Катализируемый пенициллинацилазой синтез β-лактамных антибиотиков в высококонцентрированных водных системах тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.15, кандидат химических наук Буханов, Александр Леонидович

• Буханов, Александр Леонидович
• кандидат химических наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат химических наук Буханов, Александр Леонидович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1 Пенициллинацилаза из Е.соН.

1.1.1 Общие свойства.

1.1.2 Структура активного центра пенициллинацилазы.

1.1.3 Механизм действия.

1.2 Ферментативный синтез р-лактампых антибиотиков.

1.2.1 Основные подходы.

1.2.1.1 Термодинамически контролируемый синтез р-лактамных антибиотиков.

1.2.1.2 Кинетически контролируемый синтез р-лактамных антибиотиков.

1.2.2 Кинетические закономерности катализируемого ПА переноса ацильной группы на нуклеофил

1.2.3 Ферментативный синтез Р-лактамных антибиотиков в гомогенных и гетерогенных (раствор/осадок реагентов) водных системах.

1.3 Факторы оптимизация синтеза р-лактамных антибиотиков.

1.3.1 Эволюция кинетической схемы ферментативного синтеза Р-лактамных антибиотиков.

1.3.2 Влияние ионной силы на ферментативный синтез р-лактамных антибиотиков.

1.3.3 рН-зависимость эффективности биокаталитических процессов, катализируемых ПА.

1.3.4 Влияние органических веществ на процессы биокаталитического получения р-лактамных антибиотиков.

ПОСТАНОВКА ЗАДАЧИ.

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2.1 Материалы.

2.2 Методы.

2.2.1 Определение констант специфичности (ккат /Км ) гидролиза антибиотиков и доноров ацильной части.

2.2.2 Количественная характеристика связывания нуклеофила в активном центре ПА.

2.2.3 Количественная характеристика связывания нуклеофила с фермент-субстратным комплексом

2.2.4 Анализ влияния добавленного нуклеофила на реакцию гидролиза ампициллина.

2.2.5 Изучение растворимости компонентов реакции.

2.2.6 Создание кинетически пересыщенных водных систем в реакциях ферментативного синтеза Р-лактамных антибиотиков.

2.2.7 Определение параметров нуклеофильности 6-АПК в реакции синтеза ампициллина.

2.2.8 Изучение нуклеофильности 6-АПК в реакции синтеза ампициллина в присутствии неорганических солей.

2.2.9 Изучение реакций ферментативного синтеза ампициллина, амоксициллина и цефалексина в высококонцентрированных водных системах с использованием эффекта кинетического пересыщения

2.2.10 Анализ состава реакционной смеси методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

2.2.11 Математическая обработка результатов и моделирование реакций.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1 Анализ факторов, определяющих эффективность катализируемого ПА синтеза р-лактамных антибиотиков.

3.2 Кинетический анализ катализируемого ПА переноса ацильной группы на нуклеофил.

3.2.1 Оптимизация кинетической схемы катализируемого ПА переноса ацильной группы на нуклеофил.

3.2.2 Изучение влияния добавленного нуклеофила на ферментативную реакцию.

3.3 Оптимизация катализируемого ПА переноса ацильной группы на нуклеофил в высококонцентрированных водных системах.

3.3.1 Эффект кинетического пересыщения.

3.3.2 Определение параметров нуклеофильности 6-АПК в высококонцентрированных водных системах

3.3.3 Влияние анионов неорганических солей на нуклеофильность 6-АПК.

3.3.4 Изучение зависимости нуклеофильности 6-АПК от концентрации анионов.

3.3.5 Влияние неорганических солей на скорости синтеза и гидролиза при катализируемом ПА переносе ацильной группы на 6-АПК.

3.3.6 Связывание аниона вблизи активного центра ПА.

3.3.7 Изучение влияния природы аниона на нуклеофильность 6-АПК.

3.3.8 Разработка и применение модели ферментативного синтеза р-лактамных антибиотиков.

3.4 Катализируемый ПА синтез р-лактамных антибиотикрв в высококонцентрированных водных системах.

3.4.1 Катализируемый ПА синтез ампициллина, цефалексина и амоксициллина с использованием эффекта кинетического пересыщения.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Катализируемый пенициллинацилазой синтез β-лактамных антибиотиков в высококонцентрированных водных системах»

Актуальность проблемы. Пенициллинацилаза (ПА) из Escherichia coli несколько десятков лет успешно применяется в процессе синтеза полусинтетических Р-лактамных антибиотиков. Одним из исходных веществ для химического синтеза р-лактамных антибиотиков является ядро антибиотика, которое получают катализируемым ПА ферментативным гидролизом природных пенициллинов и цефалоспоринов. Химический синтез Р-лактамных антибиотиков включает в себя большое количество стадий (защита боковой цепи, активация карбоксильной группы, реакция ацилирования ядра Р-лактамного антибиотика , снятие защиты боковой цепи), которые проводятся в органическом растворителе.

Наряду с полусинтетическим методом в последнее время наблюдается всё возрастающий интерес к разработке полностью биокаталитических методов получения р-лактамных антибиотиков, в которых ПА катализирует ферментативный перенос ацильной группы активированного донора (в роли которых выступают эфиры и амиды карбоновых кислот) на ядра антибиотиков (6-АПК, 7-АДЦК) в водной среде. В связи с этим, особую актуальность приобретает задача изучения общих закономерностей катализируемых ПА биокаталитических превращений с переносом ацильной группы, понимание которых позволило бы разработать эффективные методы оптимизации технологических процессов. Целью настоящей работы явилось: изучение закономерностей реакции ферментативного переноса ацильной группы на нуклеофил на примере синтезов ряда Р-лактамных антибиотиков, катализируемого пенициллинацилазой; исследование реакции ферментативного синтеза Р-лактамных антибиотиков в высококонцентрированных водных системах с использованием эффекта кинетического пересыщения; изучение влияния неорганических солей на реакции ферментативного переноса ацильной группы на нуклеофил; создание математической модели, адекватно описывающей процесс ферментативного переноса ацильной группы на 6-АПК; разработка общих алгоритмов оптимизации процесса ферментативного синтеза р-лактамных антибиотиков и выбор оптимальных условий синтеза ампициллина, цефалексина и амоксициллина, катализируемого пенициллинацилазой.

Научная новизна работы. В результате проведенных исследований впервые было показано, что реакция ферментативного синтеза ампициллина включает стадии образования комплексов фермент-нуклеофил и фермент-субстрат-нуклеофил, установлена кинетическая схема ферментативного переноса ацильной группы на нуклеофил; качественно и количественно охарактеризовано влияние нуклеофила на ферментативные реакции синтеза и гидролиза ампициллина; показано, что параметры нуклеофильности, определяющие эффективность ферментативного переноса ацильной группы на 6-АПК, сохраняют свои значения при переходе от истинных растворов к кинетически пересыщенным; изучено влияние ионной силы на нуклеофильность 6-АПК в реакции ферментативного синтеза ампициллина, показано селективное влияние анионов неорганических солей на параметры нуклеофильности; предложена математическая модель, позволяющая описать протекание реакции биокаталитического получения р-лактамных антибиотиков в гомогенных, гетерогенных и высококонцентрированных водных системах; разработаны общие подходы для проведения оптимизации ферментативного синтеза Р-лактамных антибиотиков; разработан метод проведения ферментативных синтезов |3-лактамных антибиотиков в высококонцентрированных водных системах с использованием эффекта кинетического пересыщения и показаны преимущества данного метода перед ранее разработанными.

Практическая значимость работы. Полученные результаты позволили разработать научно обоснованные подходы для оптимизации ферментативного синтеза Р-лактамных антибиотиков. Предложенные методики позволяют проводить ферментативный синтез Р-лактамных антибиотиков с выходами, превышающими значения, представленные в научной или патентной литературе, и могут быть рекомендованы для применения в технологических процессах биокаталитического получения ампициллина, цефалексина и амоксициллина.

1. Литературный обзор

Заключение диссертации по теме «Катализ», Буханов, Александр Леонидович

Основные результаты и выводы

1. Показано, что катализируемая ПА реакция переноса ацильной группы на нуклеофил (6-АПК) включает стадию образования комплексов фермент-нуклеофил и фермент-субстрат-нуклеофил. Количественно охарактеризовано влияние нуклеофила на ферментативные реакции синтеза и гидролиза ампициллина.

2. Предложена минимальная кинетическая схема ферментативного переноса ацильной группы на нуклеофил. Разработана математическая модель, позволяющая описать протекание реакции биокаталитического получения р-лактамных антибиотиков в гомогенных, гетерогенных и высококонцентрированных водных системах.

3. Разработана методика создания пересыщенных растворов реагентов для катализируемого ПА синтеза различных Р-лактамных антибиотиков. Показано, что кинетические закономерности, количественно характеризующие эффективность катализируемого ПА переноса ацильной группы на нуклеофил, сохраняются в пересыщенных водных системах.

4. Обнаружено селективное влияние анионов неорганических солей на нуклеофильность 6-АПК. Предложен механизм возможного связывания аниона вблизи активного центра ПА.

5. Проведены катализируемые ПА синтезы ампициллина, цефалексина и амоксициллина в высококонцентрированных водных системах с использованием эффекта кинетического пересыщения исходных реагентов. Полученные результаты показали более высокую эффективность данного метода по сравнению с известными ранее.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Буханов, Александр Леонидович, 2005 год

1., and Rauenbusch, E., Preparation and general properties of crystalline penicillin acylase from Escherichia coli ATCC 11105, Hoppe-Seylers Z. Physiol. Chem., 1974, 354, 45-53.

2. Bock, A., Wirth, R., Schumacher, G., Lang and P. Buckel. G., The penicillin acylase from Escherichia coli ATCC 11105 consists of two dissimilar subunits, FEMS Microb. Lett, 1983, 20, 135-139.

3. Oh S. J., Kim Y.-Ch., Park Y.-W., Min S.-Y., Kim I.-S. and Kang H.-S. Complete nucleotide sequence of the penicillin G acylase gene and the flanking regions, and its expression in E.coli. Gene. 1987, 56, 87-97.

4. Shimizu, M., Okachi, R., and Nara, T., Enzymic synthesis of cephalosporins. III. Purification and properties of penicillin acylase from Kluyvera citrophila, Agric. Biol. Chem., 1975,39, 1655-1661.

5. Barbero, J. L., Buesa, J. M., de Buitrago. G. G., Mendez, E., Perez-Aranda, A., and Garcia, J. L., Complete nucleotide sequence of the penicillin acylase gene from Kluyvera citrophila. Gene. 1986,49,69-80.

6. Daumy, G. O., Danley, D., McColI, A. S., Apostolakos, D., and Vinick, F. J., Experimental evolution of penicillin G acylases from Escherichia coli and Proteus rettgeri, J. Bacterid., 1985, 163, 925-932.

7. Sizmann, D., Keilmann, C., and Bock. A., Primary structure requirements for the in vivo maturation of penicillin acylase from E. coli ATCC 11105, Eur. J. Biochem., 1990, 192,143-150.

8. Кочеткова, E. Ф., Бартошевич, Ю. Э., Романова H. Б., Биосинтез пенициллинацилаз, Антибиотики, 1986, 31, 729-740.

9. Lindsay C.D. and Pain R.H. Refolding and assembly of penicillin acylase, an enzyme composed of two polypeptide chains that results from proteolytic activation. Biochemistry. 1991, 30, 9034-9040.

10. Duggleby, H. J., Tolley, S. P., Hill, C. P., Dodson, E. J., Dodson, G., and Moody, P. С. E., Penicillin acylase has a single-amino-acid catalytic centre, Nature, 1995, 373, 264-268.

11. Alkema W. B. L., Dijkhuis A-J., de Vries E., Janssen D. В., The role of hydrophobic active-site residues in substrate specificity and acyl transfer activity of penicillin acylase, Eur. J. Biochem., 2002, 269,2093-2100.

12. Alkema W. B. L., Prins A. K., de Vries E., Janssen D. В., The role of aArgl45 and aArg263 in the active site of penecillin acylase of E.coli, Biochem. J., 2002, 365, 303309.

13. Швядас В.К., Марголин A.JL, Шерстюк С.Ф., Клесов А.А. Березин И.В. Определение абсолюьной концентрации активных центров растворимой и иммобилизированной пенициллинамидазы. ДАН. 1977, 232, 1127-1129.

14. Konecny J., Schneider A. and Sieber М. Kinetics and mechanism of acyl transfer by penicillin acylases. Biotechnol. and Bioeng. 1983,25,451-467.

15. Choi C.S., Kim J.A. and Kang H.S. Effects of site-directed mutations on processing and activities of penicillin G acylase from E.coli ATCC 11105. J. Bact. 1992, 174, 6270-6276.

16. Martin J., Slade A., Aitken A., Arche R. and Virden R. Chemical modification of serine at the active site of penicillin acylase from Kluyvera citrophila. Biochem. J. 1991,280, 659-662.

17. Березин И.В., Мартинек К. Основы физической химии ферментативного катализа. Москва, изд-во "Высшая школа", 1977.

18. Brannigan J.A., Dodson G., Duggleby H.J., Moody P.C., Smith J.L., Tomchick D.R. and Murzin A.G. A protein catalytic framework with an N-terminal nucleophile is capable of self-activation. Nature. 1995, 378, 416-419.

19. Березин И.В., Клесов A.A., Марголин A.JL, Ныс П.С., Савицкая Е.М., Швядас В.К. Изучение пенициллинамидазы из E.coli: pH-зависимости константы равновесия ферментативного гидролиза бензилпенициллина. Антибиотики. 1976, 21(6), 519-523.

20. Березин И.В., Клесов A.A., Марголин А.Л., Ныс П.С., Савицкая Е.М., Швядас В.-Ю.К. Изучение пенициллинамидазы из E.coli. pH зависимость кинетических параметров ферментативного гидролиза бензилпенициллина. Антибиотики. 1976, 21(5), 411-415.

21. Svedas V., Guranda D., Van Langen L., Van Rantwijk F. and Sheldon R. Kinetic study of penicillin acylase from Alcaligenes faecalis. FEBS Lett. 1997,417,414-418.

22. Ямсков И.А., Буданов M.B., Даванков B.A. Координационно-ионная иммобилизация ферментов. Влияние металла и стационарного лиганда на свойства иммобилизированных препаратов пенициллинамидогидролазы. Биохимия. 1981,46(9), 1603-1608.

23. Kaufmann, W., and Bauer, К., Enzymatische Spaltung und resynthese von penicillin, Naturwiss., 1960,47,474-475.

24. Cole, M., Penicillins and other acylamino compounds synthesized by the cell-bound penicillin acylase of Escherichia coli, Biochem. J., 1969, 115, 747-756.

25. Marconi, W., Bartoli, F., Cecere, F., Galli, G., and Morisi, F., Synthesis of penicillins and cephalosporins by penicillin acylase entrapped in fibres, Agr. Biol. Chem., 1975,39, 277-279.

26. Margolin, A. L., Svedas, V. K., and Berezin, I. V., Substrate specificity of penicillin amidase fromis. coli, Biochim. Biophys. Acta., 1980, 616, 283-289.

27. Stambolieva, N., Mincheva, Z., Galunsky, В., and Kalcheva, V., Penicillin amidase-catalyzed transfer of low specific acyl moiety. Synthesis of 7-benzoxazolonylacetamido desacetoxycephalosporanic acid, Enzyme Microb. Technol., 1992, 14,496-500.

28. Svedas, V. K., Margolin, A. L., and Berezin, I. V., Enzymatic synthesis of ß-lactam antibiotics: A thermodynamic background, Enzyme. Microb. Technol., 1980, 2, 138144.

29. Березин, И.В., Марголин, A.JI., Швядас, B.K., Ферментативный синтез антибиотиков. Исследование реакции гидролиза-синтеза цефалотина, катализируемой пенициллинамидазой, Докл. АН СССР, 1977, 235, 961-964.

30. Diender, М. В., Straathof, A. J. J., van der Wielen, L. A. M., Ras, С., Heijen, J. J., Feasibility of the thermodynamically controlled synthesis of amoxicillin, J. Mol. Catal. B: Enzymol., 1998, 5,249-253.

31. Svedas, V. K., Margolin, A. L., Borisov, I. L., and Berezin, I. V., Kinetics of enzymatic synthesis of benzylpenicillin, Enzyme Microb. Technol., 1980, 2, 313-317.

32. Березин, И.В., Клесов, A.A., Швядас, В.К., Ныс, П.С., Савицкая, Е.М., Кинетика гидролиза бензилпенициллина, катализируемого пенициллинацилазой, Антибиотики, 1974, 19(10), 880-887.

33. Bruggink, A., Roos, Е. С., de Vroom, Е., Penicillin acylase in the industrial production of ß-lactam antibiotics, Org. Process Res. Dev., 1998,2, 128-133.

34. Zerner, В., and Bender, M. L., The kinetic consequences of the acyl-enzyme mechanism for the reactions of spesific substrates with chymotrypsin, J.Am.Chem.Soc., 1964, 86, 3669-3673.

35. Bender, M.L., Clement, G.E., Gunter, C.R., and Kezdy, F., The kinetics of a-chymotrypsin reactions in the presence of added nucleophiles, J.Am.Chem.Soc., 1964, 86, 3697-3703.

36. Fink, A. L., and Bender, M. L., Binding sites for substrate leaving groups and added nucleophiles in papain-catalysed hydrolyses, Biochemistry, 1969, 8(12), 5109-5118.

37. Seydoux, F., Yon, J., Nucleophilic competition in enzymic hydrolytic reactions. Kinetic analysis and application to the tryptic hydrolysis of some esters, Europ. J. Biochem., 1967,3,42-56.

38. Seydoux, F., Yon, J., Nemethy, G., Hydrophobic interactions of some alcohols with acyl trypsins, Biochim. Biophys. Acta, 1969, 171, 145-156.

39. Клесов, А. А., Марголин, A. JL, Швядас, В. К., Перенос ацильной группы на 6-аминопенициллановую кислоту, катализируемый пенициллинацилазой. Кинетическое рассмотрение, Биоорг. химия, 1977, 5, 654-661.

40. Kato, К., Kinetics of acyl transfer by a-amino acid ester hydrolase from Xanthomonas citri, Agric. Biol. Chem., 1980, 44, 1083-1088.

41. Nam, D. H., Kim, C., and Ryu, D. D. Y., Reaction kinetics of cephalexin synthesizing enzyme from Xanthomonas citri, Biotechnol. Bioeng., 1985,27, 953-960.

42. Швядас B.K., Клесов A.A. Проблемы ферментативной модификации антибиотиков. Изучение пенициллинамидазы из E.coli: кинетика и механизм действия. В кн.: Инженерная энзимология и биоорганический катализ. Под ред.

43. B.JI. Кретовича и И.В. Березина. Сер. биолог, химия, т. 12. М., Изд-во ВИНИТИ АН СССР,. 1978, 209-237.

44. Kasche, V., Haufler., U., Zollner, R., Kinetic studies on the mechanizm of the penicillin amidase-catalysed synthesis of ampicillin and benzylpenicillin, Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem., 1984, 365, 1435-1443.

45. Riechmann, L., and Kasche, V., Peptide synthesis catalyzed by serine proteinases chymotrypsin and trypsin, Biochim. Biophys. Acta, 1985, 830, 164-172.

46. Kasche V. Review. Mechanism and yields in enzyme catalysed equilibrium and kinetically controlled synthesis of P-lactam antibiotics, peptides and other condensation products. Enzyme Microb. Technol. 1986, 8,4-16.

47. Stambolieva, N., Mincheva, Z., and Galunsky, В., Kinetic comparison of penicillin amidase catalyzed transfer of nonspecific and specific acyl moieties to 7-aminodeacetoxycephalosporanic acid, Biocatal. Biotransform., 1998, 16, 225-232.

48. Gololobov, M. Yu., Borisov, I. L., Belikov, V. M., and Svedas, V. K., Acyl group transfer by proteases forming acyl-enzyme intermediate: Kinetic model analysis, Biotechnol. Bioeng., 1988,32, 866-872.

49. Gololobov, M. Yu., Borisov, I. L., and Svedas, V. K., Acyl group transfer by proteases forming an acylenzyme intermediate: Kinetic model analysis (Including hydrolysis of acylenzyme-nucleophile complex), J. Theor. Biol., 1989, 140,193-204.

50. Гололобов, M. Ю., Борисов, И. JI., Швядас, В. К., Пептидный синтез, катализируемый протеазами. Анализ кинетической модели для ферментов, действующих по ацилферментному механизму, Биохимия, 1987, 52, 584-591.

51. Gololobov, M. Yu., Petrauskas, A., Pauliukonis, R., Koschke, V., Borisov, I. L., and Svedas, V., Increased nucleophile reactivity of amino acid p-naphthylamides in a-chymotrypsin-catalyzed peptide synthesis, Biochim. Biophys. Acta, 1990, 1041, 71-78.

52. Blinkovsky, A. M., Markaryan, A. N., Synthesis of (5-lactam antibiotics containing a-aminophenylacetyl group in the acyl moiety catalyzed by D-(-)-phenylglycyl-p-lactamide amidohydrolase, Enzyme Microb. Technol., 1993, 15, 965-973.

53. Tougu V., Talts P., Meos H., Hage M., Aaviksaar A., Aminolysis of acyl-chymotrypsins by amino acids. Kinetic appearance of concentration effect in peptide yield enhancement by freezing, Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1247, 272-276.

54. Gerisch S., Jakubke H. D., Kreuzfeld H. J., Enzymatic peptide synthesis in frozen aqueous systems: use of N-unprotected unusual acyl donors, Tetrahedron Asymmetry, 1995,6, 3039-3045.

55. Lopez-Fandino, R., Gill, I., Vulfson, E. N., Protease-catalysed synthesis of oligopeptides in heterogeneous substrate mixtures, Biotechnol. Bioeng., 1994, 43, 1024-1030.

56. Lopez-Fandino, R., Gill, I., Vulfson, E. N., Enzymatic catalysis in heterogeneous mixtures of substrates: the role of the liquid phase and the effects of "adjuvants", Biotechnol. Bioeng., 1994, 43, 1016-1023.

57. Gill, I., and Vulfson, E., Enzymic catalysis in heterogeneous eutectic mixtures of substrates, Tibtech., 1994, 12, 118-122.

58. Kasche, V., and Galunsky, В., Enzyme catalyzed Biotransformations in aqueous two-phase systems with precipitated substrate and/or product, Biotechnol. Bioeng., 1995,45, 161-167.

59. Youshko M.I., Van Langen L.M., De Vroom E., Van Rantwijk F., Sheldon R.A., Svedas V.K. "Penicillin Acylase-Catalyzed Ampicillin Synthesis Employing a pH Gradient: a New Approach to Optimization", Biotechnol. Bioeng. 2002, 78 (5), 589593.

60. Швядас, В. К., Марголин, А. Л., Шерстюк. С. Ф., Березин. И. В., Инактивация пенициллинамидазы из E.coli под действием фенилметилсульфонил фторида: кинетический анализ и титрование активных центров, Биоорган, химия, 1977, 3, 546-553.

61. Alkema W.B.,de Vries Е., Floris R., Janssen D.B. Kinetics of enzyme acylation and deacylation in the penicillin acylase-catalyzed synthesis of p-lactam antibiotics. Eur.J.Biochem. 2003,270, 3675-3683.

62. Ospina S.,Barzana E., Ramirez O.T., Lopez-Munguia A. Effect of pH in the synthesis of ampicillin by penicillin acylase. Enzyme and microbial technology. 1996, 19,462-469.

63. Kheirolomoom A., Ardjmand M., Fazelinia H., Zakeri A., Clarification of penicillin G acylase reaction mechanism, Process Biochemistry, 2001, 36, 1095-1101.

64. Kin M.G., Lee S.B., Effect of organic solvents on penicillin acylase-catalyzed reactions: interaction of organic solvents with enzymes, J. Mol. Catalysis B:enzymatic, 1996, 1, 181-190.

65. Prabhune A.A., Sivaraman H., Evidence for involvement of arginyl residue at the catalytic site of penicillin acylase from E.coli, Biochem. Biophys. Res. Commun., 1990, 173(1), 317-322.

66. Done S.H., Brannigan J.A., Moody P., Hubbard R., Ligand-induced conformational change in penicillin acylase, J. Mol. Biol., 1998,284,463-475.

67. McVey C.E., Walsh M.A., Dodson G.G., Wilson K.S., Brannigan J.A., Crystal structure of penicillin acylase enzyme-substrate complexes: structural insights into the catalytic mechanism, J. Mol. Biol., 2001, 313, 139-150.

68. Alkema W., Hensgens C., Kroezinga E., de Vries E., Janssen D., Characterization of the P-lactam binding site of penicillin acylase of E.coli by structural and site-directed mutagenesis studies, Protein Engineering, 2000,13(12), 857-863.

69. Гуранда Д.Т., Воловик Т.С., Швядас В.К. pH-зависимость стабильности пенициллинацилазы из Escherichia coli., Биохимия, 2004, 69(12), 1700-1705.

70. Гуранда Д.Т. Субстратная специфичность и стереоспецифичность пенициллинацилаз из Escherichia coli и Alcaligenes faecalis. Канд. дисс. Москва. 2000.

71. Martin J., Prieto I., Mancheno J.M., Barbero J.L. and Arche R. pH studies to elucidate the chemical mechanism of penicillin acylase from Kluyvera citrophila. Biotechnol. Appl. Biochem. 1993, 17,311-325.

72. Chilov G.G., Svedas V.K. Enzymatic hydrolysis of beta-lactam antibiotics at low pH in a two-phase "aqueous solution water-immiscible organic solvent" system". Can. J. Chem. 2002, 80, 699-707.

73. Ныс П.С., Савицкая E.M., Клесов A.A., Синицын А.П., Швядас В.-Ю.К., Березин И.В. Изучение пенициллинамидазы из E.coli. pH-зависимость кинетики инактивации фермента. Антибиотики. 1978,23(1), 46-50.

74. Haufler U., Wiesemann I., Ulmke R. and Kasche V. Structure, pH-stability and renaturation of free and immobilized E. coli penicillin amidase. Dechema Biotechnology Conferences 1 VCH Verlagsgesellschaft. 1988,345-350.

75. Воловик T.C. Стабильность пенициллинацилазы. Дипл. работа. Хим. ф-т МГУ, кафедра хим. энзимологии. М. 2004.

76. Berezin I.V., Klibanov A.M., Klyosov A.A., Martinek K. and Svedas V.K. The effect of ultrasound as a new method of studying conformational transitions in enzyme active sites. FEBS Lett. 1975,49(3), 325-328.

77. Yang S., Zhou L., Tang H., Pan J., Wu X., Huang H., Yuan Z. Rational design of a more stable penicillin G acylase against organic cosolvent. 2002 J. Mol. Cat. B: Enzymatic. 18, 285-290.

78. Margolin A.L., Izumrudov V.A., Svedas V.K., Zenin A.B., Kabanov V.A. and Berezin I.V. Preparation and properties of penicillin amidase immobilized in polyelectrolytic complexes, Biochem. Biophys. Acta, 1981, 660, 359-365.

79. Ямсков И.А., Буданов M.B., Даванков B.A. Координационно-ионная иммобилизация ферментов. Влияние металла и стационарного лиганда на свойства иммобилизированных препаратов пенициллинамидогидролазы, Биохимия, 1981, 46, 1603-1608.

80. Guisan J.M., Alvaro G., Fernandez-Lafuente R., Rossel C.M., Garcia J.L. and Tagliani A. Stabilization of heterodimeric enzyme by multipoint covalent immobilization: Penicillin G acylase from Kluyvera citrophila. Biotechnol. Bioeng., 1993,42,455-464.

81. Ospina S.S., Lopez-Munguia A., Gonzalez R.L., and Quintero R. Characterization and use of a penicillin acylase biocatalyst. J. Chem. Tech. Biotechnol, 1992., 53, 205214.

82. Юшко М.И. Кинетические закономерности ферментативного синтеза ампициллина, катализируемого пенициллинацилазой, в гомогенных, гетерогенных и твердофазных системах. Канд. дисс. Москва. 2000.

83. Fernandez-Lafiiente R, Rosell CM and Guisan JM, The use of stabilized penicillin acylase derivatives improves the design of kinetically controlled synthesis. J Mol Catal ArChem, 1995, 101, 91-97.

84. Rosell CM, Terreni M, Fernandez-Lafuente R and Guisan JM, A criterion for the selection of monophasic solvents for enzymatic synthesis. Enzyme Microb Technol, 1998,23, 64-69.

85. Park CB, Lee SB and Ryu DDY, Penicillin acylase-catalyzed synthesis of cefazolin in water-solvent mixtures: enhancement effect of ethyl acetate and carbon tetrachloride on the synthetic yield. J Mol Catal B: Enzym, 2000, 9,275-281.

86. Illanes A and Fajardo A, Kinetically controlled synthesis of ampicillin with immobilized penicillin acylase in the presence of organic cosolvents. J Mol Catal B: Enzym, 2001, 11,587-595.

87. Dong-Zhi Wei, Liu Yang, Effects of ethylene glycol on the synthesis of ampicillin using immobilized penicillin G acylase, J Chem Technol Biotechnol, 2003, 78, 431436.

88. Aguirre C, Baeza J and Illanes A, Cosolvent effect on the synthesis of ampicillin and cephalexin with penicillin acylase. Prog Biotechnol, 1998, 15, 95-100.

89. Erarslan A, The effect of polyol compounds on the thermostability of penicillin G acylase from a mutant of Escherichia coli ATCC11105. Proc Biochem, 1995, 30, 133139.

90. Fernandez-Lafuente R, Rosell CM and Guisan JM, The presence of methanol exerts a strong and complex modulation of the synthesis of different antibiotics by immobilized penicillin G acylase. Enzyme Microb Technol, 1998,23, 305-310.

91. Kin M.G., Lee S.B., Penicillin acylase-catalyxed synthesis of J3-lactam antibiotics in water-methanol mixtures: effect of cosolvent content and chemical nature of substrate on reaction rates and yields, J. Mol. Catalysis Brenzymatic, 1996, 1,201-211.

92. Kin M.G., Lee S.B., Penicillin acylase-catalyxed synthesis pivampicillin: Effect of reaction variables and organic cosolvents, J. Mol. Catalysis B:enzymatic, 1996, 1, 7180.

93. Hewitt L., Kasche V., Lummer K., Lewis R.J., Structure of a slow processing precursor penicillin acylase from E. coli reveals the linker peptide blocking the active-site cleft, J. Mol. Biol., 2000,302, 887-898.