Картирование непрерывных В-эпитопов искусственного белка альбебетина и его биологически активных вариантов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.36, кандидат медицинских наук Бочарова, Ольга Владимировна

• Бочарова, Ольга Владимировна
• кандидат медицинских наук
• 2002

Оглавление диссертации кандидат медицинских наук Бочарова, Ольга Владимировна

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Белки de novo: история вопроса

2.1.1. Получение искусственных белков с заданными функциями

2.1.2. Альбебетин - первый искусственный белок с уникальной топологией, не имеющий аналогов в природе

2.1.3. Активные конструкции, созданные на основе альбебетина.

2.2. Происхождение и структура эпитопов.

2.2.1. Иммунитет

2.2.2. Структура и функции иммуноглобулинов.

2.2.3. Структура эпитопов

2.2.4. Свойства В-эпитопов

2.3. Методы картирования В-эпитопов

2.3.1. Определение В-эпитопов белка на основании данных о пространственной структуре его комплекса с антителом.

2.3.2. Применение точечных мутантов

2.3.3. Использование прокариотических и фаговых библиотек.

2.3.4. Использование пептидных фрагментов изучаемого белка.

2.4. Использование антител в исследованиях белков

2.4.1. Антитела - инструмент для определения белков в биологических образцах

2.4.2. Применение антител для локализации функционально важных участков белковых молекул

2.4.3. Применение антител для изучения конформации и динамики белковых молекул

2.5. Изучение иммунногенности искусственных белков

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1. Материалы.

3.1.1. Реагенты

3.1.2. Оборудование и расходные материалы

3.1.3 Программное обеспечение

3.1.4 Штаммы Escherichia coli.

3.1.5 Плазмиды.

3.1.6 Среды для выращивания микроорганизмов

3.2. Методы.

3.2.1 Трансформация плазмидной ДНК клеток E.coli

3.2.2 Экспрессия и выделение белков

3.2.3 Электрофорез белков в ПААГ в присутствии ДСН

3.2.4 Иммунизация животных. Получение препаратов антител.

3.2.5 Определение титра антител с использованием сорбционного иммуноферментного анализа (ELISA)

3.2.6 Множественный параллельный синтез ковалентно связаных с полиэтиленовыми иглами (пинами) гексапептидов

3.2.7 Иммуноферментный сорбционный анализ (ELISA) пептидов на иглах.

3.2.8 Отмывка игл с пептидами после каждого ИФА.

3.2.9 Статистическая обработка результатов ИФА

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. Непрерывные антигенные детерминанты ABB и конструкций на его основе, выявляемые при иммунизации кур.

4.1.1. Чувствительность препаратов IgY из желтка куриных яиц и титры сывороток против ABB, ABBI и TRX-ABBI-Ins.

4.1.2. Антигенные гексапептиды ABB, ABBI и слитного белка TRX-ABBI-Ins.

4.1.3. Конкурентное ингибирование ABBI и рекомбинантным ИФН-а связывания антител против ABBI с гексапептидами.

4.2. Непрерывные антигенные детерминанты ABB и конструкцийна его основе, выявляемые при иммунизации мышей линии BALB/c.

4.2.1. Динамика иммунного ответа при иммунизации мышей ABB, ABBI,ABBI-Ins и ABB-Ins.

4.2.2 Титры IgG сывороток иммунных мышей против ABB,

ABBI,ABBI-Ins и ABB-Ins.

4.2.3 Антигенные гексапептиды ABB, ABBI, ABBI-Ins и ABB-Ins, выявляемые мышиными сыворотками и динамика специфичности иммунного ответа на ABBI-Ins.

4.2.4. Конкурентное ингибирование ABB, ABBI, ABBI-Ins и рекомбинантным ИФН-а связывания антител против ABBI и ABBI-Ins с гексапептидами.

4.3. Сравнение антигенных карт искусственных белков, полученных при использовании антител животных двух видов.

4.4. Соотношение антигенной карты и пространственной структуры молекулы

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Картирование непрерывных В-эпитопов искусственного белка альбебетина и его биологически активных вариантов»

Актуальности» проблемы. Распознавание белковых молекул лежит в основе практически всех биологических процессов. Имитирование их сайтов связывания делает возможным создание новых молекул для использования в биотехнологии, терапии и диагностике. В этом случае белковые конструкции de novo (искусственные белки, сконструированные под заранее заданную третичную структуру и уникальную топологию, не встречающуюся в природных белках) могут являться неким каркасом, в который можно ввести сайт распознавания природного белка, тем самым открывая подход к созданию новых миметиков и антагонистов природных молекул.

Пептидные препараты, исследуемые in vitro, порой невозможно успешно применять в клинической практике, так как пептиды обычно быстро инактивируются в организме благодаря нескольким механизмам, включая гломерулярную фильтрацию в почках, рецепторно-опосредованный эндоцитоз, протеолиз сывороточными протеазами [2, 3]. Главным механизмом из перечисленных является последний. Учитывая также, что белковые фармакологические препараты разрушаются при введении per os, и поэтому вводятся внутримышечно, подкожно или внутривенно, поддержание терапевтически активной концентрации в кровотоке является важным фактором при клиническом использовании этих препаратов.

Одним из путей преодоления этого препятствия является увеличение молекулярного веса путем ковалентного свазывания с биологически инертной матрицей [4] . Представляется вполне вероятным, что присоединение активного пептида к белковой молекуле жителя приведет к возникновению иммунного ответа как против носителя, так и против самого пептида. В этом случае новые конструкции, предназначенные для длительного курса лечения, будут инактивироваться и элиминироваться иммунной системой.

Любой новый белковый препарат после экспериментов in vitro, подтверждающих требуемую биологическую активность в отсутствии нежелательных побочных активностей и токсичности, должен рассматриваться в качестве потенциального антигена. Поэтому белковый препарат, который планируется применять парэнтерально в течение длительного курса лечения, должен обладать низкой иммуногенностью, т.к. возникновение иммунного ответа приведет к возникновению тяжелых побочных эффектов у пациента и будет препятствовать проявлению активности препарата. Он не должен иметь перекрестной реакции с собственными белками организма, чтобы не вызывать у пациента аутоиммунные реакции.

Гипотезы, касающиеся иммуногенности искусственных белков могут быть проверены только экспериментально, так как теоретический анализ возможной антигенности, основанный на поиске Т- и В-эпитопов, встречающихся в последовательностях природных белков, все еще недостадочно точен и в данном случае малоэффективен, поскольку последовательности искусственных белков отличаются от природных по определению.

Цель исследования: Целью настоящей работы является изучение иммуногенности искусственного белка альбебетина и его трех биологически активных вариантов, а также изучение специфичности и межвидовой вариабельности гуморального иммунного ответа на эти белки.

Задачи исследования:

1. Получить и охарактеризовать мышиные сыворотки и препараты иммуноглобулинов из желтка куриных яиц против альбебетина и его трех биологически активных вариантов, имеющих в своем составе пептидные фрагменты интерферона-а2 и инсулина человека.

2. С применением пиновой технологии синтезировать гексапептиды, перекрывающие последовательность белка с фрагментами интерферона-а2 и инсулина.

3. Определить линейные антигенные детерминанты белковых конструкций методом сорбционного ИФА гексапептидов последовательности белка с фрагментами интерферона-а2 и инсулина, используя полученные антисыворотки и препараты иммуноглобулинов.

4. Сравнить внутри- и межвидовые антигенные карты, определить иммунодоминантные участки.

5. Определить, как влияет на иммуногенность исследуемых белков присоединение к альбебетину биологически активных фрагментов.

6. Сопоставить расположение антигенных детерминант с известными структурными элементами исследуемых белков.

Научная новизна и практическая значимость работы.

1. Впервые проведено детальное исследование иммуногенности искусственного белка альбебетина и его производных, несущих биологически активные фрагменты интерферона-а2 и инсулина человека. Получены данные об иммунодоминантных В-эпитопах четырех (альбебетин, альбеферон, альбебетин-инсулин, альбеферон-инсулин) молекул.

2. Впервые показано влияние присоединенных фрагментов интерферона-а2 и инсулина человека на иммуногенность искусственных белков.

3. Впервые проведено сопоставление данных антигенного картирования искусственных белков с их трехмерной структурой. Данные антигенного картирования косвенно свидетельствуют о значительном сходстве пространственной структуры четырех исследуемых белков.

4. Впервые показано, что специфичность иммунного ответа на исследуемые искусственные белки практически не зависит от видовых особенностей иммунной системы.

Полученные данные об иммуногенности и иммунодоминантных В-эпитопах искусственных белков целесообразно учитывать в дальнейшем при создании новых искусственных белковых конструкций.

Заключение диссертации по теме «Аллергология и иммулология», Бочарова, Ольга Владимировна

выводы

1. Впервые установлено, что присоединение к молекуле альбебетина фрагмента ИФН-а2 увеличивает иммуногенность итоговых химерных конструкций, тогда как присоединение фрагмента инсулина не влияет на их иммуногенность.

2. Впервые показана минимальная зависимость антигенных карт четырех искусственных белков (альбебетин, альбеферон, альбебетин-инсулин, альбеферон-инсулин) от видовых особенностей иммунной системы.

3. Выявлены три общих непрерывных В-эпитопа и по одному, индивидуальному для каждого вида животных. Иммунодоминантным В-эпитопом является С-конец фрагмента ИФН-а2 и прилегающий к нему участок альбебетина.

4. Антигенные участки всех исследуемых белков расположены на границах элементов вторичной структуры и на предполагаемой поверхности молекул.

5. Антигенные карты всех четырех исследуемых белков совпадают практически полностью, что косвенно свидетельствует о значительном сходстве пространственной структуры этих белков.

БЛАГОДАРНОСТИ

Выражаю глубокую признательность и благодарность моим научным руководителям Долгих Дмитрию Александровичу и Колесановой Екатерине Федоровне за обеспечение возможности выполнения диссертационной работы и доброжелательное отношение на протяжении всего времени работы. Приношу свою глубокую благодарность заведующему лабораторией спектральных методов анализа ИБХ РАН Арсеньеву Александру Сергеевичу и сотрудникам его лаборатории за дружескую атмосферу взаимопомощи, безусловно помогающей выполнению работы.

Особую благодарность выражаю Чертковой Рите Валерьевне за помощь в освоении методов экспрессии и очистки искусственных белков; Мошковскому Сергею Александровичу (НИИ биомедицинской химии РАМН) за совместно произведенный синтез пептидов последовательности альбебетин-инсулина, помощь в освоении метода пептидного сканирования и содействие в работе с литературой; Моисееву Екатерину Викторовну за предоставление мышей линии ВАЪВ/с11С:^Мо1зе; Котельникову Ольгу Викторовну за помощь в работе с животными; Бочарову Эдуарду Валерьевичу за помощь в оформлении работы. Отдельную благодарность хочу выразить моим родителям за разделение со мной обязанностей по воспитанию ребенка в период работы над диссертацией.

Работа финансировалась Российским фондом фундаментальных исследований, грант № 00-04-48355, и частично Международным научно-техническим центром, грант № 403-98.

Список литературы диссертационного исследования кандидат медицинских наук Бочарова, Ольга Владимировна, 2002 год

1. Jones J.H. A short guide to abbreviations and their use in peptide science // J. Peptide Sci. 1999 V.5, P. 465-471

2. O'Kelly P., Thomsen L., Tilles J.G., Cesario T. Inactivation of interferon by serum and synovial fluids. // Proc Soc Exp Biol Med. 1985 V. 178(3), P. 407-411

3. Fersht А. // Enzyme Structure and Mechanism, 2nd ed. New York: Freeman; 1985

4. Gregory D.S., Martin A.C.R., Cheetham J.C., Rees A.R. The prediction and characterisation of metal binding sites in proteins. // Protein En. 1993 V. 6, P. 29-35

5. Chung H-H., Benson D.R., Schuitz P.G. Probing the role of lysine-16 in Ras p21 protein with un-natural amino acids. // J Am Chem Soc 1993 V. 115, P. 6414-6415

6. Sander C. // Trends in Biotechnology. 1994. V. 12, P. 163167

7. DeGrado W.F., Lear J.D. // J. Am. Chem. Soc. 1985. V. 107, P. 7684-7689

8. Altman K.-H., Floersheimer A., Mutter M. // Int. J. Pept. Protein Res. 1986 V. 27, P. 314-319

9. Taylor J.W., Kaiser E.T. // Pharmacol. Rev. 1986. V. 38, P.291-298

10. Kaiser E.T., Kezdy F.J. // Ann. Rev. Biophysics and Biophys.Chem. 1987. V. 16, P. 561-581

11. DeGrado W.F. // Adv. Prot. Chem. 1988. V. 39, P. 51-124.

12. Frances H.Arnold. Protein design for non-aqueous solvents, // Protein Engineering, 1988 V. 2, № 1, P. 21-25

13. Hodges R.S., Saund A.K., Chong P.C.S., St.Pierre S.A., Reid R.R. // J. Biol. Chem. 1981 V. 256, P. 1214-1224

14. Lau S.Y., Taneja A.K., Hodges R.S. // J. Biol. Chem. 1984 V. 259, P. 13253-13261

15. Gutte B., Daumigen M., Wittschieber R. // Nature 1979 V. 281, P. 650-655

16. Kaumaya P.T.P., Berndt K.D., Heidorn D.B., Trewhella J., Kezdy F.J., Goldberg E. // Biochemistry. 1990 V. 29, P. 13-23

17. Ho S.P., DeGrado,W.F. // J. Am. Chem. Soc. 1987 V. 109, P. 6751-6758

18. Lynne Regan. Protein design: novel metal-binding sites. // Trends Biochem. Sei., 1995, V. 20, P. 280-285

19. Farid R.S., Moser C.C., Dutton P.L. // Curr. Opin. Struct. Biol. 1993 V. 3, P. 225

20. Choma C.T. // J. Am. Chem. Soc. 1994 V. 116, P. 856

21. Robertson D.E., Farid R.S., Moser C.C., Urbauer J.L., Mulholland S.E., Pidikiti R., Lear J.D., Wand A.J., DeGrado W.F., Dutton P.L. Design and synthesis of multi-haem proteins. // Nature 1994 V. 31; 368 (6470), P. 425-432

22. Montal M. Molecular anatomy and molecular design of channel proteins. // FASEB J 1990 V. 4(9), P. 2623-2635

23. Ghadiri M.R., Granja J.R., Buehler L.K. Artificial transmembrane ion channels from self-assembling peptide nanotubes. // Nature 1994 V. 26;369(6478), P. 301-304

24. Kienker P.K., DeGrado W.F., Lear J.D. A helical-dipole model describes the single-channel current rectification of an uncharged peptide ion channel. II Proc Natl Acad Sci USA 1994 V. 24;91(11), P. 4859-4863

25. Johnsson K., Alleman R.K., Widmer H., Benner S.A., Synthesis, structure and activity of artificial, rationally designed catalytic polypeptides. // Nature 1993 V. 7;365(644 6), P. 530-532

26. Choo Y., Sanchez-Garsia I., Klug A. In vivo repression by a site-specific DNA-binding protein designed against an oncogenic sequence. // Nature 1994 V. 15(372), P.642-645

27. Птицын О.В., Финкелылтейн А.В. Проблема предсказания структуры белка. // "Итоги науки и техники", сер. "Мол. Биология" (ред.: Волькенштейн М.Д.). М.: ВИНИТИ, 1979, Т.15, С.6-41

28. Ptitsyn O.B., Finkelstein A.V. Why do globular proteins fit a limited set of folding patterns? // Prog. Biophys. Mol. Biol., 1987: 171-190

29. Chothia C., Finkelstein A.V. The classification and origins of protein folding patterns. // Ann. Rev. Biochem., 1990, V.59, P. 1007-1039

30. Finkelstein A.V., Badretdinov A.Ya., Gutin A.M. Why do protein architectures have a Boltzmann-like statistics? // Proteins, 1995 V.23, P. 142-150

31. Fedorov A.N., Dolgikh D.A., Chemeris V.V., Chernov B.K., Finkelstein A.V., Schulga A.A., Alakhov Yu.B., Kirpichnikov M.P., Ptitsyn O.B. // J. Mol. Biol. 1992 V. 225, P. 927-931

32. Barnes E., Webster G., Jacobs R., Dusheiko G. Long-term efficacy of treatment of chronic hepatitis C with alpha interferon or alpha interferon and ribavirin. // J Hepatol. 1999 V.31 Suppl 1, P. 244-249

33. Krown S.E. Interferon and other biologic agents for the treatment of Kaposi's sarcoma. // Hematol Oncol Clin North Am. 1991 V. 5 (2), P. 311-322

34. Zinzani P.L., Lauria F., Salvucci M., Rondelli D., Raspadori D., Bendandi M., Magagnoli M., Tura S. Hairy-cell leukemia and alpha-interferon treatment: long-term responders. // Haematologica. 1997 V. 82 (2), P. 152-155

35. Horisberger M.A., Di Marco S. Interferon-alpha hybrids. // Pharmacol Ther. 1995 V. 66 (3), P. 507-534

36. Aphasizheva I.Y., Dolgikh D.A., Abdullaev Z.K., Uversky V.N., Kirpichnikov M.P., Ptitsyn O.B. Can grafting of an octapeptide improve the structure of a de novo protein? // FEBS Lett. 1998 V. 20;425(1), P. 101-104

37. Kaarsholm N.C., Ludvigsen S. The high resolution solution structure of the insulin monomer determined by NMR. // Receptor 1995 V. 5, P. 1-8

38. Kurtzhals P., Schaffer L., Sorensen A., Kristensen C., Jonassen I., Schmid C., Trub T. Correlations of receptor binding and metabolic and mitogenic potencies of insulin analogs designed for clinical use. // Diabetes. 2000 V. 49(6), P. 999-1005

39. Drejer K. The bioactivity of insulin analogues from in vitro receptor binding to in vivo glucose uptake. // Diabetes 1992 Metab Rev 8, P. 259-285

40. Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология // М: Мир, 2000-С. 582

41. Warr G.W., Magor K.E., Higgins D.A. IgY: clues to the origin of modern antibodies 11 Immunology Today 1995 V.16, N8, P. 392-398

42. Poison A., von Wechmar M.B., Van Regenmortel M.H.V. Isolation of viral IgY antibodies from yolks of immunized hens // Immunological Communications 1980 V.9, P. 475-493

43. Jensenius J.C., Andersen I., Hau J., Crone M., Koch C. Eggs: conveniently packaged antibodies. Methods for purification of yolk IgG. // J Immunol Methods 1981 V. 46(1), P. 63-68

44. Албертс Б., Брей Д., Льюис Дж. , Рэфф М., Роберте К., Уотсон Дж. Молекулярная биология летки // М.: Мир, 1994. Т.З, С. 215-282

45. Макс Э.А. Иммуноглобулины: молекулярная генетика // Иммунология / Пол У. (ред.) М.: Мир, 1987 Т. 1, С. 255-306

46. Rao K.V.S. Selection in T-dependent primary humoral response: new insights from polypeptide models // APMIS 1999 V. 107, P. 807-818

47. Agarwal A., Sarkar S., Nazabal C., Balasundaram G., Rao K.V. В cell responses to a peptide epitope. I. The cellular basis for restricted recognition. // J. Immunol. 1996 V. 157(7), P. 2779-2788

48. Agarwal A., Rao K.V. B cell responses to a peptide epitope: III. Differential T helper cell thresholds in recruitment of B cell fine specificities // J. Immunol. 1997 V. 159(3), P. 1077-1085

49. Ozaki S., Berzofsky J.A. Antibody conjugates mimic specific B cell presentation of antigen: relationship between T and B cell specificity // J. Immunol. 1987 V. 138, P. 41334142

50. Harding C.V., Song R., Griffin J., France J., Wick M.J., Pfeifer J.D., Geuze H.J. Processing of bacterial antigens for presentation to class I and II MHC-restricted T lymphocytes // Infect. Agents Dis. 1995 V. 4(1), P. 1-12

51. Rammensee H.-G., Bachmann J., Emmerich N.P.N., Bachor 0. A., Stevanovic S. SYFPEITHI: database for MHC ligands and peptide motifs // Immunogenetics, 1999 V. 50, P. 213-219

52. Stern S. Predicting antigenic sites on proteins // Trends Biochem. Sci. 1991 V. 9, F. 163-169

53. Otte L., Ivascu C., Kramer A., Schuwirth B., Dong L., Keitel T., Hoehne W., Schneider-Mergener J. Investigation of monoclonal antibody polyspecifisity with synthetic peptide libraries, phage display and crystallographic analysis //

54. Proceedings of 26th European Peptide Symposium / J. Peptide Sci. 2000, Suppl. to V.6, P. 178

55. Geysen H.M., Rodda S.J., Mason T.J. The delineation of peptides able to mimic assembled epitopes // Ciba Found Symp. 1986 V. 119, P. 130-149

56. Машковский M.Д. Лекарства XX века // M.: Новая Волна, 1998 С. 155-157

57. Sela M. Antigenicity: some molecular aspects // Science. 1969 V. 166(911), P. 1365-1374

58. Atassi M.Z., Smith J.A. A proposal for the nomenclature of antigenic sites in peptide and proteins // Immunochemistry. 1978 V. 15(8), P. 609-610

59. Slootstra J.W., Schaaper W.M.M., Pujik W.C., Meloen R.H. New PEPSCAN method to detect discontinuous epitopes of Foot-and-Mouse Disease Virus // Proceedings of 26th European Peptide Symposium / J. Peptide Sci. 2000 Suppl. to V. 6, P. 209

60. Pellequer J.L., Westhof E., Van Regenmortel M.H.V. Predicting location of continuous epitopes in protein from their primary structure // Methods in enzymology. 1991 V. 203, P. 176-201

61. Geysen H.M., Rodda S.J., Mason T.J., Tribbick G., Schoofs P.G. Strategies for epitope analysis using peptide synthesis // J. Immunol.Meth. 1987 V. 102, P. 259-274

62. Laver W.G., Air G.M., Webster R.G., Smith-Gill S.J. Epitopes on protein antigens: misconceptions and realities // Cell 1990 V. 61(4), P. 553-556

63. Jemmerson R. Antigenicity and native structure of globular proteins: low frequency of peptide reactive antibodies // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987 V. 84(24), P. 9180-9184

64. Spangler B.D. Binding to native proteins by antipeptide monoclonal antibodies // J. Immunol. 1991 V. 146(5), P. 15911595

65. Edwards R.J., Murray B.P., Singleton A.M., Boobis A.R. Orientation of cytochromes P450 in the endoplasmic reticulum // Biochemistry. 1991, V. 30, P. 71-76

66. Strobel H.W., Shen S. Studies of the interaction of microsomal cytochrome P450 reductase with cytochromes P450 // Cytochrome P450. 8th International Conference / Lechner M.C. (ed.) Paris: John Libbey Eurotext, 1994, P. 341-348

67. Fineschi В., Miller J. Endosomal proteases and antigen processing // TIBS. 1997, V. 22, P. 377-382

68. Novotny J., Bruccoleri R.E., Saul F.A. On the attribution of binding energy in antigen-antibody complex McPC 603, D1.3 and Ну HEL-5 // Biochemistry. 1989 V. 28, P. 4735-4742

69. Geysen H.M., Mason T.J., Rodda S.J. Cognitive features of continuous antigenic determinants // J. Mol. Recognit. 1988 V. 1(1), P. 32-41

70. Козин С. А. Линейные антигенные детерминанты цитохромов Р450 101 и Р450 2В1 // Диссертационная работа на соискание ученой степени кандидата биологических наук. М. : НИИБМХ РАМН, 1995

71. Lee В., Richards F.M. The interpretation of protein structures: estimation of static accessibility // J. Mol. Biol. 1971, V. 55, P. 379-400

72. Nayak B.P., Tuteja R., Manivel V., Roy R.P., Vishwakarma R.A., Rao K.V. В cell responses to a peptide epitope. V. Kinetic regulation of repertoire discrimination and antibody optimization for epitope // J. Immunol. 1998 V. 161(7), P. 3510-3519

73. Walter G. Production and use of antibodies against synthetic peptides // J. Immun. Meth. 1986 V. 88, P. 149-161

74. Pellequer J.L., Westhof E., Van Regenmortel M.H.V. Epitope prediction from the primary structure of protein // Peptide

75. Antigens. A Practical Approach / Wisdom G.B.(ed.) Oxford-New York-Tokio: Oxford University Press, 1994 P. 7-25

76. Kuntz I.D. Protein folding // J. Amer. Chem. Soc. 1972 V. 94, P. 4009-4018

77. Tan X., Ratnam M., Huang S., Smith P.L., Freisheim J.H. Mapping the antigenic epitopes of human dihydrofolate reductase by systematic synthesis of peptides on solid supports // J. Biol. Chem. 1990 V. 265, P. 8022-8026

78. Kolesanova E.F., Kiselar J.G., Jung C., Kozin S.A., Hui Bon Hoa G., Archakov A.I. Antigenic mapping of bacterial and animal cytochromes P450 // Biochimie (Paris). 1996, V. 78, P. 752-762

79. Kolesanova E.F., Kozin S.A., Rumyantsev A.B., Jung C., Hui Bon Hoa G., Archakov A.I. Epitope mapping of cytochrome P450cam (CYP 101) // Arch. Biochem. Biophys. 1997, V. 341, P. 229-237

80. Parmley S.F., Smith G.P. Filamentous fusion phage cloning vectors for the study of epitopes and design of vaccines // Adv. Exp. Med. Biol. 1989 V. 251, P. 215-218

81. Dower W.J., Cwirla S.E. Epitope mapping using libraries of random peptides displayed on phage // Peptide Antigens. A Practical Approach / Wisdom G.B.(ed.) Oxford New York -Tokio: Oxford University Press, 1994 P. 219-243

82. Van Regenmortel M.H.V. Protein structure and antigenicity // Int. J. Rad. Appl. Instrum. 1987 V. 14(4), P. 277-280

83. Kiselar J.G., Downard K.M. Direct identification of protein epitopes by mass spectrometry without immobilization of antibody and isolation of antibody-peptide complexes // Anal. Chem. 1999 V. 71(9), P. 1792-1801

84. Kiselar J.G., Downard K.M. Preservation and detection of specific antibody—peptide complexes by matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry // J. Am. Soc. Mass. Spectrom. 2000 V. 11(8), P. 746-750

85. Geysen H.M., Meloen R.H., Barteling S.G. Use of peptide synthesis to probe viral antigens for epitopes to a resolution of a single amino acid // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1984 V. 81, P. 3998

86. Geysen H.M., Meloen R.H., Barteling S.G. Use of peptide synthesis to probe viral antigens for epitopes to a resolution of a single amino acid // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1984 V. 81, P. 3998

87. Frank R. Spot-synthesis: an easy technique for the positionally addressable, parallel chemical synthesis on a membrane support // Tetrahedron. 1992 V. 48, N42, P. 92179232

88. Slootstra J.W., Puijk W.C., Ligtvoet G.J., Langeveld J.P., Meloen R.H. Structural aspects of antibody-antigen interaction revealed through small random peptide libraries // Mol. Divers. 1996 V. 1(2), P. 87-96

89. Фримель X., Хольцхайдт Г. (1987) Иммуноферментный анализ // Иммунологические методы / Фримель X. (ред.) М.: Медицина, 1987 С. 171-175

90. Scholz S., Behn I., Honeck H., Hauck С., Braunbeck Т., Segner H. Development of a monoclonal antibody for ELISA of CYPla in primary cultures of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) hepatocytes // Biomarkers. 1997 V.2, P. 287-294

91. Worthington J., Morgan K. Epitope mapping using synthetic peptides // Peptide Antigens. A Practical Approach / Wisdom G.B.(ed.) Oxford New York - Tokio: Oxford University Press, 1994 P. 181-217

92. Subramanian S., Adiga P.R. Identification and mapping of linear antigenic determinants of chicken riboflavin carrier protein // Bioch.Biophys.Acta. 1998 V. 1429, P. 74-82

93. Goldberg M.E. Investigating protein conformation, dynamics and folding with monoclonal antibodies // TIBS. 1991 V.16, P. 358-362

94. Collawn J.F., Wallace C.J., Proudfoot A.E., Paterson Y. Monoclonal antibodies as probes of conformational changes in protein-engineered cytochrome с // J. Biol. Chem. 1988 V. 263(18), P. 8625-8634

95. Киселарь Ж.Г. Линейные антигенные детерминанты цитохромов Р450 1А2, 2В4 и апоцитохрома Р450 2В4 // Диссертационная работа на соискание ученой степени кандидата биологических наук.- М.: НИИБМХ РАДОН, 1997

96. Afasizheva IIu, Dolgikh DA, Kirpichnikov MP. Immunogenic properties of albeferon biologically active artificial protein // Mol Biol (Mosk). 1999 T. 33(4), C. 679-683

97. Гловер Д. Ред., Клонирование ДНК. Методы.// М. «Мир» 1988

98. Laemmli U. // Nature. 1970. V. 227, Р. 680-685

99. Schagger, Н. and von Jagrw, G. 1987. Anal. Biochem. V. 166, P. 368-379

100. Festing M.F.W. compiled // International Index of Laboratory Animals, 6th ed. University of Leicester, UK. 1993 P. 98

101. Мошковскиий С.А. Диссертационная работа на соискание ученой степени кандидата биологических наук. М. : НИИБМХ РАМН, 1995

102. McLaren R.D., Prosser C.G., Grieve R.C., Borissenko M. The use of caprylic acid for the extraction of the immunoglobulin fraction from egg yolk of chickens immunised with ovine alpha-lactalbumin. // J Immunol Methods. 1994 V. 28;177 (1-2), P. 175-184

103. Есть листы с текстом плохого качества