.

2. Среди мышиных мАТ, полученных к ЦСБ-70, обнаружены две группы, различающиеся по способности выявлять антиген, что позволило установить присутствие ЦСБ-70 в цитоплазме и ядрах, а также в пластидах клеток проростка.

3. С помощью мАТ первой группы ЦСБ-70 обнаружен в ядрах и ядрышках клеток всех тканей и органов этиолированных проростков кукурузы.

4. Установлено, что ЦСБ-70 преимущественно накапливается в зонах клеточных делений: меристеме корня, корневом чехлике, апикальной меристеме стебля и зачаточных листьях, что указывает на его возможное участие в регуляции цитокинином деления клеток.

5. Электронная микроскопия с определением локализации ЦСБ-70 с помощью мАТ и их мечения коллоидным золотом позволила установить внутриклеточную локализацию ЦСБ-70.

6. С помощью мАТ второй группы впервые показано присутствие ЦСБ в этиопластах и амилопластах. Установлено, что накопление пластидного ЦСБ связано со степенью развития системы внутренних мембран в пластидах.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Передача гормонального сигнала в растении является одной из основных областей исследования современной физиологии растений. В настоящее время большое внимание уделяется изучению путей рецепции и трансдукции цитокининового сигнала в растительной клетке. На сегодняшний день установлена и продолжает изучаться система цитокининовой регуляции, включающая мембранные сенсорные гистидин-киназы CRE1 (АНК4), АНК2, и АНКЗ [Grefen Ch., Harter К., 2004; Hutchison С.Е., KieberJ.J., 2002], белки-фосфотрансмиттеры AHP и регуляторы ответа ARR групп А и В. Однако, блокирование способности рецепторных гистидип-киназ связывать гормон в тройном мутанте арабидопсиса не выключает механизм цитокинииовой регуляции полиостью. Это говорит о существовании альтернативной системы восприятия и передачи цитокининового сигнала. Предположительно, цитокинин-связывающие белки ЦСБ-67, выделенный из листьев ячменя, и ЦСБ-70 из этиолированных проростков кукурузы, а также ЦСБ 64 кД, выделенный из хлоропластов ячменя, входят в такую систему.

Основным результатом данной работы является разработка методики иммуноцитохимического исследования ЦСБ-70 в этиолированном проростке кукурузы и установление локализации этого белка в компартментах растительной клетки. Предварительная работа с ЦСБ-70 показала, что этот белок весьма чувствителен к воздействию окислителей, повышенных температур, изменения рН. На белковых экстрактах, выделенных из проростков, было проверено влияние различных реагентов, используемых для обработки растительного материала в процессе фиксации подготовки к иммуномечению, на сохранение иммунореактивности ЦСБ-70. Было обнаружено, что высокие концентрации глутарового альдегида в фиксаторе затрудняют выявление ЦСБ-70, причем попытки обрабатывать растительный материал периодатом натрия, рекомендуемые для уменьшения последствий перефиксации, отрицательно влияют на иммупореактивность исследуемого белка. Вследствие этого, был выбран фиксатор содержащий минимальное количество глутарового альдегида. При подборе способа выявления ЦСБ-70 на срезе, нами была учтена такая особенность растительной ткани, как наличие эндогенной пероксидазы. Оказалось, что реагенты, используемые обычно для ингибирования этого фермента (НС1, Н2О2), также оказывают негативное влияние на сохранение иммунных детерминант ЦСБ-70, поэтому было решено использовать в качестве ферментной метки щелочную фосфатазу.

Процедура иммуноцитохимического выявления ЦСБ-70 подбиралась с использованием разных вариантов контроля: исключение моноклональных антител к ЦСБ-70, замена их па моноклональные антитела к белку, заведомо отсутствующему в растительных тканях и использование вместо специфических антител преиммунной сыворотки. Это позволило добиться минимального уровня фонового окрашивания на срезах растительных образцов. Для оптимального усиления специфической реакции иммуномечения нами была выбрана стрептавидин-биотиновая система. В исследованиях с помощью световой микроскопии ее использовали с дополнительным усилением, путем повторной обработки срезов биотипилированными вторыми антителами и стрептавидин-ферментным коньюгатом.

Использование панели мышиных моноклональных антител к ЦСБ-70 для проведения иммуноцитохимической реакции показало, что по способности выявлять антиген антитела делятся на 3 группы: 1) выявляющие белок в цитоплазме и ядрах растительных клеток; 2) способные узнавать белок в ядрах и цитоплазме, однако значительно эффективнее выявляющие его в пластидах; 3) не выявляющие ЦСБ-70 в иммуноцитохимических тестах.

С помощью моноклональных антител первой группы нам удалось показать, что ЦСБ-70 присутствует в цитоплазме клеток, максимальная его концентрация находится в ядре, особенно в ядрышке. В кончике корня и надземных органах проростка ЦСБ-70 обнаруживается преимущественно в зонах клеточных делений. Локализация ЦСБ-70 в зонах активной пролиферации позволяет предполагать его участие в цитокинин-зависимой регуляции клеточных делений. Однако исследуемый белок обнаруживается не только в делящихся клетках, но и в ядрах и ядрышках клеток, закончивших деление, это может свидетельствовать о возможном участии этого белка также и в общих процессах транскрипции.

Моноклональные антитела второй группы позволили обнаружить реагирующий с ними белок в пластидах. Оказалось, что распределение ЦСБ-70 в пластидах зависит от степени развития в них внутренней мембранной системы. В тех пластидах, где система внутренних мембран находится на начальном этапе развития, или напротив, уже образовалось проламеллярное тело, количество белка, реагирующего с антителами, меньше, чем в тех органеллах, где мембранная структура развивается активно. Полученные данные о локализации в пластидах белка, выявляемого антителами к ЦСБ-70, указывают на возможную способность исследуемого белка влиять на процессы, происходящие в этих органеллах на стадии развития внутренней мембранной системы. Как показано в нашей лаборатории, в пластидах этиолированных проростков кукурузы присутствует ЦСБ-70, обладающий способностью активировать в комплексе с т/?ш/с-зеатином синтез РНК in vitro в транскрипционной системе хлоропластов. Полученные нами данные показали, что пластидный ЦСБ обладает общими иммунодетерминантами с ЦСБ-70 ядерной и цитоплазматической локализации. Эти иммунодетерминанты узнаются моноклональными антителами второй группы. Вместе с тем, пластидный белок не узнается первой группой антител к ЦСБ-70. Это подчеркивает различие этих белков или различие в конформации и окружении, которые могли бы экранировать соответствующие эпитопы. Полученные данные позволяют утверждать, что в пластидах существует белок, родственный ЦСБ-70 ядра и цитоплазмы. Поскольку белок активирует транскрипцию в хлоропластной транскрипционной системе, он функционально близок ядерному ЦСБ, участвующему в цитокинин-зависимой активации транскрипции.

Таким образом, есть все основания заключить, что в клетках этиолированных проростков кукурузы есть 2 типа ЦСБ: ядерной локализации, который участвует в регуляции транскрипции в ядре, и, по-видимому, имеет отношение к регуляции цитокинином деления клеток, и пластидный белок, который участвует в регуляции транскрипции в пластидах и связан с формированием в пластидах внутренней мембранной системы. До нашей работы не существовало данных, позволяющих предполагать участие ядерного и пластидного ЦСБ-70 в одном из проявлений функциональной активности цитокининов. Полученные нами данные об аккумуляции ядерного ЦСБ-70 в зонах клеточной пролиферации позволяют ожидать участие этого белка в регуляции цитокинином деления клеток и открывают перспективу изучения механизма этого участия.

Соответствие накопления пластидного ЦСБ со стадией формирования системы внутренних мембран пластид указывает на связь ЦСБ с этими процессами и ставит задачу дальнейшего изучения этой связи.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Васильева, Виктория Сергеевна, 2007 год

1. Аверина Н.Г. Механизмы регуляции и внутрипластидная локализация биосинтеза хлорофилла//Биол. мембраны. 1998. т. 15. № 5. с. 504-516.

2. Ананиев Е., Шакирова Ф.М., Клячко H.JL, Кулаева О.Н. Влияние цитокинина на образование полисом из предшествующих мРНК и рибосом // ДАН. 1980. т. 255. с. 508-510.

3. Бровко Ф.А., Шепеляковская А.О., Бурханова Э.А., Бозиев Х.М., Ламан А.С., Васильева B.C., Холл М.А., Кулаева О.Н. Преимущественная локализация цитокининсвязывающего белка (70 кД) в апикальной меристеме корня // ДАН. 2001. т. 381. №5. с. 684-686.

4. Бурханова Э.А., Федина А.Б., Дмитриева Г.Н., Кулаева О.Н. Влияние цитокинина на активность РНК-полимеразы в ядрах, выделенных из протопластов // ДАН. 1980. т. 252. вып. 2. с. 488-491.

5. Заграничная Т.К., Бровко Ф.А., Шепеляковская А.О., Бозиев Х.М., Липкин В.М. Моноклональные антитела к цитокинин-связывающему белку 70 кД из этиолированных проростков кукурузы // Физиология растений. 1997. т. 44. с. 5-10.

6. Каравайко Н.Н., Мошков И.Е., Селиванкина С.Ю., Новикова Г.В., Кулаева О.Н. Выделение при помощи антиидиотииических антител белка со свойствами рецептора цитокининов // ДАН. 1990. т. 310. № 3. с. 765-767.

7. Кулаева О.Н. Гормональная регуляция физиологических процессов у растений на уровне синтеза РНК и белка. М.: Наука, 1982. 84 с.

8. Кулаева О.Н. Цитокинины, их структура и функция. М.: Наука, 1973. 264 с.

9. Кулаева О.Н., Кузнецов В.В. Новейшие достижения и перспективы в области изучения цитокининов // Физиология растений, 2002. Т. 49, № 4, с. 626-640.

10. Кулаева О.Н., Кузнецов В.В. Новейшие достижения и перспективы изучения механизма действия фитогормонов и их участия в сигнальных системах целого растения // Вестник РФФИ. 2004. № 2 (36). с. 12-36.

11. Кулаева О.Н., Прокопцева О.С. Новейшие достижения в изучении механизма действия фитогормонов // Биохим. 2004. т. 69. № 3. с. 233-247.

12. Курсанов А.Л., Кулаева О.Н., Свешникова И.Н., Попова Э.А., Болякина Ю.П., Клячко Н.Л., Воробьева И.П. Восстановление клеточных структур и обмена веществ в желтых листьях под действием 6-бензиламинопурина // Физиология растений. 1964. т. 11. с. 838-847.

13. Микулович Т.П., Хохлова В.А., Кулаева О.Н., Свешникова И.Н. Влияние 6-бензиламинопурина на изолированные семядоли тыквы // Физиология растений. 1971. т. 18. с. 98.

14. Миронов А.А., Комиссарчик Я.Ю., Миронов В.А. Методы электронной микроскопии в биологии и медицине. С-Пб.: Наука, 1994. 399 с.

15. Свешникова И.Н., Кулаева О.Н. Болякина Ю.П. Образование ламелл и гран в хлоропластах желтых листьев под дейетием 6-бензиламинопурина // Физиология растений. 1966. т. 13. с. 769.

16. Селиванкина С.Ю., Каравайко Н.Н., Земляченко Я.В., Маслова Г.Г., Кулаева О.Н. Регуляция транскрипции рецептором цитокинина в системах in vitro // Физиология растений. 2001. т. 48. с. 434-440.

17. Селиванкина С.Ю., Каравайко Н.Н., Черепнева Г.Г., Прищепова А.Е., Кузнецов В.В., Кулаева О.Н. Биологически активный зеатин-связывающий белок из хлоропластов листьев ячменя // ДАН. 1997. т. 356. № 6. с. 830-832.

18. Селиванкина С.Ю., Зубо Я.О., Зубкова Н.К., Кудрякова Н.В., Кулаева О.Н., Кузнецов В.В. Цитокинин контролирует Транскрипцию генов рРНК в зеленеющих листьях ячменя // Докл. биохим. биофиз. 2004. т. 397. с. 258-260.

19. Хохлова В.А., Свешникова И.Н., Кулаева О.Н. Влияние фитогормонов на формирование структуры хлоропластов в изолированных семядолях тыквы // Цитология. 1978. т. 20. с. 1033-1038.

20. Хохлова В.А., Каравайко Н.Н., Подергина Т.А., Кулаева О.Н. Антагонизм в действии абсцизовой кислоты и цитокинина на структуру и биохимическую дифференцировку хлоропластов в изолированных семядолях тыквы // Цитология. 1978. т. 29. с. 10331039.

21. Aloni R., Langhans M., Aloni E., Dreieicher E., Ullrich C.I. Root-synthesized cytokinin in Arabidopsis is distributed in the shoot by the transpiration stream // J. Exp. Bot. 2005. v. 56 pp. 1535-1544.

22. Allison L.A. The role of sigma factor in plastid transcription // Biochimie. 2000. v. 82. pp. 537548

23. Amador V., Monte E., Garci'a-Martinez J.-L., and Prat S. Gibberellins signal nuclear import of PHOR1, a photoperiod-responsive protein with homology to Drosophila armadillo // Cell. 2001. v. 106. pp. 343-354.

24. Anantharaman V., Aravind L. The CHASE domain: a predicted ligand-binding module in plant cytokinin receptors and other eukaryotic and bacterial receptors // Trends Biochem. Sci. 2001. v. 26. pp. 579-582.

25. Aoyama Т., Oka A. Cytokinin signal transduction in plant cells // J. Plant Res. 2003. v. 116. pp. 221-231.

26. Avrameas S. Coupling of enzymes to proteins with glutaraldehyde. Use of the conjugates for the detection of antigens and antibodies // Immunochem. 1969. v. 6. pp. 43-47.

27. Barkan A., Goldschmidt-Clermont M. Participation of nuclear genes in chloroplast gene expression // Biochimie. 2000. v. 82. pp. 559-572.

28. Batt S., Venis M.A. Separation and localization of two classes of auxin-binding sites in corn coleoptile membranes // Planta. 1976. v. 130. pp. 15-21.

29. Benkova E., Witters E., van Dongen W., Kolar J., Motyka V., Brzobohaty В., van Onckelen H.A., Machackova I. Cytokinins in tobacco and wheat chloroplasts. Occurrence and changes due to light/dark treatment// Plant Physiol. 1999. v. 121. pp. 245-251.

30. Bligny M., Courtois F., Thaminy S., Chang Ch.-Ch., Lagrange Th., Baruah-Wolf J., Stern D., Lerbs-Maehe S. Regulation of plastid rDNA transcription by interactions of CDF2 with two different RNA polymerases // EMBO J. 2000. v. 19. pp. 1850-2000.

31. Bodescu G.O., Napier R.M. Receptors for auxin: will it all and in TIRs? // Tr. In PI. Sci. 2006. v. 11, pp. 217-223.

32. Bradford M.M. A rapid and sensitive method of the quantitation of microgram quantities of protein using the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. 1976. v. 72. № 1. pp.248-254.

33. Bronsema F.B.F., van Oostveen W.J.F., van Lammeren A.A.M. Immunocytochemical localization of auxin-binding proteins in coleoptiles and embryos of lea mays L. II Protoplasma. 1998. v. 202. pp. 65-75.

34. Che P., Gingerich D.J., Lall S., Howell S.II. Global and hormone-induced gene expression changes during shoot development in Arabidopsis I/ Plant Cell. 2002. v. 14. pp. 2771-2785.

35. Chen J.G., Ullah H., Young J.C., Sussman M.R., Jones A.M. ABP1 is required for organized cell elongation and division in Arabidopsis embryogenesis 11 Genes Dev. 2001. v. 15. pp. 902911.

36. Chen Yi-F., Randlett M.D., Findell J.L., Schaller G.E. Localization of the Ethylene Receptor ETR1 to the Endoplasmic Reticulum of Arabidopsis II J. Biol. Chem. 2002. v. 277. pp. 19861-19866.

37. Craig S., Goodchild D.J. Post-embedding immunolabelling. Some effects of tissue preparation on the antigenicity of plant proteins // Eur. J. of Cell Biol. 1982. v. 28. pp. 251-256.

38. D'Agostino I.B., Deruere J., Kieber J.J. Characterization of the response of the Arabidopsis response regulator gene family to cytokinin // Plant Physiol. 2000. v. 124. pp. 1706-1717.

39. Dill A., Jung H.-S., Sun T.-P. The DELLA motif is essential for gibberellin-induced degradation of RGA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. v. 98. pp. 14162-14167.

40. Dill A., Thomas S.G., Hu J., Steber C.M., Sun T.-P. The Arabidopsis F-box protein SLEEPY 1 targets gibberellin signaling repressors for gibberellin-induced degradation // Plant Cell. 2004. v. 16: pp. 1392-1405.

41. Dodds J.H. Experiments in plant tissue culture. Cambridge University Press, 1995.231 p.

42. Dubell A.N., Mullet J.E. Differential transcription of Pea chloroplast genes during light-induces leaf development// Plant Physiol. 1995. v. 1995. pp. 105-112.

43. Fasulo M.P. Kinetin counteracts the myomycin inhibitory effect on plastid differentiation in excised cucumber cotyledons // Biohem. Physiol. Pflanzen. 1980. v. 175. pp. 322-326.

44. Flores S., Tobin E.M. Cytokinin modulation of LHCP mRNA levels: the involvement of posttranscriptional regulation // Plant Mol. Biol. 1988. v. 11. pp. 409-417.

45. Gaudino R.J., Pikaard C.S. Cytokinin induction of RNA polymerase I transcription in Arabidopsis thaliana II J. Biol. Chem. 1997. v. 272. № 10. pp. 6799-6804.

46. Golovko A., Sitbon F., Tillberg E., Nicander B. // Plant Mol. Biol. 2002. v. 49. pp. 161-169.

47. Grefen Ch., Harter K. Plant two-component systems: principles functions, complexity and cross talk // Planta. 2004. v. 219. pp. 733-742.

48. Haberer G., Kieber J.J., Cytokinins: new insights into a classic phytohormone // Plant Physiol. 2002. v. 128. pp. 359-362.

49. Hall A.E., Findell J.L., Schaller G.E., Sisler E.C., Bleecker A.B. Ethylene perception by the ERS1 protein in Arabidopsis // Plant Physiol. 2000. v. 123. pp 1449-1458.

50. Hall J.M., Couse J.F., Korach K.S. The multifaceted mechanisms of estrogen receptor signaling // J. Biol. Chem. 2001. v. 276. pp. 36869-36872.

51. Hare P.D., van Staden J. The molecular basis of cytokinin action // Plant Growth Regul. 1997. v. 23. pp. 41-78.

52. Hess W.R., Borner Th. Organellar RNA polymerases of higher plants // Int. Rev. Cytol.1999. v. 190. pp. 1-59.

53. Hua J., Sakai H., Nourizadeh S., Chen Q.G., Bleecker A.B., Ecker J.R., Meyerowitz E.M. EIN4 and ERS2 are members of the putative ethylene-receptor gene family in Arabidopsis // Plant Cell. 1998. v. 10. pp. 1321-1332.

54. Hutchison C.E., Kieber J.J. Cytokinin Signaling in Arabidopsis II The Plant Cell. 2002. v. 14. pp. 47-59.

55. Jacobs M., Connell L., Cattolico R.A. A conserved His-Asp signal response regulator-like in Heterosigma akashiwo chloroplasts // Plant Mol. Biol. 1999. v. 41, pp. 645-655.

56. Jacobsen S.E., Olszewski N.E. Mutations at the SPINDLY locus of Arabidopsis alter gibberellin signal transduction // Plant Cell. 1993. v. 5. pp. 887-896.

57. Jensen E.V. Overview of Nuclear Receptor Family. In: Nuclear hormone receptors molecular mechanisms, cellular functions and clinical abnormalities/ ed. Parker M. London: Academic Press. 1991. pp. 1-13.

58. Jones A.M., Herman E.M. KDEL-containing auxin-binding protein is secreted to the plasma membrane and cell wall//Plant Physiol. 1993. v. 101. pp. 595-606.

59. Johnstone A., Thorpe R. Immunochemistry in Practice. N.-Y.: Blackwell Science Publications. 1982. 394 p.

60. Kakimoto T. CKI-1 a histidine kinase homologue implicated in cytokinin signal transduction // Science. 1996. v. 274. pp. 982-985.

61. Kakimoto T. Plant cytokinin biosynthetic enzymes as dimethylallyl diphosphate: ATP/ADP isopentenyltransferases // Plant Cell Physiol. 2001. v. 42. pp. 677-685.

62. Kasahara H., Takei K., Ueda N., Hishiyama Sh., Yamaya Т., Kamiya Yu., Yamaguchi Sh., Sakakibara H. Distinct isoprenoid origins of cis- and trans-zzatin biosyntheses in Arabidopsis II J. Biol. Chem. 2004. v. 279. № 14. pp. 14049-14054.

63. Kende H., Zeevaart A.D. The five "classical" plant hormones // The Plant Cell. 1997. v. 9. pp. 1197-1210.

64. Kim M., Christopher D.A., Mullet J.E. ADP-dependent phosphorylation regulates association of a DNA-binding complexwith the Barley chloroplast psbD blue-ligt-responsive promoter // Plant Physiol. 1999. v. 119. pp. 663-670.

65. Kim Y.S., Kim D.H., Jung J. Isolation of a novel auxin-receptor from soluble fractions of rice (Oryza sativa L.) shoots // FEBS Lett. 1998. v. 438. pp. 241-244.

66. Kulaeva O.N., Karavaiko N.N., Moshkov I.E., Selivankina S.Yu., Novikova G.V. Isolation of a protein with cytokinin-receptor properties by means of anti-idiotype antibodies // FEBS Lett. 1990. v. 261. № 1. pp. 410-412.

67. Kulaeva O.N., Karavaiko N.N., Selivankina S. Yu., Zemlyachenko Ya.V., Shipilova S.V. Receptor of trans-zeatin involved in transcription activation by cytokinin // FEBS Lett. 1995. v. 366. pp. 26-28.

68. Kulaeva O.N., Karavaiko N.N., Selivankina S.Yu., Moshkov I.E., Novikova G.V., Zemlyachenko Ya.V., Shipilova S.V., Orudgev E.M. Cytokinin signaling systems // Plant Growth Regul. 1996. v. 18. pp. 29-37.

69. Kulaeva O.N., Zagranichnaya Т.К., Brovko F.A., Karavaiko N.N., Selivankina S.Yu., Zemlyachenko Ya.V., Hall M., Lipkin V.M., Boziev Kh.M. A new family of cytokinin receptors from Cereales // FEBS Lett. 1998. v. 423. pp. 239-242.

70. Maliga P. Two plastid RNA-polymerases of higher plants: a evolving story // Trends Plant Sci. 1998. v. 3. pp. 4-6.

71. McGinnis K.M., Thomas S.G., Soule J.D., Strader L.C., Zale J.M., Sun T.-P., Steber C.M. The Arabidopsis SLEEPY 1 gene encodes a putative F-box subunit of an SCF E3 ubiquitin ligase //Plant Cell. 2003. v. 15: pp. 1120-1130.

72. Melan M.A. Overview of cell fixation and permeabilization // Methods Mol. Biol. 1994. v. 34. pp. 55-66.

73. Mendel D.D., Bodwell J.E., Gametchu B. The role of Heat Shock proteins in regulation of the function of the glucocorticoid receptor//J. Biol. Chem. 1986. v. 261. pp. 3758-3763.

74. Miyawaki K., Matsumoto-Kitano M., Kakimoto T. Expression of cytokinin biosynthesis isopentenyltransferase genes in Arabidopsis: tissue specificity and regulation by auxin, cytokinin and nitrate // The Plant J. 2004. v. 37. pp. 128-138.

75. Мок M.C. Cytokinins and plant development An overview // Cytokinins: Chemistry, activity and functions. Boca Raton: CRC Press, 1994. p. 155-166.

76. Мок D.W., Мок M.C. Cytokinin metabolism and action // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 2001. v. 52. pp. 89-118.

77. Monte E., Amador V., Russo E., Martinez-Garcia J., Prat S. PHOR1: a U-box GA signaling component with a role in proteasome degradation? // J. Plant Growth Regul. 2003. v. 22. pp.152-162.

78. Napier R.M., Venis M.A. Epitope mapping reveals conserved regions of an auxin-binding protein // Biochem. J. 1992. v. 284. pp. 841-845.

79. Oelmiiller R. Photooxidative destruction of chloroplasts and its effect on nuclear gene expression and extraplastidic enzyme levels // Photochem. Photobiol. 1989. v. 49. pp. 229-239.

80. Ogawa M., Kusano Т., Katsumi M., Sano H. Rice gibberellin-insensitive gene homolog, OsGAI, encodes a nuclear-localized protein capable of gene activation at transcriptional level // Gene. 2000. v. 245. pp. 21-29.

81. Parthier В. The role of phytohormones (eytokinins) in ehloroplast development // Biochem. Physiol. Pflanz. 1979. v. 174. pp. 173-214.

82. Pelletier G., Morel G. Immunoenzyme techniques at the electron microscopical level // Immunolabelling for electron microscopy.: Amsterdam: Elsevier, 1984. pp. 83-93.

83. Peng J., Carol P., Richards D.E., King K.E., Cowling R.J., Murphy G.P., Harberd N.P. The Arabidopsis GAI gene defines a signaling pathway that negatively regulates gibberellin responses // Genes Dev. 1997. v. 11. pp. 3194-3205.

84. Pischke M.S., Jones L.G., Otsuga D., Fernandez D.E., Drews G.N., Sussman M.R. An Arabidopsis histidine kinase is essential for megagametogenesis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. v. 99. pp. 15800-15805.

85. Rashotte A.M., Carson S.D.B., To J.P.C., Kieber J.J. Expression profiling of cytokinin action in Arabidopsis II Plant Physiol. 2003. v. 132. pp. 1998-2011.

86. Razem F.A., Luo M., Liu J.-H., Abrams S.R., Hill R.D. Purification and characterization of a barley aleurone abscisic acid-binding protein // J. Biol. Chem. 2003. v. 279. pp. 9922-9929.

87. Razem F.A., El-Kereamy A., Abrams S.R., Hill R.D. The RNA-binding protein FCA is an abscisic acid receptor//Nature. 2006. v. 439. pp. 227-228.

88. Ritchie S., Gilroy S. Abscisic acid signal transduction in the barley aleurone is mediated by phospholipase D activity // Plant Biol. 1998. v. 95, pp. 2697-2702.

89. Rodermel S. Pathways of plastid-to-nucleus signaling // Trends Plant Sci. 2001. v. 6. pp. 471478.

90. Roland J.C., Vian В. General preparation and staining of thin sections // Electron microscopy of plant cells. London: Academic Press, 1991. pp. 1-66.

91. Sakakibara H., Suzuki M„ Takei K., Deji A., Taniguchi M., Sugiyama T.A. Response-regulator homologue possibly involved in nitrogen signal transduction mediated by cytokinin in maize // Plant J. 1998. v. 14. pp. 337-344.

92. Schaller G.E., Ladd A.N., Lanahan M.B., Spanbauer J.M., Bleecker A.B. The ethylene response mediator ETR1 from Arabidopsis forms a disulfide-linked dimmer // J. Biol. Chem. 1995. v. 270. pp. 12526-12530.

93. Silverstone A.L., Мак P.Y.A., Casamitjana Martinez E., and Sun T.-P. The new RGA locus encodes a negative regulator of gibberellin response in Arabidopsis thaliana II Genetics. 1997. v. 146. pp. 1087-1099.

94. Sossountzov L., Maldiney R., Sotta В., Subbagh I., Habricot Y., Bonner M., Miginias E. Immunocytochemical localization of cytokinins in Graigella tomato and a side-shoot less mutant // Planta. 1988. v. 175. pp. 291-304.

95. Spurr A.R. A low viscosity epoxy resin embedding medium for electron microscopy // J. Ultrastruc. Res. 1969. v. 26. pp. 31-43.

96. Sternberger L.A., Sternberger N.H. The unlabelled antibody method: comparison of peroxidase-antiperoxidase with avidin-biotin complex by a new method of quantification // J. Histohem. Cytochem. 1986. v. 34. pp. 599-602.

97. Stock A.M., Robinson V.L., Goudreau P.N. Two-component signal transduction // Annu. Rev. Biochem. 2000. v. 97. pp. 14778-14788.

98. Suzuki Т., Imamura A., Ueguchi C., Mizuno T. Histidine-containing phosphotransfer (HPt) signal transducers implicated in His-to-Asp phosphorelay in Arabidopsis И Plant Cell Physiol. 1998. v. 39. pp. 1258-1268.

99. Suzuki Т., Miwa К., Ishikawa К., Yamada H., Aiba H., Mizuno Т. The Arabidopsis sensor His-kinase, AHK4, can respond to cytokinins // Plant Cell Physiol. 2001. v. 42. pp. 107-113.

100. Swain S.M., Tseng T.-S., Thornton Т., Gopalraj M., Olszewski N.E. SPINDLY is a nuclear-localized repressor of gibberellin signal transduction expressed throughout the plant // Plant Physiol. 2002. v. 129. pp. 605-615.

101. Takei K., Sakakibara H., Sugiyama T. Identification of genes encoding adenilate isopentenyltransferase, a cytokinin biosynthesis enzyme, in Arabidopsis thaliana II J. Biol. Chem. 2001. v. 276. pp. 26405-26410.

102. Takei K., Yamaya Т., Sakakibara H. Arabidipsis CYP735A1 and CYP735A2 encode cytokinin hydroxylases that catalyze the biosynthesis of trans-zeatin // J. Biol. Chem. 2004. v. 279. pp. 41866-41872.

103. Taniguchi M., Kiba Т., Sakakibara H., Ueguchi C., Mizuno Т., Sugiyama T. Expression of Arabidopsis response-regulator homologies is induced by cytokinin and nitrate // FEBS Lett. 1998. v. 429. pp. 259-262.

104. Thornton T.M., Swain S.M., Olszewski N.E. Gibberellin signal transduction presents ellipsis the SPY who O-GlcNAc'd me // Trends Plant Sci. 1999. v. 4. pp. 424^128.

105. Timms B.G. Postembedding immunogold labeling for electron microscopy using "LR White" resin // Am. J. Anat. 1986 v. 175. v. 267-275.

106. Tsai M.J., O'Malley B.W. Molecular mechanisms of action of steroid. Thyroid receptor super family members//Annu. Rev. Biochem. 1994. v. 63. pp. 451-486.

107. Ueguchi C., Koizumi H., Suzuki Т., Mizuno T. Novel family of sensor histidine kinase genes in Arabidopsis thaliana IУ Plant Cell Physiol., 2001. v. 42, pp. 231-235.

108. Ueguchi-Tanaka M., Ashikari M., Nakajina M, et al. Gibberellin insensitive dwarfl encodes a soluble receptor for gibberellin // Nature. 2005. v. 437. pp. 627-628.

109. Wang X. The role of phospholipase D in signal cascades // Plant Physiol. 1999. v. 120. pp. 645651.

110. Werner Т., Motyka V., Strnad M., Schmiilling T. Regulation of plant growth by cytokinin // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. v. 98. pp. 10487-10492.

111. Wilchek M., Bayer E.A. The avidin-biotin complex in bioanalytical applications // Anal. Biochem. 1988. v. 171. pp. 1-32.

112. Yakovleva L.A., Kulaeva O.N. The effect of phytohormones on phosphorylation of ribosomal proteins in detached pumpkin cotyledons // Biochem. Physiol. Pflanz. 1987. v. 182. pp. 359365.

113. Yonekura-Sakakibara K., Kojima M., Yamaya Т., Sakakibara H. Molecular characterization of cytokinin-responsive histidine kinases in maize. Differential ligand preferences and response to c/j-zeatin // Plant Physiol. 2004. v. 134, pp. 1654-1661.

114. Zhang D.-P., Wu Z.-Y., Li X.-Y., Zhao Z.-X. Purification and identification of a 42-kilodalton abscisic acid-specific-binding protein from epidermis of broad bean leaves // Plant Physiol. 2002. v. 128. pp. 714-725.

115. Zheng Z., Nafisi M., Tam A. Plasma membrane-associated ROPIO small GTPase is a specific negative regulator of abscisic acid responses in Arabidopsis II The Plant Cell. 2002. v. 14. pp.2787-2797.