Молекулярно-биологические методы в системе контроля качества сырья при производстве культуральных инактивированных противоящурных и антирабических вакцин тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, доктор наук Доронин Максим Игоревич

• Доронин Максим Игоревич
• доктор наук
• 2022

Оглавление диссертации доктор наук Доронин Максим Игоревич

1.1 Актуальность темы

1.2 Степень разработанности темы

1.3 Цель и задачи исследования

1.4 Научная новизна исследования

1.5 Теоретическая и практическая значимость работы

1.6 Методология и методы исследования

1.7 Основные положения, выносимые на защиту

1.8 Личный вклад соискателя

1.9 Апробация результатов исследования

1.10 Объем и структура диссертации

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1 Строение и свойства вирусов ящура и бешенства

2.1.1 Строение вирусов ящура и бешенства

2.1.2 Генетическое и антигенное разнообразие вирусов ящура и бешенства

2.1.3 Репродукция вирусов ящура и бешенства в клеточных линиях

2.2 Меры профилактики ящура и бешенства

2.3 Контроль качества сырья для изготовления противоящурных и антирабических вакцин

2.3.1 Схема контроля качества сырья для противоящурных и антирабических вакцин

2.3.2 Методы определения полноты инактивации вирусов ящура и бешенства

в сырье для производства вакцин

2.3.3 Спектрометрические методы определения концентрации иммуногенных компонентов и методы оценки титра инфекционной активности вирусов в сырье для производства противоящурных и антирабических вакцин

2.4 Молекулярно-биологические методы, применяемые для определения

содержания вируса в биоматериале

2.4.1 Полимеразная цепная реакция

2.4.2 Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени

2.4.3 Математические модели анализа количественных данных в ПЦР в режиме реального времени

2.4.4 Характеристика метода амплификации вирусной РНК (КАББА)

2.4.5 Применение молекулярно-биологических методов для определения

полноты инактивации вирусов

2.5 Заключение по обзору литературы

3 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1 Материалы

3.2 Методы

4 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

4.1 Разработка и применение количественных молекулярно-биологических методов опосредованного определения вирусов ящура и бешенства в сырье

для вакцин

4.1.1 Методы спектрометрического опосредованного определения концентрации иммуногенных компонентов вирусов ящура и бешенства в вирусосодержащем сырье для вакцин

4.1.2 Разработка олигонуклеотидных праймеров и зондов для проведения количественного молекулярно-биологического анализа сырья для изготовления противоящурных и антирабических вакцин

4.1.3 Методы опосредованного определения концентрации иммуногенных компонентов вирусов ящура и бешенства в сырье для вакцин с помощью ОТ-ПЦР-РВ

4.1.4 Методы опосредованного определения концентрации иммуногенных компонентов вирусов ящура и бешенства в сырье для вакцин при сравнении максимальных экстремумов графиков второй производной для кривых накопления флуоресцентного сигнала

4.1.5 Методы опосредованного определения титра инфекционной активности вирусов ящура и бешенства в вирусосодержащем сырье для вакцин с применением количественной ОТ-ПЦР-РВ пороговым способом

4.1.6 Методы опосредованного определения титра инфекционной активности вирусов ящура и бешенства в вирусосодержащем сырье для вакцин с применением изотермической амплификации и детекции РНК-ампликонов с

помощью технологии молекулярных биконов (NASBA)

4.1.7 Методы опосредованного контроля полноты инактивации вирусов

ящура и бешенства в сырье для вакцин с применением ОТ-ПЦР

4.1.8 Метод опосредованного определения полноты инактивации вируса

ящура в сырье для вакцин с применением nested ОТ-ПЦР-РВ

5 ОБСУЖДЕНИЕ

6 ЗАКЛЮЧЕНИЕ

6.1 Итоги выполенных исследований

6.2 Практические предложения

6.3 Перспективы дальнейшей разработки темы

7 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

8 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

9 ПРИЛОЖЕНИЯ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Молекулярно-биологические методы в системе контроля качества сырья при производстве культуральных инактивированных противоящурных и антирабических вакцин»

1 ВВЕДЕНИЕ 1.1 Актуальность темы

За последние 30 лет для диагностики инфекционных заболеваний и контроля качества сырья при изготовлении вакцин для профилактики особо опасных и экономически значимых болезней сельскохозяйственных животных стали широко применяться молекулярно-биологические методы анализа, которые постепенно вытесняют классические методы исследования [274].

Ящур - особо опасное, карантинное, высококонтагиозное заболевание парнокопытных и мозоленогих животных, которое вызывает РНК(+)-содержащий вирус порядка Picornavirales семейства Picornaviridae рода Aphthovirus с длиной нуклеиновой кислоты около 8500 н.о. [39, 72, 76, 90, 113]. При репродукции вируса ящура в биологических системах формируются 146S компонент (полные частицы, основной иммуногенный компонент), состоящий из одной молекулы вирусной РНК и 60 копий полипептида, каждая из которых представлена комплексом белков VP1-VP2-VP3-VP4 [103].

Бешенство является одним из опасных зоонозов, который приводит к поражению центральной нервной системы, энцефаломиелитам, параличам с неизбежным летальным исходом, вызывается РНК(-)-содержащим вирусом порядка Mononegavirales семейства Rhabdoviridae рода Lyssavirus вида Rabies lyssavirus с длиной нуклеиновой кислоты около 12000 н.о. [23, 245]. РНК вируса бешенства в консервативном линейном порядке кодирует нуклеопротеин (N-белок), фосфопротеин (P-белок), матриксный белок (М-белок), гликопротеин (G-белок), РНК-зависимую РНК-полимеразу (L-белок). РНК, N-, P- и L-белок образуют рибонуклеопротеин, который является основным иммуногенным компонентом вакцинных препаратов против бешенства [313].

Оба заболевания приводят к значительным экономическим потерям, которые связаны с гибелью животных, ликвидацией последствий вспышек болезни, введением строгих ограничений, налагаемых на внутреннюю и международную торговлю продукцией животноводства, проведением профилактических и карантинных мероприятий и др. [23, 72, 175, 314].

В соответствии с Кодексом наземных животных и Руководством МЭБ по диагностическим тестам и вакцинам для борьбы с ящуром и бешенством рекомендуется вакцинопрофилактика. Эффективность вакцин зависит от содержания иммуногенных компонентов вирусов в препаратах [75].

Контроль качества сырья для изготовления вакцин против ящура и бешенства предполагает определение титра инфекционной активности, концентрации иммуногенных компонентов и полноты инактивации вирусов. Исследования сырья осуществляют на основе комплекса вирусологических и серологических методов анализа. Для определения титра вируса при анализе в монослое клеточных линий к недостаткам относятся: продолжительность по времени выдачи результатов анализа (не менее 72 ч); определенная степень субъективности при оценке полученных данных; возможное получение сомнительных результатов из-за неспецифических процессов деградации монослоя культуры клеток. В последние десятилетия для исследования полноты инактивации стали применять культуры клеток, ограничения в использовании которых представлены выше. В отношении реакции связывания комплемента (РСК), применяемой для определения концентрации 146 Б компонента вируса ящура, отмечают трудоемкость и продолжительность проводимого анализа, невозможность одновременного исследования большого количества проб, многокомпонентность тест-системы и необходимость титрования всех составляющих реакции [7, 126]. Для определения концентрации рибонуклеопротеина вируса бешенства используют иммуноферментный анализ, при котором возможно наличие в тестируемых образцах ингибиторов и стимуляторов активности ферментов; реакция многокомпонентная и многостадийная, предполагает получение биологических компонентов с различной степенью их стабильности; необходимость титрования компонентов реакции [207, 214].

Контроль производства вакцин - технологический процесс, в котором важно снижать время проведения анализа и достоверно исследовать большое количество проб, полученных на различных этапах изготовления вакцинных препаратов. Усовершенствование контроля качества сырья с помощью экспресс-методов, позволяющих получать результаты с высокими показателями чувствительности и специфичности анализа, является актуальным.

1.2 Степень разработанности темы

В настоящее время известны разные варианты ОТ-ПЦР и ОТ-ПЦР-РВ для детекции вирусов ящура и бешенства [222, 235]. Существует опыт по применению молекулярно-биологических методов для определения полноты инактивации вирусов. Так, метод ОТ-ПЦР с последующей детекцией продуктов реакции с помощью гель-электрофореза, а также биофизический метод с применением рестрикционного и электрофоретического анализа применяются для определения остаточной вирулентности вирусов КЧС, АЧС, инфекционного бронхита кур, эховирусов и др. [36, 99, 101]. В целом, на сегодняшний день мало научной информации об использовании именно этого подхода в исследовании полноты инактивации микроорганизмов. Сведения о разработке методов ОТ-ПЦР и ОТ-ПЦР-РВ для определения полноты инактивации вирусов ящура и бешенства в сырье для вакцин в литературе не обнаружены.

ОТ-ПЦР-РВ возможно применять для качественного и количественного анализа, причем не только копий кДНК, но и концентрации иммуногенных компонентов и титра инфекционной активности вирусов. За инфекционную активность ответственны полные частицы вирусов ящура и бешенства [104, 199]. Вирионы данных вирусов содержат одну молекулу нуклеиновой кислоты, при детекции которой молекулярно-биологическими методами можно опосредованно судить о содержании вируса в исследуемом образце. ПЦР-РВ применяют для контроля в сырье для вакцин концентрации вирионов вируса оспы [169], титра инфекционной активности вируса лесов Семлики [254], вируса инфекционного ларинготрахеита [158], лентивирусов [299], вируса болезни Ньюкасла [197], коронавируса 8ЛЯ8-СоУ-2 [115, 137], вируса инфекционного некроза поджелудочной железы [246] и др.

В мировой практике широко применяется пороговый способ определения концентрации аналита, а также некоторые варианты прямого сравнения графиков накопления флуоресцентного сигнала, в частности, с использованием вторых производных функций [85, 147]. На сегодняшний день сведения о разработке метода ОТ-ПЦР-РВ с применением порогового способа и прямого сравнения графиков накопления ампликонов для определения титра инфекционной активности вирусов ящура и бешенства и

концентрации их иммуногенных компонентов в сырье для вакцин не обнаружены.

К числу молекулярно-биологических методов с возможностями количественного анализа относят также метод Nucleic Acid Sequence-Based Amplification (NASBA), который находит применение как в медицинской, так и ветеринарной практике [202, 263]. В настоящее время тест-системы NASBA применяются для определения концентрации вирионов вируса гепатита, цитомегаловирусной инфекции, вирусов сем. Coronaviridae [294]. Сведения о разработке количественной NASBA для определения титра инфекционной активности вирусов ящура и бешенства в сырье для изготовления вакцин в литературе отсутствуют.

Различные варианты спектрометрических методов широко применяются для лабораторного анализа в медицинской и ветеринарной практике, в частности, используются при определение оптического сигнала в ИФА, РСК для качественного и количественного выявления связанных в иммунные комплексы с последующим окрашиванием антигенов широкого спектра возбудителей и антител к ним [166, 323]. В литературе не обнаружены сведения о совмещении серологического этапа формирования иммунных комплексов на подложке с последующим их снятием, выделением и количественным анализом содержания в полученном элюате нуклеиновой кислоты. Для исследования степени чистоты экстрактов РНК используют спектральный анализ [179]. Сведений о разработке спектрометрических методов для определения концентрации иммуногенных компонентов вирусов ящура и бешенства по количеству нуклеиновой кислоты в сырье для вакцин в литературе не обнаружено.

1.3 Цели и задачи исследований

Целью работы являлась разработка и применение молекулярно-биологических методов для контроля качества сырья при производстве противоящурных и антирабических вакцин.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. усовершенствовать контроль качества сырья для изготовления противоящурных и антирабических вакцин с помощью разработанных

спектрометрических методов опосредованного определения концентрации иммуногенных компонентов вирусов;

2. разработать оригинальные олигонуклеотидные праймеры и зонды для проведения количественного молекулярно-биологического анализа качества сырья для изготовления противоящурных и антирабических вакцин;

3. разработать методы опосредованного определения концентрации 146S компонента вируса ящура и рибонуклеопротеина вируса бешенства в сырье для вакцин с применением порогового способа и технологии прямого сравнения максимальных экстремумов графиков второй производной кривых ОТ-ПЦР-РВ;

4. усовершенствовать контроль качества сырья для изготовления противоящурных и антирабических вакцин с помощью разработки методов опосредованного определения титра инфекционной активности вирусов ящура и бешенства с применением порогового способа в ОТ-ПЦР-РВ и NASBA;

5. сконструировать положительные контроли в виде модифицированных вариантов плазмиды p Jet 1.2 sf GFP, применяемых в разработанных молекулярно-биологических методах для контроля качества сырья на всех этапах изготовления вакцин против ящура и бешенства;

6. с помощью ОТ-ПЦР и ОТ-ПЦР-РВ разработать методы опосредованного контроля полноты инактивации вирусов ящура и бешенства в сырье для изготовления инактивированных вакцин;

7. применить разработанные методы для расчета концентрации компонентов при изготовлении противоящурных и антирабических вакцин и провести на животных исследования эффективности полученных образцов вакцин для доказательства достоверности результатов, полученных с помощью предложенных методов.

1.4 Научная новизна исследования

Научная новизна состоит в том, что:

1. результаты проведенных исследований по разработке методов опосредованного определения концентрации иммуногенных компонентов вирусов спектрометрическим методом позволили модернизировать схему

контроля качества сырья для изготовления противоящурных и антирабических вакцин, тем самым, повысив точность и воспроизводимость результатов;

2. на основе анализа более 830 и 1900 нуклеотидных полногеномных последовательностей кДНК вирусов ящура и бешенства, соответственно, определены их наиболее консервативные области, разработан дизайн 42 оригинальных олигонуклеотидных праймеров и зондов, а также доказана эффективность их использования для проведения количественного молекулярно-биологического анализа качества сырья для изготовления противоящурных и антирабических вакцин;

3. результаты исследований по разработке методов опосредованного определения концентрации 146 S компонента вируса ящура и рибонуклеопротеина вируса бешенства с применением порогового способа и технологии прямого сравнения максимальных экстремумов графиков второй производной кривых ОТ-ПЦР-РВ позволили усовершенствовать контроль качества сырья для противоящурных и антирабических вакцин, что сократило время анализа и дало возможность улучшить диагностические показатели тест-систем;

4. на основе результатов разработки методов опосредованного определения титра инфекционной активности вирусов ящура и бешенства с применением порогового способа в ОТ-ПЦР-РВ и NASBA установлена прямая корреляционная зависимость значений Ct от титра инфекционности, и усовершенствована схема контроля качества сырья для изготовления противоящурных и антирабических вакцин;

5. проведенные исследования позволили сконструировать положительные контроли в виде модифицированных вариантов плазмиды p Jet 1.2 sf GFP, применяемых в разработанных молекулярно-биологических методах для оценки качества сырья на всех этапах изготовления вакцин против ящура и бешенства;

6. на основе разработки методов опосредованного контроля полноты инактивации вирусов ящура и бешенства в сырье для изготовления вакцин с помощью ОТ-ПЦР и ОТ-ПЦР-РВ модернизирована система контроля инактивированного сырья для вакцин;

7. применение разработанных молекулярно-биологических методов контроля качества сырья противоящурных и антирабических вакцин позволяло провести точное определение концентрации антигена и изготовить вакцины, эффективность которых подтверждена на животных, тем самым, была доказана достоверность результатов, полученных с помощью разработанных методов.

1.5 Теоретическая и практическая значимость работы

Разработаны спектрометрические методы для опосредованного определения концентрации 146 Б компонента вируса ящура и рибонуклеопротеина вируса бешенства в сырье для вакцин, что позволяет заменить классические методы РСК и ИФА, проводить анализ в течение 1,5 ч и, тем самым, сократить сроки контроля в 32 раза по сравнению с РСК и в 16 раз по сравнению с ИФА, увеличить количество исследуемых проб. Чувствительность и специфичность тест-систем не менее 98,17%, корреляция с достоверностью не менее 83,9% при 95%-ном доверительном интервале. На основе анализа более 830 и 1900 нуклеотидных полногеномных последовательностей кДНК вирусов ящура и бешенства впервые разработан дизайн 42 оригинальных олигонуклеотидных праймеров и зондов, что позволило с высокой специфичностью и точностью проводить количественный молекулярно-биологический анализ качества сырья для изготовления противоящурных и антирабических вакцин. На основе данных олигонуклеотидов был разработан ряд методов, дающих возможность определять концентрацию иммуногенных компонентов, титр инфекционной активности и полноту инактивации вирусов ящура и бешенства. Впервые созданы 2 тест-системы ОТ-ПЦР-РВ с оригинальными олигонуклеотидными праймерами, зондами и формулами для опосредованного определения концентрации 146S частиц вируса ящура и рибонуклеопротеина вируса бешенства в сырье для вакцин, позволяющие получать результаты в 12 раз быстрее по сравнению с РСК, в 6 раз быстрее по сравнению с ИФА и одновременно исследовать в 12 раз больше проб в сравнении с РСК. Разработанные методы характеризуются чувствительностью, равной 98,64100,0%, специфичностью - 98,17-100,00%, корреляцией результатов с классическими методами с достоверностью не ниже 82,5% и выше в 95%-ном

доверительном интервале. Впервые разработаны 2 тест-системы для опосредованного определения концентрации вирионов вируса ящура и рибонуклеопротеина вируса бешенства в сырье для вакцин при сравнении максимальных экстремумов графиков второй производной с применением оригинальных праймеров, зондов и расчетных формул, позволяющих сократить время проведения контроля в 12 раз по сравнению с РСК, в 6 раз по сравнению с ИФА, повысить достоверность получаемых результатов до 94,8-100,0%, с чувствительностью - 98,30-99,99%, специфичностью - 98,17100,00% в 95%-ном доверительном интервале. Сконструированы 14 положительных контролей в виде модифицированных вариантов плазмиды p Jet 1.2 sf GFP, применяемых в разработанных молекулярно-биологических методах для оценки качества сырья на всех этапах изготовления вакцин против ящура и бешенства. Впервые разработаны 2 тест-системы на основе NASBA для опосредованного определения титра инфекционной активности вирусов ящура и бешенства в сырье для изготовления вакцин с использованием оригинальных олигонуклеотидов, beacon и расчетных формул, что позволяет сократить время проведения анализа в 36 раз по сравнению с анализом в культуре клеток и в 2,7 раз по сравнению с пороговым методом ПЦР, дает возможность одновременно исследовать большее количество проб сырья для вакцин. Метод характеризуется чувствительностью - 98,08-99,94%, специфичностью - 97,57-100,00%, корреляцией с классическими методами с достоверностью выше 94,2% в 95%-ном доверительном интервале. На основе разработанных и классических методов проведено определение концентрации иммуногенных компонентов и титра инфекционной активности вирусов, исходя из этого изготовили вакцины против вируса ящура типов О, А, Азия-1 для свиней и вакцины против вируса бешенства штаммов «РВ-97» и «ВНИИЗЖ» для кошек. Получены сопоставимые результаты титров антител после иммунизации данными вакцинами и подтверждена достоверность результатов количественного анализа с помощью разработанных методов. Впервые создана тест-система для опосредованного контроля полноты инактивации вируса бешенства при амплификации большеразмерного фрагмента в ОТ-ПЦР с применением оригинальных олигонуклеотидных праймеров. Отсутствие фрагмента размером 9999 п.н. и наличие большого

количества фрагментов меньшей длины свидетельствует о полной инактивации вируса бешенства. Разработанный метод позволяет снизить время анализа в 24 раза и одновременно тестировать большее количество проб по сравнению с анализом в культуре клеток, характеризуется чувствительностью не менее 99,12%, специфичностью не менее 98,82% в 95%-ном доверительном интервале. Впервые создана тест-система контроля полноты инактивации вируса ящура в сырье для вакцин с применением метода nested ОТ-ПЦР и оригинальных пар праймеров для амплификации большеразмерных фрагментов. Отсутствие в ПЦР фрагмента размером 7244 п.н. и наличие большого количества фрагментов меньшей длины свидетельствует о полной инактивации вируса ящура. Метод сокращает время проведения анализа в 24 раза и позволяет одновременно исследовать в 10 раз больше проб сырья для вакцин по сравнению с анализом в клеточном монослое, характеризуется чувствительностью 95,86-98,58%, специфичностью - 98,99-100,00% в 95%-ном доверительном интервале. Впервые разработаны оригинальные пары праймеров и зондов для nested ОТ-ПЦР-РВ для ПЦР1 и ПЦР2 для амплификации большеразмерных фрагментов при контроле полноты инактивации вируса ящура в сырье для вакцин. Метод сокращает время исследования в 27 раз по сравнению с анализом в монослое клеток. По сравнению с тест-системой nested ОТ-ПЦР метод nested ОТ-ПЦР-РВ не предполагает проведение гель-электрофореза, что снижает риски контаминации продуктами ПЦР. Валидационные показатели для разработанного метода nested ОТ-ПЦР-РВ выше, чем для nested ОТ-ПЦР. Чувствительность составила 99,57-100,00%, специфичность - 100,00% в 95%-ном доверительном интервале.

На основе разработок были оформлены и утверждены директором ФГБУ «ВНИИЗЖ» 8 методических рекомендаций, получены 14 патентов РФ на изобретения и подана заявка на 1 патент РФ. Результаты проведенных научно-исследовательских работ внедрены в производственный процесс по изготовлению и контролю противоящурных и антирабических вакцин, отражены в 5 Промышленных регламентах на производство данных препаратов.

1.6 Методология и методы исследования

В работе использованы вирусологические, серологические и

молекулярно-биологические методы исследований с применением клеточных

культур, лабораторных и естественно восприимчивых животных.

1.7 Основные положения, выносимые на защиту:

1. спектрометрические методы опосредованного определения концентрации иммуногенных компонентов вирусов ящура и бешенства в сырье для изготовления вакцин;

2. 42 оригинальных олигонуклеотидных праймеров и зондов для проведения количественного молекулярно-биологического анализа сырья для изготовления противоящурных и антирабических вакцин;

3. методы опосредованного определения концентрации 146 S компонента вируса ящура и рибонуклеопротеина вируса бешенства в сырье для вакцин с применением порогового способа и технологии прямого сравнения максимальных экстремумов графиков второй производной кривых ОТ-ПЦР-РВ;

4. методы опосредованного определения титра инфекционной активности вирусов ящура и бешенства с применением порогового способа в ОТ-ПЦР-РВ и NASBA в сырье для изготовления противоящурных и антирабических вакцин;

5. 14 положительных контролей в виде модифицированных вариантов плазмиды p Jet 1.2 sf GFP, применяемых в молекулярно-биологических методах для оценки качества сырья на всех этапах изготовления вакцин против ящура и бешенства;

6. методы опосредованного контроля полноты инактивации вирусов ящура и бешенства в сырье для изготовления инактивированных вакцин с помощью ОТ-ПЦР и ОТ-ПЦР-РВ;

7. результаты исследований эффективности на животных противоящурных и антирабических вакцин, расчеты концентраций антигена и титра инфекционной активности вирусов для которых проводили с применением классических и разработанных методов.

1.8 Личный вклад автора

Работа выполнена автором самостоятельно. Автор выражает искреннюю благодарность за консультативную и научно-методическую помощь в выполнении отдельных этапов работы коллективу лаборатории профилактики ящура, заведующему лаборатории профилактики ящура, д-ру ветеринарн. наук Михалишину Д.В., научному консультанту д-ру биол. наук Мудрак Н.С. Автор выражает признательность канд. биол. наук Жбановой Т.В. и сотрудникам научной библиотеки ФГБУ «ВНИИЗЖ».

1.9 Апробация результатов исследования

Результаты проведенных исследований получены с использованием стандартных методик и других нормативных документов и большого объема экспериментального материала. Степень достоверности результатов экспериментов подтверждена обработкой их статистическими методами и комиссионными испытаниями. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на заседаниях методической комиссии и Ученого совета ФГБУ «ВНИИЗЖ» в период с 2016 по 2022 гг. Материалы диссертационной работы обсуждены на 8 Международных конференциях: на XXII Международной Пущинской школе-конференции (г. Пущино, 2018 г.), на XXI Международной конференции «Научный форум: Медицина, биология и химия» (г. Москва, 2019 г.), на XI Международной конференции «Инновационные процессы в сельском хозяйстве» (г. Москва, 2019 г.), на V Международной научной конференции «Достижения молодых ученых - в ветеринарную практику» (г. Владимир 2019 г.), на XII international scientific and practical conference "Innovative processes in agriculture" (2020 г.), на XXX Международной конференции «Научный форум: Медицина, биология и химия» (г. Москва, 2020 г.), на Международной конференции ВНИТИБП (г. Москва, 2020 г.), на Международной конференции "Обеспечение продовольственной безопасности в условиях пандемии COVID-19" (г. Пермь, 2021 г.) и на 4 Всероссийских конференциях: на ХХ1-я Всероссийской конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и сельскохозяйственной микробиологии» (г. Москва, 2021 г.) на IX Всероссийской конференции «Молекулярная диагностика 2017» (г. Москва, 2017 г.), на XVIII Всероссийской конференции «Биотехнология в

растениеводстве, животноводстве и ветеринарии», (г. Москва, 2018 г.), на XIX Всероссийской конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и сельскохозяйственной микробиологии» (г. Москва, 2019 г.). По материалам диссертации опубликовано 47 научных работ, из них 25 -в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки России, из них - 14 патентов РФ на изобретения, а также 1 заявка на изобретение РФ (Приложения 9-23).

Исследования по диссертационной работе являются частью комплексных тем НИР, выполнявшихся в ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» в 2015-2021 гг.:

- Федеральная целевая программа «Национальная система химической и биологической безопасности РФ» на 2015-2020 гг. в рамках госконтрактов по созданию новых защитных препаратов на основе выделенных циркулирующих штаммов вируса ящура;

- Государственный контракт № 22/15 от 20.10.2015 «Выполнение научно-исследовательских и опытно-конструкторских работ по созданию новых защитных препаратов на основе циркулирующих вновь выделенных изолятов особо опасных и экзотических инфекций животных и их испытание».

1.10 Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 378 страницах компьютерного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, собственные исследования, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение, список сокращений и условных обозначений, список использованной литературы, приложения; иллюстрирована 104 таблицами и 42 рисунками. Список использованной литературы включает 337 источников, из них 230 иностранных. В приложении представлены копии титульных листов документов, подтверждающих достоверность результатов работы, ее научную новизну и практическую значимость.

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Строение и свойства вирусов ящура и бешенства

2.1.1 Строение и функции генома вирусов ящура и бешенства

Вирус ящура.

В соответствии с классификацией Международного комитета по таксономии ВЯ относится к порядку Р1оогпау1га1в8, семейству Picorпaviridae, роду ЛрЫНоу^ш [195]. Для ВЯ при константе седиментации полных вирусных частиц 146 Б, константе диффузии 1,41 см2/с молекулярная масса составляет 8,08 х 106 Д. Размер вириона 23-25 нм, масса составляет 8,4 х 10-18

г [82].

Геномная организация. Геном ВЯ представлен одноцепочечной молекулой РНК (8бККА(+)) положительной полярности. Вирионная РНК различных штаммов ВЯ имеют одинаковую длину около 8400-8500 н.о. [218].

Рисунок 1 - Карта генома вируса ящура и продуктов расщепления белков (информация с сайта: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/15858032)

Список литературы диссертационного исследования доктор наук Доронин Максим Игоревич, 2022 год

Список использованной литературы

Приложения

1 Режим работы и штаты.

2 ПлаН производственной площади с расстановкой оборудования в лаборатории профилактики ящура,

3 Объединенный план-схема движения сырья, полуфабриката

готового продукта и персонала.

стр.

4 12

26 71

105

232

241

246

251

277

292

304

309

314

••»"г

ВЕРНА

КРЕТАРЬ

низ*

с РУСАЛЕЕ

Ш

Основные разделы промышленного регламент» на производство вакцины против ящура эмульсионной моно-п поливалентной для профилактики ящура свиней (из вируса, выращенного в клетках ВНК-21)

Раздел 5. Изложение технологического процесса.

ВР 5. Внутренний контроль

1. Определение концентрации 1465 иммуногенного компонента кулыурального вируса ящура в неннактивированной суспензии для изготовления вакцин с помощью метода обратной транскрипции и полимер а зной цепной реакции в режиме реального времени (ОТ-ПЦР-РВ)

158

2. Определение концентрации 1468. 75Б, 125 компонентов вакцинных штаммов культурального вируса ящура в реакции связывания комплемента (РСК) 160

3. Определение титра инфекционной активности вируса ящура в ненн активированном сырье для вакцины с применением метода обратной транскрипции-полимера зной цепной реакции

162

4. Контроль полноты ннактивации вируса ящура в сырье для вакцины с применением монослойных клеточных линий

165

Промышленный регламент на производство вакцины против ящура эмульсионной моно- и поливалентной для профилактики ящура свиней (из вируса, выращенного в клетках ВНК-21) разработали:

Разработчики:

Заведующий лабораторией

профилактики ящура

" »_¿V_20 „-У г.

Ведущий научный сотрудник лаборатории профилактики ящура

____20 . ' г.

Ведущий научный сотрудник лаборатории профилактики ящура

«(- С » О ¿з 20 ' ' г.

Ведущий научный сотрудник лаборатории профилактики ящура

« ( » С < 20

Старший научный сотрудник лаборатории профилактики ящура

«j3_» t •_20 У г.

Старший научный сотрудник лаборатории профилактики ящура

« С i(» '■_20 г.

Старший научный сотрудник лаборатории профилактики ящура

«IX» ( t_20 г.

Вед.технолог лаборатории профилактики, ящура

<■ _20_

Вед.ветврач лаборатории профилактики ящура

'< ('С » (■' '__ 20 -"' г.

Технолог 1 категории лаборатории профилактики ящура

" С<_20 " "г.

Главный эксперт ФГБУ "ВНИИЗЖ"

г.

• ^S/t-t

Í

// "У1

If-

UCk/,-

« Ч. Ъ »

С .

20

У

с < ¿е

Д.В. Михалишин A.B. Борисов М.И. Доронин H.H. Луговская Т.В. Оковытая М.Н. Гусева Н.Д. Клюкина

A.Н. Балашов М.А. Шевченко Ю.С. Елькина

B.В. Михалишин

ЖЗ-

ЕРНА

ЕТДРЬ

V, 1ШЗЖ r I ЭДбРУСАКЕ

jíAt/

V Z'JTj'Obir-Z—^ у' t

Раздел 4

Раздел 5 Раздел 6 Раздел 7 Раздел 8 Раздел 9 Раздел 10 Раздел 11 Раздел 12 Раздел 13 Раздел 14

Характеристика готового продукта Технологическая схема производства

оборудования СХ6Ма Пр°ИЗВОДСТВа и спецификация

Характеристика сырья, вспомогательных материалов полупродуктов и производственного штамма микроорганизма

Изложение технологического процесса Материальный баланс

Переработка и обезвреживание отходов производства

Контроль производства

Безопасная эксплуатация производства

Охрана окружающей среды

Перечень производственной документации

Технико-экономические нормативы

Список использованной литературы

Приложения

стр. 4

12 26

72

106

232

241

246

251

277

292

303

308

312

1 Режим работы и штаты.

2 План производственной площади с расстановкой оборудования в лаборатории профилактики ящура.

3 Объединенный план-схема движения сырья, полуфабриката, готового продукта и персонала.

ШС. РУС АЛЕ

Основные разделы промышленного регламента на производство вакцины против ящура культур а лмо й инактивированной эмульсионной «АРРИАХ-ВАК»

Раздел 5. Изложение технологического процесса.

ВР 5. Внутренний контроль

1. Определение концентрации 1468 нммуногенного компонента культурального вируса ящура в неинактивированной суспензии для изготовления вакцин с помощью метода обратной транскрипции и полимер а зной цепной реакции в режиме реального времени (ОТ-ПЦР-РВ)

2. Определение концентрации 146S. 75S. 12S компонентов вакцинных штаммов культурального вируса ящура в реакции

3. Определение титра инфекционной активности вируса ящура в неин активированном сырье для вакцины с применением метода обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции

4. Контроль полноты инактивации вируса ящура в сырье для вакцины с применением монослойных клеточных линий

158

связывания комплемента (РСК)

160

162

165

■ -■ ¿fc UPE ГАРЬ

у *У i- tíUffí i * Щ' y'/X/rJ^ ^ ^f'с РУ С AIEE

Промышленный регламент на производство вакцины против ящура культурально инактивированной эмульсионной "АРРИАХ-ВАК" разработали:

Разработчики:

Заведующий лабораторией

профилактики ящура

« LL »

2021

г.

Ведущий научный сотрудник лаборатории профилактики ящура

-С___ 20_Х г.

Ведущий научный сотрудник лаборатории профилактики ящура

_I_____ 20 '. г.

Ведущий научный сотрудник лаборатории профилактики ящура

" 1 д »_(' * _ 20 -' г

Старший научный сотрудник лаборатории профилактики ящура

«Х^» С < 20_ с г.

Старший научный сотрудник лаборатории профилактики ящура

*Чг ц_» Г у__20 ,7 11

Старший научный сотрудник лаборатории профилактики ящура

"1 (■ » __20_

Вед.технолог лаборатории профилактики ящура

« С- <■ » С Ч___20 'г.

Вед.ветврач лаборатории профилактики ящура « С 6 » с* 4

г.

_20.

Технолог 1 категории лаборатории профилактики ящура

«М_» С <•_20 ° г Г.

Главный эксперт ФГБУ "ВНИИЗЖ"

«!_£.» с < ?п ,гСг.

'Л

п-

г/

Д.В. Михалишин A.B. Борисов М.И. Доронин H.H. Луговская Т.В. Оковытая М.Н. Гусева Н.Д. Кпюкина А.Н. Балашов М.А. Шевченко Ю.С. Елькина

А <

с В.В. Михалишин

ЛйШ

1изж

Раздел 4

Раздел 5 Раздел 6 Раздел 7 Раздел 8 Раздел 9 Раздел 10 Раздел 11 Раздел 12 Раздел 13 Раздел 14

стр. 4

12 26

СОДЕРЖАНИЕ РЕГЛАМЕНТА

Характеристика готового продукта Технологическая схема производства

Аппаратурная схема производства и спецификация оборудования

Характеристика сырья, вспомогательных материалов 72 полупродуктов и производственного штамма микроорганизма

Изложение технологического процесса юб

Материальный баланс 232

Переработка и обезвреживание отходов производства 241 Контроль производства Безопасная эксплуатация производства Охрана окружающей среды Перечень производственной документации Технико-экономические нормативы Список использованной литературы Приложения

246 251 277 292 303 308 312

1 Режим работы и штаты.

2 План производственной площади с расстановкой оборудования в лаборатории профилактики ящура.

3 Объединенный план-схема движения сырья, полуфабриката, готового продукта и персонала.

.шшт

П.С РУСАЛЕЕ

Основные разделы промышленного регламента на производство вакпины антирабической ин активирован ной культур альнон жидкой

(ВНИИЗЖ)

Раздел 5. Изложение технологического процесса.

ВР 5. Внутренний контроль

1. Опосредованное определение титра инфекционной активности культурального вируса бешенства штамма «ВНИИЗЖ» в сырье для вакцины методом обратной транскрипции и поли мер а зной цепной реакции в режиме реального времени (ОТ-ПЦР-РВ) 158

2. Опосредованное определение концентрации рибопуклеопротеина культурального вируса бешенства в сырье для вакцины методом обратной транскрипции и поли мер а зной цепной реакции в режиме реального времени (ОТ-ПЦР-РВ)»

3. Контроль полноты инактивации культурального вируса бешенства в сырье для вакцины методом обратной транскрипции и полимер а зной цепной реакции (ОТ-ПЦР)

167

171