Математическое моделирование радиационных и тепловых полей в биологических тканях, подвергаемых лазерному облучению тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 05.13.18, кандидат физико-математических наук Аникина, Алла Степановна

• Аникина, Алла Степановна
• кандидат физико-математических наук
• 2004

Оглавление диссертации кандидат физико-математических наук Аникина, Алла Степановна

Введение.

Глава 1. Состояние вопроса (обзор).

1.1. Математические модели радиационных полей.

1.2. Численные методы расчета радиационных полей.

1.3. Математическая модель тепловых полей.

1.4. Численные методы расчета тепловых полей.

1.5. Программные комплексы для расчета радиационных и тепловых полей.

Глава 2. Метод характеристических функций в оценивании математического ожидания случайных величин с бесконечной дисперсией.

2.1. Асимптотики характеристической функции.

2.2. Оценки математического ожидания.

2.3. Смещение.

2.4. Дисперсия.

2.5. Погрешности.

2.6. Выбросы.

2.7. Численное исследование оценок.

Глава 3. Моделирование радиационных и тепловых полей.

3.1. Математическая модель радиационных полей.

3.2. Численный метод расчета радиационных полей.

3.3. Математическая модель переноса тепла.

3.4. Решение биотеплового уравнения.

Глава 4. Программный комплекс для моделирования радиационных и тепловых полей. Тестирование и приложения

4.1. Общие характеристики комплекса.

4.2. Тестирование программного комплекса.

4.3. Численное исследование локальных оценок.

4.4. Практическое моделирование лазерных процедур.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Математическое моделирование радиационных и тепловых полей в биологических тканях, подвергаемых лазерному облучению»

Настоящая работа посвящена моделированию процессов переноса излучения и тепла в биологических тканях, подвергающихся интенсивному лазерному облучению.

Такие исследования актуальны для лазерной терапии и хирургии, биооптики, теплофизики. В медицине лазерные источники излучения и оптоволоконная техника позволили создать целый ряд новых эффективных медицинских технологий, существенно уменьшающих сроки лечения, его стоимость, риск и тяжесть осложнений. К таким технологиям, в частности, относятся термотерапия (лазерная гипертермия), каналирование и перфорация мягких и костных тканей, фотодинамическая терапия, технологии, основанные на термокоагуляции и термоабляции тканей. Все они нашли широкое применение в онкологии, отоларингологии, дерматологии, урологии, нейрохирургии, кардиохирургии, косметологии и других отраслях медицины.

Главными физическими агентами воздействия во всех перечисленных процедурах, вызывающими конечный медицинский эффект, являются излучение и тепло. Следовательно, для исследования воздействия лазерного1 излучения на биоткани необходимо, прежде всего, иметь информацию о радиационных и тепловых полях, возбуждаемых в процессе облучения.

Одним из способов получения такой информации являются приборные методы. Большинство используемых методов являются проникающими: регистрирующие датчики помещаются внутри ткани. Преимуществом таких методов является их точность и надежность. Но они имеют существенные недостатки:

• введение датчиков создает дополнительную травму ткани, которая часто недопустима по медицинским показаниям, т.к. ведет к повреждению жизненно важных объектов (сосуды, нервные узлы);

• получаемая информация, относится лишь к малому числу точек.

Существующие непроникающие приборные методы дистанционные и контактно-поверхностные) позволяют получать лишь, поверхностное распределение нужных характеристик. Ведутся разработки и для непроникающих измерений радиационных и температурных полей внутри тканей, но пока они далеки от внедрения в клиническую практику.

Альтернативным методом получения информации о радиационных и тепловых полях является метод математического компьютерного моделирования. Он, в принципе, позволяет получать пространственные распределения характеристик; проводить исследования «без повреждения» исследуемого объекта и существенных затрат, которых требует эксперимент.

Разработка средств компьютерного моделирования включает 3 задачи:

1. создание математической модели (исходные уравнения, граничные условия, параметры);

2. разработка алгоритмов реализации модели (аналитические, численные, статистические методы);

3. создание компьютерной программы, реализующей эти алгоритмы.

К настоящему времени в литературе предложен ряд моделей, численных алгоритмов и компьютерных программ для моделирования радиационных и тепловых полей. Проведенный анализ литературы (Глава 1) позволяет сделать следующие выводы.

1. Наиболее адекватной математической моделью переноса лазерного излучения в мутных средах является кинетическая модель, т.е. кинетическое уравнение переноса излучения в сочетании с законами Френеля, описывающими граничные условия. Именно эта модель принята в настоящей работе.

Наиболее адекватные математические модели переноса тепла в биотканях основаны на нестационарном уравнении теплопроводности и отличаются разными способами учета конвективного переноса тепла за счет кровотока.

Учет теплового эффекта кровотока в больших сосудах (вены, артерии) осуществляется явным образом. Из-за сложной геометрии кровеносных систем такие модели не являются универсальными, они разрабатываются отдельно для конкретных биотканей.

Учет капиллярного кровотока осуществляется двумя методами: «keff »-метод и «bio heat transfer»-MeTOfl. а) Идея «keff »-метода заключается в учете теплового эффекта капиллярного кровотока в коэффициенте теплопроводности. Такой способ не требует изменения вида исходного уравнения (уравнения теплопроводности) и введения дополнительных параметров, но на наш взгляд, является не вполне обоснованным физически. б) «Bio heat 1гапзГег»-метод - физически более обоснован. Учет капиллярного кровотока осуществляется здесь введением в уравнение теплопроводности дополнительного конвективного слагаемого, пропорционального разности температуры среды и температуры крови. Такой метод содержит дополнительные параметры и требует решения уже более сложного уравнения, называемого в мировой литературе «bio heat transfer equation». Поскольку в отечественной литературе перевод этого термина пока не закрепился, мы примем свой: «биотепловое» уравнение. В стационарном случае оно совпадает с уравнением Гельмгольца.

Сопоставления, проведенные в ряде работ, позволяют заключить, что, несхмотря на простоту, первая модель может применяться в случае достаточно мелких капилляров. Вторая модель позволяет учитывать капилляры практически любых размеров.

В настоящей работе в качестве тепловой модели выбрана комбинация этих моделей, включающая в качестве частных случаев keff и «bio heat transfer» модели, а также уравнение теплопроводности без конвекции.

2. Наиболее точным методом реализации кинетической модели, позволяющей учитывать сложную геометрию среды и источников излучения, является метод Монте-Карло. Во всех работах по биооптике реализован, так называемый, нелокальный метод Монте-Карло, что является существенным недостатком при расчете радиационных полей. Такие методы дают значения радиационных характеристик, усредненные по некоторым областям фазового пространства, что может приводить к большим систематическим погрешностям в случаях больших градиентов радиационных полей, весьма характерных для практических лазерных процедур. В то же время в теории методов Монте-Карло для расчета полей ионизирующего излучения разработаны локальные алгоритмы, позволяющие рассчитывать нужные характеристики радиационного поля в заданных точках пространства. Наиболее известной и часто применяемой на практике является локальная оценка Калоса (см. Глава 1 «Математические модели радиационных полей»), позволяющая рассчитывать плотность потока частиц (гамма-квантов, нейтронов) в фиксированной точке. Платой за это преимущество является бесконечность дисперсии этих оценок и, как следствие, пониженная скорость сходимости, плохое качество сходимости (велика вероятность больших отклонений от оцениваемой величины), что существенно затрудняет практическое использование этих оценок. Несмотря на то, что для преодоления этого недостатка предложен ряд, так называемых, ускоренных локальных методов, проблема далека от окончательного решения.

Литературный анализ показал, что численные методы для принятой тепловой модели не достаточно развиты. Во всех работах используются громоздкие конечно-разностные методы. В то же время эта модель может быть реализована любым численным методом, разработанным для уравнения теплопроводности, решению которого посвящена обширная литература.

Для решения стационарного уравнения теплопроводности наибольшее применение получили: метод конечных элементов; конечно-разностный метод; метод взвешенных невязок (решение параметризуется некоторой функцией; ее параметры находятся из условия ортогональности невязки к заданным весовым функциям). Для различных приложений, включая биомедицинские, имеющих дело со сложной геометрией и гетерогенными средами, хорошо зарекомендовал себя метод конечных элементов.

Для решения нестационарного уравнения теплопроводности, в основном, применяются методы, основанные на его сведении к системе более простых уравнений. Такое сведение осуществляется разными способами. Наиболее распространенным является сведение к системе обыкновенных дифференциальных уравнений (по времени) применением какого-нибудь численного алгоритма к пространственной части уравнения, т.е. к стационарному уравнению теплопроводности, в предположении известной производной по времени. Для решения стационарного уравнения используются те же методы: метод конечных элементов, конечно-разностный метод. Для решения системы обыкновенных дифференциальных уравнений используются в основном методы численного интегрирования Рунге-Кутта, конечно-разностный метод, метод взвешенных невязок.

Недостатком этого способа является громоздкость: приходится численно решать две системы. Реализация этого способа особенно трудна для задач, в которых параметры уравнения зависят от температуры.

Другим способом решения нестационарного уравнения является сведение к системе дифференциальных уравнений применением какого-нибудь конечно-разностного алгоритма к временной части. Наиболее интересными, в практическом смысле, являются схемы, приводящие к пошаговому решению уравнения по времени: температурное поле в следующий момент времени находится из температурного поля в предыдущий момент времени. В таких схемах на каждом временном шаге приходится решать одно стационарное уравнение. Часто - это уравнение типа Гельмгольца. Этот подход проще и естественнее предыдущего, не возникает проблем, связанных с зависимостью параметров от температуры.

Для численной реализации биотеплового уравнения, на наш взгляд, последний способ является более естественным: биотепловое уравнение и в стационарном случае является уравнением типа Гельмгольца.

3. В настоящее время в мире предприняты попытки создания компьютерных программ для моделирования радиационных и тепловых полей. Наиболее полными являются программные комплексы: LATIS (London R.A. et al., Lawerence Livermore National Laboratory, California) и LITCIT (Roggan A. et al., Laser-Medizin-Zentrum gGmbH, Berlin).

Но они являются чисто лабораторным продуктом и не доступны для сторонних пользователей. Достоинством этих комплексов является использование наиболее адекватных математических моделей: кинетическая модель переноса излучения (т.е. кинетическое уравнение переноса излучения в сочетании френелевскими граничными условиями) для моделирования радиационных полей; и биотепловое уравнение (нестационарное уравнение теплопроводности с конвективным слагаемым для учета переноса тепла за счет капиллярного кровотока) для моделирования тепловых полей.

Но эти программы имеют существенные недостатки по части принятых численных методов. Основным недостатком является использование только нелокального метода Монте-Карло (его недостатки указаны выше) для решения уравнения переноса излучения. Кроме того, для решения биотеплового уравнения используются громоздкие конечно-разностные методы.

В результате проведенного анализа в качестве исходных в данной работе приняты следующие модели и подходы к их реализации. Для радиационных полей:

• модель: квазистационарное уравнение переноса излучения с френелевскими граничными условиями;

• подход: метод Монте-Карло с использованием модифицированных локальных оценок с конечной дисперсией.

Для тепловых полей:

• модель: биотепловое уравнение с граничными условиями, учитывающими взаимодействие биоткани с окружающей средой, и источниками тепла, генерируемыми лазерным излучением;

• подход: метод взвешенных невязок для сведения биотеплового уравнения к стационарному уравнению Гельмгольца и метод конечных элементов для решения этого уравнения.

ЦЕЛЬЮ данной работы является создание единого программного комплекса для моделирования радиационных и тепловых полей в гетерогенных биологических тканях, подвергаемых лазерному облучению.

Для достижения этой цели предполагается решить следующие ЗАДАЧИ:

1. Для математического ожидания случайных величин с бесконечной дисперсией предложить и исследовать статистические оценки, имеющие лучшие характеристики сходимости и устойчивости по сравнению с выборочным средним.

2. На основе этих оценок разработать ускоренный локальный алгоритм метода Монте-Карло для решения уравнения переноса излучения. Конкретизировать его для моделирования полей лазерного излучения в мутных средах.

3. Разработать алгоритм решения биотеплового уравнения на основе методов конечных элементов и взвешенных невязок. Конкретизировать его для моделирования нестационарных тепловых полей в биологических тканях.

4. Реализовать алгоритмы в виде единого программного комплекса.

5. Провести тестирование комплекса и промоделировать ряд практических лазерных процедур.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

1. Разработаны новые оценки математического ожидания случайных величин с бесконечной дисперсией, имеющие большую скорость сходимости и большую устойчивость по отношению к выбросам по сравнению с выборочным средним.

2. На основе этих оценок разработан новый ускоренный локальный алгоритм метода Монте-Карло для расчета локальных радиационных характеристик полей лазерного излучения.

3. Предложена новая схема решения биотеплового уравнения, сочетающая метод взвешенных невязок и метод конечных элементов.

4. На основе принятых моделей и численных методов создан единый программный комплекс для расчета радиационных и тепловых полей лазерного излучения.

5. Впервые проведено моделирование радиационных и тепловых полей в тканях головного мозга, облучаемых лазерным излучением с длиной волны 1064 нм и 805 нм; печени крысы, облучаемых лазерным излучением с длиной волны 1064 нм.

АПРОБАЦИЯ

Основные результаты работы докладывались и обсуждались на Всероссийской конференции молодых ученых «Физика в биологии и медицине» (Екатеринбург, 1999, 2001) (доклады были отмечены дипломами конференции); международной конференции по биомедицинской оптике «International Simposium in Biomedical Optics "BiOS'2000"» (Сан-Хосе, Калифорния, 2000), на семинаре Уральского научно-практического центра радиационной медицины (Челябинск, 2004), а также неоднократно на семинарах по биомедицинской оптике в Челябинском государственном университете (1997-2004 г.г.).

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

1. Разработанный ускоренный локальный метод может быть применен для практических расчетов локальных радиационных характеристик полей как лазерного излучения, так и ионизирующего излучения.

2. Созданный программный комплекс предназначен для моделирования нестационарных радиационных и тепловых полей в гетерогенных биологических тканях, описываемых в виде двумерных осесимметричных многозонных сред. Он может быть использован для разработки и оптимизации лазерных хирургических операций, методов лазерной термотерапии и биостимуляции, для сравнительного исследования воздействия лазерного излучения с различными длинами волн; может служить основой математического обеспечения экспериментального определения оптических и теплофизических параметров биотканей.

3. Созданный программный комплекс может быть использован во всех организациях, занимающихся разработкой и оптимизацией лазерных медицинских технологий. В частности, он был использован в Челябинском государственном институте лазерной хирургии для оптимизации лазерных процедур на головном мозге; в МУЗ ГКБ №1 для оптимизации процедур лазерной термотерапии и исследования полей лазерного излучения в присутствии фотосенсибилизатора в процедурах фотодинамической терапии; в Челябинском государственном университете для математического обеспечения экспериментального определения оптических параметров биотканей, оптимизации метода экспериментального измерения температуры ткани.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ И РЕЗУЛЬТАТЫ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Предложенные оценки математического ожидания случайных величин с бесконечной дисперсией обладают существенными преимуществами по сравнению с выборочным средним. Они имеют большую скорость сходимости и большую устойчивость по отношению к выбросам, к ним применим стандартный способ одновременного оценивания статистической погрешности (через оценивание дисперсии). Установленный критерий для выбора свободного параметра оценок обеспечивает близкое к оптимальному сочетание устойчивости и точности оценок.

2. Предложенная схема решения биотеплового уравнения абсолютно устойчива и имеет второй порядок сходимости как по времени, так и по пространству.

3. Созданный программный комплекс позволяет рассчитывать основные характеристики нестационарных радиационных и тепловых полей в биологических тканях, подвергаемых электромагнитному облучению в оптическом диапазоне, в приближении двумерных гетерогенных многозонных сред.

4. Выполненные расчеты полей представляют практический интерес для лазерной хирургии. С их помощью разработаны и оптимизированы лазерные операции на головном мозге, щитовидной железе, печени и др.

ПУБЛИКАЦИИ

Результаты работы изложены в 9 статьях и 4 тезисах докладов на научных конференциях.

Решению поставленных задач посвящены 4 главы диссертации.

ПЕРВАЯ ГЛАВА содержит обзор известных моделей, методов и программ для моделирования радиационных и тепловых полей в биотканях, подвергающихся лазерному облучению.

ВТОРАЯ ГЛАВА посвящена решению задачи №1: разработке и исследованию статистических оценок математического ожидания одномерных неотрицательных случайных величин £ с бесконечной дисперсией, функция распределения ^(л;) = Р{^<л;} которых удовлетворяет либо условию l-F(x) = о{х~а}, д:оо; а > 1, (1) либо его частному случаю l-F{x) = cx-a +о(х'р), х-*°с\1<а<2, а*/3;с> 0. (2)

Общая идея предлагаемого в настоящей работе метода оценивания математического ожидания заключается в использовании априорной информации о случайной величине а именно, условия (1) или (2). Построение новой ускоренной локальной оценки основано на статистическом оценивании характеристической функции g случайной величины £ и использовании асимптотических связей между характеристической функцией и математическим ожиданием (Л = М£.

Эти связи установлены и сформулированы в виде теоремы для произвольного распределения, имеющего асимптотическое разложение степенного типа, включая частные случаи (1), (2). Этот результат используется для построения двух оценок математического ожидания: первая оценка применима для оценивания математического ожидания в случае (1) (и, разумеется, в его частном случае (2)), вторая - в случае (2). Обе оценки зависят от некоторого неотрицательного свободного параметра t > 0.

Для этих оценок: получены асимптотические оценки скорости изменения смещения и дисперсии при / —>0, построен критерий устойчивости, предложены практические способы оценивания смещения и статистической погрешности.

Оценки численно исследованы на задаче о вычислении математического ожидания [г неотрицательной случайной величины £ с функцией распределения F вида:

1,

-3/2 - (3)

X , х>1.

В этом случае £ имеет бесконечную дисперсию и математическое ожидание /г = 3.

ТРЕТЬЯ ГЛАВА посвящена решению задач №2, 3: разработке численных алгоритмов расчета характеристик радиационных и тепловых полей лазерного излучения в гетерогенных биологических тканях, описываемых в виде двумерных осесимметричных многозонных сред.

Для моделирования радиационных полей приняты:

• математическая модель: квазистационарная кинетическая модель переноса излучения с френелевскими граничными условиями;

• численный подход: нелокальный и ускоренный локальный метод Монте-Карло, который включает оценку Калоса и полученные в Главе 2 оценки математического ожидания.

Для моделирования тепловых полей приняты:

• математическая модель: модель биотеплового уравнения с граничными условиями, учитывающими взаимодействие биоткани с окружающей средой, и источниками тепла, генерируемыми лазерным излучением. Эта модель включает в качестве частных случаев keff и «bio heat transfer» модели, а также уравнение теплопроводности без конвекции;

• численный подход: метод взвешенных невязок для сведения биотеплового уравнения к решению стационарного уравнения (типа Гельмгольца) на каждом временном шаге и метод конечных элементов для решения этого уравнения.

ЧЕТВЕРТАЯ ГЛАВА посвящена решению задач №4,5: разработке и тестированию программного комплекса и моделированию с его помощью ряда практических лазерных процедур. Настоящая глава содержит:

• общую характеристику программного комплекса (область применимости, входные параметры, рассчитываемые характеристики полей излучения, возможности комплекса);

• результаты тестирования программного комплекса, которое включало сопоставление с известными аналитическими решениями, результатами других программ, а также результатами эксперимента;

• исследование ускоренных локальных оценок для задач лазерной медицины;

• результаты практического моделирования лазерных процедур: радиационных и тепловых полей в ткани мозга человека, подвергающейся облучению двух видов лазеров; в коже человека; в ткани печени крысы.

Заключение диссертации по теме «Математическое моделирование, численные методы и комплексы программ», Аникина, Алла Степановна

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

1. Разработаны и реализованы статистические оценки математического ожидания случайных величин с бесконечной дисперсией. Эти оценки обладают существенными преимуществами по сравнению с выборочным средним: они имеют большую скорость сходимости и большую устойчивость по отношению к выбросам, к ним применим стандартный способ одновременного оценивания статистической погрешности (через оценивание дисперсии).

Для этих оценок:

• установлен критерий для выбора свободного параметра, который обеспечивает близкое к оптимальному сочетание устойчивости и точности оценок;

• построены оценки смещения, которые позволяют оценивать систематическую погрешность вычисления математического ожидания (л одновременно с оцениванием самого [л.

2. На основе этих оценок разработан ускоренный локальный алгоритм метода Монте-Карло для решения уравнения переноса лазерного излучения в мутных средах.

3. Разработан алгоритм решения биотеплового уравнения, сочетающий метод взвешенных невязок и метод конечных элементов. Схема абсолютно устойчива и имеет второй порядок сходимости как по времени, так и по пространству.

4. Разработанные алгоритмы реализованы в виде программного комплекса для расчета характеристик нестационарных радиационных и тепловых полей в биологических тканях, подвергаемых электромагнитному облучению в оптическом диапазоне в приближении двумерных гетерогенных многозонных сред. Проведенные тестовые исследования позволяют судить о хорошей работоспособности комплекса.

5. С помощью комплекса проведено моделирование радиационных и тепловых полей в тканях головного мозга, облучаемых лазерным излучением с длиной волны 1064 нм и 805 нм; печени крысы, облучаемых лазерным излучением с длиной волны 1064 нм. Выполненные расчеты полей представляют практический интерес для лазерной хирургии. С их помощью разработаны и оптимизированы лазерные операции на головном мозге, щитовидной железе, печени и др.

Список литературы диссертационного исследования кандидат физико-математических наук Аникина, Алла Степановна, 2004 год

1. Аникина А.С. Моделирование радиационно-температурных полей в биологических тканях, облучаемых лазером // Физика в биологии и медицине: сборник научных работ Уральской конференции молодых ученых. Екатеринбург, 1999. - С. 26-27.

2. Антюфеев B.C., Михайлов Г.А., Назаралиев М.А. Модификации локальных оценок с учетом осевой симетрии в задачах атмосферной оптики. // Вероятностные методы решения задач математической физики. Новосибирск: Изд. ВЦ СО АН СССР, 1971, С. 26-43.

3. Беляев Н.М., Рядно А.А. Методы теории теплопроводности. М.: Высшая школа, 1982. Т. 1,2. - 327 е., 304 с.

4. Бондаревский И .Я., Бордуновский В.Н., Астахова Л.В. Опыт применения высокоинтенсивного лазерного излучения при операциях на печени (экспериментальное исследование) // Лазерные технологии в медицине: Сборник научных работ. -Челябинск, 1999.-С. 114-121.

5. Гаплагер Р. Метод конечных элементов. Основы. М.: Мир, 1984. -428 с.

6. Деклу Ж. Метод конечных элементов. Пер. с франц. Б.И.Квасова; Под ред. Н.Н. Яненко. М.: Мир, 1976. 95 с.

7. Дэйвид Г. Порядковые статистики. М.: Наука, 1979. 336 с.

8. Ермаков С.М. Метод Монте-Карло и смежные вопросы. М.: Наука., 1975.-470 с.

9. Зарубин B.C. Инженерные методы решения задач теплопроводности. М.: Энергоатомиздат, 1983. 328 с.

10. Зенкевич О., Морган К. Конечные элементы и аппроксимация. М.: Мир, 1986.-318 с.

11. Зенкевич О.С., Тейлор P.JL, Ту Дж.М. Метод конечных элементов в технике. М.: Мир. 1975. - 543 с.

12. Золотарев В.М. Одномерные устойчивые распределения. М.: Наука, 1983.-304 с.

13. Ибрагимов И.А., Линник Ю.В. Независимые и стационарно связанные величины. М.: Наука, 1965. 524 с.

14. Исимару А. Распространение и рассеяние волн в случайно-неоднородных средах. М.: Мир, 1981. -Т. 1,2.- 280 е., 317 с.

15. Капиткин Н.Н. Численные методы. М.: Наука, 1978. 511 с.

16. Кольчужкин A.M., Учайкин В.В. Введение в теорию прохождения частиц через вещество. М.: Атомиздат, 1978. — 256 с.

17. Ландсберг Г.С. Оптика. М.: Высшая школа, 1976. 926 с.

18. Лаппа А.В., Бахвалов Е.В., Аникина А.С. Метод характеристических функций в оценивании математического ожидания случайных величин с бесконечной дисперсией // Известия Челябинского научного центра. Челябинск, 2004. Вып. 2. С. 1-6.

19. Лыков А.В. Теория теплопроводности. М.: Высшая школа, 1967.600 с.24,25,26