Клонирование и характеристика мРНК, содержащей повторяющийся элемент В2 и богато представленной в печени мыши тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Иванов, Павел Леонидович

• Иванов, Павел Леонидович
• кандидат биологических наук
• 1984

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Иванов, Павел Леонидович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Рассеянные повторяющиеся.элементы. генома эукариот.

Общая характеристика рассеянных повторяющихся эле-*-. ментов.

Длинные рассеянные.повторы: элементыварьирующей. локализацией.

Короткие рассеянные повторы ; вездесущие последователь-г-. ности генома млекопитающих.

Экспрессия рассеянных повторяющихся.элементов.генома. эукариот

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

1. Бактериальные штаммы и.векторы.для.клонирова-. ния.

2. Получение поли (А)-содержащей мРНК из клеток. асцитной карциномы Эрлиха и.печени.мыши.;.;;.v

3. Получение ядерной: пре-мРНК

4. Электрофоретическое фракционирование РНК.в. агарозном геле и перенос на ДБМ^фильтры.

5. Выделение ДНК плазмиды pBR

6. Получение библиотеки клонов кДНК на основе. цитогшазматической поли(А)*РНК печени мыши.

7. Приготовление меченых,тест-проб для гибрида-., зации

8. Детектирование и отбор рекомбинантных.клонов;. Метод гибридизации с колониями.

9. Выделение рекомбинантной ДНК

10. Обработка.ДНК.рестрикционными эндонуклеа-. зами.

11. Фракционирование ДНК с помощью электрофореза.

12. Перенос ДНК из агарозного геля на нитроцел-. люлозные фильтры ; блотт-гибридизация.

13* Выделение вставочных фрагментов ДНК

14. Концевое мечение.32Р.двуцепочечных.фраг-. ментов ДНК.

15. Разделение цепей ДНК в ШАГ

16. Выделение меченых дву- и.одноцепочечных. фрагментов ДНК из ПААГ.

17. Определение первичной структуры ДНК

РЕЗУЛЬТАТЫ.

1. Получение библиотеки клонов кДНК на основе цитоплазматической поли(А)+РНК печени мыши и отбор рекомбинантов, содержащих.повторы. BI и В

2. Рестрикционный анализ рекомбинантных клонов, содержащих последовательности, гомологичные В-элементам: определение.типа. клонированных В-элементов

3. Анализ первичной структуры четырех клонированных кДНК, содержащих повторяющийся элемент В2 ; полная копия В2-последовательности представлена в одной из мажорных.полиадени-. лированных мРНК печени мыши

4; Вг+мРНКд. - основной тип В2-содержащих мРНК печени мыши. Соседствование повтора В2 и уникальной (слабоповторяющейся). последовательности внутри транскрипта • •.

5. Универсальная ориентация повторяющихся последовательностей семейства В2 в полисомных и цитоплазматических полиШ^РНК. клеток асцитной карциномы и печени мыши

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Клонирование и характеристика мРНК, содержащей повторяющийся элемент В2 и богато представленной в печени мыши»

Одной из важнейших проблем современной молекулярной биологии является организация и функционирование эукариотичес-кого генома. Центральное место в этой проблеме занимают вопросы, связанные с реализацией генетической информации у высших организмов, которые являются ключевыми для понимания механизмов, определяющих смысл и специфику всех биологических явлений и процессов. N

Изучение экспрессии генов эукариот проводится на разных уровнях. Это структурные исследования индивидуальных генов и последовательностей, контролирующих их выражение в онтогенезе, анализ закономерностей функционирования отдельных генов и генных комплексов, изучение организации транскрипционных еда-ниц и биогенеза генных продуктов - как полинуклеотидных, так и белковых.

Исследования транскрипционных единиц млекопитающих выявили в составе ядерных предшественников мЗДК (пре-мРНК) специфические взаимокомплементарные последовательности /13,140/. Характерной особенностью данных последовательностей является то, что,по крайней мере,часть из них образует в молекулах пре-мРНК достаточно протяженные двуспиральные участки -"шпильки". Как оказалось, эти внутримолекулярные двуспиральные РЫК (дсРНК-В /106/) транскрибируются с "вездесущих" повторов - рассеянных по геному высокоповторяющихся элементов, таких как ALu. -последовательности человека /84/ и семейства В-типа грызунов /107/.

Функции вездесущих повторов неизвестны. Некоторые особенности строения, активная транскрипция и образование своеобразных шпилечных структур в составе транскриптов позволяют предполагать важную роль этих последовательностей в сплайсинге пре-мРНК, а также в процессах репликации и реорганизации генома. На возможное участие вездесущих повторов в регуляции экспрессии генов указывает факт их локализации в геноме рядом со структурными генами /161/. Последовательности, гомологичные дсРНК были обнаружены и в составе зрелых мРНК /106,141/, что также может свидетельствовать о связи вездесущих элементов с образованием генных продуктов. Однако природа этой гомологии и структурная взаимосвязь дсРНК и мРНК оставались до настоящего времени неясными. Вопрос об организации повторяющихся элементов в мРНК требовал использования новых подходов. Одним из возможных методических приемов является клонирование комплементарной ДНК (кДНК), полученной на основе мРНК. Этот метод позволяет исследовать индивидуальные транскрипты, содержащие РНК-копии повторяющихся элементов и выявить особенности их организации, транскрипции и процессинга.

В настоящей работе с помощью данного метода клонирования выделены и исследованы индивидуальные последовательности кДНК, полученные на основе цитоплазматической поли(А)+РНК печени мыши и соответствующие неидентифицированной мРНК, содержащей повторяющийся элемент В2. Определен размер этой: РНК ; показана ее принадлежность к мажорному классу полисомной мРНК печени мыши. Изучение структурной организации клонированной мРНК прямо продемонстрировало соседствование внутри транскрипта уникальной или слабоповторяющейся части и высокоповторяюще-гося элемента В2. Анализ первичной структуры последовательности В2 в составе мРНК показал, что она совпадает с первичной структурой геномной последовательности В2, причем полная копия В2 локализована у 3'-конца клонированной мРНК. Кроме того было установлено, что в этой мРНК, а также во всех видах цитоплазматических и полисошых В2-содержащих РНК клеток печени мыши и асцитной карциномы Эрлиха РНК-копии В2 представляют лишь одну (относительно направления транскрипции) ориентацию повтора. В этой "канонической" ориентации В2 несет ряд функционально значимых участков, в том числе, сигнал полиаде-нилирования мРНК. Примечательно, что в ядерных пре-мРНК присутствуют копии обеих цепей повторов,.т.е. представлены обе возможные ориентации. Тем самым показано, что в процессе превращения пре-мРНК в зрелые мРНК, а также при созревании всех других типов цитоплазматических В2-содержащих поли(А)+РНК происходит специфическая деградация большинства транскриптов, соответствующих неканонической ориентации В2-элемента. Поставлен вопрос о функциональной обусловленности феномена универсальной ориентации В2, представленной в зрелых транскриптах возможным участием этих элементов в терминации и полиаде-нилировании мРНК. В ходе работы предложен метод, позволяющий определять функциональную ориентацию любой клонированной последовательности генома.

Таким образом,получена новая информация об особенностях строения зрелых продуктов транскрипции эукариотических генов, определяемых ходом их специфического процессинга. Результаты, полученные в работе, а также методические приемы, разработанные в процессе ее выполнения могут представлять теоретический и практический интерес для всех дальнейших структурно-функциональных исследований генетического аппарата эукариот.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ РАССЕЯННЫЕ ПОВТОРЯЮЩИЕСЯ ЭЛЕМЕНТЫ ГЕНОМА ЭУКАРИОТ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАССЕЯННЫХ ПОВТОРЯЮЩИХСЯ ЭЛЕМЕНТОВ.

Рассеянные повторяющиеся последовательности ДНК (РП), присутствующие в геномах практически всех эукариотических организмов, объединяют два основных типа повторяющихся элементов, различающихся по длине и относительному содержанию в геноме. Это короткие повторяющиеся последовательности (КРП), длиной в несколько сотен п.н. и длинные повторяющиеся последовательности (ДРП), размер которых обычно составляет более 2 тыс.п.н. Относительное содержание РП обоих типов, а также характер их распределения варьирует в геномах разных организмов.

Как правило, РП не являются точными копиями друг друга; каждый тип включает многочисленные группы и семейства повторяющихся последовательностей, обособленные той или иной степенью внутригрупповой гомологии. Количество семейств РП варьирует в очень широком диапазоне и не коррелирует со сложностью организма. Так, в геноме быка и ряда грибов присутствует менее 10-ти семейств рассеянных повторов, в то время как у многих других эутсариот число семейств достигает десятков и даже сотен тысяч /цит. по 15/. Члены одного семейства РП обычно не соседствуют друг с другом и диспергированы в геноме среди повторов других семейств и уникальных элементов /15/.

Фракции КРП и ДРП после реассовдавди характеризуются неодинаковой термостабильностью: длинные - более высокой, а короткие - более низкой, что говорит о значительно большей дивергенции последовательностей, составляющих семейства КРП, чем ДРП /73/. В то же время,изучение степени гомологии между короткими и длинными диспергированными повторами показывает, что в некоторых случаях они могут иметь заметное сходство и не отличаться по спектру частот повторяемости и кинетической сложности /15/. Анализ клонированных повторяющихся участков генома некоторых видов морского ежа /32,38/ подтверждает данную точку зрения и указывает на то, что длинные повторяющиеся последовательности могут состоять из коротких. Одним из примеров таких сложных повторяющихся элементов являются так называемые "перетасованные" (scra-fabled ) последовательности -достаточно протяженные повторы, состоящие из отдельных коротких субэлементов /55,131,167/. Последовательности этого семейства представляют собой определенные, но различные в каждом конкретном случае сочетания из одного и того же набора коротких повторов. Некоторые из этих коротких повторов, выполняющих роль внутренних дискретных участков гомологии перетасованных последовательностей существуют в геноме также и самостоятельно - в виде отдельных диспергированных копий /131/# С другой стороны в ДНК морского ежа S. pu.hpui-atus степень взаимной гомологии отличающихся по размерам РП составляет лишь 10-30% /36,54/, что указывает на то, что в геноме эукариот существуют длинные и короткие РП, не имеющие взаимной гомологии и соседствующие с уникальными последовательностями.

Заметные успехи в изучении РП были достигнуты с введением в исследовательскую практику методов генной инженерии. С помощью клонирования ДНК выделены и детально охарактеризованы многие индивидуальные семейства РП. Выяснилось, что различные копии одного семейства отличаются друг от друга не только за счет нуклеотидных замен, но и за счет инсерций, де-леций и транслокаций./55,146/.

Рассеянные повторы, относящиеся к одному и тому же семейству могут располагаться в различных хромосомах, однако существуют и такие семейства, члены которых локализуются только в определенных хромосомах или даже в определенных районах хромосом. Примером такого избирательного расположения повторов служит одно из семейств РП человека (с частотой повторяемости приблизительно 600) /ИЗ/. Это семейство встречается только в определенных районах Y-хромосомы, где перемежается с другими повторяющимися последовательностями.

Расположение в геноме по крайней мере части РП строго не фиксировано и может меняться в фило- и онтогенезе. Такие последовательности получили название генетических элементов с нестабильной локализацией /61,85,163/. Подобные мобильные элементы, имеющие сходство с бактериальными транспозонами и IS-элементами обнаружены у одноклеточных эукариот и высокоразвитых многоклеточных организмов /см.З/.

В настоящее время высказывается мнение, что большинство эффективно транскрибирующихся РП относится к мобильным генетическим элементам, которые, по-видимому, являются важной общей структурной деталью всех эукариотических организмов /8/. Существуют предположения об участии этих элементов в процессах, связанных с репликацией и реорганизацией генома, регуляцией экспрессии генов, канцерогенезом. Они могут играть роль в определении ряда количественных характеристик, например,имеющих отношение к жизнеспособности индивидуумов /77/.

Члены многих семейств РП, как коротких, так и длинных встречаются в геноме в виде копий, имеющих взаимопротивоположную ориентацию /44/. Совокупность таких обращенных или инвертированных повторов (0П) составляет чрезвычайно быстро ренатурирующую фракцию ДНК при CQt < 10~4) /170/. При реассоциации ДНК, содержащей ОП, взаимокомплементарные последовательности, находящиеся в одной цепи, образуют своеобразные структуры, получившие название "шпилек". Электронномикроскопи-ческие исследования шпилечных структур показали, что во многих случаях ствол шпильки (спаренный участок) заканчивается однонитевой петлей /170/. Это говорит о том, что обращенные копии чаще всего разделены какой-то иной последовательностью. ОП, не образующие при отжиге петли, называются палиндромами.

У разных организмов длинные и короткие РП характеризуются различным относительным содержанием обращенных копий. Так,у человека, дрожжей, пшеницы преобладают короткие ОП - в несколько десятков и сотен нуклеотидов, а у дрозофилы, каймана и черепахи - длинные, достигающие размеров в несколько тысяч п.н. /15/. Последовательности, разделяющие в геноме две обращенные копии по длине очень гетерогенны: от 10^ до > Ю^п.н. Средние их размеры у большинства организмов находятся в интервале (1-6)хЮ3 п.н. /15/.

Биологическое значение феномена обращенных повторяющихся последовательностей в настоящее время остается невыясненным. Имеются работы, где показано, что значительная часть ОП транскрибируется в составе пре-мРНК /см.13/. Большое количество и разнообразие их в ДНК, а также их транскрибируемость позволяют предположить, что эти последовательности представляют собой важную, но функционально гетерогенную группу структурных элементов генома эукариот. Возможно, образующиеся в молекулах-предшественниках различных видов РНК шпильки,служат сигналами для ферментов, осуществляющих их процессинг и сплайсинг /95/. Существуют предположения об участии шпилек в качестве сигнальных структур для ДНК-полимеразы /23/ и РНКполимераз /130/. Инвертированные повторы, находящиеся на концах элементов с нестабильной локализацией в геноме, вероятно необходимы для перемещения этих элементов вдоль ДНК /21,86/.

ДЛИННЫЕ РАССЕЯННЫЕ ПОВТОРЫ: ЭЛЕМЕНТЫ С ВАРЬИРУЮЩЕЙ ЛОКАЛИЗАЦИЕЙ.

К этому типу относятся РП эукариотического генома, кото-г рые достигают значительной длины - их размер в среднем составляет несколько тысяч п.н. Они объединяются в многочисленные семейства, характеризующиеся разной степенью дивергенции последовательностей-копий и представляющие как самостоятельные классы повторяющихся последовательностей, так и повторы, имеющие внутренние области гомологии с некоторыми представителями КРП.

Большинство ДРП характеризуется весьма сложной структурной организацией. Некоторые из них, как уже упоминалось выше, состоят из коротких повторяющихся субэлементов, которые в разных сочетаниях образуют различные длинные повторяющиеся участки, известные как "перетасованные" последовательности. Это было непосредственно показано на клонированных ДРП дрозофилы, курицы и некоторых видов морских ежей /55,131, 167/. ДРП крысы также состоят в основном из отдельных коротких повторяющихся элементов /171/. Во многих других случаях в составе ДРП обнаруживаются характерные участки внутренней гомологии, могущие иметь различную ориентацию. По существующим оценкам 16-17$ ДНК дрозофилы состоит из ДРП, которые образуют приблизительно 70 семейств последовательностей. Представительность различных семейств варьирует от 3 до 100 копий на гаплоидный геном /163/.

Клонирование последовательностей, активно транскрибирующихся в клетках дрозофилы и ответственных за синтез поли(А)-содержащих РНК привело к открытию длинных - в несколько тысяч пар нуклеотидов - повторов ДНК, имеющих варьирующую локализацию на хромосомах разных линий дрозофилы /61,85/. Различия в локализации наблюдались также, хотя и в меньшей степени, между индивидуумами, принадлежащими к одной и той же линии. На основании этих данных, подтвержденных позднее в ряде других работ, было высказано предположение,: что обнаруженные семейства повторов являются подвижными, мигрирующими элементами генома и для их обозначения был предложен термин "мобильные диспергированные гены" (ЩГ) /4,17/. ЩГ-подобные элементы найдены также в геноме дрожжей и млекопитающих /30, 71,72/, что позволяет считать их универсальными компонентами генома эукариотических организмов.

Мобильные ДРП, впервые описанные в геноме дрозофилы,характеризуются следующими основными свойствами. Это протяженные повторы длиной 5-8 тыс.п.н., представленные в геноме от 10 до 100 копиями и рассеянные по всем хромосомам дрозофилы, причем локализация их в хромосомах.разных линий мух варьирует. Число обнаруженных семейств ЩГ составляет сейчас 15-20 и, следовательно, общее число таких элементов в геноме достигао ет 10 или около Ъ% от всего генетического аппарата /4,8/. Все копии одного и того же семейства ЩГ весьма сходны друг с другом по рестриктным картам.

Особый интерес представляет структурная организация ЩГ; t

Каждый элемент фланкирован с обеих сторон прямыми повторами длиной 300-600 п.н. /21,61,72,118,159,164/, получившиминазвание длинных концевых повторов (ДКП). Изучение первичной структуры ДКП /21,118,148,169/ показало, что в составе одного элемента оба ДКП (левый и правый) являются точными копиями друг друга. При сравнении ДКП из разных элементов одного семейства было показано, что они могут несколько различаться (заменой оснований, вставками, делециями). В начале и конце каждого ДКП имеются не вполне совершенные обращенные повторы. Наконец, сразу перед левым ДКП и после правого ДКП обнаруживаются короткие прямые повторы (~5 п.н.), происходящие, по-видимому, за счет дупликации последовательности-мишени в месте внедрения ЩГ в хромосомную ДНК /12/. Подобная организация характерна для концевых фрагментов большинства бактериальных транспо-зонов /29/.

Помимо аналогии с транспозонами МДГ имеют очень много общих черт с проретровирусами птиц и млекопитающих. Это касается их структурной организации, характера транскрипции, строения ДКП. Предполагается, что эти элементы имеют одну и ту же природу /4,8,64/.

В нескольких различных МДГ в области стыка одного из ДКП и внутренней части элемента обнаружена полностью идентичная последовательность длиной в 35 нуклеотидов, комплементарная 3»-концевой части одной из клеточных тРНК, а в области стыка с другим ДКП выявлен обогащенный пуринами аналогичный участок полной идентичности длиной 18 п.н. /12,169/.

Как известно, затравкой для синтеза " - "-цепи реплика-тивной ДНК ретровирусов служит одна из тРНК, комплементарная участку ДНК провируса на границе с одним из ДКП, а для инициации " + "-цепи существенным является полипуриновый блок, расположенный у границы с другим ДКП /121/.

Прослеживаемая аналогия позволяет думать, что, по крайней мере, для некоторых мобильных элементов генома эукариот их амплификация, а,следовательно,и инсервдя осуществляется способом, аналогичным тому, который имеет место у ретровирусов, т.е. через обратную транскрипцию соответствующих РНК. Далее, при инфекции ретровирусами удается выявить в клетках кольцевые решшкативные формы вирусной ДНК /160/. Аналогичные кольцевые молекулы, содержащие ЭДДГ были выделены из клеток культуры дрозофилы /63/. Кольцевые ДНК, гомологичные РП генома были обнаружены также у других эукариот /156/.

Происхождение экстрахромосомных копий мобильных элементов генома остается,однако, неясным. Это могут быть саморегулирующиеся плазмиды, продукты обратной транскрипции соответствующих РНК, представляющие собой промежуточные фазы транспозиции, а также продукты непосредственного выщепления из генома, связанного с гомологичной рекомбинацией между двумя ДКП /цит. по 94/.

Б геноме дрожжей также обнаружены мобильные элементы. Это так называемая последовательность Ту1 /30/. Ее длина составляет приблизительно 5,9 тыс.п.н. и,подобно ЩГ дрозофилы, на своих концах она несет ДКП, обозначенные как S -элементы. Длина 8 -последовательностей - около 340 п.н. На гаплоидный геном дрожжей приходится около 35 копий Tyl. Число 8 -последовательностей немного выше: наряду с 8 , входящими в состав Tyl и обрамляющими ее, встречаются так называемые "соло" S , то есть одиночные, не связанные с Tyl 8-последовательности /30/.

Использование моноклональных линий дрожжей позволило показать относительно высокую частоту перемещений Tyl в геноме. Так, В 2-х случаях из 5-ти после непрерывного месячного роста культур были обнаружены перемещения одной копии

Tyl в геноме /30/. Анализ первичной структуры 8 показал, что в ней обнаруживаются (в обеих цепях) сигналы инициации транскрипции, а в одной из цепей - последовательность для полиаде-нилирования /68/. В 8 -последовательностях, видимо, находятся промоторы и терминаторы считываемых с Tyl полиСАЭ^ТЖ /59/.

Вскоре после открытия ВДГ, в геноме дрозофилы были обнаружены ДРП, которые также имеют варьирующую локализацию в хромосомах, но устроены иначе, чем ЩГ. Они характеризуются наличием протяженных обращенных повторов на своих концах, и поэтому получили обозначение 5Б (foLd-Ьа.ск ) /132/. IB-ce-мейство охватывает примерно 30 чрезвычайно гетерогенных по длине последовательностей (0,4-4,0 тыс.п.н;). Общим для них является наличие гомологичных участков на концах - в области обращенных повторов. Протяженность последних также варьирует в широких пределах от 0,2 до 1,3 тыс.п.н.

Участок, заключенный между обращенными повторами, и условно называемый петлей, не является обязательной составной частью FB-элемента. Возможно, что в некоторых случаях он соответствует участку генома, захваченному КВ-элементом при его транспозиции.

Предполагается, что последовательность, расположенная между двумя 0П, присущая элементу FB-4 кодирует так называемую транспоазу - гипотетический фермент, специфически узнающий концевые участки транспозонов и принимающий участие в их переносе в новые места генома. Эта последовательность, имеющая длину около 1700 п.н. многократно повторяется в геноме ' дрозофилы либо в окружении 0П, либо без них и имеет в своем составе блок Хогнесса, усилитель (см. далее), сигнал полиаде-нилирования транскрипта, а также открытую ражу считывания для синтеза белка длиной в 148 амк /132/.

Саш ОП FB-элементов весьма консервативны по первичной структуре, однако в их строении наблюдаются некоторые необычные черты. Так, аналогичные концевые последовательности нескольких ББ-элементов на протяжении первых 200 нуклеотидов практически идентичны друг другу. В то же время ОП, входящие в состав одного ИВ-элемента обладают несравненно меньшей гомологией: в них встречаются как точечные замены, так и выпадения целых блоков. "Левый" и "правый" ОП могут отличаться друг от друга по длине на 200 н. /132/.

В этом отношении ОП IB-элементов принципиально отличаются от ДЕШ ЩГ, что, по-видимому, указывает и на совершенно различный механизм транспозиции этих подвижных элементов.

В последнее время особый интерес вызывают так называемые Р-элементы генома дрозофилы, способные при определенных условиях перемещаться по геному с очень большой частотой /16/. Эти элементы обнаружены в некоторых диких линиях (Р-линии), где насчитывают от 30 до 50 копий.

Р-элементы вызывают множественные мутации инсерционной природы в потомстве, полученном от скрещивания Р-линий с линиями, не имеющими этого элемента. В самих Р-линиях перемещения Р-элементов, по-видимому, заблокированы репрессор-ными системами.

Р-элементы подобно ИБ-элементам гетерогенны по длине (0,5-3,0 тыс.п.н.), но на концах несут совершенные прямые повторы длиной в 31 п.н. /155/. По-видимому, именно они обеспечивают интеграцию Р-элементов в геном, являясь участками узнавания предполагаемой Р-специфичной транспоазы. Ряд данных свидетельствует о том, что транспоаза кодируется полным Р-элементом-длиной 3 тыс.п.н.: так, Р-элементы меньшего размера могут интегрироваться в геном только в присутствии полного Р-элемента /139,155/. Примечательно, что Р-элементы могут быть использованы как весьма эффективные векторы - с их помощью удается вводить в геном различные клонированные гены /139/.

В геноме человека несколько групп исследователей обнаружили одно доминирующее семейство ДРП, обозначенное как Крп 1-се-мейство: обработка тотальной ДНК эндонуклеазой KPh I выявила характерный набор повторяющихся последовательностей длиной 1,2, 1,5, 2,8, 3,4, и 4,6 тыс. п.н., которые в некоторых случаях являются субэлементами более длинных повторяющихся единиц /18,98,120,149/; последние обнаруживаются в различных участках Х-хромосомы и аутосом человека /149/. Одна из них, длинной 6,4 тыс.п.н., повторяющаяся в геноме (3-5)х10^раз была найдена на расстоянии 3 тыс.п.н. от З'-конца -глобинового гена человека /18,98/. Этот элемент, а также несколько других в определенной степени дивергированных клонированных копий данного повтора оказались гомологичными членам Крп 1-семейства африканской зеленой мартышки. По всей видимости, это семейство ДРП является общим для приматов /120/.

Крп. I-последовательности обнаруживают значительную степень дивергенции, причем представленность различных вариантов весьма различается в геномах обезьяны и человека. Существуют данные, что число копий этого семейства различается у разных индивидуумов; кроме того, на концах Крп 1-последовательностей найдены прямые повторы /88/. Все это может служить указанием на возможную мобильную природу этих элементов.

Использование явления симметричной транскрипции ЩГ, обнаруженное в случае дрозофилы /17/ (см. далее) позволило выявить типичные мобильные повторы в геноме мыши. ДИК геномных клонов гибридизовали с дсРНК А-типа, обнаруживаемыми в составе пре-мРНК и представляющими собой межмолекулярные РНК-дуплексы длиной более 400 п.н. /106/. Среди отобранных "положитель-ных"клонов наиболее детально были изучены последовательности, обозначенные как AI и А2, представленные в геноме соответственно 10^ и 2x10^ копиями /72/. Интересно, что разные линии и виды мышей сильно различаются по количеству копий А-элементов /112/.

Рестрикционное картирование последовательности AI длиной 5,6 тыс.п.н. показало, что она весьма напоминает гены т.наз. интерцистернальных А-частиц, т.е. один из классов эндогенных ретровирусов мышей. А-последовательность, как оказалось, соответствует известному мажорному семейству т.наз. EcoRI-повторов, составляющих от I до 3% генома мыши /27/. Эти повторяющиеся сегменты длиной 1,3 тыс.п.н., выявляемые после обработки тотальной ДНК мыши эндонуклеазой ЕсоЕЕ являются частью более длинных повторяющихся последовательностей размером 5,6 тыс. п.н. /124/.

В лаборатории Георгиева /72/ было показано, что область гомологии между разными геномными копиями А2 еще шире и достигает 7 тыс.п.н. При этом разные копии А2 (и в меньшей степени AI) различаются между собой гораздо сильнее, чем ВДГ дрозофилы. Особенно гетерогенней является 5*-область AI, равно как и концевые участки А2. На концах AI и А2 присутствуют ДКП, длиной соответственно 400 и более I тыс.п.н. /35,72/.

Недавно было показано существование в клетках асцитной карциномы Эрлиха кольцевых молекул ДНК, представляющих собой полноразмерные копии AI /72/. Это означает, что в недифференцированных клетках происходит не только транскрипция AI, но также, по-видимому, и обратная транскрипция соответствующих РНК, которая может быть связана с механизмом транспозиции А-элементов в новые места генома.

Следует, однако, заметить, что не все случаи транспозиции ЩГ и им подобных элементов могут быть связаны с обратной транскрипцией. Элементы типа обращенных повторов, по-видимому, реплицируются с помощью особых механизмов - например, путем непосредственного вырезания и встраивания в новые участки генома /6,155/.

Транспозиции мобильных элементов происходят, очевидно, весьма редко. Однако, в определенных условиях, частота внедрения, например, ЩГ дрозофилы в новые места генома может резко возрастать /I/. Хотя точные значения неизвестны, вероятность неактивированного переброса ЩГ оценивается величиной 10 . По-видимому7 более часто происходит перемещение (причем истинное перемещение) последовательностей с 0П на концах, однако, во всех случаях важная роль принадлежит различным клеточным факторам /6,24/.

КОРОТКИЕ РАССЕЯННЫЕ ПОВТОРЫ; ВЕЗДЕСУЩЕ ПОСВДОВАТЕЯЬНОСТИ ГЕНОМА МЛЕКОПИТАЮЩИХ.

Другим основным классом РП генома являются короткие повторы длиной 100-300 п.н. /8,94,152/. Они объединяют несколько индивидуальных семейств повторяющихся последовательностей с весьма различным числом копий. Некоторые семейства Насчитаем вают до 5x10 членов, тогда как другие образованы всего несколькими .копиями.

Первоначально количество семейств КРП и частота повторяемости их членов оценивалась лишь весьма приблизительно на основании анализа кинетики ренатурации геномной ДНК. Интерпретация таких данных сильно осложняется тем обстоятельством, что многие семейства КРП представлены родственными, но индивидуально различающимися членами, скорость гибридизации которых отличается от скорости ренатурации полностью комплементарных последовательностей. С другой стороны, члены разных семейств КРП в некоторых случаях обнаруживают степень гомологии,достаточную в определенных условиях для перекрестной гибридизации /94/. Изучение свойств индивидуальных фрагментов ДНК, полученных с помощью методов генной инженерии, позволило значительно уточнить имеющиеся сведения.

Клейном и сотр. /104/ были исследованы 18 различных клонированных повторов генома морского ежа. Число копий этих последовательностей составляло от 3 до 12500. Для 13 последовательностей не выявилось заметной дивергенции внутри образуемых ими семейств, в то время как для остальных 5 дивергенция среди родственных копий обнаруживалась. Оцениваемая ; частота повторяемости одного из клонированных повторов зависела от жесткости проводимого гибридизационного эксперимента и составляла от 20 до 400 копий на гаплоидный геном. Это указывает на существование по крайней мере 10-20 индивидуальных подсемейств данной последовательности в геноме морского ежа /146/. В противоположность этому, гибридизационный анализ наиболее представительного семейства КРП человека - A Lu.—семейства, насчитывающего свяше 300 тыс. членов (сщ далее), не выявил наличия в нем явно выраженных подсемейств /135/. Биологическое значение различий в степени консервативности разных семейств КРП неясно. Не исключено, что они отражают различия в механизмах амплификации и дисперсии разных представителей КРП.

Следует также заметить, что факт наличия структурных подсемейств не обязательно отражает функциональную гетерогенность последовательностей данного семейства. Можно предположить, что члены более консервативных семейств или являются эволюционно более "молодыми" или по какой либо причине испытывают более жесткое давление отбора, стабилизирующего структуру последовательностей данного вида.

Работы по клонированию коротких повторов млекопитающих были начаты параллельно с исследованием ЩГ дрозофилы. Было показано, что по крайней мере у приматов и грызунов КРП в отличие от таковых морского ежа объединяют весьма небольшое число семейств /57,93,107,137/.

В 1979 г. ряд индивидуальных КРП был клонирован в составе бактериальных плазмид. Так, Крамеров и сотр. /107/ провели отбор геномных клонов мыши, гибридизующихся с дсРНК В-типа /106/. Эти внутримолекулярные двуспиральные участки РНК были открыты в 1972 г. в составе пре-мРНК, причем,в отличие от межмолекулярных дсРНК-А,дсРНК-В короче (100-200 п.н.) и способны очень быстро ренатурировать после денатурации пре-мРНК, благодаря способности образовывать структуры типа шпильки /см.13/. Выделенные после обработки РНК-азой дсРНК-В уже могут быть денатурированы, так как при этом уничтожается петля, соединяющая взаимокомплементарные копии. Полученный таким образом меченный материал и был использован в качестве тест-пробы для гибридизации со случайным набором геномных клонов мыши.

Было установлено, что все множество клонов геномной ДНК мыши, гибридизующихся с дсРНК-В, распадается в основном на 2 индивидуальных семейства, оказавшихся доминирующими в геноме грызунов и получивших названия BI- и В2-семейств /107/. BI- и В2-элементы составляют соответственно половину и четверть всей дсРНК-В. Каждое из этих семейств представлено в геноме мыши примерно 5x10^ копиями. Это наиболее часто встречающиеся КРП. Почти каждый клонированный фрагмент геномной ДНК, имеющей длину 10 тыс.п.н., содержит в своем составе повторяющиеся элементы В-типа. Наличие BI-последовательностей показано с помощью ' гибридизационных методов в ДНК всех исследованных грызунов /9/. Описаны аналоги повтора В2 в геноме хомяка /81/ и в составе второго интрона гена соматотропина крысы /128/. Продемонстрировано соседствование последовательностей типа BI и В2 со стук-турными генами /161/. Все это дает основание называть В-эле-менты "вездесущими" повторами грызунов.

BI- и В2-элементы встречаются в геноме во взаимокомплементарных ориентациях. Наличием обращенных В-копий видимо объясняется происхождение большинства внутримолекулярных шпилечных структур в гяРНК. Последовательности-копии каждого из В-се-мейств не идентичны друг другу: отклонение от усредненной последовательности составляют около Q% /109,110/.

Длина усредненной-последовательности BI составляет 130 п.н. В их число не входит протяженная зона, богатая А'Т-пара-ми, которая всегда примыкает к BI-элементу, но различается по структуре и длине каждой конкретной его копии. Нуклеотидную последовательность этой зоны можно описать формулой АхСу, где х равен 3-7, а у равен 1-2. Поскольку в разных копиях BI эти участки сильно варьируют по длине и нуклеотидной последовательности, их нельзя рассматривать как часть повтора.

В2 по длине превосходит BI ж насчитывает 190 п.н. В отличие от BI, А'Т-концевая зона В2-последовательности весьма консервативна по структуре и ее можно считать частью повторяющегося элемента. ЕЕ- и В2-последовательности содержат в своем составе целый ряд примечательных участков, например, области гомологии с усредненными экзон-интронными (и наоборот) пограничными зонами, а также с усредненной последовательностью расчлененного промотора РНК-полимеразы Ш, установленной на основе анализа промоторов генов 5S рРНК и тРНК /65,69/. Последнее обстоятельство указывает на то, что повторы В-типа могут транскрибироваться РНК-полимеразой Ш. В BI, кроме того, имеются протяженные области гомологии с двумя малыми клеточными РНК - 4,5S РНК и 7S РНК и с участками начала репликации вирусов группы папова /10,93/, а в В2 - с малой ядерной РНК, обозначаемой как 4,5S РНК 1/110/.

Представляет интерес организация 3'-конца нуклеотидной последовательности В2. Она содержит до 4-х блоков ААТААА, которые, как известно, являются сигналами для полиаденилирования мРНК, а также последовательность ТСТТТ, часто соседствующую с участками терминации транскрипции РНК-полимеразы III /65/.

В геномах китайского хомячка и крысы было обнаружено семейство КРП В2-типа /81,82,128/. Интересно, что первые 61 нуклеотид этой последовательности соответствуют дивергирован-ному участку нуклеотидной последовательности между 47-м и 107-м нуклеотидами BI-элемента мыши.

Примерно в одно время с открытием В-семейств КРП грызунов в лаборатории Шмида /84/ было показано, что в геноме человека доминирует одно наиболее представительное семейство

КРП, на долю которого приходится от 30 до 50$ всех КРП человека. Электрофоретическое фракционирование денатурированной ДНК плаценты человека, подвергнутой отжигу при низких значениях CQt и обработанной затем экзонуклеазой SI выявило наличие дискретной полосы размером приблизительно 300 п.н. Более 60% полученных таким образом фрагментов ДНК расщеплялось эндонуклеазой ALul на 2 субфрагмента длиной 170 и 120 п.н., что с большой вероятностью указывало на существование индивидуального семейства повторяющихся последовательностей. Оно было названо ALu-семейством /84/.

ALu.-семейство составляет от 3 до генома человека, что соответствует 300000-500000 копиям данной последовательности /84/. При случайном характере распределения по геному члены ALu-семейства должны быть разделены участками ДНК длиной около 5 тыс. п.н. Поскольку среднее расстояние между КРП в геноме человека равно приблизительно 2200 п.н. /44/, каждый второй-третий повтор,по всей видимости,представляет собой А ^-последовательность. Эти рассуждения подтверждаются экспериментально. Так, изученный фрагмент ДНК человека длиной 56 тыс. п.н., содержащий 6 -, А^ G^-, £ - и /$ -глобиновые гены, содержит и 7 ALu.-последовательностей /34, 66/, а в клеточном онкогене человека (c-si-s), гомологичном онкогену вируса саркомы обезьян, длиной 12 тыс. п.н. обнаружено 3 Alu-последовательности, локализующиеся в двух ин-тронах /46/. Анализ случайно отобранных клонов ДНК человека и зеленой африканской мартышки также свидетельствует о том, что члены ALu-семейства наиболее многочисленны и широко диспергированы в геноме приматов /94/.

Индивидуальные члены ALu-семейства, как и большинство других семейств КРП не идентичны друг другу. Обобщенная и усредненная первичная структура вездесущей ALu -последовательности была установлена при анализе клонированных фрагментов ДНК человека, содержащих копии из этого семейства /22,53, 137/. Нуклеотидная структура индивидуальных клонированных ALu-последовательностей отличается от усредненной лишь на 10% /45/. Большинство вариаций сводится к точечным мутациям, имеющим случайное распределение в пределах 300-нуклеотидной последовательности. Два конца ALu-элемента,подобно концам В-элементов,отличаются по степени дивергенции. Менее консервативный конец представлен А'Т-богатой зоной, структура которой у разных членов семейства в большинстве случаев описывается формулой /N (A) h. /т » где А/ - любой нуклеотид (иногда более чем один), п - обычно 4 20, a fn 4-10 /94/.

При анализе первичной структуры выяснилось, что Alu-эле-мент, имеющий в длину 300 п.н. представляет собой несовершенный димер, образованный двумя тандемно расположенными копиями одной последовательности, длина которой составляет 135 п,н. Вторая копия содержит инсерцию длиной 31 п.н. (позиции 218250), которая отсз^тствует в первой копии. Оба мономера заканчиваются А'Т-богатой зоной ; внутри каждого из них .обнаруживается 14-нуклеотидный сегмент (позиции 41-53 и 176-188), имеющий структуру, сходную с областью начала репликации папова-вирусов /93/. Исследование усредненной нуклеотидной последовательности димерного ALu -элемента показало, что каждый его мономер обнаруживает довольно высокую степень гомологии с последовательностью BI грызунов и может считаться ее аналогом /82,109/. Особенно консервативной оказалась 40-нуклео-тидная последовательность, присутствующая как в обоих мономерах ALll (позиции 21-60 и 156-195), так и в В1-элементе ; именно эта последовательность содержит участок гомологии с областью начала репликации паповавирусов. Длина второго мономера в большей степени, чем первого соответствует длине BI-последовательности грызунов, которая содержит участок, эквивалентный по длине (но не по структуре) его 31-нуклеотидной ин-серции. Несмотря на очевидную родственную близость ALu- и BI-последовательностей они не гибридизуются в жестких условиях, что обусловлено спецификой их структурных различий /151/.

ALu -подобные последовательности обнаружены в геномах других приматов. Так,у зеленой мартышки /48,74/ выявляются КРП, очень похожие на /?/^-семейство по структуре и степени повторяемости в геноме. Около 75$ библиотеки генов зеленой мартышки гибридизовалось с клонированной -последователь с ностью человека. Это соответствует 1,8x10 копии гомологичной последовательности на гаплоидный геном. Анализ первичной структуры клонированного ALu-элемента мартышки продемонстрировал ее 84%-ную гомологию с усредненной ALu -последовательно-ностыо человека /74/.

В большинстве случаев элементы В-типа и -последовательности фланкированы с обеих сторон короткими прямыми повторами размером от 8 до 20 п.н. /94/. Структура этих повторов варьирует в пределах семейства, будучи уникальной для каждой конкретной копии - т.е. они не являются частью собственно ALu , BI или В2. Такие особенности строения являются типичными для подвижных элементов генома. Аналогично прямым повторам, ограничивающим бактериальные транспозоны или инсерционные последовательности и мобильные элементы эу-кариот прямые повторы, фланкирующие вездесущие КРП могут быть . результатом дупликации уникальной последовательности ДНК в области внедрения повтора в хромосому /29,64/. Это позволяет предположить, что А1м- и В-повторы являются подвижными элементами генома эукариот /8,72,82,110,165/.

Хотя описанные вездесущие последовательности составляют основную массу КРП генома млекопитающих, они не исчерпывают многообразие их семейств. Помимо АЫ в геноме приматов обнаружены и другие, гораздо менее представительные семейства КРП /45,67/. Хейгвуд и соавт. /78/ обнаружили в составе кластера /в -глобиновых генов мыши, имеющего в длину 65 тыс. п.н. три отдельных, не гибридизующихся между собой семейства

КРП ; каждая из трех повторяющихся последовательностей была ' представлена в этом фрагменте ДНК как минимум двумя копиями. Сходные данные по распределению этих повторов внутри -гло-бинового кластера были получены на двух линиях мышей - BAIB/C и C57BI/I0. Описанные семейства получили наименования <2., Ь и с ; их связь с семействами В-элементов остается невыясненной. Клонированные а- и Ь -последовательности гибридизова-лись почти со всей фаговой библиотекой генов мыши, что позволяет оценить вероятную повторяемость каждой из этих последовательностей в 2x10 . Не исключено, что описанные КРП рассеяны главным образом в области сателлитной ДНК мыши /78/.

Представители 5-ти различных семейств КРП обнаружены в 20-ти местах внутри сегмента ДНК кролика длиной 44 тыс.п.н., содержащего ft -глобиновые гены /67,150/. Лишь для одного семейства, получившего обозначение "С" показана гибридизация в мягких условиях с /4/^-человека. С-элементы, так же как ALu способны транскрибироваться ui i/'df-o РНК-полимеразой Ш (см. далее).

Геном млекопитающих содержит также от 100 до 2000 локусов, комплементф^ных малым ядерным РНК U I, U2, U3, которые, как предполагают, участвуют в сплайсинге пре-мРНК /117/. Были получены геномные клоны, содержащие псевдогены этих РНК /165/. Оказалось, что вездесущие повторы не единственные среди КРП, имеющие на одном конце А*Т-богатую область и фланкированные прямыми повторами: псевдогены UI-, U2-, I) 3-РНК, а также ген U-6-PHK в геноме человека также обладает подобной структурой Д80/. Перед псевдогенами часто локализуются повторы ALu- (у человека) и В-типов (у мыши) /47,126/, причем вездесущие повторы и U-гены имеют во всех случаях одинаковую ориентацию.

В настоящее время в различных организмах идентифицированы еще несколько семейств КРП, однако все они охарактеризованы значительно хуже, чем последовательности AUt- и В-типов. Так, определена первичная структура одного повторяющегося элемента из генома ксенопуса /154/ и нескольких - из генома морского ежа /131/. Повтор ксенопуса имеет длину 77 п.н. и образует небольшие блоки, рассеянные по геному; прямых повторов, фланкирующих элемент найдено не было. В геноме морского ежа, по-видимому, отсутствуют столь богато представленные повторы как ALu, BI и В2, однако в этом объекте выше разнообразие повторяющихся элементов. В связи с тем, что клонированные повторы морского ежа получены без прилежащих районов, пока не известно, обладают ли они структурными особенностями мобильных элементов.

Интересно, что у дрозофилы вопреки ранним представлениям /39/ также имеются в геноме КРП. Один из них, получивший название11 суффикс" недавно обнаружен на 3'-конце гена Н55 в 7В оласти /158/. Это короткий повтор, имеющий длину 150

200 п.н. и представленный в геноме несколькими сотнями копий. Характерно то, что он выявляется на 3'-конце примерно 2% всех мРНК дрозофилы, хотя та мРНК?в которой он был первоначально обнаружен,составляет не более 0,1$ всей мРНК.

В геномах эукариот КРП диспергированы между функционирующими генами, в интронах самих генов, а также в последовательностях сателлитной ДНК. Было изучено распределение КРП в межгенных участках разных организмов: например,внутри^ -глоби-новых кластеров мыши /78/, кролика /66,83,150/ и человека /66/, а также с^-глобинового кластера человека /66/. Каждый из изученных генных кластеров состоит из кодирующих участков, одного или нескольких псеццогенов и различных представителей КРП. Пять генов у^-глобинового кластера человека экспрессируются в следующей временной последовательности: £ - в эмбрионах, А^ и Q-^ в процессе развития плода, 8 и ft - во взрослом состоянии. У кролика два гена экспрессируются в эмбрионах и один у взрослых особей, а у мыши наоборот, два - во взрослом состоянии и один - в эмбрионах /89/.

Несмотря на то, что можно проследить некоторые закономерности в организации КРП внутри кластеров функционирующих генов - например С-семейство кролика группируется в области эмбриональных генов, а в пределах /2> -глобинового кластера человека ALu-элементы не обнаруживаются в промежутках между одновременно экспрессирующимися генами /152/, функциональная значимость этих наблюдений остается неясной.

Последовательности, составляющие индивидуальные семейства КРП обнаруживают лишь небольшую степень дивергенции как в пределах данного генома, так и в геномах относительно близкородственных групп млекопитающих - таких, например, как род мышь или отряд приматы /152/. Это резко отличает КРП от последовательностей сателлитной ДНК, лишь самые общие черты строения которых похожи у родственных организмов. С другой стороны, при сравнении семейств приматов и грызунов наряду с определенным сходством обращают на себя внимание некоторые отличия, и, в первую очередь, разница в многообразии семейств КРП в этих геномах. Возможно, это указывает на то, что индивиду- ' альные семейства КРП сформировались внутри геномов грызунов и приматов уже после того, как их эволюционные пути разошлись /цит. по 152/.

Исследование гомологии между повторами разных организмов позволяет определить таксономические и <|шюгенетические взаимоотношения между этими организмами /56/. Однако, при анализе индивидуальных последовательностей может иметь место значительное несоответствие между степенью сходства повторов у разных организмов и таксономической близостью последних, на что, например, указывает сравнение клонированного повтора BI с аналогичными повторами других грызунов /9/.

Механизм образования семейств КРП, очевидно, включает амплификацию первичных последовательностей ДНК и их дисперсию в геноме. Концептуально данная проблема неоднократно обсуждалась /19,129,147/. Неравный кроссинговер /которым может объясняться амплификация сателлитной ДНК вряд ли подходит для объяснения амплификации и дисперсии КРП. Более приемлемой представляется модель, предлагающая конверсию генов /см,152/.

Вместе с тем,одной лишь конверсией генов нельзя исчерпывающе описать дисперсию различных КРП в геноме. Изучение первичной структуры BI, В2 и A Lu. и их окружения /45,71,72, 110,137/ позволило предположить, что эти последовательности так же как мобильные ДРП являются подвижными элементами генома эукариот /72,82,110,165/, хотя прямой анализ здесь затруднен из-за большого числа копий и отсутствия доступного метода гибридизации с политенными хромосомами. В таком случае подобно ДРП (ЩГ дрозофилы, Tyl-элементы дрожжей, прорет-ровирусные последовательности и т.п.) КРП эукариот,по всей видимости^распространились (а может быть и продолжают распространяться) по геному путем транспозиции. Однако,структурные различия между этими двумя типами рассеянных повторов предполагают существование различий в механизме их перемещения. ДКП проретровирусов, МДГ и сходных с ними последовательностей ограничены короткими обращенными повторами размером от 2 до 17 п.н., которые на обоих концах имеют нуклеотидн TG.СА во всех исследованных случаях /64,160/. Поскольку бактериальные транспозоны и инсерционные последовательности имеют аналогичные инвертированные повторы, участвующие в перемещении этих лабильных элементов по гежщу, считают, что описанные структуры также обеспечивают мобильность ДРП /8/.

КРП не обнаруживают в своем составе фланкирующих обращенных повторов. В то время, как короткие прямые повторы, ограничивающие ДРП дрозофилы и дрожжей и проретровирусные ДНК в клетках птиц и млекопитающих насчитывают всего 4-тб нуклеоти-дов, аналогичные структуры в ALu.-, BI- и В2-семействах КРП, а также в рассеянных псевдогенах низкомолекулярных РНК имеют в длину 8-20 п.н. /94/. Поскольку сами КРП приблизительно равны по длине ДКП, ограничивающим ДРП, не исключено, что в ряде случаев они могут выполнять функции ДКП для неких еще не идентифицированных транспозоноподобных элементов генома млекопитающих /цит. по 94/.

По всей видимости в большинстве случаев транспозиция вездесущих КРП происходит при участии обратной транскрипта-зы. Матрицей могут служить малые цитоплазматические BI- и В2-содержащие поли (А)+РНК (см. далее), а в качестве затравки выступать олиго(U)-участки, имеющиеся в составе РНК цитоплаз' мы. Недавно показано существование в клетках приматов коротких экстрахромосомных ДНК, содержащих И/^-элементы /III/. Такие ДНК наряду с низкомолекулярными РНК могут соответствовать промежуточным продуктам транспозиции.

Хорошим свидетельством в пользу участия обратной транскрипции в образовании инсерций является структура некоторых псевдогенов, которые лишены интронов /97,125/. Такая структура возможна в том случае, если матрицей для синтеза служит зрелая мРНК, также не содержащая интронов. В псевдогенах малых ядерных РНК Ul, U2, и U3 часто представлен только 5'-конец. Это, по-видимому, связано с тем, что 3*-конец свободной РНК образует структуру типа шпильки, используемую ревер-тазой в качестве затравки для синтеза ДНК, и поэтому не представлен в ДНК-транскрипте. На возможность такого объяснения указывают опыты с использованием бесклеточной системы обратной транскрипции /165/.

Т.обр. складывается мнение, что все типы рассеянных повторов могут оказаться подвижными инсерционными элементами. По-видимому, именно возможность реплицироваться и встраиваться в новые места генома обусловливает их высокую повторяемость .

ЭКСПРЕССИЯ РАССЕЯННЫХ ПОВТОРЯЮЩИХСЯ ЭЛЕМЕНТОВ ГЕНОМА ЭУКАШОТ.

РП относятся к транскрипционно активным элементам генома: в составе молекул гяРНК и цитоплазматических РНК выявляются повторяющиеся последовательности, гомологичные РП ДНК /см. 94 и 152/. В некоторых транскриптах такие последовательности встречаются более чем I раз, часто в виде взаимокомплементарных копий, которые способны образовывать двуспиральные структуры /13,71/. Как внутримолекулярные шпильки, так и межмолекулярные РНК-дуплексы были выделены в виде устойчивой к РНК-азе фракции двуспиральных РНК (дсРНК) /см,13/. Было показано, что взаимокомплементарные РНК-копии, на долю которых приходится до 20% суммарной пре-мРНК обязаны своим происхождением либо инвертированной ориентации повторов.в геноме либо симметричной транскрипции обеих цепей данной последовательности /17,44/. В молекулах гяРНК, так же как -и в геноме имеет место чередование последовательностей, транскрибированных с повторов и уникальных участков /36,168/. Определенные семейства РП транскрибируются в виде дискретных по размеру РНК, образующих самостоятельные классы молекул. Между частотой повторяемости различных последовательностей и частотой встречаемости их в РНК прямой корреляции не обнаружено: некоторые относительно редкие геномные повторы являются в РНК более представительными, чем те, которые характеризуются более высокой частотой повторяемости в ДНК /94/.

Значительную часть поли(А)+РНК ряда эукариотических организмов составляют транскрипты с ДРП /61/. Эти РНК имеют кэпированный 5'-конец /138/ и, видимо, синтезируются РНК-полимеразой П.

В клетках культуры дрозофилы до 2% всей поли(А)+РНК синтезируется на матрице ЩГ1-последовательности, представляющей одно из семейств длинных мобильных повторов. Закономерности транскрипции ЩГ1 были подробно изучены /7,17,71/. Оказалось, что главным продуктом транскрипции является полноразмерная копия одной из цепей ВДГ. Наряду с ней в составе поли-аденилированной РНК цитоплазмы присутствуют и более короткие цепи, образующиеся, по-видимому, в результате сплайсинга 5'-и 3'-концов первичного транскрипта. Транскрипция начинается внутри 5»-ДКП и продолжается в область З'-ДКП. 8 -последовательности дрожжей так^же инициируют и терминируют транскрипцию Ту1 /59/,

Особенностью транскрипции 1УЩГ является то, что в ядерной и цитоплазматической полиаденилированной РНК присутствуют последовательности, комплементарные обеим цепям элемента /17/. Можно думать, что наряду с главным направлением транскрипция идет и в противоположном направлении, т.е. она носит симметричный характер. Следует, однако, подчеркнуть, что концентрация главного транскрипта примерно в 20 раз превышает концентрацию дополнительного /17/, поэтому более точно следует говорить о частично симметричной транскрипции ЩГ. Интересно, что в пределах ДКП различия в интенсивности транскрипции между двумя цепями значительно ниже чем в пределах собственно ОДЦГ. Возможно, что в цепи минорного транскрипта большинство инициированных молекул РНК быстро обрывается внутри ДКП или вблизи от него.

Частично симметричная транскрипция является характерным свойством ВДГ - обычные однокопийные гены этим свойством не обладают.

ДКП, присущие как ретровирусам, так и ВДГ играют важную роль в их репликации и транскрипции. Различные мобильные элементы и разные провирусы отличаются по силе промоторов,лежащих в ДКД /162/. У экзогенных вирусов она обычно много выше, чем у эндогенных, что , вероятно, связано с присутствием в их ДКП т.наз. усилителей ( e-h.kahc.e-r) - последовательностей, резко увеличивающих эффективность транскрипции /76,100/.

ДКП мобильных элементов подобно аналогичным участкам проретровирусов содержат в обеих цепях характерные сигнальные участки. Это ТАТА-блок или последовательность Хогнесса /21,68,118/, указывающая на наличие точки инициации транскрипции, находящейся от нее на расстоянии 25-30 п.н. и ААТААА-последовательность, которая, как предполагают, определяет точку полиаденилирования транскрипта, находясь от нее на расстоянии 20 п.н. / 12/. При этом более совершенные, "канонические" сигналы являются в цепи минорного, а не главного транскрипта. Предполагается, что как и в случае ретровирусов, именно минорный транскрипт служит матрицей для синтеза "-" цепи репликативной ДНК мобильных элементов /71/.

Информационное содержание ЩГ пока неясно. В бесклеточной системе удалось протранслировать полиаденилированную РНК, комплементарную ДНК одного из видов ЩГ /62,63/, однако с транскриптами других ВДГ такие попытки успеха не принесли. Было показано, что лишь малая доля поли(А)+РНК, комплементарной ЩГ, обнаруживается в составе полисом, в то время как большая часть транскриптов связана с отличными от полисом РНП-комплексами /7,71/.

Экспрессия AI генов млекопитающих происходит на ранних стадиях эмбриогенеза, а во взрослых тканях практически не детектируется /99/. В культивируемых раковых клетках наблюдается активация транскрипции последовательностей А-типа /96/, причем А2 транскрибируется слабее, чем AI, даже в раковых клетках.В опытах по гибридизации тотальной поли(А)+РНК с разделенными цепями клонированных последовательностей AI и А2 было показано, что их транскрипция как и в случае МДГ является частично симметричной /72/, Недавно последовательности гомологичные А2- и Kph I-повторам были обнаружены в составе полисомной мРНК клеток человека /105/.

В РНК ооцитов морского ежа представлено около 80$ КРП и 35$ ДРП генома /36/, причем на примере 9 клонированных повторов показано, что в ядерной РНК присутствуют копии обеих цепей каждого повтора. Существуют данные, свидетельствующие о том, что большинство уникальных полиаденилированных РНК морского ежа содержат в своем составе транскрипты с КРП, причем частотные спектры встречаемости транскриптов и повторяемости соответствующих последовательностей в геноме не обязательно совпадают ; в составе различных молекул полиаденилиро-ванной РНК участки,транскрибированные с КРП одного и того же семейства,могут быть связаны с различными уникальными транскриптами /37/.

Представленность транскриптов ряда семейств повторов в ядерной РНК клеток кишечника морского ежа оказалась отличной от таковой в ядерной РНК клеток гаструлы /145/. Это указывает на селективную аккумуляцию транскриптов различных РП в разных тканях, и может объясняться дифференцированной транскрипцией и/или различной стабильностью транскриптов, частью которых эти повторы являются» В свою очередь, тканеспе-цифичный характер транскрипции различных семейств КРП можно трактовать и как причину и как следствие дифференцированной транскрипции генов в клетках разных тканей, поэтому вопрос о конкретной роли КРП в экспрессии эукариотических генов остается открытым.

Тот факт, что КРП соседствуют в геноме с последовательностями, кодирующими белок и их транскрипты обнаруживаются в составе ядерных РНК послужил основанием для предположения, что некоторые повторяющиеся последовательности функционируют в ДНК как регуляторные сигналы транскрипции, а в РНК как регу-ляторные сигналы процессинга первичных транскриптов /26,43,92, 93,140/. Однако, по-видимому, не следует рассматривать РП только как контролирующие элементы генома ; не исключено, что часть их участвует в генетических процессах, связанных с репликацией и реорганизацией генома /2/.

Вездесущие КРП млекопитающих богато представлены в клеточной РНК, особенно в новообразованной ядерной РНК. Например, последовательности ALu. -семейства составляют от 18 до 25$ гяРНК клеток НеЬа /92/. Размеры /Ни -транскриптов варьируют от 100 до 5000 п.н. /58,92,93/. По крайней мере часть транскрибированных /^^-последовательностей обнаруживается в составе внутримолекулярных и межмолекулярных РНК'РНК-дуплексов, обязанных своим происхождением обращенной ориентации последовательностей-копий и/или симметричной транскрипции обеих цепей АШ-Ш. /94/.

До 2% всей ядерной новообразованной РНК мыши составляют транскрипты BI- и КЗ-элементов /107/. При этом около четверти суммарной BI- и В2-РНК образуют дсРНК В, т.е. представляют собой сближенные инвертированные копии ; остальные 3/4 В-транскриптов существуют независимо друг от друга.

ALu. -транскрипты обнаруживаются в составе как полиадени-лированной, так и неполиаденилированной РНК цитоплазмы /58,91, 129,157/, однако представленность их здесь гораздо ниже, чем в молекулах гя РНК /58,91/ ; процент гибридизации ядерной РНК с ALu-jm по крайней мере в 10 раз превышает таковой для РНК цитоплазмы. Аналогичные данные получены для ядерной и цито-плазматической РНК мыши /140, 141/.

Как известно, для ряда клонированных индивидуальных генов показано присутствие КРП в составе интронов. Например, в инт-роне гормона роста крысы содержится 2 элемента В2-типа /128/, а в двух интронах клеточного онкогена (c-s>/s) человека локализованы 3 ALu -последовательности /46/. Т.обр. вездесущие повторы В-типа входят в состав транскрипционных единиц РНК-полимеразы П. По-видимому они чаще локализуются в тех областях первичных транскриптов, которые подвергаются деградации при процессинге РНК, однако каких-либо определенных закономерностей в локализации КРП внутри транскрипционных единиц РНК-поли-меразы П пока не выявлено.

Наряду с высокомолекулярными транскриптами в цитоплазме клеток млекопитающих выявляются самостоятельные транскрипты вездесущих КРП, образующие дискретные классы низкомолекулярных цитоплазматических РНК. Были получены данные, указывающие на то, что члены ALu- и В-семейств возможно транскрибируются РНК-полимеразой Ш в виде коротких РНК, образующих отдельные классы цитоплазматических молекул. Один из них, обозначенный как 4,5 S РНК /91/ был идентифицирован в клетках китайского хомячка благодаря способности этих РНК образовывать гибридные дуплексы с полиаденилированными молекулами гяРНК и мРНК. Анализ нуклеотидной последовательности 4,5SРНК грызунов /79,82/ показал, что она наделена характерными чертами транскрипта РНК-полимеразыШ: эта молекула длиной 96 нуклеотидов имеет на 5»-конце структуру pppGpp, а на 3»-конце - олиго (U) различной длины. На 5*-конце выявляется 26-нуклеотидная область, на 65% гомологичная усредненной BI-последовательности грызунов. Эта гомология прерывается 10-нуклеотидной последовательностью и затем вновь наблюдается уже с частотой совпадений QQ% на протяжении 50-ти 3*-концевых нуклеотидов. Т.обр. гены 4,5 5РНК можно рассматривать как дивергировавшие копии BI-элемента. Хотя 4,5SPHK обнаруживается как в цитоплазме, так и в составе ядерных РНП-комплексов остается неясным, происходит ли vivo ассоциация 4,5 5РНК с полиаденилированны-ми гяРНК и цитоплазматическими РНК.

Интересно, что структурное сходство между 4,53РНК мыши и китайского хомячка выражено гораздо сильнее (всего 3 замены на 90 нуклеотидов), чем между усредненными последовательностями BI-ДНК этих видов. В обоих случаях 4,5SPHK являются транскриптом одной и той же цепи определенной BI-последовательности, которая служит функционирующим геном данной РНК и относится по всей видимости к подсемейству консервативных В1-элементов.

В клетках человека 4,5SРНК не обнаружены, однако для клеток Hela и многих нормальных тканей характерен другой дискретный класс низкомолекулярных цитоплазматических РНК, способных гибридизоваться с ^&-ДНК. Это т.наз. 7SPHK. Длина молекулы этой РНК составляет 295 нуклеотидов ; как и в случае 4,5SРНК наблюдается значительная гомология ее нуклеотидной последовательности с А1м человека и BI-последовательностью грызунов. Имеются данные, указывающие на консервативность последовательности 75РНК в период относительно недавней эволюции /60/.Эти же данные служат еще одним экспериментальным подтверждением того, что /IZ^-подобные элементы характерны не только для млекопитающих, но и для других классов позвоночных. Вместе с тем, анализ гибридных дуплексов между 75 РНК и клонированной ALu-ЩИ показал их несовершенную структуру, свидетельствующую о том, что 7£э РНК возможно кодируется каким-то определенным подсемейством ALu -последовательностей /166/.

В клетках крысы был обнаружен еще один класс низкомолекулярных РНК, получивший название 4,5SPHK I /136/. Молекулы этой РНК имеют в длину 99 нуклеотидов и обнаруживают значительную гомологию с В2-элементом грызунов. При этом отдельные участки нуклеотидной последовательности В2 в составе 4.5S РНК I как бы "перетасованы" в сравнении с геномной последовательностью.

Биологические функции перечисленных РНК неизвестны. В отличие от не вполне идентичных ALu- и В-элементов, каждый класс низкомолекулярных РНК представлен?видимо^идентич-ными копиями. Это может свидетельствовать о том, что низкомолекулярные датоплазматические РНК эукариот кодируются какими-то конкретными членами ALu- и В-семейств повторов.

Многие, но не все клонированные /^-последовательности могут служить матрицами для РНК-полимеразы Ш в бесклеточной-системе транскрипции /52/. При этом наблюдается образование дискретных классов молекул низкомолекулярных РНК /53,58,129/. Детальное картирование показало, что точка начала транскрипции близка или совпадает с первым нуклеотидом /^-последовательности /53/. ALu. транскрибируется полностью, причем терминация цепи наблюдается за пределами А'Т-богатой зоны в области уникальной ДНК. Каждая последовательность-копия ALoc-семейства видимо продуцирует один или, по крайней мере, небольшое число транскриптов определенной длины. При этом транскрипты различных копий ALu. различаются по длине, что связано с терминацией транскрипции ALu. в различных уникальных последовательностях на различном расстоянии от А'Т-зоны повтора /52,67/.

Хотя ALu.-элемент состоит из двух похожих мономерных единиц, транскрипция в бесклеточной системе всегда начинается только с первого мономера. По предположению Элдера и соавт. /58/ это связано с наличием в первом мономере внутренней контрольной последовательности для РНК-полимеразы Ш. Известно, что контрольные участки транскрипции обычно локализуются внутри транскрипционных единиц РНК-полимеразы Ш /53/. Усредненная /^^-последовательность имеет в своем составе сегмент 5*-GrAGTTCPu^ACrACC-З' (примерно в районе 75-го нуклеотида), структура которого весьма близка к последовательности 5'-(KJOTTCGANNCC-S', которой приписывают роль усредненной про-моторной последовательности РНК-полимеразы Ш. Указанный сегмент отсутствует во втором мономере ALu\гомологичная последовательность здесь прерывается нуклеотидными инсерциями. Терминация транскрипции ALu. происходит в олиго(Т)-кластере с числом мономеров > 4, подобно тому, как это наблюдается на других матрицах РНК-полимеразы Ш /53/.

Аналогично членам ALu -семейства последовательности В2 (но не BI) могут служить матрицей для транскрипции i/tit-o РНК-полимеразой Ш /81/. При этом также образуются декретные по длине низкомолекулярные РНК. Кроме того, подобные РНК были выделены из живых клеток /81/. Транскрипция начинается с первого нуклеотида.В2-последовательности и заканчивается в олиго(Т)-участке А'Т-зоны повтора. В некоторых В2-копиях этот участок терминавди отсутствует, вследствие.чего считывание продолжается за пределы А*Т-зоны повтора и заканчивается уже в области прилежащей уникальной последовательности ДНК. В этом плане В2-элементы весьма напоминают первый мономер димерных /(/^-последовательностей, в то время как В1-элемен-ты ведут себя аналогично второй их части,которая, по-видимому, не содержит инициаторных участков РНК-полимеразы Ш /81,58/.

Возможно, некоторые типы транскриптов КРП, продуцируемые РНК-полимеразой Ш, имеют отношение к механизму их перемещения по геному - например, выполняют роль матриц для образования репликативных форм повторов в схеме с обратной транскрипцией /87,165/.

Наряду с дискретными по размеру неполиаденилированными транскриптами при гибридизации меченой BI- или В2-ДНК с фракционированной по размеру РНК-цитоплазмы выявляется низкомолекулярная BI- и В2-содержащая поли(А)+РНК /108/. Эта фракция гетерогенна по длине - ее размеры варьируют от 200 до 400 нуклеотидов. Вариабельность размера можно в значительной мере приписать вариабельности поли(А)-области, размеры которой колеблются от нескольких десятков до 200 нуклеотидов. Гибриды меченой малой В2- и BI-PHK с соответствующими ДНК стабильны в присутствии панкреатической РНК-азы, что предполагает отсутствие в этих РНК сколько нибудь протяженных последовательностей, отличных от поли(А) и В-элементов. Содержание низкомолекулярной полиаденилированной В2-РНК значительно выше, чем содержание аналогичной BI-PHK. Вместе с тем, их количества в опухолевых клетках (рак Эрлиха, клетки МОРС I04E) во много раз выше, чем в клетках нормальной печени. Эти РНК не входят в состав полисом, а обнаруживаются исключительно во фракции свободных РНК.

Пока нет точного ответа на вопрос образуются ли малые полиаденилированные РНК в результате процессинга тяжелых ядерных РНК или синтезируются независимо от них. Однако, недавно полученные данные по чувствительноститранскрипции В-элемен-тов к УФ-облучению /72/ позволяют оценить размеры соответствующих им транскрипционных единиц (т.е. размер мишени облучения). В условиях, когда синтез BI- и В2-РНК,имеющих размеры пре-мРНК и мРНК полностью подавляется7синтез малых РНК остается неизменным. Это говорит в пользу того, что малые В-содержа-щие РНК образуются независимо от высокомолекулярных транскриптов, возможно, при участии РНК-полимеразы Ш. С таким предположением согласуются и вышепреведенные данные, свидетельствующие о том, что клонированные А 1ц человека /53/ и В2 хомяка /81/ служат хорошими матрицами для РНК-полимеразы Ш в системе viiro .

Наряду с изучением первичных транскриптов, содержащих КРП, тщательно исследовался вопрос об организации этих последовательностей в мРНК эукариот. Рысков с соавт. /141/ одними из первых обнаружили присутствие в мРНК мыши участков, гомологичных двуспиральной фракции пре-мРНК, на основании чего было сделано предположение об участии двуспиральных шпилечных структур в процессинге пре-мРНК - возможно, в качестве сигнальных участков расщепления специфических нуклеаз.

В работах, проведенных на мРНК ксенопуса .было показано, что последовательности, транскрибированные с уникальных и повторяющихся участков генома перемежаются между собой в пределах целых молекул /40/.Позднее, исследуя мРНК, кодирующую кератин пера птиц, Локкет я соавт. /119/ обнаружили на 5»-конце этих молекул участки, транскрибированные с повторов ДНК, а на 3»-конце ' последовательности, транскрибированные с уникальной ДНК.

В экспериментах с клонированным фрагментом ДНК диктио-стеллума, содержащим одновременно уникальную и повторяющуюся последовательности генома, около 1% полисомных РНК гибридизо-валоськак с повторяющейся, так и с уникальной частями, причем оказалось, что участки, транскрибированные с одного и того же семейства повторов входят в состав нескольких различных мРНК /101/. Аналогично, последовательности, транскрибированные с уникальных и повторяющихся участков генома соседствуют в цитоплазматической поли(А)+РШ( мыши /114/ и эмбрионов морского ежа /37/.

В плане предполагаемого участия вездесущих повторов в экспрессии эукариотических генов особый интерес представляет исследование структуры и организации В-элементов млекопитающих в составе мРНК, поскольку при этом выявляются новые закономерности, связанные с их функционированием. Наличие этих элементов в составе полиаденилированных РНК было продемонстрировано в гибридизационных экспериментах с суммарной дсРНК /141,142/, дсРНК-В /106/ и клонированными BI-, В2- и ALol-Щ. /58,108,141/. Однако, во всех этих случаях гибридизация могла объясняться частичной гомологией между повторяющимися элементами В-типа и поли (А) "'"РНК. Поскольку присутствие В-последо-вательностей в мРНК является или отражением структуры генома, т.е. непосредственного соседствования последовательностей структурных генов и повторяющихся участков генома и/или есть результат процессинга и сплайсинга пре-мРНК, в каждом конкретном случае организация этих повторов внутри транскрипта может иметь свои особенности.

В отличие от пре-мРНК, молекулы мРНК,по-видимому, содержат только одну из комплементарных цепей дсРНК, причем содержание этих последовательностей в мРНК оказывается на порядок ниже, чем в пре-мРНК /58,91/. Открытым остается вопрос о том, какие именно цели взаимокомплементарных транскриптов вездесущих повторов и в какой степени представлены в мРНК эукариот ; также неясны конкретная локализация и взаимное расположение кодирующих и повторяющихся элементов внутри молекулы мРНК. Все эти вопросы могут быть решены только при условии получения исследуемых транскриптов в гомогенном состоянии. Последняя задача в настоящее время выполнима благодаря использованию новых методических приемов, включающих клонирование соответствующих РНК и определение их первичной структуры.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

МАТЕРИМЫ И МЕТОДЫ

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Иванов, Павел Леонидович

ВЫВОДЫ

1. Исследованы 4 клонированные в составе длазмиды /э£/?322 индивидуальные последовательности кДНК, соответствующие мажорной мРБК печени мыши, содержащей повторяющийся элемент В2. Проведено рестрикционное картирование вставочных фрагментов. Определены нуклеотидная последовательность 3»-концевой области, а также размер и функциональная топография клонированной мРНК.

2. Популяция молекул РНК, содержащих последовательности, гомологичные вездесущим повторяющимся элементам В-типа составляет не менее 1-1,5% суммарной цитоплазматической поли(А)+РНК печени мыши. По крайней мере некоторые из таких BI- и В2-содержащих транскриптов могут быть отнесены к информационным РНК, поскольку они детектируются в составе высо коочищенных полисом печени мыши. Последовательности BI- и В2-типа, по-видимому, не встречаются вместе в составе одной и той же мРНК.

3. В цитоплазматической полиаденилированной РНК печени мыши среди транскриптов, содержащих копии повторяющегося элемента В2 обнаружен дискретный доминирующий класс молекул^ обозначенных нами как В2+мРНКх. Природа этой РНК неизвестна. Она имеет размер около 2 тысяч нуклеотидов, составляет 0,5% суммарной поли(А)+РНК цитоплазмы и является основным компонентом полиаденилированной В2+РНК полисом. В2+мРНКх по-видимому типична для некоторых (возможно многих) нормальных тканей мыши, в то время как в недифференцированных раковых клетках ее синтез не происходит.

4. В2+мРНКх содержит полную копию геномного В2-эле-мента, имеющую незначительную дивергенцию от усредненной

В2-последовательности и расположенную в 3'-концевой нетран-слируемой зоне на расстоянии 54 нуклеотидов от терминаторно-го кодона TGA. 3'-концевая локализация В2-элемента, по-видимому, является общей для большинства В2-содержащих мРНК. Внутри изученной мРНК В2-транскрипт соседствует с уникальной или слабоповторяющейся последовательностью.

5. В ядерных пре-мРНК присутствуют копии обеих цепей В2-повтора. Во всех цитоплазматических и полисомных В2-со-держащих РНК клеток печени мыши и асцитной карциномы Эрлиха представлена лишь одна цепь В2-элемента т.е. одна его ориентация, совпадающая с той, которая определена для В2+мРНКх. Универсальная ориентация В2-копий в составе зрелых РНК-тран-скриптов названа нами "канонической". В канонической ориентации В2 несет ряд функционально значимых участков - в том числе сигнал полиаденилирования транскриптов, что указывает на возможное использование сигнальных участков В2-последова-тельности в процессах созревания некоторых типов мРНК,

6. Разработанный нами метод позволяет определять функциональную ориентацию любой клонированной последовательности генома и может быть использован в дальнейших структурно-функциональных исследованиях генетического аппарата эукариот.

Выражаю глубокую и искреннюю благодарность Алексею Петровичу Рыскову за глубокое и всестороннее руководство, неустанную заботу и терпение, и Георгию Павловичу Георгиеву за повседневное внимание к работе, ценные советы и поддержку.

Я признателен Д.А.Крамерову за помощь в проведении отдельных экспериментов и участие в обсуждении полученных результатов.

Сердечно благодарю всех сотрудников Лаборатории биосинтеза нуклеиновых кислот за доброжелательное отношение.

112

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Иванов, Павел Леонидович, 1984 год

1. Беляева, E.C., Пасюнова, Е.Г., Гвоздев Б.А., Ильин Ю.В., Амосова И.С., Кайданов Л.З. Транскрипции мобильных диспергированных генов у Drosophila melanogaster , выявляемые С помощью селекции. Генетика, 1981, т. 17, К? 9, с. 1566-1580.

2. Гвоздев В.А. Организация генома у эукариот. Молек. биол., 1978, т. 12, It I, с. 5-33.

3. Георгиев Г.II. О механизме онтогенеза: "промоторная" гипотеза. Молекул, биол., 198I, т. 15, №2, с. 261-273.

4. Георгиев Г.П., Ильин КЗ.В., Рысков А.П., Крамеров Д.А. Мобильные диспергированные генетические элементы эукариот и их возможное отношение к канцерогенезу. Генетика, 1981, т. 17, № 2, с. 222-232.

5. Георгиев Г.П., Мантьева В.Л., Информационная и рибосомальная РНК хромосомно-ядрышкового аппарата, методы разделения и нук-леотидный состав. Биохимия, 1972, т. 27, вып. 5, с. 949-957.

6. Герасимова Т.Н. Гибридный дисгенезис, мутаторные системы и факторы нестабильности у Drosophila melanogaster; данные попу ляционно-генетических исследований. Генетика, 198I, т. 17, № 3, с. 583-594.

7. Ильин Ю.В., Хмеляуекайте В.Г., Кульгускин В.В. Множественные рассеянные ПО хромосомам гены Drosophila melanogaster с варьирующей локализацией. Сообщение УЛ. Транскрипция мобильных диспергированных генов I и 3. Генетика, 198I, т. 17, № 2, с. 2II-22I.

8. Ильин Ю.В. Мобильные диспергированные гены эукариот. В кн.: Итоги науки и техники. Серия Мол. Биол., М., ВИНИТИ, 1982, т. 18, с. 5-48.

9. Крамеров Д.А., Ломидзе Н.В. "Парадоксальная" эволюция индивидуальной транскрибируемой повторяющейся последовательности ДНК(В1) у грызунов. Докл. АН СССР, 1980, т. 255, К= 4, с. 1005-1009.

10. Крамеров Д.А., Краев А.С., Рысков А.П., Скрябин К.Г. Первичная структура высокоповторяющейся последовательности ДНК мыши, гомологичной двуспиралъным участкам про-мРНК. Докл.

11. АН СССР, 1980, т. 252, № I, с. 241-244.

12. Крамеров Д.А. Организация генома и единиц транскрипции у высших организмов. В кн.: Итоги науки и техники. Серия биол. хим., М., ВИНИТИ, 1982, т. 16, с. 4-56.

13. Кульгускин В.В., Ильин Ю.В., Георгиев Г.II. Множественные рассеянные по хромосомам гены Drosophila melanogaster с варьирующей локализацией. Сообщение УШ. Первичная структура длинных концевых повторов в мдг I. Генетика, IS82, т. 18, Ш 6,с. 869-879.

14. Рысков А.П. Двуспиральные структуры и комплементарные последовательности в ядерных предшественниках мРНК. Успехи совр. биол., 1978, т. 86, №2, с. 163-173.

15. Рысков А.П., Токарская О.Н., Кутель Ч., Хунгер Г.-Д. Структура ядерной пре-мРНК. IX. Гибридизация двуспиральных участков пре-мРНК с избытком мРНК. Мол. биол., 1978, т. 12, )ё 2, с. 334-342.

16. Тарантул В.З., Гольцов В.А., Кузнецова Е.Д. Структурная организация генома эукариот. В Кн.: Итоги науки и техники. Серия Мол. биол., М., ВИНИТИ, 1982, т. 19, с. 7-83.

17. Хесин Р.Б. Непостоянство генома. Мол. биол., 1980, т. 14, Ш 6, с. 1205-1233.

18. Adams J.W., Kaufman R.E., Kretschmer P.J., Harrison M.,

19. Nienhuis A.w. A family of long reiterated DNA sequence . one copy of which, is next to the human beta globin gene. Nucl. Acids Res., 1980, v. 8, ?й 24, p. 6113-6128.

20. Baltimore D. Gene conversions some implications for immunoglobulin genes, cell, 1981, 24, Ш 3, p. 592-594.

21. Barta A., Richards R.J., Baxter L.D., Shine J. Primary structure and evolution of rat growth hormone gene. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1981, v. 78, Mi 8, p. 4867-4871.

22. Bayev A.A., Krayev A.S., Lyubomirskaya N.V., llyin Y.V.,

23. Skryabin K.G., Georgiev G.P. The transposabie element mdg3 in Drosophila melanogaster is flanked with the perfect direct and mismatched inverted repeats. Nucleic Acids

24. Res., 198О, v.8, Ii2 15, p. 3263-3273.

25. Bell G.I., Pictet R., Rutter W.J. Analysis of the regionsflanking the human insulin gene and sequence of the family member. Nucleic Acids Res., 1980, v. 8, Ш 18, p. 4091-4Ю9.

26. Biezunski N. Structure and distribution of inverted repeatspalindromes). Chromosoma, 1981, v. 84, K2 1, p. 87-109,

27. Bingham P.M., Kidwell M.G., Rubin G.M. The molecular basisof P-M hybrid dysgenesis: the role of the P-element, a P-strain-specific transposon family, cell, 1982, v. 29, Ш 4, p. 985-995.

28. Bolivar F., Rodriguez R.C., Greene P.J., BetlachN.C., Heyneker H.C., Boyer H.w., Crosa J.H., Falkov s. Cosntruction and characterization of new cloning vehicles. II. A multipurpose cloning system» Gene, 1977, v. 2, № 2, p. 95-113.

29. Britten R.J., Davidson E.H. Gene regulation for higher cells: a theory. Science, 1969, v. 165, Ш 3891, p. 349357*

30. Brown S.D.M., Dover G. Organization and evolutionary progress of dispersed repetitive family of sequences in widely separated rodent genomes. J. Moi. Biol., 1981, v. 150, m 4, p. 441-466.

31. Chaudhari N., Craig S.P. Internal organization of long repetitive DNA sequences in sea urchin genome. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1979, v. 76, № 12, p. 6101-6105.

32. Clewell D.B., Helinski D.R. Supercoiled circular DNA-protein complex in E.coli: purification and induced convertion toan open circular DNA form. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1969, v. 62, № 4, p. 1159-1162.

33. Coggins L.W., Grindlay G.J., Vass J.K., Slater A.A., Montague P., Stinson M.A., Paul J. Repetitive DNA sequences nearthree human B-type globin genes. Nucleic Acids Res., 1980» v. 8, Ы 15, p. 3319-3333.

34. Cole M.D., Ono M., Huang R.c.c. Terminally redundant sequences in cellular intracisternal A-particie genes. J. Virol., 1981, v. 38, m 2, p. 680-687.

35. Costantini F.D., Scheller E.H., Britten R.J., Davidson E.H. Repetitive sequence transcrips in the mature sea urchin oocyte, cell, 1978, v. 15, Ш 1, p. 173-187.

36. Costantini F.D., Britten R.J., Davidson E.H. Message sequences and short repetitive sequences are interspersed in sea urchin egg poly(A)+ RNAs. Nature, 1981, v. 287, Ш 11, p. 111-117.

37. Craig S.P., Chaudhari N., Steinert M. Characterization of long and short repetitive sequences in the sea urchin genome. Biochim. Biophys. Acta, 1979, v. 565, Ы 1, p. 33-50.

38. CrainW.R., Davidson E.H., Britten R.J. Contrasting patterns of dnA sequence arrangement in Apis mellifera (Honeybee) and Musca domestica (Housefly). Chromosoma, 1976, v. 59, Ш 1, p. 1-12.

39. Crippa M., Meza I., Dina D. sequence arrangement in mENA: presence of poly(A) and identification of a repetitive fragment at the 5'-end. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 1974, v. 38, p. 933-942.

40. Curtiss III R., Ihoue M., Pereira D., Hsu J.Ch., Alexander L., Rock L. Construction and use of safer bacterial host for recombinant DNA research. Miami Winter Symp., 1977, v. 13, p. 99-111.

41. Davidson E.H., Hough B.R., Klein W.H., Britten R.J. Structural genes adjacent to interspersed repetitive DNA sequences. cell, 1975, 4, м 3, p. 2, 217-238.

42. Davidson E.H., Britten R.J. Regulation of gene expression: possible role of repetitive sequences. Science, 1979, v. 204, Ж 4397, p. 1052-1059.

43. Deininger P.L., Schmid C.VZ. An electron microscope study of the DNA sequence organization of the human genome. J. Mol. Biol., 1976, 106, m 3, p. 773-790.

44. Deininger P.L., Jolly D.J., Rubin C.M., Friedmann Т., Schmid C.vz. Base sequence studies of 300 nucleotide rena-tured repeated DNA clones. J. Mol, Biol., 198i, v. 151» № 1, P. 17-33.

45. Delia Fovira K., Gelman E.P., Gallo R.C., Wong-Stall F.

46. A human one gene ./homologous to the transforming gene (v-sis) of simian sarcoma virus. Nature, 1981, v. 292, № 5818, p. 31-35.

47. Denison R.A., van Arsdell S.W., Bernstein L.B., Weiner A.M. Abundant pseudogenes for small nuclear RNAs are dispersed in the human genome. Proc. Natl. Acad. Sci, USA, i98i, v. 78, re 2, p. 810-814.

48. Dhruva B.E., Shenk Т., Subramanian K.N. Integration in vivo into simian virus 40 DNA of a sequence that resembles a certain family of genomic interspersed repeated sequences. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1980, v. 77, Ш 8, 4514-4518.

49. Dobrynin V.N., Korobko Y.G., SevertsOva I.V., $ystrov N.S., Chuvpilo S.A., Kolosov M.N. Nucl. Acids Res., Symp. series, Ш 7, 1980, 365-376.

50. Doolittle W.P., sapienza C. selfish genes, the phenotype paradigm and genome evolution. Nature, 1980, v. 284, Ш 5736, p. 601-603.

51. Dowkins I. The selfish gene. Oxford University Press, 1976.

52. Duncan C., Biro P.A., Choudary P.V., Elder J.Т., Wang R.E.C., Forget B.G., DeHiel J.к., weissman Б.М. ENA polymerase III transcription units are interspersed among human non oi-globin genes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1979»v. 76, Ш Ю, p. 5095-5099.

53. Duncan C.H., Jagadeeswaran p., wang E.K.C., weissman s.M. structure analysis of templates and enA polymerase 111 transcripts of Alu family sequences interspersed among the human в-iike globin genes. Gene, v. 13, m 2, p. 185-196.

54. Eden F.C., Musti A.M., So.bieski D.A. Clusters of repeated sequences of chicken DNA are extensively methylated but contain specific undermethylated regions. J. Mol. Biol., 1981, v. 148, Ш 2, p. 129-151.

55. Eibel H., Gafner J., Stotz A., Philippsen P. Characterization of the yeast mobile element Ty1. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 198i, v. 45, p. 609-61?.

56. Elder J.Т., Pan J., Duncan C.H., Weissman S.M. Transcriptional analysis of interspersed repetitive polymerase III transcription units in human DNA. Nucleic Acids Ees., 1981, v. 9, K2 5, p. 1171-1189.

57. Erikson E., Erikson R.L., Henry В., Pace N.R. Comparison of oligonucleotides produced by RNAse T,j digestion of 7S RNA from avian and murine oncorna viruses and from uninfected cells. Virology, 1973» v. 53, Ki 1, p. 40-46.

58. Finnegan D.J., Rubin G.M., Young M.W., Hogness D.S. Repeated gene families in Drosophila melanogaster, 1978, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 1978, v. 42, p. 1053-Ю64.

59. Flavell As-J., Ruby S.W., PToole J.J., Roberts B.E., Rubin G.M. Translation and developmental regulation of ША encoded by the eukaryotic transposable element copia. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1980, v. 77, Hi 12, p. 7Ю7-7Ш.

60. Flavell A.J., Ish-Horowicz D. Extrachromosomal circular copies of the eukariotic transposable element copia in cultured Drosophila cells. Nature, 1981, v. 292, hi 5824, p. 591594.

61. Flavell A. Did retroviruses evolve from transposable elements? Nature, 1981, v. 289, Ы 5793, p. Ю-11.

62. Fowlkes D.M., Shenk T. Transcriptional control regions of the adenovirus VAI RNA gene, cell, 1980, v. 22, Ш 2, p. 405-413.

63. Fritsch E.F., Lawn R.M., Maniatis T. Molecular cloning and characterization of the human B-like globin gene cluster, cell, 1980, v. 19, № 5, P. 959-972.

64. Fritsch E.F., Shen C.K.J., Lawn H.M., Maniatis T. The organization of repetitive sequences in mammalian globin gene clusters. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 1981, v. 45, p. 761-775.

65. Gafner J., Philippsen p. The yeast transposon '£y1 generates duplication of target DNA on insertion. Nature, 1980, v. 286, K2 5771, p. 414-418.

66. Galli G., Hofstetter H., Birnstiel M.L. Two conserved sequence blocks within eukaryotic tRNA genes are major promoter elements. Nature, 1981, v. 294, 5842, p. 626-631.

67. Georgiev G.P., Eyskov A.P., Coutelle c., Mantieva V.L., Avakyan E.R. on the structure of transcriptional unit in mammalian cells. Biochim. Biophys. Acta, 1972, v. 259, К 2, p. 259-283.

68. Crimaldi G., Queen С., Singer M.F. Interspersed repeated sequences in the African green monkey genome that are homologous to the human Alu family. Nucl. Acids Res., 1981, v. 9, ffi 21, p. 5553-5568.

69. Grunstein M.G,, Hogness D.S. Colony hybridization: a method for isolation of cloned , DNAs that contain a specific gene. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1975, v. 72, ш 10, p. 3961-3965.

70. Gruss P., Dhar R., Khoury G. Simian virus 40 tandem repeated sequences as an element of the early promoter. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1981, 78, № 2, p. 943-947.

71. Gvozdev V.A., Belyaeva E.S., Ilyin Y.V., Amosova I.S., Kaidanov L.Z. Transposition of mobile dispersed genes revealed by selection in Drosophila melanogaster. Cold Spring narb. symp. quant. Biol., 1981, v. 45, p. 673-685.

72. Haigwood N.L., John C.L., Hutchison III C.A., Edgell Ivi.H. Locations of three repetitive sequence families found in BALB/c adult J3-globin clones. Nucl. Acids Res., 1981, v. 9,5, p. 1133-1150.

73. Harada F., Kato N. Nucleotide sequences of 4,5s RNAs associated with poly(A)-containing RNAs of mouse and hamster cells. Nucleic Acids Res., 1981, v. 8, Ш 6, p. 1273-1285.

74. Hayashi к. Organization of sequences related to U6 RNA in the human genome. Nucl. Acids Res., 1981, v. 9, Ш 14, p. 3379-3388.

75. Haynes s.R., Jelinek W.R. Low molecular weight RNAs transcribed in vitro by RNA polymerase III from Alu-type dispersed repeats in Chinese hamster DNA are also found in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1981, v. 78, Ш 10, p. 6130-6134.

76. Hoeijmakers-van Dommelen H.A.M., Grosveld G.C., De Boer E., Flavell R.A. Localization of repetitive and unique DNA sequences neighbouring the rabbit B-globin gene. J. Mol. Biol., 1980, v. 140, Ш 4, p. 531-547.

77. Houck C.M., Rinehart F.P., Schmid C.W. A ubiquitous family of repeated DNA sequences in the human genome. J* Mol. Biol., 1979, v. 132, № 3, p. 289-306.

78. Ilyin Y.V., Chmeliauskaite V.G., Ananiev E.V., Itfubomirs-kaya N.V., Kulguskin V.V., Bayev A.A., Georgiev G.P. Mobile dispersed genetic element MDG1 of Drosophila melanogas-ter: structural organisation. Nucl. Acids Res., 1980, V.8, № 22,p.5333-5346.

79. Jagadeeswaran P., Forget B.G., weissman S.M. Short interspersed repetitive DNA elements in eukariots: transposable DNA elements generated by reverse transcription of RNA-polIII transcripts, cell, 1981, v. 26, № 2, p. 141-142.

80. Jahn C.L., Hutchison III C.A., Phillips S.J., Weaver S., Haigwood N.L., Voliva C.F., Eigell M.H* DNA sequence organization of the Б-globin complex in the BALB/c mouse, cell, 198О, 21, Ж 1, p.

81. Jelinek W.E. Inverted repeated DNA from Chinese hamster ovary cells studied with cloned DNA fragments. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1978, v. 75, Ki 6f 2679-2683.

82. Jelinek W.E., Leinwand L. Low molecular weight KNAs hydrogen-bonded to nuclear and cytoplasmic poly(A)-terminated ENA from cultured Chinese hamster ovary cells, cell, 1978, v. 15, NS 2, p. 205-214.

83. Kakefuda Т., Roberts E., Suntseff V. Electron microscopic study of methyicholanthrene-induced epidermal carcinogenesis in mice: mitochondrial dense bodies and intracisternal A-particles. cancer Res., 1970, v. 30, Ш 4, p. 1011-1119.

84. Karin M., Richards R.J. Human metallothionein genes primary structure of the metallothionein-n gene and a related processed gene. Nature, 1982, v. 299, m 5886, p. 797802.

85. Khoury G., Gruss P. Enhancer elements, cell, 1983, v. 33,hi 2, p. 313-314.

86. Kimmel A.R., Firtel R.A. A family of short, interspersed repeat sequences at the 5'-end of a set of dictyostelium single-copy .mRNAs. Cell, 1979, v. 16, к= 4, p. 787-796.

87. Kioussis D., Eiferman F., Van de Rijn P., Gorin M.B. , Ingram R.S., Tilgham S.M. The evolution of c< -fetoprotein and albumin. II. The structures of. the c< -fetoprotein and albumin genes in the mouse. J. Biol. Chem., 1981,v. 256, № 4, p. 196О-1967.

88. Klein W.H., Murphy V/., Attardi G., Britten E.J., Davidson E.H. Distribution of repetitive and nonrepetitive sequence transcripts in HeLa mENA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1974, 71, M 5, p. 1785-1789.

89. Kline W.H., Thomas T.L., La, C., Scheller E.H., Britten E.J., Davidson E.H. Characteristics of individual repetitive sequence families in the sea urchin genome studied with cloned repeats. Cell, 1978, 14, № 4, p. 889-900.

90. Kole L.B., Haynes S.H., Jelinek w.E. Discrete and heterogeneous high molecular weight ENAs complementary to a long dispersed repeat family (a possible transposone) of human DNA. J. Mol. Biol., 1983, v. 165, Ш 2, p. 257-286.

91. Kramerov D.A., Eyskov A.P., Georgiev G.P. The structural organization of nuclear pre-mRNA. II. Very long double-stranded structures in nuclear pre-mENA. Biochim. Biophys. Acta, 1977, v. 475, № 3. P. 461-475.

92. Kramerov D.A., Lekakh I.Y., Samarina O.P., Eyskov A.P. The sequences homologous to major interspersed repeats are ргеьепг in mENA and small cytoplasmic poly(A)+ ENA. Nucl. Acids Ees., 1982, v. 10, !Л 23, p. 7477-7491.

93. Krayev A.S., Markusheva T.V., Kramerov D.A., Ryskov A.P., Skrybin K.G., Bayev A.A., Georgiev G.P. Ubiquitous trans-poson-like repeats B1 and B2 of the mouse genome: B2 sequencing. Nucl. Acids Res., 1982, v. 10, K2 23, p. 74617475.

94. Krolewski Y.J., Bertelsen A.H., Hamayun M.Z., Rush M.G. Members of the Alu family of interspersed repetitive ША sequences are in the small circular ША population of monkey cells grown in culture. J. Mol. Biol., 1982, v. 154, № 4, p. 319-415.

95. Kuff E.L., Lueders K.K., Scolnick E.M. Nucleotide sequence relationship between intracisternal type A particles of Mus. musculus and an endogenous retrovirus (M 432) of Mus. cervicolor. J. Virol., 1978, v. 28, Ki 1, p. 66-74.

96. Kunkel L., Smith K.D., Boyer S.H. Organization and heterogeneity of sequences within a repeating unit of human Y chromosome deoxyribonucleic acid. Biochemistry, 1979, v. 18, M! 15, p. 3343-3354.

97. Kuroiwa A., Natory S. Preferential expression of unique sequences adjacent to middle repetitive sequences in mouse cytoplasmic RNA. Nucl. Acids Res., 1979, v. 7, Ш 3, p. 751-764.

98. Lalanne J.L., Bregegere F., Delarbre c., Abastado J.p., Gachelin G., Kourilsky P. Comparison of nucleotide sequences of mRNAs belonging to the mouse H-2 multigene family. Nucl. Acids Res., 1982, v. 10, № 3, p. Ю39-1150.

99. Levis R., Dunsmuir P., Rubin G. Terminal repeats of the Drosophila transposable element copia: nucleotide sequence and genomic organization. Cell, 198о, v. 21, N? 9, p. 581-588.

100. Lockett T.J., Kemp D.J., Rogers G.E. Organization of the unique and repetitive sequences in feather keratin messenger ribonucleic acid. Biochemistry, 1979, v. 18, te 25, P. 5654-5663.

101. M8iо J.J., Brown F.L., McKenna W.G., Musich P.R. Toward a molecular paleontology of primate genomes. II. The ICpnl families of alphoid DNA. Chromosoma, 1981, v. 83, Ш 1, p. 127-144.

102. Maniatis Т., Fritsch E.F., Sambrook J. Molecular cloning* A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, 1982.

103. Maxam A., Gilbert W. Sequencing end-labeled DNA with base specific chemical cleavages. Methods Enzymol., 1980, v. 65, P. 499-560.

104. Meunier-Eotival M., Soriano P., Cuny G., Strauss F., Bernard! G. Sequence organization and genomic distribution of the major family of interspersed repeats of mouse DNA.

105. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1982, v. 79, Kg 2, p. 355-359.

106. Nishioka Y., Leder p., Leder A. Unusual ы. -globin-like gene that has cleanly lost both globin intervening sequences. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1980, v. 77, № 5, p. 2806-2809.

107. Ohshima Y., Okada N., Tani Т., Itoh Y., Itoh M. Nucleotide sequences of mouse loci including a gene or pseudo-gene for U6 (4,8S) nuclear ENA. Nucl. Acids Ees., 1981, v. 9, KS 19, p. 5145-5158.

108. Orgel L.E., Crick F.H.C. Selfish DNA: the ultimate parasite. Nature, 1980, v. 284, Ms 5736, p. 604-607.

109. Page G.S., Smith S.t Goodman H.M. DNA sequence of the rat growth hormone gene: location of the 5'-terminus of the growth hormone mENA and identification of an internal transposon-like element. Nucleic Acids Ees., 1981, v. 9, III 9, P. 2087-2104.

110. Pan J., Elder J.Т., Duncan C.H., Weissman S.M. Structural analysis of interspersed repetitive polymerase ill transcription units in human DNA. Nucleic Acids Ees., 1981, v.9,1. К 5, p. И51-117О.

111. Pays E. Double-stranded ENA in chromatin transcripts formed by exogenous ENA polymerase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1976, v. 73, Ы 4, p. 1121-1125.

112. Posakony J.W., Scheller E.H., Anderson D.M., Britten E.J., Davidson E.H. Eepetitive sequences of the sea urchin genome. ill. Nucleotide sequences of cloned repeat elements. J. Mol. Biol., 1981, v. 149, Ш 1, p. 41-67,

113. Potter s.s. DNA sequence of a fold-back transposable element in Drosophila. Nature, 1982, v. 297, W2 5863, p. 201-204.

114. Prenslty v/., Steffensen d.m., Hughes w.L. The use of iodinated enA for gene localization. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1973, v. 70, Ki 6, p. 1860-1869.

115. Rigly P.W.J,, Dreckmann M., Rhonders C., Berg P. Labelling of deoxyribonucleic acid to high specific activity in vitro by nick translation with DNA polymerase I, J. Mol. Biol., 1977, v. 113, hi 1, p. 237-251.

116. Rinehart P.P., Ritch T.G., Deininger P.L., Schmid C.W. Renaturation rate studies of a single family of interspersed repeat sequences in human deoxyribonucleic acid. Biochemistry, 1981, v. 20, fll 11, p. 3003-30Ю.

117. RoChoi T.S., Reddy R., Henning D., Takano Т., Taylor C.W., Busch H. Nucleotide sequence of 4,5S ribonucleic acid Iof Novikoff hepatoma cell nuclei. J. Biol, Chem., 1972, v. 247, Ш 10, p. 3205-3222.

118. Rubin G.M., Houck C.M., Deininger P.L., Friedmann Т., Schmid C.W. Partial nucleotide sequence of the 300-nuc-leotide interspersed repeated human DNA sequences. Nature, 1980, v. 284, KI 5734, p. 372-374.

119. Rubin G.M., Brorein W.J., Dunsmuir P., Flavell A.J., Levis R., Strobel E., Toole J.J., Young E. Copia-like transpo-sable elements in the Drosophila genome. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol., v. 45, 1981, p. 619-628.

120. Rubin G.M., Spradling A.C. Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors. Science, 1982, v. 218, № 4570, p. 348-353.

121. Eyskov A.P., Limborska Б.А., Georgiev G.P. Hybridization of mENA and pre-mENA with the sequence forming double-stranded structures in pre-mENA. Mol. Biol. Reports, 1973, -v. 1, fti 3, P. 215-219.

122. Scheller E.H., Costantini F.D., Kozlowski M.E., Britten E.J., Davidson E.H. Specific representation of cloned repetitive DNA sequences in Sea urchin ENAs. Cell, 1978,15, 1, p. 189-203.

123. Scheller E.H., Andersen D.M., Posakony J.V/., McAllister L.B., Britten e.j. , DavidsonE.il, Eepetitive sequences of the sea urchin genome. II. Subfamily structure andevolutionary conservation, J. Mol. Biol., 1981, v. 149, Ш 1, P. 15-39.

124. Scherer S., Davis E.W. Becombination of dispersed repeated DNA sequences in yeast, science, 198o, v. 209, № 4463, p. 1380-1384.

125. Shen C.-K,, Maniatis T. The organization of repetitive sequences in a cluster of rabbit B-like globin genes. Cell, 1980, v. 19, Ш 2, p. 379-391.

126. Shih C., Padhy L.C., Murray M.J., Weinberg E.A. Transforming genes of carcinomas and neuroblastomas introduced into mouse fibroblasts. Nature, 1981, v. 290, Ш 5803,p. 261-264.

127. Singer Ы.Р. SINEs and LINEs: Highly repeated short and long interspersed sequences in mammalian genomes. Cell,1982, v. 28, ш 3, p. 433-484.

128. Southern E.M. Deletion of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. «X. Mol.

129. Biol., 1975, v. 98, Ш 3, P. 503-517.

130. Spohr G., Eeith W., Sures I. Organization and sequence analysis of a cluster of repetitive DNA elements from xenopus laevis. J. Mol. Biol., 1981, v. 151, Ш 4, p. 573592.

131. Tashima м., Caiabretta в., Toveiii G., Scofieid м., Mai-zel A., Saunders G.P. Presence of a highly repetitive and widely dispersed DNA sequence in the human genome. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1981, 78, Ш 3, p. 1508-1512.

132. Tchurikov N.A., Naumova A.K., Zelentsova E.S., Georgiev G.P. A cloned unique gene of Drosophila melanogaster contains repetitive 3'exon whose sequence is present at the З'-ends of many different mRNAs. Cell, 1982, v. 28, Ni 2, P. 365-373.

133. Temin H.M. Origin of retroviruses from cellular moveable genetic elements, cell, 198о, v. 21, № 3, p. 599-600.

134. Tokarskaya O.N., Tchurikov N.A., Ivanov P.L., Kramerov D.A., Ryskov A.P. Sequences hybridizing to mRNA, oligo(dT) and dsRNA from pre-mRNA are contiguous in the cloned mouse DNA fragments. Nucl. Acids Res., 1980, v. 8, Ш 3, p. 425439.

135. Tsichlis P.M., Coffin J.M. Role of the С region in relative growth rates of endogeneous and exogeneous avian oncoviruses. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 1981, v. 44, p. 1123-1132.

136. Young M.W• Middle repetitive DNA: a fluid component of the Drosophila genome. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1979, v. 76, №12, p. 6274-6278.

137. Young M.W., Schwartz H.E. Nomadic gene families in Drosophila. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 1981, v. 45, p. 629-640.

138. Van Arsdelle S.W., Denison R.A., Bernstein L.B., Weiner A.M., Manser т., Gesteland r.f. Direct repeats flank three small nuclear RNA pseudogenes in the human genome. Cell, 1981, v. 26, Ni 1, p. 11-17.

139. Wieslander L. Number and structure of balbiani ring 75s RNA transcription units in Chironomus tentans. J. Mol. Biol., 1979, v. 134, Ш 2, p. 347-367.

140. Wilson D.A., Thomas C,A., Jr, Palindromes in chromosomes. J. Mol. Biol., 1974, v. 84, Hi 1, p. 115-144.

141. Wu J.R,, Pearson W.R., Posakony J.M., Bonner J, Sequence relationship between long and short repetitive DNA of the rat: A preliminary report. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1977, v. 74, N5 10, p. 4382-4386.