Изучение посттрансляционных модификаций вирусных белков с использованием масс-спектрометрических подходов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, кандидат химических наук Серебрякова, Марина Васильевна

• Серебрякова, Марина Васильевна
• кандидат химических наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат химических наук Серебрякова, Марина Васильевна

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.9

2.1 Использование масс-спектрометрии при изучении белков.

2.2 Основы MALDI-времяпролетной масс-спектрометрии белков и пептидов.

2.2.1 MALDI - получение газофазных ионов биополимеров.

2.2.2 Фрагментация пептидов, индуцированная MALDI.

2.2.3 Изучение природных модификаций белков.

2.2.4 Времяпролетная система разделения ионов и их детекция.

2.2.5 Разрешение и точность MALDI-времяпролетных масс-спектрометров.

2.2.6 Получение масс-спектров фрагментации.

2.3 Белок оболочки X вируса картофеля.

2.3.1 Строение белка оболочки X вируса картофеля.

2.3.2 Возможные модификации белка оболочки X вируса картофеля.

2.4 Гемагглютинин вируса гриппа типа А.

2.4.1 Строение вирусных частиц гриппа типа А.

2.4.2 Строение гемагглютинина и его участие в слияниис клеткой хозяина.

2.4.3 Ацилирование С-концевого участка гемагглютинина жирными кислотами и возможная роль этой модификации белка.

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.41

Препараты X вируса картофеля.

Препараты вируса гриппа типа А.

Модельные пептиды.

Масс-спектрометрия.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.48

4.1 Масс-спектрометрическое определение положения углеводных остатков в белке оболочки Х-вируса картофеля, штамм UK3, и его мутанта.

4.1.1 Определение возможных модификаций белка оболочки.

4.1.2 Определение точного положения сахарных остатков.

4.2 Изучение ацилирования цистеинов С-концевой области гемагглютинина вируса гриппа штаммов A/Puerto Rico/8/34, А/Х-31 и A/FPV/Weybridge/34 жирными кислотами.

4.2.1 Выделение и идентификация С-концевых фрагментов.

4.2.2 Изучение лабильности тиоэфирной связи под действием восстанавливающих агентов.

4.2.3 Определение соотношения количеств пальмитиновых и стеариновых остатков в С-концевой области гемагглютининов разных штаммов.

4.2.4 Изучение направленности ацилирования трех цистеиновых остатков С-концевой области гемагглютинина разными жирными кислотами.

5. ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение посттрансляционных модификаций вирусных белков с использованием масс-спектрометрических подходов»

Актуальность проблемы.

Модификация белков в биологических системах приводит к изменению их физико-химических свойств, конформации, стабильности, биологической активности. Такие посттрансляционные модификации, как гликозилирование, фосфорилирование, присоединение остатков жирных кислот являются не только наиболее распостраненными, но и функционально важными для обретения белковой молекулой новых свойств, влияющих на их биологическую функцию.

В последние десятилетия были достигнуты впечатляющие успехи в разработке физико-химических подходов к выявлению посттрансляционных модификаций белков, среди которых наиболее важное место заняли методы масс-спектрометрического анализа. С появлением способов получать ионы белков и пептидов, не разрушая их, и измерять их точные массы, появилась возможность судить об их модификациях по расхождению значений расчитанных и измеренных масс. Одним из таких способов ионизации является MALDI - лазерная десорбция/ионизация в присутствии вспомогательного вещества - матрицы.

При исследовании структуры белка обычно прибегают к получению масс-спектрометрической пептидной карты - определению набора значений масс пептидов после проведения высокоспецифического гидролиза белка - химического или ферментативного («MS-peptide fingerprint»). Помимо получения значений масс целых молекул в сложных смесях, масс-спектрометрия предоставляет и возможность получения спектров фрагментации отдельных пептидов, происходящей непосредственно в масс-спектрометре. Как MS-пептидный фингерпринт характеристичен для данной молекулы белка, так и спектр фрагментации характеристичен для пептида. Получение пептидных карт белка и/или спектров фрагментации отдельных пептидов позволяет подтвердить первичную структуру, выявить посттрансляционные модификации, включая природу заместителей и места их ковалентного связывания.

В ряде случаев, при получении спектров фрагментации оказывается, что энергия связи модифицирующей группы с пептидом низка, поэтому её разрушение происходит наиболее интенсивно и приводит к потере информации об исходной локализации данной группы. Так, например, при определении точек гликозилирования неустойчивость гликозидных связей в условиях ионизации ведет к первоочередному отщеплению сахара от исследуемого пептида. Поэтому для правильной интерпретации масс-спектров необходимо правильно оценивать устойчивость ковалентной связи модифицирующей группы с пептидом и в случае её низкой устойчивости искать комплементарные подходы к установлению точки модификации.

Вследствие разной способности у разных пептидов сокристаллизоваться с матрицей (при использовании метода MALDI), а также образовывать газофазные ионы, масс-спектрометрию нельзя отнести к количественным методам физико-химического анализа. Поэтому, при изучении степени модифицированное™ белка требуется либо применение специальных методов пробоподготовки, либо параллельное использование других методов (хроматография, электрофорез etc.).

В данной работе при помощи MALDI-времяпролетной-масс-спектрометрии (MALDI-TOF) исследованы два типа природных модификаций - О-гликозилирование остатков серина и треонина и ацилирование жирными кислотами SH-групп цистеиновых остатков природных белков.

Первая часть работы направлена на определение модификаций белка оболочки X вируса картофеля - представителя группы потексвирусов из семейства нитевидных вирусов растений. Роль белка оболочки не ограничивается формированием защитного белкового чехла. Он также вовлечен в транспорт вирусной РНК по растению, влияет на возникновение резистентности растения картофеля к заражению, значим для регуляции трансляции на разных стадиях инфекции. Факт О-гликозилирования белка оболочки был установлен в 1994 году, но до последнего времени не были изучены ни тип Сахаров, ни их локализация, ни степень гликозилирования белка, ни их возможная значимость. Это делает углубленный анализ этой модификации белка оболочки безусловно актуальным.

Во второй части работы изучались модификации С-концевого участка малой субъединицы гемагглютинина вируса гриппа А. Гемагглютинин - гликозилированный поверхностный белок вируса. Он представляет собой гомотример, каждый мономер которого состоит из двух цепей, связанных между собой дисульфидным мостиком. Легкая цепь заякорена в мембрану своим С-концевым участком. Основные исследования структурных и функциональных особенностей гемагглютинина связаны с изучением его эктодоменов. Для ряда штаммов получены рентгеноструктурные данные, проливающие свет на пространственную организацию экспонированной на поверхность части белка. В то же время, практически отсутствуют данные о структуре заякоренного в оболочке вириона С-концевого гидрофобного пептида. На сегодня опубликована единственная работа на искусственно синтезированном пептиде, встроенном в липосому, направленная на выяснение его свойств и структуры. Фрагмент гемагглютинина, остающийся в вирусной мембране после обработки вириона протеазой бромелаином, содержит трансмембранный домен и небольшой внутривирионный участок. В нём присутствуют три консервативных цистеиновых остатка, которые способны к ацилированию высшими жирными кислотами. Исследование типа и степени ацилирования представляется очень важным, так как остатки жирных кислот могут служить для ориентации трансмембранных доменов в липидном бислое, способствовать тримеризации гемагглютинина, участвовать в образовании пор слияния в процессе инфицирования клетки-хозяина или во взаимодействии гемагглютинина с внутренными вирусными белками.

Цель и задачи исследования.

Работа посвящена отработке методов применения MALDI-TOF для изучения двух из распостраненных модификаций природных белков - О-гликозилирования и ацилирования цистеиновых остатков высшими жирными кислотами. С этой целью были сформулированны следующие задачи:

1 исследовать возможные постгрансляционные модификации белка оболочки природного штамма UK3 Х-вируса картофеля, являющегося типичным представителем группы потексвирусов из семейства нитевидных вирусов растений. Для этого: получить и проанализировать пептидные карты белка, определить степень гликозилирования и тип присоединенных сахарных остатков, разработать подходы к точному установлению сайтов гликозилирования.

2 исследовать структуру и характер ацилирования высшими жирными кислотами цистеинов С-концевого фрагмента лёгкой цепи гемагглютинина трёх штаммов вируса гриппа A: A/Puerto Rico/8/34, А/Х-31 и A/FPV/Weybridge/34. Для этого: выделить и идентифицировать С-концевые пептиды, определить степень ацилирования трех консервативных цистеиновых остатков этой области белка и тип присоединяемых жирнокислотных остатков, изучить стабильность тиоэфирной связи в условиях получения масс-спектров и в присутствии восстанавливающих агентов в процессе выделения белка.

Научная новизна работы сформулирована в виде следующих положений, которые выносятся на защиту:

1 Впервые с использованием масс-спектрометрических подходов проведен структурный анализ белка оболочки X вируса картофеля природного штамма UK.3 и его ST-мутанта, у которого все остатки серина и треонина N-концевой области белка заменены на остатки глицина или аланина. Для них:

- установлено, что модификации сосредоточены только в N-концевой области белка и заключаются в его N-ацетилировании у обоих штаммов, а также О-гликозилировании белка оболочки природного штамма. С точностью, определяемой использованными методами, показано, что выявленные модификации характерны для всех молекул белка оболочки вирусных частиц;

- впервые установлен тип и локализация присоединяемых сахарных остатков. Показано, что единственный остаток моносахарида - галактозы или фукозы -присоединяется только к ацетилированному остатку серина в первом положении аминокислотной последовательности белка оболочки X вируса картофеля штамма UK3;

2 Выделены и методами масс-спектрометрии охарактеризованы С-концевые пептиды легкой цепи гемагглютинина вируса гриппа типа А, содержащие трансмембранный домен и внутривирионный участок. Исследования проведены на трех вирусных штаммах A/Puerto Rico/8/34, А/Х-31 и A/FPV/Weybridge/34. Для них:

- впервые продемонстрировано практически полное ацилирование трех консервативных цистеиновых остатков внутривирионного участка белка остатками жирных кислот;

- впервые установлена возможность модификации гемагглютинина вируса гриппа типа А не только пальмитиновой, но и стеариновой кислотой. Определены количественные соотношения ацилирующих эту область белка пальмитиновых и стеариновых остатков, которые оказались существенно различными для трех вирусных штаммов.

- впервые показана неравноценность трех указанных цистеиновых остатков по отношению к ацилированию разными жирными кислотами. Для штамма A/FPV/Weybridge/34 установлено преимущественное присоединение остатка стеариновой кислоты к цистеину, наиболее приближенному к трансмембранному домену белка.

Практическая значимость работы заключается в разработке методологических подходов к изучению неустойчивых при проведении масс-спектрометрического анализа модификаций белков, в разработке способов выделения и MS-детекции трансмембранных пептидов. В ходе исследования также показана достаточная для получения масс-спектров фрагментации устойчивость тиоэфирной связи и исследована лабильность этой связи под действием известных восстанавливающих агентов.

Публикации и апробация работы.

Материалы диссертации опубликованы в 11 работах, в том числе в 5 статьях в отечественных и зарубежных научных журналах, и в тезисах 6 докладов на международных и всероссийских научных конференциях.

Результаты работы доложены на З"6* международном пептидном симпозиуме (Прага, Чехия, сентябрь 2004), на 2"°м международном семинаре-школе «Масс-спектрометрия в химической физике, биофизике и экологии» (Звенигород, октябрь 2004), на VII чтениях, посвященных памяти академика Ю.А. Овчинникова (Москва, октябрь 2004), на I и II Российском симпозиуме по химии и биологии пептидов (Москва, ноябрь 2003; Санкт-Петербург, май 2005) и на 19"°м Американском пептидном симпозиуме (Сан-Диего, США, июнь 2005).

Вклад автора в разработку проблемы.

Автором проведены все исследования данных вирусных белков в части применения MALDI-времяпролетной масс-спектрометрии, в том числе получения и интерпретации спектров фрагментации. Предложены оригинальные схемы проведения экспериментов для получения масс-спектрометрических результатов. Установлена точка гликозилирования белка оболочки Х-вируса картофеля. Идентифицированы С-концевые фрагменты легкой цепи гемагглютинина вируса гриппа типа А трех штаммов и определена степень их ацилирования жирными кислотами, получены соотношения пальмитатов и стеаратов, установлена направленность ацилирования трех цистеиновых остатков внутривирионного участка гамагглютинина разными жирнокислотными остатками. Изучены условия разрушения тиоэфирной связи в присутствии восстанавливающих агентов.

Работа выполнена в отделе хроматографии Научно-исследовательского института физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, в лаборатории клинической биохимии Научного центра психического здоровья РАМН и в отделе протеомных исследований Научно-исследовательского института биомедицинской химии им. В.Н.Ореховича РАМН.

Объем и структура работы.

Диссертационная работа изложена на 98 страницах машинописного текста, содержит 5 таблиц, 37 рисунков и 2 приложения. Работа состоит из введения, трех глав (обзор литературы, экспериментальная часть, результаты и их обсуждение), выводов и списка литературы, содержащего 121 ссылку.

Заключение диссертации по теме «Биоорганическая химия», Серебрякова, Марина Васильевна

5. ВЫВОДЫ

1. Впервые с использованием масс-спектрометрических подходов проведен структурный анализ белка оболочки X вируса картофеля природного штамма UK3 и его ST-мутанта, у которого все остатки серина и треонина N-концевой области белка заменены на остатки глицина или аланина. Установлено, что модификации сосредоточены только в N-концевой области белка и заключаются в его N-ацетилировании у обоих штаммов, а также О-гликозилировании белка оболочки природного штамма. С точностью, определяемой использованными методами, показано, что выявленные модификации характерны для всех молекул белка оболочки вирусных частиц.

2. Впервые установлен тип и точная локализация присоединяемых сахарных остатков. Показано, что единственный остаток моносахарида - галактозы или фукозы — присоединяется только к ацетилированному остатку серина в первом положении аминокислотной последовательности белка оболочки X вируса картофеля штамма UK3.

3. Выделены и охарактеризованы методами масс-спектрометрии С-концевые пептиды легкой цепи гемагглютинина вируса гриппа типа А, содержащие трансмембранный домен и внутривирионный участок. Исследования проведены на трех вирусных штаммах A/Puerto Rico/8/34, А/Х-31 и A/FPV/Weybridge/34. Продемонстрировано практически полное ацилирование трех консервативных цистеиновых остатков внутривирионного участка белка остатками жирных кислот.

4. Впервые установлена возможность модификации гемагглютинина вируса гриппа типа А не только пальмитиновой, но и стеариновой кислотой. Определены количественные соотношения ацилирующих эту область белка пальмитиновых и стеариновых остатков, которые оказались существенно различными для трех вирусных штаммов.

5. Впервые показана неравноценность трех цистеиновых остатков внутривирионного участка гемагглютинина вируса гриппа А по отношению к ацилированию разными жирными кислотами. Для белка из штамма гриппа A/FPV/Weybridge/34 установлено преимущественное присоединение остатка стеариновой кислоты к цистеину, наиболее приближенному к трансмембранному домену белка.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Серебрякова, Марина Васильевна, 2005 год

1. Yamashita М., Fenn J. В. Electrospray ion source: Another variation of the free-jet theme. // J. Phys. Chem.1984, v.88, p.4451-4459

2. Александров M.JI., Галль Л.Н., Краснов H.B., Николаев В.И., Павленко В.А., Шкуров В.А. //Докл. АН СССР 1984, т.277, с.379-383

3. Fenn J.B., Mann М„ Meng С.К., Wong S.F., Whitehouse C.M. Electrospray ionization-principles and practice. // Mass Spectrom. Rev. 1990, v.9 (1), p.37-70

4. Karas M., Hillenkamp F. Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons. // Anal Chem. 1988, v.60 (20), p.2299-2301

5. Tanaka K., Waki H., Ido Y., Akita S„ Yoshida Y, Yoshida Т. II Rapid Commun. Mass. Spectrom. 1988, v.2, p.151

6. Mann M., Hojrup P., Roepstorrf P. Use of mass spectrometric molecular weight information to identify proteins in sequence databases. // Biol. Mass Spectrom. 1993, v.22(6), p.338-345

7. Tang C., Zhang W., Fenyo D., Chait В. T. Assessing the Performance of Different Protein Identification Algorithms. // ProteoMetrics, LLC, New York, 48-th ASMS Conference, June 11 15,2000, Long Beach, California

8. Jensen O.N., Wilm M., Shevchenko A, Mann M. Sample preparation methods for mass spectrometric peptide mapping directly from 2-DE gels. // Methods Mol. Biol. 1999, v.112, p.513-530

9. Patterson S. D., Thomas D., Bradshow R. A. Application of combined mass spectrometry and partial amino acid sequence to the identification of gel-separated proteins. // Elecrophoresis 1996, v.17 (5), p.877-891

10. Jates IIIJ.R., EngJ.K., McCormack A.L., Schieltz D.M. Method to correlate tandem mass spectra of modified peptides to amino acid sequences in the protein database. // Anal. Chem. 1995, v.67 (8), p.1426-1436

11. McCormack A.L., Schieltz D.M., Goode В., Yang S„ Barnes G„ Drubin D„ Yates J. R. Direct analysis and identification of proteins in mixtures by LC/MS/MS and database searching at the low-femtomole level. II Anal. Chem. 1997, v.69 (4), p.467-476

12. Siuzdak G. Mass Spectrometry For Biotechnology. // Academic press Inc., San Diego, CA, 1996, p. 161

13. Snyder A. P. Interpreting Protein Mass Specra: A Comprehensive Resource Global View Publishing. // Pittsburg, PA, 2000, p.48

14. Арчаков А. К, Говорун B.M. Протеомные технологии в современной биомедицине\ской науке. // Биохимия 2000, т.67 (10), с. 1109-1123

15. Hillenkamp F., Karas М., Beavis R.C., Chait В.Т. Matrix-assisted laser desorption / ionization mass-spectrometry of biopolymers. // Anal. Chem. 1991, v.63 (24), p. 1193A-1203A

16. Kussmann M„ Roepstorff P. Sample preparation techniques for peptides and proteins analyzed by MALDI-MS // Methods Mol Biol. 2000, v.146, p.405-24

17. Staudenmann W., Halt P.D., Hoving S., Lehmann A., Kertesz M., James P. Sample Preparation. Sample handling for proteome analysis. I I Electrophoresis 2005, v. 19(6), p.901-908

18. Kruger R., Karas M. Formation and fate of ion pairs during MALDI analysis: anion adduct generation as an indicative tool to determine ionization processes. // J. Am. Soc. Mass. Spectrom. 2002, v.13 (10), p.1218-1226

19. Sechi S. A method to identify and simultaneously determine the relative quantities of proteins isolated by gel electrophoresis. // Rapid Commun Mass Spectrom. 2002, v. 16(15), p.1416-1424

20. Parker K.C., Patterson D., Williamson В., Marchese J., Graber A., He F„ Jacobson A., Juhasz P., Martin S. Depth of proteome issues: a yeast isotope-coded affinity tag reagent study. // Mol Cell Proteomics. 2004, v.3 (7), p.625-659

21. Roepstorff P. MALDI-TOF mass spectrometry in protein chemistry. // EXS 2000, v.88, p.81-97

22. Karas M., Gluckmann M„ Schafer J. Ionization in matrix-assisted laser desorption/ionization: singly charged molecular ions are the lucky survivors. // J.Mass.Spectrom. 2000, v.35, p.1-12

23. Knochenmuss R, Stortelder A, Breuker K, Zenobi R. Secondary ion-molecule reactions in matrix-assisted laser desorption/ionization. // J Mass Spectrom. 2000, v.35 (11), p.1237-1245

24. Zhigilei L. V., Leveugle Е. Computer simulations of laser ablation of molecularsubstrats. // Chem.Rev. 2003, v. 103, p.321-347

25. Zhang J, Zenobi R. Matrix-dependent cationization in MALDI mass spectrometry. // J Mass Spectrom. 2004, v.39 (7), p.808-816

26. Бродский А.И. Физическая химия. // Москва, Госхимиздат, 1948, т.2, с.942

27. Papayannopoulos I.A. The interpretation of collision-induced dissociation tandem mass spectra of peptides. // Mass Spectrom. Rev. 1995, v. 14 (1), p.49-73

28. Brown R.S., Lennon J.J. Sequence-specific fragmentation of matrix-assisted Iaser-desorbed protein/peptide ions. // Anal Chem. 1995, v.67 (21), p.3990-3999

29. Andersen J.S., Mann M. Functional genomics by mass spectrometry. // FEBS Lett. 2000, v.480 (1), p.25-31

30. Lottspeich F. Proteome Analysis: A Pathway to the Functional Analysis of Proteins. // Angew Chem Int Ed Engl. 1999, v.38 (17), p.2476-2492

31. Person M.D., Monks T.J., Lau S.S. An integrated approach to identifying chemically induced posttranslational modifications using comparative MALDI-MS and targeted HPLC-ESI-MS/MS. // Chem. Res. Toxicol. 2003, v.16 (5), p.598-608

32. Герасимов Я.И. Курс физической химии. // Москва, Госхимиздат, 1968, с. 69

33. Kinumi Т., Niwa H„ Matsumoto H. Phosphopeptide sequencing by in-source decay spectrum in delayed extraction matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. // Anal Biochem. 2000, v.277(2), p. 177-186

34. Talbo G.H., Suckau D„ Malkoski M„ Reynolds E.C. MALDI-PSD-MS analysis of the phosphorylation sites of caseinomacropeptide. // Peptides 2001, v.22 (7), p.l093-1098

35. Hanisch F.G., Jovanovic M., Peter-Katalinic J. Glycoprotein identification and localization of O-glycosylation sites by mass spectrometric analysis of deglycosylated/alkylaminylated peptide fragments. // Anal Biochem.2001, v.290 (1), p.47- 59

36. Wells L., Vosseller K„ Cole R.N., Cronshaw J.M., Matunis M.J., Hart G. W. Mapping sites of O-GlcNAc modification using affinity tags for serine and threonine post-translational modifications. // Mol Cell Proteomics. 2002, v.l (10), p.791-804

37. Mirgorodskaya E., Hassan H., Clausen H, Roepstorff P. Mass spectrometric determination of O-glycosylation sites using beta-elimination and partial acid hydrolysis. // Anal Chem. 2001, v.73 (6), p. 1263-1269

38. Kuster В., Krogh T.N., Mortz £., Harvey D.J. Glycosylation analysis of gel-separated proteins. // Proteomics 2001, v.l, p.350-361

39. Liang X., Lu Y., Neubert T.A., Resh M.D. Mass spectrometric analysis of GAP-43/neuromodulin reveals the presence of a variety of fatty acylated species. // J Biol Chem. 2002, v.277 (36), p.33032-33040

40. Bizzozero O.A., Malkoski S.P., Mobarak C., Bixler H.A., Evans J.E. Mass-spectrometric analysis of myelin proteolipids reveals new features of this family of palmitoylated membrane proteins. // J Neurochem. 2002, v.81(3), p.636-645

41. Jagannadham M. V., Nagaraj R. Detection of peptides covalently modified with multiple fatty acids by MALDI-TOF mass spectrometry. // J Pept Res. 2005, v.66 (2), p.94-100 (2

42. Brown R.S., Gil/rich N.L. Ion detection limitations to mass resolution in matrix-assisted laser desorption time-of-flight mass spectrometry. // Rapid Commun Mass Spectrom. 1992, v.6 (11), p.690-696

43. Doroshenko V.M., Cotter R.J. Ideal velocity focusing in a reflectron time-of-flight mass spectrometer. //J Am Soc Mass Spectrom. 1999, v. 10(10), p.992-999

44. Guilhaus M. Principles and instrumentation in time-of-flight mass-spectrometry. Physical and instrumental concepts. // J.Mass.Spectrom. 1995, v.30, p. 1519-1532

45. Brown R.S., Lennon J.J. Mass resolution improvement by incorporation of pulsed ion extraction in a matrix-assisted laser desorption/ionization linear time-of-flight mass spectrometer. // Anal Chem. 1995, v.67(13), p.1998-2003

46. Gabelica V, Schulz E, Karas M. Internal energy build-up in matrix-assisted laser desorption/ionization. // J Mass Spectrom. 2004, v.39 (6), p.579-593

47. Kocher Т., Engstrom A., Zubarev R.A. Fragmentation of peptides in MALDI in-source decay mediated by hydrogen radicals. // Anal.Chem. 2005, v.7, p. 172-177

48. Chaurand P., Luetzenkirchen F„ Spengler B. Peptide and protein identification by matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) and MALDI-post-source decay time-of-flight mass spectrometry. // J Am Soc Mass Spectrom. 1999, v. 10 (2), p.91 -103

49. Spengler B. Post-source decay analysis in matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry of biomolecules. // J. Mass Spectrom. 1997, v.32 (10), p.1019-1036

50. Cordero M.M., Cornish T.J., Cotter R.J., Lys LA. Sequencing peptides without scanning the reflectron: post-source decay with a curved-field reflectron time-of-flight mass spectrometer. // Rapid Commun Mass Spectrom. 1995, v.9 (14), p.1356-1361

51. Tollin P., Wilson H.R. Particle structure. // The Plant Viruses: The Filamentous Plant Viruses (Ed. R.C.Milne), Plenum Press, New-York, 1988, v.4, p.51-83

52. Koenig R„ Tremaine J.H., Shepard J.F. In situ degradation of the protein chain of potato virus X at the N- and C-termini. // J. Gen. Virol. 1978, v.38, p.329-337

53. Goulden M.G., Kohm B.A., Santa Cruz S., Kavanagh T.A., Baulcombe D.C. A feature of the coat protein of potato virus X affects both induced virus resistance in potato and viral fitness. // Virology 1993, v.197, p.293-302

54. Rodionova N.P., Karpova O.V., Kozlovsky S.V., Zayakina O.V., Arkhipenko M.V., Atabekov J.G, Linear remodeling of helical virus by movement protein binding. // J. Mol. Biol. 2003, v.333, p.565-572

55. Kavanagh Т., Goulden M., Santa Cruz S., Chapman S., Barker L, Baulcombe D. Molecular analysis of a resistance-breaking strain of potato virus X. // Virology 1992, v. 189, p.609-617

56. Atabekov J.G., Rodionova N.P., Karpova O.V., Kozlovsky S.V., Poljakov V.Y. The movement protein-triggered in situ conversion of potato virus X virion RNA from a nontranslatable into a translatable form. // Virology 2000, v.271 (2), p.259-263

57. Atabekov J.G., Rodionova N.P., Karpova О. V., Kozlovsky S. V., Novikov V.K, Arkhipenko M.V. Translational activation of encapsidated potato virus X RNA by coat protein phosphorylation. // Virology 2001, v.286 (2), p.466-474 (2001)

58. Miki Т., Knight C.A. The protein subunit of potato virus X. // Virology 1968, v.36, p. 168173

59. Tozzini A.C., Ek В., Palva E.T., Hopp HE. Potato virus X coat protein: a glycoprotein. // Virology 1994, v.202, p.651-658

60. Козловский C.B., Карпова O.B., Архипенко M.B., Заякина О.В., Родионова Н.П., Атабеков ИГ. Влияние N-концевого фрагмента белка оболочки X вируса картофеля на структуру вирусных частиц. // Докл. АН 2003, т.391, с.117-119

61. Garoff Н, Hewson R., Opstelten D.J. Virus maturation by budding. // Mol. Biol. Rev. 1998, v.62, p.l 171-1190

62. Cox N.J., Bender C.A. The molecular epidemiology of influenza viruses. // Semin. Virol. 1995, v.6, p.359-370

63. Nobusawa E., Aoyama Т., Kato H„ Suzuki Y., Tateno Y., Nakajima K. Comparison of amino acid sequences and receptor binding properties among 13 serotypes of hemagglutinins of influenza A viruses. // Virilogy 1991, v. 182, p.475-485

64. Lamb R.A. Genes and proteins of the influenza viruses. // In: The Influenza viruses (R.M. Krug, Ed.), Plenum Press, New York/London, 1989, p. 1-87

65. Stegman Т., Helenius A. II In: Viral Fusion Mechanisms, ed. Bentz J. (CRC, Boca Raton, FL), 1993, p.89-111

66. Skehel J. Influenza hemagglutinin structure and antigenicity. // Experientia 1986, v.46, p.89

67. Zebedee S.L., Lamb R.A. Influenza A virus M2 protein: monoclonal antibody restriction of virus growth and detection of M2 in virions. // J. Virol. 1988, v.62, p.2762-2772

68. Ruigrok R.W., Barge A., Durrer P., Brunner J., Ma K., Whittaker G.R. Membrane interaction of influenza virus Ml protein. II Virology 2000, v.267, p.289-298 (2000)

69. Hernandez L.D., Hoffman L.R., Wolfsberg T.G., White J.M. Virus-cell and cell-cell fusion. // Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 1996, v. 12, p.627-661

70. Chernomordik L.V., Kozlov MM. Protein-lipid interplay in fusion and fission of biological membranes. // Annu.Rev.Biochem. 2003, v.72, p. 175-207

71. White J., Kielian M., Helenius A. Membrane fusion proteins of enveloped animal viruses. II Q. Rev. Biophys. 1983, v.16, p.151-195

72. Eckert D.M., Kim P.S. Mechanisms of viral membrane fusion and its inhibition. II Annu. Rev. Biochem. 2001, v.70, p.777-810

73. White J.M., Wilson I.A. Anti-peptide antibodies detect steps in a protein conformational change: low-pH activation of the influenza virus hemagglutinin. // J. Cell Biol. 1987, v. 105, p.2887-2896

74. Tsurudome M., Gluck R., Graf R., Falchetto R„ Schaller U., Brunner J. Lipid interactions of the hemagglutinin HA2 NH2-terminal segment during influenza virus-induced membrane fusion. // J. Biol. Chem. 1992, v.267, p.20225-20232

75. Weber Т., Paesold G., Galli C., Mischler R., Semenza G., Brunner J. Evidence for H(+)-induced insertion of influenza hemagglutinin HA2 N-terminal segment into viral membrane. //J. Biol. Chem. 1994, v.269, p.18353-18358

76. Skehel J.J., Wiley D.C. Receptor binding and membrane fusion in virus entry: the influenza hemagglutinin. // Annu. Rev. Biochem.2000, v.69, p.531-569

77. Wilson I.A., Skehel J.J., Wiley D.C. Structure of the haemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus at 3 A resolution. // Nature 1981, v.289, p.366-373

78. Bullough P.A., Hughson F.M., Skehel J.J., Wiley D.C. Structure of influenza haemagglutinin at the pH of membrane fusion. // Nature 1994, v.371, p.37-43

79. Chen J., Skehel J.J., Wiley D.C. N- and C-terminal residues combine in the fusion-pH influenza hemagglutinin HA(2) subunit to form an N cap that terminates the triple-stranded coiled coil. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, v.96, p.8967-8972

80. Brand C.M., Skehel J.J. Crystalline antigen from the influenza virus envelope. // Nat. New Biol. 1972, v.238, p.145-147

81. Tamm L.K., Han X. Viral fusion peptides: a tool set to disrupt and connect biological membranes. // Biosci. Rep. 2000, v.20, p.501-518

82. Han X, Bushweller J.H., Cafiso D.S., Tamm L.K. Membrane structure and fusion-triggering conformational change of the fusion domain from influenza hemagglutinin. // Nat. Struct. Biol. 2001, v,8, p.715-720

83. Cross K.J., Wharton S.A., Skehel J.J., Wiley D.C., Steinhauer D.A. Studies on influenza haemagglutinin fusion peptide mutants generated by reverse genetics. // EMBO J. 2001, v.20, p.4432-4442

84. Armstrong R.T., Kushnir A.S., White J.M. The transmembrane domain of influenza hemagglutinin exhibits a stringent length requirement to support the hemifiision to fusion transition. // J. Cell Biol. 2000, v.151, p.425-437

85. Melikyan G.B., Jin H., Lamb R.A., Cohen F.S. The role of the cytoplasmic tail region of influenza virus hemagglutinin in formation and growth of fusion pores. // Virology 1997, v.235, p. 118-128

86. Ohuchi M., Fischer C., Ohuchi R„ Herwig A., Klenk H.-D. Elongation of the cytoplasmic tail interferes with the fusion activity of influenza virus hemagglutinin. // J. Virol. 1998, v.72, p.3554-3559

87. Tatulian S.A., Tamm L.K. Secondary structure, orientation, oligomerization, and lipid interactions of the transmembrane domain of influenza hemagglutinin. // Biochemistry 2000, v.39, p.496-507

88. Zurcher Т., Luo G., Palese P. Mutations at palmitoylation sites of the influenza virus hemagglutinin affect virus formation. // J. Virol. 1994, v.68, p.5748-5754

89. Jin H., Subbarao K., Bagai S„ Leser G.P., Murphy B.R., Lamb R.A. Palmitoylation of the influenza virus hemagglutinin (H3) is not essential for virus assembly or infectivity. // J. Virol. 1996, v.70, p.1406-1414

90. Ujike M„ Nakajima К., Nobusawa E. Influence of additional actlation site(s) on influenza В virus hemagglutinin on syncytium formation. // Microbiol. Immunol. 2005, v.49 (4), p.355-359

91. Schroth-Diez В., Ludwig K„ Baljinnyam В., Kozerski C., Huang Q„ Herrmann A. The role of the transmembrane and of the intraviral domain of glycoproteins in membrane fusion of enveloped viruses. // Biosci. Rep. 2000, v.20, p.571-595

92. Fischer C., Schroth-Diez В., Herrmann A., Garten W., Klenk H.-D. Acylation of the influenza hemagglutinin modulates fusion activity. // Virology 1998, v.248, p.284-294

93. Nairn H.Y., Amarneh В., Kristakis N.T., Roth M.G. Effects of altering palmitoilation sites on biosynthesis and function of the influenza virus hemagglutinin. // J. Virol. 1992, v.66, p.7585-7588

94. Veit M., Reverey H., Schmidt M. Cytoplasmic tail length influences fatty acid selection for acylation of viral glycoproteins. // Biochem. J. 1996, v.318, p. 163-172

95. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. // Nature 1970, v.227, p.680-685

96. Thiede В., Wittmann-Liebold В., Bienert М., Krause Е. MALDI-MS for C-terminal sequence determination of peptides and proteins degraded by carboxypeptidase Y and P. // FEBS Lett. 1995, v.357, p.65-69

97. Zhirnov O.P., Ovcharenko A.V., Bukrinskaya A.G. Myxovirus replication in chicken embryos can be suppressed by aprotinin due to the blockage of viral glycoprotein cleavage. // J Gen Virol. 1985, v.66 (7), p.1633-1638

98. Peterson G.L. A simplification of the protein assay method of Lowry et al. which is more generally applicable. // Anal Biochem 1977, v.83, p.346-356

99. Lebaron F.N., Folch J. The effect of pH and salt concentration on aqueous extraction of brain proteins and lipoproteins. // J Neurochem. 1959, v.4 (1), p.1-8

100. Cho Y.-P., Chrispeels M.J. Synthesis and secretion of hydroxyproline-containing proteins in carrots. 9. Serine-Ogalactosyl linkages in glycopeptides from carrot cell-walls. // Phytochemistry 1976, v. 15, p. 165-169

101. Fernandez-Fernandez M., Camafeita E. Bonay P., Mendez E., Albar J.-P., Garcia J.A. The capsid protein of a plant single-stranded RNA virus is modified by O-linked N-acetylglucosamine. // JBC 2002, v.277 (1), p.135-140

102. Liu F., Iqbal K„ Grundke-Iqbal /., Hart G.W., Gong C.X. O-GlcNAcylation regulates phosphorylation of tau: a mechanism involved in Alzheimer's disease. // Proc Natl Acad Sci U S A 2004, v. 101 (29), p. 10804-10809

103. Dopheide T.A., Ward C.W The location of the bromelain cleavage site in a Hong Kong influenza virus Haemagglutinin. // J Gen Virol. 1981, v.52 (2), p.367-370

104. Торчинский Ю.М. Сера в белках. // Москва, Наука, 1977, с. 17-19

105. Philipp Н.С., Schroth В., Veil М, Krumbiegel M, Herrmann A., Schmidt M.F. Assessment of fusogenic properties of influenza virus hemagglutinin deacylated by site-directed mutagenesis and hydroxylamine treatment. // Virology 1995, v.210 (1), p.20-28

106. Bizzozero O.A., Fridal K„ Pastuszyn A. Identification of the palmitoylation site in rat myelin P0 glycoprotein. // J Neurochem. 1994, v.62 (3), p. 1163-71

107. Bijlmakers M.J., Marsh M. The on-off story of protein palmitoylation. // Trends of Cell Biol. 2003, v.13(1), p.32-42

108. Метионин c5h9n101s1 131.19861. Пролин c5h7n101 97.11671. Серии c3h5n102 87.07821. Тирозин c9h9n102 163.17601. Треонин c4h7n102 101.1051

109. Триптофан c11h10n201 186.2132

110. Фенил ал анин c9h9n101 147.1766

111. Цистеин (sh) c3h5n101s1 103.1448

112. Расчет моноизотопной массы однозарядного иона пептида (протонированная форма):1. МН.+=1а.о. + Н20 + Н+

113. Расчет естественного изотопного распределения:

114. Вероятность того, что среди п атомов углерода окажется ровно m атомов |3С, определяется уравнением Бернулли:

115. Pm''c=Cnm.pra.(l-pfm,XPm'>c=lгде C„m =п!/(п-т)!т! сочетание возможных расположений ш атомов ,3С в наборе из п атомов углерода, р=0.011 - частота встречаемости ,3С в природе. Для остальных элементов можно провести аналогичные расчеты.

116. Основной вклад в естественное изотопное распределение пептидов вносит включение в состав 13С и 34S, поэтому интенсивность сигнала k-ого пика на масс-спектре будет определяться суперпозицией указанных распределений:

117. Р|<= 2 (Pml3c* PlMs)> суммирование ведется по всем m и 1: m +21= к

118. С-концевые области геммаглютининов вируса гриппа типа А разных подтипов:1. Н1

119. KLEENTTYKILSIYSTVAASLCLAILIAGGLILGMQNGSCRCMFCI A/Turkey/Ontario/6118/68 H9

120. VKLSSGYKDIILWFSFGESCFVLLAWMGLVFFCLKNGNMRCTICI A/Mink/Sweden/84 Hll

121. KLDSSGNVYKILSIYSCIASSLVLAALIMGFMFWACSNGSCRCTICI A/Duck/England/1/56 RLDSSGNVYKILSIYSCIASSLVLAALIMGFILWACSNGSCRCTICI A/mallard/Netherlands/7/99 H12

122. KLEENSTYKILSIYSSVASSLVLLLMIIGGFIFGCQNGNVRCTFCI A/Duck/Alberta/60/76 H13

123. KLKSEDNVYKVLSIYSCIASSIVLVGLILAFIMWACSNGNCRFNVCI A/black-headed gull/Sweden/5/99 H14

124. VTLTMGYKDIILWISFSMSCFVFVALILGFVLWACQNGNIRCQICI A/Mallard/Astrakhan/263/82 H15

125. VKLSGGYKDVILWFSFGASCVMLLAIAMGLIFMCVKNGNLRCTICI A/duck/Australia/341/83 VKLSSGYKDVILWFSFGASCVMLLAIAMGLIFMCVKNGNLRCTICI A/shearwater/West Australia/2576