Механизмы нарушения систем транспорта кальция в нейронах мозга при действии глутамата тема диссертации и автореферата по ВАК 03.00.13, доктор биологических наук Сторожевых, Татьяна Павловна

Диссертация и автореферат на тему «Механизмы нарушения систем транспорта кальция в нейронах мозга при действии глутамата». disserCat — научная электронная библиотека.
Автореферат
Диссертация
Артикул: 154184
Год: 
2002
Автор научной работы: 
Сторожевых, Татьяна Павловна
Ученая cтепень: 
доктор биологических наук
Место защиты диссертации: 
Москва
Код cпециальности ВАК: 
03.00.13
Специальность: 
Физиология
Количество cтраниц: 
212

Оглавление диссертации доктор биологических наук Сторожевых, Татьяна Павловна

Принятые сокращения.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1-1. Приготовление первичной культуры нейронов.

1-2. Микроспектрофлуориметрические исследования.

1-3. Измерение внутриклеточной концентрации АТФ и отношения

АТФ/АДФ.

1-4. Определение выживаемости нейронов.

1-5. Изучение захвата 45Са2+ в гранулярные клетки мозжечка.

1-6. Измерение выхода цитохромас из митохондрий.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 2. ПРОНИЦАЕМОСТЬ ПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ МЕМБРАНЫ ДЛЯ Са2+ (РСа) В ПОКОЕ, ВО ВРЕМЯ И ПОСЛЕ ДЕЙСТВИЯ ГЛУТАМАТА

Обзор литературы а. Глутамат как метаболит и основной возбуждающий нейротрансмиттер ЦНС. б. Нейротоксичность глутамата.

2-1. Изменение [Ca2+]j в нейронах мозжечка и гиппокампа крысы во время действия глутамата или гиперкалиевой деполяризации.

2-2. Исследование динамики Р( а спектрофлуориметрическим методом.

2-3. Исследование динамики Рса радиоизотопным методом.

Выводы.

Глава 3. РОЛЬ Na+/Ca2+ ОБМЕНА ПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ МЕМБРАНЫ В

РЕГУЛЯЦИИ Са2+ ГОМЕОСТАЗА НЕЙРОНОВ В ПОКОЕ И ПОСЛЕ ДЕЙСТВИЯ ГЛУТАМАТА ИЛИ КАЛИЕВОЙ ДЕПОЛЯРИЗАЦИИ

Обзор литературы.

3-1. Влияние бепридила, как ингибитора Na+/Ca2+ обмена, на регуляцию

Ca2+]j в нейронах в покое и во время действия глутамата.

3-2. Изменения [Ca2+]j в нейронах при блокаде Na+/Ca2+ обмена заменой внеклеточного Na+ на NMDG.

3-3. Изменения [Ca2+]j при блокаде Na+/Ca2+ обмена путем замены Na+ в инкубационной среде на Li+.

3-4. Влияние Na+/Ca2+ обмена на регуляцию [Ca2+]j в условиях блокады захвата Са2+ митохондриями и ретикулумом.

3-5. Влияние блокады Na+0/Ca2+i обмена на уровень |Са2+], в нейронах во время длительного действия Glu или калиевой деполяризации.

Выводы.

Глава 4. РОЛЬ Са2+-АТФАЗЫ ПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ МЕМБРАНЫ И

ЭИДОПЛАЗМАТИЧЕСКОГО РЕТИКУЛУМА В РЕГУЛЯЦИИ Са2+ ГОМЕОСТАЗА НЕЙРОНОВ В ПОКОЕ И ПОСЛЕ ДЕЙСТВИЯ ГЛУТАМАТА ИЛИ КАЛИЕВОЙ ДЕПОЛЯРИЗАЦИИ

Обзор литературы.

4-1. Влияние ингибирования Са2+ насоса плазмалеммы ортованадатом на [Ca2+]i в нейронах в покое и после действия глутамата.

4-2. Изменение [Ca2+]j в нейронах при ингибирования Са2+ насоса плазмалеммы внеклеточным защелачиванием.

4-3. Исследование роли Са2+-АТФазы в регуляции [Ca2+]i гомеостаза нейронов путем замещения Са2+ во внеклеточной среде на Ва2+.

4-4. Роль зндоплазматического ретикулума в регуляции [Са в нейронах в покое и после стимуляции глутаматом.

Выводы.

Глава 5. ДИСФУНКЦИЯ МИТОХОНДРИЙ -КЛЮЧЕВОЕ ЗВЕНО В МЕХАНИЗМЕ НАРУШЕНИЯ Са2+ ГОМЕОСТАЗА НЕЙРОНОВ ПРИ ДЕЙСТВИИ ГЛУТАМАТА

Обзор литературы.

5-1. Влияние глутамата на потенциал внутренней митохондриальной мембраны, ДЧ'т.

5-2. Влияние блокады захвата Са2+ митохондриями на восстановление базальной [Ca2+]j после кратковременного действия глутамата.

5-3. Блокада захвата Са2+ митохондриями увеличивает [Ca2+]j в нейронах во время действия глутамата.

5-4. Деполяризация митохондрий - основная причина дестабилизации нейронального [Ca2+]j гомеостаза при длительном действии глутамата. 136 5-5. Внутриклеточное содержание АТФ/АДФ при действии Glu и при сочетанном действии Glu и митохондриальных ингибиторов.

5-6. Возможность индукции поры в митохондриях культивируемых нейронов мозжечка после действия глутамата.

Выводы.

Введение диссертации (часть автореферата) На тему "Механизмы нарушения систем транспорта кальция в нейронах мозга при действии глутамата"

Многочисленные клинические и экспериментальные наблюдения свидетельствуют о том, что нейроны мозга, в отличие от клеток других типов, быстро повреждаются и часто гибнут даже при кратковременном нарушении кровообращения (Choi, 1987; 1992). Однако причины столь высокой чувствительности нейронов мозга к ишемии/гипоксии длительное время оставались не исследованными. Изучение механизмов повреждения нейронов стало возможным благодаря трем научным достижениям: а) развитию методов, позволяющих работать на первичных культурах нейронов и срезах мозга (Hansson & Ronnback, 1989; Gahwiler et al., 1997); б) открытию нейротрансмиттерной роли L-глутаминовой кислоты (Curtis & Watkins, 1960; Olney & Sharpe, 1969); в) развитию представлений об аноксической деполяризации нейрональной мембраны и нарушении ионного гомеостаза (Hansen, 1985; Siesjo В.К et al., 1988, 1992).

Первичные культуры нейронов являются адекватной экспериментальной моделью, позволяющей на клеточном и молекулярном уровне изучать нейродеструктивные процессы, вызываемые действием возбуждающих аминокислот. Физиологические и биохимические характеристики культивируемых нейронов близки тем, что наблюдаются у нейронов in situ (И.В.Викторов и соавт. 1988; Хаспеков, 1995). В исследованиях на культивированных нейронах было установлено, что ключевую роль в отсроченной гибели нейронов при ишемии/гипоксии мозга играет длительная стимуляция глутаматных рецепторов, вызванная избыточным выделением и накоплением в синаптическом пространстве возбуждающего медиатора глутамата (Glu) (Rothman & Olney, 1986; Choi, 1992; обзор Masson et al., 1999). Было показано, что аппликация Glu в цитотоксической концентрации на культивируемые нейроны вызывает в них повреждения, аналогичные тем, что наблюдаются в мозге при ишемии/гипоксии, in vivo (Rothman & Olney, 1986). Согласно современным представлениям, нейродеструктивное действие Glu опосредуется главным образом NMDA подтипом Glu рецепторов, причем гибели нейронов предшествует быстрое и неконтролируемое увеличение внутриклеточной концентрации Са2+ ([Са2+]0 (Ходоров и др., 1992; Ogura et al., 1988; Erausquin et al., 1990; Randall & Thayer, 1992; Tymianski et al., 1993b; Danysz & Parsons, 1998 и др.). Повышение [Са2+]ь вызванное входом Са по ионотропным Glu каналам, сохраняется и после отмены действия Glu (возникает так называемая «кальциевая «перегрузка» нейрона). При моделировании на животных ишемии/аноксии мозга, эпилепсии и черепно-мозговой травмы также наблюдается аккумуляция Са2+ в нервной ткани (Hansen, 1985;Gill et al., 1988; Andine et al., 1991). Значение ионов

Ca2+ для функционирования нервной системы очень велико. Как

2+ вторичные мессенджеры, ионы Са регулируют множество внутриклеточных и межклеточных процессов в нервной ткани: инициацию и торможение возбуждения, высвобождение нейротрансмиттеров и гормонов, рост и дифференциацию нервных окончаний, экспрессию генов, метаболизм митохондрий и др. (Kostyuk, 1992; Clapham,

2+

1995; Dunican & Doherty, 2000). Вход Са в нейроны при их активации осуществляется в основном по потенциал-зависимым и лиганд-управляемым каналам плазматической мембраны (Ткачук, 1999; Llinas, 1988; Regehr et al., 1990; Ogura et al., 1987; Meir et al., 1999). Восстановление базального уровня [Ca2+]i в нейронах, как и в других возбудимых клетках, происходит за счет активации Са2+-АТФ-азы и Na+/Ca2+ обмена плазматической

2+ мембраны, захвата Са эндоплазматическим ретикулумом и митохондриями, а также связывания Са2+ с внутриклеточными буферными белками (Авдонин, Ткачук, 1994; Костюк, 1997; Carafoli, 1987; Berridge, 1998; Blaustein & Lederer, 1999; Kostyuk & Verkhratsky, 1994). Интегративная активность этих механизмов поддерживает [Са2^ в покое в пределах 50-150 нМ, в то время как во внеклеточном пространстве она почти на 5 порядков выше - около 1.3-1.5 мМ (Miller, 1991). Нарушение кальциевого гомеостаза, даже кратковременное, несомненно, влечет за собой драматическое изменение жизнедеятельности нейрона.

Несмотря на заметный прогресс в изучении внутриклеточных процессов, инициируемых воздействием Glu при ишемии/аноксии мозга, множество вопросов, касающихся отдельных звеньев этого каскада, остаются нерешенными. В частности, недостаточно изучена ключевая проблема Са2+ природы нейротоксичности Glu - какие именно механизмы ответственны за необратимое повышение [Ca2+]j после интенсивной стимуляции Glu рецепторов. До последнего времени оставалось не ясным, обусловлен ли высокий уровень [Са ], альтерацией клеточной мембраны и увеличением ее проницаемости к Са2+, или «кальциевый стресс» является следствием повреждения внутриклеточных систем регуляции (транспорта) [Ca2+]j. Вклад различных систем транспорта Са в восстановление [Са ]j гомеостаза после действия глутамата мало изучен, и имеющиеся в литературе данные во многом противоречивы (Segal & Manor,

1992; Tatsumi & Katayama, 1993; Budd & Nicholls, 1996; Stout et al., 1998). К началу наших исследований не было опубликовано ни одной работы на нервных клетках ЦНС, в

2+ которой на одном объекте было бы сопоставлено участие двух и более Са -регулирующих систем в восстановлении Са2 гомеостаза после действия Glu, поэтому изучение этого вопроса представляет несомненный интерес. Кроме того, ответ на вопрос о том, какие механизмы ответственны за дестабилизацию [Ca2+]j гомеостаза после нейротоксического действия Glu, позволил бы получить более четкие представления и о механизмах регуляции [Ca2+]j нейронов в норме, при физиологических воздействиях, не вызывающих гибели нейронов.

Одним из наиболее важных фундаментальных аспектов проблемы гибели нервных клеток при ишемии/реоксигенации мозга является вопрос о роли митохондрий в повреждении нейронов. Известно, что при таких состояниях происходит снижение активности дыхательных ферментов в митохондриях, увеличение проницаемости мембраны митохондрий к катионам, разобщение дыхания и фосфорилирования (Владимиров, Коган, 1981; Хватова и др., 1987; Almeida et al., 1995). Появившиеся в последние годы новые данные о том, что в разных типах возбудимых клеток, в том числе и в нейронах мозга митохондрии способны модулировать Са2+ сигнал, т.е. захватывать Са2+ при увеличении [Ca2+]j и впоследствии высвобождать его (обзор Pozzan & Rizzuto, 2000), определили новое направление в исследовании механизмов глутаматной нейротоксичности. Появление флуоресцентных методов исследования в клеточной физиологии сделало возможным измерение потенциала митохондриальной мембраны в интактной клетке (АЧ;П1). Это побудило нас обратиться к изучению изменений AxFm в нейронах во время длительного действия глутамата. Одним из наиболее важных и малоизученных вопросов является взаимосвязь изменений [Са ]j и AxFm во время и после токсического действия Glu, а также последствия деполяризации митохондрий для [Са ]j гомеостаза. Большой интерес в плане возможных механизмов повреждения митохондрий представляют данные о возможности открытия неселективной поры во внутренней мембране митохондрий при сочетанном действии нескольких факторов, в том числе аккумуляции митохондриями большого количества Са2+ (Crompton et al., 1987). Подавляющее большинство этих данных было получено в экспериментах на изолированных митохондриях или на гепатоцитах/миоцитах. и поэтому изучение этого феномена на нейронах, подвергнутах действию Glu, представляется перспективным. Цель и задачи исследования

Цель работы заключалась в изучении вклада внутриклеточных систем транспорта Са2+ в регуляцию [Ca2+]j гомеостаза нейронов мозга в норме и в выяснении механизмов, лежащих в основе нарушения этих гомеостатических систем при цитотоксическом действии глутамата.

Были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать изменения Са2+ проницаемости плазматической мембраны во время и после продолжительного действия глутамата в зернистых клетках мозжечка и гиппокампа крысы.

2. Провести сравнительный анализ роли Са2+-АТФазы и Na+/Ca2+ обменника нейрональной мембраны в поддержании низкой базальной [Ca2+]i в покое и в восстановлении [Са2+], гомеостаза после нетоксического кратковременного действия глутамата или калиевой деполяризации.

3. Оценить вклад митохондриального транспорта Са2+ в динамику [Ca2+]j ответов нейронов на кратковременное действие глутамата или К+ деполяризации.

4. Исследовать изменения [Са ]i, митохондриального потенциала, внутриклеточной концентрации АТФ и отношения АТФ/АДФ, а также выживаемости нервных клеток после цитотоксического действия глутамата.

5. Выяснить природу связи между дисфункцией митохондрий, нарушением восстановления [Ca2+]j гомеостаза и гибелью нейронов после токсического действия глутамата.

6. Оценить возможные механизмы дисфункции митохондрий в условиях токсического действия глутамата; изучить факторы, способствующие индукции поры в митохондриях культивируемых нейронов.

Положения, выносимые на защиту:

2+

1. Са -АТФаза плазматической мембраны играет основную роль не только в регуляции базального уровня [Ca2+]j в интактных нейронах, как это полагали ранее, но и в механизме восстановления исходного уровня [Ca2+]i после его значительного повышения, вызванного глутаматом или калиевой деполяризацией мембраны.

2. Воздействие глутамата вызывает подавление прямого (выведение Са2+) и облегчение реверсивного (вход Са2+) направления Na+/Ca2+ обмена через плазматическую мембрану вследствие значительного повышения внутриклеточных концентраций ионов Na+ и Н+. Изменение трансмембранного градиента Na+ сохраняется длительное время после отмены действия глутамата, поэтому Na+/Ca2+ обменник не играет

2+ существенной роли в механизмах восстановления [Са ], после действия глутамата. Напротив, дополнительный вход Са2+ в клетки вследствие реверсии транспорта Са2+ Na+/Ca2+ обменником играет важную роль в патогенезе глутаматной нейротоксичности. л I

3. Стойкое повышение [Са ]; в нейронах в результате цитотоксического действия глутамата обусловлено нарушением функции АТФ-зависимых систем выведения Са2+ из клеток: Са2+-АТФазы и Na+/Ca2+ обмена. Са2+ проницаемость нейрональной мембраны после окончания действия глутамата незначительно отличается от Са2+ проницаемости в состоянии покоя.

2+

4. Митохондрии аккумулируют значительное количество Са , входящего в нейроны во время их стимуляции глутаматом, но не во время калиевой деполяризации мембраны, и длительно его удерживают. Захват Са2+ митохондриями снижает амплитуду внутриклеточного [Ca2+]j сигнала при действии глутамата более, чем в два раза.

5. В основе дестабилизации [Ca2+]j гомеостаза после токсического действия глутамата лежит стойкая деполяризация митохондрий. Коллапс митохондриального потенциала, во-первых, препятствует захвату Са2+ митохондриями, что увеличивает |Са2+]1з во-вторых, прекращает аэробный синтез АТФ, что снижает внутриклеточную концентрацию АТФ и отношение АТФ/АДФ. Происходящая при деполяризации митохондрий реверсия АТФ-синтетазы (FiFo-АТФазы) митохондрий и последующий гидролиз ею цигоплазматической АТФ усиливают распад АТФ, вызываемый глутаматом. Следствием этих процессов является подавление активности АТФ-зависимых систем транспорта Са2+ из клеток. 6. После цитотоксического действия глутамата и аккумуляции Са2+ митохондриями происходит выход митохондриального белка цитохрома с в цитозоль, что указывает на структурные повреждения митохондрий и возможность индукции неселективной поры во внутренней митохондриальной мембране. Важным фактором индукции неселективной поры в митохондриях, помимо захвата большого количества Са2+, является значительное снижение цитоплазматической концентрации АТФ. Предварительная деполяризация митохондрий разобщителями, препятствующая транспорту Са2+ в митохондрии во время действия глутамата, снижает гибель нейронов. Научная новизна

Впервые был проведен сравнительный анализ динамики [Ca2+]j сигнала в нейронах мозга после их стимуляции в условиях избирательного ингибирования разных систем регуляции [Са2+],, что позволило оценить индивидуальный вклад каждой системы в поддержание и восстановление Са2+ гомеостаза.

Впервые показано, что ведущую роль в механизмах выведения Са из нейронов после их стимуляции глутаматом или высоким К+ играет Са2+ насос плазмалеммы. Инактивация этой транспортной системы вызывает драматическую задержку восстановления базального уровня [Ca2+]i после действия глутамата или калиевой деполяризации. В отличие от этого, подавление Na+/Ca2+ обмена в сочетании с блокадой захвата Са2+ митохондриями в подавляющем большинстве нейронов оказывает слабое влияние на скорость снижения [Са2+]| после кратковременного глутаматного «удара» или калиевой деполяризации.

Установлено, что стойкое увеличение [Са2+], после цитотоксического действия глутамата не является следствием повышения Са2+ проницаемости мембраны, а обусловлено нарушением систем транспорта Са2+ в нейронах.

Получены новые данные о том, что Na+/Ca2+ обменник плазматической мембраны во время действия глутамата функционирует преимущественно в реверсивном направлении, что является следствием продолжительного увеличения внутриклеточной концентрации

9+

Na и ацидоза. Это приводит к дополнительному повышению [Са ]j в нейронах. Выявлено снижение захвата изотопа 45Са2+ зернистыми клетками мозжечка во время действия 100 мкМ глутамата в условиях блокады реверсивного транспорта Са2+ Na+/Ca2+ обменником.

2+

При изучении вклада митохондрий в регуляцию [Са ]i гомеостаза в нейронах

2+ обнаружено, что митохондрии захватывают значительное количество Са и длительно его удерживают только при действии глутамата, но не при активации потенциал-зависимых Са2+ каналов высоким К+.

В опытах с одновременной регистрации [Ca2+]j и A^Fm во время и после длительного действия глутамата было показано, что между снижением митохондриального потенциала и нарушением способности нейронов восстанавливать базальный уровень [Са'+], существует прямая зависимость. Таким образом, впервые продемонстрировано, что причиной дестабилизации [Ca2+]i гомеостаза нейронов является коллапс потенциала внутренней мембраны митохондрий, вызванный захватом значительного количества С а2'. Блокада этого захвата путем предварительной деполяризации митохондрий ингибиторами дыхания/разобщителями снижает гибель нейронов после 30-минутного действия глутамата в среднем в 1,7 раза.

Обнаружено, что сильное снижение внутриклеточного пула АТФ, ведущее к подавлению активности АТФ-зависимых систем регуляции Са , обусловлено не только нарушением аэробного синтеза АТФ и потреблением АТФ Са2+ и Na+ насосами плазмалеммы, но и гидролизом цитоплазматической АТФ FiFo-АТФазой митохондрий.

Впервые получены данные о возможности образования неселективной поры в митохондриях культивируемых нейронов в результате действия глутамата. Иммуноцитохимические исследования свидетельствуют о появлении цитохрома с в цитоплазме нейронов через 6 часов после 30-мин действия глутамата. В модельных экспериментах показана индукция циклоспорин-А и олигомицин-чувствительной поры в митохондриях культивируемых нейронов после аккумуляции Са2+ и последующего коллапса митохондриального потенциала с помощью разобщителей. Одним из важнейших условий выхода Са2+ из митохондрий в разработанной нами модели индукции неселективной поры является снижение внутриклеточной концентрации АТФ. Теоретическая и практическая значимость.

Настоящее исследование позволило получить новые данные об основных механизмах регуляции Са2+ гомеостаза нейронов мозга в покое, при физиологических и патологических воздействиях. Результаты этой работы могут найти применение в теоретической и экспериментальной физиологии, исследованиях по моделированию различных патологических состояний в мозге, связанных с нарушением ионного гомеостаза. Данные о том, что при использовании ингибиторов митохондриального захвата Са2+ гибель нейронов при действии глутамата уменьшается, несмотря на значительное снижение внутриклеточной концентрации АТФ, а также о том, что в результате действия глутамата возможна индукция неселективной поры в митохондриях нейронов, могут быть использованы для разработки новых подходов к терапии мозговых инсультов. Используемые клеточные модели глутаматной нейротоксичности могут найти применение в фармакологии для создания и проведения первичного скрининга новых нейропротекторов.

Апробация работы

Основные результаты работы были представлены на XVII и XVIII съездах физиологического общества им. Павлова (Ростов-на-Дону, 1998, Казань, 2001); на XII Международном Биофизическом конгрессе (1996), ежегодных конгрессах по нейронаукам (США, 1996-2001), 3-м Международном симпозиуме по гипоксии (ФРГ, 1994), заседаниях Английского физиологического общества (Ливерпуль, 1998, Глазго, 1999); 2-ой Всероссийской конференции «Гипоксия. Механизмы, адаптация, коррекция» (Москва, 1999); съезде Украинского физиологического общества (Одесса, 2000); I и II Российском конгрессах по патофизиологии (Москва, 1996, 2000); совещании «Зондовая микроскопия-2000» (Нижний Новгород, 2000); VIII Всероссийской конференции «Физиология нейротрансмиттеров» (Москва, 2000); симпозиуме Скандинавского физиологического общества "Насосы, каналы и их физиологичесое значение" (Дания, 2001), Европейском форуме по нейронаукам (Париж, 2002). Результаты работы неоднократно обсуждались на теоретических конференциях Научного Центра здоровья детей РАМН, на совместных заседаниях лаборатории мембранологии НЦЗД РАМН, лаборатории экспериментальной нейроцитологии НИИ мозга РАМН и лаборатории ионного транспорта НИИ общей патофизиологии и патофизиологии РАМН.

Публикации По теме диссертации опубликовано 48 научных работ в отечественной и зарубежной печати.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 212 стр., состоит из введения, описания материалов и методов исследования, 4 глав результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 357 отечественных и зарубежных источников. Содержит 1 таблицу и 87 рисунков. Каждая глава собственных исследований включает вводный обзор литературы по изучаемому вопросу.

Заключение диссертации по теме "Физиология", Сторожевых, Татьяна Павловна

выводы

2+ 2+

1. Поддержание низкой базальной внутриклеточной концентрации Са ([Са ]j) в интактных нейронах мозга осуществляется, главным образом, Са -АТФазой плазматической мембраны. Ингибирование остальных систем транспорта Са не

2+ оказывает значительного влияния на уровень [Са ]i в покоящихся нейронах.

2. Са2+-АТФаза плазмалеммы играет ведущую роль в механизмах выведения Са"+ из нейронов после кратковременного повышения [Са2+]„ вызванного калиевой деполяризацией или стимуляцией глутаматных рецепторов. Сохранение активности Са2+ насоса при одновременной блокаде остальных систем регуляции [Са2+]; не приводит к существенному нарушению динамики восстановления базальной [Са ];.

2+

3. Сильное замедление восстановления [Са ]j гомеостаза после действия глутамата при ингибировании Na+/Ca2+ обмена путем замещения внеклеточного Na+ на органические катионы (NMDG, холин, трис) обусловлено реверсией №+-зависимого транспорта глутамата и вторичной активацией глутаматных рецепторов.

4. Митохондрии модулируют динамику Са2+ сигнала при действии глутамата, захватывая Са2+ и длительно его удерживая. Блокада транспорта Са2+ в митохондрии во время кратковременного глутаматного «удара» приводит к дополнительному увеличению [Ca2+]i и замедлению в два раза скорости снижения [Ca"h]j в постглутаматный период.

5. Продолжительное действие глутамата вызывает в нейронах необратимое повышение [Ca2+]i (|Са2~],-плато). которое сохраняется и после отмены действия глутамата. [Са2+];-плато обусловлено не повышением проницаемости плазматической мембраны для Са2+, а нарушением транспорта Са2+ из клеток и секвестрации его во внутриклеточные органеллы.

6. Na+/Ca2+ обменник плазматической мембраны во время действия глутамата в концентрации более 10 мкМ функционирует преимущественно в реверсивном направлении, что является следствием увеличения внутриклеточной концентрации Na+ и ацидоза. Это приводит к дополнительному повышению [Ca2+]j в нейронах и усиливает дестабилизацию [Ca2+]j гомеостаза.

7. Стимуляция глутаматных рецепторов вызывает в зрелых нейронах Са -зависимую деполяризацию митохондриальной мембраны. Между необратимой деполяризацией митохондрий во время действия глутамата и нарушением восстановления [Ca2+]i в постглутаматный период выявлена прямая корреляция. В молодых нейронах, устойчивых к токсическому действию глутамата, коллапс митохондриального потенциала, вызванный метаболическими ингибиторами, препятствует

2+ восстановлению [Са ]j после действия глутамата.

8. Вызванное глутаматом значительное снижение внутриклеточного уровня АТФ обусловлено не только активацией ионных насосов плазмалеммы и ингибированием окислительного фосфорилирования вследствие деполяризации митохондрий, но и гидролизом реверсированнной митохондриальной FiFo-АТФазой цитоплазматического

2+ пула АТФ. Быстрый распад АТФ является основной причиной дестабилизации [Са ]j гомеостаза после действия глутамата.

9. Стойкая деполяризация митохондрий при цитотоксическом действии глутамата может быть следствием индукции неселективной поры во внутренней мембране митохондрий. На структурные повреждения в митохондриях указывает выход цитохрома с из межмембранного пространства в цитозоль после действия глутамата.

10. В митохондриях нейронов, загруженных Са2 после стимуляции глутаматом, коллапс митохондриального потенциала разобщителями вызывает образование циклоспорин А- и олигомицин-чувствительной транзиторной поры. Воздействия, препятствующие резкому снижению уровня цитоплазматической АТФ при действии глутамата и разобщителей (блокада митохондриальной АТФазы олигомицином или Na+-Hacoca плазмалеммы оубаином), препятствуют формированию поры.

11. Нарушения [Са2+]; гомеостаза, вызываемые в культурах нейронов мозга длительным воздействием глутамата, являются хорошей экспериментальной моделью для апробирования новых лекарственных препаратов, направленных на защиту нервных клеток при ишемии/аноксии мозга.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей работе мы поставили перед собой задачу исследовать вклад различных систем транспорта Са2+ в восстановление кальциевого гомеостаза нейронов мозга после стимуляции глутаматных рецепторов и, таким образом, ответить на вопрос о причинах дестабилизации Са2+ гомеостаза при цитотоксическом действии глутамата.

Для решения этой задачи были использованы первичные культуры зернистых клеток мозжечка и гиппокампа крысы. Высокий уровень морфофункциональной организации нейронов в диссоциированных культурах (формирование функциональных синаптических связей) позволяет считать этот объект адекватной моделью для изучения рецепторных механизмов нейродеструктивного действия глутамата (Хаспеков, 1995).

Воздействие глутамата вызывало в зернистых клетках мозжечка и гиппокампальных нейронах дозозависимое увеличение внутриклеточной концентрации свободного Са2+ ([Са2+];). Как показали опыты с использованием низкоаффинного Са2+-зонда Fura-2FF, во время действия глутамата [Са2+], увеличивается до 5-7 мкМ (рис.63, 65), тогда как в покоящихся нейронах базальный уровень [Ca2+]i составляет всего 50-100 нМ. По данным (Llinas et al., 1995; Rizzuto et al., 1998), локальная [Ca2+]j в микродоменах

2+ вблизи Са каналов плазматической мембраны может достигать 100 мкМ в течение нескольких миллисекунд после активации клетки. Быстрое восстановление [Са ]j гомеостаза имеет принципиальное значение для нормального функционирования нейрона и возможности проведения следующего импульса. Восстановление базального уровня [Са ]j в нейронах, как и в других возбудимых клетках, происходит за счет активации Са -АТФ

-азы и Na+/Ca2+ обменника плазматической мембраны, захвата Са2+

2+ эндоплазматическим ретикулумом и митохондриями, а также связывания Са с внутриклеточными буферными белками (Авдонин, Ткачук, 1994; Костюк, 1997; Carafoli, 1987; Berridge, 1998; Kostyuk & Verkhratsky, 1994; Blaustein & Lederer, 1999 и др.). В настоящей работе для изучения вклада внутриклеточных систем регуляции [Са2+], в этот процесс, мы применили методический подход, который заключался в оценке изменений внутриклеточного ионного гомеостаза при воздействии глутамата/NMDA или высокого К+ в условиях ингибирования различных систем транспорта Са2+, а также в изучении взаимосвязи этих изменений с выживаемостью нейронов.

Методические трудности были связаны с отсутствием специфических фармакологических блокаторов Na+/Ca2+ обмена и Са2+ насоса плазмалеммы, которые можно было бы применять в исследовании на клеточных культурах, не повреждая клетки (Carafoli, 1991; Blaustein, 1999). Поэтому был проведен тщательный анализ возможных побочных эффектов тех экспериментальных приемов, которые обычно применяются для ингибирования этих систем транспорта Са2+. Так, исследования показали, что наиболее адекватным способом ингибирования Na+/Ca2+ обмена плазматической мембраны является замена наружного Na+0 на Li+. По нашим данным, такое замещение, в отличие от замены Na+0 на органические катионы, не приводит к реверсивному транспорту глутамата из нервных клеток в раствор и вторичной активации глутаматных рецепторов (раздел 3-3). При анализе различных способов ингибирования Са2+-АТФазы было выявлено, что часто применяемый в этих целях метод защелачивания внеклеточной среды является не вполне адекватным, поскольку в этих условиях увеличивается Са2+ проницаемость плазматической мембраны (раздел 4-2). В части опытов мы одновременно ингибировали

9+ несколько систем, регулирующих [Са ]„ так как теоретически эффект ингибирования одной системы может быть нивелирован усилением активности остальных систем. В этом состоит преимущество настоящей работы по сравнению с ранее опубликованными исследованиями (Benham et al., 1992; Kiedrowski et al., 1994; Goldman et al., 1994; Mills, 1996; Mironov, 1995; Fierro et al., 1998; Nett & Deitmer, 1998). Следует подчеркнуть, что результаты наших исследований позволили охарактеризовать состояние систем регуляции

Ca ]j не только при цитотокеичееком действии Glu, но оценить их вклад в поддержание базального уровня [Са2+]; и в его восстановление после кратковременных Glu «ударов», не вызывающих гибели нейронов (моделирующих физиологическое воздействие глутамата).

Согласно классическим представлениям (Blaustein, 1988; DiPolo R., Beauge L, 1988; Miller, 1991), в покое и при небольших отклонениях Са2+ от уровня покоя [Ca2+]j гомеостаз поддерживается Са2+-АТФазой плазматической мембраны, тогда как при

2+ 9+ значительном увеличении Са в клетке (более 1 мкМ) основную роль в снижении [Са ]j Са2+ играет Na+/Ca2+ обменник. Это заключение было основано на различиях в сродстве этих структур к Са2+: Са2+ насос обладает более высоким сродством к Са2+ (около 0,2 мкМ), чем Na+/Ca2+ обменник (~ 1 мкМ), но меньшей скоростью транспорта Са2+ (Carafoli, 1987; DiPolo & Beaugle, 1988).

Исследования показали, что базальный уровень [Ca2+]i в интактных нейронах, действительно, регулируется, главным образом, Са2+-АТФазой плазматической мембраны. Одновременная блокада Na+/Ca2+ обмена и захвата Са2+ митохондриями и ретикулумом не влияла на уровень [Са2+], в интактных нейронах (глава 4, рис.27). Отсюда следует, что Са2+-АТФаза способна полностью компенсировать ингибирование как Na+/Ca2+ обмена, так и захвата Са2+ внутриклеточными органеллами, и поддерживать низкий базальный уровень [Ca2+]j. Этот вывод был подтвержден в опытах, в которых заменяли Са2+0 в среде инкубации на Ва2+, который входит в клетки по тем же каналам, что и Са , но очень плохо переносится Са2+-АТФазой (Graf et al., 1982). Такая замена вызвала медленно

2+ нарастающее увеличение содержания Ва в зернистых клетках мозжечка (рис.46, 47). Таким образом, данные, полученные при сочетанном ингибировании нескольких Са -регулирующих механизмов, согласуются с представлением о том, что в покоящихся нейронах ведущую роль в поддержании Са2+ гомеостаза играет Са2+ насос плазмалеммы. Однако результаты настоящей работы ставят под сомнение представление о том, что основная роль в выведении Са2+ после стимуляции нейронов глутаматом или высоким К+ принадлежит Na+/Ca2+ обменнику. Согласно полученным данным, возвращение [Са2+]; к базальному уровню после стимуляции нейронов глутаматом, NMDA или высоким К+ происходит в основном благодаря двум механизмам - захвату Са2+ митохондриями и активации Са2+-АТФазы плазмалеммы, причем последняя играет ведущую роль в этом

2+ процессе при кратковременном воздействии агонистов. При устранении захвата Са митохондриями (коллапс ДЧ'П1 разобщителями) восстановление [Са2+], после действия глутамата замедлилось в 2-2,5 раза (рис.28). Ингибирование Са2+-АТФазы внеклеточным защелачиванием (раздел 4-2) или инактивация ее в опытах с заменителем Са2+, ионами Ва2+ (раздел 4-3) вызывали более значительное замедление или полную задержку восстановления флуоресцентного сигнала после калиевой деполяризации мембраны или 1-мин действия глутамата (рис.48-50). Ведущая роль Са2+-АТФазы в этом процессе, по-видимому, обусловлена тем обстоятельством, что действие глутамата или калиевая деполяризация нейрональной мембраны приводят к быстрому нарушению функционирования другой системы выведения Са2+ - Na+/Ca2+ обменника.

При исследовании роли Na+/Ca2+ обмена плазматической мембраны в механизмах восстановления [Ca2+]j гомеостаза нейронов установлено, что ингибирование прямой компоненты обмена слабо влияет на скорость снижения [Ca2+]j в постглутаматный период (раздел 3-3, 3-4, рис.25, 28). Незначительность вклада обменника в восстановление [Са ]j после действия глутамата, очевидно обусловлена длительно сохраняющейся в клетке высокой концентрацией ионов Na+ (рис.32) и Н+ (рис.21) в постглутаматный период. Известно, что снижение трансмембранного градиента [Na+]0/[Na+], и внутриклеточный ацидоз ингибируют выведение Са2+ обменником (Blaustein & Lederer, 1999). Однако и после действия К+ нам не удалось выявить влияния прямой моды обменника на восстановление [Ca2+]j в зернистых клетках мозжечка (рис.26).

Возникает вопрос о том, какова физиологическая роль обменника в нейронах? Разумеется, мы отдаем себе отчет, что вклад обменника в регуляцию [Са2+]; мы оценивали за период времени, намного превышающий время проведения импульса (миллисекунды). Возможно, при таких краткосрочных процессах, как импульсное действие трансмиттера, Na7Ca2+ обмен может участвовать в выведении [Ca2+]j. Однако в исследовании (Suzuki et al., 2002) отмечается, что блокада прямой моды обменника заменой Na+0 на Li+ не повлияла на динамику [Са ], сигналов в окончаниях моторных нервов лягушки, вызванных 1-2 секундным электрическим раздражением (быстрое сканирование с помощью конфокального микроскопа). Нам представляется, что обменник в нейронах может играть определенную роль в механизмах потенциации синаптической передачи, функционируя в реверсивной моде после активации глутаматных рецепторов. Продлевание периода повышенного [Ca2+]j может увеличивать выделение медиаторов в синаптических терминалях.

Что касается эндоплазматического ретикулума, нам не удалось выявить сколько-нибудь значительного влияния захвата Са2+ ретикулумом на восстановление [Ca2+]j гомеостаза в зернистых клетках мозжечка после действия глутамата или калиевой деполяризации (разлел 4-4).

Итак, выведение Са из нейронов после действия глутамата или высокого К происходит за счет сохранения активности плазмалеммальной Са2+-АТФазы„ несмотря на

2+ 2+ низкую скорость транспорта Са этой системой и высокую аффинность к

CaZT. В пользу нашего представления можно привести данные, полученные на гладкомышечных клетках о том, что Са2+ насос продолжает выводить Са2+ и при увеличении [Са2+], до 0.8 мкМ (Furukawa et al., 1989). При этом деполяризация мембраны не угнетала активность Са2+-АТФазы, а увеличивала в 1.5-2 раза.

Целью следующего этапа исследований было изучение механизмов дестабилизации Са2+ гомеостаза при длительном, цитотоксическом действии глутамата (моделирование состояния ишемии/гипоксии мозга). Прежде всего, было обнаружено, что 15-30 минутная стимуляция глутаматных рецепторов вызывает необратимое повышение [Ca2+]j ([Ca2+]i -плато) в нейронах в постглутаматный период, что согласуется с данными других авторов (Ходоров и др., 1992; Ogura et al., 1988;; Erausquin et al., 1990; Randall & Thayer, 1992; Tymianski et al., 1993b и др.). Ранее причиной образования [Са2+];-плато считали увеличение Са2+ проницаемости плазматической мембраны (Manev et al., 1989; Erausquin et al., 1990). Полученные нами данные (глава 3, рис.8-10) привели к заключению, что дестабилизация [Са2+] j гомеостаза в постглутаматный период - это следствие повреждения систем регуляции [Са ], в нейронах. Каковы же механизмы нарушения транспорта Са в нейронах мозга при цитотоксическом действии глутамата?

Было обнаружено, что при длительном действии глутамата Na+/Ca2+ обменник функционирует преимущественно в реверсивной моде, что существенно увеличивает вход Са2+ в клетки и усиливает дестабилизацию [Са2+]| гомеостаза (раздел 3-5, рис.34). Такое состояние обменника обусловлено значительным увеличением [Na+], (рис.32) и сильным внутриклеточным ацидозом (рис.21) во время и после длительной стимуляции глутаматных рецепторов. Аналогичные данные о реверсии обменника в условиях аноксии/гипоксии и об усилении вследствие этого повреждения нейронов приведены в работах (Stys et al., 1992; Breder et al., 2000). Таким образом, можно говорить не о защитной, а о патогенетической роли Na+/Ca2+ обмена в условиях ишемии/гипоксии мозга.

К числу факторов, подавляющих активность

Са2+-АТФазы во время и/или после цитотоксического действия глутамата, можно отнести внутриклеточный ацидоз, снижение активности протеинкиназы С (Durkin et al., 1997), усиление синтеза свободнорадикальных соединений, к которым Са2+-АТФаза высоко чувствительна (Архипенко и др., 1983;

Bolanos et al., 1997; Kourie, 1998) и др. Другим важнейшим фактором регуляции активности Са2+ насоса является внутриклеточный уровень АТФ (Carafoli, 1991). Многочисленные работы указывают на то, что выживаемость нервных клеток при действии глутамата в культуре или in vivo при ишемии/гипоксии мозга зависит от уровня АТФ. Добавление к культивируемым нейронам веществ, увеличивающих содержание высокоэнергетических фосфатов в клетке (пирувата, фруктозы) в определенной мере защищает клетки от гибели, вызванной агонистами глутаматных рецепторов (Siesjo, 1992; Tsuji et al., 1994; Eimerl & Schramm, 1995; Castilho et al., 1998; Lee et al., 2001; но см. Marcaida et al., 1995). Изучение роли митохондрий в механизме глутаматной нейротоксичности и факторов, вызывающих повреждение митохондрий, позволило выяснить природу связи между дисфункцией митохондрий и дестабилизацией [Са2+]; гомеостаза (глава 5).

В последние годы появились исследования, указывающих на важную роль митохондрий в быстром освобождении цитоплазмы нейронов от избыточного Са2+ (White & Reynolds, 1995; Wang & Thayer, 1996). В нашей работе были получены сходные данные. При кратковременном, не токсическом, действии глутамата захват Са2+ митохондриями уменьшал «кальциевую нагрузку» цитоплазмы приблизительно в три раза. Очевидно, физиологический смысл этого процесса заключается в ограничении [Ca2+]j сигнала локальным участком клетки, поскольку митохондрии расположены близко к плазматической мембране или эндоплазматическому ретикулуму (Rizzuto et al., 1998). В пресинаптических нейронах, возможно, быстрый захват Са2+ митохондриями ограничивает экзоцитоз нейротрансмиттеров.

Однако захват большого количества Са2+ во время длительного действия глутамата, как показали эксперименты с регистрацией А^пъ приводит к деполяризации митохондриальной мембраны (раздел 5-1, рис.57). Были выявлены популяции нейронов мозжечка с различной чувствительностью к внутриклеточным изменениям, вызванным стимуляцией глутаматных рецепторов. В более старых 9-12 дневных нейронах возникала сильная двух- или однофазная деполяризация, и после отмены глутамата восстановления АЧ^т не происходило, или оно было лишь частичным. В среде, не содержащей Са2+ (+100 мкМ ЭГТА), снижение AlFm в ответ на аппликацию глутамата было незначительным. Следовательно, сильное увеличение [Ca2+]j в цитоплазме, оказывая множественные эффекты на внутриклеточные процессы, в том числе увеличивая Са2+ в митохондриях, является ведущим фактором развития коллапса АТт во время токсического действия глутамата.

Важнейшим следствием коллапса ДТт митохондрий, как было продемонстрировано в опытах с одновременной регистрацией АТШ и [Ca2+]j, является нарушение способности

•л I нейронов восстанавливать базальный уровень [Са ]j в постглутаматный период. На это указывала прямая корреляционная зависимость между деполяризацией митохондрий во время действия глутамата и формированием стойкого [Са2+];-плато после действия глутамата (раздел 5-4, рис.68). Было обнаружено также, что индуцированный при помощи метаболических ингибиторов или разобщителей коллапс AT,,, препятствует восстановлению [Ca2+]j в молодых нейронах, устойчивых к токсическому действию глутамата и восстанавливающих [Ca2+]j в отсутствии этих ингибиторов (рис.70, 71).

Таким образом, способность нейронов восстанавливать [Ca2+]j гомеостаз сразу после действия глутамата зависит от потенциала митохондрий, т.е. от состояния митохондриальной биоэнергетики. Снижение ДТщ, как известно, подавляет два процесса: синтез АТФ и электрофоретический захват Са . На изолированных митохондриях было установлено (Nicholls & Bernson, 1977), что синтез АТФ прекращается при снижении ДЧ^ всего лишь на 10% от уровня в покое. Теоретически, и снижение синтеза АТФ, и прекращение захвата Са2+ митохондриями могут привести к стойкому увеличению [Са21|,.

Однако оказалось, что падение уровня АТФ в клетках имеет принципиальное значение не только для нарушения регуляции [Са2+]ь но и для развития необратимой, стойкой деполяризации митохондриальной мембраны. Применение ингибитора FiFo-синтазы митохондрий олигомицина позволило выяснить, что уменьшение АТФ в нейронах при деполяризации митохондрий происходит не только за счет прекращения аэробного синтеза АТФ, но и за счет реверсии FiFo-АТФ-азы митохондрий и гидролиза ею цитоплазматической АТФ. Подавление олигомицином гидролиза АТФ реверсированной FiFo-АТФ-азой уменьшало снижение [АТФ]/[АДФ] в нейронах при одновременном действии глутамата и разобщителей (рис.74). В большинстве таких нейронов, несмотря на деполяризацию митохондрий разобщителем, наблюдалось восстановление [Ca2+]i после отмены глутамата (рис.73А). Сходные данные в этих опытах были получены при ингибировании Ма+/К+-АТФазы оубаином (рис.75). Расходуя энергии больше, чем остальные АТФ-гидролизуюгцие внутриклеточные системы (Ames, 2000), Na+- насос активируется в первые минуты действия глутамата (Marcaida et al., 1996) и усиливает энергетический дисбаланс в клетке, таким образом, подавляя активность Са2+ насоса плазмалеммы. При сочетанном действии митохондриальных ингибиторов, глутамата и оубаина в клетках не происходило значительного снижения [АТФ]/[АДФ] и [Ca2+]j после отмены глутамата снижалась почти до базального уровня.

Итак, дисфункция митохондрий является ключевым звеном в механизме нарушения кальциевого гомеостаза нейронов при токсическом действии глутамата.

Хотелось бы обратить внимание на следующее. Сам по себе высокий уровень цитоплазматической концентрации Са2+, при сохранении митохондриальной функции, не вызывает быстрой (по крайней мере, в течение суток) гибели нейронов. Только если митохондрии захватывают много Са2+, и в них развивается необратимая, стойкая деполяризация, нейроны быстро погибают. Так, предварительная деполяризация митохондрий разобщителем, которая устраняла захват ими Са2+ во время действия глутамата, оказала протективное действие - гибель нейронов через сутки после действия глутамата снижалась почти в полтора раза (рис.76), несмотря на то, что во время действия глутамата разобщитель увеличивал [Са ], сигнал в цитозоле.

В наших исследованиях были получены дополнительные факты в пользу гипотезы (Ankarcrona et al., 1995) о том, что цитотоксическое действие глутамата может вызывать индукцию неселективной поры в митохондриях и их деструкцию. Было обнаружено появление митохондриального белка цитохрома с (маркера повреждения митохондрий) в цитозоле спустя 6 часов после 30-мин действия 100 мкМ глутамата (раздел 5-6, рис.77).

Впервые в настоящей работе в митохондриях in situ, в нейронах, а не в изолированных митохондриях, показана возможность индукции неселективной поры (НП). НП - это комплекс, объединяющий несколько компонентов, образование которого приводит к внезапному увеличению проводимости внутренней митохондриальной мембраны и коллапсу A*Fm (Crompton et al., 1987; Skulachev, 1996; Bernardi, 1999 и др.). В наших опытах после аккумуляции Са2+ митохондриями, вызванной глутаматом, разобщение окислительного фосфорилирования вызывало выход Са2+ из митохондрий, чувствительный к иммунодепрессанту циклоспорину А и олигомицину, известным ингибиторам НП (Crompton, 1999; Matsuyama & Reed, 2000). Изучение факторов, ведущих к индукции НП в нашей модели, показало, что помимо захвата Са2+ митохондриями и их деполяризации, важнейшим условием формирования такого канала в митохондриях является значительный распад АТФ в клетке (рис.81, 84, 85) и усиление NO-синтазной активности (рис.86).

Предложенная модель индукции НП может оказаться полезной для тестирования содержания Са2+ в митохондриях и выхода Са2+ из митохондрий под влиянием различных агентов. Так, в наших исследованиях было обнаружено, что Са2+, захваченный митохондриями во время 5-минутного действия глутамата, впоследствии покидает митохондрии в течение продолжительного времени (десятки минут), что можно определить как своеобразную «кальциевую память» клетки. Медленное выведение Са2+ из митохондрий и умеренно повышенное его содержание в цитозоле может влиять на различные внутриклеточные процессы, в том числе активацию Са2+-зависимых ферментов, процессы генной экспрессии, синаптическую передачу и др.

2+

Итак, значительный вклад митохондрий в динамику [Са ]j сигнала во время активации нейронов позволяет рассматривать митохондрии не только как источник высокоэнергетических фосфатов, но как важнейшую систему регуляции [Са ]i и ключевое звено в патогенезе глутаматной нейротоксичности. Способность митохондрий захватывать и связывать

Са2+ ведет к снижению накопления свободного Са в цитоплазме, однако в условиях патологии (цитотоксическое действие глутамата) этот же процесс приводит к значительной деполяризации митохондрий. Обнаруженная в настоящем исследовании прямая зависимость восстановления базальной [Ca2+]j после глутаматного воздействия от потенциала митохондриальной мембраны подтверждает важную роль дисфункции митохондрий в дестабилизации Са2+ гомеостаза. Энергетический дефицит не только ослабляет выведение

Са из нейронов Са насосом и Na+/Ca2+ обменником, но по принципу положительной обратной связи способствует индукции неселективной поры в митохондриях и последующему необратимому коллапсу A4V Выход при образовании поры цитохрома с из митохондрий в цитозоль запускает каскад внутриклеточных реакций, включающих активацию протеолитических ферментов, что в итоге завершается быстрой или отсроченной гибелью нейронов по пути некроза или апоптоза. В схематическом виде роль изученных факторов в нарушении [Ca2+]j гомеостаза и гибели нейронов при цитотоксическом действии Glu представлена на рис.87.

СТИМУЛЯЦИЯ ГЛУТАМАТНЫХ РЕЦЕПТОРОВ

Физиологическая норма

Патология транзиторное повышение [Са /,- и [Na /,

2+

Повышение Са в митохондриях I

Транзиторные деполяризация митохондрий и снижение АТФ/АДФ в нейроне

Активация окислительного фосфорилирования и гликолиза

Реполяризация митохондрий и увеличение А ТФ/АДФ i активация систем выведения Са2+ и Na из клетки 1

Восстановление базального уровня [Ca2+]i

Сильное и/или длительное повышение [Са // и [Na /

1 2+

Реверсия Na /Са обмена

Са2+ перегрузка митохондрий деполяризация митоходрий генерация ROS

Снижение АТФ/АДФ <—

Образование неселективной поры в митохондриях \

НЕОБРАТИМАЯ ДИСФУНКЦИЯ МИТОХОНДРИЙ I

Реверсия F/Fo А ТФазы Падение АТФ/АДФ Генерация ROS

Необратимое повреждение систем выведения Са2+ и Na+ из клетки I

Некроз, апоптоз

Рис.87.Схема дестабилизации [Ca~+]j гомеостаза в нейронах при цитотоксическом действии глутамата (справа). ROS - свободнорадикальные соединения.

Слева - внутриклеточные изменения при кратковременном (нетоксическом) действии глутамата.

Схема обобщает результаты собственных исследований и данные литературы.

В последнее время, с выявлением важной роли дисфункции митохондрий в нейротоксичности глутамата, возникло новое направление в поиске фармакологических препаратов (Болдырев, 2000; Яковлева и соавт., 2001; Tatton & Olanow, 1999) для предотвращения последствий перенесенных инсультов или предупреждения развития нейродегенеративных заболеваний. Перспективы в этом направлении могут быть связаны с разработкой и применением препаратов, улучшающих функции митохондрий и препятствующих их деструкции. Эти препараты, с одной стороны, должны способствовать сохранению митохондриями функциональной активности при ишемии/гипоксии мозга, с другой стороны, в отдаленный период нейтрализовать активацию апоптоз-индуцирующих факторов, вызванных формированием поры в митохондриях. Полученные в последнее время данные о том, что при ишемии и нейродегенеративных заболеваниях гибель нейронов может быть отсроченной и идти по пути апоптоза, а не только некроза, постепенно изменяют стратегию лечения этих заболеваний (Choi, 1996; Tatton & Olanow, 1999). Очевидно, что терапия в этом случае будет направлена на ингибирование тех звеньев каскада внутриклеточных реакций, которые являются ведущими в гибели нейронов в доступный для лечения промежуток времени. Помимо препаратов, подавляющих активность Glu рецепторов и снижающих

2+

Са ]i, представляется перспективным использование ингибиторов развития апоптоза, т.е. блокаторов синтеза белков de novo. Дальнейшие исследования с использованием современных методов регистрации изменений ионного гомеостаза в нейронах и использование специальных биохимических маркеров гибели нейронов позволят вплотную подойти к решению проблем нейротоксичности и защиты нейронов при ишемии/гипоксии и других заболеваниях центральной нервной системы.

Список литературы диссертационного исследования доктор биологических наук Сторожевых, Татьяна Павловна, 2002 год

1. Авдонин П.В., Ткачук В.А. Рецепторы и внутриклеточный кальций. // М. Наука. 1994. 288 С.

2. Архипенко Ю.В., Каган В.Е., Козлов Ю.П. Модификация ферментной системы2+транспорта Са в саркоплазматическом ретикулуме при перекисном окислении липидов. Молекулярные механизмы изменения активности Са2+-АТФазы. // Биохимия. 1983. Т.48. №3. С.433-441.

3. Балезина О.П. Роль внутриклеточных кальциевых каналов нервных терминалей в регулиции секреции медиатора. // Успехи физиологических наук. 2002. Т. 33. Вып.З. С.38-56.

4. Баранова О.В., Скарга Д.Д., Негода А.Е., Миронова Г.Д. Ингибирование адениновыми нуклеотидами динитрофенол-индуцированного транспорта калия в митохондриях. // Биохимия. 2000. Т.65. № 2. С.262-267.

5. Башкатова В.Г., Раевский К.С. Оксид азота в механизмах повреждения мозга, обусловленных нейротоксическим действием глутамата. // Биохимия. 1998. Т.63. С.866-873.

6. Беспалов А.Ю., Эвертау Э.Э. Антагонисты ионотропных глутаматных рецепторов как объект исследования в психофармакологии. // Успехи физиол. наук. 1999. Т.30. № 1. С.39-53.

7. Блуменау Л.В. Мозг человека. Анатомо-физиологическое введение в клинику нервных и душевных болезней. // Госиздат. Москва-Ленинград. 1925. 335 С.

8. Бойер П.Д. На пути к пониманию каталитического механизма АТР-синтетазы. // Биохимия. 2001. Т.66. Вып. 10. С.1312-1322.

9. Болдырев А.А. Проблемы и перспективы в изучении биологической роли карнозина. // Биохимия. 2000. Т.65. № 7. С.751-756.

10. П.Владимиров Ю.А., Коган Э.М. Механизмы нарушения биоэнергетических функций мембран митохондрий при тканевой гипоксии. // Кардиология. 1981. №1. С.82-85.

11. Костюк П.Г. Исследование механизмов гомеостаза ионов кальция в нервных клетках и его нарушений при мозговой патологии. // Физиол. журнал им. И.М.Сеченова. 1997. Т.83. №5-6. С.2-18.

12. Костюк П.Г., Свичар Н.В., Войтенко И.В., Шишкин В.О., Костюк Е.П. Роль митохондрий в кальциевой сигнализации в сенсорных нейронах млекопитающих. // Нейрофизиология. Киев. 1998. Т.ЗО. № 4/5. С.245-248.

13. Нейрохимия (под ред. И.П.Ашмарина и П.В.Стукалова) // Москва. 1996. 470 С.

14. Пинелис В.Г., Быкова Л.П., Богачев Ф.П., Исаев Н.К. Викторов И.В., Ходоров Б.И. Токсическое воздействие глутамата на культивируемые зернистые клетки мозжечка снижает внутриклеточное содержание АТФ. Роль ионов Са2+. // БЭБМ. 1997. Т. 123. С. 162-164.

15. Прихожан А.В. Нейроанатомия и нейрохимия возбуждающей аминокислотной передачи. // Итоги науки и техники. ВИНИТИ. Сер.:Физиол.чел. и жив./Под ред.К.С.Раевского. М. 1989. Т.36. С.6-31.

16. Программированная клеточная гибель. // Под ред. проф. В.С.Новикова. Спб. Наука. 1996. 276 С.

17. Раевский К.С. Возбуждающие аминокислоты, патология ЦНС и пути ее фармакологической коррекции. // Итоги науки и техники. ВИНИТИ.Сер.:Физиол.чел. и жив. Под ред.К.С.Раевского. М. 1989. Т.36. С.148-176.

18. Раевский К.С., Башкатова В.Г., Ванин А.Ф. Роль оксида азота при глутаматергической патологии мозга. // Вестник РАМН. 2000. Т.4. С. 11-15.

19. Реутов В.П., Сорокина Е.Г., Охотин В.Е., Косицын Н.С. Циклические превращения оксида азота в организме млекопитающих. // М. Наука. 1997. 156 С.

20. Сканирующая зондовая микроскопия биополимеров. // М.: Научный Мир. Под ред. проф. И.В.Яминского. Вып.1. 87 С.

21. Скулачев В.П. Энергетика биологических мембран. // М. Наука. 1989. 564 С.

22. Сорокина Е., Реутов В., Пинелис В., Винская Н., Вергун О., Ходоров Б. Механизм потенцирующего действия альбумина при токсическом воздействии глутамата: возможная роль окиси азота. // Биол. мембраны. 1999. Т. 16. С.318-324.

23. Ткачук В.А. Мембранные рецепторы и внутриклеточный кальций// Биол. мембраны. 1999. Т.16. № 2. С.212-229.

24. Филонов А.С., Яминский И.В. Полный программный пакет управления и обработки данных для сканирующей зондовой микроскопии «ФемтоСкан-001». //М.: Центр перспективных технологий. 1999. ЮС.

25. Хаспеков Л.Г. Механизмы и факторы нейродеструктивного действия возбуждающих аминокислот на нейроны головного мозга in vitro. // Автореф.докт.дисс. Москва. 1995.75 С.

26. Хватова Е.М., Сидоркина А.Н., Миронова Г.В. Нуклеотиды мозга (метаболизм и оценка при кислородном голодании). // М. Медицина. 1987. 208 С.

27. Ходоров Б.И. Пинелис В.Г., Головина В.А., Фаюк Д.А., Уварова Т.М., Андреева Н.А., Хаспеков Л.Г., Викторов И.В. О природе «кальциевой перегрузки» нейрона после токсического воздействия глутамата. // Биол. мембраны. 1992. Т.9. № 10. С.1045-1049.

28. Черныш, И.К., Слинченко Т.М. Влияние эозина Y на Са -зависимую активность Са2+

29. Mg -АТФазы в мембране гладкомышечных клеток. // Укр. бохимический журнал. 1999. Т.71. № 6. С.86-89.

30. Черняк Б.В. Индукция неселективной митохондриальной поры в лимфоидных клетках.2. Интактные тимоциты крысы. // Биохимия. 1999. Т.64. С. 1097-1104.

31. Яковлева Е.В., Кузенков B.C., Федоров В.Н., Скворцова В.И., Кошелев В.Б., Гусев Е.И., Ашмарин И.П. Изучение эффективности семакса при глобальной церебральной ишемии in vivo. //БЭБМ. 2001. Т.127. № 8. С.172-174.2+

32. Akita Т., Kuba К. Functional triads consisting of ryanodine receptors, Ca channels and Ca activated К channels in bullfrog sympathetic neurons. // J. Gen. Physiol. 2000. V.l 16. P.697-620.

33. Alano C.C., Beutner G., Gross R.A., Sheu S-S. Regulation of NMDA mediated induction of the permeability transition. // Abstracts for Soc.for Neuroscience. 28th Ann. Meeting. 1998. V.24. P. 1453 (abstr.570.16).

34. Alford S., Frenguelli B.G., Schofield J.G., Collingridge G.L. Characterization of Ca signals induced in hippocampal CA1 neurones by the synaptic activation of NMDA receptots. // J. Physiol. 1993. V.469. P.693-716.

35. Almeida A., Allen K., Bates Т., Clark J.B. Effect of reperfusion following cerebral ischaemia on the activity of the mitochondrial respiratory chain in the gerbil brain. // J. Neurochem. 1995. V.65. P.1698-1703.

36. Ames A. CNS energy metabolism as related to function. // Brain Res. Rev. 2000. V.34. P.42-68.

37. Andine P., Orwar O., Jacobson I., Sandberg M., Hagberg H. Changes in extracellular amino acids and spontaneous neuronal activity during ischemia and extended reflow in the CA1 of the rat hippocampus. // J. Neurochem. 1991. V.57. P.222-229.

38. Andrews S.B., Leapman R.D., Landis D.M., Reese T.S. Activity dependent accumulation of calcium in Purkinje cell dendritic spines. // PNAS. 1988. V.85. P.1682-1685.

39. Ankarcrona M., Dypbuct J.M., Bonfoco E., Zhivotovsky В., Orrenius S., Lipton S.A., Nicotera P. Glutamate-induced neuronal death: a succession of necrosis and apoptosis depending on mitochondrial function. // Neuron. 1995. V.15. P.961-973.

40. Arato-Oshima Т., Matsui H., Wakizaka A., Homareda H. Mechanism responsible for oligomycin-induced occlusion of Na+ within Na+/K+-ATPase. // J. Biol. Chem. 1996. V.271. P.25604-25610.

41. Arden S.R., Sinor J.D., Potthoff W.K., Aizenman E. Subunit-specific interactions of cyanide with the N-methyl-D-aspartate receptor. // J. Biol. Chem. 1998. V.273. P.21505-21511.

42. Arizza J.L., Fairman W.A., Wadiche J.I., Murdoch G.H., Kavanaugh M.P., Amara S.G. Functional comparison of three glutamate transporter subtypes cloned from human motor cortex. // J. Neurosci. 1994. V. 14. P.5559-5569.

43. Aronson P.S. Kinetic properties of the plasma membrane Na+/H+ exchanger. // Ann. Rev. Physiol. 1985.V.47. P.545-560.

44. Ascher P., Nowak L. The role of divalent cations in the N-methyl-D-aspartate responses of mouse cerebral neurones in culture. // J. Physiol. 1988. V.399. P.247-266.

45. Asztely F. & Gustafsson B. Ionotropic glutamate receptors: their role in the expression of hippocampal synaptic plasticity. // Mol. Neurobiol. 1996. V.12. P. 1-12.

46. Atwell D., Mobbs P. Neurotransmitter transporters. // Current Opin.Neurobiol. 1994. V. 4. P.353-359.

47. Balanos J.P., Almeida A., Stewart V., Peuchen S., Land J.M., Clark J.B., Heales S.J.R. Nitric oxide-mediated mitochondrial damage in the brain: mechanisms and implications for neurodegenerative diseases. // J. Neurochem. 1997. V.68. P.2227-2240.

48. Bassani R.A., Bassani J.W., Bers D.M. Relaxation in ferret ventricular myocytes: role of the sarcolemmal Ca ATPase. // Pflugers Arch.-Eur.J.Physiol. 1995. V.430. P.573-578.

49. Bean B.P. Pharmacology and electrophysiology of ATP-activated ion channels. // Trends Pharmacol. Sci.1992. V.13. P.87-90.

50. Benham C.D., Evans M.L., McBain C.J. Ca2+ efflux mechanisms following depolarization evoked calcium transients in cultured rat sensory neurones. // J. Physiol. 1992. V.455. P.567-583.

51. Benveniste H., Jorgensen M.B., Sandberg M., Hagberg H., Diemer N.H. Ischemic damage in hippocampal CA1 is dependent on glutamate-release and intact innervation from С A3. // J. Cereb. Blood Flow Metab. 1989. V.9. P.629-639.

52. Berridge M.J. Neuronal calcium signalling. //Neuron. 1998. V.21. P. 13-26.

53. Bernardi P. Mitochondrial transport of cations: channels, exchangers, and permeability transition. // Physiol. Rev. 1999. V.79. P.l 127-1155.

54. Billups В., Atwell D. Modulation of non-vesicular glutamate release by pH. // Nature. 1996. V.379. P.171-174.

55. Blaustein M.P. Calcium transport and buffering in neurons. // TiNS. 1988.V.11. No.10. P.438-441.

56. Blaustein M.P. Effects of internal cations and ATP on sodium-calcium exchange in squid axons. // Biophys. J. 1977. V.20. P.79-111.

57. Blaustein M.P. Physiological effect of endogenous ouabain: control of intracellular Ca2+ stores and cell responsiveness. // Am. J. Physiol. 1993. V.264. P.C1367-1387.

58. Blaustein M.P., Lederer W.J. Sodium/calcium exchange: its physiological implications. // Physiol. Rev. 1999. V.79. No.3. P.763-854.

59. Bolanos J.P., Almeida A., Stewart V., Peuchen S., Land J.M., Clark J.B., Heales S.J.R. Nitric oxide-mediated mitochondrial damage in the brain: mechanisms and implications for neurodegenerative diseases. // J. Neurochem. 1997. V.68. P.2227-2240.

60. Boldyrev A.A., Carpenter D.O., Huentelman M.J., Peters C.M., Johnson P. Sources of reactive oxygen species production in excitotoxin- stimulated cerebellar granule cells. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999. V.256. P.320-324.

61. Bouron A. Activation of a capacitative Ca2+entry pathway by store depletion in cultured hippocampal neurones. // FEBS Lett. 2000. V.470. P.269-272.

62. Bouvier M., Szatkowski М., Amato A., Atwell D. The glial cell glutamate uptake carrier countertransports pH-changing anions. //Nature (Lond). 1992. V.360. P.471-474.

63. Bowery N.G., Wong E.H., Hudson A.L. Quantitative autoradiography of 3H.-MK-801 binding sites in mammalian brain. // Brit. J. Pharmocol. 1988. V.93. P.944-954.

64. Bragadin M., Pozzan Т., Azzone G.P. Kinetics of Ca2+ carrier in rat liver mitochondria. // Biochemistry. 1979. V.18. P.5972-5978.

65. Brorson J.R., Sulit R.A., Zhang H. Nitric oxide disrupts Ca2+ homeostasis in hippocampal neurons. // J. Neurochem. 1997. V.68. P.95-105.

66. Brustovetsky N., Dubinsky J.M. Limitations of cyclosporin A inhibition of the permeability transition in CNS mitochondria. // J. Neurosci. 2000. V.20. P.8229-8237.

67. Budd S.L., Nicholls D.G. A reevaluation of the role of mitochondria in neuronal Ca homeostasis. // J. Neurochem. 1996a. V.66. P.403-411.

68. Budd S.L., Nicholls D.G. Mitochondria, calcium regulation and acute glutamate excitotoxicity in cultured cerebellar granule cells. // J. Neurochem. 1996b. У.61. P.2282-2291.

69. Burnashev N., Zhou Z., Neher E., Sakmann B. Fractional calcium currents through recombinant GluR channels of the NMDA, AMPA, and kainate receptor types. // J.Physiol. (Lond). 1995. V.485. P.403-418.

70. Carafoli E. Intracellular calcium homeostasis. //Annu.Rev.Biochem. 1987. V.56. P.395-433.

71. Carafoli E. The calcium pumping ATPase of the plasma membrane. // Annu. Rev. Physiol. 1991. V.53. P.531-547.

72. Carriedo S.G., Yin H.Z., Sensi S.L., Weiss J.H. Rapid Ca2+ entry through Ca2+-permeable AMPA/kainate channels triggers marked intracellular Ca rises and consequent oxygen radical production. // J. Neurosci. 1998. V.18. P.7727-7738.

73. Castilho R.F., Hansson O., Ward M.W., Budd S.L., Nicholls D.G. Mitochondrial control of acute glutamate excitotoxicity in cultured cerebellar granule cells. // J. Neurosci. 1998. V.18. No.24. P.10277-10286.

74. Chavis P., Mollard P., Bockaert J., Manzoni O. Vizualization of cyclic AMP-regulated presynaptic activity at cerebellar granule cells. //Neuron. 1998. V.20. P.773-781.

75. ChenN.S., Moshaver A., Raymond L.A. Differential sensitivity of recombinant N-methyl-D-aspartate receptor subtypes to zinc inhibition. // Mol. Pharmacol. 1997. V.51. P.1015-1023.

76. Chesler M., Chan C.Y. Stimulus-induced extracellular pH transients in the in-vitro turtle cerebellum. //Neuroscience. 1988. V.27. P.941-948.

77. Choi D.W. Ionic dependence of glutamate neurotoxicity. // J. Neurosci. 1987. V.7. P.369-379.

78. Choi D.W. Excitotoxic cell death. // J. Neurobiol. 1992. V.23. P.1261-1276.

79. Choi D.W. Ischemia-induced neuronal apoptosis. // Curr. Opin. Neurobiol. 1996. V.6. P.667-672.

80. Cidon S., Sihra T.S. Characterization of a H+-ATPase in rat brain synaptic vesicles. // J. Biol. Chem. 1989. V.264. P.8281-8288.

81. Clapham D.E. Calcium signalling. // Cell. 1995. V.80. P.259-268.

82. Clodfelter G., Porter N.M., Landfield P.W., Thibault O. Sustained Ca2+-induced Ca2+-release underlies the post-glutamate lethal Ca2+ plateau in older cultured hipocampal neurons. // Eur. J. Pharmacol. 2002. V.447. P. 189-200.

83. Condrescu M., Chernaya G., Kalaria V., Reeves J.P. Barium influx mediated by the cardiac sodium-calcium exchanger in transfected Chinese hamster ovary cells. // J. Gen. Physiol. 1997. V.109. P.41-51.

84. Condrescu M., Hantash B.M., Fang Yu., Reeves J.P. Mode-specific inhibition of sodium-calcium exchange during protein phosphatase blockade. // J. Biol. Chem. 1999. V.274. No.47. P.33279-22286.

85. Contestabile A. Roles of NMDA receptor activity and nitric oxide production in brain development. // Brain Res. Rev. 2000. V.32. P.476-509.

86. Coulter D.A., Sombati S., De Lorenzo R. Electrophysiology of glutamate neurotoxicity in vitro: induction of a calcium-dependent extended neuronal depolarization. // J. Neurophysiol. 1992. V.68. P. 362-373.

87. Cox D.A., Matlib М.А. Modulation of intramitochondrial free Ca2+ concentration by antagonists of Na+/Ca2+exchange. // Trends in Pharmacol. Sci. 1993. V. 14. P. 408-413.

88. Crompton M. The mitochondrial permeability transition pore and its role in cell death. // Biochem. J. 1999. V.341. P.233-249.

89. Crompton M. Mitochondrial intermembrane junctional complexes and their role in cell death. //J. Physiol. 2000. V.529. P.ll-21.

90. Crompton M., Capano M., Carafoli E. The sodium-induced efflux of calcium from heart mitochondria. A possible mechanism for the regulation of mitochondrial calcium. // Eur. J. Biochem. 1976. V.69. P. 453-462.

91. Crompton M., Costi A., Hayat L. Evidence for the presence of a reversible Ca dependent pore activared by oxidative stress in heart mitochondria. // Biochem. J. 1987. V.245. P.195-198.

92. Crompton M., Ellinger H., Costi A. Inhibition by cyclosporin A of a Ca2+-dependent pore in heart mitochondria activated by inorganic phosphate and oxidative stress. // Biochem. J. 1988. V.255. P.357-360.

93. Curtis D.R., Watkins J.C. The excitation and depression of spinal neurons by structurally related amino acids. // J. Neurochem. 1960. V.6. P. 117-141.

94. Danysz W., Parsons C. Glycine and N-methyl-D-aspartate receptors: physiological significance and possible therapeutic applications. // Pharmacol. Rev. 1998. V.50. No.4. P.597-664.

95. David G. Mitochondrial clearance of cytosolic Ca in stimulated lizard motor nerve terminals proceeds without progressive elevation of mitochondrial matrix1. СаП- // J.

96. Neurosci. 1999. V.19.N17. 7495-7506.

97. Dawson T.M., Steiner J.P., Dawson V.L., Dinerman J.L., Uhl G.R., Snyder S.H. Immunosuppressant FK506 enhances phosphorylation of nitric oxide synthase and protects against glutamate neurotoxicity. // PNAS. USA. 1993. V.90. P.9808-9812.

98. De Lisa F., Gambassi G., Spurgeon H., Hansford R.G. Intramitochondrial free calcium in cardiac myocytes in relation to dehydrogenase activation. // Cardiovasc. Res. 1993. V.27. P. 1840-1844.

99. DeLorenzo R.J. Calmodulin in neurotransmitter release and synaptic function. // Fed. Proc. 1982. V.41. No.7. P.2265-2272.

100. Dessi F., Charriaut-Marlangue C., Khrestchatisky M., Ben-Ari. Glutamate-induced neuronal death is not a programmed cell death in cerebellar culture. // J. Neurochem. 1993. V.60. P.1953-1955.

101. Diemer N.H., Siemkowicz E. Regional neurons damage after cerebral ischemia in the normo- and hypoglycemic rat. //Neuropathol. Appl. Neurobiol. 1981. V.7. P.217-227.

102. Dingledine R., Borges K., Bowie D., Traynelis S.F. The glutamate receptors ion channels. //Pharmacol.Rev. 1999. V.51. No.l. P.7-61.

103. DiPolo R., Beauge L. Ca2+ transport in nerve fibers. // Biochim. Biophys. Acta. 1988. V.947. P.549-569.

104. DiPolo R., Beauge L. Regulation of Na-Ca exchange. // Ann.N-Y.Acad.Sci. Proc.of the 2-nd Int.Conf. "Sodium-calcium exchange". 1991. V.639. P.100-112.

105. Doi A., Kakazu Y., Akaike N. Na+/Ca2+ exchanger in GABAergic presynaptic boutons of rat central neurons. // J. Neurophysiol. 2002. V.87. P.1694-1702.

106. Dolphin A.C. Voltage-dependence calcium channels and their modulation by neurotransmitters and G proteins. // Exp. Physiol. 1995. V.80. P. 1-36.

107. Duchen M.R. Ca2+-dependent changes in the mitochondrial energetics in single dissociated mouse sensory neurons. // Biochem. J. 1992. V.283. P.41-50.

108. Duchen M.R., Valdeolmillos M., O'Neill S.C., Eisner D.A. Effects of metabolic blocade on the regulation of intracellular calcium in dissociated mouse sensory neurones. // J. Physiol. 1990. V.424. P.411-426.

109. Duchen M.R., On the involvement of a cyclosporin A sensitive mitochondrial pore in myocardial reperfusion injury. // Cardiovasc. Res. 1993. V.27. P.1790-1794.

110. Dunican D.J., Doherty P. The generation of localized calcium rises mediated by cell adhesion molecules and their role in neuronal growth cone motolity. // Mol. Cell. Biol. Res.Commun. 2000. V.3. No.5. P.255-263.

111. Eimerl S., Schramm M. The quantity of calcium that appears to induce neuronal death. // J. Neurochem. 1994. V.62. P.1223-1226.2+ •

112. Eimerl S., Schramm M. Resuscitation of brain neurons in the presence of Ca after toxic NMDA activity. // J. Neurochem. 1995. V.65. P.739-743.

113. Emaus R.K., Gmnwald R., Lemaster J.J. Rhodamine 123 as a probe of transmembrane potential in isolated rat-liver mitochondria: spectral and metabolic properties. // Biochim.et Biophys. Acta. 1986. P.436-448.

114. Erausquin G., Manev H., Guidotti A., Costa E., Brooker G. Gangliosides normalize distorted single-cell intracellular free Ca2+ dynamics after toxic doses of glutamate in cerebellar granule cells. // PNAS. USA. 1990. V.8. P.8017-8021.

115. Erecinska M, Silver I. Metabolism and role of glutamate in mammalian brain. // Prog. Neurobiol. 1990. V.35. P.245-296.

116. Fagg G.E., Foster A.C. Amino acid neurotransmitters and their pathways in the mammalian central nervous system. //Neuroscience. 1983. V.9. P.701-719.

117. Fagni L., Olivier M., Lafon-Cazal M., Bockaert J. Involvement of divalent ions in the nitric oxide-induced blockade of N-methyl-D-aspartate receptors in cerebellar granule cells. // Mol. Pharmacol. 1995. V.47. P.1239-1247.

118. Fairman W.A., Vanderberg R.J., Arriza J.L., Kavanaugh M.P., Amara S.G. An excitatory amino acid transporter with properties of a ligand-gated chloride channel. // Nature (Lond). 1995. V.375. P.599-603.

119. Fierro L., DiPolo R., Llano I. Intracellular calcium clearance in Purkinje cell somata from rat cerebelar slices. // J. Physiol. 1998. V.510. No.2. P.499-512.

120. Fonnum F. Glutamate: a neurotransmitter in the mammalian brain. // J. Neurochem. 1984. V.42. P.l-11.

121. Franklin S.O., Elliott K., Zhu Y.S., WahlestedtC., Inturrisi C.E. Quantitation of NMDA receptor (NMDAR1) messenger RNA levels in the adult and developing rat CNS. //Mol. Brain Res. 1993. V.19. P.93-100.

122. Friel D.D., Tsien R.W. An FCCP-sensitive Ca2+ store in bullfrog sympathetic neurons and its participation in stimulus-evoked changes in Ca2+.j. // J. Neurosci. 1994. V.14. P.4007-4024.

123. Fujioka Y., Hiroe K., Matsuoka S. Regulation kinetics of Na+-Ca2+ exchange current in guinea-pig ventricular myocytes. // J. Physiol. 2000. Vol.529. No.3. P.611-623.

124. Furuichi Т., Kohda K., Miyawaki A., Mikoshiba K. Intracellular channels. // Current Opinion in Neurobiol. 1994. V.4. P.294-303.

125. Furukawa K.I., Tawada-Iwata Y., Shigekawa M. Modulation of plasma membrane Ca2+ pump by membrane potential in cultured vascular smooth muscle cells. // J. Biochem. 1989. V.106. P.1068-1073.

126. Gahwiler B.H., Capogna M., Debanne D., McKinney R.A., Thompson S.M. Organotipic slice cultures: a technique has come of age. // Trends in Neurosci. 1997. V.20. P.471-477.

127. Garthwaite G., Garthwaite J. Neurotoxicity of excitatory amino acid receptor agonists in young rat hippocampal slices. // J. Neurosci. Methods. 1989. V.29. P.33-42.

128. Gatto C., Milanick M.A. Inhibition of the red blood cell calcium pump by eosin and other fluorescein analogues. // Am. J. Physiol. 1993. V.264. P.C1577-C1586.

129. Gill R., Foster A.C., Woodruff G.M. MK-801 is neuroprotective in gerbils when administered during the post-ischemic period. // Neuroscience. 1988. V.25. P.847-855.

130. Gilmore R.S., Bullbock C.G., Sanderson G., Wallace W.F. Ultrastructural evidence in rabbit ear arteries that barium enters smooth muscle cells through calcium channels. // J. Exp. Physiol. 1986. V.71. P.417-422.

131. Globus M.Y.T., Busto R., Dietrich D., Martinez E., Valdes I., Ginsberg M.D. Effect of ischemia on the in vivo release of striatal dopamine, glutamate and GABA studied by intracerebral microdialysis. // J. Neurochem. 1988. V.51. P. 1455-1464.

132. Goldman W.F., Yarowsky P.J., Juhaszova M., Krueger B.K., Blaunstein M.P. Sodium-calcium exchange in rat cortical astrocytes. // J. Neurosci. 1994. V.14. P.5834-5843.

133. Golovina V.A., Blaustein M.P. Unloading and refilling of two classes of spatially resolved endoplasmic reticulum Ca2+ stores in astrocytes. // Glia. 2000. V.31. P. 15-28.

134. Graf E., Verma A.K., Gorski J.P., Lopaschuk G., Niggli V., Zurini M., Carafoli E. Molecular properties of the calcium pumping ATPase from human erythrocytes. // Biochemistry. 1982. V.21. P.4511-4516.

135. Green D.R., Reed J.C. Mitochondria and apoptosis. // Science. 1998. V.281. P.1309-1312.

136. Griffiths E.J., Wei S-K., Haigney M.C.P., Ocampo C.J., Stern M.D., Silverman H.S. Inhibition of mitochondrial calcium efflux by clonazepam in intact single rat cardiomyocytes and effects on NADH production. // Cell Calcium. 1997. V.21. N4. 321-329.

137. Grudt, T.J., Usowicz, M.M., Henderson, G. Ca2+ entry following store depletion in SH-SY5Y neuroblastoma cells. // Brain Res.Mol. Brain Res. 1996. V 36. N 1. P. 93-100.

138. Grynkiewicz G., Poenie M., Tsien R.Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. // J. Biol. Chem. 1985. V.260. P.3440-3450.

139. Guerini D., Garcia-Martin E., Gerber A., Volbracht C., Leist M., Merino C., Carafoli E. The expression of plasma-membrane Ca2+ pump isoforms in cerebellar granule neurons is modulated by Ca2+. // J. Biol. Chem. 1999. V.274. P. 1667-1676.

140. Gundersen V., Danbolt N.C., Ottersen O.P., Storm-Mathisen J. Demonstration of glutamate/aspartate activity in nerve endings by use of antibodes recognized exogenous D-aspartate. // Neuroscience. 1993. V.57. P.97-111.

141. Gunasekar P.G., Kanthasamy A.G., Borowitz J.L., Isom G.E. NMDA receptor activation produces concurrent generation of nitric oxide and reactive oxygen species: implication for cell death. // J. Neurochem. 1995. V.65. P.2016-2021.

142. Gunter Т.Е., Gunter K.K., Sheu S.-S., Gavin C.E. Mitochondrial calcium transport: physiological and pathological relevance. // Am. J. Physiol. 1994. V.36. P.C313-C339.

143. Gwag B.J., Lobner D., Koh J.Y., Wie M.B., Choi D.W. Blocade of glutamate receptors unmasks neuronal apoptosis after oxygen-glucose deprivation in vitro. // Neuroscience. 1995. V.68. P.615-619.1. Л i

144. Hajnoszky G., Csordas G., Madesh M., Pacher P. The machinery of local Ca signalling between sarco-endoplasmic reticulum and mitochondria. // J. Physiol. 2000. V.529. P.69-81.

145. Hallam T.J., Rink T.J. Agonists stimulate divalent cation channels in the plasma membrane of human platelets. // FEBS Lett. 1985. V.186. P.175-179.

146. Hansen A.J. Effect of anoxia on ion distribution in the brain. // Physiol. Rev. 1985. V. 65. P.101-148.

147. Hansson E., Ronnback L. Primary cultures of astroglia and neurons from different brain regions. // Shahar A., DeVellis (eds): Dissection and tissue culture. A manual of the nervous system. New York, Alan R. Liss Inc. 1989. P.92-104.

148. Harootunian A.T., Kao J.P.Y., Eckert B.K., Tsien R.Y. Fluorescence ratio imaging of cytosolic free Na+ in individual fibroblasts and lymphocytes. // J. Biol. Chem. 1989. V.264. P. 19458-19467.

149. Hartley D.M., Kurth M.C., Bjerkness L., Weiss J.H., Choi D.W. Glutamate receptor-induced 45Ca2+ accumulation in cortical cell culture correlates with subsequent neuronal degeneration. // J. Neurosci. 1993. V. 13. P. 1993-2000.

150. Hillman A., Chen D.E., Bing S.A., Penniston R.A., Llinas J.T. Ultrastrucural localization of the plasmalemmal calcium pump in cerebellar neurons. // Neuroscience. 1996. V.72. No.2. P.315-324.

151. Hirai H., Launey Т. The regulatory connection between the activity of granule cell NMDA receptors and dendritic differentiation of cerebellar Purkinje Cells. // J. Neuroscience. 2000. V.20. No.14. P.5217-5224.

152. Hoffman J., Proverbio F., Geibel J. Preferential use by the red cell Na+ and Ca2+ pumps of ATP compartmentalized within the membrane cytoskeletal complex. // Mat. XXXIII Int. Congress of Physiol. Sci. 1997. Abstr. L01604.

153. Holgado A., Beauge L. Effects of external monovalent cations of Na-Ca exchange in cultured rat glial cells. // Ann. N-Y.Acad.Sci. Proc.of the 3-nd Int.Conf. "Sodium-calcium exchange". 1996. V.779. P.279-281.

154. Holmann M., Heinemann S. Cloned glutamate receptors. // Annu. Rev. Neurosci. 1994. V. 17. P.31-108.

155. Hori N., French-Mullen J.M.H., Carpenter D.O. Kainic acid responses and toxicity show pronounced Ca2+dependence. // Brain Res. 1985. V.358. P.380-384.

156. Hoth M., Fanger C.M., Lewis R.S. Mitochondrial regulation of store-operated calcium signalling in T lymphocytes. // J. Cell Biol. 1997. V.137. P.633-648.

157. Howe J.R., Cull-Candy S.G., Colquhoun D. Currents through single glutamate receptor channels in outside-out patches from rat cerebellar granule cells. // J. Physiol. Lond. 1991. V.432. P.143-202.

158. Hoyt K.R., Stout A.K., Cardman J.M., Reynolds I.J. The role of intracellular Na+ and mitochondria in buffering of kainate-induced intracellular free Ca2+ changes in rat forebrain neurones. // J. Physiol. 1998. V.509. P. 103-116.

159. Hyrc K., Handran S.D., Rothman S.M., Goldberg M.P. Ionized intracellular calcium concentration predicts excitotoxic neuronal death: observations with low-affinity fluorescent calcium indicators. // J. Neurosci. 1997. V.17. P.6669-6677.

160. Isaev N.K., Zorov D.B., Stelmashook E.V., Uzbekov R.E., Kozhemyakin M.B., Victorov2+

161. V. Neurotoxic glutamate treatment of cultured cerebellar granule cells induces Ca dependent collapse of mitochondrial membrane potential and ultrastructural alterations of mitochondria. // FEBS Lett. 1996. V.392. P.143-147.

162. Isaev N.K., Stelmashook E.V., Alexandrova O.P., Andreeva N.A., Polyakova I.A., Victorov I.V., and Zorov D.B. The lack of extracellular Na+ exacerbates Ca2+-dependent damage of cultured cerebellar granule cells. // FEBS Lett. 1998. V. 434. P. 188-192.

163. Ishas F., Jouville L.S., Mazat J-P. Mitochondria are excitable organelles capable of generating and conveying electrical and calcium signal. // Cell. 1997. V.89. P.l 145-1153.

164. Irving A.J., Collingridge G.L., Schofield J.G. Interactions between Ca2+ mobilizing mechanisms in cultured rat cerebellar granule cells. // J. Physiol. 1992. V.456. P.667-680.

165. Iwamoto Т., Watano Т., Shigekawa M. A novel isothiourea derivative selectively inhibits the reverse mode of Na+/Ca2+ exchange in cells expressing NCX1. // J. Biol. Chem. 1996. V.271.P.22391-22307.

166. Jonansen F.F., Jorgensen M.B., Diemer N.H. Ischemic CA1 pyramidal cell loss is prevented by preischemic colchicine destruction of dentate gyrus granule cells. // Brain Res. 1986. V.377. P.344-347.

167. Jones D. ATP concentration gradients in cytosol of liver cells during hypoxia. // Am. J. Physiol. 1985. V.249. P.385-392.

168. Jones M.V., Westbrook G.L. The impact of receptor desensitization on fast synaptic transmission. // Trends Neurosci. 1996. V.19. P.96-101.

169. Jung D.W., Baysal W.K., Brierly G.P. The sodium-calcium antiport of heart mitochindria is not electroneutral. // J. Biol. Chem. 1995. V.270. P.672-678.

170. Junge W. ATP synthase and other motor proteins. // PNAS. 1999. V.96. P.4735-4737.

171. Jurkowitz M.S., Geisbuhler T.A., Jung D.W., Brierley G.P. Rutenium red-sensitive and -insensitive release of Ca2+ from uncoupled heart mitochondria. // Arch. Biochem. Biophys. 1983. V.223. P.120-128.

172. Kaas I.S., Lipton P. Mechanisms involved in irreversible anoxic damage to the in vitro rat hyppocampal slice. // J. Physiol. 1982. V.332. P.459-472.

173. Kanai Y., Hediger M.A. Primary structure and functional characterization of a high-affinity glutamate transporter. //Nature (Lond). 1992. V.380. P.467-471.

174. Kapus A., Szaszi K., Kaldi K., Ligeti E., Fonyo A. Is the mitochondrial Ca uniporter a voltage-modulated transport pathway? // FEBS Lett. 1991. V. 282. P.61-64.

175. Kauppinen R.A., Nicholls D.G. Failure to maintain glycolysis in anoxic nerve terminals. //J. Neurochem. 1986. V.47. P.1864-1869.

176. Kerr J.F.R., Wyllie A.H., Currie A.R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. // Br. J. Cancer. 1972. V.26. P.239-257.

177. Kiedrowski L. N-methyl-D-aspartate excitotoxicity: relationships among plasma membrane potential, Na+/Ca2+ exchange, mitochondrial Ca2+overload, and cytoplasmic concentrations of Ca2+, H+, and K+. // Mol. Pharmacol. 1999. V.56. P.619-632.

178. Kiedrowski L., Brooker G., Costa E. Glutamate impairs neuronal calcium extrusion while reducing sodium gradient. //Neuron. 1994. V.12. P.295-300.

179. Kiedrowski L., Costa E. Glutamate-induced destabilization of intracellular calcium concentration homeostasis in cultured cerebellar granule cells: role of mitochondria in calcium buffering. // Mol. Pharmacol. 1995. V.47. P. 140-147.

180. Kleckner N.W., Dingledine R. Requirement for glycine in activation of NMDA receptors expressed in Xenopus oocytes. // Science. 1988. V.214. P.835-837.

181. Klockner U. A, Isenberg G.T. Calcium channel current of vascular smooth muscle cells: extracellular protons modulate gating and single channel conductance. // J. Gen. Physiol. 1994. V 103.N 4. P 665-678.

182. Kristal B.S., Dubinsky J.M. Mitochondrial permeability transition in the central nervous system: induction by calcium cycling-dependent and independent pathways. // J. Neurochem. 1997. V.69. P.524-538.

183. Koch R.A., Barish M.E. Perturbation of intracellular calcium and hydrogen ion regulation in cultured mouse hippocampal neurons by reduction of the sodium ion concentration gradient. // J. Neurosci. 1994. V.14. No.5. P.2585-2593.

184. Korn S.J., Horn R. A Na+.0-independent, pH0-dependent mechanism for reduction of intracellular [Ca2+] after influx through Ca2+channels in mouse pituitary cells. // J. Gen. Physiol. 1991. V.98. P.893-907.

185. Kostyuk P.G. Calcium Ions in Nerve Cell Function. // Oxford University Press, Oxford. 1992. P.1-220.

186. Kostyuk P.G., Verkhratsky A. Calcium stores in neurons and glia. // Neuroscience. 1994. V.63. P.381-404.

187. Kourie J.I. Interaction of reactive oxygen species with ion transport mechanisms. // Am. J. Physiol. 1998. V.275. P.C1-C24.

188. Kowaltowski A.J., Castilho R.F. Ca2+ acting at the external side of the inner mitochondrial membrane can stimulate mitochondrial permeability transition induced by phenylarsine oxide. // Biochim. Biophys. Acta. 1997. V.1322. P.3221-3229.

189. Krasinskaya I.P., Kudryashova I.A., Yaguzhinsky L.S. On the mechanism of oligomycin inhibition of Ca2+-induced mitochondrial respiration. // FEBS Letters. 1991. V.290. P.52-54.

190. Kristall B.S., Dubinsky J.M. Mitochondrial permeability in the central nervous system: induction by calcium cycling-dependent and -independent pathways. // J. Neurochem. 1997. V.69. P.524-538.

191. Kunz J., Hall M.N. Cyclosporin A, FK506 and rapamycin: more than just immunosuppression. // Trends Biochem. Sci. 1993. V.18. P.334-338.

192. Kurth M.C., Weiss J.H., Choi D.W. Relationship between glutamate-induced 45Ca influx and resultant neuronal injury in cultured cortical neurons. // Neurology. 1989. V.39. Suppl. P.217 (Abstract).

193. Lardy H., Reed P., Lin Ch-H. Antibiotic inhibitors of mitochondrial ATP synthesis. // Federation Proc. 1975. V.34. No.8. P.1707-1710.

194. Lee J-Y., Kim Y-H., Koh J-Y. Protection by pyruvate against transient forebrain ischemia in rats. //J. Neurosci. 2001. V.21. RC171. P.l-6.

195. Lee S-H., Kim M-H., Park K.H., Earm Y.E., Ho W-K. K+-dependent Na+/Ca2+ exchange is a major Ca2+ clearance mechanism in axon terminals of rat neurohypophysis. // J. Neuroscience. 2002. V.22. No.16. P.6891-6899.

196. Leyssens A., Nowicky A.V., Patterson L., Crompton M., Duchen M.R. The relationship between mitochondrial state, ATP hydrolysis, Mg2+.j and [Ca2+]i studied in isolated rat cardiomyocytes. // J. Physiol. 1996. V.496. Pt.l. P.lll-128.2+

197. Li L., Guerini D., Carafoli E. Calcineurin Controls the Transcription of Na Ca Exchanger Isoforms in Developing Cerebellar Neurons. // J. Biol. Chem. 2000. V. 275/ No. 27. P.20903-20910.

198. Limbrick D.D., Churn S.B., Sombati S., DeLorenzo R.J. Inability to restore resting intracellular calcium levels as an early indicator of delayed neuronal cell death. // Brain Res. 1995. V.690. P.145-156.

199. Lipton S., Choi Y.B., Pan Z.H., Lei S.Z., Chen H.V., Sucher N.J. A redox-based mechanism for the neuroprotective and neurodestructive effects of nitric oxide and related nitroso-compounds. //Nature. 1993. V.364. P.626-632.

200. Llinas R., Sugimori M., Hillman D.E., Cherksey B. Distribution and functional significance of the P-type voltage-dependent Ca2+channels in the mammalian central nervous system. // Trends Neurosci. 1992. V.15. P.351-355.

201. Llinas R.R. The electrophysiological properties of mammalian neurons: insights into central nervous system function. // Science. 1988. V.242. P.1654-1664.

202. Llinas, R., Sugimori, M. and Silver, R.B. The concept of calcium concentration microdomains in synaptic transmission. //Neuropharmacology. 1995. V. 34. P.1443-1451.

203. Logan W.J., Snyder S.H. Unique high affinity uptake systems for glycine, glutamic and aspartic acids in central nervous tissue of the rat. // Nature (Lond). 1971. V.234. P.297-299.

204. Lucas D.R., Newhouse J.P. The toxic effect of soduim L-glutamate on the inner layers ofthe retina. // Arch. Ophthal. NY. 1957. V.58. P. 193-200.2+ 2+

205. Lukacs G.L., Fonyo A. Ba ions inhibit the release of Ca ions from rat livermitochondria. // Biochim. Biophys. Acta. 1985. V.809. P. 160-166.

206. Manev H., Favaron M., Guidotti A., Costa E. Delayed increase of Ca2+ influx elicited by glutamate: role in neuronal death. // Mol. Pharmacol. 1989. V.36. P. 106-112.

207. Marcaida G., Minana M-D., Grisolia S., Felipo V. Lack of correlation between glutamate-induced depletion of ATP and neuronal death in primary cultures of cerebellum. // Brain Res. 1995. V.695. P.146-150.

208. Marcaida G., Kosenko E., Minana M-D., Grisolia S., Felipo V. Glutamate induces a calcineurin-mediated dephosphorylation of Na+,K+-ATPase that results in its activation in cerebellar neurons in culture. // J. Neurochem. 1996. V.66. P.99-104.

209. Marchant J.S., Parker I. Functional interaction in Ca2+ signalling over different time and distance scales. // J. Gen. Physiol. 2000. V.l 16. P.691-695.

210. Marsault R., Murgia M., Pozzan Т., Rizzuto R. Domains of high Ca beneath the plasma membrane of living A7r5 cells. // EMBO J. 1997. V.16. N 7. P.1575-1581.

211. Martone M.E., Zhang Т., Simpliciano V.M., Carragher O.B., Ellisman M.H. Three-dimensional visualization of the smooth endoplasmic reticulum in Purkinje cell dendrites. // J. Neuroscience. 1993. V.13. P.4636-4646.

212. Masson J., Sagne S., Hamon M., Mestikawy S.E1. Neurotransmitter transporters in the central nervous system. // Pharmacol. Rev. 1999. V.51. No.3. P.439-464.

213. Matsuyama S., Reed J.C. Mitochondria-dependent apoptosis and cellular pH regulation. // Cell Death and Differentation. 2000. V.7. P. 1155-1165.

214. Mattson M.P., Guthrie P.В., Kater S.B. A role for Na+-dependent Ca2+extrusion in protection against neuronal excitotoxocity. // FASEB J. 1989. V.3. P.2519-2526.

215. Mayer M.L., Westbrook G.L. Permeation and block of N-methyl-D-aspartic acid receptor channels by divalent cations in mouse cultured central neurones. // J. Physiol. 1987. V.394. P.501-527.

216. McBean G.J., Roberts P.J. Neurotoxicity of L-glutamate and DL-three-3-hydroxyaspartate in the rat striatum. // J. Neurochem. 1985. V.44. P.247-254.

217. McCleskey E.W. Calcium channels: cellular roles and molecular mechanisms. // Current Opinion in Neurobiol. 1994. V.4. P.304-312.

218. McCormack J.G., Halestrap A.P., Denton R.M. Role of calcium ions in the regulation of mammalian intramitochondrial metabolism. // Physiol. Rev. 1990. V.70. P.391-425.

219. McCormack J.G., Osbaldeston N.J. The use of Ca2+-sensitive intramitochondrial dehydrogenases and entrapped fura-2 to study Sr2+ and Ba2+ transport across the inner membrane of mammalian mitochondria. // Eur. J. Biochem. 1990. V.192. P.239-244.

220. Meir A., Ginsburg S., Butkevich A. Ion channels in presynaptic nerve terminals and control of transmitter release. // Physiol. Rev. 1999. V.79. No.3. P.1019-1088.

221. Meldrum B. Possible therapeutic applications of antagonists of excitatory aminoacid neurotransmitters. // Clin. Sci. 1985. V.68. P.l 13-122.

222. Mellergard P., Ouyang Y.B., Siesjo B.K. The relationship between intra- and extracellular pH in primary cultures of rat astrocytes. // Am. J. Physiol. 1994. V.267. (Cell Physiol 36). P.581-589.

223. Michaels R.L., Rothman S.M. Glutamate neurotoxicity in vitro: antagonist pharmacology and intracellular calcium concentrations. // J. Neurosci. 1990. V.10. P.283-292.

224. Miller R.J. The control of neuronal Ca2+ homeostasis. // Progr. Neurobiol. 1991. V.37. P.255-285.

225. Mills L.R. The sodium-calcium exchanger and glutamate-induced calcium load in aged hippocampal neurons in vitro. // Arui.N-Y.Acad.Sci. Proc.of the 3-nd Int.Conf. "Sodium-calcium exchange". 1996. V.779. P.379-390.

226. Mironov S.L. Plasmalemmal and intracellular Ca2 "pumps as main determinants of slow Ca2+ buffering in rat hippocampal neurones. // Neuropharmacology. 1995. V.34. No.9. P.l 123-1132.

227. Mitani A., Kataoka K. Critical levels of extracellular glutamate mediating gerbil hippocampal delayed neuronal death during hypothermia: brain microdialysis study. // Neuroscience. 1991. V.42. P.661-670.

228. Miura Y., Kimura J. Sodium-calcium exchange current. Dependence on internal Ca and Na and competitive binding of external Na and Ca. // J. Gen. Physiol. 1989. V.93. P.1129-1145.

229. Monteith G.R., Blaustein M.P. Heterogeneity of mitochondrial matrix free Ca2+: resolution of Ca2+dynamics in individual mitochondria in situ. // Am. J. Physiol. 1999. V.276. P.C1193-C1204.

230. Murchison D., Griffith W.H. Mitochondria buffer non-toxic calcium load and release calcium through the mitochondrial permeability transition pore and sodium-calcium exchanger in rat basal forebrain neurons. // Brain Res. 2000. V.854. P.139-151.

231. Murphy Т.Н., Malouf A.T., Sastre A., Schnaar R.L., Coyle J.T. Calcium-dependent glutamate cytotoxicity in a neuronal cell line. // Brain Res. 1988. V.444. P. 325-332.

232. Nett W., Deitmer J.W. Intracellular Ca2+ regulation by the leech giant glial cell. // J. Physiol. 1998. V.507.No.l. P.147-163.

233. Nicholls D.G., Brand M.D. The nature of the calcium ion efflux induced in rat liver mitochondria by the oxidation of endogenous nicotonamide nucleotides. // Biochem. J. 1980. V.188. P.l 13-118.

234. Nicholls D.G., Budd S.L. Mitochondria and neuronal survival. // Physiol. Rev. 2000. V.80. N 1. P.3150360.

235. Nicholls D„ Attwell D. The release and uptake of excitory amino acids. // Trends in Physiol. Sci. 1990. V.l 1. P.462-468.

236. Niggli V., Sigel E., Carafoli E. The purified Ca2+-pump of human erythrocyte membrane catalyzes an electroneutral Ca2+/H+ exchange in reconstituted liposomal system. // J. Biol. Chem. 1982. V.257. P.2350-2356.

237. Novgorodov S.A., Gudz T.I., Milgrom Y.M., Brierly G.P. The permeability transition in heart mitochondria is regulated synergistically by ADP and cyclosporin A. // J. Biol. Chem. 1992. V.267. P.16274-16282.

238. Nowak L., Bregestovski P., Ascher P. Magnesium gates glutamate-activated channels in mouse central neurones. //Nature. 1984. V.307. P.462-465.

239. Ogura A., Ijima Т., Amano Т., Kudo Y. Optical monitoring of excitatory synaptic activity between cultured hippocampal neurons by a multi-site Ca2+ fluorometry. // Neurosci. Lett. 1987. V.78. P.69-74.

240. Ogura A., Miyamoto M., Kudo Y. Neuronal death in vitro: parallelism between survivability of hippocampal neurones and sustained elevation of cytosolic Ca2+ after exposure to glutamate receptor agonist. // Exp. Brain Res. 1988. V.73. P.447-458.

241. Olney J.W. Inciting excitoxic cytocide among central neurons. // Adv. Exp. Med. Biol. 1986. V.203. P.631-645.

242. Olney J.W., Sharpe L.G. Brain lesions in an infant rhesus monkey treated with monosodium glutamate. // Science (Wash DC). 1969. V.166. P.386-388.

243. O'Rourke B. Pathophysiological and protective roles of mitochondrial ion channels. // J. Physiol. 2000. V.529. P.23-36.

244. Ottersen O.P., Storm-Mathisen J. Neurons containing or accumulating transmitter amino acids. // Handbook of chemical neuroanatomy (Bjorklund et al. eds). Elsevier. Amsterdam. 1984. V.3.P.141-246.

245. Park C.K., Nehls D.G., Graham D.I., Teasdale G.M., McCulloch J. Focal cerebral ischemia in the cat: treatment with the glutamate antagonist MK-801 after induction of ischemia. // J. Cereb. Blood Flow Metab. 1988. V.8. P.757-762.

246. Park Y.B., Herrington J., Babcock D.F. Hill B. Ca2+ clearence mechanisms in isolated rat adrenal chromaffin cells. // J. Physiol. 1996. V.492. P.329-346.

247. Pellerin L., Magistretti P.J. Glutamate uptake stimulates Na+/K+-ATPase activity in astrocytes via activation of a distinct subinit highly sensitive to ouabain. // J. Neurochem. 1997. V.69. P.132-137.

248. Peng T.I., Greenamyre J.T. Privileged access to mitochondria of calcium influx through N-methyl-D-aspartate receptors. //Mol. Pharmacol. 1998. V.53. P.974-980.

249. Perschak H., Cuenod M. In vivo release of endogenous glutamate and aspartate in the rat striatum during stimulation of the cortex. // Neuroscience. 1990. V.35. P.283-287.

250. Philipp S., Hambrecht S., Braslavski L., Schroth G., Freichel M. A novel capacitative calcium entry channel expressed in excitable cells. // EMBO J. 2000. V.17. P.4274-4282.

251. Pinelis V.G., Segal M., Greenberger V., Khodorov B. Changes in sodium caused by a toxic glutamate treatment of cultured hippocampal neurons. // Boichem. Mol. Biology Intern. 1994. V.32. P.475-482.

252. Pivovarova N.B., Hongpaisan J., Andrews S.B., Friel D.D. Depolarization-induced mitochondrial Ca accumulation in sympathetic neurons: spatial and temporal characteristics. //J. Neurosci. 1999. V.19. No. 15. P.6372-6384.

253. Pozzan Т., Rizzuto R. The renaissance of mitochondrial calcium transport. // Eur. J. Biochem. 2000. V.267. P.5269-5273.

254. Pozzan Т., Rizzuto R., Volpe P., Meldolesi J. Molecular and cellular physiology of intracellular calcium stores. // Physiol. Rev. 1994. V.74. P.595-636.

255. Pringle A.K., Iannotti F., Wilde G.J.C., Chad J.E., Seeley P.J., Sundstrom L.E. Neuroprotection by both NMDA and non-NMDA receptor antagonists in in vitro ischemia. // Brain Res. 1997. V.755. P.36-46.

256. Putney J.W., Bird G.S. Calcium mobilization by inositol phosphates and other intracellular messengers. // Trends Endocr. Met. 1994. V.5. No.6. P.256-260.

257. Raess B.U., Record D.M. Inhibition of erythrocyte Ca2+ pump by Ca2+ antagonists. // Biochem. Pharmacol. 1990. V. 40. P. 2549-2555.

258. Randall R.D., Thayer S.A. Glutamate-induced calcium transient triggers delayed calcium overload and neurotoxicity in rat hippocampal neurons. // J. Neurosci. 1992. V.12. P.1882-1895.

259. Rasgado-Flores H., Blaustein M.P. ATP-dependent regulation of cytoplasmic free calcium in nerve terminales. // Am. J. Physiol. 1987. V.252. C588-C598.

260. Reeves J.P., Hale C.C. The stoichiometry of the cardiac sodium-calcium exchange. // J. Biol. Chem. 1984. V.259. P.7733-7739.

261. Regehr W.G., Connor J.A., Tank D.W. Optical imaging of calcium accumulation in hippocampal pyramidal cells during synaptic activation. // Nature. 1989. V.341. P.533-536.

262. Rego A.C., Ward M.W., Nicholls D.G. Mitochondria control AMPA/kainate receptor-induced cytoplasmic calcium deregulation in rat cerebellar granule cells. // J. Neuroscience. 2001. V.21.No.6. P.1893-1901.2+

263. Richards D.E., Rega A.F., Garrahan P.J. Two classes of site for ATP in the Ca -ATPase from human red cell membranes. // Biochim. Biophys. Acta. 1978. V.511. P. 194-201.

264. Rizzuto R., Pinton P., Carrington W., Fay F.S., Fogarty K.E., Pozzan T. Close contacts with the endoplasmic reticulum as determinants of mitochondrial Ca2+ responses. // Science. 1998. V.280. P.1763-1766.

265. Rose C.R., Ransom B.R. Mechanisms of H+ and Na+ changes induced by glutamate, kainate, and D-aspartate in rat hippocampal astrocytes. // J. Neurosci. 1996. V.16. N17. P.5933-5404.

266. Rosenmund C., Feltz A., Westbrook G.L. Calcium-dependent inactivation of synaptic NMDA receptors in hippocampal neurons. // Progress in Neurobiol. 1995. V.79. No.l. P.427-430.

267. Rosenmund C., Westbrook G.L. Calcium-induced actin depolymerization reduces NMDA channel activity. //Neuron. 1993. V.10. P.810-814.

268. Rothman S.M. Synaptic activity mediates death of hypoxic neurons. // Science. 1984. V.4. P.1884-1891.

269. Rothman S.M., Olney J.W. Glutamate and the pathophysiology of hypoxic-ischemic brain damage. //Ann. Neurol. 1986. V. 19. P. 105-111.

270. Rothman S.M., Olney J.W. Excitotoxicity and the NMDA receptor. // Trends in Neurosci. 1987. V.10. P.299-302.

271. Sandler V.M., Barbara J.-G. Calcium-induced calcium release contributes to action potential-evoked calcium transients in hippocampal CA1 pyramidal neurons. // J. Neuroscience. 1999. V.19. P.4325-4336.

272. Sather W.A., Yang J., Tsien R.W. Structural basis of ion permeation and selectivity. // Current Opinion in Neurobiol. 1994. V.4. P.313-323.

273. Sattler R., Charlton M.P., Hafner M., Tymianski M. Distinct influx pathways, not calcium load, determines neuronal vulnerability to calcium neurotoxicity. // J. Neurochem. 1998. V.71. P.2349-2364.

274. Schatzmann H.J. The calcium pump of the surface membrane and of the sarcoplasmic reticulum. // Annu. Rev. Physiol. 1989. V.51. P.473-485.

275. Schinder A.F., Olson E.C., Spitzer N.S., Montal M. Mitochondrial dysfunction is a primary event in glutamate neurotoxicity. //J. Neurosci. 1996. V.16. N.19. P.6125-6133.

276. Schneggenburger R., Zhou Z., Konnerth A., Neher E. Fractional contribution of calcium to the cation current through glutamate receptor channels. // Neuron. 1993. V.l 1. P.133-143.

277. Schoepp D.D., Conn P.J. Metabotropic glutamate receptors in brain function and pathology. // Trends in Physiol. Sci.1993. V.141. P.13-20.

278. Schousboe A. Transport and metabolism of glutamate and GABA in neurons and glial cells. // Int. Rev. Neurobiol. 1981. V.22. P. 1-45.

279. Schwartz E.A., Tachibana M. Electrophysiology of glutamate and sodium cotransport in a glial cell of the salamander retina. // J. Physiol. 1990. V.426. P.43-80.

280. Schwiening C.J. Kennedy H.J., Thomas R.C. Calcium-hydrogen exchange by the plasma membrane Ca-ATPase of voltage-clamped snail neurones. // Proc. Royal Soc. Lond. 1993. V.253. P.285-289.

281. Segal M., Manor D. Confocal microscopic imaging of Ca2+.j in cultured rat hippocampal neurons following exposure to NMDA. // J. Physiol. 1992. V.448. P.655-676.

282. Sengpiel В., Preis E., Krieglstein J., Prehn J.H. NMDA-induced superoxide production and neurotoxicity in cultured rat hippocampal neurons: role of mitochondria. // Eur. J. Neurosci. 1998. V.10. P. 1903-1910.

283. Shimada N., Graf R., Rosner G., Heiss W.-D. Differences in ischemia-induced accumulation of amino acids in the cat cortex. // Stroke. 1990. V.21. P. 1445-1451.

284. Siesjo B.K. Mechanisms of ischemic brain damage. // Crit. Care Med. 1988. V.16. P.954-963.

285. Siesjo B.K. Pathophysiology and treatment of focal cerebral ischemia. // J. Neurosurg. 1992. V.77. P.337-354.

286. Simon R.P., Swan J.H., Griffith Т., Meldrum B.S. Blocade of N-methyl-D-aspartate receptors may protect against ischemic damage in the brain. // Science. 1984. V.226. P.850-852.

287. Simon R.P., Shiraishi K. Pharmacologic attention of hypermetabolism in focal ischemia is correlated with decreased infarction size. // Ann. Neurol. 1990. V.27. P.606-611.

288. Simpson P.В., Challiss R.A., Nahorski S.R. Neuronal Ca2+ stores: activation and function. // Trends in Neurosci. 1995a. V.18. No.7. P.299-306.

289. Simpson P.В., Challiss R.A., Nahorski S.R. Divalent cation entry in cultured cerebellar granule cell measured using Mn2+ quench of fura 2. // Eur. J. Neurosci. 1995b. V.7. P.831-840.

290. Skulachev V.P. Why are mitochondria involved in apoptosis? Permeability transition pores and apoptosis as selective mechanisms to eliminate superoxode-producing mitochondria and cell. // FEBS Lett. 1996. V.397. P.7-10.

291. Sobolevsky A.I., Khodorov B.I. Blockade of NMDA channels in acutely isolated rat hippocampal neurons by the Na+/Ca2+ exchange inhibitor KB-R7943. // Neuropharmacology. 1999. V. 38. P.1235-1242.

292. Sobolevsky A., Koshelev S., Khodorov B. Bepridil-induced blockade of NMDA channels in rat hippocampal neurons. // Neuropharmacology. 1997. V.36. P.319-324.

293. Spielmann H., Jacob-Muller U., Schulz P. Simple assay of 0.1-10 pmol of ATP, ADP, and AMP in single somatic cells using purified luciferin luciferase. // Analytical Biochem. 1981. V.l 13. P.172-178.

294. Stanimirovic D.B., Ball R., Durkin J.P. Stimulation of glutamate uptake and Na,K-ATPase activity in rat astrocytes exposed to ischemia-like insult. // Glia. 1997. V.l9. P.l23-134.

295. Storck Т., Schulte S., Hofmann K., Stoffel W. Structure, expression and functional analysis of a Na+-dependent glutamate/aspartate transporter from the rat brain. // Proc. Natl. Acad. Sci USA. 1992. V.89. P.l0955-10959.

296. Storm-Mathisen J., Leknes A.K., Bore A.T. Glutamate and GABA: fir visualization in neurons by immuno-cytochemistry. //Nature. 1983. V.310. P.517-520.

297. Stout A.K., Raphael H.M., Kanterewicz B.I., Klann E., Reynolds I.J. Glutamate-induced neuron death requires mitochondrial calcium uptake. // Nature Neuroscience. 1998. V.l. No.5. P.366-373.

298. Stout A.K., Reynolds I.J. High-affinity calcium indicators underestimate increases in intracellular calcium concentrations associated with excitotoxic glutamate stimulations. // Neurosci. 1999. V.89. N 1. P.91-100.

299. Strijbos P.J., Leach M.J., Garthwaite J. Vicious cycle involving Na+ channels, glutamate release, and NMDA receptors mediates delayed neurogeneration through nitric oxide formation. //J. Neurosci. 1996. V.l 6. P.5004-5013.

300. Stys P.K., Waxman S.G., Ransom B.R. Ionic mechanisms of anoxic injury in mammalian CNS white matter: role of Na+ channels and Na+/Ca2+ exchanger. // J. Neurosci. 1992. V.l2. P.430-439.

301. Sutor В., Hablitz J.J. Influence of barium on rectification in rat neocortical neurons. // Neurosci. Lett. 1993. V.157. P. 62-66.

302. Suzuki S., Osanai M., Mitsumoto N., Akita Т., Narita K., Kijima H., Kuba K. Ca2+-dependent Ca2+ clearance via mitochondrial uptake and plasmalemmal extrusion in frog motor nerve terminales. // J. Neurophysiol. 2002. V.87. P.1816-1823.

303. Tabb J., Kish P., Vandyke R., Ueda T. Glutamate transport into synaptic vesicles roles of membrane potential, pH gradient and intravesicular pH. // J. Biol. Chem. 1992. V.267. P.15412-15418.

304. Takahashi M., Billups В., Rossi D., Sarantis M„ Hamman M., Atwell D. The role of glutamate transporters in glutamate homeostasis in the brain. // J. Exp. Biol. 1997. V.200. P.401-409.

305. Takahashi M., Hashimoto M. Lowering extracellular Na+ concentration causes NMDA receptor-mediated neuronal death in cultured rat hippocampal slices. // Brain Res. 1996. V.735. P.1-8.

306. Tatsumi H., Katayama Y. Regulation of the intracellular free calcium concentration in acutely dissociated neurones from rat nucleus basalis. // J. Physiol. 1993. V.464. P. 165-181.

307. Tatton W.G., Olanow C.W. Apoptosis in neurodegenerative diseases: the role of mitochondria. // Biochim. Biophys. Acta. 1999. V.1410. P.195-213.

308. Thayer S.A., Miller R.J. Regulation of the intracellular free calcium concentration in single rat dorsal root ganglion neurones in vitro. // J. Physiol. 1990. V.425. P.85-115.

309. Tong G., Jahr C.E. Block of glutamate transporters potentiates postsynaptic excitation. // Neuron. 1994. V.13. P.1195-1203.

310. Traynelis S.F., Cull-Candy S.G. Proton inhibition of N-methyl-D-aspartate receptors in cerebellar neurons. //Nature. 1990. V.345. P.347-350.

311. Trotta E.E., DeMeis L. ATP dependent calcium accumulation in brain microsomes: enhancement by phosphate and oxalate. // Biochem. Biophys. Acta. 1975. V.394. P.239-247.

312. Tsacopoulos M., Magistretti P.J. Metabolic coupling between glia and neurons. // J. Neurosci. 1996. V.16. No.3. P.877-885.

313. Tsien R.W., Lipscombe D., Madison D.V, Bley K.R., Fox A.P. Multiple types of neuronal calcium channels and their selective modulation. // TINS. 1988. V.ll. No.10. P.431-438.

314. Tsuji K., Nakamura Y., Ogata Т., Shibata Т., Kataoka K. Rapid decrease in ATP content without recovery phase during glutamate-induced cell death in cultured spinal neurons. // Brain Res. 1994. V.662. P.289-292.

315. Tsunoda Y. Receptor-operated Ca signalling and crosstalk in stimulus secretion coupling. //Biochim. Biophys. Acta. 1993. V.1154. P.105-156.

316. Tsuzuki K., Mochizuki S„ lino M., Mori H., Mishina M., Ozawa S. Ion permeation properties of the cloned mouse e2/tl NMDA channel. // Mol. Brain Res. 1994. V.26. P.37-46.

317. Tymianski M., Wallace M.C., Spigelman I., Uno M., Carlen P.L., Tator C.H., Charlton M.P. Cell-permanent Ca2+ chelators reduce early excitotoxic and ischemic neuronal injury in vitro and in vivo. // Neuron. 1993a. V.l 1. P.221-235.

318. Tymianski M., Charlton M.P., Carlen P.L. Tator C.H. Secondary Ca2+ overload indicates early neuronal injury which precedes staining with viability indicators. // Brain Res. 1993b. V.607. P.319-323.

319. Varecka L., Carafoli E. Vanadate-induced movements of Ca2+ and K+ in human red blood cells. //J. Biol. Chem. 1982. V.257. No. 13. P.7414-7421.

320. Vergun O., Keelan J., Khodorov В., Duchen M. Glutamate-induced mitochondrial depolarisation and perturbation of calcium homeostasis in cultured rat hippocampal neurones. //J. Physiol. 1999. V.512. No.2. P.451-466.

321. Verkhratsky A., Steinhauser C. Ion channels in glial cells. // Brain Res Brain Res Rev. 2000. V.32. No.2-3. P.380-412.

322. Wadiche J.L., Amara S.G., Kavanaugh M.P. Ion fluxes associated with excitatory amino acid transport. // Neuron. 1995a. V.l5. P.721-728.

323. Wadiche J.I., Arriza J.L., Amara S.G., Kavanaugh M.P. Kinetics of human glutamate transporter. //Neuron. 1995b. V.l4. P.1019-1027.

324. Wang G.J., Thayer S.A. Sequestration of glutamate-induced Ca2+loads by mitochondria in cultured rat hippocampal neurons. // J. Neurophysiology. 1996. V.76. No.3. P.1611-1621.

325. Weiss J.H., Goldberg M.P., Choi D.W. Ketamine protects cultured neocortical neurones from hypoxic injury. // Brain Res. 1986. V.380. P. 186-190.

326. White R.J., Reynolds I.J. Mitochondria accumulate Ca2+ following intense glutamate stimulation of cultured rat forebrain neurones. // J. Physiol. 1997. V.498. P.31-47.

327. White R.J., Reynolds I.J. Mitochondria and Na+/Ca2+ exchange buffer glutamate-induced calcium loads in cultured cortical neurons. // J. Neurosci. 1995. V.15. P.1318-1328.

328. Wingrove D.E., Gunter Т.Е. Kinetics of mitochondrial calcium transport. I. Charactiristics of the sodium-independent calcium efflux mechanism of liver mitochondria. // J. Biol. Chem. 1986a. V.261. P.l 5150-15165.

329. Wu M.L., Chen J.H., Chen W.H., Chen Y.J., Chu K.C. Novel role of Ca2+-ATPase in NMDA-induced intracellular acidification. // Am. J. Physiol. 1999. V.277. P.C717-C727.

330. Yamakage M., Lindeman K.S., Hirshman C.A., Croxton T.L. Intracellular pH regulates voltage-dependent Ca2+ channels in porcine tracheal smooth muscle cells. // Am. J. Physiol. 1995. V 268. N 4. Pt 1. P. 642-646.

331. Ye Z.C., Sontheimer H. Astrocytes protect neurons from neurotoxic injury by serum glutamate. // Glia. 1998. V.22. P.3237-3247.

332. Younes S., Moins N., Habert M. Bepridil: a new effector of oxidative phosphorilation. // Biochimie. 1977. V.59. P.73-78.

333. Zaidi A., Michaelis M.L. Effects of reactive oxygen species on brain synaptic plasma membrane Ca2+-ATPase. // Free Radic. Biol. Med. 1999. V.27. No.7-8. P.810-821.

334. Zamzami N., Susin S.A. Marchetti P., Hirsch Т., Gomes-Monterrey I., Castedo M., Kroemer G. Mitochondrial control of nuclear apoptosis. // J. Exp. Med. 1996. V.183. P.1533-1544.

335. Zhang S., Ehlers M.D., Bernhardt J.P. Calmodulin mediates calcium-dependent inactivation ofN-methyl-D-aspartate receptors. Neuron. 1998. V.21. P.443-453.

336. Zimmerman B. Control of InsP3-induced Ca2+ oscillations in permeabilized blowfly salivary gland cells: contribution of mitochondria. // J. Physiol. 2000. V.525. No.3. P.707-719.

337. Zivin J.A., Choi D.W. Stroke therapy. // Scientific American. July. 1991. P.56-63.

Обратите внимание, представленные выше научные тексты размещены для ознакомления и получены посредством распознавания оригинальных текстов диссертаций (OCR). В связи с чем, в них могут содержаться ошибки, связанные с несовершенством алгоритмов распознавания.
В PDF файлах диссертаций и авторефератов, которые мы доставляем, подобных ошибок нет.

Автореферат
200 руб.
Диссертация
500 руб.
Артикул: 154184