Латеральный проточный иммуноанализ кардиомаркёров для экспресс-диагностики острого инфаркта миокарда тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.06, кандидат наук Яковлева, Елена Алексеевна

• Яковлева, Елена Алексеевна
• кандидат наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат наук Яковлева, Елена Алексеевна

I. ВВЕДЕНИЕ......................................................................................................................6

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ........................................................................................................8

Глава 1. ЛАТЕРАЛЬНЫЙ ПРОТОЧНЫЙ ИММУНОАНАЛИЗ................................8

1.1. Строение иммунохроматографической тест-полоски.........................................10

1.2. Теоретические основы латерального проточного иммуноанализа.......................13

1.3. Основные компоненты иммунохроматографических тест-систем..........................17

1.3.1. Аналитическая мембрана.......................................................................................17

1.3.1.1. Полимерный состав и свойства мембран..........................................17

1.3.1.2. Факторы, влияющие на сорбцию белков на мембране..........................20

1.3.2. Мембрана для нанесения образца.......................................................................22

1.3.3.Мембрана для нанесения конъюгата.......................................................................23

1.3.4.Абсорбирующая (впитывающая) мембрана..........................................................23

1.3.5.Антитела в иммунохроматографическом анализе.................................................24

1.3.6. Метки, используемые в иммунохроматографическом анализе...........................25

1.3.6.1. Латексные частицы...........................................................................................26

1.3.6.2. Флуоресцентные метки....................................................................................26

1.3.6.3. Квантовые точки...............................................................................................27

1.3.6.4. Парамагнитные частицы..................................................................................28

1.3.6.5. Коллоидное золото...........................................................................................29

1.3.6.6. Нанооболочки....................................................................................................32

Глава 2. БИОХИМИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ОСТРОГО ИНФАРКТА

МИОКАРДА...................................................................................................35

2.1. Белок, связывающий жирные кислоты (с-БСЖК)...........................................36

2.1.1. Структура и функции с-БСЖК...............................................................................36

2.1.2. Методы определения с-БСЖК................................................................................40

2.2. Тропонин...............................................................................................43

2.2.1. Структура и функции тропонина...........................................................................43

2.2. 2. Методы определения тропонинов.........................................................................46

III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ................................................................................50

Глава 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ..........................................................................50

3.1. Материалы и оборудование......................................................................50

3.2. Методы исследования.............................................................................52

3.2.1. Получение наночастиц коллоидного золота по методу Френса.........................52

3.2.2. Получение золотых нанооболочек на сферах из диоксида кремния..................52

3.2.3. Определение оптимальных условий сорбции антител на наночастицах золота53

3.2.4. Получение конъюгата частиц золота с антителами..............................................54

3.2.5. Получение конъюгата наносфер с антителами.....................................................54

3.2.6. Составление иммунохроматографической тест-полоски....................................54

3.2.7. Проведение иммунохроматографического анализа.............................................55

3.2.8. Определение чувствительности и специфичности тест-системы.......................55

IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ..................................................................................57

Глава 4. ПОЛУЧЕНИЕ НАНОЧАСТИЦ ЗОЛОТА И КОНЪЮГАТОВ АНТИТЕЛ НА ИХ

ОСНОВЕ........................................................................................................57

4.1. Получение и характеристика наночастиц золота.............................................57

4.2. Получение конъюгатов антител, специфичных к с-БСЖК, с наночастицами золота.60 Глава 5. РАЗРАБОТКА ИММУНОХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЙ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ

ОПРЕДЕЛЕНИЯ С-БСЖК...................................................................................64

5.1. Оптимизация условий проведения иммунохроматографического анализа с использованием в качестве метки наночастиц золота для определения с-БСЖК...............64

5.1.1. Выбор пары антител................................................................................................64

5.1.2. Влияние размеров наночастиц золота на аналитические характеристики тест-системы...............................................................................................................................66

5.1.3. Выбор аналитической мембраны...........................................................................67

5.1.4. Оптимизация концентраций специфических реагентов......................................69

5.1.5. Выбор мембран для нанесения образца.................................................................71

5.2. Иммунохроматографический анализ с-БСЖК с использованием золотых нанооболочек в качестве метки...............................................................................................75

5.2.1 .Получение и характеристика золотых нанооболочек...........................................75

5.2.2. Использование нанооболочек в качестве метки в иммунохроматографическом анализе.................................................................................................81

5.3. Определение с-БСЖК в сыворотке и цельной крови человека...................................83

5.4. Стабильность тест-системы с-БСЖК...........................................................86

Глава 6. РАЗРАБОТКА ИММУНОХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЙ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ

ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТРОПОНИНА1..........................................................................88

6.1. Получение конъюгатов антител, специфичных к тропонину I, с наночастицами золота............................................................................................................

6.2. Оптимизация условий проведения иммунохроматографического анализа с использованием наночастиц золота для определения тропонина 1.................................91

6.2.1. Выбор пары антител................................................................................................91

6.2.2. Выбор мембран........................................................................................................92

6.2.3. Влияние размеров наночастиц золота на аналитические характеристики тест-системы ...............................................................................................................................94

6.3. Определение тропонина I в сыворотке и цельной крови..................................95

6.4. Стабильность тест-системы тропонина 1................................................................98

Глава 7. ОПРЕДЕЛЕНИЕ с-БСЖК И ТРОПОНИНА I И В ОБРАЗЦАХ СЫВОРОТКИ

КРОВИ.........................................................................................................101

Глава 8. РАЗРАБОТКА ИММУНОХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЙ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ

ОДНОВРЕМЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЕ с-БСЖК и ТРОПОНИНА 1.............................105

VI. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ..............................................................................................112

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Латеральный проточный иммуноанализ кардиомаркёров для экспресс-диагностики острого инфаркта миокарда»

I. ВВЕДЕНИЕ

Лабораторные исследования играют важную роль в диагностике различных заболеваний. Методы лабораторной диагностики довольно многочисленны и продолжают активно развиваться. Широкое применение в клинической диагностике нашли иммунохимические методы, в частности, методы иммуноферментного анализа. В течение последнего десятилетия в мировой аналитической практике очень интенсивно развиваются иммунохимические методы экспресс-анализа, которые приходят на смену стандартным методам иммуноферментного анализа благодаря своим преимуществам - простоте выполнения, возможности проведения анализа во внелабораторных, а зачастую и в домашних условиях, отсутствию необходимости использования дорогостоящих приборов, высокой чувствительности, возможности визуальной регистрации результатов анализа, низкой стоимости и т.д. Наиболее распространенным вариантом является метод латерального проточного иммуноанализа (ЛПИА), также известный как иммунохроматографический анализ (ИХА). Данный вид анализа осуществляется при помощи индикаторных полосок, содержащих все необходимые для анализа компоненты в готовом виде. В качестве метки используются наночастицы золота, позволяющие визуально детектировать результаты анализа.

Методы иммунохроматографического анализа наиболее подходят для определения веществ, содержание которых в норме незначительно или отсутствует, и значительно возрастает при развитии патологии. К таким веществам относятся кардиомаркеры, определение которых является актуальным для диагностики различных сердечно-сосудистых заболеваний, в том числе острого инфаркта миокарда (ОИМ). Развитие ОИМ сопровождается обширным разрушением кардиомиоцитов и выбросом в кровь многих специфических белков.

В настоящее время наиболее предпочтительными биохимическими маркерами повреждения миокарда являются тропонины вследствие их абсолютной кардиоспецифичности. При повреждении миокарда повышенная концентрация тропонина в крови обнаруживается через 3-4 часа, пик приходится на 3-4 сутки и остается повышенной до 7-10 дней [1]. Однако определение тропонинов не подходит для ранней диагностики ОИМ, поэтому наряду с исследованиями тропонинов рекомендуется определять ранние миокардиальные маркеры.

Выбор второго объекта исследования - белка, связывающего жирные кислоты (с-БСЖК) - обусловлен актуальностью проблемы ранней и точной диагностики острой ишемической болезни, включая острый инфаркт миокарда, в современной кардиологии. В настоящее время ни один из известных методов не гарантирует надежной диагностики ОИМ на ранней стадии болезни. Так, например, до 25% всех ОИМ не вызывают никаких изменений на кардиограмме, от 20% до 30% всех случаев ОИМ протекают без болевого приступа, особенно у

пожилых, а также больных диабетом и гипертонической болезнью. Недавно в качестве нового биохимического маркера ранней диагностики ОИМ был предложен с-БСЖК. Было показано, что при повреждении миокарда, подобно миоглобину, концентрация с-БСЖК в крови значительно повышается в течение 3 часов после появления симптомов ОИМ и возвращается к нормальному уровню через 12-24 часа [2]. Этот факт, а также хорошая тканеспецифичность в сравнении с миоглобином, делают с-БСЖК перспективным маркером ранней диагностики ОИМ.

Одновременное определение с-БСЖК и тропонина I повышает эффективность диагностики ОИМ на ранних стадиях, позволяет определить скрытые формы инфаркта миокарда.

В настоящее время на отечественном рынке экспресс тест-системы на основе ЛПИА в основном представлены продукцией зарубежных производителей. В связи с этим актуальным с точки зрения потребности практики и развития технологической и реагентой базы является проведение исследований по созданию практически значимых аналитических систем отечественного производства на основе латерального проточного иммуноанализа.

Целью настоящей работы являлось изучение основных принципов создания тест-систем на основе латерального проточного иммуноанализа для определения концентрации белка, связывающего жирные кислоты и тропонина I, а также разработка иммунохроматографической тест-системы для одновременного совместного визуального определения с-БСЖК и тропонина I в сыворотке и цельной крови для экспресс-диагностики острого инфаркта миокарда.

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. ЛАТЕРАЛЬНЫЙ ПРОТОЧНЫЙ ИММУНОАНАЛИЗ

Иммунохимические методы анализа, основанные на специфическом связывании определяемого соединения соответствующими антителами, широко вошли в аналитическую практику и используются в различных областях медицины, сельского хозяйства, микробиологической и пищевой промышленности, для целей охраны окружающей среды.

История иммуноанализа берет начало с методов иммунопреципитации, которые основаны на образовании нерастовримых комплексов антиген-антитело [3]. Однако для визуальной детекции результатов были необходимы высокие концентрации компонентов, а также длительное время анализа. Кроме того, результаты этого анализа носили качественный или полуколичественный характер.

Детекция образующихся в процессе иммунохимической реакции комплексов антиген-антитело может быть осуществлена, если в один из компонентов реакционной системы ввести метку (изотопную, флуоресцентрую, ферментную и др.), которая легко регистрируется соответсвующими высокочувствительными физико-химическими методами. Поскольку процесс образования пары анализируемое соединение-специфическое антитело происходит в строго количественном соотношении, то экспериментально определяется концентрация метки, входящей в состав обазующегося комплекса [3].

Поворотным моментом в развитии иммунохимических методов анализа стала разработка в 50-х годах Р. Йалоу и С. Берсоном радиоиммунологического анализа, который представлял собой принципиально новый метод, основанный на введении в систему радиоактивной метки -изотопа 1251 [4]. Благодаря возможности определять эту метку в очень малых концентрациях данный метод позволял определять концентрации аналита в образце с высокой чувствительностью, вплоть до Ю'10 М. Однако сложность в использовании радиоактивной метки из-за ее ограниченного срока жизни, а также необходимость использования дорогостоящего оборудования ограничивало применение данного метода анализа. Кроме того, использование радиоактивной метки представляет потенциальную угрозу для здоровья человека, поэтому встала необходимость разрабатывать альтернативные пути детекции реагентов. Подходящей альтернативой радиоиммуноанализа стала замена радиоактивной метки на ферментативную. Как и в методах радиоиммунологического анализа, ферментативная метка должна быть ковалентно связвана со специфически взаимодействующим соединением. С. Аврамисом и Г. Пирсом был разработан метод связывания ферментов с антителами или антигенами через глутаровый альдегид [5, 6].

Для достижения высокой чувствительности, специфичности и воспроизводимости иммунохимических методов анализа необходимо было проводить эффективное разделение комплексов и свободных компонентов. Это стало возможно легко осуществить, если антиген или антитело прочно иммобилизовать на твердом носителе. В 1966 году в работе [7] была впервые показана возможность использования твердой фазы в качестве носителя для иммобилизации антител или антигенов. На протяжении последних десятилетий наибольшее распространение получили методы твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА), в которых для иммобилизации антител/антигенов используются твердые носители, например, полистироловые планшеты, а образовавшиеся иммунокомплексы выявляют с помощью меченых ферментами компонентов анализа. Впервые такой анализ, основанный на использовании ферментов в качестве метки и использовании твердой фазы, провели в 1971 году Энгвал и Перлман и в этом же году независимо от них Ван Веемен и Шуре [8, 9].

Позднее стали развиваться методы иммуноферментного анализа с использованием различных меток - флуорофоров, липосом, наночастиц [10, 11].

Наряду с несомненными достоинствами, такими как высокая чувствительность метода, воспроизводимость, простота проведения анализа, стабильность при хранении всех компонентов анализа, метод твердофазного иммуноанализа имеет и определённые недостатки: анализ включает многочисленные стадии, отмывки несвязавшихся реагентов, поэтому на проведение анализа требуется значительное количество времени.

Решением данной проблемы стала разработка методов проточно-инжекционного анализа в тонкослойных ячейках, которые позволили сократить время проведения анализа, и перевели иммунохимические реакции из равновесного режима в кинетический [12].

В последнее время активно развивается новый метод иммуноанализа - латеральный проточный иммуноанализ (ЛПИА, Lateral flow immunoassay, LFIA), или как его еще называют, иммунохроматографический анализ (ИХА), положивший начало развитию «быстрых методов» проведения анализа различных соединений с визуальной регистрацией результатов [13]. Метод основан на использовании мембранных носителей с заранее импрегнированньши в них реакционными компонентами, позволяющими при нанесении на мембрану анализируемого образца выявлять наличие определяемого соединения по окрашиванию тестовой зоны мембраны наночастицами золота. Дешевые, быстрые и простые аналитические технологии на основе иммунохроматографии позволяют проводить высокочувствительные качественные измерения без специальных навыков и оборудования в домашних, лабораторных и полевых условиях. Иммунохроматографические экспресс-тесты позволяют в течение нескольких минут определить и оценить содержание различных диагностически важных биологически активных веществ.

1.1. Строение иммунохроматографической тест-полоски

Иммунохроматографический анализ основан на движении элюента вдоль мембраны, которое сопровождается образованием на разных участках мембраны специфических иммунокомплексов, визуализируемых как окрашенные полосы. В качестве меток в данных системах используют окрашенные латексы, магнитные, углеродные частицы, ферменты, липосомы, но чаще всего коллоидное золото. Преимущество коллоидного золота как маркера заключается в легкости получения наночастиц заданного размера, в возможности высушивать конъюгат антител с наночастицами коллоидного золота с последующим быстрым и полным перерастворением конъюгата в ходе проведения анализа, а также в высокой чувствительности визуальной детекции метки на основе золя золота [14, 15].

Тест-система для проведения иммунохроматографического анализа показана на рисунке 1. Она представляет собой подложку, на которую последовательно наклеены мембраны: мембрана для нанесения образца, мембрана для конъюгата золота с антителами, аналитическая мембрана и впитывающая (абсорбирующая) мембрана. Мембраны должны быть расположены относительно друг друга таким образом, чтобы край каждой из мембран перекрывал край мембраны, расположенной рядом. Такое перекрытие необходимо для равномерного переноса компонентов образца с одной части тест-полоски на другую.

Мембрана Аналитическая мембрана (1)

Мембрана для конъюгата Тестовая линии Контрольная антителе НЧЗ (3) "и,,ия

Рис. 1. Строение иммунохроматографической тест-системы.

При определении низкомолекулярных веществ методом иммунохроматографического анализа используют конкурентную схему анализа, которая заключается в конкуренции свободного антигена и меченого антигена за центры связывания с иммобилизованными антителами. Интенсивность оскраски полосы в тестовой зоне обратно пропорциональна содержанию анализируемого вещества в образце. В случае отсутствия исследуемого антигена в

образце в тестовой зоне происходит связывание меченого антигена с антителами, при этом интенсивность окраски полосы максимальна. При увеличении концентрации антигена в образце интенсивность окраски в тестовой зоне снижается.

При определении высокомолекулярных веществ используют сэндвич-схему анализа. Остановимся на ней более подробно. На аналитической нитроцеллюлозной мембране в виде узких линий в тестовой зоне нанесены специфические антитела к определяемому антигену и в аналогичной контрольной зоне - вторичные антитела. На стекловолоконной мембране содержится конъюгат наночастиц золота со специфическими антителами к определяемому антигену. При нанесении образца на специальную мембрану, расположенную у начала тест-полоски, начинается его движение вдоль полоски под действием капиллярных сил (Рис. 2). В присутствии определяемого антигена в образце, по мере продвижения вдоль мембраны происходит его взаимодействие с конъюгатом меченых золотом антител и образование специфического комплекса антигена с сорбированными на поверхности коллоидных частиц золота специфическими антителами. В тестовой зоне происходит связывание иммунокомплекса иммобилизованными специфическими антителами и наблюдается появление окрашенной полосы, интенсивность цвета которой пропорциональна содержанию анализируемого вещества в образце. Избыток несвязавшихся меченых антител мигрирует далее и в контрольной зоне взаимодействуют с вторичными антителами, где образуется вторая окрашенная линия. При отсутствии в исследуемом образце определяемого антигена, меченые золотом антитела задерживаются лишь вторичными антителами в контрольной зоне. Таким образом, наличие видимой окраски в контрольной зоне в обоих случаях является внутренним контролем теста. Расположение дополнительной впитывающей мембраны на конце тест-полоски позволяет осуществлять более равномерное движение образца вдоль полоски.

Таким образом, о наличии определяемого антигена и его концентрации свидетельствуют количество и интенсивность окрашенных зон, образовавшихся на аналитической мембране в ходе проведения анализа исследуемого раствора. Обычное время проведения анализа составляет 15-20 мин в зависимости от типа используемых мембран для изготовления тест-полосок.

Для получения готовых тест-полосок необходимо провести предобработку мембран. На аналитическую мембрану в тестовую и контрольную зоны предварительно наносят раствор антител, специфичных к исследуемому антигену, и антивидовые антитела, соответственно, на мембрану для конъюгата наносят раствор меченых антител, высушивают мембрану. При необходимости мембраны блокируют специальными растворами, которые могут содержать белки, поверхностно-активные вещества (ПАВ) или полимеры, для предотвращения неспецифических связываний антигенов и меченых антител вне тестовой и контрольной зон

при проведении анализа. Нанесение раствора антител на аналитическую мембрану в тестовую и контрольную зону, а также раствора меченых антител на мембрану для конъюгата осуществляется с помощью контактного или бесонтактного диспенсера, который распыляет раствор антител в виде узкой линии по всей длине мембраны с заданной скоростью. После высушивания реагентов собирают тест-полоску, последовательно наклеивая на специальную подложку аналитическую мембрану, впитывающую мембрану, мембрану для конъюгата и мембрану для нанесения образца таким образом, чтобы обеспечивался непрерывный поток жидкости. Склеенную мембрану режут на полоски заданной ширины и упаковывают в специальные кассеты, после чего тест-полоски готовы к использованию [16].

Образец

—1 Е—1 п —

= • и 1

у Определяемый антиген

)- Иммобилизованные специфические антитела

Иммобилизованные вторичные антитела

- конъюгат нанночастиц золота с антителами

Рис. 2. Общая схема проведения ИХА: А - положительный результат, Б - отрицательный результат.

Основными преимуществами использования иммунохроматографических тест-полосок являются:

• простота и удобство - получение результата без оборудования и специальных навыков;

• экономичность и скорость - минимальные затраты на приобретение теста и экономия времени на проведение обследования;

• анонимность - что особенно важно при выявлении заболеваний, передаваемых половым путем, других инфекционных заболеваний, а также выявлении фактов употребления наркотических веществ;

Технология экспресс-диагностики на иммунохроматографических тест-полосках представляет собой доступный инструмент для определения различных белков: антигенов, антител, гормонов и других диагностически важных веществ [17].

1.2. Теоретические основы латерального проточного иммуноанализа

Основные принципы, на которых основывается латеральный проточный иммуноанализ -это капиллярные явления и взаимодействие антиген-антитело.

Капиллярные явления

Капиллярные явления описывают движение потока жидкости вдоль мембраны. В латеральном иммуноанализе поры мембраны можно рассматривать как совокупность длинных прямых цилиндрических капилляров, расположенных параллельно друг другу. Это приближение позволяет использовать обычные принципы, применимые к жидкостям, и считать, что поток ламинарный. Капиллярный поток зависит от характеристик мембраны, таких как размер пор, распределение пор и пористость, а также от характеристик жидкости -вязкости, поверхностного натяжения.

Смачивание сухой пористой мембраны жидкостью описывается следующим уравнением:

_ у4р>{о*9 ^ ^ _ расстояние> пройденное жидкостью в пористой мембране, с(р -

диаметр пор, у - поверхностное натяжение жидкости, ц - вязкость жидкости, в - краевой угол, / - время, за которое жидкость проходит расстояние Ь в капилляре[18].

Продифференцировав уравнение по Л, получаем, что линейная скорость смачивания обратно пропорциональна расстоянию, пройденному жидкостью по капилляру:

¿О, У<1рСОБв

йг щИ

Скорость смачивания также обратно пропорциональна вязкости жидкости и пропорциональна диаметру пор мембраны (с1р), поверхностному натяжению (у ) и величине краевого угла {в). В процессе производства мембран для уменьшения краевого угла часто добавляют поверхностно-активные вещества, тем самым увеличивая смачиваемость мембраны.

После полного смачивания мембраны жидкостью, скорость потока жидкости будет определяться уравнением:

л. Л

где 0 - объемная скорость потока, к - относительная проницаемость мембраны, А -площадь сечения капилляра, ц - вязкость жидкости, протекаемой по мембране, ¿/Р- разница давлений на концах капилляра длины Ь [19].

Взаимодействие антиген-антитело

В простейшем случае взаимодействие антиген-антитело может быть представлено в виде

схемы:

где Аг - свободный антиген, Ат - свободное антитело, Аг-Ат- комплекс антиген-антитело, ка и ки - константы скоростей ассоциации и диссоциации комплекса, соответственно. Связь между антителом (Ат) и антигеном (Аг) нековалентная, предполагается, что протекает реакция первого порядка, где скорость реакции пропорциональна концентрации реагентов.

В работе [20] были рассмотрены процессы, протекающие на аналитической мембране при добавлении образца на тест-полоску. При нанесении образца на мембрану антиген взаимодействует с мечеными антителами, образуя комплекс АгАт2* (уравнение (1)). Аг +Ат2* АгАт2* (1) ,

кл

где Аг - антиген, Ат2 - меченые антитела, ка и ка - константы скоростей ассоциации и диссоциации комплексов.

Меченые антитела Атг легко диссоциируют с мембраны для конъюгата, и реакция между антигеном и мечеными антителами протекает в движущемся по внутренним порам мембраны водном растворе. Реакция (1) носит псевдогетерогенный характер. Это подтверждается достаточно малым временем установления равновесия по сравнению с аналогичными стадиями гетерогенного иммуноанализа на планшетах, характеризующихся временем установления равновесия более 1 часа.

Далее комплекс антигена с мечеными антителами, а также свободный антиген движутся вдоль мембраны, достигают тестовой зоны, и происходит взаимодействие с иммобилизованными там специфическими антителами (уравнение (2), (3) и (4)). Аналитический сигнал в тестовой зоне определяется количеством образующегося тройного комплекса иммобилизованные антитела-антиген-меченые антитела (АтАгАт), который соответствует концентрации антигена в образце.

К

Аг + Ат Аг-Ат,

Аг +Агп1 Н АгАт; (2)

кл

АгАт2*+ Ат/ & Агп1АгАт2* (3)

км

Ат/ + АгАт! ^ Ат^гАт/ (4),

кл

где Аг - антиген,Аггц - антитела, иммобилизованные на мембране, Агп2* - меченые антитела, каи ка - константы скоростей ассоциации и диссоциации комплексов.

Реакции, протекающие в тестовой зоне аналитической мембраны (реакции (2), (3) и (4)), носят гетерогенный характер, они происходят между сорбированным на мембране антителами Апц и антигеном Аг или комплексом АгАт/. В обычном твердофазном анализе реакция с компонентом, иммобилизованным на фазе, контролируется диффузией, в связи с чем время, необходимое для протекания реакции, составляет около 1 часа. Для мембранного анализа, несмотря на гетерогенный характер протекания второй, третьей и четвертой реакций, реакция не является диффузионно контролируемой из-за малых размеров пор, время реакции составляет несколько минут, и это оказывается достаточным для эффективного взаимодействия компонентов и удержания антител, меченых частицами золота, в месте локализации тестовой линии. Это подтверждается результатами, высказанными в работе [21], об отсутствии диффузионных ограничений при протекании реакций взаимодействия антиген-антитело на границе твердый носитель - вода в движущемся по тонкослойной ячейке растворе.

В работе [20] было проведено теоретическое исследование процессов, протекающих в аналитической мембране в латеральном проточном анализе, и были определены равновесные концентрации комплекса антиген-меченые антитела [АгАт/], а также концентрации комплекса антиген-антитело [АгАт/] и тройного комплекса [Ат1АгАт2*]:

[АзАт\ ] = \ + [Ат>0] + ^ - j([Aг0l + >;%} + ^ - 4[Лгэ] [Ак"0])

ка1кйг1Ат^1АгАт\]

[АтАгАт*] [АгАт] -

кЧ2 (£¿3 + каг1АвАт*А) + 3 \АгЛ;

_ка3ка2[Ат0][Агв]_

кАКз + Кз [АгАт*,]) + ка2каэ[Аге] .

где [Аге] = [Аг0] - [АгАт2*] и [Л/и/е] = [Л/я/] - [АгАт2'].

При этом выполняется условие, что концентрации комплекса антиген-меченые антитела [АгАт/] и тройного комплекса [Ат;АгАт2*] максимальны в тестовой зоне и равны нулю за ее пределами, так как в ней находится избыток связывающих антител Агп].

В тестовой зоне сигнал равен:

* * * *

Б = [Ат/АгАт} ], и вне ее: Бо = [Ат2 ]+[АгАт2 ] = [Ат2 о], который был определен фоновым сигналом.

На основе полученных расчетов экспериментально была показана зависимость аналитического сигнала (Б-Бо) от изменения концентрации компонентов анализа [20]. На рисунке ЗА представлена зависимость концентрации иммунокомплекса в тестовой зоне от концентраций антигена при фиксированной концентрации меченых антител Ат2 в образце. При невысокой концентрации антигена, аналитический сигнал возрастает линейно. С увеличением концентрации антигена, аналитический сигнал достигает максимума и затем уменьшается. Причина падения аналитического сигнала при очень высоких концентрациях антигена в образце объясняется тем, что антиген связывается и с мечеными антителами, и с иммобилизованными антителами в тестовой зоне. Скорость движения свободного антигена больше по сравнению с комплексом антиген-меченые антитела АгАт2*, и в тестовой зоне происходит преимущественное связывание свободного антигена с иммобилизованными антителами Ат¡, блокируя тем самым центры связывания антител для образования тройного комплекса (Ат/ЛгАт2*).

Влияние концентрации меченых антител на количество образовавшегося комплекса в тестовой зоне имеет насыщающий характер (рис. ЗБ). С повышением концентрации меченых антител в системе [Ат2'о] первоначально наблюдается линейное возрастание аналитического сигнала, однако, при [Ат2*о] » [АтЦ аналитический сигнал выходит на плато. Это явление связано с ограниченной связывающей способностью иммобилизованных антител Ат¡. И, наконец, с увеличением концентрации иммобилизованных антител в системе, аналитический сигнал линейно возрастает (рис. ЗВ).

Таким образом, величина аналитического сигнала, регистрируемого в тестовой зоне, зависит от соотношения концентраций всех реагентов, участвующих в анализе, констант связывания, времени протекания реакции.

'С*

!0ю'г -о10 1С4 ю-4

[.-1Г.;].«

Рис. 3. Зависимость аналитического сигнала (Б-Бо) от изменения концентрации

компонентов анализа [20].

1.3. Основные компоненты иммунохроматографических тест-систем

1.3.1. Аналитическая мембрана (1)

Выбор мембран при разработке метода латерального проточного иммуноанализа является одним из наиболее важных моментов. К выбору аналитических мембран предъявляют ряд требований, таких как прочная иммобилизация антител или антигенов и сохранение их стабильности и активности в течение длительного времени.

1.3.1.1. Полимерный состав и свойства мембран

Свойства полимера, из которого изготовлена мембрана, имеют определяющее значение для связывающих характеристик мембраны. Как правило, материалы, из которых изготавливают аналитические мембраны - нитроцеллюлоза, ацетат целлюлозы, полиэфирсульфон, поливинилиденфторид и найлон. Все эти материалы имеют толщину

примерно 100 мкм и средний диаметр пор от 0,05 до 10 мкм. Нитроцеллюлозная и найлоновая мембраны обладают высокой способностью связывать белок, в то время как поливинилиденфторидные мембраны обладают более низкой связывающей способностью. Чаще всего в анализе используют нитроцеллюлозные мембраны благодаря их высокой способности связывать белок, кроме того, их легче блокировать, чем найлоновые мембраны [22].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Яковлева, Елена Алексеевна, 2013 год

VI. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Babuin L., Jaffe A.S. Troponin: the biomarker of ehoise for the detection of cardiac injury // CMAJ. - 2005. - V.173. - N. - 10. - PP.1191-1202.

2. Lescuyer P., Allard L., Hochstrasser D.F., Sanchez J-C. Heart fatty acid-binding protein as a marker for early detection of acute myocardial infarction and stroke // Molecular Diagnosis. - 2005. -V.9. - N.l. - P.1-7,

3. Егоров A. M., Осипов А. П., Дзантиев Б. Б., Гаврилова Е. М. Теория и практика иммуноферментного анализа / Москва: Высшая школа, 1991. - 288 с.

4. Yalow RS, Berson SA. Immunoassay of endogenous plasma insulin in man // Clin Invest. -1960.-V. 39.-P. 1157-1175.

5. Avrameas S. Coupling of enzymes to proteins with glutaraldehyde: Use of the conjugates for the detection of antigens and antibodies // Immunochemistry. - 1969. - V.6. - P. 43-52.

6. Nakane P., Pierce G. Enzyme-labeled antibodies for the light and electron microscopic localization of tissue antigens //J Cell Biol. - 1967. - V.33. - P. 307-318

7. Wide L., Porath J. Radioimmunoassay of proteins with the use of Sephadex-coupled antibodies // Biochem Biophys Acta. - 1966. - V. 30. - P. 257-260.

8. Engvall E., Perlman P.Enzyme-Iinked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin G // Immunochemistry. - 1971. - V.8. - N. 9. - P. 871-874.

9. Van Weemen B.K., Schuurs A.H. Immunoassay using antigen-enzyme conjugates //FEBS Letters. - 1971. - V. 15. - N. 3. - P. 232-236.

10. Wei R, Alving C., Richards R., Copeland E. Liposome spin immunoassay: a new sensitive method for detecting lipid substances in aqueous media //J Immunol Methods. - 1975. V.9. - N. 2. - P. 165-70.

11. Cumy R.E., Heitzman H., Riege D.H., Sweet R.V. A systems approach to fluorescent immunoassay: general principles and representative applications // Clinical Chemistry. - 1979. -V.25.- P.1591-1595.

12. Stewart K. Flow-injection analysis: a review of its early history //Talanta. - 1981. - V.28. -P.789-797.

13. Weiss A. Concurrent engineering for lateral-flow diagnostics [Электронный ресурс] // IVD Technology. - 1999. - URL: http:// www.devicelink.com/ivdt/archive/99/ll/009.html (дата обращения: 15.08.2013).

14. Дыкман JT.A., Богатырев В.А. Коллоидное золото в твердофазных методах анализа // Биохимия. - 1997. - Т. 62. - № 4. - С. 411-418.

15. Wilson R. The use of gold nanoparticle in diagnostics and detection //Chem.Soc.Rex. - 2008. -V.37. - P.2028-2041.

16. Wong R.C., Harley Y.T. (Eds) Lateral flow immunoassay. / New York: Humana Press, 2009. -223 p.

17. Millipore Corp. Rapid lateral flow test strips: consideration for product development. [Электронный ресурс]// 2002. URL: httD://www.millipore.com/techpublications/techl/tb500en00 (дата обращения: 15.08.2013).

18. Fridley G., Holstein C., Oza S., Yager P. The evolution of nitrocellulose as a material for bioassays // MRS Bulletin. - 2013. - V.38. - P.326-330.

19. Parolo C., Medina-Sanchez M., Escosura-Muniz, Merkoci A. Simple paper architecture modifications lead to enhanced sensitivity in nanoparticle based lateral flow immunoassay // Lab on chip. - 2013. - V.13. -N.3. - P.386-390.

20. Qian S., Bau H. A mathematical model of lateral flow bioreactions applied to sandwich assay // Analytical Biochemistry. - 2003. - V.322. - P.89-98.

21. Gorovits B.M., Osipov A. P., Egorov A.M. New immunoassay technique using antibody immobilized on a membrane and a flow cuvette as reaction vessel // J. Immunological Methods. -1993.-V.157.-P. 11-17.

22. Mansfield M.A. The use of nitrocellulose membranes in lateral flow assays / New York: Humana Press, 2005. - P. 71-85.

23. Beer H.H., Jallerat E., Pflanz K, Klewitz T.M. Qualification of cellulose nitrate membranes for lateral flow immunoassay [Электронный ресурс]// IVD Technology. - 2002. URL:http://www.ivdtechnology.com/article/ qualification-cellulose-nitrate-membranes-lateral-flow-assays (дата обращения: 15.08.2013).

24. Jones К. D. Troubleshooting protein binding in nitrocellulose membranes [Электронный ресурс] // IVD Technology. - 1999. URL:http://www.ivdtechnologv.com/article/troubleshooting-protein-binding-nitrocellulose-membranes (дата обращения 16.08.2013)

25. O'Farrell, Bauer J. Developing highly sensitive, more-reproducible lateral-flow assays [Электронный ресурс] // IVD Technology. - 2006. U RL:http://www. ivdtechnologv.com/article/developing-highlv-sensitive-more-reproducible (дата обращения 15.08.2013).

26. Carlberg D.L. Lateral-flow assays: Designing for automation [Электронный ресурс] // IVD Technology. - 1999. URL: http://www.ivdtechnologv.com/article/lateral-flow-assays-designing-automation (дата обращения 16.08.2013).

27. Posthuma-Trumpie G., Korf J., van Amerongen A. Lateral flow (immuno)assay: its strengths, weaknesses, opportunities and threats. A literature survey // Anal Bioanal Chem. - 2009. - N. 393. - P. 569-582.

28. Marks R. S., Cullen D.C., Karube I., Lowe C. R., Weetall H. H. Handbook of Biosensors and Biochips. // John Wiley & Sons, Ltd. - 2007. - 301 p.

29. Geoghean W.D. The effect of three variables on adsorption of rabbit IgG to cooloidal gold // J. Histochem Cytochem. - 1988. - V.36. - N 4. - P.401-407.

30. Hermanson G. Bioconjugate techniques //San Diego: Academic Press, 1996. - 785p.

31. Horisberger M., Rosset J ., Bauer H. Colloidal gold granules as markers for cell surface receptors in the scanning electron microscope // Experientia. - 1975. - V. 31. - P. 1147-1149.

32. Madison R., Maklins J. D. Latex nanospheres delivery systems // Brain. RES. - 1990. - V.7. - N. 3.-P.187- 192.

33. Букреева T.B., Парахонский Б.В., Марченко И.В. Полиэлектролитные микрокапсулы с наночастицами серебра и золота в составе оболочки, полученный на ядрах карбоната кальция и полистирола // Российские нанотехнологии. - 2008. - Т. 3. - В. 1-2. - С. 89-96.

34. Khreich N., Lamourette P., Lagoutte В., Ronco С., Franck X., Creminon С., Volland H. A fluorescent immunochromatographic test using immunoliposomes for detecting microcystins and nodularins // Anal. Bioanal. Chem. - 2010. - V. 397. - P.1733-1742.

35. X. Xia, Y. Xu, X.Zhao, Q.Li.Lateral flow immunoassay using europium chelate-loaded silica nanoparticles as labels// Clinical Chemistry. - 2009. - V. - 55 N. 1 P. - 179-182

36. Murphy C.J., Coffer J.L. QuantumDots: A Primer.// Appl.Spectrosc. - 2002. - V.56. - N.l. -P. 16-26.

37. Yun Xing, Jianghong Rao. Quantum dot bioconjugates for in vitro diagnostics & in vivo imaging.// Cancer Biomarker- 2008. - V.4. - P.307-319

38. Frasco M., Chaniotakis N. Bioconjugated quantum dots as fluorescent probes for bioanalytical applications //Anal Bioanal Chem. - 2010. - V. 396. - P.229-240

39. Tansil N.C., Gao Z. Nanoparticles in biomolecular detection //Nanotoday. - 2006. - V. 1. - N. 1. -P. 28-37.

40. Штыков C.H., Русанова Т.Ю. Наноматериалы и нанотехнологии в химических и биохимических сенсорах: возможности и области применения // Рос. Хим. Ж. - 2008. T.LII. -В.2.- С. 92-100.

41. Yu W. W., Chang Е., Drezek R., Colvin V.L. Water-soluble quantum dots for biomedical applications // Biochemical and Biophysical Research Communications. - 2006. - V. 348. - P.781-786.

42. Esteve-Turrillas F., Abad-Fuentes A. Applications of quantum dots as probes in immunosensing of small-sized analytes // Biosensors and Bioelectronics. - 2013. - V. 41. - P. 12-29.

43. Hao Yang, et al. A novel quantum dots-based point of care test of syphilis// Nanoscale Res.Lett. - 2010. - V. 5. - P. 875-881.

44. Губин С.П., Кокшаров Ю.А., Хомутов Г.Б., Юрков Г.Ю. Магнитные наночастицы: методы получения, стровение и свойства // Успехи химии. - 2005. - Т.74. - С. 539-574.

45. LaBorde R.T., В O'Farrell. Paramagnetic Particle Detection in Lateral-Flow Assays // IVD Technology. - 2002. - V. 8. - N. 3. - P.36-41.

46. QuanFu Xu, et al. Development of lateral flow immunoassay system based on superparamagnetic nanobeads as labels for rapid quantitative detection of cardiac troponin I. // Materials Science and Engineering C. - 2009. - V.29. - P. - 702-707

47. Faulk W.P., Taylor G.M. An immunocolloid method for the electron microscope. // Immunochemistry. - 1971. - V.8. - P. 1081-1083.

48. Hutter E., Fendler J.H. Exploitation of localized surface plasmon resonance//Adv.Mater. -2004. - V.16. - N.19. - P.1685-1706.

49. Хлебцов Н.Г., Богатырев B.A., Дыкман Л.Г., Хлебцов Б.Н. Золотые наноструктуры с плазмонным резонансом для биомедицинских исследований.// Российские нанотехнологии. Нанообзоры. - 2007. - Т. 2. - № 3-4,- С. 69-86.

50. Хлебцов Н.Г., Богатырев В.А., Дыкман Л.Г., Хлебцов Б.Н. Плазмонно-резонансные наночастицы для биодиагностики и медицины.// Нанотехника. - 2007. - №2. - С.77-80.

51. Дыкман Л.Г., Богатырев В.А. Наночастицы золота: получение, функционализация, использование в биохимии и иммунохимии. //Успехи химии. - 2007. - Т. 76. - №2. - С.199-213.

52. Weiser Н. В. Inorganic colloid chemistry. Volume I // John Wiley and Sons, Inc. New York. -1933. - 418 p.

53. Van Bergen en Henegouwen P.M.P., Leunissen J. L. M. Controlled growth of colloidal gold particles and inplications for labeling efficiency.// Histochemistry. - 1986. - V. 85. - P. 81-87

54. Slot S.W., Geuze H.J. A new method of preparing gold probes for multiple-labeling cytochemistry. //Eur. J. Cell Biol. - 1985. - V.38. - P. 87-93

55. Slot S.W., Geuze H. J. Sizing of protein A colloidal gold probes for immunoelectromicroscopy // J.Cell.Biol. - 1981. - V. 80. - P. 533-536.

56. Roth J. The protein A-gold technique - a qualitative and quantitative approach for antigen localization on thin sections // Techniques in Immunocytochemistry. - 1982. - P.107-133.

57. Frens G. Controlled nucleation for the regulation of the particle size in monodisperse gold suspensions // Nature Phys. Sci. - 1973. - V. 241. - P. 20-22.

58. Turkevich J. Colloidal gold. Part I. Historical and preparative aspects: morphology and structure // Gold Bull. - 1985. - V. 18. - P. 86-91.

59. Mirkin С. Programming the assembly of two- and three-dimensional architectures with DNA and nanoscale inorganic building blocks // Inorg. Chem. - 2000. - V. 39. - P. 2258-2272.

60. Хлебцов Н.Г. и др. Оптические свойства коллоидного золота и его конъюгатов с биоспецифическими макромолекулами. //Коллоидный журнал.- 1995. - Т. 57. - №3. - С. 412423.

61. Holgate C.S., Jackson P., Cowen P.N, Bird C.C. Immunogold-silver staining: new method of immunostaining with enhanced sensitivity // J.Histochem.Cytochem. - 1983. - V. 31. - P. 938-944.

62. Hacker G.W, Polac J.M., Springall D.R. Immunogold-silver staining // Mikroskopie(Vienna). -1985. -V. 42. - P. 318-321.

63. Хлебцов Н.Г. и др. Использование золотых нанооболочек в твердофазном иммуноанапизе.// Российские нанотехнологии. - 2008. - Т.З. - №7-8. - С.66-79.

64. Blaadaren V., Vrij A. Synthesis and characterization of monodisperse colloidal organo-silica spheres // J.Of Colloid and interface science. - 1993. - V. 156. - P. 1-18.

65. Hirsch L.R., Jackson J.В., Lee A., Halas N.J. A Whole blood immunoassay using gold nanoshells // Anal.Chem. - 2003. - V.75. - P. 2377-2381.

66. Stober W., F ink A., Bohn E. Controlled growth of monodisperse silica spheres in the micron size range // J.Colloid Interface Sci. - 1968. - V.26. - P.62-69.

67. Graph C., Vossen D.L., Imhof A., van Blaaderen. A general method to coat colloidal particles with silica //Langmuir. - 2003. - V.19. - P.6693-6700.

68. B.J. Jankiewicz, D. Jamiola, J. Choma, M. Jaroniec. Silica-metal core-shell nanostructures // Advances in Colloid and Interface Science. - 2012. - V. 170. - P. 28-47

69. Phonthammachai N., Kah J. Synthesis of gold nanoshells based on the deposition-precipitation process //Gold Bulletin. - 2008. - V.41. - P.23-35.

70. Phonthammachai N., White T.J. One-step synthesis of highly dispersed gold nanocrystals on silica spheres//Langmuir. -2007. -V.23. -P.l 1421-11424.

71. Oldenburg S.L., Averitt R.D., Westcott S.L, Halas N.J. Nanoengineering of optical resonances //Chem.Phys.Letters. - 1998. - V.288. - P.243-247.

72. Halas N. The Optical properties of nanoshells //Optics & Photonic News. - 2002. - P.26-30.

73. Kalele S., Gosavi S.W., Urban J., Kulkarni S.K. Nanoshell particles: synthesis, properties and application //Current Science. - 2006. - V.91.- No.8. - P.1038-1052.

74. Шилов A.M. Острый коронарный синдром, патофизиология и илечение [Электронный ресурс]// Лечащий врач. Кардиология. - 2011. - В. 7.URL:http://www.lvrach.ru/2011/07/15435236/ (дата обращения: 13.10.2013)

75. Nomenclature and criteria for diagnosis of Ischaemic Heart Disease: Report of the Joint International Society and Federation of Cardiology/World Health Organization Task Force on standardization of clinical nomenclature // Circulation. - 1979. - V. 59. - P. 607-608.

76. Lewandrowski K., Chen A., MD, Januzzi J. Cardiac markers for myocardial infarction // Am J Clin Pathol. - 2002. - V.l 18. - P.S93-S99

77. Hafidh A. Al-Hadi, Keith A. Fox. Cardiac markers in the early diagnosis and management of patients with acute coronary syndrome.//Sultan Qaboos Univ Med J. - 2009. - V. 9. - N.3. - P. 231— 246.

78. Morrow et.al. National academy of clinical biochemistry laboratory medicine practice guidelines: clinical characteristics and utilization of biochemical markers in acute coronary syndromes.//Circulation. - 2007. - V.l 15. - P. 356-375.

79. Fisher M., Carliner N. Becher L. et al. Serum creatine kinase in diagnosis of acute myo-cardial infarction optima] sampling frequency // Jama. - 1983. - V. 249. - N. 3. - P.393-394.

80. Glatz J.F.C., Van Bilsen M., Paulussen R. J. A., Veerkamp J., Van der Vusse G.J., et al. Release of fatty-acid binding protein from isolated rat heart subjected to ischemia and reperfusion or the calcium paradox // Biochim Biophys Acta. - 1988. - V. 961. - P. 148-152.

81. Glatz J.F.C, van der Vusse G.J. Cellular fatty acid binding proteins: their function and physiological significance // Prog Lipid Res. - 1996. - V. 35. - P. 243-282.

82. Chmurzyñska A.The multigene family of fatty acid-binding proteins (FABPs): Function, structure and polymorphism // J Appl Genet. - 2006. - V.47. - N.l. - P. 39-48.

83. Hertzel A., Bernlohr D. The Mammalian fatty acid-binding protein multigene family: molecular and genetic insights into function.//TEM. - 2000. - V. 11. - N. 5. - P. 175-180.

84. Storch J., Thumser A.The fatty acid transport function of fatty acid-binding proteins.// Biochimica et Biophysica Acta. - 2000. - V. 1486. - P. 28-44.

85. Lucke C., Rademacher M., Zimmerman A.W., van Moerkerk H.T., Veerkamp J.H., Ruterjans H. Spin-system heterogeneities indicate a selected-fit mechanism in fatty acid binding to heart-type fatty acid-binding protein (H-FABP) // Biochem.J. - 2001. - V. 354. - P. 259-266.

86. Glatz J.F.C., van der Voort D., Hermens W.T. Fatty Acid-binding Protein as the earliest available plasma marker of acute myocardial injury //J. of Clin.L.Assay. - 2002. - V. 25. - N. 2. - P. 167-177.

87. Van Nieuwenhoven F.A., Kleine A.H., Wodzig K.W.H., Hermes W.T., Kragten H.A., Maessen J.G., Punt C.D., Van Dieijen M.P., Van der Vusse G.J., Glatz J.F.C. Discrimination between myocardial and sceletal muscle injury by assessment of the plasma ratio of myoglobin over fatty acid-binding protein // Circulation. - 1995. - V. 92. - P. 2848-2854.

88. Cavus U., Coscun F., Yavuz B. et al. Heart-type fatty-acid binding protein can be a diagnostic marker in acute coronary syndromes // J Nat Med Assoc. - 2006. - V.98. - N. 7. - P. 1067-1070.

89. Tanaka T. et al. Serum and urinary human heart fatty acid-binding protein in acute myocardial infarction // Clin. Biochem. - 1991. - V. 24. - N.2. - P.195-201.

90. Wodziq K.W., Simoons M.L. Glatz J.F., de Groot M.J.Measurement of myocardial infarct size from plasma fatty acid-binding protein or myoglobin, using individually estimated clearance rates // Cardiovasc. Res. - 1999. - V.44. - N.l 1. - P.315-24.

91. Sorichter S., Mair J., Koller A., Pelsers M., Puschendorf B., et al. Early assessment of exercise induced skeletal muscle injury using plasma fatty acid-binding protein // Br J Sports Med. - 1998. - V. 32. -P. 121-124.

92. Pelsers M., Chapelle J., Knapen M., Vermeer C., Muijtjens A., et al. Influence of age, sex and day-to-day and within-day biological variation on plasma concentrations of fatty acis-binding protein and myoglobin in healthy subjects // Clin Chem. - 1999. - V. 45. - P.441-443.

93. Pagani F., Bonora R., Bonetti G., Panteghini M. Evaluation of a sandwich enzyme-linked immunosorbent assay for the measurement of serum heart fatty acid-binding protein // Ann Clin Biochem. - 2002. - V. 39. - P. 404-405.

94. Wodzig K.W.H., Pelsers M.M.A.L., Van der Vusse G.J., Roos W„ Glatz J.F.C. One-step enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for plasma fatty acid-binding protein // Ann. Clin. Biochem. - 1997. - V. 34. - P. 263-268.

95. Siegmann-Thoss C., Renneberg R., Glatz J. Enzyme immunosensor for diagnosis of myocardial infarction // Sensnor Actuators. - 1996. - V.30. - P.71-76.

96. Schreiber A., Feldbriigge R., Key G., Glatz J., Spener F. An immunosensor based on disposable electrodes for rapid estimation of fatty acid-binding protein, an early marker ofmyocardial infarction // Biosens Bioelectr. - 1997.- V.12. -P.l 131-1137.

97. Robers M., Van der Hulst F.F., Fischer M. Development of a rapid microparticle-enhanced turbidimetric immunoassay for plasma fatty acid-binding protein, an early marker of acute myocardial infarction //Clin.Chem. - 1998. - V.44. - P. 1564-1567.

98. Speiger H., Laterveer-Vreeswijk R.H., Glatz J.F.C., Nieuwenhuizen W., Hermens W.T. One-step immunoassay for measuring protein concentrations in plasma, based on precipitate-enhanced ellipsometry // Anal. Biochem. - 2004. - V. 326. - P. 257-261.

99. Grigorenko V., Andreeva I., Borchers T., Spener F., Egorov A. A genetically engineered fusion protein with horseradish peroxidase as a marker enzyme for use in competitive immunoasays // Anal. Chem. - 2001. - V. 73. - P.l 134-1139.

100. Тапака Т., Sohmiya К., Kitaura Y. Clinical evaluation of point-of-care-testing of heart-Type fatty acid-binding protein (H-FABP) for the diagnosis of acute myocardial infarction // J Immunoassay Immunochem. - 2006. - N. 3. - P. 225 - 238.

101. Chan C.P.Y., Sum K.W., Cheung K.Y., Glatz J.F.C., Sanderson J.E., Hempel A., Lehmann M„ Renneberg I., Renneberg R. Development of a quantitative lateral-flow assay for rapid detection of fatty acid-binding protein //J. Immunol. Methods. - 2003. - V. 279. - P. 91-100.

102. Liang Y., Chan C., Cheung К., Сautherley G., Renneberg R. Сardiodetect rapid test for the diagnosis of early acute myocardial infarction. //J Immunoassay Immunochem. - 2011. - V. 32. - N. 4. -P. 342-352.

103. Li Chun-Juan et. al. Point-of care test of heart-type fatty acid-binding protein for the diagnosis of early acute myocardial infarction. //Acta Pharmacol. Sin. - 2010. - V.31. - P.307-312.

104. Зырянова А.В., Ярохно H.H., Николаев К.Ю. Эффективность иммунохроматографического определения белка, связывающего жирные кислоты, при ранней дифференциальной диагностике острого коронарного синдрома./ЯТатология кровообращения и кардиохирургия. - 2010.- Т.4. - С.46-50.

105. Затейщикова А. А., Затейщиков Д. А. Кардиоспецифический тропонин Т в диагностике поражений миокарда // Кардиология. - 1997. - Т. 37. - № 6. - С. 53-57.

106. Haum С. Troponin Т: a new marker for myocardial cell injury (editorial) // Ann. Med. - 1994. -Vol. 26.-P. 319-380.

107. Korff S., Katus H.A., Giannitsis E. Differential diagnosis of elevated troponins // Heart. - 2006. -V. 92. - P. 987-993.

108. Филатов В.Jl., Катруха А.Г., Буларгина Т.В., Н.Б. Гусев. Тропонин: строение, свойства и механизм функционирования // Биохимия. - 1999. - Т.64. - №9. - С.1155-1174.

109. Farah С., Reinach F. The troponin complex and regulation of muscle contraction // FASEB J. -1995. - V.9. -P.755-767.

110. Gomez et.al. The Role of Troponins in Muscle Contraction.//IUBMB 2002. - V.54. - P.323-333

111. Wu A. et.al. Characterization of cardiac troponin subunit release into serum after acute myocardial infarction and comparison of assays for troponin T and I // Clin.Chem. - 1998. - V.44. -N.6. -P.l 198-1208.

112. James L. Januzzi Jr. Cardiac biomarkers in clinical practice //Jones and Barlett Publishers. 2010.900 p.

113. Jaffe A.S., Landt Y., Parvin C.A., Abendschein D.R., Geltman E.M., Ladenson J.H. Comparative sensitivity of cardiac troponin I and lactate dehydrogenase isoenzymes for diagnosis of acute myocardial infarction // Clin. Chem. - 1996. - V. 42. - P. 1770-1776.

114. Panteghini M. Assay-related issues in the measurement of cardiac troponins// Clinica Chimica Acta. - 2009. - V. 402. P. 88-93.

115. Katrukha A., Bereznikova A., Filatov V., Esakova T. Biochemical factors influencing measurment of cardiac troponin I in serum //Clin.Chem. Lab.Med. - 1999. - V.39. - P.1091-1095.

116. Katrukha A., Eriksson S., Kulmala J. Troponin I measurement: the concept of a precise immunoassay [Электронный pecypc]//Cardiovascular Disease. - 2006. URL:http://www.cli-online.com/fileadmin/artintVtroponin-i-measurement-the-concept-of-a-precise-immunoassav.pdf (дата обращения: 15.10.2013).

117. Mair J., Artner-Dworzak E., Lechleitner P., Smidt J., Wagner I., Dienstl F., Puschendorf B. Cardiac troponin T in diagnosis of acute mocardial infarction // Clin. Chem. - 1991. - V. 37. - P. 845852.

118. Ricchiuti V., Voss E.M., Ney A., Odland M., Anderson P.A.W., Apple F.S. Cardiac troponin T isoforms expressed in renal diseased skeletal muscle will not cause false-positive results by the second generation cardiac troponin T assay by Boehringer Mannheim // Clin. Chem. - 1998. - V.44. - P. 930938.

119. Mach F., Lovis C., Chevloret J.C., Urban P., Unger P.F., Bouillie M., Gaspoz J.M. Rapid bedside whole blood cardiospecific troponin T immunoassay for diagnostic of acute myocardial infarction // Am. J. Cardiol. - 1995. - V.75. - P. 842-845.

120. Cummins В., Auckland M.L., Cummins P. Cardiac-specific troponin-I radioimmunoassay in the diagnosis of acute myocardial infarction // Am Heart J. - 1987. - V.l 13. - P.1333-1344.

121. Larue C., Calzolari C., Bertinchant J.P., et al. Cardiacspecific immunoenzymometric assay of troponin I in the early phase of acute myocardial infarction // Clin Chem. - 1993. - V. 39.P. - 972-979.

122. Pagani F., Stefini F., Panteghini M. Innotrac Aio! second generation cardiac troponin I assay: imprecision profile and other key characteristics for clinical use // Clin Chem. - 2004. - V. 50. - P. 1271-1272.

123. Venge P., Lindahl В., Wallentin L. New generation cardiac troponin I assay for the Access immunoassay system //Clin Chem. - 2001. - V. 47. - P.959-961.

124. Apple F.S., Murakami M.M., Christenson R., et al. Analytical performance of the i-STAT cardiac troponin I assay //Clin Chim Acta. - 2004. - V. 345. - P. 123-127.

125. Uettwiller-Geiger D, Wu AH, Apple FS, et al. Multicenter evaluation of an automated assay for troponin I // Clin. Chem. - 2002. - V.48. - P. 869-876.

126. Casals G.et. al. Evaluation of a new ultrasensitive assay for cardiac troponin I //Clinical Biochemistry. - 2007. - V. 40. - P. 1406-1413.

w

127. Pagani F., Serena C., Bosio C., Cuccia C., Panteghini M. Evaluation of a rapid bedside immunochromatographic assay for detection of cardiac troponin I in whole blood // Clin.Chem.Lab.Med. - 2001. - V. 39. - N.5. - P. 458-459.

128. Heeschen C., Goldmann B.U., Moller R.H., Hamm C.W. Evaluation of a new troponin I beside test in acute myocardial infarction //Circulation. - 1996. - V. 94. - P.322.

129. Heeschen C., Goldmann В., Moeller R., Hamm C. Analytical performance and clinical application of a new rapid bedside assay for the detection of serum cardiac troponin I // Clin. Chem. -1998. - V.44. - N.9. - P.1925-1930.

130. Ramparany L., Ramirez J., Nizou J., Le Saux D., Richard V., Talarmin A. Evaluation of four rapid immunochromatographic tests for the detection of cardiac troponin I // Clin Vaccine Immunol. -2011. - V. 18. - N.3. - P.414—417.

131. Zhu J., Zou N., Zhu D., Wang J., Jin Q., Zhao J., Mao H. Simultaneous detection of high-sensitivity cardiac troponin I and myoglobin by modified sandwich lateral flow immunoassay: proof and principle.// Clin Chem. - 2011. - V. 57. - N. 12. - P. 1732-1738.

132. Cortez Diagnostic, Inc. Troponin I/CKMB/Myoglobin Panel test. A Panel of Assay for Acute Myocardial Infarction (AMI). Cat. 166779-1. Calabasas, USA. [Инструкция к набору] URL:http://www.rapidtest.com/pdf/3 in 1 Troponin I CK-MB Myoglobin Serum WB 166779-1(8-21-2012).odf

133. Geoghean W.D., Ackerman G.A. Adsorbtion of horseradish peroxidase, ovomucoid and antiimmunoglobulin to colloidal gold for the indirect detecrion of concanavalin A, wheat germ agglutinin and goat anti-human immunoglobulin G on cell surfaces at the electron microscopic level: a new method, theory and application //J Histochem. Cytochem. - 1977,- V.25.-P. 1187-1200.

134. Liu X., Atwater M., Wang J., Ни о Q. Extinction coefficient of gold nanoparticles with different sizes and different capping ligands //Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. - 2007. - V. 58. -P. 3-7.