Морфологические изменения межпозвонковых дисков крыс в условиях асимметричной статичной компрессии тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.25, кандидат медицинских наук Волков, Алексей Вадимович

• Волков, Алексей Вадимович
• кандидат медицинских наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат медицинских наук Волков, Алексей Вадимович

ОГЛАВЛЕНИЕ.

ВВЕДЕНИЕ.

1.1. Актуальность темы.

1.2. Цель и задачи исследования.

1.5. Положения, выносимые на защиту.

ГЛАВА 2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Экспериментальные модели дегенеративных заболеваний позвоночника.

2.1 .Нотохордальные клетки.

2.2. Внеклеточный матрикс.

2.3. Экспериментальные модели.

ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1. Экспериментальная модель.

3.1.1. Методика повреждения.

3.2. Группы исследования.

3.3. Рентгенологические методы исследования.

3.4. Гистологические методы исследования.

3.5. Иммуногистохимическое исследование.

Морфом етрия.

3.6.1. Измерение высоты межпозвонкового диска.

3.6.2 Измерение площади среза.

3.6.3 Угол между замыкательными пластинками.

3.6.4. Определение ядросодержащих клеток на срезе пульпозного ядра центральной части диска. мм. Подсчет осуществлялся ручным способом с использованием гематологического счетчика (Рис. 3.9).

3.8. Статистические методы исследования.

ГЛАВА 4. РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ИССЛЕДОВАНИЯ.

4.1. Контрольная группа, интактные животные (N).

4.1.1. Рентгенологическое исследование.

4.1.2 Гистологическое исследование.

4.1.3. Иммуногистохимическое исследование.

4.2. Группа М-1. 1 месяц воздействия.

4.2.1. Гистологическое исследование.

4.2.2. Иммуногистохимическое исследование.

4.3. Группа М-2. 2 месяца воздействия.

4.3.1. Гистологическое исследование.

4.3.2 Иммуногистохимическое исследование.

4.4. Группа М-3. 3 месяца воздействия.

4.4.1. Рентгенологическое исследование.

4.4.2. Гистологическое исследование.

4.4.2 Иммуногистохимическое исследование.

4.5. Группа К-1. Резекция хвоста, срок 2 месяца.

4.5.1. Гистологическое исследование.

4.5.2 Иммуногистохимическое исследование.

4.5. Статистический анализ данных.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Морфологические изменения межпозвонковых дисков крыс в условиях асимметричной статичной компрессии»

1.1. Актуальность темы

В последние десятилетия у врачей различных специальностей значительно вырос интерес к проблеме боли в спине, способам профилактики, к новым методам лечения, а также биомоделированию дегенеративных заболеваний позвоночника - дорсопатий (МКБ-Х) [2]. Это вызвано широкой распространенностью таких патологических состояний позвоночника, как остеохондроз, спондилез, спондилоартроз и др. Патологоанатомические исследования свидетельствуют о том, что дегенеративные изменения в межпозвонковых дисках имеются практически у всех взрослых людей и детей старших возрастных групп, а у детей с нарушением осанки - еще в более раннем возрасте. По данным Национального центра статистики здоровья США (NCHS), ежегодно 14,3 % первичных обращений к врачу происходит из-за впервые возникших болей в поясничном отделе позвоночника. Из числа обратившихся к врачу около 50% больных с заболеваниями позвоночника были госпитализированы, 22 % из них лечились хирургически. Как правило, пациенты, страдающие болями в спине - это активно работающие люди.

Изучение процессов, протекающих в межпозвонковых дисках при их дегенеративных изменениях, и разработка новых эффективных методов лечения невозможны без экспериментальных исследований на лабораторных животных. Однако в настоящее время в отечественной и зарубежной литературе отсутствуют работы, которые были бы проведены с использованием различных лабораторно-инструментальных методов для выявления всех звеньев патофизиологической цепочки дегенеративных заболеваний позвоночника.

1.2. Цель и задачи исследования

Изучить морфологические изменения тканей межпозвонкового диска в условиях асимметричной статичной компрессии позвоночника у крыс.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработать адекватную воспроизводимую экспериментальную модель дегенеративных заболеваний позвоночника у крыс.

2. Оценить влияние статичной асимметричной компрессии на ткани межпозвонковых дисков и дать сравнительную характеристику их патологических изменений динамике.

3. Исследовать восстановительные процессы и оценить возможность репарации тканей межпозвонковых дисков в условиях статичной асимметричной компрессии.

4. Исследовать влияние ассиметричной статичной компрессии на нотохордальные клетки пульпозного ядра в динамике.

1.3. Научная новизна

Разработана новая воспроизводимая адекватная модель дегенеративных заболеваний позвоночника.

Впервые было проведено сравнительное комплексное исследование дегенеративных изменений и регенераторного потенциала межпозвонкового диска с применением рентгенологических, иммуногистохимических и морфологических методов в условиях статичной асимметричной компрессии межпозвонкового диска.

Установлено, что нотохордальные клетки пульпозного ядра экспрессируют эпителиальные (цитокератин 8) и мезенхимальными маркеры (аггреканан, металл опротеиназы). Показано участие нотохордальных клеток в ремоделировании внеклеточного матрикса пульпозного ядра путем синтеза, как компонентов внеклеточного матрикса, так и ферментов его разрушающих (аггреканазы).

Установлено, что асимметричная статичная компрессия приводит к развитию каскада дегенеративных изменений в тканях межпозвонковых дисков. Пульпозное ядро и фиброзное кольцо не способны к регенерации в условиях статичной осевой нагрузки. Выявленные морфологические и патологические изменения сопоставимы с таковыми у человека, страдающего остеохондрозом позвоночника.

Установлено, что:

1. Асимметричная статичная компрессия приводит к развитию каскада дегенеративных изменений в тканях межпозвонковых дисков;

2. Пульпозное ядро и фиброзное кольцо не способны к регенерации в условиях статичной осевой нагрузки;

3. Выявленные морфологические и патологические изменения в межпозвонковом диске сопоставимы с таковыми у человека, страдающего остеохондрозом позвоночника;

4. Нотохордальные клетки проявляют экспрессию эпителиальных маркеров (цитокератин 8) и мезенхимальных маркеров (аггрекан, аггреканазы) и тем самым активно участвуют в ремоделировании внеклеточного матрикса пульпозного ядра.

1.4. Научно-практическая значимость

Анализ полученных экспериментальных результатов позволяет в дальнейшем исследовать патофизиологические механизмы остеохондроза позвоночника, разрабатывать новые методы лечения и изучать эффективность фармацевтических препаратов. Определено, что нотохордальные клетки проявляют свойства как мезенхимальных, так и эпителиальных клеток.

Заключение диссертации по теме «Гистология, цитология, клеточная биология», Волков, Алексей Вадимович

выводы

1. Разработана адекватная асимметричная статичная компрессионная экспериментальная модель дегенеративных заболеваний позвоночника у крыс, соответствующая основным патогенетическим звеньям остеохондроза позвоночника человека;

2. Нотохордальные клетки пульпозного ядра одновременно демонстрируют свойства как эпителиальных, так и мезенхимальных клеток, активно участвуют в ремоделировании внеклеточного матрикса путем синтеза его компонентов (аггреканы) и разрушающих их металлопротеиназ (аггреканаз);

3. Получены иммуногистохимические, морфологические и рентгенологические данные характерные для дегенеративных процессов в межпозвонковом диске сравнимые с таковыми у человека.

4. Статичная асимметричная компрессия в течение одного месяца компрессии приводит к гибели 63,8% нотохордальных клеток пульпозного ядра. Нотохордальные клетки снижают пролиферативный потенциал с 82,4% до 5,2% к 90 дням и не могут обеспечить полноценной регенерации пульпозного ядра;

5. Повреждение и гибель тканей межпозвонкового диска крыс в условиях продолжающейся компрессии приводит к общему снижению высоты межпозвонкового диска, уменьшению пульпозного ядра, разрушению фиброзного кольца, образованию остеофитов. Повреждение не приводит к развитию воспалительных реакций на повреждающий фактор в самом диске и прорастанию в очаг повреждения сосудов в условиях компрессии;

6. Разработан оригинальный метод быстрой декальцинации образцов костной ткани щадящим способом, пригодный для иммуногистохимических исследований.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенное экспериментальное исследование моделирования дегенеративных заболеваний позвоночника выявило, что каскад патологических изменений запускается в скором времени после начала компрессии на межпозвонковый диск и приводит к прогрессивным необратимым изменениям в тканях. Процесс начинается с гибели нотохордальных клеток, количество которых в течение первого месяца сокращается в три раза. В ответ на такое повреждение запускаются механизмы регенерации пульпозного ядра - пролиферация и реорганизация внеклеточного матрикса, которые, однако, не завершаются его восстановлением. Вероятно, это обусловлено быстрым истощением регенераторного потенциала пульпозного ядра, уменьшение его размера и отсутствие синтеза главных компонентов внеклеточного матрикса. Это приводит к уменьшению объема пульпозного ядра и снижению высоты диска. Выявленные в эксперименте изменения в межпозвонковом диске сходны с таковыми, выявляемыми у человека при спиральной компьютерной и магнитно-резонансной томографии — синдром «черного диска».

В месте максимальной компрессии происходит гибель хондроцитов фиброзного кольца, его разволокнение, разрушение волокон и отсутствие каких-либо регенеративных процессов, миграции клеток как миелоидного, так и лимфоцитарного ряда. В условиях компрессии также не выявлено признаков прорастания сосудов и развития воспаления в поврежденной ткани. Данное наблюдение может быть объяснено не только синтезом хрящевой тканью антиангиогенных факторов, но и самой компрессией.

Немаловажные изменения претерпевают и костные структуры. Спустя три месяца статичной компрессии происходит уменьшение в объеме эпифизов позвонков вплоть до полного их исчезновения. В месте обнажения зоны роста пролиферирующая хрящевая ткань в совокупности с надкостницей дают начало остеофитам. Костная ткань тел позвонков также претерпевает ряд изменений, выражающиеся в утолщении костных балок в месте компрессии и появление признаков остеопороза с противоположной стороны.

Таким образом, данные, полученные в экспериментальном исследовании, свидетельствуют о повреждающем действии осевой нагрузки на межпозвонковый диск, приводящей к запуску основных патологических механизмов, приводящих к дегенеративным изменениям в межпозвонковом диске у крыс, которые не сопровождаются регенерацией тканей в целом в условиях продолжающейся компрессии и характеризуется быстрым истощением пролиферативного потенциала нотохордальных клеток пульпозного ядра.

Список литературы диссертационного исследования кандидат медицинских наук Волков, Алексей Вадимович, 2008 год

1. Команденко Н.И, Рыжов А.И., Жураковский И.П. Экспериментальная модель остеохондроза позвоночника. // БЭБИМ, -1996. -том 126.- №6. С. 706-708.

2. Мендель О.И., Никифоров А.С. Дегенеративные заболевания позвоночника, их осложнения и лечения. // РМЖ. -2006. -№4. -С. 247.

3. Adams М.А., et al. Mechanical initiation of intervertebral disc degeneration. // Spine. -2000.- V. 25, P. 1625-1636.

4. Anderson D.G., et al. Comparative gene expression profiling of normal and degenerative discs: analysis of a rabbit annular laceration model. // Spine. -2002. V. 27, P. 1291-1296.

5. Ando Т., et al. Effects of chondroitinase ABC on degenerative intervertebral discs. // Clin Orthop 1995.- V. 318, P. 214-221.

6. Ariga K., et al. The relationship between apoptosis of endplate chondrocytes and aging and degeneration of the intervertebral disc. // Spine 2001,- V. 26, P. 2414 2420.

7. Bailey AS, Adler F, Min Lai S, Asher MA. A comparison between bipedal and quadrupedal rats: do bipedal rats actually assume an upright posture? // Spine. 2001.- V. 26, P. 14-15.

8. Bradford D.S., Cooper K.M., Oegema T.R. Chymopapain, chemonucleolysis and nucleus pulposus regeneration. // J Bone Joint Surg Am 1983.- V. 65, P. 1220.

9. Brem H., Folkman J. Inhibition of tumor angiogenesis mediated by cartilage. // J Exp Med. 1975 Feb 1.- V. 141, N 2, P. 427-439.

10. Boden S.D., et al. Abnormal magnetic-resonance scans of the cervical spine in asymptomatic subjects: a prospective investigation. // J Bone Joint Surg Am 1990.-V. 72:1178-1184

11. Boos N., Weissbach S., Rohrbach H., Weiler C., Spratt K.F., Nerlich A.G.: Classification of age-related changes in lumbar intervertebral discs: 2002 Volvo Award in basic science. // Spine 2002,- V. 27, P. 2631-2644.

12. Cassidy JD, Yong-Hing K, Kirkaldy-Willis WH, Wilkinson AA. A study of the effects of bipedism and upright posture on the lumbosacral spine and paravertebral muscles of the Wistar rat. // Spine. 1988.- V. 13, N 3, P. 301-308.

13. Ching C.T. ,Chow D.H., Yao F.Y., Holmes A.D. Changes in nuclear composition following cyclic compression of the intervertebral disc in an in vivo rat-tail model. // Med Eng Phys. 2004 V. 26, N 7, P. 587-594.

14. Ching C.T., et al. The effect of cyclic compression on the mechanical properties of the inter-vertebral disc: an in vivo study in a rat tail model. // Clin Biomech (Bristol, Avon) 2003,- V. 18, P. 182-189.

15. Cole Т., et al. The proteoglycans of the canine intervertebral disc. // Biochim Biophys Acta 1985.- V. 839, P. 127-138.

16. Ford J.L., Downes S. Cellularity of human annulus tissue: an investigation into the cellularity of tissue of different pathologies. // Histopathology. 2002.- V. 41, N 6, P. 531-537.

17. Ghosh P., et al. The collagenous and non-collagenous protein of the canine intervertebral disc and their variation with age, spinal level and breed. // Gerontology 1976.- V. 22, P. 124-134.

18. Goff C.W., Landmesser W. Bipedal rats and mice: laboratory animals for orthopaedic research. J Bone Joint Surg Am 1957.- V. 39, P. 616-622.

19. Gotz W., Osmers R., Herken R. Localisation of extracellular matrix components in the embryonic human notochord and axial mesenchyme. // JAnat. 1995.-V. 186, N1, P. 111-121.

20. Gruber H.E., Hanley E.N. Jr. Human disc cells in monolayer vs 3D culture: cell shape, division and matrix formation. BMC Musculoskelet Disord. // 2000.- V. 23, N 1, P. 1-7.

21. Gruber H.E., Gordon В., Williams C., James-Norton H., Hanley E.N. Jr. Bone mineral density of lumbar vertebral end plates in the aging male sand rat spine. // Spine. 2003.- V. 28, N 16, P. 1766-1772.

22. Hamrick M.W., Pennington C., Byron C.D. Bone architecture and disc degeneration in the lumbar spine of mice lacking GDF-8 (myostatin). // J Orthop Res 2003.- V. 21, P. 1025-1032.

23. Каара E., et al. Collagens in the injured porcine intervertebral disc. J // Orthop Res 1994.- V. 12, P. 93-102.

24. Kaapa E., et al. Collagen synthesis and types I, III, IV, and VI collagens in an animal model of disc degeneration. // Spine 1995.- V. 20, P. 59-66; discussion 66-67.

25. Kaigle A.M., Holm S.H., Hansson Т.Н. 1997 Volvo Award winner in biome chanical studies. Kinematic behavior of the porcine lumbar spine: a chronic lesion model. // Spine 1997.- V. 22, P. 2796-2806.

26. Kiester D.P., et al. The dose-related effect of intradiscal chymopapain on rabbit intervertebral discs. // Spine 1994.- V. 19, P. 747-751.

27. Kim J.S., et al. Successful in vivo gene transfer to intervertebral discs in a slowly progressive and reproducible animal model of disc degeneration. // 50th Annual Meeting о f the Orthopaedic Research Society, San Francisco, 2004.

28. Kimura Т., et al. Progressive degeneration of articular cartilage and intervertebral discs: an experimental study in transgenic mice bearing a type IX collagen mutation. // Int Orthop 1996.- V. 20, P. 177-181.

29. Kluba Т., Niemeyer Т., Gaissmaier C., Grunder T. Human anulus fibrosis and nucleus pulposus cells of the intervertebral disc: effect ofdegeneration and culture system on cell phenotype. // Spine. 2005.- V.30, N 24, P. 2743-2748.

30. Koike Y., Uzuki M., Kokubun S., Sawai T. Angiogenesis and inflammatory cell infiltration in lumbar disc herniation. // Spine. 2003 .V. 28, N 17, P. 1928-1933.

31. Kroeber M.W., et al. New in vivo animal model to create intervertebral disc degeneration and to investigate the effects of therapeutic strategies to stimulate disc regeneration. // Spine 2002.- V. 27, P. 2684-2690.

32. Lindblom K. Intervertebral disc degeneration considered as a pressure atrophy. // J Bone Joint Surg Am 1957.- V. 39, P. 933-945.

33. Lipson S.J., Muir H. Proteoglycans in experimental intervertebral disc degeneration. // Spine 1981.-V. 6, P. 194-210.

34. Lotz J.C. Animal models of intervertebral disc degeneration: lessons learned. // Spine. 2004.- V. 29, N 23, P. 2742-2750.

35. Lotz J.C., et al. Compression-induced degeneration of the intervertebral disc: an in vivo mouse model and finite-element study. // Spine 1998.- V. 23, P. 2493-2506.

36. Lotz J.C., Hsieh A.H., Walsh A.L., Palmer E.I., Chin J.R. Mechanobiology of the intervertebral disc. // Biochem Soc Trans. 2002 .V. 30, N6, P. 853-858.

37. MacLean J.J., et al. Effects of immobilization and dynamic compression on intervertebral disc cell gene expression in vivo. // Spine 2003.- V. 28, P. 973-981.

38. Maiorano E, Renzulli G, Favia G, Ricco R. Expression of intermediate filaments in chordomas. An immunocytochemical study of five cases. // Pathol Res Pract. 1992.- V. 188, N 7, P. 901-907.

39. Marlcolf K.L., Morris J.M. The structural components of the intervertebral disc: a study of their contributions to the ability of the disc to withstand compressive forces. // J Bone Joint Surg Am 1974.- V. 56, P. 675-687.

40. Mason R.M., Palfrey A.J. Intervertebral disc degeneration in adult mice with hereditary kyphoscoliosis. // J Orthop Res 1984.- V. 2, P. 333-338.

41. Melrose J., et al. Increased nerve and blood vessel ingrowth associated with proteoglycan depletion in an ovine anular lesion model of experimental disc degeneration. // Spine 2002.- V. 27, P. 1278-1285.

42. Miyamoto S., Yonenobu К., Ono K. Experimental cervical spondylosis in the mouse. // Spine 1991.- V. 16(suppl), P. 495-500.

43. Moskowitz R.W., et al. Spondylosis in sand rats: a model of intervertebral disc degeneration and hyperostosis. // J Orthop Res 1990.-V. 8, P. 401-411.

44. Muehleman C., et al. Histological assessment of a novel needle puncture model: a mild, progressive intervertebral disc degeneration. // 49th Annual Meeting о f the Orthopaedic Research Society, New Orleans, 2003.

45. Nagano Т., et al. Distribution of the basic fibroblast growth factor and its receptor gene expression in normal and degenerated rat intervertebral discs. // Spine 1995.- V. 20, P. 1972-1978.

46. Nerlich A.G., Weiler C., Zipperer J., Narozny M., Boos N. Immunolocalization of phagocytic cells in normal and degenerated intervertebral discs. // Spine. 2002.- V. 27, N 22, P. 2484-2490.

47. Nerlich A.G., et al. Immunolocalization of major interstitial collagen types in human lumbar intervertebral discs of various ages. // Virchows Arch 1998.- V. 432, P. 67-76.

48. Palmer E.I., Lotz J.C. The compressive creep properties of normal and degenerated murine intervertebral discs. // J Orthop Res. 2004.- V. 22, N 1,P. 164-169.

49. Palmer E.I., Lotz J.C. The time dependent role of cytokines in mechanically induced intervertebral disc degeneration. // Transactions of the 50th Annual Meeting of the Orthopaedic Research Society, San Francisco, CA.2004.

50. Pazzaglia U.E, Andrini L, Di Nucci A. The effects of mechanical forces on bones and joints. Experimental study on the rat tail. // J Bone Joint Surg Br. 1997.- V. 79, N 6, P. 1024-1030.

51. Phillips F.M., Reuben J., Wetzel F.T. Intervertebral disc degeneration adjacent to a lumbar fusion: an experimental rabbit model. // J Bone Joint Surg Br 2002.- V. 84, P. 289-294.

52. Roughley P.J. Biology of intervertebral disc aging and degeneration: involvement of the extracellular matrix. // Spine. 2004.- V.29, N 23, P. 2691-2699.

53. Sahlman J., et al. Premature vertebral endplate ossification and mild disc degeneration in mice after inactivation of one allele belonging to the Col2al gene for Type II collagen. // Spine 2001.- V. 26, P. 2558-2565.

54. Sakuma M., et al. Effect of chondroitinase ABC on matrix metalloproteinases and inflammatory mediators produced by intervertebral disc of rabbit in vitro. // Spine 2002.- V.27, P. 576-580.

55. Silberberg R. Histologic and morphometric observations on vertebral bone of aging sand rats. // Spine 1988.- V. 13, P. 202-208.

56. Sive J.I., Baird P., Jeziorsk M., Watkins A., Hoyland J.A., Freemont A.J. Expression of chondrocyte markers by cells of normal and degenerate intervertebral discs. // Mol Pathol. 2002.- V. 55, N 2, P. 91-97.

57. Stokes I.A., Iatridis J.C. Mechanical conditions that accelerate intervertebral disc degeneration: overload versus immobilization. // Spine. 2004.- V. 29, N 23, P. 2724-2732.

58. Takahashi Т., et al. Chemonucleolytic effects of chondroitinase ABC on normal rabbit intervertebral discs: course of action up to 10 days postinjection and minimum effective dose. // Spine 1996.- V. 21, P. 2405-2411.

59. Tamai Y, Ishikawa T, Bosl MR, Mori M, Nozaki M, Baribault H, Oshima RG, Taketo MM. Cytokeratins 8 and 19 in the mouse placental development. // J Cell Biol. 2000.- V. 151, N 3, P. 563-572.

60. Venn G., Mason R.M. Changes in mouse intervertebral-disc proteoglycan synthesis with age: hereditary kyphoscoliosis is associated with elevated synthesis. // Biochem J 1986.- V. 234, P. 475-479.

61. Yamada K., et al. Investigation of the short-term effect of chemonucleolysis with chondroitinase ABC. // J Vet Med Sci 2001.- V. 63, P. 521-522.

62. Walsh A.J., Lotz J.C. Biological response of the intervertebral disc to dynamic loading. // J Biomech 2004.- V. 37, P. 329-337.

63. Ziv I., et al. Physicochemical properties of the aging and diabetic sand rat intervertebral disc. // J Orthop Res 1992.- V. 10, P. 205-210.