Конструирование тест-системы для выявления возбудителя холеры методом полимеразной цепной реакции тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.07, кандидат биологических наук Давыдова, Наталия Александровна

• Давыдова, Наталия Александровна
• кандидат биологических наук
• 2001

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Давыдова, Наталия Александровна

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Лабораторная диагностика холеры.

1.1.1. Традиционные методы выявления V. cholerae.

1.1.2. Использование молекулярно-генетических подходов для индикации и идентификации холерных вибрионов.

1.2. Пути совершенствования генной диагностики инфекционных болезней.

1.2.1. Способы повышения эффективности реакции амплификации ДНК.

1.2.2. Конкурирующая ПЦР.

Я» г

1.2.3. Магноиммуносепарацириньщ ПЦР-^надиз.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Объекты исследования.

2.1.1. Бактериальные штаммы.

2.1.2. Питательные среды.

2.2. Культивирование бактерий.

2.3. Отбор и подготовка проб.

2.3.1. Приготовление бактериальных взвесей.

2.3.2. Пробы испражнений, рвотных масс.

2.3.3. Пробы воды открытых водоемов и смывов с поверхностей

2.4. Выделение ДНК.

2.4.1. Выделение ДНК методом лизиса гуанидинтиоцианатом с нуклеосорбцией на силикагеле.

2.4.2. "Однопробирочный способ" подготовки биологического материала для ПЦР-анализа.

2.5. Определение концентрации ДНК.

2.6. Магноиммуносорбционная подготовка проб для ПНР.

2.7. Полимеразная цепная реакция.

2.8. Статистическая обработка полученных данных.

Глава 3. Создание ПЦР-тест-системы для индикации и идентификации токсигенных штаммов V. cholerae.

3.1. Оптимизация параметров полимеразной цепной реакции с праймерами на основе ctxA гена V. cholerae.

3.1.1. Выбор олигонуклеотидных праймеров и ДНК-матриц

3.1.2. Разработка оптимальных условий ПЦР.

3.2. Разработка схемы подготовки проб для ПЦР.

3.3. Характеристика тест-системы для выявления

V. cholerae (ctxA+) методом полимеразной цепной реакции.

Глава 4. Определение диагностической ценности тест-системы для выявления V. cholerae (ctxA+) методом полимеразной цепной реакции (комиссионные испытания).

4.1. Программа комиссионных испытаний.

4.1.1. Подготовка проб и постановка ПЦР.

4.2. Результаты испытаний.

4.2.1. Исследование чистых культур.

4.2.2. Исследование биологического материала и объектов внешней среды, искусственно инфицированных

V. cholerae (ctxA+).

4.2.3. Исследование смывов с поверхностей, искусственно инфицированных V. cholerae (ctxA+) и V. cholerae (ctxA-), с помощью ПЦР и люминесцентной микроскопии.

4.2.4. Специфичность ПЦР-тест-системы.

4.2.5. Воспроизводимость результатов.

4.3. Оценка ПЦР-тест-системы для выявления V. cholerae (ctxA+) по результатам комиссионных испытаний.

Глава 5. Применение ПЦР-тест-системы для детекции и идентификации токсигенных штаммов V. cholerae

5.1. Идентификация токсигенных холерных вибрионов

5.2. ПЦР-мониторинг поверхностных водоемов на наличие

V. cholerae (ctxA+).

Глава 6. Пути совершенствования ПЦР-тест-системы для выявления

V. cholerae (ctxA+).

6.1. Разработка конкурирующей ПЦР для детекции

V. cholerae (ctxA+).

6.2. Выявление V. cholerae (ctxA+) в пробах воды открытых водоемов с помощью магноиммуносепарационного ПЦР-анализа.

6.3. Мультиплексная ПЦР для одновременного обнаружения и биотипирования токсигенных штаммов холерных вибрионов.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Конструирование тест-системы для выявления возбудителя холеры методом полимеразной цепной реакции»

Актуальность проблемы

В настоящее время во всем мире сохраняется нестабильная ситуация по холере. В 1998-2000 гг. отмечались крупные эпидемические вспышки холеры за рубежом. В России также регистрировались как единичные, так и вспышечные случаи заболевания в Челябинске, Москве, Дагестане, на Сахалине, в Приморье. Ежегодно в различных регионах страны выделяют до 100 нетоксигенных штаммов V. cholerae [Онищен-ко Г.Г. с соавт., 2000]. Широко используемые для обнаружения и идентификации возбудителя холеры бактериологический и иммунологические методы оказываются недостаточно эффективными для индикации и экспресс-диагностики. Бактериологический анализ длителен (24-48 ч), трудоемок, требует наличия специальных сред и биопробных животных, высокая изменчивость холерных вибрионов нередко затрудняет использование традиционной схемы идентификации выделенной культуры [Подо-синникова JI.C. с соавт., 1998; Синичкина Н.А. с соавт., 1998; Голубинский Е.П. с соавт., 2000]. Иммунологические методы недостаточно чувствительны (lxlO4 - 1 х10 м.к./мл), имеются трудности при работе с нативным материалом [Адамов А.К., 1981; Адамов А.К., Наумшина М.С., 1984; Jesudason M.W. et al., 1984].

Важная практическая задача - определение вирулентности и эпидзначимости выявленного штамма. Методы генетического анализа могут рассматриваться в качестве одного из наиболее эффективных путей ее решения, позволяя детектировать гены, детерминирующие патогенные свойства микроорганизма. Очевидно, что при лабораторной диагностике холеры первостепенное значение имеет обнаружение ctx-генов, отвечающих за синтез основного фактора патогенности - холерного энтероток-сина. К тому же показано, что эпидемические осложнения при холере вызывают 8 штаммы V. cholerae, содержащие ctxA ген.

Одним из новых способов ускоренной диагностики инфекционных заболеваний является полимеразная цепная реакция (ПЦР), позволяющая в короткий срок (4-6 ч) с высокой чувствительностью (100-1000 м.к./мл) и специфичностью выявить возбудитель инфекции практически в любом исследуемом материале без предварительного этапа культивирования. Описано применение ПЦР для детекции возбудителей особо опасных инфекций, в том числе и холеры, с использованием в большинстве случаев в качестве ДНК-мишени ctxA гена, кодирующего А-субъединицу холерного токсина [Четина Е.В. с соавт., 1992; Глухов А.И. с соавт., 1996; Парамонов И.В. с соавт., 1998; Shirai U.H. et al, 1991; Fields P.A. et al, 1992; Salles C.A. et al, 1993; Varela P. et al, 1994; Hoshino K. et al., 1998].

Однако приведенные в литературе данные не позволяют дать оценку чувствительности, специфичности и воспроизводимости использованных вариантов ПЦР, возможности создания на их основе диагностического препарата для обнаружения возбудителя холеры с помощью ПЦР-анализа.

На основании вышеизложенного очевидна необходимость конструирования ПЦР-тест-системы для выявления V. cholerae (ctxA+) и ее апробация на широком круге микроорганизмов при работе с различным биологическим материалом и объектами внешней среды. При этом наиболее важным является практическое внедрение созданного препарата, разработка необходимой нормативной документации и проведение Государственных комиссионных испытаний.

На сегодняшний день при идентификации холерных вибрионов известные трудности возникают при определении биовара выделенных культур. Это связано с нарастанием количества выделяемых штаммов V. cholerae, устойчивых к диагностическим холерным бактериофагам, нетипичности результатов по другим тестам диф9 ференциации. Поэтому остается актуальным поиск новых подходов для биотипиро-вания, в том числе основанных на анализе генома с помощью ПЦР, позволяющих выявлять нуклеотидные последовательности, присущие определенному виду (биовару) микроорганизмов.

До настоящего времени существует целый ряд проблем, связанных с практическим применением ПЦР для анализа материала от больных и объектов внешней среды. Это - невозможность дифференциации истинного и ложного отрицательного результата в случае ингибирования реакции компонентами исследуемых проб, сложности при работе с большими объемами материала, например воды, при низкой концентрации искомого микроорганизма. С целью преодоления указанных трудностей необходимы соответствующие разработки по конструированию системы внутреннего контроля ПНР-тест-систем для исключения ложных ответов и созданию эффективных методов пробоподготовки.

Цель работы - разработка и внедрение в практику ПЦР-тест-системы для обнаружения ДНК возбудителя холеры в биологическом материале и объектах внешней среды, определение возможных путей её совершенствования.

Основные задачи исследования

1. Подобрать праймеры для специфичной амплификации ctxA гена, кодирующего синтез А-субъединицы холерного токсина. Оптимизировать параметры ПЦР с данными праймерами.

2. Разработать ПЦР-тест-систему для выявления V. cholerae (ctxA+) в биологическом материале и объектах внешней среды. Сравнить эффективность различных способов подготовки нативного материала для ПЦР-анализа. Определить диагностическую ценность сконструированной тест-системы для выявления V. cholerae (ctxA+) методом ПЦР.

10

3. Изучить возможность биотипирования штаммов возбудителя холеры на основе различий геномов V. cholerae cholerae и V. cholerae eltor. Апробировать прайме-ры на участок tcpA гена, отличающийся у этих биоваров. Разработать параметры ПЦР-анализа с использованием трех пар праймеров для одновременного обнаружения и биотипирования токсигенных штаммов V. cholerae.

4. Сконструировать на основе клонированных специфичных ампликонов внутренний контроль ПЦР-тест-системы для выявления V. cholerae (ctxA+). Разработать параметры ПЦР с внутренним контролем.

5. Изучить возможность использования магноиммуносорбентов на этапе подготовки проб при ПЦР-анализе воды открытых водоемов.

Научная новизна работы

Сконструирована тест-система для выявления V. cholerae (ctxA+) методом по-лимеразной цепной реакции. Показана возможность выявления с помощью ПЦР токсигенных штаммов V. cholerae в биологическом материале (испражнения, рвотные массы) и объектах внешней среды (вода открытых водоемов, смывы с поверхностей). Разработаны параметры мультиплексной ПЦР для одновременного обнаружения и биотипирования токсигенных штаммов холерных вибрионов на основе различий в структуре ДНК tcpA гена.

Сконструирован внутренний контроль и определены параметры конкурирующей ПЦР с внутренним контролем ПЦР-тест-системы для выявления V. cholerae (ctxA+).

Показана возможность применения магноиммуносорбентов на этапе подготовки проб при исследовании больших объемов воды открытых водоемов с помощью разработанной ПЦР-тест-системы.

11

Продемонстрирована эффективность использования ПЦР-анализа при исследовании поверхностных водоемов на наличие холерных вибрионов, идентификации культур V. cholerae, выделенных от больных и из объектов внешней среды.

Практическая значимость работы

По результатам работы разработана нормативно-техническая документация (фармакопейная статья предприятия, фармакопейная статья, экспериментально-производственный регламент, инструкция по применению) на тест-систему для выявления V. cholerae (ctxA+) методом полимеразной цепной реакции.

Проведены Государственные приемочные испытания по разработанной и утвержденной комитетом МИБП программе (протокол N 6 от 24.06.99 г.). Результаты Госиспытаний одобрены на ученом совете ГИСК им. JI.A. Тарасевича (протокол N 13 от 16.11.99 г.). Получено разрешение комитета МИБП на внедрение "Тест-системы для выявления Vibrio cholerae (ctxA+) методом полимеразной цепной реакции" в практику здравоохранения (протокол N 10 от 29.12.99 г.). Составлен акт по внедрению тест-системы для выявления V. cholerae (ctxA+) методом ПЦР (утвержден директором ГИСК им. JI.A. Тарасевича от 17.05.2000 г.).

Основные положения, выносимые на защиту

1. Разработанная ПЦР-тест-система для выявления V. cholerae (ctxA+) характеризуется чувствительностью - 10 - 1000 м.к./мл, специфичностью - 96-100% и воспроизводимостью результатов - 100 %, и позволяет детектировать возбудитель холеры в биологическом материале и объектах внешней среды.

2. Генетический анализ, основанный на мультиплексной ПЦР с тремя парами праймеров на ctxA и tcpA гены, дает возможность одновременного выявления и био-типирования токсигенных штаммов V. cholerae.

3. Конкурирующая ПЦР, с использованием внутреннего контроля, позволяет

12 определить возможное ингибирование реакции компонентами исследуемых проб и предотвратить ложноотрицательные результаты.

4. Применение магноиммуносорбентов на этапе подготовки проб дает возможность эффективно исследовать с помощью разработанной ПЦР-тест-системы пробы воды большого объема, содержащие незначительное количество клеток возбудителя холеры.

Апробация работы

Материалы диссертации представлены на: Международной научно-практической конференции "Проблемы санитарно-эпидемиологической охраны территорий стран СНГ" (Саратов, 1998); Юбилейной научной конференции, посвященной 25-летию ГНЦ прикладной микробиологии "Проблемы медицинской и экологической биотехнологии (Оболенск, 1999); 3-й Всероссийской научно-практической конференции "Генодиагностика в современной медицине" (Москва, 2000); 1-й Всероссийской научно-практической конференции "Генная диагностика особо опасных инфекций" (Саратов, 2000); итоговой научно-практической конференции РосНИПЧИ "Микроб" (Саратов, 2000); межлабораторных научных конференциях (РосНИПЧИ «Микроб», 1999, 2000).

Публикации

Основное содержание работы отражено в 8 научных публикациях.

Структура и объем диссертации

Работа состоит из введения, обзора литературы, 5 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы, включающего 309 цитируемых работ. Общий объем диссертации 159 страниц. Текст иллюстрирован 16 таблицами и 3 рисунками.

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Давыдова, Наталия Александровна

ВЫВОДЫ

1. Разработана ПЦР-тест-система для выявления ДНК возбудителя холеры с праймерами, обеспечивающие специфичную амплификацию 564 п.н. фрагмента ctxA гена, кодирующего синтез А-субъединицы холерного энтеротоксина.

2. Определена диагностическая ценность тест-системы для выявления V. cholerae (ctxA+) методом полимеразной цепной реакции:

- чувствительность - 10-1000 м.к./мл при исследовании чистых культур V. cholerae (ctxA+), 1000 м.к./мл при анализе биологического материала и объектов внешней среды, искусственно инфицированных V. cholerae (ctxA+);

- специфичность - со штаммами V. cholerae (ctxA-) 100 %, с гетерогенными микроорганизмами - 96 %;

- воспроизводимость результатов ПЦР составила 100 %.

3. Показана высокая эффективность ПЦР-анализа с помощью разработанной тест-системы для идентификации штаммов V. cholerae по признаку токсинпродукции. Наличие или отсутствие ctxA гена в культурах холерных вибрионов, выделенных от больных и из объектов внешней среды, совпадало в 100 % случаев с результатами определения вирулентности на модели кроликов-сосунков.

4. Разработана мультиплексная ПЦР для одновременного обнаружения и биотипиро-вания токсигенных штаммов V. cholerae на основе анализа генома с использованием трех пар праймеров, обеспечивающих специфичную амплификацию фрагментов ctxA и tcpA генов. Определены оптимальные параметры ПЦР и учета результатов. Доказана эффективность данного генетического подхода при идентификации 50 штаммов холерных вибрионов, выделенных в 1994 и 1998 гг. в Дагестане.

120

5. Сконструирован внутренний контроль ПЦР-тест-системы для детекции V. cholerae (ctxA+), позволяющий выявлять возможное ингибирование реакции компонентами исследуемого материала в каждой пробе. Определены оптимальные параметры ПЦР с внутренним контролем.

6. Показана возможность использования магноиммуносорбентов на этапе подготовки проб для ПЦР при исследовании воды открытых водоемов на наличие токсигенных штаммов V. cholerae с помощью разработанной ПЦР-тест-системы. Применение данного подхода позволяет повысить чувствительность анализа до 100 м.к./л без увеличения его продолжительности.

121

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В связи с нестабильной эпидемиологической ситуацией по холере в России и ряде зарубежных стран, из которых возможен завоз данной инфекции, сохраняет свою актуальность вопрос совершенствования ее лабораторной диагностики, разработки новых методов выявления V. cholerae. Особое значение при этом придается созданию эффективных средств индикации и ускоренной диагностики, позволяющих в короткие сроки обнаружить возбудителя холеры и принять противоэпидемические меры.

Традиционная схема лабораторного анализа основана на выделении чистой культуры и ее идентификации, и занимает в общей сложности 48-72 часа. Использование для исследования нативного материала методов экспресс-диагностики (бактериоскопия, люминесцентная микроскопия, реакция коагтютинации, ИФА, РИА) ограничено их невысокой чувствительностью 1х 106 - lxlO4 м.к./мл и необходимостью подращивания нативного материала в 1 %-ной пептонной воде.

При идентификации особое значение придается определению вирулентности выделенных культур. Основным фактором патогенности холерных вибрионов является холерный энтеротоксин. Установлено, что штаммы его продуцирующие эпидемически опасны, поэтому крайне важно своевременное выявление признака токсинпро-дукции в исследуемых изолятах V. cholerae. Для определения вирулентности на сегодняшний день используют методы in vivo и in vitro. К методам in vivo относится постановка биопробы на крольчатах 10-дневного возраста [Dutta N.K., HabbuN.Y., 1965]. Эта методика достаточно сложна и требует существенных материальных затрат. Среди методов in vitro широкое практическое применение нашел комплексный способ определения вирулентности, основанный на оценке видовых, культуральных,

108 биохимических признаков холерных вибрионов, антигенной структуры, лизабельно-сти диагностическими холерными бактериофагами и гемолитической активности [Адамов А.К. с соавт., 1971]. Однако нарастание фагорезистентности среди выделяемых в последнее время штаммов V. cholerae создает существенные трудности при использовании данного подхода. Поэтому перспективным представляется использование для обнаружения и идентификации холерных вибрионов молекулярно-генетических подходов, основанных на выявление генов, отвечающих за синтез главных факторов патогенности. Один из них - полимеразная цепная реакция (ПЦР). Основные достоинства метода: высокая чувствительность - до 10 - 1000 м.кУмл, быстрота выполнения (4-6 часов) и возможность работы с различным биологическим материалом и объектами внешней среды без предварительного этапа культивирования. В связи с этим, очевидна актуальность разработки тест-системы для выявления токси-генных штаммов холерных вибрионов методом ПЦР и ее адаптация для исследования нативного материала на наличие возбудителя холеры.

Анализ штаммов V. cholerae eltor различного происхождения с помощью ДНК-зондирования показал, что эпидемические осложнения вызывают только те изоляты, которые содержат ctxA ген, отвечающий за синтез А-субъединицы холерного токсина [Брюханов А.Ф., 1991]. Данный ген характеризуются высокой консервативностью у вида V. cholerae. Поэтому он и был выбран нами в качестве ДНК-мишени. Используя компьютерную базу данных GenBank и программу Gene Ranner, для проведения ПЦР были подобраны праймеры ctx2-ctx3. обеспечивающие амплификацию фрагмента ctxA гена (a.n. VCTOXAB 56 Х58785 S55782 J48888) размером 564 п.н. В ходе серии экспериментов установлен оптимальный состав реакционной смеси и программа амплификации. На основании результатов, полученных при разработке стандартных

109 параметров реакции, нами была сконструирована ПЦР-тест-система для выявления V. cholerae (ctxA+), состоящая из 8 компонентов:

1. Праймеры ctx2 и ctx3;

2. 7ag-noлимераза - термостабильная ДЕЖ-полимераза;

3. дНТФ - водный раствор дезоксинуклеозидтрифосфатов;

4.К "+" - водный раствор ДНК V. cholerae 569В в концентрации 1 нг/мл;

5. ЮхБ - 10-кратный буферный раствор;

6. MgCl2 - 50 мМ раствор магния хлорида;

7. Масло вазелиновое стерильное;

8. Вода деионизованная стерильная.

Важной характеристикой диагностического препарата является его стабильность (чувствительность, специфичность и воспроизводимость) в период всего срока хранения. В результате экспериментально-лабораторных испытаний установлено, что тест-система сохраняет свою чувствительность - 1000-10 м.к./мл при исследовании чистых культур микроорганизмов и 1000 м.к./мл при исследовании биологического материала и объектов внешней среды, 100 %-ную специфичность и воспроизводимость в течение 6 месяцев при условии хранения - минус 20 °С. Также показано, что компоненты тест-системы остаются стабильны в течение 24 часов при 10 °С (срок наблюдения).

Определение диагностической ценности разработанной ПЦР-тест-системы осуществляли в процессе комиссионных испытаний на базах специализированной лаборатории ГИСК им. Л.А. Тарасевича, Ставропольского НИПЧИ и Ростовского-на-Дону НИПЧИ. Исследования проводили по программе, утвержденной комитетом МИБП (протокол N 6 от 24.06.99 г.), на чистых культурах V. cholerae (ctxA+),

110

V. cholerae (ctxA-), E. coli, Shigella spp., биологическом материале (испражнения, рвотные массы) и объектах внешней среды (вода открытых водоемов, смывы с поверхностей), искусственно инфицированных V. cholerae (ctxA+) и V. cholerae (ctxA-), а также гетерогенными микроорганизмами. В качестве методов сравнения использовали бактериологический анализ и люминесцентную микроскопию после 6-часового подращивания проб в 1 %-ной пептовной воде.

В результате испытаний показан ряд преимуществ ПЦР-тест-системы для выявления V. cholerae (ctxA+):

- продолжительность метода -6ч против 20-36 ч при бактериологическом исследовании и 10 ч при посеве в 1 %-ную пептонную воду с последующей люминесцентной микроскопией;

- на результаты анализа не влияла контаминация проб посторонней микрофлоры, которая при бактериологическом исследовании затрудняет получение чистой культуры, увеличивая его продолжительность на 12-16 часов;

- возможность быстрой идентификации токсигенных штаммов V. cholerae, содержащих ctxA ген.

Диагностический препарат обладает высокой чувствительностью и специфичностью. Так, с помощью ПЦР-тест-системы выявлено 38 % проб, содержащих V. cholerae (ctxA+) в концентрации 10 м.к./мл, 76% - lxlO2 м.к./мл и 98% - lxlO3 м.к./мл. С эпидемиологически неопасными штаммами V. cholerae (ctxA-) в 100 % получен отрицательный результат, с гетерогенными микроорганизмами - в 96 %. Специфичность при исследовании искусственно инфицированного токсигенными штаммами V. cholerae (ctxA+) и гетерогенными микроорганизмами биологического материала и объектов внешней среды составила 100 %. Воспроизводимость метода ПЦР

Ill

100%.

На основании результатов комиссионных испытаний получено разрешение комитета МИБП на внедрение "Тест-системы для выявления V. cholerae (ctxA+) методом полимеразной цепной реакции" в практику здравоохранения (протокол N 10 от 29.12.99).

Важное значение при ПЦР-исследовании нативного материала, является этап подготовки проб. Нами был проведен сравнительный анализ трех методов выделения ДНК из образцов биологического материала (испражнения, рвотные массы) и объектов внешней среды: разработанный нами метод температурного лизиса-БСА, заключающийся в добавлении к пробам, после их прогревания при 100 °С в течение 30 мин, БСА до конечной концентрации 400 мкг/мл; метод нуклеосорбции [Boom R. et al., 1990] в модификации Гараниной С.Б. [1996] и "однопробирочный способ" подготовки биологического материала для ПЦР, предложенный Н.А. Федоровым и А.А. Еловым (ЦНИИТММТ АМТН РФ). Показана одинаковая эффективность всех использованных подходов, однако метод температурного лизиса-БСА имеет некоторые преимущества: непродолжителен, прост в исполнении, экономичен.

Разработанная ПЦР-тест-система использована в практической работе для детекции и идентификации холерных вибрионов. Были изучены 28 штаммов холерных вибрионов, выделенных из воды открытых водоемов на территориях Саратовской области и других регионах РФ (республиках Мордовия и Чувашия, Астраханской, Оренбургской, Липецкой, Курганской и др. областях), и 20 штаммов от больных, виб-рионосителей и из объектов внешней среды, выделенных в период вспышки холеры в Дагестане в 1998 г. При ПЦР-исследовании 37 штаммов, выделенных из воды открытых водоемов, во все случаях зафиксирован отрицательный результат, свидетельст

112 вующий об отсутствии у данных изолятов ctxA гена и их эпидемической безопасности. В тоже время при ПЦР-анализе 10 штаммов V. cholerae, выделенных от людей и из 1-го из объектов внешней среды в очаге инфекции (Дагестан, 1998 г.), за исключением одного случая, получены положительные ответы, что указывает на наличие у них ctxA гена и об их токсигенности. Данное по результатам ПЦР заключение о ток-сигенности выделенных изолятов было в 100 % случаях подтверждено на модели кроликов-сосунков, у которых наблюдали выраженный холерогенный эффект. Использование комплексного метода определения вирулентности в 66 % случаев оказалось невозможным вследствие резистентности выделенных культур к диагностическим холерным бактериофагам. В ходе исследования были выявлены штаммы V. cholerae, не имеющие по данным ПЦР ctxA гена, но обладающие энтеропатогенными свойствами. Представляется интересным дальнейшее изучение данного явления, которое подчеркивает необходимость разработки ПЦР для определения других детерминантов патогенности.

Возможность применения ПЦР для исследования воды поверхностных водоемов на наличие патогенной микрофлоры и холерных вибрионов была продемонстрирована при тестировании 284 проб воды из 7 стационарных точек забора в 1998-2000 гг. (гл. "Материалы и методы"). В ПЦР во всех случаях зафиксирован отрицательный ответ, что свидетельствует об отсутствии в данных образцах штаммов холерных вибрионов, имеющих ctxA ген. Продолжительность анализа составила 6 часов. При бактериологическом исследовании было выявлено 17 штаммов V. cholerae, которые по данным ПЦР-анализа не содержали ctxA гена. Окончательный ответ был получен через 72 ч и более. Полученные результаты указывают на целесообразность использования ПЦР при исследовании проб воды открытых водоемов в качестве ориентировочно-направляющего теста для бактериологического анализа. С целью повышения из шения информативности в дальнейшем целесообразным представляется разработка ПЦР с праймерами для выявления штаммов V. cholerae 01 серогруппы вне зависимости от их вирулентности и определение среди них токсигенных.

Заслуживает внимания факт, свидетельствующий что из одной и той же стационарной точки в течение разных месяцев одного года и, более того, нескольких лет имели место случаи выделения холерных вибрионов. Так, из воды р. Гуселка-2 (5 м от моста выше по течению) холерные вибрионы были выявлены в июле 1998 г., июле, августе и сентябре 1999 г., а на 1 км ниже моста по течению - в августе 1998 г. и июле 1999 г. Вопрос о происхождении и взаимосвязи этих штаммов остается нерешенным, что обусловливает необходимость их типирования, в том числе с помощью генетических методов [Сучков И.Ю. с соавт., 1998; Coelho A. et al, 1995; Colombo М.М. et al, 1997; Shangkuan Y.H. etal, 1997].

Следующим этапом нашей работы было определение возможных путей совершенствования ПЦР-анализа на холеру. В последнее время при идентификации холерных вибрионов наибольшие трудности возникают при биотипировании исследуемых культур. Это в основном связано с повышением у штаммов устойчивости к диагностическому бактериофагу "Эльтор" и нарастанию неспецифичных результатов по дополнительным тестам дифференциации. Поэтому представляется актуальной разработка иных подходов для биотипирования холерных вибрионов, особенно токсигенных. Одним из таких методов может выступать полимеразная цепная реакция, позволяющая выявлять нуклеотидные последовательности присущие определенному виду (биовару) микроорганизмов. Более того, проведение ПЦР с двумя и более праймерами (мультиплексная ПЦР) обеспечивает выявление сразу несколько генов (признаков).

114

Все штаммы V. cholerae способные вызывать заболевание продуцируют ток-син-корегулируемые пили, обеспечивающие адгезию возбудителя к слизистой тонкого кишечника и являющиеся рецептором для холерного умеренного фага СТХф. Синтез большой субъединицы токсин-корегулируемых пилей контролируется tcpA геном. Нуклеотидные последовательности данного гена у холерных вибрионов классического биовара отличается от таковой у V. cholerae eltor и V. cholerae 0139. Поэтому нами в качестве ДНК-матриц для мультиплексной ПЦР были выбраны tcpA и ctxA гены. На основе нуклеотидной последовательности tcpA гена апробированы две пары праймеров tcpACl 1- tcpACl 2 и tcpAEl 1- tcpAEl 2, обеспечивающие специфичную амплификацию участка размером 617 п.н. для V. cholerae cholerae и 471 п.н. для V. cholerae eltor, соответственно. В ходе серии экспериментов установлен оптимальный состав реакционной смеси и программа амплификации. Чувствительность реакции составила lxlO3 м.к./мл, специфичность -100 %, воспроизводимость 100 %.

Разработанную мультиплексную ПЦР с тремя парами праймерами использовали для идентификации 50 штаммов V. cholerae, выделенных на территории Дагестана в 1994 и 1998 гг. Использование традиционной схемы биотипирования у 63,4% штаммов, выделенных в 1994 г. и у 90 % - в 1998 г. было невозможно из-за их фагоре-зистентности. При ПЦР-анализе у 39 изолятов V. cholerae, выделенных от людей и из питьевой воды в очаге инфекции, наблюдали амплификацию фрагментов 564 п.н. и 471 п.н., что свидетельствовало о наличии ctxA и tcpA генов, характерных для токси-генных холерных вибрионов биотипа эльтор. При исследовании 9 штаммов V. cholerae, изолированных из объектов внешней среды, V. cholerae 88 (1994 г.) и V. cholerae 1-Д (1998 г.), выделенных от человека, в ПЦР со всеми праймерами имел место отрицательный результат, что подтверждало их эпидемическую безопасность.

115

При исследовании нативного материала возможно получение ложноотрица-тельных результатов, возникающих из-за ингибирования реакции амплификации компонентами проб, или вследствие малого количества микробных клеток в образцах большого объема. Для решения этих проблем перспективным представляется использование, соответственно, конкурирующей и магноиммуносепарационной ПЦР.

Принцип конкурирующей ПЦР (кПЦР) основан на использовании ДНК внутреннего контроля (ВК), амплификация которого осуществляется в каждой реакционной микропробирке с теми же праймерами, что и ДНК-мишень, и в результате которой образуются ампликоны отличные от ПЦР-продуктов ДНК-матрицы. Амплификация ВК свидетельствует о нормальном ходе ПЦР в данной пробе. Поскольку амплификация такого контроля и последовательности-мишени осуществляется в одинаковых условиях, между ними происходит конкуренция за праймеры, которая приводит к пропорциональному изменению количества нарабатываемых специфичных амплико-нов. Так, если концентрация ДНК-мишени во много раз превышает концентрацию ВК, то в ПЦР происходит наработка ампликонов только последовательности мишени. При условии равенства концентраций или если количество ДНК-мишени меньше ВК в 5-10 раз происходит наработка обоих ПЦР-продуктов, но с разной интенсивностью. И, наконец, если концентрация ДНК-мишени в несколько раз ниже ВК, то образуются ампликоны только внутреннего контроля. Отсутствие амплификации ВК свидетельствует об ингибировании реакции. Таким образом, кПЦР позволяет проводить не только контроль реакции амплификации на предмет получения ложноотрицательных ответов из-за наличия ингибиторов, но и полуколичественное определение содержание ДНК-мишени в исследуемой пробе.

116

Внутренний контроль был получен путем вставки 92-звенного фрагмента участка LacZ вектора pUC 18, прилегающего к сиквенс-праймеру М13 со стороны противоположной полилинкеру, вместо 4 звеньев амплификата ctxA гена между ctx2 и ctx3 праймерами. В результате длина амплифицируемого ВК составила 652 п.н. Экспериментально было установлено, что минимальное количество вносимых в каждую реакционную микропробирку копий внутреннего контроля - 50. Такая концентрация не приводит к снижению диагностической чувствительности ПЦР-тест-системы при исследовании биологического материала и объектов внешней среды (1x10 м.к./мл).

Конкурирующая ПЦР с ВК была апробирована нами при исследовании проб воды открытых водоемов. Во всех случаях зафиксировано отсутствие ампликонов ДНК-мишени на фоне амплификации ВК с интенсивностью отличающейся от контрольной. Полученные результаты свидетельствуют о наличии в исследуемых образцах веществ частично ингибируюших реакцию амплификации и истинности полученных отрицательных результатов.

Увеличению чувствительности ПЦР и, таким образом, предотвращению лож-ноотрицательных результатов при исследовании проб с низкой обсемененностью, способствует использование на этапе подготовки проб магноиммуносорбентов (МИС), осуществляющих на своей поверхности избирательное концентрирование микроорганизмов. Для определения эффективности магноиммуносепарационной ПЦР (МС-ПЦР) при анализе проб объектов внешней среды мы использовали композиционные МИС, любезно предоставленные производственным отделом Ставропольского НИПЧИ (заведующая - д.м.н. Тюменцева И.С.). В ходе серии экспериментов установлено, что чувствительность МС-ПЦР при исследовании чистых культур и воды открытых водоемов составила 10 м.к./мл и 100 м.к./л, соответственно. Нами также

117 отмечен ряд преимуществ магноиммносепарационной ПЦР: возможность работы с большими объемами воды, продолжительность анализа 6 ч против 48 -72 ч при бактериологическом исследовании; упрощение процедуры выделения ДНК, которая сводилась к прогреванию суспендированных в дистиллированной воде МИС при 100 °С в течение 30 мин; на результаты реакции не влияло наличие посторонней микрофлоры.

Таким образом, нами разработана "Тест-система для выявления Vibrio cholerae (ctxA+) методом полимеразной цепной реакции". Чувствительность ПЦР-анализа с использованием данной тест-системы составляет 10 - 1000 м.к./мл при исследовании чистых культур микроорганизмов и 1000 м.к./мл - при работе с биологическим материалом и объектами внешней среды, специфичность - 100 %, воспроизводимость результатов -100 %.

Намечены пути совершенствования ПЦР-тест-системы. С целью дифференциации истинных и ложноотрицательных ответов, возникающих из-за ингибирования реакции компонентами исследуемых проб, наиболее оптимальным представляется использование конкурирующей ПЦР с введением в состав диагностического набора внутреннего контроля. При исследовании образцов большого объема с низкой концентрацией микроорганизмов чувствительность метода может быть существенно повышена с помощью использования на этапе подготовки проб магноиммуносорбентов, обеспечивающих селективное концентрирование холерных вибрионов. Одновременная детекция и биотипирование токсигенных штаммов V. cholerae возможно при использовании мультиплексной ПЦР с двумя и более праймерами.

Применение новой генетической технологии - ПЦР-анализа в комплексе с традиционными методами лабораторной диагностики холеры, позволяет существенно

118 повысить эффективность выявления V. cholerae, установить эпидзначимость обнаруженных штаммов, своевременно принять адекватные противоэпидемические меры.

119

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Давыдова, Наталия Александровна, 2001 год

1. Адамов А.К., Быстрый Н.Ф., Шмеркевич Д.Л., Середин В.Г. Методика дифференцирования патогенных и апатогенных вибрионов Эль-Тор // Пробл. особо опасных инфекций. Саратов, 1971. - Вып. 1 (17). - С. 116-123.

2. Адамов А.К. Иммунология холеры. Саратов: изд-во СГУ, 1981. - 320 с.

3. Адамов А.К. Современные данные по иммунологии и иммунопрофилактике холеры // Обл. науч.-практ. конф. по проблеме "Холера": Тез. докл. Ростов-н/Д, 1984. - С. 75-83.

4. Адамов А.К., Наумшина М.С. Холерные вибрионы. Саратов: Изд-во СГУ, 1984. -327 с.

5. Аксенов М.Ю., Гинцбург А.Л. Диагностика инфекционных заболеваний с помощью метода ПЦР // Мол. ген., микробиол. и вирусол. 1993. - N 4. - С. 3-8.

6. Алексеева Л.П., Бурлакова О.С., Винокур Н.И. Моноклональные антитела в диагностике возбудителя холеры // Состояние проблемы и перспективы развития диагностики бактериальных инфекций: М-лы раб. совещ. Оболенск, 1990. - С. 69.

7. Аляпкина Ю.С., Аксенов М.Ю., Чернов Б.К., Гинцбург А.Л. Количественный ПЦР-анализ: разработка системы определения содержания амплифицированного фрагмента ДНК // Мол. ген., микроб, и вирусологии. -1994. N 5. - С. 22-26.

8. Балахонов С.В., Ганин B.C., Урбанович Л.Я. с соавт. Определение генных детерминант холерного энтеротоксина методом полимеразной цепной реакции // Журнал инфекционной патологии. 1998. - Т.5, N 4. - С. 52-54.

9. Брюханов А.Ф. Молекулярно-биологическая характеристика штаммов холерных вибрионов эльтор разного происхождения: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Саратов, 1991.-20 С.

10. Василенко Н.Ф., Ефременко В.И., Гнутов И.Н. Тест-система диагностическая для выявления вируса гепатита А: Пат. N 5036693 РФ, G 01 N 33153; Заявл. 9.04.92; Опубл. 22.02.95.

11. Вертиев Ю.В., Шагинян И.А., Степанова М.В., Езепчук Ю.В. Определение токси-генности штаммов кишечной палочки и холерного вибриона радиоиммунологическим методом // Мол. генет., микробиол. и вирусол. 1985. - N 3. - С. 38-40.

12. Владимцева И.В., Ефременко В.И., Пушкарь В.Г. с соавт. Иммунофлюоресцент-ный метод обнаружения холерного токсина // ЖМЭИ. 1986. - N 12. - С. 62-65.

13. Власов В.П., Монахова Е.В., Ушакова И.Е. с соавт. Гемолизин Vibrio cholerae eltor: клонирование и экспрессия генов в Е. coli // Мол. ген., микробиол. и ви-русол. 1992, N 7-8. - С. 14-20.

14. Воробьев А.А., Виха И.В. Современное состояние и перспективы совершенствования иммуноферментного анализа для решения задач клинической диагностики // ЖМЭИ. 1987. - N 9. - С. - 3-8.

15. Воронцова М.С., Балаян М.С. Методы лабораторной диагностики энтеровирус-ных инфекций. М.: Медицина, 1964. - С. 125.

16. Гавенский С.Д., Ефременко В.И., Климова И.М. с соавт. Современные методы диагностики особо опасных инфекций и способы их применения: Метод, пособие. Саратов, 1991. - С. 35-40.

17. Гаранина С.Б. Конструирование тест-системы, основанной на полимеразной цепной реакции, для детекции возбудителя бруцеллеза: Автореф. дисс. . канд. мед. наук. Саратов, 1996. - 20 с.

18. Гинцбург A.JL, Брюханов А.Ф., Янишевский Н.В. Определение наличия гена ток-синообразования у холерного вибриона: Методич. рекомендации. М., 1986.

19. Гинцбург A.JL, Грижебовский Г.М., Токарская О.Н. Изучение полиморфизма штаммов холерного вибриона разного происхождения методом геномной дактилоскопии // Генетика. 1989. - Т. 25, N 7. - С. 1320-1324.

20. Гинцбург А.Л., Янишевский Н.В., Мотин В.Л. с соавт. Организация и клонирование структурных генов энтеротоксина Vibrio cholerae eltor RV 79 // Мол. ген., микробиол. и вирусол. 1984. - N 9. - С. 12-19.

21. Глухов А.И., Онищенко Г.Г., Гордеев С.А. с соавт. Определение содержания гена холерного токсина в составе ДНК из штаммов Vibrio cholerae методом "гнездовой"125полимеразной цепной реакции // Журн. микробиол. 1996. - N 5. - С. 20-22.

22. Голосев Ю.А. Количественная оценка активности холерного энтеротоксина им-мунофдюоресцентным методом // Акгуал. вопр. микробиол., лаб. диагн. и профи-лакт. холеры: Тез. Всесоюз. науч. конф., 16-18 ноября 1988 г. Ростов-н/Д, 1988. -С. 168-170.

23. Демкин В.В., Бруханский Г.В., Захаренко В.И. с соавт. Использование метода ДДК-ДНК-гибридизации на фильтрах для определения токсигенной потенции атипичных штаммов Vibrio cholerae, выделенных из природных источников // ЖМЭИ. 1989. - N 2. - С. 41-45.

24. Езепчук Ю.В. Биомолекулярные основы патогенности бактерий. М.: Медицина, 1977.-216 с.

25. Ефременко В.И. Магносорбенты в микробиологических исследованиях. Ставрополь, 1996.- 131 с.

26. Ефременко В.И., Пушкарь В.Г., Трофимов Е.Н., Перов В.Ю. Получение и применение магнитных сорбентов в методах иммуноанализа микроорганизмов // ЖМЭИ. 1989.-N12.-С. 100-105.

27. Ефременко В.И., Таран В.И., Афанасьев Е.Н., Тюменцева И.С. Опыт применения магносорбентных диагностикумов в эпиднадзоре за холерой в Дагестане и Чеченской республики // ЖМЭИ. 1996. - N 3. - С. 73-75.

28. Ефременко В.И., Шапко С.А., Нарбутович Н.И. с соавт. Новый метод выделения возбудителя холеры из воды // Особо опасные инфекционные заболевания: диагностика, профилактика и биологические свойства возбудителей. Волгоград, 1990. -Вып. 4.-с. 213-219.

29. Захаренко В.И., Бруханский Г.В., Вертиев Ю.В. с соавт. Клонирование фрагментов хромосомы V. cholerae 569В, содержащих структурные гены холерного токсина, в клетках Е. coli // Мол. ген., микробиол. и вирусол. 1984, N 1. - С. 3-8.

30. Зименков И.В. Иммуноферментный анализ в лабораторной диагностике холерных вибрионов не 01 группы: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Волгоград, 1990. -17 с.

31. Зыкин Л.Ф. Применение иммуноферментного и радиоиммунного методов, реакций коагглютинации и газожидкостной хроматографии для диагностики особо опасных инфекций // Лаб. диагн., биохимия и специф. профилак. чумы и холеры. -Саратов, 1986. С. 90-103.

32. Климова И.М., Ефременко В.И., Пушкарь В.Г. Магнитный иммуноферментный анализ антигенов Yersinia pestis // ЖМЭИ. 1989. - N 7. - С. 62-66.

33. Климова И.М., Пушкарь В.Г., Тихонов Н.Г. Иммноферментный анализ токсина чумного микроба на магнитных микрогранулах // Генетика и биохимия вирулентности возбудителей особо опасных инфекций. Волгоград, 1992. - С. 155.

34. Кузьмин А.И., Хальчицкий С.Е., Скрябин Б.В. с соавт. Простые методы энзима-тической амплификации ДНК для клинической практики // Мол. ген., микроб, и вирус. 1991.-N 8.-С. 6-8.

35. Куличенко А.Н. Конструирование молекулярно-генетических систем для детекции возбудителей особо опасных инфекций: чумы, бруцеллеза и сибирской язвы: Автореф. дис. д-ра мед. наук. Саратов, 1995. - 38 с.

36. Лобанов В.В., Власов В.П., Монахов Е.В. с соавт. Современные подходы к оценке способности холерных вибрионов продуцировать холероген // ЖМЭИ. 1990.1291. N 1. С. 101-102.

37. Мальков И.Г., Артюшин С.К., Фомин Б.А., Коромыслов Г.Ф. Разработка метода идентификации микобактерий бычьего и человеческого видов с использованием реакции цепной полимеризации //Мол. ген., микроб, и вирус. 1993. - N 2. - С. 27 -30.

38. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование: Пер. с анл. М.: Мир, 1984. - 480 с.

39. Маркова Г.Л., Бошнаков Р.Х., Петров Я.К. с соавт. Применение полимеразной цепной реакции для идентификации Helicobacter pylori в клиническом материале // Мол. ген., микроб, и вирус. 1994. - N 1. - С. 10-15.

40. Михайлов И.Ф. Флуоресцирующие антитела и методы их применения. М.: Медицина, 1968. - 188 с.

41. Мишанысин Б.Н., Шиманюк Н.Я., Рябухина О.Ю. с соавт. Молекулярное клонирование генов нейраминидазы V. cholerae El Tor: перспективы использования //130

42. Вест. Всесоюз. микробиол. об-ва. Ростов, отд. Ростов - н/Д, 1989. - Вып. 1. -С. 149-156.

43. Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: электрофорез и ультрацентрифугирование. М.: Наука, 1981. - 288 с.

44. Остроумова Н.М., Мороз В.П., Караваева Т.Б. с соавт. Внутривидовая дифференциация Vibrio cholerae по иммунотипу их умеренных фагов на токсигенные (Vct+) и нетоксигенные (Vet") варианты // ЖМЭИ. 1993. - N 4. - С. 116-120.

45. Остроумова Н.М., Мороз В.П., Коровкина Г.И., Синичкина Н.А. Итоги разработки диагностического фагового препарата, пригодного для дифференциации Vct+ и Vet" вариантов вибрионов эльтор // Деп. в ВИНИТИ 14.01.97 N 109. С. 97.

46. Парамонов И.В., Вахнов Е.Ю., Воробьев А.А. Обнаружение и идентификация холерных вибрионов с использованием полимеразной цепной реакции // Пробл. особо опасных инфекций. Саратов,1999. - Вып. 79. - С. 95-102.

47. Подосинникова J1.C., Ломов Ю.М., Власов В.В. с соавт. Молекулярное зондирование холерных вибрионов с целью эпидемиологического анализа // Вест. Всесо-юз. микробиол. об-ва. Ростов, отд. 1989. - Вып. 1. - С. 35-38.

48. Подосинникова Л.С., Черепахина И.Я. Изменчивость холерных вибрионов // Пробл. особо опасных инфекций. Саратов, 1998. - С. 22-31.

49. Радюк С.Н., Мацевич Г.Р., Рыжов К.А., Ларюкова Т.А. Неизотопный вариант количественного анализа с помощью полимеразной цепной реакции в диагностике ВИЧ-инфекции//Вопросы вирусологии. 1996. - Т. 41, N 1. - С. 44-45.

50. Рыбкин B.C. Коагтлютинация как метод диагностики природно-очаговых инфекций // Профилакт. природно-очаговых инф.: Тез. докл. Всесоюз. науч.-практ. конф. Ставрополь, 1983. - С. 346-348.

51. Самсонова А.П., Аксенов М.Ю., Ананьина Ю.В. с соавт. Разработка тест-системы для выявления Leptospira interrogans методом полимеразной цепной реакции // Мол. ген., микроб, и вирус. 1994. - N 1. - С. 15-19.

52. Сергиев В.П., Марамович А.С. Эпидемиологические и этиологические проблемы холеры Эль-Тор // ЖМЭИ. 1988. - N 1. - С. 88-94.

53. Синичкина Н.А., Мороз В.П., Коровкина Г.И. с соавт. К изучению механизма фа-горезистентности вирулентных холерных Vct+ штаммов биовара эльтор к фагам ХДФ // Пробл. особо опасных инфекций. Саратов: Изд-во СГУ, 1998. - С. 147-152132

54. Смирнова Н.И. Основные факторы патогенности холерного вибриона и их генетический контроль // ЖМЭИ. 1987. - N 7. - С. 102-108.

55. Смирнова Н.И., Кириллина О.А., Бирюкова Н.Б., Кутырев В.В. Генетические маркеры эпидемически значимых штаммов холерного вибриона // Пробл. особо опасных инф.: Сб. науч. трудов. Саратов,1999. - Вып. 79. - С. 25-35.

56. Сун Ч. Совершенствование экспрессных методов индикации чумного микроба: Дис. канд. мед. наук. Ставрополь, 2000. - 171 с.

57. Тюменцева И.С. Научно-методические основы конструирования и усовершенствования производства диагностических тест-систем для выявления возбудителей особо опасных инфекций: Автореф. дис. д-ра мед. наук. Саратов, 1996. - 57 с.

58. Тюменцева И.С., Ефременко В.И., Афанасьев Е.Н. с соавт. Индикация возбудителей особо опасных инфекций с помощью композиционных магноиммуносорбен-тов. Деп. в ВИНИТИ 25.01.95, N 221- В95.

59. Уранева B.C., Фецайлова О.П., Воронежская Л.Г. с соавт. Оценка иммунофлуо-ресцентного метода идентификации холерных вибрионов // Пробл. особо опасных инф. Саратов, 1974. - Вып. 2. - С. 139-141.

60. Чард Т. Радиоиммунологические методы. М.: Мир, 1981. - 246 с.

61. Четина Е.В., Гинцбург А.Л., Грижебовский Г.М. Исследование эпидемической значимости некультивируемых форм холерных вибрионов методом полимеразной цепной реакции // ЖМЭИ. 1992. - N 3. - С. 21-25.

62. Четина Е.В., Грижебовский Г.М., Брюханов А.Ф. с соавт. О возможном механизме эндемичности современной холеры (роль некультивируемых форм Vibrio cholerae 01) // Мол. ген., микробиол. и вирусол. 1993. - N 6. - С. 18-22.

63. Шагинян И.А., Токарская О.Н., Грижебовский Г.М. Использование ДНК фага М13 для выявления полиморфизма у возбудителей бактериальных инфекций // Бактериальные плазмиды: Тез. докл. Нальчик, 1990. - С. 86-87.134

64. Шестопалов М.Ю. Практические аспекты использования полимеразной цепной реакции в лабораторной диагностике бруцеллеза: Диссер. . канд. мед. наук. Иркутск, 1999. - 136 с.

65. Щуркина И.И., Чибринова Е.В., Проценко О.А., Урютина Н.В. Идентификация вибрионов, выделенных из воды с помощью иммунофлуоресцентного метода // Микробиол. и иммунол. особо опасных инф.: Сб. противочум. учреж. Саратов, 1968. - вып. 3.-С. 261-265.

66. Яковлев А.Т., Зыкин Л.Ф., Рыбкин B.C. Иммуноферментный анализ в микробиологии. Саратов: Изд-во СГУ, 1990. - 109 с.

67. Инструкция по организации и проведению противохолерных мероприятий, испр. и допол. М.: Инф-изд. Центр ГКСЭН России, 1996. -176 с.

68. Abbott S.L., Janda J.M. Rapid detection of acute cholera in airline passengers by coag-glutination assay // J. Infect Dis. 1993. - Vol. 168. - P. 797-799.

69. Ahokas H., Erkkila M.J. Interference of PCR amplification by the polyamines, spermine and spermidine II PCRMeth. Appl. 1993. - Vol. 3. - P. 65-68.

70. Albert J., Fenyo E.M. Simple, sensitive, and specific detection of human immunodeficiency virus type 1 in clinical specimens by polymerase chain reaction with nested primers // J. Clin. Microbiol. 1990. - Vol. 28. - P. 1560-1564.

71. Alexandre A., Zammatteo N., Ernest I. et al. Quantitative determination of CMV DNA using a combination of competitive PCR amplification and sandwich hybridization // BioTechniques. 1998. - Vol. 25, N 4. - P. 676-683.135

72. Allard A., Giornas R., Juto P., Wadell G. Polymerase chain reaction for detection of adenoviruses in stool samples // J. Clin. Microbiol. 1990. - Vol. 28, N 12. - P. 26592667.

73. Almeida R.J., Hickman-Brenner F.W., Sowers E.G. et al. Comparison of a latex agglutination assay and an enzyme-linked immunosorbent assay for detection cholera toxin // J. Clin. Microbiol. 1990. - Vol. 28. - P. 128-130.

74. Attridge S.R., Voss E., Mamung P. A. The role of toxin co-regulated pili in the pathogenesis of Vibrio cholerae 01 El Tor//Microb. Pathog. 1993. - V. 15. - P. 421-431.

75. Babu J.S., Kanangat S., Rouse B.T. Limitations and modifications of quantitative polymerase chain reaction. Application to measurement of multiple mRNAs present in small amounts of sample RNA // J. Immunol. Meth. 1993. - Vol. 165. - P. 207-216.

76. Baudry В., Fasano A., Ketly J., Kaper J.B. Cloning of a gene (zot) encoding a new toxin produced by Vibrio cholerae // Infect. Immun. 1992. - Vol. 60. - P. 428-434.

77. Becker-Andre M., Hahlbrock K. Absolute mRNA quantification using the polymerase chain reaction (PCR). A novel approach by a PCR aided transcript titration assay (PATTY) // Nucl. Acids Res. 1989. - Vol. 17. - P.9437-9446.

78. Belak S., Ballagi-Pordany A. Experiences on the application of the polymerase chain reaction in a diagnostic laboratory // Mol. and Cell. Probes. 1993. -Vol. 7. - P. 241248.

79. Benavides G.R., Hubby В., Grosse W.M. et al. Construction and use of multi-competitor gene for quantitative RT-PCR using existing primer sets // J. Immunol.4

80. Methods. 1995. - Vol. 181. - P. 145-156.

81. Benenson A.S., Islam M.R., Greenough W.R. Rapid identification of Vibrio cholerae by darkfield microscopy // Bull. WHO. 1964. - Vol. 30. - P. 827-831.136

82. Besnard N.C., Andre P.M. Automated quantitative determination of hepatitis С virus viremia by reverse transcription-PCR // J. Clin. Microbiol. 1994. - Vol. 32. - P. 18871893.

83. Beutin L., Bodi L., Richter Th. et al. Rapid visual detection of Escherichia coli and Vibrio cholerae heat-labile enterotoxins by nitrocellulose enzyme-linked immunosorbent assay // J. Clin. Microbiol. 1984. - Vol. 19, N 3. - P. 371-375.

84. Blok H.J., Gohlke A.M., Akkermans A.D.L. Quantitative analysis of 16s rDNA using competitive PCR and the QPCR (TM) system 5000 // BioTechniques. 1997. - Vol.22, N 4. - P. 700.

85. BonodBidaud C., Giraud S., Mandon G. et al. Quantification of OXPHOS gene transcripts during muscle cell differentiation in patients with mitochonrial myopathies // Exp.l Cell Res. 1999. - Vol. 246, N 1. - P. 91-97.

86. Boom R., Sol C.J.A., Salimans M.M. et al Rapid and simple method for purification of nucleic acids // J. Clin. Microbiol. 1990. - Vol. 28. - P. 495-503.

87. Brayton P.R., Tamplin M.L., Huq A., Colwell R.R. Enumeration of Vibrio cholerae 01 in Bangladesh waters by fluorescent-antibody direct viable count // Appl. Environ. Microbiol. 1987. - Vol. 53. - P. 2862-2865.

88. Brightwell С., Pearce M., Leslie D. Development of internal controls for PCR detection of Bacillus anthracis //Mol. and Cell. Probes. 1998. - Vol. 12, N 6. - P. 367-377.

89. Bukhari Z., McCuin R.M., Fricher C.R., Clancy J.L. Immynomagnetic separation of Cryptosporidium parvum from source water samples of various turbidities // Appl. and Environ. Microbiol. 1998. - Vol. 64, N 11. - P. 4495-4499.

90. Caballero O.L., Menezes C.L.P., Villa L.L., Simpson A.J.G. A novel, internally competitive polymerase chain reaction for quantification of human cytomegalovirus DNA in human leukocytes // Moll, and Cell. Probes. 1999. - Vol. 13, N 6. - P. 407-413.137

91. Celi F.S., Zenilman M.E., Shuldiner A.R. A rapid and versatile method to synthesize internal standards for competitive PCR // Nucl. Acids Res. 1993. - Vol. 21. - P. 1047.

92. Chaicumpa W., Srimanote P., Sakolvaree Y. et al. Rapid diagnosis of cholera caused by Vibrio cholerae 0139 // J. Clin. Microbiol. 1998. - Vol. 36, N 12. - P. 3595-3600.

93. Chung E., Aldom J.E., Carreno R.A. et al. PCR-based quantitation of Cryptosporidium parvum in municipal water samples // J. Microbiol. Meth. 1999. - Vol. 38, N 1-2. - P. 119-130.

94. Cleland A., Nettleton P., Jarvis L.M., Simmonds P. Use of bovine viral diarrhoea virus as an internal control for amplification of hepatitis С virus // Vox Sanguinis. 1999. -Vol. 76, N3.-P. 170-174.

95. Coelho A., Andrade J.R.C., Baptista M.A.S. et al. Genomic fingerprints of Vibrio cholerae using arbitrary primer PCR are useful epidemiological tools // Cytokines, Cholera, and the Gut. 1995a. - P. 203-211.

96. Coelho A.,Vicente A.C.P., Baptista M.A.S. et al. The distinction of pathogenic Vibrio cholerae groups using arbitrarily primed PCR fingerprints // Res. in Microbiol. -1995b. Vol. 146, N 8. - P. 671-683.

97. Colwell R.R., Briton P.R., Grimes D.J. et al. Viable but nonculturable Vibrio cholerae and related pathogens in the environment: implication for the release of genetically engineered microorganisms //BioTechnology. 1985. - Vol. 3. - P. 817-820.

98. Colwell R.R., Hasan J.A.K., Huq A. et al. Development and evaluation of a rapid, simple, sensitive, monoclonal antibogy-based coagglutination test for direct detection138of Vibrio cholerae 01 // FEMS Microbiol. Lett. 1992. - Vol. 97. - P. 215-220.

99. Colwell R.R., Spira W.M. The ecology of Vibrio cholerae II In: D. Barua and W.B. Greenough, III (ed.) Cholera: Plenum Medical Book Co. NewYork, 1992. - P. 107127.

100. Cone R.W., Hobson A.C., Hwang M.W. Coamlified positive control detects inhibition of polymerase chain reaction // J. Clin. Microbiol. 1992. - Vol. 30. - P. 3185-3189.

101. Cudjoe K.S., Krona R., Olsen E. IMS: a new selective enrichment technique for detection of Salmonella in foods // Intern. J. Foods Microbiol. 1994. - Vol. 23. - P. 159165.

102. Damian M., Koblavi S., Carle A. et al Molecular characterization of Vibrio cholerae 01 strains isolated in Romania // Res. in Micribiol. 1998. - Vol. 149, N 10. - P. 745755.

103. Demeke Т., Adams R.P. The effects of plant polysaccharides and buffer additives on PCR // Bio Techniques. 1992. - Vol. 12. - P. 332-334.

104. Deng M.Q., Cliver D.O., Mariam T.W. Immunomagnetic capture PCR to detect viable Cryptosporidium parvum oocysts from environmental samples // Appl. and Environ. Microbiol. 1997. - Vol. 63, N 8. - P. 3134-3138.

105. Deng M.Q., Lam K.M., Cliver D.O. Immunomagnetic separation of Cryptosporidium parvum using MACS Micro Beads and high gradient separation columns // J. Microbiol. Meth. 2000. - Vol. 40, N 1. - P. 11-17.

106. DePaola A., Hwang G-C. Effect of dilution, incubation time, and temperature of enrichment on cultural and PCR detection of Vibrio cholerae obtained from the oyster Crassostrea virginica //Mol. and Cell. Probes. 1995. - Vol. 9. - P. 75-81.

107. Dickover R.E., Donovan R.M., Goldstein E. et al. Quantitation of human immunodeficiency virus DNA by using the polymerase chain reaction // J. Clin. Microbiol. 1990. -Vol. 28, N9.-P. 2130-2133.

108. Don R.H., Сох P.T., Wainwright B.J. et al Touchdown PCR to circumvent spurious priming during gene amplification // Nucl. Acids Res. -1991. Vol. 19. - P. 4008.

109. Donta S.T. Differentiation between the steroidogenic effects of cholera enterotoxin and adrenocorticotropin through use of a mutant adrenal cell line // J. Infect. Dis.•s1974.-Vol. 129.-P. 728-731.

110. Dutta N.K., Habbu N.Y. Experimental cholera in infant rabbits: a method for chemo-therapevtic investigation // Br. J. Pharmacol. Chemother. 1965. - Vol. 10. - P. 153159.140

111. Enroth H., Engstrand L. Immunomagnetic separation and PCR for detection of Helicobacter pylori in water and stool specimens // J. Clin. Microbiol. 1995. - Vol. 33. -P. 2162-2165.

112. Forster E. An improved general method to generate internal standards for competitive PCR // BioTechniques. 1994. - Vol. 16. - P. 18-20.

113. Faruque S.M., Ahmed K.M., Alim A.R.M. et al. Emergence of a new clone of toxigenic Vibrio cholerae 01 biotype El Tor displacing V. cholerae 0139 Bengal in Bangladesh // J. Clin. Microbiol. 1997. - Vol. 35. - P. 624-630.

114. Faruque S.M., Albert M.J., Mekalanos J.J. Epidemiology, genetics and ecology of toxigenic Vibrio cholerae // Microbiol, and Molecular Biology Rev. 1998 a. - Vol. 62, N4.-P. 1301-1314.

115. Fasano A., Bandry В., Pumplin D.W. et al. Vibrio cholerae produces a second en-terotoxin, which affects intestinal tight junctions // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1991. -Vol. 88. - P. 5242-5246.

116. Fasco M.J., Treanor C.P., Spwack S. et al. Quantitative RNA-polymerase chain reac-tion-DNA analysis by capillary electrophoresis and laser-induced fluorescence // Anal. Biochem. 1995. - Vol. 224. - P. 140-147.

117. Fields M. Secretion of electrolytes and water by mammalian small intestine // In: L.R. Johnson (ed.) Physiology of the gastrointestinal tract. Raven Press, New York, 1981. -P. 963-982.

118. Fields P.A., Popovic Т., Wachsmuth K., Olsvik Q. Use of polymerase chain reaction141for detection of toxigenic Vibrio cholerae 01 strains from the Latin American cholera epidemic // J. Clin. Microbiol. 1992. - Vol. 30. - P. 2118-2121.

119. Finkelsteiii R.A., LaBrec E.H. Rapid identification of cholera vibrios with fluorescent antibody // J. Bacterid. 1959. - Vol. 78. - P. 886-891.

120. Fox J.C., Griffiths P.D., Emery V.C. Quantification of human cytomegalovirus DNA using the polymerase chain reaction // J. Gen. Virol. 1992. - Vol. 73. - P. 2405-2408.

121. Furtado M.R., Murphy R., Wolinsky S.M. Quantification of human immunodeficiency virus type 1 tat mRNA as a marker for assessing the efficacy of antiretroviral therapy // J. Infect. Dis. 1993. - Vol. 167. - P. 213-216.

122. Galea E., Feinstein D.L. Rapid syntheses of DNA deletion constructs for mRNA quantitation: analysis of astrocyte m RNAs // PCR Meth. Appl. 1992. - Vol. 2. - P. 66-69.

123. Gehring A.G., Crawford C.G., Mazenko R.S. et al Enzyme-linked immunomagnetic electrochemical detection of Salmonella typhimurium // J. Immunol. Meth. 1996. -Vol. 195, N 1-2.-P. 15-25.

124. Gennaro M.L., Greenaway P.J., Brvadbent D.A. The expression of biologically active cholera toxin in Escherichia coli // Nucleic Acid Res. 1982. - Vol. 10. - P. 4883-4890.

125. Gill D.M., King C.A. The mechanism of action of cholera toxin in pigeon erythrocyte lysates // J. Biol. Chem. 1975. - Vol. 250. - P. 6424-6432.

126. Gill D.M., Rapparopt R.S. Origin of the enzymatically active Al fragment of cholera toxin // J. Infect. Dis. -1979. Vol. 139. - P. 674-680.

127. Gilliland G., Perrin S., Blanchard K., Bunn H.F. Analysis of cytokine mRNA and DNA: detection and quantitation by competitive polymerase chain reaction // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. - Vol. 87. - P. 2725-2729.

128. Goding J.W. Use of Staphilococcal protein A as an immunological reagent // J. Immu142nol. Meth. 1978. - Vol. 20, N 2. - P. 241-248.

129. Gomes P., Taveira N.C., Pereira J.M. et al. Quantitation of human immunodeficiency virus type 2 DNA in peripheral blood mononuclear cells by using a quantitative-competitive PCR assay // J. Clin. Microbiol. 1999. - Vol. 37, N 2. - P. 453-456.

130. Gooding C.N., Choudary P.V. Detection of Escherichia coli 0157-.H7 in ground beef in eight hours // J. Microbiol. Meth. 1998. - Vol. 34, N 2. - P. 89-98.

131. Grassi G., Zentilin L., Tafuro S. et al. A rapid procedure for the quantitation of low abundance RNAs by competitive reverse transcription-polymerase chain reaction // Nucl. Acids. Res. 1994. - Vol. 22. - P. 4547-4549.

132. Greenfield L., White TJ. Sample preparation methods // In: D.N. Persing, T.F. Smith, F.C. Tenover Diagnostic molecular microbiology (Ed. T.J. White). American Society for Microbiology, Washington, D.C. - 1993. - P. 122-137.

133. Gustafsson B. Monoclonal antibody-based enzyme-linked immunosorbent assay for identification and serotyping of Vibrio cholerae // J. Clin. Microbiol. 1984. - Vol. 20, N6.-P. 1180-1185.

134. Herrengton D.A., Hall R.H., Losonsky G. et al. Toxin, toxin-coregulated pili and ToxR regulon are essential for Vibrio cholerae pathogenesis in humans // J. Exp. Med. 1988. - Vol. 168. - P. 1487-1492.143

135. Holmgren J., Svennerholm A.-M. Enzyme-linked immunosorbent assay for cholera serology // Infect. Immun. 1973. - Vol. 7, N 5. - P. 759-763.

136. Holodniy M., Kum S., Katzenstein D. et al. Inhibition of human immunodeficiency virus gene amplification by heparin // J. Clin. Microbiol. 1991. - Vol. 29. - P. 676679.

137. Honda Sh.-I., Shinoirisa Т., Adochi A. et al. Clinical isolates of Vibrio cholerae 01 not-producing cholera toxin // Lancet. 1988. - Vol. 2, N 8626/8627. - P. 1486.

138. Hoonan K.E., Beck C., Holzmayer T.A. et al. Quantitative analysis of MDR 1 (multidrug resistance) gene expression in human tumor by polymerase chain reaction // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1990. - Vol. 87. - P. 7160-7164.

139. Horton R.M., Hobbe B.L., Conte-Tronconi B.M. Ampligrease: "hot start" PCR using petroleum jelly //BioTechniques. 1994. - Vol. 16. - P. 42-43.

140. Hoshino K., Yamasaki S., Mukhopadhyay A.K. et al. Development and evolution of a multiplex PCR assay for rapid detection of toxigenic Vibrio cholerae 01 and 0139 // FEMS Immun. and Med. Microbiol. 1998. - Vol. 20. - P. 201-207.

141. Hu Y., Zhang Q., Meitzler J.C. Rapid and sensitive detection of Escherichia coli 0157:H7 in bovine feces by a multiplex PCR // J. Appl. Microbiol. 1999. - Vol. 87, N 6. - P. 867-876.

142. Inouye S., Hondo R. Microplate hybridization of amplified viral DNA segment // J. Clin. Microbiol. 1990. - Vol. 28, N 6. - P. 1469-1472.144

143. Islam D., Tzipori S., Lindberg A.A. Rapid detection of Shigella dysenteriae and Shigella flexneri in faeces by an immunomagnetic assay with monoclonal antibodies // European J. Clin. Microbiol, and Infect. Dis. 1993. - Vol. 12. - P. 25-32.

144. Jalava Т., lehtovaara P., Kallio A., et al. Quantification of hepatitis В virus DNA by competitive amplification and hybridization on microplates // BioTechniques. 1993. -Vol. 15. - P. 134-139.

145. Jesudason M.V., Thangavelu C.P., Lalitha M.K. Rapid screening of fecal samples for Vibrio cholerae by a coagglutination technique // J. Clin. Microbiol. 1984. - Vol. 19. -P. 712-713.

146. Jin C.-F., Mata M., Fink D.J. Rapid construction of deleted DNA fragments for use as internal standards in competitive PCR // PCR Meth. Appl. 1994. - Vol. 3. - P. 252255.

147. Johnson D.W., Piemazek N.J., Griffin D.W. et al. Development of a PCR protocol for sensitive detection of Cryptosporidium oocysts in water samples // Appl. and Environ. Microbiol. 1995. - Vol. 61, N 11. - P. 3849-3855.

148. Jolly M.E., Wang Chao J.H., Ekenberg S.J. et al. Particle concentration fluorescence immunoassay (PCEJA): a new rapid immunoassay technique with high sensitivity // J. Immunol. Meth. 1984. - Vol. 67, N 1. - P. 21-35.

149. Jurriaans S., Dekker J.T., A. de Ronde HIV-1 viral DNA load in peripheral blood mononuclear cells from seroconverters and long-term infected individuals // AIDS. -1992.-Vol. 6.-P. 635-641.

150. Kanangat S., Solomon A., Rouse B.T. Use of quantitative polymerase chain reaction to quantitate cytokine messenger RNA molecules // Mol. Immunol. 1992. - Vol. 29. -P. 1229-1236.

151. Kaneko S., Murakami S., Unoura M., Kobayashi K. Quantitation of hepatitis С virus RNA by competitive polymerase chain reaction // J. Med. Virol. 1992. - Vol. 37. - P. 278-282.

152. Kant E. de, Rochlitz C.F., Herrmann R. Gene expression analysis by a competitive and differential PCR with antisense competitors // BioTechniques. 1994. - Vol. 17. - P. 934-942.

153. Kaper J.B., Levine M.M. Cloned cholera enterotoxin genes in study and pervention of cholera//Lancet. -1981.- Vol. 2.-P. 1162-1163.

154. Kaper J.B., Morris J.G., Levine M.M. Cholera // Clin. Microbiol. Rev. 1995. - Vol. 16.-P. 129-134.

155. Karaolis D.K.R., Johnson J.A., Bailey C.C. et al. A Vibrio cholerae pathogenicity is-lang associated with epidemic and pandemic strains // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. -1998.-Vol. 95, N6.-P. 3134-3139.

156. Kellogg D.E., Sninsky J.J., Kwok Quantitation of HIV 1 proviral DNA relative to cellular DNA by the polymerase chain reaction // Anal. Biochem. 1990. - Vol. 189. -P. 202-208.146

157. Kellogg D.E., Rabalkin A., Chen S. et al. TaqStart antibody™: "hot start" PCR facilitated by a neutralizing monoclonal antibody directed against Taq DNA polymerase // BioTechniques. 1994.-Vol. 16. - P. 1134-1137.

158. Kessler H.H., Dodge D.E., Pierer K. et al. Rapid detection of Mycoplasma pneumoniae by an assay based on PCR and probe hybridization in a nonradioactive microwell plate format // J. Clin. Microbiol. 1997. - Vol. 35, N 6. - P. 1592-1594.

159. Keyiti J., Pacsa A.S. Estimation of Vibrio cholerae and E. coli heat-labile enterotoxin by enzyme-linked immunosorbent assay // Acta Microbiol. Acad. Sci. Hung. 1980. -Vol. 27. - P. 89-97.

160. Khan G., Kanqro H.O., Coates P.J., Heath R.B. Inhibitory effects of urine on the polymerase chain reaction for cytomegalovirus DNA // J. Clin. Pathol. 1991. - Vol. 44. - P. 360-365.

161. Klein A., Barsuk R., Dagan S. et al. Comparison of methods for extraction of nucleic acids from hemolytic serum for PCR amplification of hepatitis В virus DNA sequences // J. Clin. Micribiol. 1997. - Vol. 35, N 7. - P. 1897-1899.

162. Kobayashi K., Set K., Akasaka S., Makino M. Detection of toxigenic Vibrio cholerae 01 using polymerase chain reaction for amplifying the cholera enterotoxin gene // J. Japanese Association Infect. Dis. 1990. - Vol. 64. - P. 1323-1329.

163. Koblavi S., Grimont F., Grimont P.A.D. Clonal diversity of Vibrio cholerae 01 evidenced by rRNA gene restriction patterns // Res. Microbiol. 1990. - Vol. 141. - P. 645-657.

164. Koch W.H., Payne W.L., Wentz B.A., Cebula T.A. Rapid polymerase chain reaction method for detection of Vibrio cholerae in foods // Appl. Environ. Microbiol. 1993. -Vol. 59.-P. 556-560.147

165. Kohsaka H., Tamgushi A., Richman D.D., Carson D.A. Microtiter format gene quantification by covalent capture of competitive PCR products: application to HIV-l detection//Nucl. Acids Res. 1993. - Vol. 21. - P. 3469-3472.

166. Kongmuang U., Luk J.M.C., Lendberg A.A. Comparison of three stool-processing methods for detection of Salmonella serogroups В, C2, and D by PCR // J. Clin. Microbiol. 1994. - Vol. 32. - P. 3072-3074.

167. Laser T.D. Quantification of Pseudomonas sp. strain В 13 (FR 1) in the marine environment by competitive polymerase chain reaction // J. Microbiol. Meth. 1995. - Vol. 22. - P. 249-262.

168. Levine M.M., Kaper J.B., Black R.E., Clements M.L. New knowledge on pathogenesis of bacterial enteric infections as applied to vaccine development // Microbiol. Rev. -1983.-Vol. 47.-P. 510-550.148

169. Levine M.M., Kaper J.B., Herrington D. et al. Volunteer studies of deletion mutants of Vibrio cholerae 01 prepared by recombinant techniques // Infect. Imrnun. 1988. -Vol. 56.-P. 161-167.

170. Linnaka Y., Shimodori S., Takeya K. Application of fluorescent antibody technique to the detection of cholera Vibrio II Jap. J. Inf. Dis. 1965. - Vol. 39, N 1. - P. 51-58.

171. Lockman H., Kaper J.B. Nucleotide sequence analysis of the A2 and В subunits of Vibrio cholerae enterotoxin // J. Biol. Chem. 1983. - Vol. 258. - P. 13722-13726.

172. Moller A., Jansson J.K. Quantification of genetically tagged Cyanobacteria in Baltic Sea sediment by competitive PCR // BioTechniques. 1997. - Vol. 22. - P. 512-518.

173. Madico G., Quinn T.C., Rompalo A. et al. Diagnosis of Trichomonas vaginalis infection by PCR using vaginal swab samples 11 J. Clin. Microbiol. 1998. - Vol. 36, N 11. -P. 3205-3210.

174. Manning P.A., Brown M.H. Cloning of the structural gene (hly) for the hemolysin of Vibrio cholerae El Tor strains 017 // Gene. 1984. - Vol. 31. - P. 225-231.

175. Mansfield E.S., Worley J.M., McKenzie S.E. et al. Nucleic acid detection using nonradioactive labelling methods // Molecular and Cellular Probes. 1995. - Vol. 9. - P. 145-156.

176. Manzin A., Bagnarelli P., Menzo S. et al. Quantitation of hepatitis С virus genome molecules in plasma samples I I J. Clin. Microbiol. 1994. - Vol. 32. - P. 1939-1944.

177. Mecalanos J.J., Swartz D.J., Pearson G.D. et al. Cholera toxin genes: nucleo-tidesquences deletion analysis and vaccine development I I Nature. 1983. - Vol. 306, N5943.-P. 551-557.

178. Menzo S., Bagnarelli M., Giacca A. et al. Absolute quantitation of viremia in human immunodeficiency virus infection by competitive reverse transcription and polymerase chain reaction // J. Clin. Microbiol. 1992. - Vol. 30. - P. 1752-1757.149

179. Michael N.L., Mo Т., Merzouki A. et al. Human immunodeficiency virus type 1 cellular RNA load and splicing patterns predict disease progression in a longitudinally studied cohort // J. Virol. 1995. - Vol. 69. - P. 1868-1877.

180. Michalski J., Galen J.E., Fasano A., Kaper J.B. V. cholerae CVD 110: a live oral attenuated Eltor vaccine strain // Infect. Immun. 1993. - Vol. 61. - P. 4462-4468.

181. Miyagi K., Omura K., Noda K. et al. The first cholera case diagnosed early in the clinical laboratory by DNA probe method // J. Jap. Assoc. Infect. Dis. 1992. - Vol. 66, N.12.- P. 1645-1650.

182. Mocharla H., Butch A.W., Pappos A.A. et al. Quantificationof vitamin D receptor mRNA by competitive polymerase chain reaction in PBMC: lack of correspondence with common allelic variants // J. Bone and Mineral Res. 1997. - Vol. 12, N 5. - P. 726-733.

183. Momen H., Salles C.A. Enzyme markers for Vibrio cholerae: identification of classical, El Tor and environmental strains // Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 1985. - Vol. 79. - P. 773-776.

184. Monteiro L., Hua J., Birac C. et al. Quantitative polymerase chain reaction for the detection of Helicobacter pylori in gastric biopsy specimens // European J. Clin. Micro-biol. & Infect. Dis. 1997. - Vol. 16, N 2. - P. 143-149.

185. Mullins P.H., Gurtler H., Wellington E.M.H. Selective recovery of Streptosporangium fragile from soil by indirect immunomagnetic capture // Microbiology UK 141: Part 9.- 1995.-P. 2149-2156.

186. Nair G.B., Takeda Y. Detection of toxins of Vibrio cholerae 01 and non-01 // In: K. Wachsmuth, P.A. Blake and Q. Olsvik (ed.) Vibrio cholerae and cholera: molecular to global perspectives. ASM Press., Washington, D.C. - 1994. - P. 53-67.

187. Nyvold C., Madsen H.O., Ryder L.P. et al. Competitive PCR for quantification of minimal residual disease in acute lymphoblastic leykaemia // J. Immunol. Meth. 2000. -Vol. 233, N 1-2.-P. 107-118.

188. Ohkura R., Miwa H., Murai T. et al. Usefulness of a novel enzyme immunoassay for the detection of Helicobacter pylori in feces // Scand. J. Gastroenterol. 2000. - Vol. 35, N l.-P. 49-53.

189. Oku Y., Hesaka Y., Hirayama T. et al. Development of a highly sensitive ELISA to detect bacterial toxins // Jap. J. Med. Sci. Biol. 1986. - Vol. 39, N 5-6. - P. 216.

190. Olsvik Q., Popovic Т., Skjerve E. et al. Magnetic separation techniques in diagnostic microbiology // Clin. Microbiol. Rev. 1994. - Vol. 7. - P. 43-54.

191. Patel R., Kvach J.T., Mounts P. Isolation and restrection endonuclease analysis of mycobacterial DNA //J. Clin. Microbiol. 1986. - Vol. 132. - P. 541-551.151

192. Payan С., Veal N., Crescenzochaigue B. et al. New quantitative assay of hepatitis В and С viruses by competitive PCR using alternative internal sequences // J. Virol. Meth. 1997. - Vol. 65, N 2. - P. 299-305.

193. Pearson G.D., Mekalanos J.J. Molecular cloning of Vibrio cholerae enterotoxin genes in Escherichia coli K-12 // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1982. - Vol. 79. - P. 29762980.

194. Perrin S., Gilliland G. Site-specific mutagenesis using asymmetric polymerase chain reaction and a single mutant primer // Nucl. Acids Res. 1990. - Vol. 18. - P. 74337438.

195. Person G.D.N., Woods A., Chiang S.L., Mekalanos J.J. CTX genetic element encodes a site-specific recombination system and an intestinal colonization factor // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1993. - Vol. 90. - P. 3750-3754.

196. Piatak M., Jr., Luk K-C. et al. Quantitative competitive polymerase chain reaction for accurate quantitation of HIV DNA and RNA species // BioTechniques. 1993. -Vol.14.-P. 70-81.

197. Piatak M., Jr., Saag M.S. et al. High levels of HIV-l in plasma during all stages of infection determined by competitive PCR// Science. 1993. - Vol. 259. - P. 1749-1754.

198. Popovic Т., Bopp C., Olsvik Q, Wachsmuth K. Epidemiologic application of a standardized ribotype scheme for Vibrio cholerae 01 //J. Clin. Microbiol. 1993. - Vol. 31, N9.-P. 2474-2482.152

199. Popovic Т., Fields P.A., Olsvik Q. Detection of cholera toxin genes // In: K. Wachs-muth, P.A. Blake and Q. Olsvik (ed.) Vibrio cholerae and cholera: molecular to global perspectives. ASM Press, Washington, D.C. - 1994. - P. 41-52.

200. Porcher C., Malinge M-C., Picat C., Grandchamp B. A simplified method for determination of specific DNA or RNA copy member using quantitative PCR and automatic DNA sequencer// BioTechniques. 1992. - Vol. 13. - P. 106-113.

201. Rabbani G.H., Greenough W.B. Cholera // In: E. Lebenthal and M. Duffy (ed.) Text book of secretory diarrhea. Raven Press, New York, N.Y. - 1990. - P. 233-253.

202. Rahman M., Sack D.A., Wadood A. et al Rapid identification of Vibrio cholerae serotype 01 from primary isolation plates by a coagglutination test // J. Med. Microbiol. -1989.-Vol. 28.-P. 39-41.

203. Ramakrishnan R., Levine M., Fink D.J. PCR-based analysis of herpes simplex vims type 1 latency in the rat trigeminal ganglion established with a ribonucleotide reduc-tase-deficient mutant // J. Virol. 1994. - Vol. 68. - P. 7083-7091.

204. Ravaggi A.Z., Mazza C., Albertine A., Cariani E. Quantification of Hepatitis С virus RNA by competitive amplification of RNA from denatured serum and hybridization on microtiter plates // J. Clin. Microbiol. 1995. - Vol. 33. - P. 265-269.

205. Rene K. mRNA quantitation techniques: considerations for experimental design and application // J. Nutrition. 1998. - Vol. 128, N 11. - P. 2038-2044.

206. Riedy M.C., Timm E.A., Stewart Jr., Stewart C.C. Quantitative RT-PCR for measuring gene expression // BioTechniques. 1995. - Vol. 18. - P. 70-76.153

207. Roberts N.C., Siebeling R.J., Kaper J.B., Bradford H.B., Jr. Vibrios in the Lousiana Gulf Coast environment // Microbiol. Ecol. 1982. - Vol. 8. - P. 299-312.

208. Rolfs A., Schuller S., Finckh U., Weber-Rolfs I. PCR: clinical diagnostics and research. N.Y.: Springer-Verlag Berlin Heidelberg, 1992. - 268 p.

209. Rosenfeld M.A., Yoshimura K., Trapnell B.C. et al. In vivo transfer of the human cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene to the airway epithelium // Cell. 1992. - Vol. 68. - P. 143-155.

210. Rossen L., Norskov P., Holmstrom K., Rasmussen O.F. Inhibition of PCR by components of food samples, microbial diagnostic assay and DNA extraction solutions // Intern. J. Food Microbiol. 1992. - Vol. 17. - P. 37-45.

211. Roszah D.B., Colwell R.R. Survival strategies of bacteria in the natural environment // Microbiol. Rev. 1987. - Vol. 51. P. 365-379.

212. Ruano G., Fenton W., Kidd K.K. Biophasic amplification of very dilute DNA samples via "booster" PCR // Nucl. Acids Res. 1989. - Vol. 17. - P. 5407.

213. Ruchlic W., Spencer W.J., Rhoads R.E. Optimization of the annealing temperature in vitro // Nucl. Acids Res. 1990. - Vol. 18. - P. 6409-6411.

214. Ruchlik I., Van Kesteren L., Cardona L. et al. Rapid detection of Salmonella in field samples by nested polymerase chain reaction // Lett, in Appl. Microbiol. 1999. - Vol. 29, N 4. - P. 269-272.

215. Rumamurthy Т., Bhattacharya S.K., Uesaka Y. et al. Evaluation of the bead enzyme-linked immunosorbent assay for detection of cholera toxin directly from stool specimens // J. Clin. Microbiol. 1992. - Vol. 30. - P. 1783-1786.

216. Ruster В., Zenzem S., Roth W.K. Quantification of hepatitis С virus RNA by competitive reverse transcription and polymerase chain reaction using a modified hepatitis RNA transcript // Anal. Biochem. 1995. - Vol. 224. - P. 597-600.

217. Sack R.B. Ваша D. The fluorescent antibody technique in the direct examination of cholera stool // In: Proceedings of the Cholera Research Symposium, Honolulu, Jan. 24-29, 1965. U.S. Government Priting Office, Washington, D.C., 1965. - P. 50-56.

218. Salles C.A., Momen H., Vicente A.C.P., Coelho A. Vibrio cholerae in South America: polymerase chain reaction and zymovar analysis // Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. -1993.-Vol. 87.-P. 272.

219. Sarkar G., Bolander M.E. The "looped oligo" methods for generating reference molecules for quantitative PCR // BioTechniques. 1994. - vol. 17. - P. 864-866.

220. Saulnier P., Andremont A. Detection of genes in feces by booster polymerase chain reaction // J. Clin. Microbiol. 1992. - vol. 30. - P. 2080-2083.

221. Scadden D.T., Wang Z., Groopman J.E. Quantitation of plasma human immunodeficiency virus type 1 RNA by competitive polymerase chain reaction // J. Infect. Dis. -1992.-Vol. 165.-P. 1119-1123.

222. Schanke J.Т., Quam L.M., Van Ness B.G. Flip PCR for DNA sequence motif inversion // BioTechniques. 1994. - Vol. 16. - P. 414-416.

223. Shangkuan Y.H., Tsao C.M., Lin H.C. Comparison of Vibrio cholerae 01 isolates by polymerase chain reaction fingerprinting and ribotyping // J. Med. Microbiol. 1997. -Vol. 46,N 11.-P. 941-948.

224. Shirai U.H., Nishibuchi M., Ramamurthy S.K. et al. Polymerase chain reaction for detection of the cholerae toxin operon of Vibrio cholerae // J. Clin. Microbiol. 1991. -Vol. 29. - P. 2517-2521.

225. Siegling A., Lehmann M., Platzer C. et al. A novel multispecific competitor fragment for quantitative PCR analysis of cytokine gene expression in rats // J. Immunol. Meth. -1994.-Vol. 177.-P. 23-38.

226. Siebert P.D., Larrick J.W. PCR MIMICS: competitive DNA fragments for use as internal standards in quantitative PCR // BioTechniques. 1993. - Vol. 14. - P. 244-249.

227. Song Q., Haller В., Ulrich D. et al. Quantitation of Helicobacter pylori in dental plaque samples by competitive polymerase chain reaction // J. Clin. Pathol. 2000. -vol. 53, N3.-P. 218-222.

228. Stalbom B.-M., Torven A., Lundberg L.C. Application of capillary electrophoresis to the post-polymerase chain reaction analysis of rat mRNA for gastric H", K+ ATPase // Anal. Biochem. - 1994. - Vol. 217. - P. 91-97.

229. Stiger M., Demolliere C., Ahlborn-Laake L., Mous J. Competitive polymerase chain reaction assay for quantitation of HIV-1 DNA and RNA //J. Virol. Meth. 1991. - Vol. 34.-P. 149-160.

230. Tamayo M. Koblavi S., Crimont F. et al. Molecular epidemiology of Vibrio cholerae 01 isolates from Colombia // J. Med. Microbiol. 1997. - Vol. 46. - P. 611-616.156

231. Tamguchi A., Kohsaka H., Carson D.A. Competitive RT-PCR ELISA: a rapid, sensitive and non-radioactive method to quantitate cytokine mRNA // J. Immunol. Meth. -1994.-Vol. 169.-P. 101-109.

232. Teble C.C., Vahjen W. Interference of humic acids and DNA extracted directly from soil in detection and transformation of recombinant DNA from bacteria and Yeast // Appl. and Environ. Microbiol. 1993. - Vol. 59. - P. 2657-2665.

233. Telenti A., Imboden P., Germann D. Competitive polymerase chain reaction using an internal standard: application to the quantitation of viral DNA // J. Virol. Meth. 1992.- Vol. 39. P. 259-268.

234. Thierry D., Brisson-Noel A., Vinsent-Livy-Ferbault V. et al. Characterization of a Mycobacterium tuberculosis insertion sequence, IS 6110, and its application in diagnosis // J. Clin. Microbiol. 1990. - Vol. 28., N 12. - P. 2668-2673.

235. Thoreson A.C.E., Borre M., Andersen L.P. et al. Helicobacter pylori detection in human biopsies: a competitive PCR assay with internal control reveals false results // FEMS Immunol, and Med. Microbiol. 1999. - vol. 24, N 2. - P. 201-208.

236. Trucksis M., Galen J.E., Michalski J. et al. Accessory cholera enterotoxin (Ace), the third member of a Vibrio cholerae virulence cassette // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. -1993.-Vol. 90.-P. 5267-5271.

237. Tsai Y-L., Olson B.H. Rapid method for separation of bacterial cells in soil and sediments by polymerase chain reaction // Appl. and Environ. Microbiol. 1992. - Vol. 58.- P. 2292-2295.

238. Ursi D., Ieven M., Van Bever H.P., Goossens H. Construction of an internal control for the detection of Chlamydia pneumoniae by PCR 11 Mol. and Cell. Probes. 1998. -Vol. 12.-P. 235-238.157

239. Vadivelu J., Lyer L., Kshatriya B.M., Puthucheary S.D. Molecular evidence of clonal-ity amongt Vibrio cholerae 01 biotype El tor during an outbreak in Malaysia // Epidemiol. and Infect. 2000. - Vol. 124, N 1. - P. 25-30.

240. Varela P., Pollevick G.D., Rivas M. et al. Direct detection of Vibrio cholerae in stool samples // J. Clin. Microbiol. 1994. - Vol. 32. - P. 1246-1248.

241. Varela P., Rivac M., Binsztein N. et al. Identification of toxigenic Vibrio cholerae from the Argentine outbreak by PCR for ctxAl and ctx2-B // FEBS Lett. 1993. - Vol. 315.-P. 74-76.

242. Waage A.S., Vardund Т., Lund V., Kapperud G. Detection of low numbers of pathogenic Yersinia enterocolitica in environmental water and sewage samples by nested polymerase chain reaction // J. Appl. Microbiol. 1999. - Vol. 87, N 6. - P. 814-821.

243. Wachsmuth I.K., Olsvik Q., Evins G.M. Popovic T. Molecular epidemiology of cholera // In: K. Wachsmuth, P.A. Blake and Q. Olsvik (ed.) Vibrio cholerae and cholera: molecular to global perspectives. ASM Press., Washington, D.C. - 1994. - P. 357-370.

244. Waldor M.K., Mekalanos J.J. Lysogenic conversion by a filamentous phage encoding cholera toxin // Science. 1996. - Vol. 272. - P. 1910-1914.

245. Wang A.M., Doyle M.V., Mark D.F. Quantitation of mRNA by the polymerase chain reaction // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1989. - Vol. 86. - P. 9717-9721.

246. Wang H.L., Fliegel C.E., Cass A.M.W. et al. Quantification of mitochondrial DNA in heteroplasmic fibroblasts with competitive PCR // BioTechniques. 1994. - Vol. 17. -P. 76-82.

247. Watanabe Т., Tomita S., Kudo M. et al. Detection of Helicobacter pylori gene by means of immunomagnetic separation-based polymerase chain reaction in feces // Scand. J. Gastroenterol. 1998. - Vol. 33, N 11. - P. 1140-1143.158

248. Widjojoatmodjo M.N., Fluit A.C., Torensma R. et al. The magnetic immuno polymerase chain reaction assay for direct detection of Salmonellae in fecal samples // J. Clin. Microbiol. 1992. - Vol. 30. - P. 3195-3199.

249. Wiedbrank D.L., Werner J.C., Drevon A.M. Inhibition of PCR by aqueons and vitreous fluids // J. Clin. Microbiol. 1995. - Vol. 33. - P. 2643-2646.

250. Wilson I.G. Inhibition and facilitation of nucleic acids amplification // Appl. and Environ. Microbiol. 1997. - Vol. 63. - P. 3741-3751.

251. Wolf S.S., Cohen A. Expression of cytokines and their receptors by human thymocytes and thymic stromal cells // Immunology. 1992. - Vol. 77. - P. 362-368.

252. Wright A.C., Guo Y., Johnson J.A. et al. Development and testing of a nonradioactive DNA oligonucleotide probe that is specific for Vibrio cholerae cholera toxin // J. Clin. Microbiol. 1992. - Vol. 30. - P. 2302-2306.

253. Xu H.-Sh., Roberts H., Singleton F.L. et al. Survival and viability of nonculturable Escherichia coli and Vibrio cholerae in the estuarine and marine environment // Microb. Ecol. 1982,-N8. -P. 313-323.

254. Yamasaki S., Gard S., Nair G.B., Takeda Y. Distribution of Vibrio cholerae 01 antigen biosynthesis genes among 0139 and other non-Ol serogroups of Vibrio cholerae II FEMS Microbiol. Lett. 1999. - Vol. 179. - P. 115-121.

255. Yoh M., Miyagi K., Matsumoto Y. et al. Development of an enzyme-labeled oligonucleotide probe for the cholera toxin gene // J. Clin. Microbiol. 1993. - Vol. 31. - P. 1312-1314.

256. Yoshimura K., Nakamura H., Trapnell B.C. et al. Expression of the cystic fibrosis transmembrane conductance redulator gene in cells of non-epithelial origin // Nucl. Acids Res. -1991. Vol. 19. - P. 5417-5423.159

257. Yun Z., Lundeberg J., Johansson B. et al. Colorimetric detection of competitive PCR products for quantification in hepatitis С viremio // J. Virol. Meth. 1994. - Vol. 47. -P. 1-13. '