Молекулярно-клеточные маркеры в доклинической характеристике поливалентных вакцин против гриппа и бактериальных осложнений тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Ландграф Галина

• Ландграф Галина
• кандидат наук
• 2023

Оглавление диссертации кандидат наук Ландграф Галина

Содержание

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Вирусы гриппа

1.1.1. Изменчивость вирусов гриппа человека

1.2. Гриппозные вакцины 22 1.2.1 Инактивированные гриппозные вакцины (ИГВ)

1.2.2. Рекомбинантные гриппозные вакцины

1.2.3. Живые гриппозные вакцины (ЖГВ). 23 1.2.3.1. Методы, применяемые в настоящее время для анализа состава генома вакцинных штаммов, включаемых в состав ЖГВ

1.2.4. Разработка вакцин против вирусов гриппа А потенциально пандемических подтипов (Н7, Н9, Н6)

1.2.5. Проблемы применения поливалентных ЖГВ

1.2.5.1. Оценка репродуктивной активности отдельных штаммов ЖГВ

в клеточной культуре на основе технологии Taqman

1.2.5.2. Использование моноклональных антител

1.3. Механизмы защитного иммунитета при гриппозной инфекции и вакцинации

1.3.1. Факторы врожденного иммунитета при гриппе

1.3.1.1. Цитокины

1.3.1.2. Различия в выработке цитокинов при инфекции вирусами гриппа различных подтипов

1.3.1.3. Значение цитокинов при иммунизации гриппозными вакцинами

1.3.2. Адаптивный иммунитет (гуморальный и клеточный)

1.4. Разработка вирус-бактериальных ассоциированных вакцин на 52 основе ЖГВ.

1.4.1. Факторы защитного иммунитета при иммунизации вирус-

бактериальными вакцинами

Заключение

Глава 2. Материалы и методы исследования

2.1. Вирусы гриппа и вакцинные препараты. 60 2.1.2. Культивирование вирусов гриппа в куриных эмбрионах

2.2. Методы работы с клеточными культурами

2.2.1. Культивирование вирусов в клеточной культуре MDCK

2.2.2. Работа с клеточной культурой THP-1

2.3. Методы молекулярно-генетического анализа

2.3.1. Анализ «т 8Шсо»

2.3.2. Анализ кривых плавления продуктов ПЦР высокого разрешения 65 (ИЯМ-анализ).

2.3.3. Метод гидролизируемых зондов (TaqMan) для определения 66 инфекционных титров вакцинных вирусов гриппа в составе трехвалентной ЖГВ.

2.3.4. Секвенирование по Сэнгеру

2.3.5. Филогенетический анализ

2.3.6. Изучение экспрессии генов ранних цитокинов в клетках THP-1

2.4. Методы работы с мышами

2.4.1. Заявление об этике

2.4.2. Изучение репродукции и иммуногенности ЖГВ на мышах

2.4.3. Изучение ранней защиты против гомологичной и гетерологичной 72 гриппозной инфекции после иммунизации мышей вирус-бактериальной вакциной.

2.4.4. Изучение прививочных свойств вирус-бактериальной вакцины на основе ЖГВ и рекомбинантных бактериальных полипептидов на модели постгриппозной бактериальной пневмонии

2.5. Статистическая обработка результатов. 76 Глава 3 Результаты собственных исследований. 77 3.1. Разработка методологической базы для изучения

олигонуклеотидных полиморфизмов вируса гриппа методом анализа кривых плавления продуктов ПЦР высокого разрешения (НИМ-анализ)

3.1.1. Анализ генов внутренних и неструктурных белков вакцинного 77 кандидата А/17/серебристая чайка /Сарма /2006/887(Н6Ш).

3.1.2. Изучение биологических свойств реассортантного вируса 84 А/17/серебристая чайка /Сарма /2006/887(Н6Ш).

3.1.3. Сравнительный анализ средних температур плавления ПЦР-продуктов генов внутренних и неструктурных белков реассортантов вирусов гриппа птиц

3.2. Анализ ростовых характеристик реассортантных вирусов гриппа методом одношаговой ПЦР-РВ с использованием гидролизируемых зондов (TaqMan)

3.2.1. Изучение репродукции трехвалентой ЖГВ в клетках MDCK

3.2.2. Изучение репродукции вирусов В/Виктория и В/Ямагата в клетках 89 MDCK.

3.2.3. Изучение прививочных свойств отдельных штаммов 91 трехвалентной ЖГВ на мышах.

3.3. Изучение прививочных свойств вирусно-бактериальной вакцины на 94 основе ЖГВ и рекомбинантных пептидов стрептококка группы В.

3.3.1. Изучение экспрессии и продукции ранних цитокинов в клетках

таг-!.

3.3.2. Изучение ранней защиты после иммунизации ЖГВ на мышах

3.3.3. Изучение иммуногенности и защиты от вирус-бактериальной 101 инфекции на модели постгриппозной бактериальной пневмонии.

3.3.3.1. Иммуногенность

3.3.3.2. Защита от вирус-бактериальной инфекции 104 Глава 4. Обсуждение 108 Выводы 121 Список литературы

Список сокращений

АЕ - агглютинирующая единица

ВОЗ - всемирная организация здравоохранения

СГВ - стрептококк группы В

ДК - дендритные клетки

ЖГВ - живая гриппозная вакцина

и/н - интраназально

ИФА - иммуноферментный анализ

КИД50 - 50% культуральная инфекционная доза

КОЕ - колониеобразующая единица

КЭ -куриные эмбрионы

ЛД50 - 50% летальная доза

МИД50 - 50% мышиная инфекционная доза

МОИ - множественность инфекции

ОТ-ПЦР - обратно-транскриптазная полимеразная цепная реакция

РГА - реакция гемагглютинации

РТГА - реакция торможения гемагглютинации

СГТ - среднегеометрический титр

СКО - среднеквадратичное отклонение

ФБ - фосфатно-солевой буфер

ХА - холодоадаптированный

ЦТЛ - цитотоксические лимфоциты

ЭИД50 - 50% эмбриональная инфекционная доза

att- аттенуированный

ca- холодоадаптированный

GAPDH - глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа HA - гемагглютининMDCK - Madin Darby canine kidney HPRT - гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансфераза IFN - интерферон

IL - интерлейкин

NA - нейраминидаза

MIP - воспалительный белок макрофагов

RANTES - хемокин, экспрессируемый и секретируемый T-клетками при активации TNF- фактор некроза опухоли

Введение

Основной стратегией профилактики и борьбы с сезонным и пандемическим гриппом является вакцинация [1]. Ежегодная вакцинация рекомендуется с использованием инактивированных гриппозных вакцин (ИГВ), которые используются начиная с 1940-х годов с постепенными улучшениями, в основном касающимися технологий производства и применения адъювантов; или живыми гриппозными вакцинами (ЖГВ) [2]. Впервые ЖГВ начали применять на территории СССР с 1960-х годов [3]; начиная с 1980-х годов ХХ века ЖГВ применяется в трехвалентном виде; в 2003 году ЖГВ была лицензирована для использования на территории Северной Америки и стран Европы [4].

Подготовка вакцинных штаммов для ЖГВ основывается на генетической реассортации аттенуированного (ослабленного) донорского штамма с эпидемическим вирусом «дикого» типа [4]. Реассортантные вакцинные штаммы содержат гены, кодирующие поверхностные гликопротеины - гемагглютинин (НА) и нейраминидазу (МЛ) - от вируса «дикого» типа и шесть генов внутренних и неструктурных белков - от аттенуированного донорского штамма (РВ1, РВ2, РА, М, ОТ и №), то есть имеют формулу генома 6:2. На территории Российской Федерации используются холодоадаптированный (ХА) донор аттенуации А/Ленинград/134/17/57(И2Ш) (Лен/17), который лицензирован для подготовки вакцинных штаммов ЖГВ для иммунизации взрослых и детей от 3-х лет [4]. Для производства поливалентных ЖГВ, используемых в России, разработан адаптированный к холоду штамм типа В/СССР/60/69 [5].

Иммуногенность ЖГВ составляет до 80% у детей младше 6 лет и 40% у взрослых [6, 7]. ЖГВ вводится интраназально и может вызывать более длительный, более

и и / и и \ с»

широкий иммунный (гуморальный и клеточный) ответ, который больше напоминает естественный иммунитет после инфекции. В отличие от ИГВ, ЖГВ индуцирует ответ с индукцией не только сывороточных иммуноглобулинов класса IgG, но и локальных иммуноглобулинов класса А (^А), а также антигенспецифических цитокин-секретирующих Т-клеток [8, 9, 10]. В экспериментах на мышах показано, что иммунизация ЖГВ оказывает защитное действие против гомологичной гриппозной инфекции уже в первые дни после интраназального введения [11].

Анализ состава генома кандидатов в вакцинные штаммы ЖГВ осуществляется методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) с последующим рестрикционным анализом продуктов амплификации или мультиплексной ПЦР и последующим полным секвенированием всех генов реассортанта [12]. Для быстрого анализа состава генома потенциальных вакцинных кандидатов применяют пиросеквенирование [13], однако этот метод является слишком дорогим для рутинного, широкомасштабного использования. На промежуточных этапах подготовки вакцинного штамма необходимо проанализировать значительное число реассортантов (провести первичный скрининг), в связи с чем возникает потребность в разработке наиболее быстрых и наименее затратных методов изучения нуклеотидных полиморфизмов в геноме вакцинных кандидатов.

Сезонные трехвалентные ЖГВ включают три штамма вируса гриппа - А/НШ1, А/Н3К2 и В. Определение инфекционных титров каждого из вирусов в составе тривакцины является трудоемким процессом. Для определения инфекционной активности каждого штамма вируса гриппа в составе трехвалентных ЖГВ требуется использование поликлональных антисывороток или моноклональных антител, специфичных для блокирования инфекционности двух других вирусов. Эти методики являются продолжительными, затратными и могут быть недостаточно точными, если антитела не являются высокоспецифичными. Развитие быстрого и точного метода определения титров вирусов гриппа в составе тривакцины, основанного на молекулярнно-клеточных технологиях, необходимо не только для своевременного и эффективного производства вакцины, но и для изучения репродуктивных свойств вирусов гриппа в составе гетерогенных смесей.

Вирусы гриппа повышают чувствительность дыхательных путей к бактериальным инвазиям, которые часто вызывают тяжелые вторичные осложнения, такие как бронхит и пневмония [14], которые особенно опасны для пациентов, страдающих хроническими обструктивными заболеваниями легких. Вакцинация против гриппа может снижать количество постгриппозных осложнений [15], однако эффективность гриппозных вакцин, включая самые современные, составляет не более 80% [7]. Создание ассоциированных или векторных вирусно-бактериальных вакцин на основе ЖГВ и

бактериальных пептидов, соответствующих консервативным факторам патогенности бактерий, является новым направлением иммунопрофилактики [16]. Современные методы генной инженерии и пептидного синтеза позволяют получать на основе консервативных бактериальных антигенов различные вакцинные прототипы, включая химерные конструкции и векторные вакцины, но вопрос оптимальной их доставки и режима вакцинации для формирования наиболее эффективной защиты еще подлежит изучению. При создании инновационных комплексных препаратов против вирус-бактериальных инфекций необходимо изучать факторы врожденного и адаптивного иммунитета, коррелирующие с защитой. Изучение экспрессии и продукции ранних цитокинов в клеточных культурах в ответ на введение вирусных или вирус-бактериальных вакцин может служить новым критерием оценки как безвредности вновь разрабатываемых препаратов, так и прогнозирования их защитного действия.

Актуальность исследования определяется важностью разработки подходов к доклинической оценке вакцин для защиты против гриппа и постгриппозной бактериальной пневмонии. Разработка методик на основе обратно-транскриптазного ПЦР-анализа в реальном времени (ОТ-ПЦР-РВ) для быстрого скрининга олигонуклеотидных полиморфизмов и для оценки ростовых характеристик реассортантных вакцинных штаммов ЖГВ имеет большое значение для своевременного производства вакцин. Актуальность разработки ассоциированных вирус-бактериальных вакцин обусловлена высокой социально-экономической значимостью вторичных бактериальных осложнений при гриппе. В связи с этим актуальной является разработка моделей для изучения иммуностимулирующих свойств ассоциированных вирус-бактериальных вакцин.

Степень разработанности темы исследования

Для анализа состава генома вакцинных штаммов применяются различные методики на основе ПЦР. Интерес к упрощению изучения олигонуклеотидных полиморфизмов приводит к активному развитию анализа кривых плавления продуктов ПЦР высокого разрешения (НЯМ-анализ). До сих пор отсутствовало практическое обоснование технологии определения генома реассортантных вакцинных штаммов с

использованием HRM-анализа, который достаточно широко применяется для генотипирования «диких» штаммов вируса гриппа.

В настоящее время на территории Российской Федерации отсутствует на уровне законодательных документов метод оценки инфекционной активности актуальных аттенуированных реассортантных штаммов вирусов гриппа, входящих в состав поливалентной ЖГВ. Традиционный метод определения 50% -ной инфекционной дозы в куриных эмбрионах (КЭ) - ЭИД50 - требует не менее 2-3-x дней, а титрование в клеточных культурах - 3-5 дней для достижения цитопатического эффекта. Ранее Yang Zang, et al. (2014), показали, что уровни репродукции отдельных вакцинных штаммов современных эпидемических вирусов на основе отечественных доноров аттенуации уже после 18-20 часов инкубации в клеточной культуре MDCK соответствовали уровням репродукции в КЭ [17]. Однако до сих пор не была разработана методика изучения репродукции сразу нескольких вакцинных штаммов в составе трехвалентных ЖГВ.

Профилирование экспрессии м-РНК генов цитокинов в настоящее время рассматривается как перспективный метод молекулярно-генетического анализа для определения воздействия вакцинных препаратов или других внешних стимулов, поскольку транскрипция является динамическим процессом, позволяющим клеткам быстро приспосабливаться к изменению гомеостаза. Известна работа Плотниковой М. А., посвященная разработке мультиплексных методов оценки профиля цитокинов в эпителиальных клетках человека, инфицированных вирусами гриппа А [18]. Оценка in vitro цитокинового профиля вакцинных компонентов, таких как живые вакцинные вирусы гриппа и рекомбинантные бактериальные пептиды, ранее не проводилась.

Цель исследования

Разработать новые молекулярно-генетические маркеры, характеризующие безвредность и потенциальную эффективность поливалентных вакцин на основе ЖГВ против гриппа и его бактериальных осложнений.

Задачи исследования

1. Разработать метод для быстрого скрининга реассортантных вакцинных штаммов на основе донора аттенуации А/Ленинград/134/17(Н2№) с использованием HRM анализа.

2. Разработать методику на основе технологии TaqMan для оценки взаимного влияния реассортантных вирусов гриппа в составе тривалентной живой гриппозной вакцины (ЖГВ). Изучение ростовых характеристик поливалентных ЖГВ in vitro и in vivo.

3. Изучить экспрессию ранних цитокинов и интерферонов 1 типа в клеточной культуре моноцитов-макрофагов человека (THP-1) при контакте c реассортантными вирусами гриппа и рекомбинантными бактериальными полипептидами.

4. Оценить факторы раннего защитного действия ЖГВ против гомологичной и гетерологичной гриппозной инфекции.

5. Изучить защитное действие ассоциированной интраназальной вирус-бактериальной вакцины на основе ЖГВ и рекомбинантных пептидов стрептококка группы В против гриппозной инфекции и постгриппозной бактериальной пневмонии.

Научная новизна работы

В результате выполнения работы впервые разработаны методики для быстрого скрининга олигонуклеотидных полиморфизмов в геноме реассортантных вирусов гриппа с помощью HRM-анализа и для изучения ростовых характеристик реассортантных вирусов гриппа A/H1N1, A/H3N2 и вирусов гриппа В, входящих в состав тривалентной ЖГВ.

Выявлены ранее неохарактеризованные нуклеотидные замещения в консервативных белках вирусов гриппа птиц.

В ходе разработки методики для определения инфекционных титров вакцинных вирусов А и В, входящих в состав трехвалентной ЖГВ, впервые применен метод ОТ-ПЦР-РВ на основе технологии гидролизируемых олигонуклеотдных зондов (Taqman). Показано, что взаимное угнетение вакцинных штаммов при их объединении в

поливалентный препарат является минимальным при наибольших концентрациях вирусов. На модели мышей впервые показано, что отсутствие репродукции компонента А/Н3К2 тривакцины в дыхательных путях не влияло на развитие поствакцинального ответа антител.

В результате выполнения работы получены новые научные данные о механизмах защитного действия вирус-бактериальных вакцин на основе ЖГВ против постгриппозной стрептококковой пневмонии. Впервые показано, что при введении в культуру клеток моноцитов-макрофагов человека (ТНР-1) вакцинных вирусов ЖГВ и рекомбинантных пептидов стрептококка группы В наблюдается повышение экспрессии ранних цитокинов и хемокинов, и это повышение положительно коррелирует с последующей защитой от против гомологичной и гетерологичной гриппозной инфекции в исследованиях на мышах.

Теоретическая и практическая значимость работы

Теоретическая значимость работы заключается в выявлении новых нуклеотидных замещений в консервативных белках вирусов гриппа птиц, что может указывать на возможные пути эволюционной изменчивости вирусов гриппа А потенциально пандемических подтипов. Показанные различия в филогенетических линиях РА-гена вирусов гриппа типа А свидетельствуют о возможной реассортации между низкопатогенными и высокопатогенными вирусами гриппа птиц.

Выполнение проекта позволило получить новые фундаментальные данные о механизмах защитного действия вирус-бактериальных вакцин на основе ЖГВ и путей активации иммунной системы при введении таких вакцин.

Научное исследование имеет также выраженную прикладную значимость. В ходе работы была показана возможность применения разработанных методов на платформе ОТ-ПЦР-РВ при подготовке кандидатов в вакцинные штаммы и при производстве поливалентных живых гриппозных вакцин. Впервые показано, что снижение репродуктивной активности отдельных вакцинных штаммов в составе трехвалентной ЖГВ было минимальным при низких разведениях препаратов.

Внедрение результатов работы

Метод оценки репродуктивности вакцинных штаммов в составе трехвалентной ЖГВ защищен патентом Российской Федерации.

Методы исследования В ходе научной работы применялись биоинформационные методы (выравнивание последовательностей (UGENE от UniPro (версия 1.31.0); разработка праймеров (Primers 3); молекулярно-генетические методы (ОТ-ПЦР-РВ-анализ, методы рестрикции, секвенирование по Сэнгеру); вирусологические методы (культивирование вирусов гриппа в куриных эмбрионах и клеточной культуре MDCK); моделирование гриппозной инфекции на мышах; клеточные технологии (изучение иммуностимулирующих свойств реассортантных вирусов гриппа и рекомбинантных бактериальных полипептидов в клеточной культуре THP-1).

Основные положения, выносимые на защиту

1. Технология анализа кривых плавления продуктов ПЦР (HRM-анализ) позволяет проводить скрининг вакцинных кандидатов потенциально пандемических вирусов гриппа, полученных на основе донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57(И2К2).

2. Разработана и апробирована клеточная система на основе культуры MDCK для изучения репродуктивной активности вирусов гриппа А и В в составе трехвалентной ЖГВ с использованием ПЦР-технологии гидролизируемых зондов (TaqMan). Для уменьшения возможного снижения репродукции отдельных компонентов ЖГВ в клетках млекопитающих в составе поливалентных вакцин необходимо соблюдать равенство инфекционных доз вирусов.

3. Метод изучения репродукции вакцинных вирусов в трехвалентной вакцине с использованием ОТ-ПЦР применим для количественной оценки репликации вакцинных штаммов после иммунизации лабораторных животных. Несмотря на сниженную репродукцию в дыхательных путях мышей, ЖГВ способна вызывать системный гуморальный иммунный ответ при интраназальном введении.

4. С помощью анализа экспрессии м-РНК ранних цитокинов и хемокинов в перевиваемой культуре моноцитов-макрофагов человека THP-1 продемонстрированы иммуностимулирующие свойства рекомбинантных пептидов стрептококка группы В с различной молекулярной структурой. Продукция вакцинными препаратами ЖГВ и рекомбинантным пептидом стрептококка группы В ScaAB интерферонов первого типа in vitro коррелировала с ранней защитой от летальной гриппозной инфекции.

5 Вирус-бактериальная ассоциированная вакцинация является наиболее эффективной для защиты от постгриппозной бактериальной пневмонии по сравнению с раздельным применением ЖГВ или рекомбинантных пептидов стрептококка группы В на мышиной модели.

Личный вклад автора состоит в самостоятельном планировании и проведении ПЦР-исследований, разработке и апробации олигонуклеотидных праймеров, проведении молекулярно-генетического анализа, работе с клеточными культурами. Изучение вирус-бактериальных вакцин проводилось совместно с сотрудниками отдела микробиологии ФГБНУ «ИЭМ» Заведующий отделом д.м.н., профессор, член-корреспондент РАН А.Н. Суворов, Ученый секретарь - к.б.н. Г.Ф. Леонтьева. Постановка экспериментов на клетках (THP-1) проводилось совместно с в.н.с. отдела вирусологии ФГБНУ «ИЭМ» к.б.н. А.Р. Рекстиным.

Степень достоверности, и апробация материалов диссертации

Достоверность результатов исследований подтверждена использованием различных экспериментальных моделей, применением набора современных методов исследования, неоднократными повторами экспериментов и статистическим анализом.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Молекулярно-клеточные маркеры в доклинической характеристике поливалентных вакцин против гриппа и бактериальных осложнений»

Апробация работы

Материалы диссертационной работы были доложены на следующих конференциях: XIX Молодёжная конференция-школа по органической химии, «ОргХим-2016», (Санкт-Петербург, 2016 г.); Первое совещание по протективным факторам иммунитета при противогриппозой вакцинации International Society for Influenza and other Respiratory Virus (ISIRV), Университет San Niccolo Complesso,

(Сиена, Италия, 2019 год); 10-е совещание «Выбор средств по борьбе с гриппом» (Options X) 2019 (Сингапур, 2019 год); 7-я конференция Европейской научной рабочей группы по гриппу (ESWI), 6-9 декабря 2020 г., Всероссийская конференция по естественным и гуманитарным наукам - «Наука СПбГУ - 2020», 6-9 декабря 2020 г.; 8-я конференция Европейской научной рабочей группы по гриппу (ESWI), 4-7 декабря 2021 г.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ, включая 1 статью в источнике ВАК, 4 статьи в рецензируемых журналах Scopus и Web of Science, а также 8 тезисов докладов, 1 патент.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 142 страницах текста, включая 12 таблиц и 29 рисунков; состоит из введения, четырех глав обзора литературы, материалов и методов, трех глав собственных исследований, обсуждения и выводов. Обзор литературы включает 233 источника, из них 10 отечественных и 223 -иностранных.

Работа подержана грантом РФФИ №19-34-90021/19: Конкурс на лучшие проекты фундаментальных научных исследований, выполняемые молодыми учеными, обучающимися в аспирантуре «Молекулярно-генетические маркеры безопасности и эффективности поливалентных вакцин против гриппа и бактериальных осложнений гриппозной инфекции».

Исследование одобрено комиссией по биоэтике Локального этического комитета при ФГБНУ «ИЭМ», протокол № 3/17 от 30.11.2017 года.

Глава 1. Обзор литературы 1.1. Вирусы гриппа

Вирус гриппа относится к семейству Orthomyxoviridae. Геном вируса гриппа состоит из восьми фрагментов одноцепочечной рибонуклеиновой кислотой (РНК), имеющая отрицательную полярность. Гликопротеины оболочки - гемагглютинин (НА) и нейраминидаза (КА), образуют множественных серологически различных подтипов вируса. В настоящее время идентифицировано 16 подтипов НА и 9 КА вирусов гриппа А, все из них можно обнаружить у диких птиц [20]. Еще две комбинации, Н17Ш0 и Н18Ш1, были идентифицированы у летучих мышей [21].

На сегодняшний день помимо вируса гриппа А известны вирусы гриппа В, С и D. Тип А инфицирует людей и млекопитающих. Сезонный грипп, вызванный вирусом гриппа А у людей, является очень серьезным респираторным заболеванием, приводящий к летальным исходам [22]. Ежегодно из числа пациентов с вирусом гриппа наблюдается от 3 до 5 миллионов тяжелых заболеваний, из которых от 300 до 600 тысяч случаев заканчивается летальным исходом [23].

Вирусы гриппа В также ежегодно вызывают заболеваемость и смертность. В 20102011 гг. вирус гриппа В стал причиной инфицирования 25% от всех случаев заражения гриппом. Доля смертей среди детей, госпитализированных с гриппом, вызванным вирусом гриппа В, составляет 1,1% по сравнению с 0,4% в случае вируса гриппа А [24].

Вирус гриппа С вызывает инфекцию верхних дыхательных путей у детей, при этом клинические симптомы протекают легче, в сравнении с гриппом А и В. Резервуаром вируса гриппа С является человек, также вирус поражает свиней и крупный рогатый скот, наблюдается межвидовая циркуляция. Вирус гриппа D. Согласно эпидемиологическим данным естественным основным резервуаром вируса гриппа D является крупный рогатый скот [25]. Вирусы гриппа В, С, и D никогда не вызывали пандемий.

Геном вируса гриппа имеет длину около 13 500 оснований, вирусы гриппа А и В имеют 8 генов, которые кодируют не менее 11 белков [26] (рисунок 1).

Рисунок 1. HA - гемагглютинин, NA - нейраминидаза, M1 белок матрикса, M2 трансмембранный белок, NP - белок нуклеопротеина, NS1 - NS2 неструктурные белки, PA полимераза А, PB1 полимераза, PB2 полимераза [27].

На рисунке 1 восемь сегментов генома вирусов гриппа A и B пронумерованы в порядке уменьшения количества нуклеотидов. В вирусах гриппа A и B сегменты 1, 3, 4 и 5 кодируют только один белок: белки PB2, PA, HA и NP соответственно [26, 28, 29]. Сегмент 2 всех вирусов гриппа кодирует полимеразную субъединицу PB1 [29]. В некоторых штаммах вируса гриппа А этот сегмент также кодирует дополнительный протеин PB1-F2. В вирусах гриппа В и С не обнаружено аналогов белка PB1-F2. Сегмент 6 вируса гриппа A кодирует только белок NA, тогда как этот же сегмент вируса гриппа B кодирует как NA-белок, так и в -1 рамке считывания белок матрицы NB, который представляет собой интегральный белок мембраны, соответствующий белку M2 вируса гриппа A [26]. Сегмент 7 вирусов гриппа A и B кодирует белок M1. В геноме гриппа A белок ионного канала M2 кодируется сегментом 7 с помощью сплайсинга РНК [29], тогда как вирус гриппа B кодирует мембранный белок BM2. Наконец, оба вируса гриппа A и B имеют один сегмент РНК - сегмент 8, на основе которого экспрессируется белок NS1 - антагонист интерферона [31, 32, 33, 34].

РНК-зависимая РНК-полимераза состоит из трех субъединиц: РВ1, РВ2 и РА. Между РА и РВ1 имеется контакт, между РА и РВ2 нет прямых взаимодействий. Этим субъединицам полимеризации принадлежит ключевая роль в транскрипции и репликации вируса. РВ2-субъединица РНК-полимеразы образует комплекс рибонуклеопротеина (РНП) с восемью сегментами генома и перемещается в ядро [28,

35]. Субъединица РВ2 связывается с метилированными структурами сар-1 на 5'-концах активно транскрибируемых клеточных мРНК, которые затем эндонуклеолитически расщепляются полимеразным комплексом [28]. Белок РВ1 - субъединица полимеразного комплекса, является наиболее охарактеризованной. Биохимическое структурное изучение показало участие субъединицы РВ1 в удлинении РНК-цепи [29]. РВ1 содержит аминокислотные участки, общие для всех РНК-зависимых РНК-полимераз и РНК-зависимых ДНК-полимераз [35]. Мутации в этих участках делают комплекс неактивным для транскрипции и репликации в клетках культуры ткани [34,

36]. РА необходима для репликации вирусной РНК, хотя ее роль в этом процессе остается неясной [35].

Белок КР (белок нуклеопротеина) вируса гриппа является главным фактором в вирусном инфекционном цикле при переключении синтеза РНК вируса гриппа из режима транскрипции в режим репликации.

Матричный белок М1, или белок периферической мембраны, покрывает вирусную оболочку на его внутренней стороне. Было обнаружено, что экспорт из ядра в цитоплазму зависит от этого белка.

Неструктурный белок №1 вируса гриппа А, который в больших количествах синтезируется на начальных этапах инфекционного цикла, является РНК-связывающим белком и регулирует несколько посттранскрипционных этапов, а именно: ингибирует ядерный экспорт и сплайсинг мРНК. Белок №1 связывается с двухцепочечной РНК, тем самым блокируя ингибирование трансляции, а также осуществляет ингибирование факторов иммунного ответа хозяина, в частности интерферона (1ЕЫ) и противовирусных эффектов 1РК-индуцированных белков. Таким образом, белок N81 необходим для эффективной репликации вируса в ШК-компетентных системах [31, 34].

НА является прикрепительным белком и обеспечивает проникновение в клетки за счет связывания сиаловой кислоты на клеточной поверхности и за последующее слияние мембран. КА, являясь ферментом класса гидролаз, высвобождает новые вирионы из инфицированных клеток, разрывая связи между НА и сиаловой кислотой и облегчает перемещение вируса через слизь [37]. Из-за неправильного включения нуклеотидов вирусной полимеразой во время репликации генома и сегментированной природы геномов вирусы гриппа эволюционируют за счет постепенного накопления мутаций или реассортации генома, которые также известны как «антигенный дрейф» и «антигенный сдвиг», соответственно [38].

1.1.1. Изменчивость вирусов гриппа человека

Отличительной чертой вирусов гриппа человека является их способность подвергаться антигенным изменениям.

Антигенный «дрейф» характеризуется постепенным и относительно непрерывным изменением вирусных белков НА и КА в результате накопления точечных мутаций в генах во время репликации вируса. Оба типа вирусов гриппа А и В подвергаются антигенному дрейфу, что приводит к появлению новых штаммов вируса, это требует частого обновления вакцинных штаммов [39].

Антигенный «сдвиг». Помимо к антигенного дрейфа, вирусы гриппа А могут более резко и внезапно изменять тип. В этом случае в циркуляции появляется вирус гриппа, имеющих либо белок НА или комбинацию НА и КА белков, которые не циркулировали среди людей в последние годы. Существуют по крайней мере три возможных механизма, с помощью которых могут происходить антигенный сдвиг [40]:

1. вирус, несущий новые НА и КА белки, может возникнуть путем генетических рекомбинаций вирусов гриппа животных и человека;

2. вирус гриппа от животных (например, птицы или свиньи) могут заразить человека непосредственно без прохождения генетической рекомбинации;

3. вирус, не являющемся вирусом человека, может передаваться от одного вида животного (например, птицы) через промежуточного животного-хозяина (например,

свиньи) и инфицировать человека (рисунок 2).

Рисунок 2. Происхождение вируса пандемического гриппа 2009 г. [40].

Вирус гриппа может передаваться от человека животным, например свиньям. Сопутствующее инфицирование птичьими штаммами вирусами гриппа может привести к появлению реассортантов, содержащих генетические сегменты вирусов гриппа человека и животных. Эти новые вирусы могут передаваться восприимчивым группам людей, и соответственно приводить к пандемии. Известно, что Азиатский и Гонконгский грипп были вызваны штаммами, возникшими в результате реассортации [40].

В то время как антигенный дрейф происходит непрерывно, антигенный сдвиг происходит редко и непредсказуемо. При появлении нового вируса гриппа в результате антигенного сдвига большая часть населения мира не будет иметь антител против него.

"Ж"/® К* к* к*

Когда новый штамм приобретает устойчивый путь передачи от человека к человеку, новый вирус может распространиться по всему миру, вызывая пандемию [43].

За прошедшее столетие отмечено четыре наиболее важных пандемии, вызванные различными подтипами вируса гриппа А, унесшие большое количество жизней. В их числе «Испанский грипп», вызванный вирусом гриппа А (НШ1) в 1918 году, «Азиатский грипп», вызванный вирусом гриппа А (^N2) в 1957 году, «Гонконгский» грипп вызванный вирусом гриппа А (^N2) в 1968 году, пандемия гриппа А (ШШ) в

1977 г. Первой пандемией XXI века была пандемия гриппа А (Н1Ш) в 2009 году [44]. Начиная с 1997 г. периодически наблюдаются вспышки инфекции, вызванной вирусами гриппа птиц, такими как А (Н5Ш) и А (Н7№) [45, 46]. Смертность во время вспышек «птичьего» гриппа может достигать 60% [46, Ошибка! Источник ссылки не найден.].

Частое появление «дрейфовых» антигенных вариантов является вирусологической основой для сезонных эпидемий и является причиной ежегодно пересматривать необходимость изменения одного или нескольких из рекомендованных штаммов для вакцин против гриппа [47].

1.2. Гриппозные вакцины

Прошло сто лет с тех пор, когда возникла первая зарегистрированная пандемия гриппа, вызвана вирусом гриппа А (НШ1) - «Испанский» грипп 1918 года. Тем не менее по настоящее время фиксируются эпидемии и сезонные заболевания, вызванные вирусами гриппа. Для профилактики и снижения заболеваемости сезонным и пандемическим гриппом используются различные подходы, наиболее эффективным из которых является вакцинация. В настоящее время применяются инактивированные гриппозные вакцины (ИГВ) и живые гриппозные вакцины (ЖГВ) [49]. Используемые в настоящее время вакцины против сезонного гриппа обычно выпускаются в трехвалентном виде, включая два подтипа вирусов гриппа А - А (НШ1) и А (Н3К2) - и вируса гриппа В одной антигенной линии. Из-за двух одновременно циркулирующих вирусов гриппа В линии В/Виктория и В/Ямагата для наиболее эффективной защиты все чаще используют четырехвалентные вакцины, содержащие две антигенные линии вируса гриппа В. Производство четырехвалентных вакцин снижает риск несоответствия вакцинных штаммов эпидемическим [49].

С 1945 года вакцины против гриппа производятся на развивающихся куриных эмбрионах, и до сегодняшнего дня этот метод является актуальным.

1.2.1. Инактивированные гриппозные вакцины (ИГВ)

Есть три типа инактивированных вакцин: цельновирионные, расщепленные и субъединичные вакцины [50]. Цельновирионные вакцины получают путем очистки вирионов, которые химически инактивированы формальдегидом или в-пропиолактоном. В вакцине с расщепленным вирионом вирусные частицы разрушают диэтиловым эфиром или детергентами. Субъединичные вакцины содержат НА и КА, которые дополнительно очищаются путем исключения вирусного РНП, белка М1 и гликопротена. Инактивированные вакцины против гриппа вызывают штаммо-

1 и о т /-> __и

специфический сывороточный ответ антител и могут применяться для детей в возрасте от 6 месяцев и пожилых людей старше 65 лет [51].

1.2.2. Рекомбинантные гриппозные вакцины

Рекомбинантная вакцина на основе НА, экспрессирующегося на основе бакуловируса в клетках насекомых, одобрена для использования в США. Эта система не использует живые вирусы гриппа, используется только рекомбинантный белок НА, который не имеет нежелательных мутаций. Кроме того, процесс производства этой вакцины имеет более короткие сроки, что очень важно для своевременного реагирования на возникновение новых штаммов. Хотя механизм действия этой вакцины аналогичен механизму действия инактивированных вакцин, коммерческий состав рекомбинантной вакцины содержит 45 мкг НА, то есть в три раза больше, чем инактивированная субъединичная вакцина. Рекомбинантной ЕЛ вакциной прививают население в возрасте 18-49 лет, у для детей младшего возраста данная вакцина продемонстрировала низкую иммуногенность [52].

1.2.3. Живые гриппозные вакцины (ЖГВ)

Современные реассортантные вирусы, включаемые в состав сезонных ЖГВ, имеют формулу генома 6:2. Шесть генов, кодирующих внутренние и неструктурные белки (РВ2, РВ1, РА, ОТ, М и №) происходят от адаптированного к холоду (са-) и чувствительного к температуре (£?-) донора аттенуации. В качестве доноров аттенуации применяются хорошо охарактеризованные безвредные для человека лабораторные штаммы вирусов гриппа А и В [3,4,48]. Гены поверхностных антигенов НА и NA наследуются реассортантными вакцинными штаммами от циркулирующего эпидемического вируса «дикого» типа, рекомендованного Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) для производства сезонных вакцин (рисунок 3).

f

^ f

Дидр,Ш1ЩШНМЙ1 холоду (ca) к чч-ЕСТЕИгельнй к темпер arvpe (ts) (гены -?В 2, ?В 1. РА. ХР5 М к NS)

Гены псе ерхносткых анткгеноЕ НА к X А от цнркчгнрующего ъкрусз.

У Ч.

г

?В2

?Bi

RA.

ХР

NS

Ш

Ллаля гриппс:нал ыкцкка

/

Рисунок 3. Схема получения реассортантных вакцинных штаммов ЖГВ.

В 1937 году А.А. Смородинцев с коллегами впервые разработали интраназальную ЖГВ [53]. Для производства реассортантных вакцинных штаммов вирусов гриппа в СССР были разработаны «донорские» штаммы, адаптированные к пониженной температуре. Отечественная сезонная реассортантная ЖГВ применяется в практическом здравоохранении начиная с 1980-х годов. Начиная с 1980-х годов ХХ века вакцинные штаммы против вируса гриппа А, входящие в состав ЖГВ для взрослых и детей, подготавливают на основе холодоадаптированного (ХА) донора аттенуации - штамма А/Ленинград/134/17/57 (подтип H2N2) [54]. Донор аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) был получен после 17 пассажей на КЭ при пониженной до 25°C температуре. Во время серийных пассажей при 25°C вирусы гриппа приобретают несколько мутаций в геноме, которые отвечают за температурочувствительность (ts- фенотип) и фенотип адаптации к холоду (ca-фенотип). Это позволяет вирусу эффективно репродуцироваться при низких температурах. Репликация вируса ограничивается при высокой температуре, идентичной температуре нижних дыхательных путей человека (> 35°C), что приводит к аттенуации (att- фенотип).

Для производства вакцинных штаммов вирусов гриппа типа В в отделе вирусологии Института экспериментальной медицины был разработан донорский штамм В/СССР/60/69, адаптированный к пониженной температуре после 60 пассажей [5].

На территории США также были разработаны донорские штаммы для ЖГВ типа А и В: А/Анн-Арбор/6/60 (Н2Ш) и В/Анн-Арбор/1/66 соответственно [54, 55]. В отличие от отечественных «доноров» аттенуации, американские «донорские» штаммы получали при понижающих температурах по схеме от 36°С до 25°С, проводя множество пассажей на ткани первичной культуры почки цыпленка [55].

С 2003 года ЖГВ применяется на территории США [55]. В Канаде ЖГВ применяется с 2010 года, для пациентов от 2 до 59 лет; а в Европейском союзе с 2011 года с 2 до 17 лет [56]. ЖГВ была одобрена в программах вакцинации детей в Великобритании с 2013 г., и в Финляндии с 2015 г. [56]. Недавно Российская ЖГВ была лицензирована в КНР [57]. Несмотря на официальные рекомендации вакцинации против сезонного гриппа, показатели возрастных групп различаются в зависимости от рекомендаций органов общественного здравоохранения каждой отдельной страны. В России ЖГВ рекомендована для детей от 3-х лет и взрослых без ограничения возраста [58]. Американская ЖГВ применяется среди детей от двух лет и взрослых до 50 лет [56]. ЖГВ вводится интраназально, обеспечивая детям младшего возраста лучшую защиту от гриппа, чем современные инактивированные вакцины [59]. Интраназальное введение ЖГВ вызывает длительный иммунный (гуморальный и клеточный) ответ, напоминающий естественный иммунитет после инфекции [8, 60]. Преимуществами ЖГВ являются отсутствие серьезных побочных реакций и формирование локальных 1§А, который является основным изотипом секрета на слизистой оболочке и действует в основном на эпителиальных поверхностях, обеспечивая защиту во входных воротах инфекции [9].

Производство ЖГВ отличается более высокой продуктивностью по сравнению с производством ИГВ, когда требуется накопление и концентрирование больших объемов вирусного материала. Приблизительно 10 доз ЖГВ можно получить из одного куриного эмбриона [61].

1.2.3.1. Методы, применяемые в настоящее время для анализа состава генома вакцинных штаммов, включаемых в состав ЖГВ

Определение состава генома реассортантных вакцинных штаммов занимает важное место в процессе подготовки сезонных ЖГВ. На протяжении многих лет Всемирная Организация Здравоохранения (ВОЗ) постоянно обновляет свои рекомендации в отношении состава вакцины. На промежуточных этапах подготовки вакцинного штамма, когда нужно быстро проанализировать значительное число реассортантов, возникает потребность в разработке быстрых и недорогих методов скрининга вакцинных кандидатов. Анализ реассортантов - кандидатов в вакцинные штаммы проводится с использованием различных методов.

Электрофорез белков в полиакриламидном геле (ПААГ).

Долгое время для анализа реассортантных штаммов вируса гриппа применялся метод, основанный на разности подвижностей однонитевых РНК-сегментов разных вирусных гриппозных штаммов в электрофорезе в ПААГ [62]. Этот метод имеет ряд недостатков. Во-первых, разность в электрофоретических подвижностях генетически похожих, особенно протяженных РНК-сегментов разных штаммов трудно различима. Во-вторых, порядок миграции при электрофорезе в полиакриламидном геле для некоторых генов может меняться.

Рестрикционный анализ состава генома ЖГВ.

В 1994 году А.И. Климовым и Н. Дж. Кокс был предложен метод, позволяющий изучать одиночные нуклеотидные замены доноров аттенуации и эпидемических штаммов, суть которого заключалась в довольно быстром и простом определении состава генома и генетической стабильности ЖГВ [12]. Метод основан на амплификации отдельных РНК-сегментов (длиной примерно 150-300 нуклеотидов), содержащих мутации, методом ОТ-ПЦР и дальнейшем рестрикционном анализе ДНК при помощи эндонуклеаз рестрикции. В процессе рестрикционного анализа генома кандидата в вакцинные штаммы сайты рестрикции, характерные для одного из родительских штаммов, узнаются выбранными нуклеазами. Метод нуждается в минимальном количестве вирусного материала (примерно 100 мкл аллантоидной жидкости) и показывает относительно быстрое определение (в течение 10-ти часов)

наличия или отсутствия мутаций. Этот метод сочетает в себе высокую чувствительность ПЦР-анализа и высокую специфичность рестрикционного анализа, он позволяет изучать уникальные нуклеотидные различия между вакцинными донорами аттенуации и дикими штаммами для анализа состава генома и генетической стабильности реассортантов вируса гриппа. Авторами были идентифицированы изменения в последовательностях нуклеотидов при сравнении родительского дикого штамма и двух ХА доноров аттенуации А/Ленинград/134/17/57(Е2К2) и А/Ленинград/134/47/57(Е2К2), предназначенных для подготовки вакцинных щтаммов для взрослых и детей от 3-х до 14 лет соответственно. В шести генах холодоадаптированного донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57(Н2К2) выявлено 10 нуклеотидных замен, 8 из которых являются значащими. Существенно, что все мутации, обнаруженные в геноме донора А/Ленинград/134/17/57(Е2К2), сохранились в геноме прошедшего 30 дополнительных пассажей в куриных эмбрионах при 25°С ХА-штамма А/Ленинград/134/47/57(Н2К2), который при этом приобрёл ещё четыре дополнительные мутации, три из которых являются значащими. Метод, предложенный в 1994 году, получил широкое распространение и повсеместно используется и сегодня при создании ЖГВ.

Мультиплексная ПЦР.

Данная методика используется как для типирования вирусов гриппа типа А и В, так и для отбора вакцинных штаммов [68]. Принцип метода заключается в подборе флуоресцентно-меченых пар олигонуклеотидных праймеров, специфичных для внутренних генов донора аттенуации, и генов, кодирующих НА и КА эпидемического вируса, для образования ПЦР-продукта для каждого сегмента генома в мультиплексной конфигурации, которую затем исследуют с помощью электрофореза. Происхождение каждого сегмента можно определить по флюоресценции и электрофоретической подвижности. Затем последовательность всех генов реассортанта подтверждается секвенированием [63, 64].

Анализ состава генома ЖГВ методом пиросеквенирования.

Сравнительно недавно был разработан еще один метод оценки состава генома -пиросеквенирование, который заключается в том, что в процессе синтеза ДНК

происходит детектирование высвобождающихся пирофосфатов. Данный метод сочетает в себе все преимущества секвенирования и ПЦР в режиме реального времени, что позволяет получать точную информацию о последовательности, по меньшей мере, 50 нуклеотидов, а также проводить высокопродуктивный скрининг до 96 образцов в течение 1,5-2 часов. Пиросеквенирование в основном используется для типирования вируса гриппа и скрининга мутаций, например, для выявления мутаций, отвечающих за устойчивость вируса к различным противогриппозным препаратам [13]. Возможно использование данной методики и для анализа состава генома кандидатов в вакцинные штаммы [65, 66].

Каждый из перечисленных методов имеет свои преимущества и недостатки. Основными ограничениями методов рестрикционного анализа и мультиплексной ПЦР является оценка результатов косвенным путем - по размеру фрагментов на электрофореграмме, что подразумевает возможность получения ложных результатов. Полное или частичное секвенирование исключает получение ложных результатов, однако анализ реассортантов требует применения дорогостоящих реактивов и значительных трудозатрат, в связи с чем малопригодно для рутинного анализа большого числа образцов. В связи с этим необходимо разработать альтернативный, высокоскоростной и недорогой метод первичного скрининга вакцинных кандидатов.

Анализ кривых плавления продуктов ПЦР с высоким разрешением, предложенный в 2003 г. [67], заключается в обработке профилей кривых плавления, которые являются специфичными и достаточно чувствительными для различия ДНК с небольшими отклонениями в последовательности, что позволяет сканировать мутации, анализировать метилирование и выполнять генотипирование [68]. НЯМ-анализ можно использовать для характеристики образцов на основе их гуанин-цитозинового состава (ГЦ) и комплементарности последовательностей ДНК. Растущая тенденция к упрощению анализа полиморфизма мононуклеотидов приводит к быстрому развитию НЯМ-технологий. Для проведения анализа кривых плавления с высоким разрешением рекомендуется использовать интеркалирующие красители третьего поколения, такие как EvaGreen, LCGreen и SYTO9 [68, 69]. Эти красители обладают низкой токсичностью; они не ингибируют процесс ПЦР и могут использоваться в ОТ-ПЦР в

более высоких концентрациях, чем SybrGreen. Это позволяет достичь более высокого насыщения двухцепочечной ДНК красителем и снижает перераспределение красителя на неденатурированные участки ДНК в процессе плавления. Популярные используемые красители включают: LC Green/LC Green Plus (Idaho Technology Inc., США), Reso Light Dye (Roche Diagnostics Limited, КНР) и SYTO9 (Invitrogen, КНР). Среди перечисленных LC Green, LC Green Plus, безусловно, наиболее широко используются благодаря своей высокой чувствительности, стабильности, надежности и совместимости со многими инструментами HRM [68]. Однако высокая стоимость этих красителей часто ограничивает применение этой технологии, особенно при работе с большим количеством образцов. EvaGreen (BiotiumInc., США) представляет собой недавно разработанный и недорогой краситель акридинового ряда, который используется в количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени, анализе кривых плавления ДНК после ПЦР, который используется для обнаружения и количественной оценки вирусов гриппа [69], а также для скрининга новых появляющихся штаммов в популяции [70, 71, 72].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Ландграф Галина, 2023 год

Список литературы

1. Treanor J. J. Influenza vaccination //New England Journal of Medicine. - 2016. - Т. 375. - №. 13. - С. 1261-1268.

2. Fiore AE, Uyeki TM, Broder K, et al, and the Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Prevention and control of influenza with vaccines: recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices (ACIP), 2010. MMWR Recomm Rep 2010; 59: 1-62.

3. Александрова Г. И., Климов А. И. Живая вакцина против гриппа СПб. - 1994.

4. Klimov A. I. et al. Genes coding for polymerase proteins are essential for attenuation of the cold-adapted A/Leningrad/134/17/57 (H2N2) influenza virus //International Congress Series. - Elsevier, 2001. - Т. 1219. - С. 955-959.

5. Alexandrova G. I. et al. Laboratory properties of cold-adapted influenza B live vaccine strains developed in the US and USSR, and their B/Ann Arbor/1/86 cold-adapted reassortant vaccine candidates //Vaccine. - 1990. - Т. 8. - №. 1. - С. 61-64.

6. Demicheli V. et al. Vaccines for preventing influenza in healthy adults //Cochrane database of systematic reviews. - 2018. - №. 2.

7. Poland G. A. Influenza vaccine failure: failure to protect or failure to understand? //Expert review of vaccines. - 2018. - Т. 17. - №. 6. - С. 495-502.

8. Mohn K. G. I. et al. Early induction of cross-reactive CD8+ T-cell responses in tonsils after live-attenuated influenza vaccination in children //The Journal of infectious diseases. -2020. - Т. 221. - №. 9. - С. 1528-1537.

9. Ambrose C. S. et al. The role of nasal IgA in children vaccinated with live attenuated influenza vaccine //Vaccine. - 2012. - Т. 30. - №. 48. - С. 6794-6801.

10. Forrest B. D. et al. Correlation of cellular immune responses with protection against culture-confirmed influenza virus in young children //Clinical and vaccine immunology. -2008. - Т. 15. - №. 7. - С. 1042-1053.

11. Rekstin A. R. et al. Early protection against influenza by pandemic live attenuated influenza vaccines //Medical academic journal. - 2019. - Т. 19. - №. 3. - С. 37-46.

12. Klimov A. I., Cox N. J. PCR restriction analysis of genome composition and stability of cold-adapted reassortant live influenza vaccines //Journal of virological methods. - 1995.

- Т. 52. - №. 1-2. - С. 41-49.

13. Shcherbik S. V. et al. Rapid strategy for screening by pyrosequencing of influenza virus reassortants-candidates for live attenuated vaccines //PloS one. - 2014. - Т. 9. - №. 3. -С.e92580.

14. Centers for Disease Control and Prevention (CDC et al. Bacterial coinfections in lung tissue specimens from fatal cases of 2009 pandemic influenza A (H1N1)-United States, May-August 2009 //MMWR. Morbidity and mortality weekly report. - 2009. - Т. 58. - №. 38. -С. 1071-1074.

15. Haynes L. et al. Immunity to the conserved influenza nucleoprotein reduces susceptibility to secondary bacterial infections //The Journal of Immunology. - 2012. - Т. 189. - №. 10. - С. 4921-4929.

16. Suvorov A. et al. Construction of recombinant polypeptides based on beta antigen C (Bac) protein & their usage for protection against group B streptococcal infection //Indian Journal of Medical Research. - 2004. - Т. 119. - С. 228-232.

17. Zang Y. et al. Development of one-step real-time PCR assay for titrating trivalent live attenuated influenza vaccines //Human vaccines & immunotherapeutics. - 2014. - Т. 10. -№. 12. - С. 3642-3648.

18. Плотникова М. А. и др. Разработка мультиплексной пир для определения уровня цитокинов //Вестник гематологии. - 2014. - Т. 10. - №. 4. - С. 46-47.

19. Desheva Y. A. et al. Factors of early protective action of live influenza vaccine combined with recombinant bacterial polypeptides against homologous and heterologous influenza infection //Heliyon. - 2019. - Т. 5. - №. 2. - С. e01154.

20. Spackman E. A brief introduction to the avian influenza virus //Avian Influenza Virus.

- 2008. - С. 1-6.

21. Wu Y. et al. Bat-derived influenza-like viruses H17N10 and H18N11 //Trends in microbiology. - 2014. - Т. 22. - №. 4. - С. 183-191.

22. Kumar B. et al. The emerging influenza virus threat: status and new prospects for its therapy and control //Archives of virology. - 2018. - Т. 163. - №. 4. - С. 831-844.

23. Iuliano A. D. et al. Estimates of global seasonal influenza-associated respiratory mortality: a modelling study //The Lancet. - 2018. - T. 391. - №. 10127. - C. 1285-1300.

24. McCullers J. A., Hayden F. G. Fatal influenza B infections: time to reexamine influenza research priorities //Journal of Infectious Diseases. - 2012. - T. 205. - №. 6. - C. 870-872.

25. Su S. et al. Novel Influenza D virus: Epidemiology, pathology, evolution and biological characteristics //Virulence. - 2017. - T. 8. - №. 8. - C. 1580-1591.

26. Krammer, F., et al.//Nature Reviews Disease Primers. - 2018. - Vol. 4. - Issue 1 P. 3.

27. Cox R. J., Brokstad K. A., Ogra P. L. Influenza virus: immunity and vaccination strategies. Comparison of the immune response to inactivated and live, attenuated influenza vaccines //Scandinavian journal of immunology. - 2004. - T. 59. - №. 1. - C. 1-15.

28. Guilligay D. et al. The structural basis for cap binding by influenza virus polymerase subunit PB2 //Nature structural & molecular biology. - 2008. - T. 15. - №. 5. - C. 500-506.

29. Perez D. R., Donis R. O. Functional analysis of PA binding by influenza a virus PB1: effects on polymerase activity and viral infectivity //Journal of virology. - 2001. - T. 75. -№. 17. - C. 8127-8136.

30. Lamb R. A., Lai C. J., Choppin P. W. Sequences of mRNAs derived from genome RNA segment 7 of influenza virus: colinear and interrupted mRNAs code for overlapping proteins //Proceedings of the National Academy of Sciences. - 1981. - T. 78. - №. 7. - C. 4170-4174.

31. Jiang H. et al. Influenza virus non structural protein 1 inhibits the production of interferon p of alveolar epithelial cells upon the infection of influenza A H1N1 //Molecular Medicine Reports. - 2017. - T. 16. - №. 4. - C. 4553-4560.

32. Nogales A. et al. Functional evolution of the 2009 pandemic H1N1 influenza virus NS1 and PA in humans //Journal of Virology. - 2018. - T. 92. - №. 19. - C. e01206-18.

33. Zhang L. et al. Influenza virus NS1 protein-RNA interactome reveals intron targeting //Journal of virology. - 2018. - T. 92. - №. 24. - C. e01634-18.

34. Dauber B., Heins G., Wolff T. The influenza B virus nonstructural NS1 protein is essential for efficient viral growth and antagonizes beta interferon induction //Journal of virology. - 2004. - T. 78. - №. 4. - C. 1865-1872.

35. Waters K. et al. Variations outside the conserved motifs of PB1 catalytic active site may affect replication efficiency of the RNP complex of influenza A virus //Virology. -2021. - T. 559. - C. 145-155.

36. Biswas S. K., Nayak D. P. Mutational analysis of the conserved motifs of influenza A virus polymerase basic protein 1 //Journal of virology. - 1994. - T. 68. - №. 3. - C. 18191826.

37. Gaymard A. et al. Functional balance between neuraminidase and haemagglutinin in influenza viruses //Clinical Microbiology and Infection. - 2016. - T. 22. - №. 12. - C. 975983.

38. Petrova V. N., Russell C. A. The evolution of seasonal influenza viruses //Nature Reviews Microbiology. - 2018. - T. 16. - №. 1. - C. 47.

39. Kim H., Webster R. G., Webby R. J. Influenza virus: dealing with a drifting and shifting pathogen //Viral immunology. - 2018. - T. 31. - №. 2. - C. 174-183.

40. Garten R. J. et al. Antigenic and genetic characteristics of swine-origin 2009 A (H1N1) influenza viruses circulating in humans //science. - 2009. - T. 325. - №. 5937. - C. 197-201.

41. Ding X. et al. Progress and Challenge in Computational Identification of Influenza Virus Reassortment //Virologica Sinica. - 2021. - C. 1-11.

42. Kain T., Fowler R. Preparing intensive care for the next pandemic influenza //Critical Care. - 2019. - T. 23. - №. 1. - C. 1-9.

43. Smith G. J. D. et al. Dating the emergence of pandemic influenza viruses //Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2009. - T. 106. - №. 28. - C. 11709-11712.

44. Writing Committee of the World Health Organization (WHO) Consultation on Human Influenza A/H5. Avian influenza A (H5N1) infection in humans //New England Journal of Medicine. - 2005. - T. 353. - №. 13. - C. 1374-1385

45. Lam T. T. Y. et al. The genesis and source of the H7N9 influenza viruses causing human infections in China //Nature. - 2013. - T. 502. - №. 7470. - C. 241-244.

46. European Food Safety Authority et al. Avian influenza overview February-May 2020 //Efsa Journal. - 2020. - T. 18. - №. 6. - C. e06194.

47. Wong S. S. Y., Yuen K. Avian influenza virus infections in humans //Chest. - 2006. -T. 129. - №. 1. - C. 156-168.

48. Yamayoshi S., Kawaoka Y. Current and future influenza vaccines //Nature medicine. -2019. - Т. 25. - №. 2. - С. 212-220.

49. Харит С. М. и др. Предотвращенный ущерб при вакцинации против гриппа 3-и 4-валентными вакцинами //Журнал инфектологии. - 2017. - Т. 9. - №. 2. - С. 17-22.

50. World Health Organization et al. Influenza vaccines: recommendations for the use of inactivated influenza vaccines and other preventive measures //Weekly Epidemiological Record= Relevé épidémiologique hebdomadaire. - 2000. - Т. 75. - №. 35. - С. 281-288.

51. Iorio A. M. et al. Immune response to trivalent inactivated influenza vaccine in young and elderly subjects //Vaccine. - 1989. - Т. 7. - №. 4. - С. 341-344.

52. Mathew N. R., Angeletti D. Recombinant influenza vaccines: saviors to overcome immunodominance //Frontiers in immunology. - 2020. - Т. 10. - С. 2997.

53. Голубев Д. Б., Смородинцев А. А. Анатолий Александрович Смородинцев-корифей иммунологии и вакцинопрофилактики вирусных инфекций //Эпидемиология и вакцинопрофилактика. - 2007. - №. 2. - С. 1-6.

54. Kendal A. P. et al. Development of cold-adapted recombinant live, attenuated influenza A vaccines in the USA and USSR //Antiviral research. - 1982. - Т. 1. - №. 6. - С. 339-365.

55. Subbarao K. Live Attenuated Cold-Adapted Influenza Vaccines //Cold Spring Harbor perspectives in medicine. - 2020. - С. a038653.

56. Pebody R., McMenamin J., Nohynek H. Live attenuated influenza vaccine (LAIV): recent effectiveness results from the USA and implications for LAIV programmes elsewhere //Archives of disease in childhood. - 2018. - Т. 103. - №. 1. - С. 101-105.

57. http://www.biodiem.com/wp-content/uploads/2020/02/20-02-28-LAIV-influenza-vaccine-approved-in-China.pdf

58. Rudenko L. Live attenuated vaccine in Russia: Advantages, further research and development //proceedings of the international conference on options for the control of influenza VI, Toronto, Ontario, Canada. - 2007. - С. 122-124.

59. Rudraraju R., Mordant F., Subbarao K. How live attenuated vaccines can inform the development of broadly cross-protective influenza vaccines //The Journal of infectious diseases. - 2019. - Т. 219. - №. Supplement_1. - С. S81-S87.

60. Hoft D. F. et al. Comparisons of the humoral and cellular immune responses induced by live attenuated influenza vaccine and inactivated influenza vaccine in adults //Clinical and Vaccine Immunology. - 2017. - T. 24. - №. 1.

61. Chen J. R. et al. Better influenza vaccines: An industry perspective //Journal of biomedical science. - 2020. - T. 27. - №. 1. - C. 1-11.

62. Palese P., Schulman J. L. Differences in RNA patterns of influenza A viruses //Journal of Virology. - 1976. - T. 17. - №. 3. - C. 876-884.

63. Ellis J. S., Fleming D. M., Zambon M. C. Multiplex reverse transcription-PCR for surveillance of influenza A and B viruses in England and Wales in 1995 and 1996 //Journal of clinical microbiology. - 1997. - T. 35. - №. 8. - C. 2076-2082.

64. Le T. B. et al. Development of a multiplex RT-qPCR for the detection of different clades of avian influenza in poultry //Viruses. - 2020. - T. 12. - №. 1. - C. 100.

65. Deng Y. M., Caldwell N., Barr I. G. Rapid detection and subtyping of human influenza A viruses and reassortants by pyrosequencing //PLoS One. - 2011. - T. 6. - №. 8. - C. e23400.

66. Deyde V. M. et al. Pyrosequencing as a tool to detect molecular markers of resistance to neuraminidase inhibitors in seasonal influenza A viruses //Antiviral research. - 2009. - T. 81. - №. 1. - C. 16-24.

67. Wittwer C. T. et al. High-resolution genotyping by amplicon melting analysis using LCGreen //Clinical chemistry. - 2003. - T. 49. - №. 6. - C. 853-860.

68. Liew M. et al. Genotyping of single-nucleotide polymorphisms by high-resolution melting of small amplicons //Clinical chemistry. - 2004. - T. 50. - №. 7. - C. 1156-1164.

69. Eischeid A. C. SYTO dyes and EvaGreen outperform SYBR Green in real-time PCR //BMC research notes. - 2011. - T. 4. - №. 1. - C. 1-5.

70. Herrmann M. G. et al. Amplicon DNA melting analysis for mutation scanning and genotyping: cross-platform comparison of instruments and dyes //Clinical chemistry. - 2006. - T. 52. - №. 3. - C. 494-503.

71. Curd E. et al. Rapid influenza A detection and quantitation in birds using a one-step real-time reverse transcriptase PCR and High Resolution Melting //Journal of virological methods. - 2011. - T. 176. - №. 1-2. - C. 125-130.

72. Lin J. H. et al. Rapid differentiation of influenza A virus subtypes and genetic screening for virus variants by high-resolution melting analysis //Journal of clinical microbiology. - 2008. - T. 46. - №. 3. - C. 1090-1097.

73. Uyeki T. M., Peiris M. Novel avian influenza A virus infections of humans //Infectious Disease Clinics. - 2019. - T. 33. - №. 4. - C. 907-932.

74. Wang D. et al. The epidemiology, virology, and pathogenicity of human infections with avian influenza viruses //Cold Spring Harbor perspectives in medicine. - 2020. - C. a038620.

75. Webster R. G. et al. Intestinal influenza: replication and characterization of influenza viruses in ducks //Virology. - 1978. - T. 84. - №. 2. - C. 268-278.

76. Koopmans M. et al. Transmission of H7N7 avian influenza A virus to human beings during a large outbreak in commercial poultry farms in the Netherlands //The Lancet. - 2004. - T. 363. - №. 9409. - C. 587-593.

77. Fouchier R.A., Schneeberger P.M., Rozendaal F.W. et al. Avian influenza A virus (H7N7) associated with human conjunctivitis and a fatal case of acute respiratory distress syndrome // PNAS USA. - 2004. - T. 101. - C. 1356-1361.

78. on Emerging C. U. S. C. P. et al. Emergence of avian influenza A (H7N9) virus causing severe human illness—China, February-April 2013 //MMWR. Morbidity and mortality weekly report. - 2013. - T. 62. - №. 18. - C. 366.

79. World Health Organization et al. Human infection with avian influenza A (H7N9) virus—China: update //World Health Organization, Geneva, Switzerland. https://www. who. int/csr/don/05-september-2018-ah7n9-china/en. - 2018.

80. World Health Organization http://www.who.int/csr/don717-august-2016-ah7n9-china/en/.

81. Zeng H. et al. A (H7N9) virus results in early induction of proinflammatory cytokine responses in both human lung epithelial and endothelial cells and shows increased human adaptation compared with avian H5N1 virus //Journal of virology. - 2015. - T. 89. - №. 8. -C. 4655-4667.

82. Shi J. et al. A detailed epidemiological and clinical description of 6 human cases of avian-origin influenza A (H7N9) virus infection in Shanghai //PLoS One. - 2013. - T. 8. -№. 10. - C. e77651.

83. Zhou L. et al. Clusters of human infection and human-to-human transmission of avian influenza A (H7N9) virus, 2013-2017 //Emerging infectious diseases. - 2018. - T. 24. - №. 2. - C. 397

84. Wu J. et al. Influenza H5/H7 virus vaccination in poultry and reduction of zoonotic infections, Guangdong Province, China, 2017-18 //Emerging infectious diseases. - 2019. -T. 25. - №. 1. - C. 116.

85. James J. et al. A global perspective on H9N2 avian influenza virus //Viruses. - 2019. -T. 11. - №. 7. - C. 620.

86. Hoffmann E. et al. Characterization of the influenza A virus gene pool in avian species in southern China: was H6N1 a derivative or a precursor of H5N1? //Journal of virology. -2000. - T. 74. - №. 14. - C. 6309-6315.

87. Yuan J. et al. Origin and molecular characteristics of a novel 2013 avian influenza A (H6N1) virus causing human infection in Taiwan //Clinical infectious diseases. - 2013. - T. 57. - №. 9. - C. 1367-1368.

88. Corrand L. et al. A low-pathogenic avian influenza H6N1 outbreak in a turkey flock in France: a comprehensive case report //Avian Pathology. - 2012. - T. 41. - №. 6. - C. 569577.

89. Di Pillo F. et al. Novel Low Pathogenic Avian Influenza H6N1 in Backyard Chicken in Easter Island (Rapa Nui), Chilean Polynesia //Viruses. - 2022. - T. 14. - №. 4. - C. 718.

90. Wei S. H. et al. Human infection with avian influenza A H6N1 virus: an epidemiological analysis //The lancet Respiratory medicine. - 2013. - T. 1. - №. 10. - C. 771-778.

91. Wu H. et al. Isolation and genetic characterization of novel reassortant H6N6 subtype avian influenza viruses isolated from chickens in eastern China //Archives of virology. -2016. - T. 161. - №. 7. - C. 1859-1872.

92. Yuan R. et al. Reassortment of avian influenza A/H6N6 viruses from live poultry markets in Guangdong, China //Frontiers in microbiology. - 2016. - T. 7. - C. 65.

93. Фармакопейная Статья на «Вакцину гриппозную аллантоисную интраназальную живую сухую» // ФСП 42-0504-4097-04.-2004.-12 с.

94. Романова Ю.Р. Принципы конструирования дивакцин из холодоадаптированных рекомбинантов вируса гриппа А: Дисс. канд. мед. наук.- Л„ 1988.-134 с

95. Hawksworth A. et al. Replication of live attenuated influenza vaccine viruses in human nasal epithelial cells is associated with H1N1 vaccine effectiveness //Vaccine. - 2020. - Т. 38. - №. 26. - С. 4209-4218.

96. Shcherbik S. et al. Application of real time RT-PCR for the genetic homogeneity and stability tests of the seed candidates for live attenuated influenza vaccine production //Journal of virological methods. - 2014. - Т. 195. - С. 18-25.

97. Köhler G., Milstein C. Derivation of specific antibody-producing tissue culture and tumor lines by cell fusion //European journal of immunology. - 1976. - Т. 6. - №. 7. - С. 511-519.

98. Kreijtz J.H.C.M., Fouchier R.A.M., Rimmelzwaan G.F. Immune responses to influenza virus infection.// J. Virus Research- 2011- vol. 162, pp. 19- 30.

99. Julkunen I., Sareneva T., Pirhonen J., Ronni T., Melen K., et al. Molecular pathogenesis of influenza A virus infection and virus-induced regulation of cytokine gene expression.// J. Cytokine & Growth Factor Reviews-2001 - vol. 12, pp. 171-180.

100. Biondo C. et al. The dual role of innate immunity during influenza //biomedical journal. - 2019.

101. Betakova T. et al. Cytokines induced during influenza virus infection //Current pharmaceutical design. - 2017. - Т. 23. - №. 18. - С. 2616-2622.

102. Edwards M. R., Slater L., Johnston S. L. Signalling pathways mediating type I interferon gene expression.// J. Microbes and Infection-2007- vol.9, pp. 1245-1251.

103. Almatrrouk S. et al. Virus sensing receptors in cellular infectivity of influenza A virus //The Journal of Infection in Developing Countries. - 2021. - Т. 15. - №. 01. - С. 1-8.

104. Ichinohe T., Pang I. K., Iwasaki A. Influenza virus activates inflammasomes via its intracellular M2 ion channel //Nature immunology. - 2010. - Т. 11. - №. 5. - С. 404-410.

105. Pang IK, Iwasaki A (2011) Inflammasomes as mediators of immunity against influenza virus. Trends Immunol 32: 34-41.

106. Garcia M. A., Gil J., Ventoso I., Guerra S., Esteban M., et al. Impact of Protein Kinase PKR in Cell Biology: from Antiviral to Antiproliferative Action.// J. Microbiology and molecular biology reviews-2006- vol.70, pp. 1032-1060.

107. Marion T. et al. Respiratory mucosal proteome quantification in human influenza infections //PloS one. - 2016. - Т. 11. - №. 4. - С. e0153674.

108. Ludwig S., Planz O., Pleschka S., Wolff T. Influenza-virus-induced signaling cascades: targets for antiviral therapy// J. Trends in Molecular Medicine-2003-vol.9, No.2.

109. Mogensen T, Paludan S. Molecular Pathways in virus-induced cytokine production. microbiology and molecular biology reviews 2001;65(1): 131-150.

110. Stetson D, Medzhitov R: Type I interferons in host defense. Immunity. 2006;25:373-381

111. Honda K., Takaoka A., Taniguchi T. Type I Interferon Gene Induction by the Interferon Regulatory Factor Family of Transcription Factors.// J. Immunity-2006-vol.25, pp. 349-360.

112. Van Reeth Kristien. Cytokines in the pathogenesis of influenza.// J. Veterinary Microbiology-2000-vol. 74, pp. 109-116.

113. McClain M. T. et al. Differential evolution of peripheral cytokine levels in symptomatic and asymptomatic responses to experimental influenza virus challenge //Clinical & Experimental Immunology. - 2016. - Т. 183. - №. 3. - С. 441-451.

114. Alagarasu K. et al. TNFA and IL10 Polymorphisms and IL-6 and IL-10 Levels Influence Disease Severity in Influenza A (H1N1) pdm09 Virus Infected Patients //Genes. -2021. - Т. 12. - №. 12. - С. 1914.

115. Фрейдлин И. С. Иммунная система и ее дефекты. - 1998.

116. Chen X. et al. Host immune response to influenza A virus infection //Frontiers in immunology. - 2018. - Т. 9. - С. 320.

117. Haller O., Kochs G. Human MxA protein: an interferon-induced dynamin-like GTPase with broad antiviral activity //Journal of Interferon & Cytokine Research. - 2011. - Т. 31. -№. 1. - С. 79-87.

118. Wang P. et al. Generation of DelNS1 influenza viruses: a strategy for optimizing live attenuated influenza vaccines //MBio. - 2019. - Т. 10. - №. 5. - С. e02180-19.

119. Thomas M. et al. Proinflammatory chemokines are major mediators of exuberant immune response associated with Influenza A (H1N1) pdm09 virus infection //Journal of Medical Virology. - 2017. - T. 89. - №. 8. - C. 1373-1381.

120. Feghali C. A. and Wright. T. M. Cytokines in acute and chronic inflammation.// J. Frontiers in Bioscience-1997-vol.2, pp.12-26.

121. Shastri M. D. et al. Interleukin-13: A pivotal target against influenza-induced exacerbation of chronic lung diseases //Life sciences. - 2021. - T. 283. - C. 119871.

122. Bradley-Stewart A. et al. Cytokine responses in patients with mild or severe influenza A (H1N1) pdm09 //Journal of Clinical Virology. - 2013. - T. 58. - №. 1. - C. 100-107.

123. Herbein G. and. O'Brien W. A. Tumor necrosis factor (TNF)-a and TNF-a receptors in viral pathogenesis.//J. Society for Experimental Biology and Medicine-2000-vol. 223, pp. 241-257.

124. Kishimoto T, Akira S, Narazaki M, Taga T. Interleukin-6 family of cytokines and gp130.// J. Blood 86-1995- vol. 4, pp. 1243-54.

125. Hopkins Stephen John. The pathophysiological role of cytokines.// J. Legal Medicine-2003- vol.5, pp.45-57.

126. Scheller J. et al. The pro-and anti-inflammatory properties of the cytokine interleukin-6 //Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research. - 2011. - T. 1813. - №. 5. - C. 878-888.

127. Borish L. C. and Steinke J. W. Cytokines and chemokines.// Journal of Allergy and Clinical Immunology-2003-vol.111, pp. 460-475.

128. Wang H. et al. G-CSFR antagonism reduces neutrophilic inflammation during pneumococcal and influenza respiratory infections without compromising clearance //Scientific Reports. - 2019. - T. 9. - №. 1. - C. 1-12.

129. Rose-John S. and Heinrich P.C. Soluble receptors for cytokines and growth factors: generation and biological function.// Biochemical Journal-1994-vol.300, pp. 281-290.

130. Denney L. et al. Epithelial-derived TGF-ß1 acts as a pro-viral factor in the lung during influenza A infection //Mucosal immunology. - 2018. - T. 11. - №. 2. - C. 523-535.

131. Zvezdanovic L. et al. The significance of cytokines in diagnosis of autoimmune diseases //Jugoslovenska medicinska biohemija. - 2006. - T. 25. - №. 4. - C. 363-372.

132. Wu W. et al. Innate immune response to H3N2 and H1N1 influenza virus infection in a human lung organ culture model //Virology. - 2010. - T. 396. - №. 2. - C. 178-188.

133. Rekstin A. R. et al. Interferon and other proinflammatory cytokine responses in vitro following infection with wild-type and cold-adapted reassortant influenza viruses //Vaccine. - 2006. - T. 24. - №. 44-46. - C. 6581-6584.

134. Nüssing S. et al. Innate and adaptive T cells in influenza disease //Frontiers of medicine. - 2018. - T. 12. - №. 1. - C. 34-47.

135. Liu Q., Zhou Y., Yang Z. The cytokine storm of severe influenza and development of immunomodulatory therapy //Cellular & molecular immunology. - 2016. - T. 13. - №. 1. -C. 3-10.

136. Nakayama T. et al. Cytokine production in whole-blood cultures following immunization with an influenza vaccine //Human vaccines & immunotherapeutics. - 2018. -T. 14. - №. 12. - C. 2990-2998.

137. Peiris J. S. M. et al. Innate immune responses to influenza A H5N1: friend or foe? //Trends in immunology. - 2009. - T. 30. - №. 12. - C. 574-584.

138. Mok K. P. et al. Viral genetic determinants of H5N1 influenza viruses that contribute to cytokine dysregulation //The Journal of infectious diseases. - 2009. - T. 200. - №. 7. - C. 1104-1112.

139. Short K. R. et al. Proinflammatory cytokine responses in extra-respiratory tissues during severe influenza //The Journal of infectious diseases. - 2017. - T. 216. - №. 7. - C. 829-833.

140. Meliopoulos V. A. et al. Human H7N9 and H5N1 influenza viruses differ in induction of cytokines and tissue tropism //Journal of Virology. - 2014. - T. 88. - №. 22. - C. 1298212991.

141. Wang Z. et al. Early hypercytokinemia is associated with interferon-induced transmembrane protein-3 dysfunction and predictive of fatal H7N9 infection //Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2014. - T. 111. - №. 2. - C. 769-774.

142. Nakayama T. et al. Cytokine production in whole-blood cultures following immunization with an influenza vaccine //Human vaccines & immunotherapeutics. - 2018. -T. 14. - №. 12. - C. 2990-2998.

143. Ramakrishnan A. et al. Differential serum cytokine responses to inactivated and live attenuated seasonal influenza vaccines //Cytokine. - 2012. - Т. 60. - №. 3. - С. 661-666.

144. Найхин А. Н. и др. Продукция интерлейкина-2 in vitro и in vivo у пожилых людей, привитых раздельно и сочетанно живой и инактивированной гриппозными вакцинами //Вопросы вирусологии. - 2000. - Т. 45. - №. 1. - С. 25-29.

145. Lanthier P. A. et al. Live attenuated influenza vaccine (LAIV) impacts innate and adaptive immune responses //Vaccine. - 2011. - Т. 29. - №. 44. - С. 7849-7856.

146. Zhu J., Yamane H., Paul W. E. Differentiation of effector CD4 T cell populations //Annual review of immunology. - 2009. - Т. 28. - С. 445-489.

147. van Gisbergen K. P. J. M. et al. The costimulatory molecule CD27 maintains clonally diverse CD8+ T cell responses of low antigen affinity to protect against viral variants //Immunity. - 2011. - Т. 35. - №. 1. - С. 97-108.

148. Grant E. J. et al. Human influenza viruses and CD8+ T cell responses //Current opinion in virology. - 2016. - Т. 16. - С. 132-142

149. Mix E., Goertsches R., Zett U. K. Immunoglobulins—basic considerations //Journal of neurology. - 2006. - Т. 253. - №. 5. - С. v9-v17.

150. Krammer F. The human antibody response to influenza A virus infection and vaccination //Nature Reviews Immunology. - 2019. - Т. 19. - №. 6. - С. 383-397.

151. Hermans D., Webby R. J., Wong S. S. Atypical antibody responses to influenza //Journal of thoracic disease. - 2018. - Т. 10. - №. Suppl 19. - С. S2238.

152. Kipps T. J. et al. Importance of immunoglobulin isotype in human antibody-dependent, cell-mediated cytotoxicity directed by murine monoclonal antibodies //The Journal of experimental medicine. - 1985. - Т. 161. - №. 1. - С. 1-17.

153. Huber V. C. et al. Distinct contributions of vaccine-induced immunoglobulin G1 (IgG1) and IgG2a antibodies to protective immunity against influenza //Clinical and Vaccine Immunology. - 2006. - Т. 13. - №. 9. - С. 981-990.

154. Tamura S., Kurata T. Defense mechanisms against influenza virus infection in the respiratory tract mucosa //Jpn J Infect Dis. - 2004. - Т. 57. - №. 6. - С. 236-47.

155. van Riet E. et al. Mucosal IgA responses in influenza virus infections; thoughts for vaccine design //Vaccine. - 2012. - Т. 30. - №. 40. - С. 5893-5900.

156. Suzuki T., Ainai A., Hasegawa H. Functional and structural characteristics of secretory IgA antibodies elicited by mucosal vaccines against influenza virus //Vaccine. - 2017. - Т. 35. - №. 39. - С. 5297-5302.

157. McCullers J. A., Huber V. C. Correlates of vaccine protection from influenza and its complications //Human vaccines & immunotherapeutics. - 2012. - Т. 8. - №. 1. - С. 34-44.

158. Potter C. W. Chronicle of influenza pandemics //Textbook of influenza. - 1998. - С. 317.

159. Morens D. M., Taubenberger J. K., Fauci A. S. Predominant role of bacterial pneumonia as a cause of death in pandemic influenza: implications for pandemic influenza preparedness //The Journal of infectious diseases. - 2008. - Т. 198. - №. 7. - С. 962-970.

160. Metzger D. W., Sun K. Immune dysfunction and bacterial coinfections following influenza //The Journal of Immunology. - 2013. - Т. 191. - №. 5. - С. 2047-2052

161. Birger R. B. et al. The potential impact of coinfection on antimicrobial chemotherapy and drug resistance //Trends in microbiology. - 2015. - Т. 23. - №. 9. - С. 537-544.

162. Суворов А. Н. и др. Рекомбинантные фрагменты консервативных белков стрептококков группы В как основа специфической вакцины //Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2010. - №. 2. - С. 44-50.

163. Kramskaya T. et al. Combined immunization with attenuated live influenza vaccine and chimeric pneumococcal recombinant protein improves the outcome of virus-bacterial infection in mice //Plos one. - 2019. - Т. 14. - №. 9. - С. e0222148

164. McCullers J. A. et al. Influenza enhances susceptibility to natural acquisition of and disease due to Streptococcus pneumoniae in ferrets //The Journal of infectious diseases. -2010. - Т. 202. - №. 8. - С. 1287-1295.

165. Wu N. H. et al. Sialic acid-dependent interactions between influenza viruses and Streptococcus suis affect the infection of porcine tracheal cells //Journal of General Virology. - 2015. - Т. 96. - №. 9. - С. 2557-2568.

166. José R. J., Periselneris J. N., Brown J. S. Community-acquired pneumonia //Current opinion in pulmonary medicine. - 2015. - Т. 21. - №. 3. - С. 212-218.

167. Desheva Y. A. et al. Prevention of influenza A (H7N9) and bacterial infections in mice using intranasal immunization with live influenza vaccine and the group B streptococcus

recombinant polypeptides //Virology: Research and Treatment. - 2017. - T. 8. - C. 1178122X17710949.

168. Raabe V. N., Shane A. L. Group B streptococcus (Streptococcus agalactiae) //Gram-Positive Pathogens. - 2019. - C. 228-238.

169. Madrid L. et al. Infant group B streptococcal disease incidence and serotypes worldwide: systematic review and meta-analyses //Clinical infectious diseases. - 2017. - T. 65. - №. suppl_2. - C. S160-S172.

170. Kohli-Lynch M. et al. Neurodevelopmental impairment in children after group B streptococcal disease worldwide: systematic review and meta-analyses //Clinical Infectious Diseases. - 2017. - T. 65. - №. suppl_2. - C. S190-S199.

171. Johri A. K. et al. Group B Streptococcus: global incidence and vaccine development //Nature Reviews Microbiology. - 2006. - T. 4. - №. 12. - C. 932-942.

172. Kasper D. L. et al. Immune response to type III group B streptococcal polysaccharide-tetanus toxoid conjugate vaccine //The Journal of clinical investigation. - 1996. - T. 98. - №. 10. - C. 2308-2314.

173. Cleary P. P. et al. Streptococcal C5a peptidase is a highly specific endopeptidase //Infection and immunity. - 1992. - T. 60. - №. 12. - C. 5219-5223.

174. Kling D. E. et al. Characterization of two distinct opsonic and protective epitopes within the alpha C protein of the group B Streptococcus //Infection and immunity. - 1997. -T. 65. - №. 4. - C. 1462-1467.

175. Koroleva I. V., Efstratiou A., Suvorov A. N. Structural heterogeneity of the streptococcal C5a peptidase gene in Streptococcus pyogenes. - 2002.

176. Ustinovitch I. et al. Cloning and expression of gene fragment IgA-binding protein of group B streptococci //Folia microbiologica. - 1999. - T. 44. - №. 6. - C. 726-728.

177. Vorobieva E. I. et al. Analysis of recombinant group B streptococcal protein ScaAB and evaluation of its immunogenicity //Folia microbiologica. - 2005. - T. 50. - №. 2. - C. 172-176.

178. Berry A. M., Paton J. C. Sequence heterogeneity of PsaA, a 37-kilodalton putative adhesin essential for virulence of Streptococcus pneumoniae //Infection and immunity. -1996. - T. 64. - №. 12. - C. 5255-5262

179. Cleary P. P. et al. Similarity between the group B and A streptococcal C5a peptidase genes //Infection and immunity. - 1992. - T. 60. - №. 10. - C. 4239-4244.

180. Kuleshevich E. V. et al. Russian strains of group B streptococci are different in the content and organization of the PAI-A and PAI-A1 pathogenicity islands //Journal of obstetrics and women's diseases. - 2021. - T. 70. - №. 4. - C. 65-72.

181. Smith M. W. et al. Induction of pro-and anti-inflammatory molecules in a mouse model of pneumococcal pneumonia after influenza //Comparative medicine. - 2007. - T. 57. - №. 1. - C. 82-89.

182. Pietras E. M., Saha S. K., Cheng G. The interferon response to bacterial and viral infections //Journal of endotoxin research. - 2006. - T. 12. - №. 4. - C. 246-250.

183. Shahangian A. et al. Type I IFNs mediate development of postinfluenza bacterial pneumonia in mice //The Journal of clinical investigation. - 2009. - T. 119. - №. 7. - C. 1910-1920.

184. Zaman M. et al. Combinatorial liposomal peptide vaccine induces IgA and confers protection against influenza virus and bacterial super-infection //Clinical & translational immunology. - 2021. - T. 10. - №. 9. - C. e1337.

185. Bergeron Y. et al. Cytokine kinetics and other host factors in response to pneumococcal pulmonary infection in mice //Infection and immunity. - 1998. - T. 66. - №. 3. - C. 912-922.

186. McCullers J. A. Insights into the interaction between influenza virus and pneumococcus //Clinical microbiology reviews. - 2006. - T. 19. - №. 3. - C. 571-582.

187. Stegemann-Koniszewski S. et al. TLR7 contributes to the rapid progression but not to the overall fatal outcome of secondary pneumococcal disease following influenza A virus infection //Journal of innate immunity. - 2013. - T. 5. - №. 1. - C. 84-96.

188. Lee N. et al. Neuraminidase inhibitors, superinfection and corticosteroids affect survival of influenza patients //European Respiratory Journal. - 2015. - T. 45. - №. 6. - C. 1642-1652.

189. Vester D. et al. Real-time RT-qPCR assay for the analysis of human influenza A virus transcription and replication dynamics //Journal of virological methods. - 2010. - T. 168. -№. 1-2. - C. 63-71.

190. Reed L.J., H.A. Muench Simple method of estimating fifty percent endpoints/ // American Journal of Hygiene. - 1938. - P. 493191. Tsuchiya S. et al. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1) //International journal of cancer. - 1980. - Т. 26. - №. 2. - С. 171-176.

192. Дешева Ю. А., Ландграф Г. О., Руденко Л. Г. Способ оценки репродуктивной активности вирусов гриппа в составе тривалентной и квадривалетной живой гриппозной вакцины. -2020,- Bull. № 31.- Патент

193. Kumar S. et al. MEGA X: molecular evolutionary genetics analysis across computing platforms //Molecular biology and evolution. - 2018. - Т. 35. - №. 6. - С. 1547.

194. Saitou N., Nei M. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees //Molecular biology and evolution. - 1987. - Т. 4. - №. 4. - С. 406-425.

195. Rowe T. et al. Detection of antibody to avian influenza A (H5N1) virus in human serum by using a combination of serologic assays //Journal of clinical microbiology. - 1999.

- Т. 37. - №. 4. - С. 937-943.

196. МУ 3.3.2.1758—03. Методические указания по методам определения показателей качества иммунобиологических препаратов для профилактики и диагностики гриппа.

197. Mann H. B., Whitney D. R. On a test of whether one of two random variables is stochastically larger than the other. // Annals of Mathematical Statistics. — 1947. — № 18.

— P. 50—60.

198. Дешева Ю. А. и др. Разработка холодоадаптированного реассортантного вируса гриппа A/H6N1 на основе донора аттенуации A/Ленинград/134/17/57 (H2N2) и его генотипирование методом анализа кривых плавления высокого разрешения (HRM-анализ) //Microbiology Independent Research journal. - 2016. - Т. 3. - №. 1. - С. 42-48.

199. Landgraf G., Desheva Y. A., Rudenko L. G. Evaluation of influenza A and B cold-adapted reassortant virus reproduction in trivalent live influenza vaccines //Virus Research. -2021. - Т. 300. - С. 198396.

200. Landgraf G., Desheva Y. A., Rudenko L. G. Assessment of trivalent live influenza vaccines in MDCK cell line //MethodsX. - 2021. - Т. 8. - С. 101442.

201. Baz M. et al. Synergistic PA and HA mutations confer mouse adaptation of a contemporary A/H3N2 influenza virus //Scientific reports. - 2019. - T. 9. - №. 1. - C. 1-14.

202. World Health Organization et al. WHO recommendations on pandemic (H1N1) 2009 vaccines, Pandemic (H1N1) 2009 briefing note 2 //http://www. who. int/csr/disease/swineflu/notes/h1n1_vaccine_20090713/en/index. html. - 2009

203. Kiseleva I. V. et al. PB2 and PA genes control the expression of the temperature-sensitive phenotype of cold-adapted B/USSR/60/69 influenza master donor virus //Journal of general virology. - 2010. - T. 91. - №. 4. - C. 931-937.

204. Lutz M. M. et al. Key role of the influenza a virus PA gene segment in the emergence of pandemic viruses //Viruses. - 2020. - T. 12. - №. 4. - C. 365.

205. Perez D. R., Donis R. O. Functional analysis of PA binding by influenza A virus PB1: effects on polymerase activity and viral infectivity //Journal of virology. - 2001. - T. 75. -№. 17. - C. 8127-8136.

206. Kaverin N. V. et al. Studies on heterotypic interference between influenza A and B viruses: a differential inhibition of the synthesis of viral proteins and RNAs //Journal of general virology. - 1983. - T. 64. - №. 10. - C. 2139-2146.

207. Sirinonthanawech N. et al. Titration of individual strains in trivalent live-attenuated influenza vaccine without neutralization //Journal of virological methods. - 2016. - T. 237. -C. 154-158.

208. Bandell A., Woo J., Coelingh K. Protective efficacy of live-attenuated influenza vaccine (multivalent, Ann Arbor strain): a literature review addressing interference //Expert review of vaccines. - 2011. - T. 10. - №. 8. - C. 1131-1141.

209. Lindsey B. B. et al. Effect of a Russian-backbone live-attenuated influenza vaccine with an updated pandemic H1N1 strain on shedding and immunogenicity among children in The Gambia: an open-label, observational, phase 4 study //The Lancet Respiratory Medicine. - 2019. - T. 7. - №. 8. - C. 665-676.

210. Goldhill D. H. et al. The Consequences of Egg Adaptation in the H3N2 Component to the Immunogenicity of Live Attenuated Influenza Vaccine //bioRxiv. - 2019. - C. 834887.

211. Acosta P. L. et al. Human type I interferon antiviral effects in respiratory and reemerging viral infections //Journal of immunology research. - 2020. - T. 2020.

212. Bradley J. R. TNF-mediated inflammatory disease //The Journal of Pathology: A Journal of the Pathological Society of Great Britain and Ireland. - 2008. - T. 214. - №. 2. -C. 149-160.

213. Tanaka T., Narazaki M., Kishimoto T. IL-6 in inflammation, immunity, and disease //Cold Spring Harbor perspectives in biology. - 2014. - T. 6. - №. 10. - C. a016295.

214. McNab F. et al. Type I interferons in infectious disease //Nature Reviews Immunology.

- 2015. - T. 15. - №. 2. - C. 87-103.

215. Boxx G. M., Cheng G. The roles of type I interferon in bacterial infection //Cell host & microbe. - 2016. - T. 19. - №. 6. - C. 760-769.

216. Martin F. J. et al. Staphylococcus aureus activates type I IFN signaling in mice and humans through the Xr repeated sequences of protein A //The Journal of clinical investigation. - 2009. - T. 119. - №. 7. - C. 1931-1939.

217. Schmolke M. et al. RIG-I detects mRNA of intracellular Salmonella enterica serovar Typhimurium during bacterial infection //MBio. - 2014. - T. 5. - №. 2. - C. e01006-14.

218. Liedmann S. et al. New virulence determinants contribute to the enhanced immune response and reduced virulence of an influenza A virus A/PR8/34 variant //The Journal of infectious diseases. - 2014. - T. 209. - №. 4. - C. 532-541.

219. Fujita T., Kohno S. Studies on interferon priming: cellular response to viral and nonviral inducers and requirement of protein synthesis //Virology. - 1981. - T. 112. - №. 1.

- C. 62-69.

220. Zhou Z. H. et al. The broad antibacterial activity of the natural antibody repertoire is due to polyreactive antibodies //Cell host & microbe. - 2007. - T. 1. - №. 1. - C. 51-61.

221. Notkins A. L. Polyreactivity of antibody molecules //Trends in immunology. - 2004. -T. 25. - №. 4. - C. 174-179.

222. Miao H. et al. Quantifying the early immune response and adaptive immune response kinetics in mice infected with influenza A virus //Journal of virology. - 2010. - T. 84. - №. 13. - C. 6687-6698.

223. Baumgarth N. et al. B-1 and B-2 cell-derived immunoglobulin M antibodies are nonredundant components of the protective response to influenza virus infection //The Journal of experimental medicine. - 2000. - T. 192. - №. 2. - C. 271-280.

224. Choi Y. S., Baumgarth N. Dual role for B-1a cells in immunity to influenza virus infection //The Journal of experimental medicine. - 2008. - T. 205. - №. 13. - C. 3053-3064.

225. Rudenko L. et al. Assessment of human immune responses to H7 avian influenza virus of pandemic potential: Results from a placebo-controlled, randomized double-blind phase I study of live attenuated H7N3 influenza vaccine //PloS one. - 2014. - T. 9. - №. 2. - C. e87962

226. Rudenko L., Isakova-Sivak I., Donina S. H7N3 live attenuated influenza vaccine has a potential to protect against new H7N9 avian influenza virus //Vaccine. - 2013. - T. 31. - №. 42. - C. 4702-4705.

227. Coutelier J. P. et al. IgG2a restriction of murine antibodies elicited by viral infections //The Journal of experimental medicine. - 1987. - T. 165. - №. 1. - C. 64-69.

228. Desheva Y. A. et al. Evaluation in mouse model of combined virus-bacterial vaccine based on attenuated influenza A (H7N3) virus and the group B streptococcus recombinant polypeptides //The open microbiology journal. - 2016. - T. 10. - C. 168.

229. Neuberger M. S., Rajewsky K. Activation of mouse complement by monoclonal mouse antibodies //European journal of immunology. - 1981. - T. 11. - №. 12. - C. 1012-1016.

230. Snapper C. M., Paul W. E. Interferon-y and B cell stimulatory factor-1 reciprocally regulate Ig isotype production //Science. - 1987. - T. 236. - №. 4804. - C. 944-947.

231. Diaz M. O. The human type I interferon gene cluster //Semin. Virol. - 1995. - T. 6. -№. 3. - C. 143-149.

232. Yoo J. K., Baker D. P., Fish E. N. Interferon-P modulates type 1 immunity during influenza virus infection //Antiviral research. - 2010. - T. 88. - №. 1. - C. 64-71.

233. Wang S. et al. Influenza Virus—cytokine-protease cycle in the pathogenesis of vascular hyperpermeability in severe influenza //The Journal of infectious diseases. - 2010. -T. 202. - №. 7. - C. 991-1001.

SAINT PETERSBURG STATE UNIVERSITY

Manuscript copyright

Landgraf Galina

MOLECULAR CELL MARKERS IN THE PRECLINICAL CHARACTERIZATION OF POLYVALENT VACCINES AGAINST PLEASURE AND BACTERIAL

COMPLICATIONS

Scientific specialty 1.5.11. Microbiology Thesis for the degree of Candidate of Biological Sciences Translation from Russian

Scientific supervisor Doctor of Medical Sciences, docent Desheva Yulia Andreevna

St. Petersburg — 2022

Contents

Introduction 149

Chapter 1 Literature Review 158

1.1. Influenza virus es 158 1.1.1. Variability of human influenza viruses 161

1.2. Influenza vaccines 164

1.2.1. Inactivated influenza vaccines (IIV) 164

1.2.2. Recombinant influenza vaccines. 165

1.2.3. Live attenuated influenza vaccine (LAIV) 165

1.2.3.1. Methods currently used to analyze the composition of the genome of 167 vaccine strains included in the composition of the LAIV

1.2.4. Development of vaccines against influenza A viruses of potentially 170 pandemic subtypes (H7, H9, H6).

1.2.5. Problems of application of polyvalent LAIV 173

1.2.5.1. Evaluation of the reproductive activity of individual strains of LAIV 174 in cell culture based on Taqman technology.

1.2.5.2. Use of monoclonal antibodies 174

1.3. Mechanisms of protective immunity in influenza infection and 175 vaccination.

1.3.1. Factors of innate immunity in influenza 175

1.3.1.1. Cytokines 177

1.3.1.2. Differences in cytokine production during infection with influenza 183 viruses of different subtypes.

1.3.1.3. Importance of cytokines during immunization with influenza 185 vaccines.

1.3.2. Adaptive immunity (humoral and cellular) 186

1.4. Development of virus-bacterial associated vaccines based on LAIV. 190

1.4.1. Factors of protective immunity during immunization with virus- 193

bacterial vaccines.

Conclusion. 195

Chapter 2. Materials and methods 195

2.1.1. Influenza viruses and vaccine preparations. 196

2.1.2. Cultivation of influenza viruses in chicken embryos. 198

2.2. Methods for working with cell cultures. 198

2.2.1. Cultivation of viruses in MDCK cell culture 198

2.2.2. Work with THP-1cell culture 200

2.3. Methods of molecular genetic analysis. 200

2.3.1. «In silico» analysis 201

2.3.2. Analysis of the melting curves of high resolution PCR products (HRM 201 analysis).

2.3.3. The method of hydrolysable probes (TaqMan) for the determination of 202 infectious titers of vaccine influenza viruses in trivalent LAIV.

2.3.4. Sanger sequencing. 204

2.3.5. Phylogenetic analysis 204

2.3.6. Study of early cytokine gene expression in THP-1 cells 206

2.4. Mouse methods. 207

2.4.1. Ethics Statement. 207

2.4.2. Study of reproduction and immunogenicity of LAIV in mice. 207

2.4.3. Study of early protection against homologous and heterologous 208 influenza infection after immunization of mice with a virus-bacterial vaccine.

2.4.4. Study of the vaccination properties of a virus-bacterial vaccine based 210 on LAIV and recombinant bacterial polypeptides on a model of postinfluenza bacterial pneumonia.

2.5. Statistical processing of results. 211 Chapter 3 Results of the study. 213 3.1. Development of a methodological base for studying oligonucleotide 213

polymorphisms of the influenza virus by analyzing the melting curves of high-resolution PCR products (HRM analysis)

3.1.1. Analysis of the genes of internal and non-structural proteins of the 213 vaccine candidate A/17/herring gull /Sarma /2006/887(H6N1).

3.1.2. The study of the biological properties of the reassortant virus A / 17 / 220 herring gull / Sarma / 2006/887 (H6N1).

221

3.1.3. Comparative analysis of average temperature melting of PCR products of genes for internal and non-structural proteins of reassortants of avian

influenza viruses

3.2. Analysis of the growth characteristics of reassortant influenza viruses by 222 one-step RT-PCR using hydrolysable probes (TaqMan).

3.2.1. Study of the reproduction of trivalent LAIV in MDCK cells. 222

3.2.2. Study of reproduction of B/Victoria and B/Yamagata viruses in MDCK 226 cells

3.2.3. Study of individual strains of trivalent LAIV in mice 227

3.3. Study of the properties of a viral-bacterial vaccine based on LAIV and 230 recombinant peptides of group B streptococcus.

3.3.1. Study of expression and production of early cytokines in THP-1 cells. 230

3.3.2. Study of early protection after immunization with LAIV in mice. 232

3.3.3. The study of immunogenicity and protection against virus-bacterial 237 infection in the model of post-influenza bacterial pneumonia.

3.3.3.1. Immunogenicity. 237

3.3.3.2. Protection against virus-bacterial infection 241 Chapter 4. Discussion 244 Conclusions 255 Bibliography 257

List of abbreviations

AE - agglutinating unit

att - attenuated

ca- cold adapted

CFU - colony forming unit

ColdA - cold adapted

CTL - cytotoxic lymphocytes

DC - dendritic cells

EID50 - 50% fetal infective dose

ELISA - enzyme immunoassay

FB - phosphate-buffered saline

GAPDH - glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase

GBS - group B streptococcus

GMT - geometric mean titer

HA - hemagglutinin

HPRT - hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase i / n - intranasally IFN - interferon IL - interleukin

KID50 - 50% culture infectious dose LAIV - live influenza vaccine LD50 - 50% lethal dose MDCK - Madin Darby canine kidney MID50 - 50% mouse infectious dose MIP - macrophage inflammatory protein MOI - multiplicity of infection NA - neuraminidase

RANTES is a chemokine expressed and secreted by T cells upon activation. HI - hemagglutination reaction

CE - developing chick embryos

HAI - hemagglutination inhibition reaction

RT-PCR - reverse transcriptase polymerase chain reaction

SD- standard deviation

TNF - tumor necrosis factor

WHO - World Health Organization

Introduction

The main strategy for the prevention and control of seasonal and pandemic influenza is vaccination [1]. Annual vaccination is recommended using inactivated influenza vaccines (IlVs), which have been in use since the 1940s with gradual improvements, mainly in manufacturing techniques and the use of adjuvants; or live attenuated influenza vaccines (LAIVs) [2]. For the first time, LAIV began to be used on the territory of the former USSR since the 1960s [3]; starting from the 1980s of the XX century, LAIV has been used in a trivalent form; in 2003 LAIV was licensed for use in North America and Europe [4].

The preparation of vaccine strains for LAIV is based on the genetic reassortment of an attenuated "donor" strain with an epidemic wild-type virus. Reassortant vaccine strains contain genes encoding surface glycoproteins - hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) - from the wild-type virus and six genes for internal and non-structural proteins - from an master donor strain (MDS) - PB1, PB2, PA, M, NP and NS- that is, they have a genome formula of 6:2. In the Russian Federation, a cold-adapted (CA) MDS A/Leningrad/134/17/57(H2N2) (Len/17) is used, which is licensed for the preparation of vaccine strains of LAIV for immunization of adults and children from 3 years of age [4]. Cold-adapted strain type B - B/SSSR/60/69 has been developed for the production of polyvalent LAIV in Russia [5].

Immunogenicity of LAIV is up to 80% in children under 6 years of age and 40% in adults [6, Ошибка! Источник ссылки не найден.]. LAIV is administered intranasally and can induce a longer, broader immune (humoral and cellular) response that more closely resembles natural immunity after infection. Unlike inactivated influenza vaccines (IIVs), LAIV induces a response with the induction of not only serum immunoglobulins of class G (IgG), but also local immunoglobulins of class A (IgA), as well as antigen-specific cytokine-secreting T cells [7, 9, 10]. Experiments on mice have shown that immunization with LAIV has a protective effect against homologous influenza infection already in the first days after intranasal administration [11].

Analysis of the composition of the genome of candidates for LAIV vaccine strains is carried out by reverse transcription polymerase chain reaction (rRT-PCR) followed by

restriction analysis of amplification products or multiplex PCR followed by complete sequencing of all genes [12]. Pyrosequencing is used to quickly analyze the composition of the genome of potential vaccine candidates [13], however, this method is too expensive for routine, large-scale use. At the intermediate stages of preparing a vaccine strain, it is necessary to analyze a significant number of reassortants (perform primary screening), and therefore there is a need to develop the fastest and least expensive methods for studying nucleotide polymorphisms in the genome of vaccine candidates.

Seasonal trivalent LAIV include three strains of the influenza virus - A/H1N1, A/H3N2 and B. Determining the infectious titers of each of the viruses in the trivaccine is a laborious process. To determine the infectious activity of each strain of the influenza virus in trivalent LAIV, the use of polyclonal antisera or monoclonal antibodies specific for blocking the infectivity of the other two viruses is required. These techniques are time consuming, costly, and may not be accurate unless the antibodies are highly specific. The development of a fast and accurate method for determining the titers of influenza viruses in a trivaccine based on molecular cell technologies is necessary not only for the timely and efficient production of a vaccine, but also for studying the reproductive properties of influenza viruses in heterogeneous mixtures.

Influenza viruses increase the sensitivity of the airways to bacterial invasions, which often cause severe secondary complications such as bronchitis and pneumonia. [14], which are especially dangerous for patients suffering from chronic obstructive pulmonary disease. Influenza vaccination may reduce post-influenza complications [15], however, the effectiveness of influenza vaccines, including the most modern ones, is no more than 80% [Ошибка! Источник ссылки не найден.]. Creation of associated or vector viral-bacterial vaccines based on LAIV and bacterial peptides corresponding to conservative factors of bacterial pathogenicity is a new direction in immunoprophylaxis [16]. Modern methods of genetic engineering and peptide synthesis make it possible to obtain various vaccine prototypes based on conserved bacterial antigens, including chimeric constructs and vector vaccines, but the question of their optimal delivery and vaccination regimen to form the most effective protection is still to be studied. When creating innovative complex drugs against virus-bacterial infections, it is necessary to study the factors of innate and adaptive immunity

that correlate with protection. The study of the expression and production of early cytokines in cell cultures in response to the introduction of viral or virus-bacterial vaccines can serve as a new criterion for assessing both the safety of newly developed drugs and predicting their protective effect.

The relevance of the study is determined by the importance of developing approaches to the preclinical evaluation of vaccines for protection against influenza and post-influenza bacterial pneumonia. The development of techniques based on rRT-PCR for rapid screening of oligonucleotide polymorphisms and for assessing the growth characteristics of reassortant LAIV vaccine strains is of great importance for the timely production of vaccines. The relevance of the development of associated virus-bacterial vaccines is due to the high socioeconomic significance of secondary bacterial complications in influenza. In this regard, the development of models for studying the immunostimulating properties of associated virus-bacterial vaccines is relevant.

The degree of development of the research topic

To analyze the composition of the genome of vaccine strains, various methods based on PCR are used. Interest in simplifying the study of oligonucleotide polymorphisms leads to the active development of the analysis of melting curves of high-resolution PCR products (HRM analysis). Until now, there has been no practical justification for the technology for determining the genome of reassortant vaccine strains using HRM analysis, which is widely used for genotyping "wild" strains of the influenza virus.

Currently, in the Russian Federation, there is no method at the level of legislative documents for assessing the infectious activity of actual attenuated reassortant strains of influenza viruses that are part of the polyvalent LAIV. The traditional method for determining the 50% infectious dose in chicken embryos (CE) - EID50 - requires at least 2-3 days, and titration in cell cultures - 3-5 days to achieve a cytopathic effect. Previously, Yang Zang, et al. (2014) showed that the levels of reproduction of individual vaccine strains of modern epidemic viruses based on Russian MDSs already after 18-20 hours of incubation in MDCK cell culture corresponded to the levels of reproduction in chick embryos (CE) [17]. However,

a technique for studying the reproduction of several vaccine strains at once in the composition of trivalent LAIV s has not yet been developed.

Profiling of mRNA expression of cytokine genes is currently considered as a promising method of molecular genetic analysis to determine the impact of vaccine preparations or other external stimuli, since transcription is a dynamic process that allows cells to quickly adapt to changes in homeostasis. The work of Plotnikova M.A. is known, devoted to the development of multiplex methods for assessing the profile of cytokines in human epithelial cells infected with influenza A viruses. [18]. The in vitro cytokine profile of vaccine components, such as live influenza vaccine viruses and recombinant bacterial peptides, has not been previously evaluated.

The aim of the study

To develop new molecular genetic markers that characterize the safety and potential efficacy of polyvalent vaccines based on LAIV against influenza and its bacterial complications.

Research objectives

1. To develop a method for rapid screening of reassortant vaccine strains based on the MDS A/Leningrad/134/17(H2N2) using HRM analysis.

2. To develop a methodology based on TaqMan technology for assessing the mutual influence of reassortant influenza viruses as part of a trivalent live influenza vaccine (LAIV). Study of growth characteristics of polyvalent LAIV in vitro and in vivo.

3. To study the expression of early cytokines and type I interferons in a cell culture of human monocyte-macrophages (THP-1) upon contact with reassortant influenza viruses and recombinant bacterial polypeptides.

4. To evaluate the factors of early protective action of LAIV against homologous and heterologous influenza infection.

5. To study the protective effect of an associated intranasal virus-bacterial vaccine based on LAIV and recombinant peptides of group B streptococcus against influenza infection and post-influenza bacterial pneumonia.

Scientific novelty of the work

As a result of the work, for the first the time methods have been developed for rapid screening of oligonucleotide polymorphisms in the genome of reassortant influenza viruses using HRM analysis and for studying the growth characteristics of reassortant influenza viruses A/H1N1, A/H3N2 and influenza B viruses that are part of the trivalent LAIV.

Previously uncharacterized nucleotide substitutions in conserved proteins of avian influenza viruses have been identified.

During the development of a methodology for determining the infectious titers of vaccine viruses A and B, which are part of the trivalent LAIV, the RT-PCR method based on the technology of hydrolyzable oligonucleotide probes (Taqman) was used for the first time. It has been shown that the mutual inhibition of vaccine strains when they are combined into a polyvalent preparation is minimal at the highest concentrations of viruses. On a mouse model, it was shown for the first time that the absence of reproduction of the A/H3N2 component of the trivaccine in the respiratory tract did not affect the development of the post-vaccination antibody response.

As a result of the work, new scientific data were obtained on the mechanisms of the protective action of virus-bacterial vaccines based on LAIV against post-influenza streptococcal pneumonia. It has been shown for the first time that when LAIV vaccine viruses and recombinant group B streptococcus peptides are introduced into human monocyte-macrophage (THP-1) cells, an increase in the expression of early cytokines and chemokines is observed, and this increase positively correlates with subsequent protection against homologous and heterologous influenza infection. in studies on mice.

Theoretical and practical significance of the work

The theoretical significance of the work lies in the identification of new nucleotide substitutions in conserved proteins of avian influenza viruses, which may indicate possible ways of evolutionary variability of influenza A viruses of potentially pandemic subtypes. There were shown differences in the phylogenetic lineages of the PA gene of influenza A

viruses that indicate a possible reassortment between low pathogenic and highly pathogenic avian influenza viruses.

The implementation of the results made it possible to obtain new fundamental data on the mechanisms of the protective action of virus-bacterial vaccines based on LAIV and ways of activating the immune system when such vaccines are administered.

Scientific research also has a pronounced applied significance. In the course of the work, the possibility of using the developed methods on the rRT-PCR platform was shown in the preparation of candidates for vaccine strains and in the production of polyvalent live influenza vaccines. It was shown for the first time that the decrease in the reproductive activity of individual vaccine strains in the composition of trivalent LAIV was minimal at low dilutions of the preparations.

Implementation of the results

The method for assessing the reproduction of vaccine strains in the composition of the trivalent LAIV is protected by a patent of the Russian Federation.

Research methods

In the course of scientific work, bioinformatic methods were used (sequence alignment (UGENE from UniPro (version 1.31.0); primer development (Primers 3); molecular genetic methods (RT-PCR-RT analysis, restriction methods, Sanger sequencing); virological methods (cultivation of influenza viruses in chicken embryos and MDCK cell culture); simulation of influenza infection in mice; cell technologies (study of the immunostimulatory properties of reassortant influenza viruses and recombinant bacterial polypeptides in THP-1 cell culture.

Мain points for defense

1. The technology for analyzing the melting curves of PCR products (HRM-analysis) allows screening of vaccine candidates for potentially pandemic influenza viruses obtained on the basis of the MDS A/Leningrad/134/17/57(H2N2).

2. A cell system based on the MDCK culture was developed and tested to study the reproductive activity of influenza A and B viruses as part of trivalent LAIV using TaqMan PCR technology). In order to reduce the possible decrease in the reproduction of individual components of LAIV in mammalian cells in the composition of polyvalent vaccines, it is necessary to observe the equality of infectious doses of viruses.

3. The method of studying the reproduction of vaccine viruses in a trivalent LAIV using rRT-PCR is applicable to quantify the replication of vaccine strains after immunization of laboratory animals. Despite reduced reproduction in the respiratory tract of mice, LAIV is able to induce a systemic humoral immune response when administered intranasally.

4. Using the analysis of mRNA expression of early cytokines and chemokines in a continuous culture of human monocyte-macrophages THP-1, the immunostimulatory properties of recombinant group B streptococcus peptides with different molecular structures were demonstrated. In vitro production of LAIV vaccine preparations and recombinant GBS peptide ScaAB correlated with early protection against lethal influenza infection.

5 Associated vaccination is the most effective for protection against post-influenza bacterial pneumonia compared to separate application of LAIV or recombinant GBS peptides in a mouse model.

The author's personal contribution consists in independent planning and conduct of PCR studies, development and testing of oligonucleotide primers, molecular genetic analysis, and work with cell cultures. The study of virus-bacterial vaccines was carried out jointly with the staff of the Department of Microbiology of the Federal State Budgetary Scientific Institution "IEM" Head of Department Doctor of Medical Sciences, Professor, Corresponding Member of the Russian Academy of Sciences Suvorov, Scientific Secretary - Ph.D. G.F. Leontiev. The experiments on THP-1 cell culture were carried out in collaboration with the leading researcher. Department of Virology, Federal State Budgetary Scientific Institution "IEM", Ph.D. A.R. Rekstin.

The degree of reliability, and approbation of the dissertation materials

The reliability of the research results is confirmed by the use of various experimental models, the use of a set of modern research methods, repeated repetitions of experiments and statistical analysis.

Thesis presentation

The materials of the thesis were presented at the following conferences: XIX Youth Conference-School on Organic Chemistry, "0rgChem-2016", (St. Petersburg, 2016); First Meeting on Protective Immunity in Influenza Vaccination International Society for Influenza and other Respiratory Virus (ISIRV), University of San Niccolo Complesso, (Siena, Italy, 2019); Options X meeting, (Singapore, 2019); 7th Conference of the European Scientific Working Group on Influenza (ESWI), December 6-9, 2020, Russian Conference on Natural Sciences and Humanities - "Science of St. Petersburg State University - 2020", December 6-9, 2020; 8th Meeting of the European Scientific Working Group on Influenza (ESWI), 4-7 December 2021

Publications

On the topic of the thesis, 6 printed works were published, including 1 article in the HAC sources, 4 articles in peer-reviewed journals Scopus and Web of Science, 1 patent and 8 abstracts.

The volume and structure of the thesis

The thesis is presented on 142 pages of text, including 12 tables and 29 figures; consists of an introduction, four chapters of literature review, materials and methods, three chapters of own research, discussion and conclusions. The literature review includes 233 sources, of which 10 are domestic and 223 are foreign.

This work was supported by RFBR grant No. 19-34-90021/19: Competition for the best projects of fundamental scientific research carried out by young scientists studying in

graduate school "Molecular genetic markers of the safety and efficacy of polyvalent vaccines against influenza and bacterial complications of influenza infection".

The study was approved by the Commission on Bioethics of the Local Ethical Committee at the Federal State Budgetary Scientific Institution "IEM", Protocol No. 3/17 dated November 30, 2017.

Chapter 1. Literature Review

1.1. Influenza viruses

Influenza viruses belong to the Orthomyxoviridae family. The genome of influenza virus consists of eight fragments of single-stranded ribonucleic acid (RNA) with a negative polarity. Two surface glycoproteins hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) form multiple serologically distinct virus subtypes. Currently, 16 HA subtypes and 9 NA subtypes of influenza A viruses have been identified, all of which can be found in wild birds. [20]. Two more combinations, H17N10 and H18N11, have been identified in bats [21].

To date, in addition to the influenza A virus, influenza viruses B, C and D are distinguished. Type A infects humans and other mammals. Seasonal influenza, caused by the influenza A virus in humans, is a very serious respiratory illness that is fatal [22]. From 3 to 5 million serious illnesses are observed annually among patients with the influenza virus, of which from 300 to 600 thousand cases end in death [23].

Influenza B viruses also cause morbidity and mortality every year. In 2010-2011 Influenza B virus caused 25% of all influenza morbidity. The proportion of deaths among children hospitalized with influenza due to influenza B is 1.1% compared to 0.4% for influenza A [24].

Influenza C virus causes upper respiratory tract infection in children with milder clinical symptoms than influenza A and B. Influenza C virus has a human reservoir and also infects pigs and cattle, with cross-species circulation. Influenza D virus. According to epidemiological data, the main natural reservoir of influenza D virus is cattle [25]. Influenza B, C, and D viruses have never caused pandemics.

The influenza virus genome is about about 13,500 bases long; influenza A and B viruses have 8 genes that code for at least 11 proteins [26] (Figure 1).

Figure 1. HA - hemagglutinin, NA - neuraminidase, M1 matrix protein, M2 transmembrane protein, NP - nucleoprotein protein, NS1 - NS2 non-structural proteins, PA polymerase A, PB1 polymerase, PB2 polymerase [27].

In Figure 1, eight RNA segments of influenza A and B viruses are shown, which are arranged in descending order of the number of nucleotides. In influenza A and B viruses, segments 1, 3, 4, and 5 code for single protein: the PB2, PA, HA, and NP, respectively. [26, 28, 29]. Segment 2 of all influenza viruses encodes the PB1 polymerase subunit [29]. The PB1 segment of some strains of the influenza A virus also codes for an additional PB1-F2 protein, whereas influenza viruses B and C do not include similar protein. Influenza A virus segment 6 encodes only the NA protein, while the same segment of influenza B virus encodes both the NA protein and the NB protein in the -1 open reading frame, which is an integral membrane protein corresponding to the influenza A virus M2 protein [26]. Segment 7 of influenza A and B viruses encodes the M1 protein. In the influenza A genome, the M2 ion channel protein is encoded by segment 7 via RNA splicing [29], whereas influenza B virus encodes the BM2 (membrane) protein. Finally, both influenza A and B viruses have one RNA segment - segment 8, on the basis of which the NS1 protein, an interferon antagonist, is expressed [31, 32, 33, 34].

RNA-dependent RNA polymerase consists of three subunits: PB1, PB2 and PA. There is a contact between PA and PB1, there are no direct interactions between PA and PB2. These

polymerization subunits play a key role in the transcription and replication of the virus. PB2 subunit of RNA polymerase forms a ribonucleoprotein (RNP) complex with eight segments of the genome and moves to the nucleus [28, 35]. The PB2 subunit binds to methylated cap-1 structures at the 5' ends of actively transcribed cellular mRNAs, which are then enzymatically cleaved by the polymerase complex. [28]. The PB1 protein, a subunit of the polymerase complex, is the best characterized. Biochemical structural studies showed the involvement of the PB1 subunit in RNA chain elongation [30]. PB1 contains amino acid regions common to all RNA-dependent RNA polymerases and RNA-dependent DNA polymerases [35]. Mutations in these regions render the complex inactive for transcription and replication as it was demonstrated in tissue cultures [34, 36]. PA is required for viral RNA replication, although its role in this process remains unclear [35].

The NP protein, or nucleoprotein of the influenza virus is the main factor in the viral infection cycle in switching the synthesis of influenza virus RNA from the transcription mode to the replication mode.

The M1 matrix protein, or peripheral membrane protein, covers the viral envelope on its inner side. Export from the nucleus to the cytoplasm was found to depend on this protein.

The nonstructural protein NS1 of the influenza A virus, which is synthesized in large quantities at the initial stages of the infectious cycle, is an RNA-binding protein and regulates several post-transcriptional steps, namely, it inhibits nuclear export and mRNA splicing. The NS1 protein binds to double-stranded RNA, thereby blocking the inhibition of translation, and also inhibits host immune response factors, in particular interferon (IFN) and the antiviral effects of IFN-induced proteins. Thus, the NS1 protein is required for efficient viral replication in IFN-competent systems [31, 34].

HA is an attachment protein and allows entry into cells by binding sialic acid to the cell surface and subsequent membrane fusion. NA, being an enzyme of the hydrolase class, releases new virions from infected cells, breaking the bonds between HA and sialic acid and facilitates the movement of the virus through the mucus [37]. Due to the misincorporation of nucleotides by viral polymerase during genome replication and the segmented nature of genomes, influenza viruses evolve through gradual accumulation of mutations or genome