Мезенхимальные стволовые клетки в лечении идиопатического легочного фиброза тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.01.25, кандидат наук Сотникова Анна Геннадьевна

• Сотникова Анна Геннадьевна
• кандидат наук
• 2019

Оглавление диссертации кандидат наук Сотникова Анна Геннадьевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Эпидемиология, факторы риска и патогенез идиопатического легочного фиброза

1.2. Диагностика и лечение идиопатического легочного фиброза

1.3. Виды стволовых клеток и механизмы их действия

1.4. Стволовые клетки в легких

1.5. Эффекты клеточной терапии в экспериментальных моделях легочного фиброза

1.6. Клинические исследования эффектов клеточной терапии при ИЛФ

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Экспериментальное исследование

2.1.1. Оценка выживаемости мезенхимальных стволовых клеток при разных методах небулизации

2.1.2. Клеточный препарат для экспериментального этапа

2.1.3. Экспериментальная модель

2.1.4. Морфологическое и иммуногистохимическое исследование ткани легких экспериментальных животных

2.1.5. Конфокальная лазерная эндомикроскопия

2.2. Пилотное клиническое исследование

2.2.1. Характеристика пациентов

2.2.2. Критерии включения/исключения

2.2.3. План исследования

2.2.4. Оценка безопасности и эффективности

2.2.5. Клеточный препарат для клинического исследования

2.2.6. Методы диагностики

2.2.7. Статистическая обработка результатов

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Экспериментальное исследование

3.1.1. Выживаемость мезенхимальных стволовых клеток при распылении в разных типах небулайзеров

3.1.2. Эффекты МСК при ингаляционной и внутривенной доставке в легкие

3.2. Пилотное клиническое исследование безопасности и эффективности аллогенных МСК костного мозга у пациентов с идиопатическим легочным фиброзом с быстрым снижением функции легких

3.2.1. Оценка безопасности высокой кумулятивной дозы аллогенных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга

3.2.2. Оценка эффективности высокой кумулятивной дозы аллогенных МСК

у пациентов с идиопатическим легочным фиброзом

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

БАЛ - бронхоальвеолярный лаваж

ГЭР - гастроэзофагеальный рефлюкс

ГЭРБ - гастроэзофагеальная рефлюксная болезнь

ИИП - идиопатические интерстициальные пневмонии

ИЛФ - идиопатический легочный фиброз

КЛЭМ - конфокальная лазерная эндомикроскопия

КТ - компьютерная томография

КТВР - компьютерная томография высокого разрешения

ММП- матриксная металлопротеиназа

МСК - мезенхимальные стволовые клетки

ОИП - обычная интерстициальная пневмония

ОФВ1 - объем форсированного выдоха за первую секунду

ПК - прогениторные клетки

СК - стволовые клетки

ТББЛ - трансбронхиальная биопсия легкого

ФГБУ - Федеральное государственное бюджетное учреждение

ФМБА - Федеральное медико-биологическое агентство

ФЖЕЛ - форсированная жизненная емкость легких

ФНКЦ - Федеральный научно-клинический центр

ФР - факторы риска

DLCO - диффузионная способность легких по моноксиду углерода

Ш-у - интерферон гамма

ГЬ-6 - интерлейкин

SpO2 - сатурация кислорода

TGF-P1 - трансформирующий фактор роста бета-1 ТЫБ-а - фактор некроза опухоли альфа

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Мезенхимальные стволовые клетки в лечении идиопатического легочного фиброза»

Актуальность темы исследования

Идиопатический легочный фиброз (ИЛФ) - хроническое прогрессирующее заболевание неизвестной этиологии, характеризующееся развитием фиброзной трансформации легочной паренхимы, преимущественно у лиц старшего возраста с развитием прогрессирующей дыхательной недостаточности [1]. Несмотря на относительно низкую распространенность, заболеваемость ИЛФ неуклонно возрастает, в среднем на 5% в год, что во многом обусловлено общим старением населения [2]. До эры антифиброзных препаратов медиана выживаемости пациентов с ИЛФ от момента постановки диагноза составляла 2,5-3,5 года [1]. Традиционно ИЛФ рассматривается как прогрессирующее заболевание, однако встречаются формы болезни как с быстрым падением легочной функции, так и остающиеся стабильными на протяжении многих месяцев, даже без какой-либо интервенции [3-5]. Больные с быстро прогрессирующими формами болезни имеют наиболее неблагоприятный прогноз по выживаемости, вероятно, обусловленный генетическими факторами [6]. При этом эффективность противофиброзных препаратов у данной категории пациентов пока не изучена. Кроме того, антифиброзная терапия нинтеданибом и пирфенидоном, более чем в 60% случаев сопровождается побочными эффектами, которые могут стать причиной их отмены [4, 5]. В последние годы активно разрабатываются новые направления терапии ИЛФ, в том числе путем трансплантации мезенхимальных стволовых клеток (МСК), считающихся одним из наиболее перспективных [7]. МСК - субпопуляция стромальных клеток, представленных во многих органах и тканях, но максимально в костном мозге, жировой ткани, фетальном материале, пуповинной крови, амниотической жидкости и плаценте, которые чаще всего являются их источниками для последующего клинического применения [8] Потенциальные эффекты МСК при легочном фиброзе обусловлены их способностью продуцировать целый ряд биологически активных субстанций, обладающих противовоспалительными, антифиброзными, иммуносупрессивными и

ангиогенными свойствами [9]. Экспериментальные исследования по трансплантации аллогенных МСК мелким животным с моделированным легочным фиброзом, доказали их эффективность и безопасность. Тем, не менее, многие вопросы, применения клеточных препаратов остаются нерешенными. К примеру, отсутствуют публикации о сравнительных исследованиях методов доставки стволовых клеток в легкие, а такой, потенциально простой и доступный метод, применяющийся для лекарственных препаратов, как ингаляции, ранее не применялся в терапии фиброза легких даже на уровне эксперимента. Существующие способы небулизации в отношении стволовых клеток ранее также не оценивались. Результаты опубликованных клинических исследований I фазы с использованием клеточной терапии ИЛФ свидетельствуют о безопасности МСК, при минимальной эффективности, однако все они включали пациентов с легким и умеренным нарушением функции легких без учета скорости ее предшествующего падения, общая доза введенных клеток не превышала 2*108 и использовались разные пути доставки клеток в легкие - эндобронхиальный или внутривенный без сравнения их эффектов [10-13]. Таким образом, сравнительное исследование эффективности разных путей введения клеточного препарата в легкие; изучение безопасности и эффективности более высоких кумулятивных доз МСК у пациентов с ИЛФ, особенно с быстропрогрессирующим жизнеугрожающим течением, представляется весьма актуальным.

Степень разработанности темы

Несмотря на то, что лечение идиопатического легочного фиброза гетерогенными видами стволовых клеток в качестве возможной перспективы рассматривается более 10 лет, а в международной базе данных клинических исследований QinicalTrials по ключевым словам «stem cells» и «idiopathic pulmonary fibrosis» зарегистрированы 11 ведущихся работ в данном направлении, включая нашу, до настоящего времени не опубликовано результатов рандомизированных, плацебо-контролированных клинических исследований 2 фазы, а три клинических исследования первой фазы оценивали безопасность и

эффективность клеточных препаратов в кумулятивной дозе не более 200 млн. клеток на одного пациента. В Российской Федерации нам не удалось найти публикаций или патентов, касающихся данной тематики, подобных работ, ведущихся другими (кроме нашей) научными группами. Все это свидетельствует о недостаточной разработанности темы по оценке роли клеточных технологий в терапии ИЛФ.

Цель исследования

Изучить безопасность и эффективность трансплантации аллогенных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга в экспериментальной модели легочного фиброза и в рамках пилотного клинического исследования у пациентов с идиопатическим легочным фиброзом

Задачи исследования

1. Сравнить степень выживаемости МСК при распылении через компрессорный, ультразвуковой и сетчатый небулайзеры.

2. Оценить сравнительные эффекты трансплантации аллогенных МСК костного мозга в экспериментальной модели легочного фиброза при внутривенной и ингаляционной доставке клеточного материала.

3. Изучить неблагоприятные эффекты при повторных внутривенных инфузиях МСК у больных с быстропрогрессирующими формами ИЛФ.

4. Оценить влияние клеточной терапии на клинические, функциональные и рентгенологические параметры у пациентов ИЛФ в течение 12 месячного наблюдения.

Научная новизна

- Впервые доказана безопасность высоких кумулятивных доз аллогенных МСК у пациентов с ИЛФ

- Показана эффективность высоких кумулятивных доз аллогенных МСК при сравнении с плацебо у пациентов с быстро прогрессирующим ИЛФ

- Модифицирована модель экспериментального легочного фиброза у кроликов технологией прицельного эндобронхиального введения раствора блеомицина через ультратонкий бронхоскоп в рассчитанных дозировках;

- Изучена выживаемость МСК при разных методах небулизации, доказано преимущество компрессорного небулайзера над ультразвуковым и сетчатым для сохранения жизнеспособности клеток.

- Проведено сравнительное исследование эффективности МСК в экспериментальной модели легочного фиброза у кроликов при разных путях доставки препарата, доказана эквивалентность эффектов внутривенной инфузии и ингаляций МСК через компрессорный небулайзер в сопоставимых дозах.

Теоретическая и практическая значимость

Результаты проведенного экспериментального исследования и установленные в ходе него новые научные факты позволяют рассматривать ингаляционный путь доставки клеточного препарата в дыхательные пути как возможный и сопоставимый по эффектам с внутривенным введением клеток. Пилотное клиническое исследование закладывает фундамент для дальнейшего изучения высокодозной терапии аллогенными МСК, ранее не использовавшейся у человека, не только при ИЛФ, но и других хронических болезнях, при которых применение традиционных доз МСК было недостаточно эффективным. Результаты работы могут быть положены в основу разработки нового метода лечения быстро прогрессирующих форм ИЛФ путем внутривенной трансплантации аллогенных МСК костного мозга.

Методология, материалы и методы исследования

Предметом исследования диссертации явилась разработка метода лечения идиопатического легочного фиброза с использованием аллогенных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга в эксперименте и клиническом исследовании. Объектами исследования явились 20 экспериментальных животных

(кроликов) и 20 пациентов с быстро прогрессирующей формой ИЛФ. В ходе экспериментального этапа исследования была изучена выживаемость МСК при распылении через разные типы небулайзеров, наиболее оптимальный из которых был использован для доставки клеточного материала в дыхательные пути животных. В ходе эксперимента была модифицирована модель блеомицинового фиброза путем прицельного введения блеомицина через ультратонкий фибробронхоскоп лишь в одну долю легкого. Сравнительная оценка эффективности терапии МСК при внутривенной и ингаляционной доставке в эксперименте проведена с использованием методов морфометрии ткани легких, иммуногистохимического исследования, анализа бронхоальвеолярного лаважа и конфокальной лазерной эндомикроскопии нижних дыхательных путей. В ходе второго этапа - открытого рандомизированного плацебо-контролированного исследования у пациентов с ИЛФ для оценки безопасности и эффективности внутривенной трансплантации МСК были использованы методы функциональной и ультразвуковой диагностики, компьютерной томографии высокого разрешения.

Метод однофакторного дисперсионного анализа (АЫОУА) использовался для оценки достоверности различий оцениваемых показателей между исследуемыми группами в эксперименте, критерий Манна - Уитни применялся для оценки эффективности в клиническом исследовании, критерий Фишера - для оценки безопасности в клиническом исследовании1.

Основные положения, выносимые на защиту

1. При доставке в дыхательные пути стволовых клеток с достижением максимальной степени их выживаемости наиболее эффективным является компрессорный (струйный) небулайзер.

2. Внутривенное и ингаляционное введение МСК (в дозе, корректированной по расчетной респирабельной фракции) в лечении блеомицин-индуцированного легочного фиброза у кроликов, обладают сходными антифиброзными эффектами.

1 Статистическая обработка результатов производилась при помощи пакета прикладных программ «Statistica for Windows StatSoft Inc. Версия 7.0»

3. Аллогенные МСК костного мозга при повторных внутривенных трансплантациях в разовых дозах 2 х 108 и в суммарной кумулятивной дозе 1,6 х 109 клеток, вызывают больше нетяжелых побочных эффектов и замедление скорости падения функции дыхания в течение 12 месяцев в сравнении с плацебо у пациентов с быстро прогрессирующим ИЛФ.

Степень достоверности и апробация результатов

Достоверность результатов определяется достаточным объемом выборки и исследуемого материала, использованием методов рандомизации и плацебо-контроля, использованием современных методов исследований и статистики, рецензированием и регистрацией протокола клинического исследования на сайте https://clinicaltrials.gov/ (идентификатор NCT02594839) национальной медицинской библиотеки США.

Работа выполнена в рамках государственного задания ФМБА России на осуществление научных исследований и разработок по теме: «Изучение эффективности и безопасности трансплантации аллогенных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга при тяжелых формах эмфиземы легких, идиопатического легочного фиброза, тяжелого сепсиса и септического шока» (2013-2015 гг.).

Основные материалы диссертации доложены и обсуждены на: XXVII Национальном Конгрессе по болезням органов дыхания, 19 октября 2017 года (Санкт-Петербург); III Национальном Конгрессе по Регенеративной Медицине, 1518 ноября 2017 года (Москва); V Юбилейном международном конгрессе и школах для врачей «Кардиоторакальная радиология», Москва, 23 марта 2018 года; II Всероссийской конференции с международным участием StemCellBio-2018, 15-17 ноября 2018 г. (Санкт-Петербург); Ежегодном конгрессе Американского торакального общества (ATS 2019), 17-22 мая 2019 г., (Даллас, США); Международном конгрессе Европейского респираторного общества (ERS 2019), 28 сентября-2 октября 2019 г. (Мадрид, Испания).

Апробация диссертации состоялась 04.09.2019 г. (протокол № 6/19) на совместном заседании членов Ученого совета Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт пульмонологии Федерального медико-биологического агентства» (ФГБУ «НИИ пульмонологии» ФМБА России) и Ученого совета Федерального государственного бюджетного учреждения «Федеральный научно-клинический центр специализированных видов медицинской помощи и медицинских технологий Федерального медико-биологического агентства» (ФГБУ ФНКЦ ФМБА России).

Соответствие диссертации паспорту научной специальности

По тематике, методам исследования, научным положениям диссертация соответствует шифру и формуле специальности научных работников: 14.01.25 -«пульмонология». Результаты выполненного исследования соответствуют пунктам 1-5 областей исследования паспорта специальности «пульмонология» (медицинские науки).

Уровень внедрения результатов исследования

Результаты исследования внедрены в практическую работу пульмонологического отделения Федерального государственного бюджетного учреждения «Федеральный научно-клинический центр специализированных видов медицинской помощи и медицинских технологий Федерального медико-биологического агентства».

Материалы исследования представлены в отчёте по государственному заданию ФМБА России 2012-2014 гг. по теме: «Изучение эффективности и безопасности трансплантации аллогенных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга при тяжелых формах эмфиземы легких, идиопатического легочного фиброза, тяжелого сепсиса и септического шока».

Личный вклад автора

Автор принимала участие в разработке планов, протоколов исследования, целей, задач, проводила все основные этапы клинического исследования, участвовала в разработке экспериментальной модели легочного фиброза. Принимала непосредственное участие в ведении пациентов с ИЛФ, участвовавших в исследовании, самостоятельно выполнила сбор и обработку полученных материалов, статистические расчеты. В соавторстве подготовила публикации для печати.

Публикации по теме диссертации

По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ, в том числе 3 -в журналах и изданиях, включенных в «Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и издании», рекомендуемых ВАК Минобрнауки России, для опубликования основных научных результатов диссертации, из них 1 публикация, входящая в международные базы данных (зарубежное издание QI).

Объем и структура диссертации

Диссертация написана на 108 страницах компьютерного текста, иллюстрирована 12 рисунками и 11 таблицами, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследования, обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций и списка используемой литературы, включающего 173 источника, из них 8 отечественных и 165 зарубежных.

13

ГЛАВА I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Эпидемиология, факторы риска и патогенез идиопатического легочного фиброза

Идиопатический легочный фиброз (ИЛФ) - специфическая форма хронической фиброзирующей интерстициальной пневмонии неизвестной этиологии, имеющая прогрессирующее течение, которая встречается преимущественно в пожилом возрасте, ограничена легкими и ассоциирована с гистопатологическим и/или КТВР паттерном обычной интерстициальной пневмонии [1]. ИЛФ - наиболее распространенная форма среди идиопатических интерстициальных пневмоний (ИИП), составляющая от 50 до 60% случаев в данной группе заболеваний [14]. Например, в США распространенность ИЛФ колеблется от 14 до 42,7 на 100 000 населения с постоянным ростом заболеваемости за последние 20 лет [15]. Если экстраполировать результаты этих эпидемиологических исследований на российскую популяцию, можно сделать вывод, что в России не меньше 30 тысяч больных ИЛФ, однако в силу низкого уровня диагностики, недостаточных знаний и настороженности среди врачей в отношении данного заболевания, диагноз ставится намного реже. Так, на начало 2019 г. в национальном регистре ИЛФ было зарегистрировано чуть более 1000 пациентов, причем не более 1/3 из них имели подтвержденный диагноз [16]. Поскольку ИЛФ чаще всего возникает у лиц старше 50 лет и учитывая старение населения за счет роста продолжительности жизни, большинство экспертов в области интерстициальных болезней легких считает, что распространенность ИЛФ будет расти и в будущем [17].

Так, в британской популяции ежегодный прирост заболеваемости ИЛФ составляет около 5%. В целом, в Евросоюзе ежегодно диагноз ИЛФ ставится примерно 40 тысячам новым пациентам [2]. Среди хронических интерстициальных заболеваний легких ИЛФ имеет самые высокие темпы прогрессирования, и худшие

показатели смертности, сопоставимые с наиболее агрессивными формами рака, с медианой выживаемости в 3-4 года с момента постановки диагноза [18].

Факторы риска. Несмотря на то, что этиология ИЛФ не установлена, факторы риска (ФР) развития заболевания изучены достаточно хорошо.

Курение - один из главных ФР ИЛФ. Около 70% заболевших ИЛФ, ранее курили или продолжали курить к моменту постановки диагноза. Чаще всего болезнь развивается у больных со стажем курения более 20 пачка/лет [19]. Существует дозо-зависимый эффект курения в отношении риска ИЛФ. Каждый пачка-год увеличивает вероятность заболевания на 3% у продолжавших курить и на 2% у бросивших курить [20]. Вероятно, именно с распространенностью курения в мужской популяции связана большая заболеваемость ИЛФ среди мужчин.

Механизмы, определяющие влияние табакокурения на развитие ИЛФ окончательно не установлены. Предполагается, что имеет значение прямое токсическое влияние компонентов табачного дыма на эпителий, свободнорадикальные процессы индуцированные вдыханием табачного дыма, активация нейтрофилов с увеличением протеазной активности, подобные тем, которые происходят при ХОБЛ. Оксидативный стресс является индуктором экспрессии гена МиС5В, который, как уже упоминалось ранее, ассоциирован с развитием легочного фиброза [21]. В последнее время описаны эпигенетическое влияние курения, а также поллютантов на процессы метилирования ДНК, которые наблюдаются также при раке легкого. Гиперметилирование участка ДНК ^у-1 приводит к уменьшению синтеза соответствующего гликопротеина фибробластами и трансформации фибробластов в миофибробласты [22]. Несмотря на сильную корреляционную связь табакокурения и развития ИЛФ, данное заболевание не относится к группе ИИП, ассоциированных с курением [23].

Поллютанты окружающей среды. Связь между развитием ИЛФ и экспозицией аэрополлютантов, особенно профессионально обусловленная, изучена меньше, чем с другими факторами риска. Ряд исследований выявили, что при хроническом вдыхании металлической, древесной, кремний-содержащей, а также органической пыли, повышается как риск развития локальных фиброзов

легких, так и ИЛФ, причем эта вероятность выше у мужчин [24] В исследовании случай-контроль среди 137 больных ИЛФ из шведского регистра, имевших более чем 10 летний анамнез контакта с различными пылевыми факторами был установлен в 68% случаев (также как и анамнез курения). В контрольной группе факт экспозиции поллютантов подтвержден был у 55% опрошенных (курение в анамнезе у 52%) [20]. Нельзя, правда, исключить, что в выборку ИЛФ попали пациенты с хроническим течением экзогенного альвеолита, практически не отличимого на поздних стадиях от ИЛФ.

Имеются данные об особенностях ИЛФ, ассоциированного с пылевыми факторами. В крупном исследовании в корейской популяции, у пациентов ИЛФ, имевших контакт с производственной пылью, наблюдалось более раннее начало заболевания и худший прогноз в сравнении с остальными больными [25] Однако в целом, роль аэрополлютантов в развитии ИЛФ, вероятно, является недооцененной. Тщательный сбор профессионального анамнеза и особенностей воздушной среды пребывания пациента ИЛФ необходим для исключения возможного провоцирующего фактора болезни. Тем не менее, к трактовке контактов с органической пылью, как возможному фактору, индуцирующему ИЛФ, следует подходить очень взвешенно, поскольку хронические формы экзогенного аллергического альвеолита могут быть практически неотличимы по КТВР от ИЛФ, часто имеют паттерн обычной интерстициальной пневмонии не только рентгенологически, но и при гистологическом исследовании.

Пожилой возраст. ИЛФ - болезнь пожилых людей (средний возраст пациентов 66 лет) и редко встречается до 50 лет [26]. Крупное эпидемиологическое исследование в США показало, что у лиц старше 65 лет цифры заболеваемости и распространенности ИЛФ составляют соответственно 93,7 и 494,5 на 100 000 населения, что на порядок выше, чем в более младшей возрастной группе (до 65 лет) [27]. Одной из гипотез развития ИЛФ является гипотеза ускоренного старения ткани легких [28]. У пациентов ИЛФ установлен целый ряд механизмов, которые лежат в основе процесса старения. Первый из них - нестабильность генома, вследствие накопления повреждений ДНК, которых гораздо больше при ИЛФ, чем

у лиц того же возраста, не страдающих данным заболеванием [29]. Эпигенетическое влияние, в частности гиперметилирование ДНК эпителиальных клеток, также ассоциированы с ускоренным старением и неконтролируемым фиброобразованием. Следующий факт, относящийся к ИЛФ, - ускорение физиологического старения эпителиальных клеток, которые экспрессируют в повышенном количестве маркеры «старения» Р-галактозидазу и циклин-зависимый киназный ингибитор [30]. По-видимому, при ИЛФ раннее старение клеток происходит не только в ткани легких. Так, мезенхимальные стволовые клетки костного мозга, выделенные у пациентов с ИЛФ, также имеют признаки глубокого физиологического старения [31].

В рамках нарушения клеточного гомеостаза активно обсуждается митохондриальная дисфункция и деградация клеточных белков вследствие повышения активности протеолитических систем [32]. Наконец, истощение ресурсов резидентных стволовых клеток, являющихся источником регенерации в легких, также отражает процесс ускоренного старения, имеющий место у больных ИЛФ [32].

Гастроэзофагеалъныйрефлюкс. Значительное число исследований доказало высокую корреляционную связь между ИЛФ и ГЭР. Суточное мониторирование РН пищевода выявило повышение кислотности в 87-94% случаев ИЛФ, что существенно выше, чем в общей популяции, причем в 54-75% случаев ГЭР не имел классических клинических проявлений, таких как изжога и отрыжка [33, 34]. Число эпизодов ГЭР напрямую связано со степенью выраженности фиброза по данным КТВР [35]. Предполагается, что регулярная микроаспирация желудочного сока является фактором, способствующим запуску хронического повреждения эпителия воздухоносных путей при ИЛФ. Однако не исключается и обратное влияние -развитие рефлюкса в силу изменения внутригрудного давления из-за уменьшения растяжимости фиброзированных легких. Несомненные факты связи ГЭР и ИЛФ привели к включению антирефлюксных препаратов в эмпирические схемы лечения ИЛФ в 2015 г. консенсусом ATS/ERS/JRS/ALAT, однако с подчеркиванием малой доказательности таких рекомендаций [36]. Действительно, ряд исследований не

выявили пользы от назначения антацидных препаратов при ИЛФ. В работе G Raghu было показано, что назначение ингибиторов протонной помпы у 63% пациентов не приводит к нормализации кислотности пищевода [34]. Исследования INPULSIS у ряда пациентов, получающих ингибиторы протонной помпы, выявили ухудшение легочной функции [4]. Одно из исследований, оценивавших влияние ИПП и Н2-гистаминоблокаторов на функцию легких у пациентов, получавших пирфенидон, показало, что их включение в схему лечения не улучшает результаты, но повышает риски респираторных инфекций у пациентов с FVC<70% [37].

Инфекция. Первичное повреждение эпителия, запускающее процесс фиброобразования в ткани легких, по-видимому, может быть вызвано не только курением, поллютантами и ГЭР, но также инфекционным фактором. У больных ИЛФ выявлено более широкое носительство герпесвирусов (особенно вируса Эпштейна-Барр), вируса гепатита С, цитомегаловируса чем в общей популяции [38, 39]. Не исключено, что те же самые вирусы, а также вирус гриппа H1N1 играют роль в индуцировании обострений ИЛФ [40].

Бактериальные инфекции также, по-видимому, вносят определенный вклад в патогенез легочного фиброза. Присутствие ДНК Streptococcus и Staphylococcus выше порогового уровня в жидкости БАЛ ассоциировалось со снижением выживаемости пациентов с ИЛФ [41]. Назначение котримоксазола в дозе 960 мг 2 раза в сутки в течение 12 месяцев у пациентов ИЛФ хотя и улучшило функциональные параметры, привело к достоверному снижению летальности в группе антибактериальной терапии [42].

В целом эксперты сходятся во мнении, что роль острой инфекции и изменений микробиома НДП в развитии ИЛФ является недостаточно изученной, тем не менее, вряд ли разработка данного направления принесет существенные плоды с точки зрения получения принципиально новых подходов в лечении пациентов с ИЛФ [43].

Генетические факторы риска. Примерно 3-5% пациентов ИЛФ имеют семейный анамнез данного заболевания. Считается, что генетически

детерминированный ИЛФ может начаться в более раннем возрасте, чем спорадические формы [44]. Мутации, определяющие риск развития ИЛФ, можно разделить на 2 категории: связанные с метаболизмом белков сурфактанта или муцина и изменениями биологии теломер [45]. Среди генов сурфактанта, полиморфизм которых ассоциируется с развитием ИЛФ, наиболее изученными являются SFTPC, кодирующий сурфактантный протеин С; SFTPA2 -сурфактантный протеин А2; ABCA3 - определяющий гомеостаз сурфактанта, а также MUC5B, локализующийся в 11 хромосоме и отвечающий за синтез муцина 5В. Причем нуклеотидный полиморфизм MUC5B одинаково часто выявляется как при семейных, так и спорадических случаях ИЛФ [46].

Теломеры - концевые участки хромосом, которые укорачиваются при делении клеток, и скорость их укорочения определяет процесс старения. Как уже упоминалось одной из гипотез развития ИЛФ является гипотеза преждевременного старения эпителия, подтверждающаяся присутствием в клетках крови и эпителии дыхательных путей укороченных теломер [47]. Кроме того, было показано, что укорочение теломер в клетках периферической крови является негативным предиктором выживаемости пациентов с ИЛФ [48].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Сотникова Анна Геннадьевна, 2019 год

ЭКГ X - - X X

Спирометрия X X X X X

Диффузионный тест X X X X X

ЯрО2 X X X X X

Тест с 6 минутной ходьбой X X X X X

ЭХО-кардиография X X X X X

КТВР X - 26 нед. X X

Общий ан. крови X X X X X

Общий ан. мочи X X X X X

Биохимический ан. крови X X X X X

2.2.4 Оценка безопасности и эффективности

В качестве гипотезы данного исследования мы предположили, что аллогенные МСК костного мозга при повторных введениях в общей кумулятивной дозе 1 миллиард 600 миллионов клеток будут ингибировать патологический процесс в легких, в результате чего будут наблюдаться изменения в скорости падения ФЖЕЛ, БЬСО, дистанции 6 минутной ходьбы, нарастании индекса фиброза по данным КТВР и давления в легочной артерии в группе терапии МСК в сравнении с группой плацебо к моменту завершения исследования. Мы также предположили, что тяжелые нежелательные эффекты в группе лечения МСК не будут отличаться от таковых в группе плацебо.

Основными переменными интереса для оценки безопасности и эффективности были:

1. Нежелательные (побочные) эффекты, связанные с применением клеточного препарата как в день инфузии, так и на протяжении всего периода исследования (53 недели). Оценивались число и тяжесть побочных эффектов.

К тяжелым побочным эффектам относились следующие:

- смерть пациента;

- любое жизнеугрожающее состояние (по мнению исследователя);

- событие, потребовавшее госпитализации, задержки выписки из стационара или вызова скорой помощи;

- возникшая в результате лечения неспособность пациентом выполнять те действия, которые ранее не вызывали затруднений.

Остальные нежелательные эффекты трактовались как нетяжелые.

2. Изменения следующих параметров (в период от начала исследования до 53 недели исследования): ФЖЕЛ, БЬСО, дистанции 6 минутной ходьбы, систолического давления в легочной артерии, индекса фиброза легких по данным КТВР.

3. Изменение скорости падения ФЖЕЛ (в % от должных величин) за 12 месяцев до включения в исследование и 12 месяцев в ходе лечения.

2.2.5. Клеточный препарат для клинического исследования

Получение МСК. Для половины пациентов (п = 5) костный мозг для выделения МСК был получен от их здоровых молодых родственников (20-35 лет). В случае отсутствия подходящих родственных доноров или их отказа от донорства костного мозга, был использован костный мозг здоровых доноров того же пола, что и пациент. Костный мозг был получен путем пункции подвздошной кости под местной анестезией 0,5% раствором новокаина с забором 100-150 мл костного мозга. Каждый донор был обследован для исключения носительства гематогенных инфекций (ВИЧ, Гепатиты В. С, сифилис, цитомегаловирус, вирус Эпштейна-Барр,

T-лимфоторопный вирус человека тип I), подписывал информированное согласие на забор костного мозга. Протокол забора костного мозга был одобрен локальным этическим комитетом ФГБУ ФНКЦ ФМБА России (No. 4-11-03-2013 от 03 марта 2013 г.).

МСК были получены из мононуклеарной фракции костного мозга в соответствии со стандартным протоколом [133]. Ошибка! Источник ссылки не найден.

Флоуцитометрический анализ

МСК (пассаж 3-5) были суспендированы с PBS содержащей 1% FBS. FITC-конъюгированные человеческие антитела к CD34, CD45, и CD105 and PE-конъюгированные человеческие антитела к CD29, CD 44, CD73 и CD90 были использованы для метки клеток. Все антитела произведены были Miltenyi Biotec. Анализ выполнялся на проточном цитофлоуметре Partee FloMax® (Sysmex Partee), используя программное обеспечение Data Acquisition and Analysis Software.

Остеогенная, адипогенная и хондрогенная дифференцировка клеток

Культивированные МСК (пассаж 5) были дифференцированы в остеогенные, адипогенные и хондрогенные линии путем культивирования на соответствующих средах: остеогенной [DMEM с добавлением 10-8 M дексаметазона (Sigma, D4902), 10 mM b-глицерофосфата (Sigma, G9422), и 50 ^g/ml аскорбиновой кислоты], адипогенной [DMEM с добавлением 10 mM 3-изобутил-1-метилксантина

(Sigma, 17018), 0.1 mM индометацина (Sigma, 17378), 10 ^g/ml инсулина (Sigma, I6634), 10-6 дексаметазона] и ходрогенной среде (Stempro, Invitrogen), с последующим окрашиванием Alizarin Red (Sigma), Oil Red O (Sigma) и Aleian Blue (Sigma), соотвественно. Для микроскопического исследования использовался микроскоп Nikon Eclipse Ci (Nikon Instruments Ine, Japan).

Кариотипирование

Кариотипирование выполнялось МСК из первого и последнего пассажей in vitro с использованием mFISH технологии [134]. Клетки были инкубированы в течение 4-х часов с раствором колхицина (40 мкг/мл), затем инкубированы в 0.075% KCl , фиксированы в жидкости Карнуа (3:1 абсолютный этанол: ледяная

уксусная кислота), нанесены на планшеты и высышены. Многоцветная флюоресцентная гибридизация in situ (mFISH) для хромосомного кариотипирования выполнялась на 24 XCyte color kit, Meta-Systems (Altlussheim, Germany) в соответствии с рекомендациями производителя.

Для введения пациентам использовали МСК 3-5 пассажа, охарактеризованные по маркерам CD, по кариотипу, с помощью тестов на стерильность и апирогенность (для каждой серии МСК). Стерильность препаратов проверяли с помощью посева на питательные среды и с помощью MALDI-TOF масс-спектрометрического анализа (Microflex LRF, Bruker) в бактериологической лаборатории ФГБУ ФНКЦ ФМБА России. С целью минимизации негативного влияния компонентов среды, МСК культивировали без добавления FBS, вместо которой применяли аутологичную сыворотку и тромбоцитарный лизат, полученный из плазмы пациентов путём замораживания-размораживания тромбоцитарной фракции. Клетки в течение всего времени культивирования находились в условиях гипоксии (5% О2), что, помимо активации гликолитических процессов, характерных для мультипотентных стволовых клеток, позволяет минимизировать оксидативные повреждения мембранных клеточных систем.

При приготовлении каждого препарата контролировали: 1) число клеток (2х106 для каждого препарата); 2) Жизнеспособность - с помощью клеточного счётчика Luna 2 (она составляла не менее 95% в каждом препарате непосредственно перед введением). 3) Отсутствие контаминации микоплазмой (с помощью ПЦР анализа в реальном времени, Mycoplasma Detection Kit, ThermoFisher).

2.2.6. Методы диагностики

Спирометрия

Спирометрическое исследование проводилось на универсальной трансмуральной бодикамере (М^егБсгееп, Ууав1в, Германия) в соответствии с рекомендациями экспертов Европейского респираторного общества [135].

До начала исследования пациент находился в состоянии покоя в течение 15 мин. В течение суток до исследования было запрещено использование бронхолитических препаратов. Проводилось не менее трех технически правильно выполненных попыток. При этом максимальный показатель ОФВ1 не должен был отличаться от другого по значению более чем 5%, а пикового экспираторного потока более чем на 10%. Выбор лучшей попытки осуществлялся по максимальной сумме показателей ОФВ1 и ФЖЕЛ.

Диффузионная способность легких

Исследование диффузионной способности легких для моноксида углерода методом одиночного вдоха с задержкой дыхания осуществлялось с использованием мультигазового анализатора быстрого ответа, что позволяло почти мгновенно определять содержание в выдыхаемой смеси концентрации трех газов: метана, ацетилена и окиси углерода, на основании которого рассчитывались диффузионные показатели. Исследование проводилось в соответствии с рекомендациями экспертов Европейского респираторного общества [136].

После нескольких спокойных дыхательных циклов обычным комнатным воздухом пациент спокойно выдыхал весь воздух, делал глубокий вдох газовой смесью, задерживал дыхание на 10 сек., после чего быстро выдыхал газ. Длительность вдоха не превышала 4 сек., время для сбора выдыхаемого воздуха -менее 3 сек. Исследовались следующие показатели: ЭЬСОуа, ЭЬСОбЬ и их процентные значения.

Тест с 6-минутной ходьбой

Выполнялся в соответствии с рекомендациями Американского торакального общества [137]. До начала исследования пациент находился в состоянии покоя не менее 10 минут. Тест выполнялся в коридоре пульмонологического отделения

ФНКЦ ФМБА России длиной 30 метров. Пациент проходил дистанцию в течение 6 минут при необходимости останавливаясь для отдыха. Врач находился во время движения позади пациента, фиксируя время и сообщая о нем больному каждые 2 минуты. До начала теста и по его окончании измерялись артериальное давление, частота пульса и сатурация кислорода пульсоксиметром ONYX 9500, производства NONIN (США)

ЭХО-кардиография проводилась при помощи на ультразвуковом анализаторе Vivid T8 pro (General Electric Healthcare, США) в соответствии с рекомендациями Американского общества по эхо-кардиографии [138].

Исследование проводилось в стандартных эхокардиографических трансторакальных доступах: парастернальном, апикальном, субкостальном.

Определение максимального систолического давления в легочной артерии (СДЛА) проводили в постоянно-волновом допплеровском режиме. Систолический градиент давления между правым желудочком и правым предсердием (ПП) рассчитывался по уравнению Бернулли с использованием пиковой скорости потока трикуспидальной регургитации. Регистрация потока трикуспидальной регургитации производилась из апикального и/или субкостального доступа.

Сумма транстрикуспидального градиента давления и давления в 1111 (Рпп) принималась равной систолическому давлению в ЛА (PAPs) (при отсутствии стеноза клапана легочной артерии): PAPs=PGтк+Pпп

Компьютерная томография

Компьютерная томография органов грудной клетки выполнялась на спиральных компьютерных томографах 128 Philips Ingenuity (Филипс, Нидерланды) и Toshiba Aquilion 64 (Тошиба, Япония).

Мы использовали следующий протокол: пациент в позиции лежа на спине; толщина срезов 0,5-1 мм с использованием кластерного сканирования зон интереса для уменьшения лучевой экспозиции, в конце глубокого вдоха; применялся реконструктивный алгоритм с высоким пространственным разрешением.

Полуколичественная оценка фиброза легких (индекс фиброза) проводилась независимым рентгенологом по методу K. Oda et al [139]. Легкие разделяли на 3 зоны - верхние (пространство выше карины), нижние (ниже уровня нижней легочной вены) и средние (между верхней и нижней зоной). На каждом уровне оценивалось 4 признака, каждому из которых соответствовал определенный балл, в зависимости от его значимости для диагноза ИЛФ:

- нормальная плотность -1 балл, ретикулярные изменения- 2 балла, тракционные бронхоэктазы - 3 балла,

- сотовое легкое- 4 балла.

В каждой зоне в обоих легких оценивался процент площади ткани легких, соответствующей каждому признаку. Далее проводилось умножение данного процента на балл признака и полученные цифры суммировались для каждой зоны. Минимальный индекс мог составлять 100 баллов (при полностью нормальной плотности) а максимальный 400 баллов при тотальном распространении сотового легкого. Для каждого пациента проводилось определение индекса фиброза путем усреднения цифр из всех 6-ти зон.

2.2.7. Статистическая обработка результатов

Для обоих этапов данные представлены как выборочное среднее ± стандартное отклонение. Достоверность различий оцениваемых показателей между исследуемыми группами в экспериментальном этапе вычислялась методом однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA).

Анализ статистической мощности для клинического исследования показал ее значения на уровне 94% для DLCO и 76% для ФЖЕЛ, рассчитанных для объема выборки 20 пациентов в двух сравниваемых группах. Достоверность различий между исследуемыми группами по оценке эффективности проводилось методом Манна-Уитни. Сравнение частоты побочных эффектов между группами проводилось с использованием критерия Фишера. Результаты считались статистически достоверными при p<0,05. Статистическая обработка результатов

исследования производилась при помощи пакета прикладных программ «Statistica for Windows StatSoft Inc. Версия 7.0».

55

ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Экспериментальное исследование 3.1.1. Выживаемость стволовых клеток при распылении в разных типах небулайзеров

Мы изучали жизнеспособность МСК после распыления в течение 10 минут через разные типы небулайзеров (компрессорного, ультразвукового и сетчатого). До начала небулизации в подготовленной для последующего распыления суспензии определялось более 95% живых клеток. Наиболее высокие показатели выживаемости стволовых клеток были достигнуты при использовании обычного компрессорного (струйного) небулайзера (72% жизнеспособных клеток), тогда как после небулизации ультразвуковым ингалятором данная цифра составляла всего 20%, а после прохождения через сетчатый небулайзер живых МСК в конденсате вообще не определялось (рис. 5).

98 97 99

100' 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

72

а Компрессорный □ Ультразвуковой

□ Сетчатый

0

до небулизации

через 10 мин.

Рисунок 5 - Доля жизнеспособных МСК после 10-минутного распыления через сравниваемые типы небулайзеров

3.1.2. Эффекты МСК при ингаляционной и внутривенной доставке в легкие

Все животные, подвергнутые эндобронхиальному введению блеомицина, дожили до 28 дня эксперимента, несмотря на достаточно большую дозу блеомицина, нередко приводящую к смерти животных. По видимому, это связано с локальным введением препарата в правую заднюю долю, благодаря чему диффузного повреждения паренхимы легких не развивалось. При оценке морфологических изменений ткани легких в исследуемых группах у всех животных с эндобронхиально введенным блеомицином наблюдалось в разной степени утолщение межальвеолярных перегородок, инфильтрация их и стенок сосудов нейтрофилами и лимфоцитами, а также деформация ацинарных структур (рис. 6).

Рисунок 6 - Легкие кроликов в группах исследования.

А - здоровый контроль; Б - блеомициновый контроль; В - группа внутривенной терапии МСК; Г - группа ингаляционной терапии МСК. Окраска гематоксилином и эозином, х100.

В группах, получивших внутривенное или ингаляционное лечение МСК, эти изменения хотя и присутствовали, но были выражены существенно меньше, чем в контрольной группе, подвергшейся введению блеомицина, без клеточной терапии. Здесь, помимо описанных изменений, выявлены массивные поля фиброза, участки полной облитерации альвеол и сосудистого русла.

При полуколичественной оценке степени фиброза у животных, получивших лечение МСК, выраженность фиброза была достоверно меньше, чем в контрольной группе блеомицинового фиброза: 2,34 и 2,11 против 4,15 баллов (табл. 6).

Таблица 6 - Морфометрические показатели, степень экспрессия коллагена

и уровень цитокинов в жидкости БАЛ в группах исследования

Здоровый контроль Блеомицин. контроль Блеомицин + МСК в/в Блеомицин + МСК инг

Шкала фиброза Эшкрофта, баллы 0.24±0.11 4.15±1.8** 2.34±1.6* 2.11±1.3*

Экспрессия коллагена, баллы 0,15±0,20 2,1±0,65** 0,79±0,55 0,51±0,29*

ТЫБ-а pg/ml Не определился 122±65 95±77 101±36

ТСЕ-Р1 р^т1 26±11 56±32 44±24 51±18

ТЬ-6 р§/т1 Не определился 44±36 Не определился Не определился

**р<0,01 в сравнении со здоровым контролем; *р<0,05 в сравнении с группой блеомицина без лечения

Значимых различий по морфометрическим изменениям между группами с ингаляционной и внутривенной доставкой МСК не установлено. Похожая картина наблюдалась в степени экспрессии коллагена - максимальная в группе блеомицинового повреждения без лечения (2,1 против 0,15 баллов в здоровой

группе), в то время как у животных получивших МСК, данный показатель был существенно ниже: в среднем 0,79 балла при внутривенной терапии и 0,51 балл при ингаляционной доставке (рис. 7). Цитокиновый профиль жидкости БАЛ оказался менее информативным в связи с тем, что ТЫБ-а и 1Ь-6 р§/ш1 у здоровых животных не определялись, а показатели ТОБ-р1 хотя и были количественно выше в группах, получивших блеомицин, однако, из-за большого разброса показателей достоверно не отличались как между собой, так и со здоровым контролем (табл. 6).

Рисунок 7 - Легкие кроликов с экспрессией иммуногистохимического маркера коллагена IV типа в исследуемых группах

А - здоровый контроль; Б - блеомициновый контроль; В - группа внутривенной терапии МСК; Г - группа ингаляционной терапии МСК. Иммуногистохимическая реакция с ОТХ антителами, х200

Результаты цитологического анализа жидкости бронхоальвеолярного лаважа представлены в таблице 7. Общий цитоз в группе блеомицинового контроля без лечения был достоверно выше, чем у животных из группы здорового контроля (567 против 365 кл/мкл), однако, данный показатель в группах лечения МСК хотя и имел тенденцию к снижению, тем не менее не продемонстрировал статистически

значимых различий с контрольной группой. Сходные изменения наблюдались и в клеточных фракциях.

Доля нейтрофилов и лимфоцитов в жидкости БАЛ в группе блеомицинового контроля была достоверно выше, чем у здоровых животных. В группах, получивших клеточный препарат, этот показатель снижался, тем не менее изменения не были статистически значимыми по сравнению в группе блеомицинового фиброза без лечения (табл. 7). По остальным клеточным фракциям жидкости БАЛ различий между животными с блеомициновым фиброзом и здоровым контролем существенных отличий не наблюдалось.

Таблица 7 - Цитологический состав жидкости БАЛ в группах исследования

Контроль Блеомициновый фиброз Блеомицин + МСК в/в Блеомицин + МСК инг.

Общее число клеток/мкл 365±72 567±112* 495±122 528±129

Нейтрофилы, % 3±3 13±5** 10±5* 10±9

Макрофаги, % 85±11 65±18 78±15 76±17

Лимфоциты, % 10±4 21±12* 12±11 14±9

Эозинофилы, % 2±4 3±3 1±4 1±3

Эритроциты, % 2±5 2±4 2±2 1±1

*р<0,05 в сравнении со здоровым контролем, **р<0,01 в сравнении со здоровым контролем

Картина альвеолоскопических изображений, полученных в результате проведения конфокальной лазерной эндомикроскопии нижних дыхательных путей (КЛЭМ) у экспериментальных животных в контрольной группе характеризовалась четкой визуализацией альвеолярных структур округлой формы, толщиной межальвеолярных перегородок 4,8±1,2 мкм, единичными внутрипросветными макрофагами (1 балл) (рис. 8А). Размер альвеол составил 123±25 мкм.

Во второй группе животных (блеомициновый контроль без лечения) альвеолярные структуры в большинстве не дифференцировались, различимы были

лишь отдельные фрагментированные межальвеолярные перегородки, присутствие альвеолярных макрофагов было существенно выше, чем у здорового контроля и составило 2-3 балла (рис. 8Б).

Рисунок 8 - Репрезентативные КЛЭМ изображения, демонстрирующие изменения в альвеолах в исследуемых группах

А - контроль; Б - блеомициновый фиброз; В - группа внутривенной терапии МСК; Г - группа ингаляционной терапии МСК

В третьей группе животных, подвергшихся внутривенной терапии МСК, структура альвеол прослеживалась преимущественно четко, однако многие альвеолярные пространства были существенно увеличены в диаметре, достигая размеров 232 мкм, средний размер составил 154±43 мкм (рис. 8В). Толщина межальвеолярных перегородок составила 4,7±1,5 мкм и была близка к таковой в

группе контроля. Полуколичественная оценка макрофагов не превышала показатель в 1-2 балла.

В экспериментальной группе с ингаляционной доставкой МСК КЛЭМ изображения демонстрировали нормальные по форме альвеолы, так же как в предыдущей группе несколько увеличенные в размере, однако данный признак был менее выражен. Размер альвеол составил 122±30 мкм, а толщина альвеолярных перегородок 4,9±1,1 мкм (рис. 8Г). Макрофаги были единичными в поле зрения -0-1 балла.

Подводя итог результатам экспериментальной части нашей работы, можно констатировать, что с одной стороны была доказана целесообразность применения компрессорного ингалятора для доставки максимального числа жизнеспособных клеток в нижние дыхательные пути, а с другой - продемонстрированы сходные позитивные морфологические, альвеолоскопические, иммуногистохимические и цитологические эффекты внутривенного и ингаляционного введения аллогенных МСК костного мозга, на модели легочного фиброза у кроликов, индуцированного эндобронхиальной инстилляцией раствора блеомицина. Следует отметить, что примененная нами технология моделирования легочного фиброза была использована впервые и позволила получить локальное повреждение и фиброз в одном участке легкого, благодаря прицельному введению индуктора фиброза через ультратонкий бронхоскоп, что благоприятно сказалось на выживаемости животных.

Положительные результаты клеточной терапии экспериментального фиброза легких на более крупных животных, чем в предшествующих исследованиях, а также приемлемая для человека технология доставки клеток в дыхательные пути, позволили нам перейти к этапу пилотного клинического исследования у пациентов с идиопатическим легочным фиброзом, имеющих быстро прогрессирующее течение заболевания, при отсутствии на тот период альтернативы патогенетического лечения.

3.2. Пилотное клиническое исследование безопасности и эффективности аллогенных МСК костного мозга у пациентов с идиопатическим легочным фиброзом с быстрым снижением функции легких 3.2.1. Оценка безопасности высокой кумулятивной дозы аллогенных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга В 2013-2016 гг. для набора в исследование было рассмотрено 27 пациентов с ИЛФ. Из них 5 больных не подошли из-за несоответствия критериям включения/исключения, двое больных отказались от участия в исследовании (рис.

9).

Рисунок 9 - Диаграмма клинического исследования CONSORT Рандомизировано было 20 пациентов по 10 в группу терапии МСК или плацебо. Пациенты разных групп не различались между собой по

демографическим, конституциональным и функциональным параметрам (табл.

5).

Таблица 8 - Основные исходные показатели пациентов, включенных в исследование

№ Пол Возраст (полных лет) ФЖЕЛ % от должного БЬСО % от должного Дистанция 6 минутной ходьбы (метры) Ра в легочной артерии мм рт. ст. Индекс фиброза легких (баллы)

Группа терапии МСК

1 М 61 67 41 384 29 139

2 Ж 60 75 22 122 88 126

3 М 50 36 24 250 30 187

4 Ж 74 79 28 292 33 128

5 Ж 58 43 28 298 36 155

6 М 33 52 31 381 44 146

7 М 68 48 33 225 40 172

8 М 61 55 27 405 29 135

9 Ж 59 51 22 141 57 172

10 Ж 70 40 20 150 37 190

Группа плацебо

11 М 56 61 38 409 28 130

12 Ж 59 53 29 240 46 136

13 Ж 65 48 26 255 39 139

14 М 69 61 35 346 31 122

15 М 52 50 31 230 49 145

16 М 71 45 24 197 45 149

17 М 69 52 30 339 32 138

18 Ж 60 64 39 457 30 121

19 М 58 45 21 89 45 167

20 Ж 66 49 21 95 35 175

Из 20 рандомизированных пациентов исследование завершили 16. Четверо больных (пациенты № 9, 10, 19, 20), 3 женщины, 1 мужчина) умерло от прогрессирования дыхательной недостаточности, вследствие основного

заболевания между 14-й и 34-й неделей исследования. Все они исходно имели низкие показатели БЬСО (20-22% от должного), БУС (40-51%), дистанцию 6-минутной ходьбы (89-150 метров), высокий индекс фиброза легких по данным КТВР (167-190 баллов) и принимали более высокие дозы преднизолона, чем остальные пациенты (20-25 мг). Умершие пациенты получили во время первой госпитализации две внутривенные инфузии по 200 млн МСК (всего 400 млн МСК) и были включены в анализ безопасности. Остальные больные, завершившие исследование, получили суммарно дозу 1 млрд 600 тысяч аллогенных МСК каждый.

Побочные эффекты чаще наблюдались в группе, получавшей МСК, среди них доминировали повышение температуры тела, ассоциированная с нею слабость и озноб в течение 1 суток после введения клеточного препарата (табл. 9). Однако эти реакции носили легкий характер и не привели к прерыванию исследования. Субфебрильная лихорадка после внутривенного введения клеток отмечалась 6 раз у 4-х пациентов, однако, носила кратковременный характер и была купирована введением 8 мг дексаметазона. Из других нежелательных эффектов, зафиксированных в ходе исследования, которые можно было бы связать с ведением клеточного препарата были тошнота, слабость, головная боль, кашель, респираторные инфекции, однако их частота в группах терапии МСК не отличалась от таковой в группе плацебо (табл. 9). Одна пациентка в группе МСК терапии перенесла ишемический инсульт с почти полным восстановлением чувствительных и двигательных функций после антикоагулянтной и сосудистой терапии и продолжила участие в исследовании. В группе плацебо 1 больной перенес обострение ИЛФ со стабилизацией состояния после внутривенного введения высоких доз метилпреднизолона. В группе МСК обострений ИЛФ не зафиксировано.

Таблица 9 - Частота побочных эффектов в исследуемых группах (п=10)

МСК суспензия 2х 108 +400 ш1 0,9% ша Число пациентов (%) / число событий Плацебо 400 мл 0,9% NaCl N (%) Число пациентов (%)/число событий

Повышение температуры тела 4 (40)/6 1 (10)/1

Озноб 2 (20)/2 0

Тошнота 2 (20)/2 2 (20)/2

Инфекции верхних дыхательных путей 2 (20)/3 2 (20)/2

Инфекции нижних дыхательных путей 2 (20)/2 2 (20)/2

Ишемический инсульт 1 (10)/1 0

Кашель 2 (20)/2 2 (20)/2

Головная боль 2 (20)/4 3 (30)/3

Слабость 4 (40)/4 1 (10)/1

ИЛФ обострение 0 1 (10%)/1

Кожная сыпь 0 1 (10)/1

Всего нежелательных событий 26 15

Таким образом, внутривенные инфузии аллогенных МСК костного мозга ассоциировались с более частыми нетяжелыми нежелательными эффектами, такими как транзиторная лихорадка, слабость и озноб в сравнении с группой плацебо, тем не менее данные явления носили непродолжительный характер и не привели к прерыванию или отмене клеточной терапии.

3.2.2. Оценка эффективности высокой кумулятивной дозы аллогенных МСКу пациентов с идиопатическим легочным фиброзом

Динамика основных показателей, использованных для оценки эффективности клеточной терапии у 8 пациентов, получивших полную дозу клеточного препарата, представлена в таблице 10.

Таблица 10 - Динамика основных показателей эффективности (N=8)

Начало лечения 13 неделя 26 неделя 39 неделя 52 неделя

ФЖЕЛ (% от должного)

МСК 56,9±15,4 53,6±14,2 53,8±14,5 54,9±15,1* 54,5±15,0**

Плацебо 54,3±6,9 51,6±6,6 50,3±7,2 48,3±6,3 47,1±6,3

БЬСО (% от должного)

МСК 30,5±6,4 30,6±4,4 30,3±6,8* 28,4±7,2 28,8±6,1**

Плацебо 31,5±5,4 29,9±5,9 28,9±5,8 27,1±5,3 26,0±5,6

Дистанция 6-минутной ходьбы (метры)

МСК 294,6±95,8 319,1±90,0** 337,6±104,9** 334,5±93,9** 346,4±103,6**

Плацебо 309,1±93,1 303,5±89,0 297,0±89,1 288,6±89,2 280,6±90,3

Ра систолическое в легочной артерии (мм рт. ст.)

МСК 41,1±19,7 42,4±25,5 44,8±24,8 35,1±7,8* 33,6±5,7*

Плацебо 37,5±8,3 39,3±8,2 41,5±9,5 43,6±10,0 46,4±14,1

КТВР индекс фиброза (баллы)

МСК 148,5±21,7 - 146,8±18,1 - 149,9±19,9

Плацебо 135,0±10,1 - 138,8±9,6 - 138,5±8,2

*р<0,05, **р<0,01 при сравнении динамики между группами

После первых 3-х месяцев лечения (введения 400 млн МСК) мы не наблюдали достоверной разницы между группами в динамике ни одного из исследуемых показателей исключением дистанции 6 минутной ходьбы - она увеличилась в группе МСК на 8,3%, а в группе плацебо снизилась на 1,8%. К 26-й неделе после начала терапии, в группе, получавшей лечение МСК,

наблюдалось достоверно лучшая динамика БЬСО (-0,7%; уб -8,3% в группе плацебо) и дистанции 6 минутной ходьбы (+14,6% уб -3,9%) по сравнению с исходными цифрами. К 39 неделе после суммарной дозы клеток 1,2* 109 разница в динамике наблюдалась в ФЖЕЛ (-3,5% уб -11,1%), (+13,5% уб -6,6%) и систолического давления в легочной артерии (-14,6% уб + 16%). После завершения курса лечения и достижения суммарной дозы 1,6 миллиарда клеток к 52-й неделе исследования достоверные различия между группами были достигнуты по показателям динамики ФЖЕЛ (-4,2% уб -13,2%), БЬСО (-5,6% уб -17,5%), дистанции 6 минутного теста (+17,6% уб -9,2%) и уровня систолического давления в легочной артерии (-18,2% уб +23,7%) в сравнении с исходными показателями. Индекс фиброза легких по данным КТВР достоверно не различался как на 26-й (МСК -1,1% уб плацебо +2,5%), так и на 52-й неделе наблюдения в группе терапии (МСК +1%; Плацебо +2,6%). При этом, оценивая сопоставимые срезы у пациентов, получавших МСК, в динамике можно было наблюдать уменьшение участков матового стекла, которые визуализировались в зонах субплевральных ретикулярных изменений, на месте которых формировались фокусы «сотового легкого» или ретикулярные изменения (рис. 10). В целом, как в группе терапии МСК, там и группе плацебо отмечалось умеренное усиление фиброзных изменений.

При сравнении динамики БУС за 12 месяцев предшествовавших терапии и 12 месяцев лечения, установлено значительно более существенное снижение скорости падения функциональных параметров в группе, получавшей МСК (с -11,8 до -4,2%), по сравнению с плацебо (с -12,23 до -13,2%) (рис. 11). Данные по динамике ЭЬСО не сравнивались, так как только 4 пациента имели предшествующие показатели диффузионной способности легких за 12 месяцев до включения в исследование. Статистическая мощность исследования, рассчитанная для 20 пациентов в двух сопоставимых группах составила для ЭЬСО 94%, а для ФЖЕЛ 76%.

Мы проанализировали отдельных пациентов в группе терапии, у которых продолжалось падение ФЖЕЛ и ЭЬСО> 10% за период наблюдения (пациенты 4,

5 см. табл. 8), а также умерших пациентов (пациенты 9, 10 см. табл. 5). Все «неответчики» были женщинами, с наиболее длительным анамнезом заболевания (48-84 месяцев) и низким ИМТ (3 из 4-х имели ИМТ 18-19 кг/м2 и одна 22 кг/м2) и низким исходным уровнем диффузионной способности легких < 30% от должных.

Рисунок 10 - 12-месячная динамика сопоставимых срезов КТВР у пациентки, получавшей лечение МСК. Умеренные субплевральные ретикулярные изменения в нижней доле правого легкого, ассоциированные со снижением прозрачности ткани легких по типу «матового стекла», которые через 12 месяцев превратились в участки «сотового легкого» (горизонтальные стрелки). Зоны сотовой дегенерации сохранились фактически в тех же границах (вертикальные стрелки)

о" 0

0

1 -2

и

и -4

Е 4

с;

ш

эе -6 е

си

I -8

Ч

П5

С

-10

-12

-14

печения

и лечения

-12

-13,2

МСК ■ Плацебо

Рисунок 11 - Изменение падения ФЖЕЛ в группах до и после лечения

о

Клинический пример

Пациент Ф., 33 лет, врач-хирург, в анамнезе хронические заболевания отрицал, курил более 10 пачка/лет, контактов с экзогенными поллютантами не отмечал, бытовые и профессиональные условия были удовлетворительными, в последние годы использовал постельные принадлежности синтетического состава. В 2013 г. отметил появление одышки при физической нагрузке, непродуктивного кашля. При обследовании выявлены интерстициальные изменения в легких. С учетом молодого возраста, не характерного для ИЛФ, было решено провести морфологическую верификацию диагноза, была выполнена хирургическая биопсия правого легкого, выявлены признаки обычной интерстициальной пневмонии. При обследовании данных за системные заболевания соединительной ткани не получено, на КТ грудной клетки - двусторонние локальные участки «сотового легкого» с преимущественно базальным и субплевральным распределением, значительное утолщение внутридольковых и междольковых перегородок, тракционные бронхоэктазы - паттерн обычной интерстициальной пневмонии (рис. 12).

Рисунок 12 - КТВР пациента Ф. Выраженные двухсторонние ретикулярные изменения, субплевральные участки сотового легкого и тракционные бронхоэктазы, нарастающие к базальным отделам. Паттерн обычной интерстициальной пневмонии

Проведен консилиум, который установил диагноз идиопатического легочного фиброза. Назначено лечение 40 мг (8 таблеток) преднизолона с постепенным снижением дозы через 3 мес., однако улучшения на фоне приема препарата пациент не отмечал, одышка продолжала усиливаться, за 12 месяцев произошло снижение форсированной жизненной емкости легких (ФЖЕЛ) с 61% до 52%, диффузионной способности легких (БЬСО) с 42% до 31% от должного. В связи с отсутствием эффекта от единственной доступной на тот период терапии системными кортикостероидами, пациенту было предложено участвовать в клиническом исследовании по оценке безопасности и эффективности клеточной терапии у больных с быстро прогрессирующими интерстициальными заболеваниями легких. Получено информированное согласие на участие в исследовании. По результатам рандомизации больной был определен в группу активной терапии (не плацебо). В течение 12 месяцев он получил 4 курса лечения аллогенных МСК костного мозга. Каждый курс включал в себя 2 внутривенных инфузии МСК по 200 млн клеток каждая с интервалом в 7 дней. Общее число введенных клеток составило 1,6 х 109. Результаты лечения представлены в таблице 11.

Таблица 11 - Динамика показателей у пациента Ф.

12 месяцев до терапии Начало терапии 3 мес. 6 мес. 9 мес. 12 мес.

ФЖЕЛ, % 61 52 48 50 58 58

БЬСО, % 42 31 29 30 30 31

6МТО, метры 381 390 459 435 462

Ра сист., мм рт. ст. 44 40 31 31 28

КТВР, фиброзный индекс 146 143 149

Как видно после быстрого прогрессирования за 12 месяцев до начала лечения - снижения основных функциональных показателей на 14,8% (ФЖЕЛ) и 26% (ЭЬСО), через 12 месяцев от начала лечения произошло увеличение ФЖЕЛ и стабилизация ЭЬСО, существенно снизилось давление в легочной артерии и выросла дистанция 6-минуной ходьбы, причем последний показатель стал увеличиваться уже через 3 месяца после первых 2-х инфузий клеточного препарата. Субъективно пациент отметил уменьшение одышки и кашля, увеличение толерантности к физическим нагрузкам, произошла полная отмена преднизолона (но момент начала клеточной терапии доза составляла 15 мг - 3 таблетки). На КТВР грудной клетки отмечалось некоторое усиление ретикулярных симптомов, без нарастания участков «сотового легкого». Единственным нежелательным явлением, зафиксированным в ходе исследования, было возникновение острой респираторной вирусной инфекции, не приведшей к ухудшению течения основного заболевания. Таким образом был достигнут хороший клинический и

функциональный результат в лечении неуклонно прогрессирующего заболевания, такого как ИЛФ.

Общими эффектами проведенного лечения МСК стало замедление темпов прогрессирования ИЛФ, по данным исследования ФЖЕЛ и ЭЬСО, увеличение толерантности к физическим нагрузкам, снижение уровня систолического давления в легочной артерии, при умеренном нарастании явлений фиброза на КТВР.

73

ГЛАВА 4

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

Вопрос об оптимальных путях доставки клеточных препаратов в легкие до настоящего времени остается открытым. При поиске в международных базах данных (Scopus, PubMed, Web of Science) по ключевым словам stem cells, delivery, lung удалось найти единичные публикации, посвященные данному направлению [140-143], причем до нашей работы сравнительных исследований по выживаемости клеток после распыления разными способами, а также эффективности гетерогенных методов доставки стволовых клеток в легкие (аэрозольному и внутривенному) не проводилось.

В проведенном нами исследовании было показано, что при использовании технологически наиболее простого струйного (компрессорного) небулайзера доля поврежденнных МСК значительно меньше (28%), чем при распылении через ультразвуковой ингалятор, в то время как сетчатый небулайзер, использующий меш-технологию, фактически полностью разрушает клетки при переводе их в аэрозольное состояние. Наши результаты оказались довольно близки к данным Sosnowski et al., которые оценивали жизнеспособность разных клеток (плесени, бактерий, фибробластов) при прохождении через разные распылители. Выживаемость фибробластов в их исследовании составила 92% при 8-минутном распылении через microsprayer®aerosolizer являющимся механическим аналогом струйного небулайзера с более грубой дисперсностью частиц, в котором давление создает не электродвигатель-компрессор, а поршень, приводимый в действие рукой исследователя [144]. Что касается ультразвуковых и меш-небулайзеров, то для фибробластов они оказались одинаково разрушительны, вероятно из-за большого размера клеток (в среднем 80 мкм). Объяснение данного факта, по-видимому, лежит в особенностях механизма небулизации. В компрессорном небулайзере струя сжатого воздуха проходит через камеру с клеточным препаратом, преобразуя его в аэрозольную взвесь. В ультразвуковых небулайзерах распыление происходит за счет ультразвуковых колебаний, создаваемых генератором. При этом ультразвуковые волны, вызывают эффекты нагревания и кавитации в жидкой среде

[145], что, по-видимому, является губительным для живых клеток. Наиболее современная меш-технология небулизации не предусматривает прямого контакта распыляемого раствора (в нашем случае суспензии) с ультразвуковыми волнами, которые передают колебания на специальную микропористую мембрану-сетку с размером перфораций в несколько мкм, а уже через нее происходит просеивание распыляемого раствора (суспензии) с преобразованием в мелкодисперсный аэрозоль [109]. Судя, по результатам, полученным в нашей работе, такая технология, наиболее прогрессивная для ингаляции лекарственных препаратов, губительна для живых клеток. Еще одним объяснением гибели клеток при небулизации может быть размер аэрозольных частиц, генерируемых разными типами распылителей. Известно, что МСК при 6 ступенчатом пассировании имеют размеры 15-50 мкм, разделяясь на две фракции мелких клеток (средний размер 17,9 мкм) и крупных (средний размер 30,4 мкм) [146].

Поскольку для ультразвуковых и меш-небулайзеров основная фракция аэрозоля приходится на размеры частиц меньшие 10 мкм, тогда как для компрессорный производит более крупные частицы, процесс деградации клеток в первых двух типах небулайзеров должен быть выше. Тем не менее, с учетом того, что в основе эффектов клеточной терапии, по-видимому, лежит паракринная активность (выделение биологически активных субстанций), а не приживаемость (встраиваемость) трансплантированных клеток и регенерация тканей, мы не можем быть уверены, что применение разных типов небулайзеров для доставки клеточных препаратов в нижние дыхательные пути имеет разное клиническое значение. Для этого необходимы дополнительные сравнительные исследования. С другой стороны, чем дольше сохранена жизнеспособность трансплантированных клеток, тем, по-видимому, большие объемы паракринных факторов поступят в зону патологических процессов, следовательно, теоретически количество активных МСК должно влиять на эффективность терапии. Таким образом, полученные результаты выживаемости МСК ex vivo позволили нам сделать выбор в пользу компрессорного небулайзера в качестве устройства для доставки в нижние дыхательные пути суспензии МСК на экспериментальном этапе.

В качестве экспериментальных животных мы использовали кроликов породы Шиншилла. Следует отметить, что кролики филогенетически ближе к человеку, и имеют похожее на приматов строение бронхиального дерева и особенности функционирования иммунной системы, в отличие от мелких грызунов, которые в большинстве случаев используют в животных моделях [147]. Еще одним преимуществом модели легочного фиброза у кроликов является возможность выполнения у них бронхоскопии ультратонким бронхоскопом с локальным введением фиброгенного препарата и прицельного бронхоальвеолярного лаважа из пораженной зоны. Такая технология была применена впервые в нашей работе, в доступной научной литературе не найдено примеров бронхоскопии у кроликов при моделировании фиброзов легких. В качестве индуктора фиброза легких был выбран цитостатик блеомицин, наиболее часто используемый в доклинических исследованиях [148]. Из существующих путей введения блеомицина (инъекционный, интраперитонеальный, интратрахеальный, эндобронхиальный) мы использовали последний, единственный позволяющий получить локальный фиброз одной и той же области с минимальной травматизацией остальных отделов легких и сниженным уровнем системной воспалительной реакции. Как показали результаты морфологического, иммуногистохимического и цитологического исследований, при использовании обоих путей введения (внутривенного и ингаляционного) МСК оказались одинаково эффективными в отношении сдерживания развития фиброза легких и отложения коллагена в интерстициальном пространстве. Для ингаляций мы использовали дозу клеточного препарата в 10 раз более высокую, чем при внутривенной доставке. Это связано с объемом доставленной респирабельной дозы, которая для компрессорных ингаляторов обычно не превышает 10% от распыляемого объема [149].

Уровни провоспалительных и профиброгенного цитокинов в жидкости бронхоальвеолярного лаважа хотя и имели тенденцию к уменьшению у животных, получивших лечение МСК, но не достигли статистической разницы, что предположительно связано как с ограниченным числом образцов для тестирования, так и достаточно большим сроком после блеомицинового повреждения (4 недели).

Анализ клеточного состава бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ) выявил достоверное увеличение общего цитоза с увеличением фракций нейтрофилов и лимфоцитов у животных с блеомициновой травмой, не получивших лечения. В группах клеточной терапии достоверного отличия от здорового контроля не установлено, за исключением повышенного содержания нейтрофилов у кроликов с внутривенным введением клеточного препарата (хотя и более низкого, чем у животных без лечения). Эти данные, в целом, свидетельствуют о местных противовоспалительных эффектах как ингаляционного, так и внутривенного пути введения МСК. Практически во всех образцах, как в контроле, так и в группах лечения мы выявили небольшое присутствие эритроцитов, нетипичное для клеточного состава БАЛ, которое связываем с локальной травмой слизистой оболочки фибробронхоскопом во время его проведения по дыхательным путям.

Весьма любопытными представляются результаты конфокальной лазерной эндомикроскопии дистальных дыхательных путей. Мы первыми провели такое исследование на животной модели легочного фиброза. Под воздействием блеомицина происходила деградация альвеолярного компартмента, «размытость» альвеолярных стенок, исчезновение эластических и сосудистых элементов. Все эти изменения нивелировались, если животным были введены МСК. Неожиданным и не совсем понятным феноменом, установленным у кроликов с ингаляционным введением клеточного препарата, является существенное уменьшение в альвеолах числа внутрипросветных макрофагов. По-видимому, имело место торможение миграции макрофагов в зону блеомицинового поражения, но лишь у тех животных, которым МСК доставлялись через дыхательные пути. Не исключено, это связано с ремоделированием сигнальных путей макрофагов трансплантированными МСК, которое ранее было описано в модели острого повреждения легких при сепсисе [150].

В целом наше исследование подтвердило противовоспалительные и протективные антифиброзные эффекты при трансплантации МСК, которые наблюдались в других экспериментальных работах на более мелких животных [7880, 151, 152]. Следует заметить, что мы использовали раннее введение МСК в течение первых суток после блеомицинового повреждения, которое в чаще всего применяется в экспериментах, и, по данным мета-анализа Zhang et al. существенно более эффективно, чем поздняя трансплантация МСК (на 14-й день после введения блеомицина) [153].

Вероятно, клеточные препараты не могут повлиять на уже сформировавшийся фиброз, а «работают» на этапе альвеолита и предотвращают коллагенообразование в ткани легких. И хотя очевидно, что блеомициновая модель по своему патогенезу отличается от ИЛФ, полученные нами данные позволили перейти к следующему этапу работы - пилотным клиническим исследованиям.

Наше клиническое исследование было первым, в котором сравнивались эффекты внутривенной трансплантации МСК с плацебо у больных с быстро прогрессирующим идиопатическим легочным фиброзом. Мы также впервые применили значительно более высокие кумулятивные дозы стволовых клеток, чем в предшествующих исследованиях, и более частое их введение. Исследование в целом продемонстрировало безопасность суммарной дозы клеток 1,6 х 109, которую получили участники, завершившие исследование. Проанализировав результаты опубликованных клинических исследований по применению МСК при различных видах патологии, мы пришли к выводу, что нами была использована максимальная из ранее официально применявшихся суммарная доза внутривенных МСК (1,6 х 109). Что касается однократной максимальной дозы у пациентов с болезнями легких, то Jennifer Wilson et al. при ОРДС вводили одномоментно до 10 млн/кг клеток, без существенных негативных эффектов [154]. Наибольшие дозы МСК, когда-либо вводимых человеку в рамках предшествующих клинических исследований, были использованы в работе T. Patila et al. у больных с ишемической сердечной недостаточностью, которые трансплантировали аутологичные стволовые клетки трансмиокардиально в дозе до 1,35 х 109 без каких либо

серьезных побочных реакций [155]. Вопрос безопасности и переносимости таких высоких доз является одним из самых важных. Несмотря на то, что практически все клинические исследования в области внутривенной трансплантации МСК свидетельствовали об отсутствии существенных побочных эффектов, большинство из них использовали аллогенные клетки от одного донора, в то время как мы применяли трансплантацию клеток одному и тому же пациенту от разных доноров. Возможно, с этим фактом связано большее число таких эффектов от введения клеток, как лихорадка, озноб и сопутствующая им слабость, редко наблюдавшихся в других исследованиях. Тем не менее, в первом клиническом исследовании, использовавшем МСК при ИЛФ, выполненном Tzouvelekis е1 а1., повышение температуры тела регистрировалось у 50% больных после эндобронхиального введения аутологичных МСК жировой ткани [10]. Кратковременная лихорадка также являлась одним из наиболее частых нежелательных явлений после внутривенных инфузий аллогенных МСК при лечении ряда нелегочных заболеваний [156, 157]. В целом наши данные по безопасности соответствуют сформированному мнению о том, что частота нефатальных побочных эффектов в клинических исследованиях, использующих аллогенные МСК выше чем при трансплантации аутологичных клеток [158]. Остальные побочные эффекты были сходными по частоте в группах плацебо и клеточной терапии. Одна пациентка 74 лет перенесла ишемический инсульт через 29 дней после первых двух введений МСК, однако мы не связываем данное событие с проведенной терапией. Несмотря на то, что повышение риска инсульта описано при интракаротидном введении МСК у крыс и мышей и ассоциировано с размерами клеток [146], у человека терапия МСК рассматривается в качестве перспективы лечения инсультов, и даже при внутривенном введении приводит к уменьшению степени неврологического дефицита [159].

Уровень смертности в нашем исследовании между группами не отличался. Умерло по 2 пациента из каждой группы, причем это были наиболее тяжелые случаи заболевания с самыми низкими функциональными характеристиками. Из 5 включенным пациентов с исходным ЭЬСО < 25% от должного и дистанции 6-

минутного теста < 150 метров, умерло 4 больных, которые успели получить по 4 инфузии клеток (8 х 108). Очевидно, на данной стадии заболевания клеточная терапия в предложенном режиме является неэффективной. В других клинических исследованиях по терапии ИЛФ лишь в работе Glassberg et al. зафиксированы 2 летальных исхода (из 9 пациентов) при лечении МСК (один - от прогрессирования, а второй - от обострения ИЛФ) [13]. Ни мы, ни наши коллеги из цитированной работы не могли связать данные исходы с инфузиями МСК. Смерти и процедуры не были связаны хронологически, наблюдалось дальнейшее прогрессирование основного заболевания, явившееся причиной смерти.

Наши данные отличаются от результатов Chambers et al., которые наблюдали частичное увеличение диффузионной способности легких и фиброзного индекса уже через 3 месяца после единственной дозы 1 х 106/кг или 2 х 106/кг плацентарных МСК [12]. В нашем случае как пациенты, получившие 400 х 106 МСК, так и пациенты группы плацебо демонстрировали дальнейшее снижение легочной функции в течение первых 13 недель лечения. Это, вероятно, объясняется более тяжелым течением заболевания, чем в работе Chambers. Наши результаты по первым трем месяцам лечения ближе к данным Glassberg M et al., показавших падение ФЖЕЛ на 1,5% (наши данные -5,8%) и DLCO на 7% (наш результат 0%) [13]. Однако, в этом исследовании 6 из 7 больных получили дозу 20 или 100 млн МСК и только один закончивший лечение больной, которому ввели 200 млн клеток, имел через 3 месяца наилучшие показатели - прирост ФЖЕЛ на 2,2% и DLCO на 14,5% [13]. Дальнейшие введения МСК в нашей работе привели к достоверной разнице в динамике функциональных показателей между группами к 26 неделям в DLCO и дистанции 6-минутной ходьбы по сравнению с исходными цифрами. В дальнейшем к 39-й неделе после введения суммарной дозы МСК 1,2 х 109 достоверная разница в динамике наблюдалась в ФЖЕЛ, 6MWDT и систолического давления в легочной артерии. Эти различия сохранялись и к 52-й неделе исследования, кроме того, вновь была установлена достоверность в динамике диффузионной способности легких между группами, которая не выявлена на 39-й неделе. Таким образом, группа, получавшая лечение МСК, в целом

демонстрировала значимое снижение скорости падения DLCO и ФЖЕЛ, прирост дистанции 6-минутной ходьбы и падение давления в легочной артерии в сравнении с плацебо.

Мы предполагаем, что эффекты от введения МСК являются дозо-зависимыми. Так, применение разных доз (1 млн/кг, 5 млн/кг и 10 млн/ кг) у больных ОРДС приводило к соответственному снижению индекса повреждения легких на 30, 36 и 45%, а оценки полиорганной недостаточности по шкале SOFA (Sequential Organ Failure Assessment) на 4, 23 и 48% [154]. У пациентов с ишемической болезнью сердца по данным мета-анализа РКИ доза менее 50 млн клеток существенно не влияли на оцениваемые параметры, тогда как дозы 50-100 и 100-250 млн вели к росту фракции выброса левого желудочка и конечного диастолического объема [160]. Это вполне объяснимо, так как паракринный механизм действия трансплантированных МСК на сегодняшний день представляется наиболее вероятным. МСК и их кондиционные среды способны оказывать антифиброзный эффект путем подавления апоптоза эпителиальных и эндотелиальных клеток, торможения эпителиально-мезенхимального перехода, подавления активированных фибробластов и воспалительного ответа за счет собственной секреции противовоспалительных цитокинов и хемокинов (TSG-6, PGE2, IL-1ra, CXCR3, CCR5 ligand chemokines), молекул адгезии (ICAM-1 и VCAM-1), факторов роста (HGF, VEGF, EGF, KGF) и др. [78, 79, 161].

Таким образом, МСК можно рассматривать как поликомпонентное лекарство - источник растворимых противовоспалительных и антифиброзных факторов. Соответственно, увеличение доз и частоты введения клеток должно теоретически увеличивать их эффективность, но одновременно и повышать риски негативных эффектов. Изученная нами схема введения МСК при достоверном торможении скорости падения легочной функции не продемонстрировала тяжелых негативных реакций по сравнению с ранее проведенными исследованиями, использовавшими меньшие дозы МСК. Возможно, эффектом накопленной дозы объясняется критическое снижение систолического давления в легочной артерии лишь к 9-му месяцу лечения. Данный показатель был использован нами для

контроля, поскольку ассоциируется с тяжестью заболевания и десатурацией при выполнении 6-минутного теста [162].

Мы не получили достоверных различий с группой плацебо по фиброзному индексу, оцененному на КТВР. Вероятно, это объясняется с одной стороны малым числом участников исследования, а с другой тем, что, по нашему мнению, эффекты клеточной терапии реализуются преимущественно на уровне микроциркуляторного русла. С этим, очевидно, связан прирост диффузионной способности легких и снижение систолического давления в легочной артерии в группе терапии, более существенные чем динамика БУС, а также увеличение дистанции 6-минутной ходьбы. Мы предполагаем, что данный факт, который наблюдался и в других исследованиях по клеточной терапии легочного фиброза, связан системным ангиогенным эффектом МСК и улучшением микроциркуляции и трофики в скелетной мускулатуре. В животных моделях сахарного диабета, физической перегрузки, дисфункции диафрагмы введение разных типов МСК приводило к увеличению ангиогенеза в мышечной ткани, возрастанию кровотока, улучшению митохондриального резерва и работы мышц [163-165].

Проангиогенный эффект подтвержден также при протеомном анализе секретома МСК, показавшем, что клетки симультанно экспрессируют как противовоспалительные, так и ангиогенные факторы в ответ на воспалительное микроокружение [166]. Сосудистые эффекты МСК также хорошо продемонстрированы в терапии при экспериментальной легочной гипертензии -уменьшение толщины легочных сосудов и депозиции коллагена, улучшение легочной гемодинамики [167]. Однако подобные изменения очень трудно оценить на КТВР, что, по-видимому, объясняет функциональное улучшение пациентов без значительной динамики визуальной картины в легких. В целом, следует отметить, что фиброзные изменения по данным КТВР у больных как в группе плацебо, так и группе лечения МСК умеренно нарастали, что свидетельствует о продолжающемся фиброзном патологическом процессе, несмотря на лечение. Мы обратили внимание на то, у части пациентов в группе активной терапии исчезали небольшие области «матового стекла» в зонах ретикулярных изменений. Поскольку симптом

«матового стекла» обычно отражает присутствие воспалительных интерстициальных изменений, его исчезновение может свидетельствовать в пользу противовоспалительного эффекта МСК. Однако, в оценке фиброза наличие «матового стекла» не учитывалось, поскольку это возможный, но не основной КТВР признак ОИП. Таким образом, эти эффекты не влияли на динамику фиброзного индекса.

Как известно, пациенты с ИЛФ по характеру течения болезни могут быть разделены на 3 основные категории - быстро прогрессирующее течение, умеренно прогрессирующее и интермиттирующее (чередование периодов умеренной прогрессии с обострениями, сопровождающимися быстрым падением легочной функции) [14, 168]. Несмотря на то, что критерии включения в исследование (падение ФЖЕЛ или БЬСО > 10% за последний год), не полностью соответствовали тем, которые сейчас используются для характеристики «быстро прогрессирующего» фенотипа ИЛФ (ежегодное падение ФЖЕЛ > 10% или БЬСО > 15%) [3, 169], за исключением одного участника наши пациенты относятся к данной категории и имели на момент включения более высокую скорость падения ФЖЕЛ (-12,98±4,69%) и БЬСО (-19,52±6,20%), чем в среднем в популяции больных ИЛФ (-6,0 - 6,2%) [4]. Поскольку доказано, что факторами неблагоприятного прогноза у пациентов ИЛФ являются частые обострения, низкие показатели ФЖЕЛ и ЭЬСО, мужской пол и скорость падения легочной функции [170, 171], фактически мы первыми провели исследование эффектов МСК у больных ИЛФ наиболее агрессивного течения, имеющих худший прогноз. При этом наши пациенты в целом относились исходно к более тяжелой функциональной категории (ФЖЕЛ 56,88±15,3%; БЬСО 30,5±6,39% от должного), чем те, у которых проведены исследования современных антифиброзных препаратов нинтеданиба и пирфенидона, одобренных впоследствии для лечения ИЛФ [4, 5].

В данном исследовании мы использовали внутривенный путь введения МСК, как наиболее традиционный. Несмотря на то, что на экспериментальном этапе были доказаны сопоставимые эффекты при внутривенной и ингаляционной и

доставке клеток в легкие, в последнем случае были использованы дозы, на порядок большие для повышения респирабельной дозы, поэтому по экономическим соображениям от ингаляционной трансплантации МСК в данном протоколе было решено воздержаться.

Интересно, что смесь МСК от разных доноров демонстрирует большую иммуносупрессивную активность, чем пул клеток от одного донора [172]. Вероятно, это связано со значительной индивидуальной вариабельностью как пролиферативного, так и иммунотропного потенциала МСК, полученных от разных доноров [173]. Таким образом, использование МСК от разных доноров снижает риски терапии МСК со «слабым» иммуносупрессивным фенотипом, полученным от одного донора и может рассматриваться как один из вариантов стратегии длительной клеточной терапии. В нашем исследовании у 5 пациентов мы использовали МСК костного мозга, полученные у кровных родственников, а у оставшихся 5 больных - от разных доноров. При этом для минимизации вероятности снижения активности клеток и риска их мутаций использовались МСК не позднее 5 пассажа.

Исследование имеет определенные ограничения, прежде всего связанные с небольшим числом участников и единственным центром, в котором оно проводилось. Данным фактом мы можем объяснить колебания в динамике отдельных показателей, например, смену роста падением в ЭЬСО и дистанции 6-минутного теста между 26 и 39 неделями исследования, а также отсутствием достоверных отличий в оценке фиброза по данным КТВР. Кроме того, из-за небольшого числа пациентов, мы не смогли установить возможное влияние МСК на снижение числа обострений ИЛФ, которое наблюдалось в исследованиях антифиброзных препаратов. Статистическая мощность в нашей работе, рассчитанная для оценки ФЖЕЛ, составила 76% из-за ограниченного числа пациентов. Протокол не был ослепленным для исследователей. Мы не использовали катетеризацию легочной артерии для оценки артериального давления, поэтому данные по цифрам Ра могут отличаться от реальных цифр,

полученных при прямом измерении. В данной работе мы не исследовали распределение и выживаемость трансплантированных клеток в организме реципиентов, их влияние на цитологический анализ жидкости БАЛ, биомаркеры активности фиброзного процесса. Наконец, мы отдаем себе отчет в том, что предложенная схема введения клеток (через каждые 3 месяца) может быть не оптимальной, поскольку срок выживания МСК после трансплантации в организм реципиента обычно не превышает нескольких дней, таким образом, более частое введение, вероятно, приведет к лучшим результатам, однако, в силу необходимости решения организационных вопросов, связанных с госпитализацией больных, использованы 3-месячные интервалы для введения клеточного препарата.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Клеточные технологии рассматриваются в качестве перспективы лечения многих прогрессирующих хронических заболеваний, для которых методы лекарственной терапии или хирургического вмешательства в настоящее время не разработаны, дорогостоящи, либо недостаточно эффективны. Идиопатический легочный фиброз относится к данной категории болезней, для которых существуют теоретические основы трансплантации стволовых клеток, как источника противовоспалительных, ангиогенных и антипролиферативных факторов. Тем не менее, на сегодняшний день опубликованы результаты всего трех зарубежных клинических исследований первой фазы, доказавших безопасность и минимальную эффективность применения невысоких доз аутологичных или аллогенных мезенхимальных стволовых клеток у больных ИЛФ. Целью нашей работы было изучение путей введения, безопасности и эффективности более высоких доз МСК при ИЛФ, чем в предшествующих работах, как в эксперименте, так и в рамках пилотного клинического исследования. На основании обзора литературы, анализа ранее выполненных работ были разработаны протоколы экспериментального этапа и модель легочного фиброза у кроликов и клинического исследования у пациентов с быстро прогрессирующими формами ИЛФ.

На первом этапе были изучены возможности ингаляционной доставки жизнеспособных клеток в дыхательные пути, для чего оценили выживаемость МСК при их распылении через 3 модели небулайзеров - компрессорный (струйный), ультразвуковой и сетчатый (меш), показав, что максимальная выживаемость (72%) достигается при формировании аэрозоля компрессорным небулйзером. Данная модель была использована нами для последующего сравнения эффектов внутривенной и ингаляционной доставки аллогенных МСК кроликам, которым предварительно моделировался локальный легочный фиброз, для чего мы впервые использовали ультратонкий (неонатальный) фибробронхоскоп как при введении блеомицина, так и для получения бронхоальвеолярного лаважа при оценке эффектов лечения. Полученные данные

морфологического и иммуногистохимического исследования свидетельствовали о сопоставимой эффективности как внутривенного, так и ингаляционного введения (с перерасчетом дозы МСК на доставленную респирабельную фракцию).

На следующем этапе пилотного клинического исследования, прошедшего этическую экспертизу в ФГБУ ФНКЦ ФМБА России, на клинической базе которого выполнялась работа, и при регистрации на международном сайте клинических исследований СНтса1Тпа1в.§оу, 20 больных с ИЛФ были рандомизированы в 2 группы, получавшие либо аллогенные МСК (8 внутривенных инфузий по 200 млн. клеток в каждой) или плацебо (8 внутривенных инфузий 0,9% раствора натрия хлорида) в течение 39 недель с последующим 12-недельным наблюдением. Данное исследование стало первым, проведенным в условиях рандомизации и сравнения МСК с плацебо у пациентов ИЛФ, которое показало увеличение числа нетяжелых побочных эффектов в группе клеточной терапии, таких как транзиторная лихорадка, озноб и слабость, а также достоверное снижение скорости прогрессирования заболевания, улучшения физической выносливости и снижения систолического давления в легочной артерии по сравнению с плацебо. На наш взгляд, несмотря на определенные ограничения, результаты диссертации открывают возможность для дальнейших работ по изучению эффектов МСК как при ИЛФ, так и других видах патологии, прежде всего с точки зрения применения более высоких доз и частоты введения клеточных препаратов, а также разработки нового метода лечения фиброзных заболеваний легких.

87

ВЫВОДЫ

1. При формировании аэрозоля в разных видах небулайзеров наибольшая выживаемость МСК была выявлена в компрессорном небулайзере (72%), при использовании ультразвукового небулайзера наблюдалась гибель 90% клеток, а после прохождения через в сетчатый (меш) небулайзер живые клетки в аэрозольном конденсате не определялись.

2. При внутривенной и ингаляционной доставке аллогенных МСК костного мозга кроликам с экспериментальным блеомициновым фиброзом легких было выявлено существенное снижение степени выраженности фиброза в легких по модифицированной шкале Эшкрофта, депозиции коллагена в интерстиции при световой микроскопии, толщине межальвеолярных перегородок и числу внутриальвеолярных макрофагов по данным альвеолоскопии в сравнении с контрольной группой не леченного блеомицинового фиброза.

3. Эффекты, достигнутые в результате клеточной терапии экспериментального фиброза легких, достоверно не отличаются при внутривенном и ингаляционном введении клеточного препарата, за исключением существенно более низкого числа эндомикроскопически визуализированных внутрипросветных макрофагов в зоне блеомицинового поражения при ингаляционной доставке, чем при внутривенной инфузии МСК.

4. Терапия МСК в кумулятивной дозе 1,6 х 109 клеток у пациентов с ИЛФ сопровождалась большим числом нетяжелых побочных эффектов, в виде транзиторной лихорадки, озноба и слабости по сравнению с плацебо (26 против 15 эпизодов), которые быстро купировались и не требовали отмены клеточного препарата.

5. Внутривенные инфузии МСК в кумулятивной дозе 1,6 х 109 клеток у пациентов с ИЛФ к 52-й неделе от начала лечения приводили к существенному замедлению скорости падения ФЖЕЛ и диффузионной способности легких, увеличению дистанции 6-минутной ходьбы и снижению

систолического давления в легочной артерии, но не влияли на фиброзный индекс по данным КТВР в сравнении с группой плацебо.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Аллогенные мезенхимальные стволовые клетки могут рассматриваться в качестве терапевтического средства для лечения быстро прогрессирующих форм ИЛФ при непереностимости или недоступности противофиброзных препаратов. В качестве разовой безопасной терапевтической дозы рекомендуется 200 млн клеток, а суммарная безопасная доза может достигать 1 млрд 600 млн МСК.

2. Мезенхимальные стволовые клетки для внутривенного введения должны быть собраны с кондиционной среды не позднее, чем за 2 часа до начала инфузии, в стерильных условиях перенесены в 200-400 мл физиологического раствора при комнатной температуре, суспендированы путем медленного покачивания флакона в течение 3-х минут для равномерного распределения клеточного материала в объеме жидкости.

3. Клеточный препарат должен вводиться внутривенно медленно со средней скоростью 30 капель в минуту, используя систему для переливания компонентов крови (не для солевых растворов).

4. Для купирования пирогенной реакции, которая может возникнуть при инфузии клеточного препарата, следует использовать внутривенное болюсное введение 8 мг дексаметазона или 60 мг раствора преднизолона.

5. Для ингаляционной доставки стволовых клеток в дыхательные пути рекомендуется использование компрессорного небулайзера, при суспендировании клеточной массы в 10 мл физиологического раствора.

6. При планировании новых клинических исследований клеточных препаратов, расчета дозировок, частоты и кратности введения следует учитывать постепенное и дозозависимое развитие эффектов трансплантированных клеток

CnHCOK ^HTEPATYPM

1. Raghu, G. An official ATS/ERS/JRS/ALAT statement: idiopathic pulmonary fibrosis: evidence-based guidelines for diagnosis and management / G. Raghu, H.R. Collard, J.J. Egan, F.J. Martinez, J. Behr, et al. // Am J Respir Crit Care Med. - 2011. -Mar 15; 183(6). P. 788-824.

2. Navaratnam, V. The rising incidence of idiopathic pulmonary fibrosis in the UK / V. Navaratnam, K.M. Fleming, J. West, C.J. Smith, R.G. Jenkins, et al. // Thorax. - 2011.

- 66(6). - P. 462-7.

3. Ley, B, Clinical Course and Prediction of Survival in Idiopathic Pulmonary Fibrosis / B. Ley, H.R. Collard, T.E. King // Am J Respir Crit Care Med. - 2011. - 183.

- p. 431-40.

4. Richeldi, L. Efficacy and Safety of Nintedanib in Idiopathic Pulmonary Fibrosis / L. Richeldi, R.M. du Bois, G. Raghu, A. Azuma, K.K. Brown, et al. // New England J Med. - 2014. - 370. - P. 2071-2082.

5. King, T. A phase 3 trial of pirfenidone in patients with idiopathic pulmonary fibrosis / T. King, W. Bradford, S. Castro-Bernardini, E.A. Fagan, I. Glaspole, et al. // N Engl J Med. - 2014. - 370. - P. 2083-92.

6. Selman, M. Accelerated variant of idiopathic pulmonary fibrosis: clinical behavior and gene expression pattern / M. Selman, G. Carrillo, A. Estrada, M. Mejia, C. Becerril, et al. // PLoS ONE. - 2007. - 2:e482.

7. Toonkel, R.L. Mesenchymal stem cells and idiopathic pulmonary fibrosis: potential for clinical testing / R.L. Toonkel, J.M. Hare, M.A. Matthay, M.K. Glassberg // Am J Respir Crit Care Med. - 2013. - Jul 15; 188(2). - P. 133-40.

8. Wecht, S. Mesenchymal stem cells in the treatment of chronic lung disease / S. Wecht, M. Rojas // Respirology. - 2016 Nov; 21(8): 1366-1375.

9. Liu, M. Stem Cell and Idiopathic Pulmonary Fibrosis: Mechanisms and Treatment / M. Liu, D. Ren, D. Wu, J. Zheng, W. Tu // Curr Stem Cell Res Ther. - 2015. - 10(6). -P. 466-76.

10. Tzouvelekis, A. A prospective, non-randomized, no placebo-controlled, phase Ib clinical trial to study the safety of the adipose derived stromal cells-stromal vascular fraction in idiopathic pulmonary fibrosis / A. Tzouvelekis, V. Paspaliaris, G. Koliakos, Ntolios P, Bouros E, et al. // J Transl Med. - 2013. - 11: 171.

11. Ntolios, P. Longitudinal outcomes of patients enrolled in a phase Ib clinical trial of the adipose-derived stromal cells-stromal vascular fraction in idiopathic pulmonaryfibrosis / P. Ntolios, E. Manoloudi, A. Tzouvelekis, E. Bouros, P. Steiropoulos, et al. // Clin Respir J. - 2018. -12(6). - P. 2084-2089.

12. Chambers, D.C. A phase 1b study of placenta-derived mesenchymal stromal cells in patients with idiopathic pulmonary fibrosis / D.C. Chambers, D. Enever, N. Ilic, L. Sparks, K. Whitelaw, et al. // Respirology. 2014. - 19. - P. 1013-1018.

13. Glassberg, M.K. Allogeneic human mesenchymal stem cells in patients with idiopathic pulmonary fibrosis via intravenous delivery (AETHER): a phase I, safety, clinical trial / M.K. Glassberg, J. Minkiewicz, R.L. Toonkel // Chest. - 2017 May. -151(5). - P. 971-981.

14. Kim, D.S. Classification and natural history of the idiopathic interstitial pneumonias / D.S. Kim, H.R. Collard, T.E. King Jr. // Proc Am Thorac Soc. - 2006. - 3.

- P. 285-292.

15. Raghu, G. Incidence and prevalence of idiopathic pulmonary fibrosis / G. Raghu, D. Weycker, J. Edelsberg, W.Z. Bradford, G. Oster // Am J Respir Crit Care Med. - 2006.

- 174. - P. 810-816.

16. https://medvestnik.ru/content/medarticles/Vserossiiskii-registr-pacientov-s-ILF-sobral-dannye-bolee-chem-o-tysyache-pacientov.html.

17. Raghu, G. Current approaches to the management of idiopathic pulmonary fibrosis / G. Raghu, L. Richeldi // Respir Med. 2017 Aug. - 129. - P. 24-30.

18. Vancheri, C. Idiopathic pulmonary fibrosis: A disease with similarities and links to cancer biology / C. Vancheri, M. Failla, N. Crimi, G. Raghu // Eur. Respir. J. - 2010. -35. - P. 496-504.

19. Baumgartner, K.B. Cigarette smoking: a risk factor for idiopathic pulmonary fibrosis / K.B. Baumgartner, J.M. Samet, C.A. Stidley, T.V. Colby, J.A. Waldron // Am J Respir Crit Care Med. - 1997. - 155. - P. 242-248.

20. Ekström, M. Effects of smoking, gender and occupational exposure on the risk of severe pulmonary fibrosis: a population-based case-control study / M. Ekström, T. Gustafson, K. Boman, K. Nilsson, G. Tornling, et al. // BMJ Open. - 2014. -4(1):e004018.

21. Lee, M.G. A meta-analysis examining the association between the MUC5B rs35705950 T/G polymorphism and susceptibility to idiopathic pulmonary fibrosis / Lee MG, Lee YH. // Inflamm Res. - 2015. - 64(6). P. 463-470.

22. Sanders, Y.Y. Thy-1 promoter hypermethylation: a novel epigenetic pathogenic mechanism in pulmonary fibrosis / Y.Y. Sanders, A. Pardo, M. Selman, G.J. Nuovo, T.O. Tollefsbol, et al. // Am J Respir Cell Mol Biol. - 2008. - 39(5): - P. 610-618.

23. Travis, W.D. An official American Thoracic Society/European Respiratory Society statement: Update of the international multidisciplinary classification of the idiopathic interstitial pneumonias / W.D. Travis, U. Costabel, D.M. Hansell, T.E. King Jr, D.A. Lynch, et al. // Am J Respir Crit Care Med. - 2013 Sep 15. - 188(6). - P. 733-48.

24. Gustafson, T. Occupational exposure and severe pulmonary fibrosis / T. Gustafson, A. Dahlman-Höglund, K. Nilsson, K. Ström, G. Tornling, et al. // Respir Med. - 2007 Oct. - 101(10). - P. 2207-12.

25. Lee, S.H. Association between occupational dust exposure and prognosis of idiopathic pulmonary fibrosis: a Korean national survey / S.H. Lee, D.S. Kim, Y.W. Kim, M.P. Chung, S.T. Uh, et al. // Chest. - 2015. - 147(2). - P. 465-474 .

26. American Thoracic Society/European Respiratory Society International Multidisciplinary Consensus. Classification of the Idiopathic Interstitial Pneumonias. Am J Respir Crit Care Med. - 2002. - 165. - P. 277-304.

27. Raghu, G. Idiopathic pulmonary fibrosis in US Medicare beneficiaries aged 65 years and older: incidence, prevalence, and survival, 2001-11 / G. Raghu, S.Y. Chen, W.S. Yeh, B. Maroni, Q. Li, et al. // Lancet Respir Med. - 2014. - 2. - P. 566-572.

28. Selman, M. Revealing the pathogenic and aging-related mechanisms of the enigmatic idiopathic pulmonary fibrosis. an integral model / M. Selman, A. Pardo // Am J Respir Crit Care Med. - 2014 May 15. - 189(10). - P. 1161-72.

29. Vassilakis, D.A. Frequent genetic alterations at the microsatellite level in cytologic sputum samples of patients with idiopathic pulmonary fibrosis / D.A. Vassilakis, G. Sourvinos, D.A. Spandidos, N.M. Siafakas, D. Bouros, et al. // Am J Respir Crit Care Med. - 2000 Sep. - 162. - P. 1115-9.

30. Minagawa, S. Accelerated epithelial cell senescence in IPF and the inhibitory role of SIRT6 in TGF-P-induced senescence of human bronchial epithelial cells / S. Minagawa, J. Araya, T. Numata, S. Nojiri, H. Hara, et al. // Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2011 Mar. - 300(3). - P. L391-401.

31. Cardenes, N. Senescence of bone marrow-derived mesenchymal stem cells from patients with idiopathic pulmonary fibrosis / N. Cardenes, D. Alvarez, J. Sellares, Y. Peng, C. Corey, et al. // Stem Cell Res Ther. - 2018 Sep 26. - 9(1). - P. 257.

32. Selman, M. Aging and Pulmonary Fibrosis / M. Selman, I. Buendia-Roldan, A. Pardo // Rev Invest Clin. - 2016 Mar-Apr. - 68(2). - P. 75-83.

33. Tobin, R.W. Increased prevalence of gastroesophageal reflux in patients with idiopathic pulmonary fibrosis / R.W. Tobin, C.E. Pope, 2nd, C.A. Pellegrini, M.J. Emond, J. Sillery, et al. // Am J Respir Crit Care Med. - 1998. - 158. - P. 1804-1808.

34. Raghu, G. High prevalence of abnormal acid gastro-oesophageal reflux in idiopathic pulmonary fibrosis / G. Raghu, T.D. Freudenberger, S. Yang, J.R. Curtis, C. Spada, et al. // Eur Respir J. - 2006. - 27. - P. 136-142.

35. Savarino, E. Gastro-oesophageal reflux and gastric aspiration in idiopathic pulmonary fibrosis patients / Savarino E, Carbone R, Marabotto E. // Eur Respir J. - 2013. - 42. - P. 1322-1331.

36. Raghu, G. An Official ATS/ERS/JRS/ALAT Clinical Practice Guideline: Treatment of Idiopathic Pulmonary Fibrosis. An Update of the 2011 Clinical Practice Guideline / G. Raghu, B. Rochwerg, Y. Zhang, C.A. Garcia, A. Azuma, et al. // Am J Respir Crit Care Med. - 2015 Jul 15. - 192(2). - P. e3-e19.

37. Kreuter, M. Antacid therapy and disease outcomes in idiopathic pulmonary fibrosis: a pooled analysis / M. Kreuter, W. Wuyts, E. Renzoni, D. Koschel, T.M. Maher, et al. // Lancet Respir Med. - 2016 May. - 4(5). - P. 381-9.

38. Arase, Y. Usefulness of serum KL-6 for early diagnosis of idiopathic pulmonary fibrosis in patients with hepatitis C virus / Y. Arase, K. Ikeda, A. Tsubota, S. Saitoh, Y. Suzuki, et al. // Hepatol Res. - 2003. - 27. - P. 89-94.

39. Tang, Y.W. Herpesvirus DNA is consistently detected in lungs of patients with idiopathic pulmonary fibrosis / Y.W. Tang, J.E. Johnson, P.J. Browning, R.A. Cruz-Gervis, A. Davis, et al. // J Clin Microbiol. - 2003. - 41. - P. 2633-2640.

40. Vannella, K.M. Viruses as co-factors for the initiation or exacerbation of lung fibrosis / K.M. Vannella, B.B. Moore // Fibrogenesis Tissue Repair. - 2008 Oct 13. -1(1):2.

41. Han, M.K. Lung microbiome and disease progression in idiopathic pulmonary fibrosis: an analysis of the COMET study / M.K. Han, Y. Zhou, S. Murray, N. Tayob, I. Noth, et al. // Lancet Respir Med. - 2014. - 2. - P. 548-556.

42. Shulgina, L. Treating idiopathic pulmonary fibrosis with the addition of co-trimoxazole: a randomised controlled trial / L. Shulgina, A.P. Cahn, E.R. Chilvers, H. Parfrey, A.B. Clark, et al. // Thorax. - 2013. - 68. - P. 155-162.

43. Molyneaux, P.L. The role of infection in the pathogenesis of idiopathic pulmonary fibrosis / P.L. Molyneaux, T.M. Maher // Eur Respir Rev. - 2013 Sep 1. - 22(129). - P. 376-81.

44. Hodgson, U. Nationwide prevalence of sporadic and familial idiopathic pulmonary fibrosis: evidence of founder effect among multiplex families in Finland / U. Hodgson, T. Laitinen, P. Tukiainen // Thorax. - 2002. - 57. - P. 338-342.

45. Kropski, J.A. The genetic basis of idiopathic pulmonary fibrosis / J.A. Kropski, T.S. Blackwell, J.E. Loyd // Eur Respir J. - 2015 Jun. - 45(6). - P. 1717-27.

46. Seibold, M.A. A common MUC5B promoter polymorphism and pulmonary fibrosis / M.A. Seibold, A.L. Wise, M.C. Speer, M.P. Steele, K.K. Brown, et al. // N Engl J Med. - 2011. - 364. - P. 1503-1512.

47. Alder, J.K. Short telomeres are a risk factor for idiopathic pulmonary fibrosis / J.K. Alder, J.J. Chen, L. Lancaster, S. Danoff, S.C. Su, et al. // Proc Natl Acad Sci USA. -2008. - 105. - P. 13051-13056.

48. Stuart, B.D. Effect of telomere length on survival in patients with idiopathic pulmonary fibrosis: an observational cohort study with independent validation / B.D. Stuart, J.S. Lee, J. Kozlitina, I. Noth, M.S. Devine, et al. // Lancet Respir Med. - 2014. -2. - P. 557-565.

49. Calado, R.T. Telomeres in lung diseases / R.T. Calado // Prog. Mol. Biol. Transl. Sci. - 2014. - 125. - P. 173-183.

50. Hoffman, T.W. Pulmonary phenotypes associated with genetic variation in telomere-related genes / T.W. Hoffman, C.H.M. van Moorsel, R. Borie, B. Crestani // Curr. Opin. Pulm. Med. - 2018. - 24(3). - P. 269-280.

51. Planas-Cerezales, L. Predictive factors and prognostic effect of telomere shortening in pulmonary fibrosis / L. Planas-Cerezales, E.G. Arias-Salgado, I. Buendia-Roldán, A. Montes-Worboys, C.E. López, et al. // Respirology. - 2019 Feb;24(2): 146-153.

52. Fingerlin, T.E. Genome-wide imputation study identifies novel HLA locus for pulmonary fibrosis and potential role for auto-immunity in fibrotic idiopathic interstitial pneumonia / Fingerlin TE, Zhang W, Yang IV, Ainsworth HC, Russell PH, et al. // BMC Genet. - 2016 Jun 7. - 17(1):74.

53. Fernandez, I.E. New cellular and molecular mechanisms of lung injury and fibrosis in idiopathic pulmonary fibrosis / I.E. Fernandez, O. Eickelberg // Lancet. - 2012. -380(9842). - P. 680-688.

54. Loomis-King, H. Pathogenesis, current treatments and future directions for idiopathic pulmonary fibrosis / H. Loomis-King, K.R. Flaherty, B.B. Moore // Curr Opin Pharmacol. - 2013 Apr 18. - pii: S1471-4892(13)00049-0.

55. Kolahian, S. Immune mechanisms in pulmonary fibrosis / S. Kolahian, I.E. Fernandez, O. Eickelberg, D. Hartl // Am J Respir Cell Mol Biol. - 2016 May 5. - 55(3). - P. 309-22.

56. Raghu, G. Diagnosis of Idiopathic Pulmonary Fibrosis. An Official ATS/ERS/JRS/ALAT Clinical Practice Guideline / G. Raghu, M. Remy-Jardin, J.L.

Myers, L. Richeldi, C.J. Ryerson, et al. // Am J Respir Crit Care Med. - 2018 Sep 1. -198(5). - P. e44-e68.

57. Диагностика и лечение идиопатического легочного фиброза. Федеральные клинические рекомендации // Пульмонология. - 2016. - 26(4). - С. 399-420.

58. Noble, P.W. Pirfenidone in patients with idiopathic pulmonary fibrosis (CAPACITY): two randomised trials / P.W. Noble, C. Albera, W.Z. Bradford, U. Costabel, M.K. Glassberg, et al. // Lancet. - 2011. - 377(9779). - P. 1760-1769.

59. Nathan, S.D. Effect of pirfenidone on mortality: pooled analyses and meta-analyses of clinical trials in idiopathic pulmonary fibrosis / S.D. Nathan, C. Albera, W.Z. Bradford, U. Costabel, I. Glaspole, et al. // Lancet Respir Med. - 2017. - 5. - P. 33-41.

60. Richeldi, L. Nintedanib in patients with idiopathic pulmonary fibrosis: combined evidence from the TOMORROW and INPULSIS trials / L. Richeldi, V. Cottin, R.M. du Bois, M. Selman, T. Kimura, et al. // Respir Med. - 2016. - 113. - P. 74-9.

61. Vancheri, C. Nintedanib with add-on pirfenidone in idiopathic pulmonary fibrosis: results of the INJOURNEY Trial / C. Vancheri, M. Kreuter, L. Richeldi, C.J. Ryerson, D. Valeyre, et al. // Am J Respir Crit Care Med. - 2018. - 197. - P. 356-63.

62. Flaherty, K.R. Safety of nintedanib added to pirfenidone treatment for idiopathic pulmonary fibrosis / K.R. Flaherty, C.D. Fell, J.T. Huggins, H. Nunes, R. Sussman, et al. // Eur. Respir. J. 2018; 52(2). pii: 1800230.

63. Richeldi, L. Idiopathic pulmonary fibrosis / L. Richeldi, H.R. Collard, M.G. Jones // Lancet. - 2017 May 13. - 389(10082). - P. 1941-1952.

64. Cottin, V. Long-term safety of pirfenidone: results of the prospective, observational PASSPORT study / V. Cottin, D. Koschel, A. Günther, C. Albera, A. Azuma, et al. // ERJ Open Res. - 2018 Oct 19. - 4(4). - pii: 00084-2018.

65. Fletcher, S.V. Safety and tolerability of nintedanib for the treatment of idiopathic pulmonary fibrosis in routine UK clinical practice / S.V. Fletcher, M.G. Jones, E.A. Renzoni, H. Parfrey, R.K. Hoyles, et al. // ERJ Open Res. - 2018 Oct 19;4(4). - pii: 00049-2018.

66. Mason, D.P. Lung transplantation for idiopathic pulmonary fibrosis / D.P. Mason, M.E. Brizzio, J.M. Alster // Ann Thorac Surg. - 2007 Oct. - 84(4). -P. 1121-8.

67. Егоров, В.В. Стволовые клетки человека / В.В. Егоров, А.А. Иванов, М.А. Пальцев // Молекулярная медицина. - 2003. - № 2. - С. 3-14.

68. Kolios, G. Introduction to stem cells and regenerative medicine / G. Kolios, Y. Moodley // Respiration. - 2013. - 85(1). - P. 3-10.

69. Thoma, E.C. Parallel differentiation of embryonic stem cells into different cell types by a single gene-based differentiation system / E.C. Thoma, K. Maurus, T.U. Wagner, M. Schartl // Cell Reprogram. - 2012. - 14. - P. 106-11.

70. Guillot, P.V. Fetal stem cells: betwixt and between / P.V. Guillot, K. O'Donoghue, H. Kurata, N.M. Fisk // Semin Reprod Med. - 2006 Nov. - 24(5). -P. 340-7.

71. Вермель, А.Е. Столовые клетки: общая характеристика и перспективы применения в клинической практике / А.Е. Вермель // Клиническая медицина. -2004. - №1. - С. 5-10.

72. Фриденштейн, А.Я. Клетки предшественники для остеогенной и кроветворной тканей. Анализ гетеротопных трансплантантов костного мозга / А.Я. Фриденштейн, К.В. Петракова, А.И. Куролесова, Г.П. Фролова // Цитология. -1968. - № 5. - C. 557-67.

73. Le Blanc, K. HLA expression and immunologic properties of differentiated and undifferentiated mesenchymal stem cells / K. Le Blanc, C. Tammik, K. Rosendahl, E. Zetterberg, O. Ringden // Exp Hematol. - 2003. - 31. - P. 890-6.

74. Zakrzewski, W. Stem cells: past, present, and future / W. Zakrzewski, M. Dobrzynski, M. Szymonowicz, Z. Rybak // Stem Cell Res Ther. - 2019. - 10. - 68.

75. Cell Therapy for Lung Disease. Ed: Julia Polak. - Imperial College Press, London; 2010. - 529 pp.

76. Rojas, M. Bone marrow-derived mesenchymal stem cells in repair of the injured lung / M. Rojas, J. Xu, C.R. Woods, A.L. Mora, W. Spears, et al. // Am J Respir Cell Mol Biol. - 2005. - 33. - P. 145-152.

77. Xu, J. Role of the SDF-1/CXCR4 axis in the pathogenesis of lung injury and fibrosis / J. Xu, A. Mora, H. Shim, Stecenko A, Brigham KL, et al. // Am J Respir Cell Mol Biol. - 2007. - 37. - P. 291-299.

78. Ortiz, L.A. Interleukin 1 receptor antagonist mediates the antiinflammatory and antifibrotic effect of mesenchymal stem cells during lung injury / L.A. Ortiz, M. DuTreil, C. Fattman, A.C. Pandey, G. Torres, et al. // Proc Nat Acad Sci. - 2007. - 104. - 1100211007.

79. Lee, S.H. Modulation of cytokine and nitric oxide by mesenchymal stem cell transfer in lung injury/fibrosis / S.H. Lee, A.S. Jang, Y.E. Kim, J.Y. Cha, T.H. Kim, et al. // Respir Res. - 2010. - 11. - 16.

80. Cargnoni, A. Conditioned medium from amniotic membrane-derived cells prevents lung fibrosis and preserves blood gas exchanges in bleomycin-injured mice-specificity of the effects and insights into possible mechanisms / A. Cargnoni, E.C. Piccinelli, L. Ressel // Cytotherapy. - 2014 Jan. - 16(1). - P. 17-32.

81. Rathinasabapathy, A. Therapeutic potential of adipose stem cell-derived conditioned medium against pulmonary hypertension and lung fibrosis / A. Rathinasabapathy, E. Bruce, A. Espejo, A. Horowitz, D.R. Sudhan, et al. // Br J Pharmacol. - 2016 Oct. - 173(19). - P. 2859-79.

82. Islam, M.N. Mitochondrial transfer from bone-marrow-derived stromal cells to pulmonary alveoli protects against acute lung injury / M.N. Islam, S.R. Das, M.T. Emin, M. Wei, L. Sun, et al. // Nat Med. - 2012. - 18. - P. 759-765.

83. Sinclair, K. Characterization of intercellular communication and mitochondrial donation by mesenchymal stromal cells derived from the human lung / K. Sinclair, S. Yerkovich, P. Hopkins, D.C. Chambers // Stem Cell Res Ther. - 2016. - 7(1): 91.

84. Kotton, D.N. Bone marrow-derived cells as progenitors of lung alveolar epithelium / D.N. Kotton, B.Y. Ma, W.V. Cardoso, E.A. Sanderson, R.S. Summer, et al. // Development. - 2001. - 128. - P. 5181-8.

85. Wang, G. Adult stem cells from bone marrow stroma differentiate into airway epithelial cells: potential therapy for cystic fibrosis / G. Wang, B.A. Bunnell, R.G. Painter, B.C. Quiniones, S. Tom, et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2005. - 102. - P. 186-91.

86. Krause, D.S. Multi-organ, multi-lineage engraftment by a single bone marrow-derived stem cell / D.S. Krause, N.D. Theise, M.I. Collector, O. Henegariu, S. Hwang, et al. // Cell. - 2001. - 105. - P. 369-77.

87. Loi, R. Limited restoration of cystic fibrosis lung epithelium in vivo with adult bone marrow-derived cells / R. Loi, T. Beckett, K.K. Goncz, B.T. Suratt, D.J. Weiss // Am. J. Respir. Crit. Care Med. - 2006. - 173. - P. 171-9.

88. Chang, J.C. Evidence that bone marrow cells do not contribute to the alveolar epithelium / J.C. Chang, R. Summer, X. Sun, K. Fitzsimmons, A. Fine // Am J Respir Cell Mol Biol. - 2005. - 33(4). -P. 335-342.

89. Lee, J.W. Potential application of mesenchymal stem cells in acute lung injury / J.W. Lee, N. Gupta, V. Serikov // Expert Opin. Biol. Ther. - 2009 Oct. - 9(10). -P. 125970.

90. Демура, С.А. Морфология и молекулярные основы повреждения ниши стволовых клеток респираторного ацинуса при идиопатических интерстициальных пневмониях / С.А. Демура, Е.А. Коган, В.С. Пауков // Архив патологии. - 2014. -Т. 76, № 6. - С. 28-36.

91. Liu, X. The glandular stem/progenitor cell niche in airway development and repair / Liu X, Engelhardt JF // Proc Am Thorac Soc. - 2008. - 5. - P. 682-688.

92. Hong, K.U. In vivo differentiation potential of tracheal basal cells: evidence for multipotent and unipotent subpopulations / K.U. Hong, S.D. Reynolds, S. Watkins, E. Fuchs, B.R. Stripp // Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. - 2004. - 286. - P. L643-L649.

93. Reynolds, S.D. Clara cell: Progenitor for the bronchiolar epithelium / S.D. Reynolds, A.M. Malkinson // Int J Biochem Cell Biol. - 2010. - 42. - P. 1-4.

94. Wang, J. Differentiated human alveolar epithelial cells and reversibility of their phenotype in vitro / J. Wang, K. Edeen, R. Manzer // Am J Respir Cell Mol Biol. - 2007. - 36(6). - P. 661-668.

95. Willis, B.C. TGF-beta-induced EMT: mechanisms and implications for fibrotic lung disease / B.C. Willis, Z. Borok // Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. - 2007. -293(3). - P. L525-L534.

96. Herrera, J. Extracellular matrix as a driver of progressive fibrosis / J. Herrera, C.A. Henke, P.B. Bitterman // J Clin Invest. - 2018 Jan 2. - 128(1). - P. 45-53.

97. Fuchs, E. Socializing with the neighbors: stem cells and their niche / E. Fuchs, T. Tumbar, G. Guasch // Cell. - 2004. - 116. - P. 769-778.

98. Wernly, B. Regenerative Cardiovascular Therapies: Stem Cells and Beyond / B. Wernly, M. Mirna, R. Rezar, C. Prodinger, C. Jung, et al. // Int J Mol Sci. - 2019 Mar 21. - 20(6). - pii: E1420.

99. Cao, Z. Targeting the vascular and perivascular niches as a regenerative therapy for lung and liver fibrosis / Cao Z, Ye T, Sun Y, Ji G, Shido K, et al. // Sci Transl Med. -2017 Aug 30. - 9(405). - pii: eaai8710.

100. Krentsis, M.I. Lung Injury Repair by Transplantation of Adult Lung Cells Following Preconditioning of Recipient Mice / M.I. Krentsis, C. Rosen, E. Shezen, A. Aronovich, B. Nathanson, et al. // Stem Cells Transl Med. - 2018 Jan. - 7(1). - P. 68-77.

101. Ortiz, L.A. Mesenchymal stem cell engraftment in lung is enhanced in response to bleomycin exposure and ameliorates its fibrotic effects / L.A. Ortiz, F. Gambelli, C. McBride, D. Gaupp, M. Baddoo, et al. // Proc Natl Acad Sci U S A. - 2003 Jul 8. -100(14). - P. 8407-11.

102. Moodley Y. Human amnion epithelial cell transplantation abrogates lung fibrosis and augments repair / Y. Moodley, S. Ilancheran, C. Samuel // Am. J. Respir. Crit. Care Med. - 2010 Sep 1. - 182(5). - P. 643-51.

103. Moodley, Y. Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells Reduce Fibrosis of Bleomycin-induced lung injury / Y. Moodley, D. Atienza, U. Manuelpillai, C.S. Samuel, J. Tchongue, et al. // Am. J. Pathol. - 2009 July. - 175(1). - P. 303-313.

104. Kumamoto, M. Minimally cultured bone marrow mesenchymal stem cells ameliorate fibrotic lung injury / M. Kumamoto, T. Nishiwaki, N. Matsuo, H. Kimura, K. Matsushima // Eur Respir J. - 2009. - 34. - P. 740-748.

105. Lan, Y.W. Hypoxia-preconditioned mesenchymal stem cells attenuate bleomycin-induced pulmonary fibrosis / Y.W. Lan, K.B. Choo, C.M. Chen, T.H. Hung, Y.B. Chen, et al. // Stem Cell Res Ther. - 2015 May 20. - 6:97.

106. Fazekasova, H. Placenta-derived MSCs are partially immunogenic and less immunomodulatory than bone marrow-derived MSCs / H. Fazekasova, R. Lechler, K. Langford, G. Lombardi // J Tissue Eng Regen Med. - 2011 Oct. - 5(9). - P. 684-94.

107. Lee, J.M. Comparison of immunomodulatory effects of placenta mesenchymal stem cells with bone marrow and adipose mesenchymal stem cells / J.M. Lee, J. Jung, H.J. Lee, S.J. Jeong, K.J. Cho, et al. // Int Immunopharmacol. - 2012 Jun. - 13(2). - P. 219-24.

108. Barczyk, M. Stem Cell-Based Therapy in Idiopathic Pulmonary Fibrosis / M. Barczyk, M. Schmidt, S. Mattoli // Stem Cell Rev. - 2015 Aug. - 11(4). - P. 598-620.

109. Martin, A.R. Nebulizers for drug delivery to the lungs / A.R. Martin, W.H. Finlay // Expert Opin Drug Deliv. - 2015 Jun. - 12(6). - P. 889-900.

110. Assis, A.C. Time-dependent migration of systemically delivered bone marrow mesenchymal stem cells to the infarcted heart / A.C. Assis, J.L. Carvalho, B.A. Jacoby, R.L. Ferreira, P. Castanheira, et al. // Cell Transplant. - 2010. - 19(2). - P. 219-230.

111. Kraitchman, D.L. Dynamic imaging of allogeneic mesenchymal stem cells trafficking to myocardial infarction / D.L. Kraitchman, M. Tatsumi, W.D. Gilson, T. Ishimori, D. Kedziorek, et al. // Circulation. - 2005. - 112(10). - P. 1451-1461.

112. Eggenhofer, E. Mesenchymal stem cells are short-lived and do not migrate beyond the lungs after intravenous infusion / E. Eggenhofer, V. Benseler, A. Kroemer, F.C. Popp, E.K. Geissler, et al. // Front Immunol. - 2012 Sep 26. - 3. -297.

113. Reddy, M. Human adipose-derived mesenchymal stem cells attenuate early stage of bleomycin induced pulmonary fibrosis: comparison with pirfenidone / M. Reddy, L. Fonseca, S. Gowda, B. Chougule, A. Hari, et al. // Int J Stem Cells. -2016. - 9. - P. 192206.

114. Zhang, E. Efficacy of bone marrow mesenchymal stem cell transplantation in animal models of pulmonary fibrosis after exposure to bleomycin: A meta-analysis / E. Zhang, Y. Yang, J. Zhang, G. Ding, S. Chen, et al. // Exp Ther Med. - 2019 Mar. - 17(3). - P. 2247-2255.

115. Srour, N. Mesenchymal Stromal Cells in Animal Bleomycin Pulmonary Fibrosis Models: A Systematic Review / N. Srour, B. Thebaud // Stem Cells Transl Med. - 2015 Dec. - 4(12). - P. 1500-10.

116. Tashiro, J. Exploring animal models that resemble idiopathic pulmonary fibrosis / J. Tashiro, G.A. Rubio, A.H. Limper, K. Williams, S.J. Elliot, et al. // Front Med (Lausanne). - 2017. - 4. - P. 118.

117. Borzone, G. Bleomycin induced chronic lung damage does not resemble human idiopathic pulmonary fibrosis / G. Borzone, R. Moreno, R. Urrea, M. Meneses, M. Oyarzun, et al. // Am. J. Respir. Crit. Care Med. - 2001. - 163. - P. 1648-1653.