Некоторые биохимические особенности устойчивых к NaCl растений картофеля in vitro и in vivo тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, кандидат биологических наук Азимов, Муродали Лакайевич

• Азимов, Муродали Лакайевич
• кандидат биологических наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Азимов, Муродали Лакайевич

Содержание

Введение

Глава 1. Литературный обзор

1.1. Механизмы устойчивости растений к стрессовым факторам среды

1.2. Влияние солевого стресса на растения

1.3. Типы засоления почв

1.4. Причины и последствия влияния засоления на растения

1.5. Механизмы адаптации к засолению

1.6. Методы борьбы с засолением почв и повышение солеустойчивости растений

1.7. Основные принципы биотехнологии и методы оздоровления

картофеля

Глава 2. Экспериментальная часть. Условия, объекты и методы исследования

2.1. Краткая характеристика картофеля

2.2. Оптимальные условия для произрастания картофеля

2.3. Материалы и методы исследования

2.4. Микроразмножение и поддержание клонов картофеля in vitro

2.5. Скрининг in vitro в условиях солевого стресса

2.6. Микроклубнеобразование в условиях солевого стресса in vitro

2.7. Определение содержания аскорбиновой кислоты

2.8. Определение содержания крахмала в клубнях картофеля

2.9. Определение водного дефицита в листьях картофеля

2.10. Определение фотосинтеза и дыхания

2.11. Определение количественного содержания

малонового диальдегида

2.12. Определение активности супероксиддимутазы

2.13. Определение активности каталазы

2.14. Определение наличия вирусов в листьях картофеля

2.15. Полевые опыты

2.16. Статистическая обработка данных

Глава 3. Результаты исследований

3.1. Отбор гибридов картофеля на устойчивость к NaCl in vitro

3.2. Накопление биомассы и формирование микроклубней у различных

генотипов картофеля in vitro

Глава 4. Водный режим как элемент адаптации к стрессу

4.1. Общее содержание воды в листьях различных гибридов

4.2.Транспирационная активность различных генотипов

4.3.Водоудерживающая способность листьев солеустойчивых

гибридов

4.4.Регуляция фитогормонами водоудерживающей способности

листьев картофеля

4.5. Активность супероксиддисмутазы и образование малонового диальдегида в листьях, разных по солеустойчивости

генотипов картофеля

4.6. Продуктивность различных генотипов картофеля in vivo

Глава 5. Биохимическая характеристика солеустойчивого клон-гибрида №1

5.1. Биохимические особенности клон-гибрида № 1

5.2. Рост, развитие и продуктивность клон-гибрида № 1

Заключение

Выводы

Практические рекомендации

Литература

<

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ:

АБК - абсцизовая кислота;

АФК - активные формы кислорода;

БЗСК - банк здоровых сортов картофеля;

6-БАП - 6-бензиламинопурин;

ИУК - 3-индолилуксусная кислота;

ИМК - индолилмасляная кислота;

ИФА - иммуноферментный анализ;

МДА - малоновый диальдегид;

МС - Мурасиге - Скуга;

НУ К - а-нафтилуксусная кислота;

ПВП - поливинилпироллидон;

ПОЛ - перекисное окисление липидов;

ПЦР - полимеразная цепная реакция

СОД - супероксиддисмутаза;

ФС - фенольные соединения;

ФЭП - фосфоэнолпируват;

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота;

Р[_КУ - вирус скручивания листьев картофеля;

РУМ - вирус мозаичности картофеля;

ВВКК - вироид веретеновидности клубней картофеля;

РУА, РУЭ, РУХ, РУУ - семейство потивирусов картофеля

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Некоторые биохимические особенности устойчивых к NaCl растений картофеля in vitro и in vivo»

Введение

Картофель - важнейшая сельскохозяйственная культура, которая подвержена воздействию различных стрессовых факторов, таких как засуха, высокие температуры и засоление. При этом засоление оказывает наиболее повреждающее действие. Вредное действие засоления имеет комплексный характер и обусловлено, как нарушением осмотического баланса клетки, что негативно сказывается на водном режиме растений, так и прямым токсическим

"Ь 2 2

влиянием ионов (Na , SOr, СГ, C03"z) на физиолого-биохимические процессы в клетке, в результате чего увеличиваются концентрации вредных метаболитов, следствием этого является дезорганизация мембран, подавление синтеза белков, нуклеиновых кислот, накопление токсогенных ионов и инициация окислительного стресса (Строганов, 1973; Кузнецов, Дмитриева, 2006).

Для изучения токсического влияния соли и клеточных механизмов толерантности было предложено использовать клеточные культуры (Кулаева и др., 1997). При изучении механизмов устойчивости у выделенных in vitro солеустойчивых клеточных линий показано, что у ряда клонов не нарушена способность к проникновению ионов соли и, вместе с тем, поддерживается осмотический градиент, необходимый для функционирования клетки. Эти линии аккумулировали значительно более высокие концентрации ионов, чем чувствительные линии и, более того, для нормального роста нуждались в повышенном содержании соли в среде. Механизмы выносливости, благодаря которым растения адаптируются к условиям засоления, могут быть разными и до конца не изучены. Получение растений с целью придания им устойчивости к стрессорным факторам основано на манипулировании экспрессии и активности основных ферментов антиоксидантной системы растений, которые напрямую связаны с защитой клетки от супероксид-радикалов (Мерзляк, 1989).

Исследования в этом направлении малочисленны и до сих пор отсутствуют обнадеживающие результаты.

Несмотря на актуальность проблемы, к началу наших исследований отсутствовали сведения об использовании гибридов картофеля на солеустойчивость в условиях in vitro. Это побудило нас обратиться к методам in vitro, как реальному подходу отбора генотипов картофеля на солеустойчивость, так как картофель по признаку устойчивости к засолению почвы варьирует в широких диапазонах в зависимости от сорта (Sabbah, Tal., 1990; Бургутин и др. 1996)

В настоящей работе представлены экспериментальные данные, свидетельствующие о возможности отбора на устойчивость к засолению разнообразных гибридов картофеля in vitro и некоторые физиолого-биохимические показатели разнотолерантных генотипов, что актуально и является перспективным в решении научно-практических задач.

Цель и задачи исследований:

Отбор солеустойчивых гибридов картофеля в условиях in vitro и сравнительное изучение некоторых физиолого-биохимических показателей устойчивых и неустойчивых к солевому стрессу генотипов и их испытание в полевых условиях.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- Размножить гибриды картофеля микроклональным черенкованиием in vitro,

- Скрининг гибридов на устойчивость к хлористому натрию in vitro;

- Изучить водообмен, как элемент адаптации к солевому стрессу in vivo;

- Определить активность супероксиддисмутазы (СОД, КФ 1.15.1.1) и содержание малонового диальдегида (МДА) при солевом стрессе;

- Определить активность каталазы (КФ, 1.11.1.6);

- Изучить некоторые биохимические показатели и продуктивность устойчивых гибридов картофеля.

Научная новизна: Впервые в системе in vitro выявлен клон-гибрид, обладающий устойчивостью к высокой концентрации хлористого натрия.

Установлено, что при многократном культивировании устойчивые гибриды сохраняли повышенную толерантность к солевому стрессу.

Полученные путем скрининга гибриды картофеля отличались от неустойчивых по активности супероксиддисмутазы и содержанию малонового диальдегида, содержанию воды, водоудерживающей способности и продуктивности, что дает возможность использования селективной системы с хлористым натрием для отбора толерантных к солевому стрессу генотипов картофеля.

Показано, что биохимическая устойчивость растений связана, прежде всего. с возрастанием активности фермента супероксиддисмутазы, обезвреживающей супероксидрадикал кислорода. Выявлено, что активность супероксиддисмутазы при солевом стрессе и засухе выше в 2-3 раза у устойчивого генотипа, чем у неустойчивого.

Обнаружено, что нарушение водообмена связано с гормональным дисбалансом, возникающим при скрещивании отдаленных генотипов картофеля. Проведение фитогормональной коррекции на уровне целого растения восстановило нормальный ход биохимических процессов вследствие чего возросли адаптационные возможности растений картофеля при стрессе.

Практическая значимость: Оценка большого набора гибридов картофеля при повышенной концентрации NaCl в условиях in vitro позволила выделить отдельные генотипы с высокой устойчивостью и продуктивностью. На основе определения некоторых физиолого-биохимических показателей в сочетании с методами биотехнологии удалось выделить новый оригинальный, высокопродуктивный гибрид картофеля, обладающий высокой устойчивостью к условиям солевого стресса. Гибрид №1 передан как новый сорт Файзабад в Государственную комиссию по сортоиспытанию сельскохозяйственных культур и охране сорта при Министерстве сельского хозяйства Республики Таджикистан.

Апробация работы: Материалы диссертации были доложены (или представлены) на:

международном семинаре «Улучшение продовольствия и безопасности доходов в Юго-Западной и Центральной Азии через сорта картофеля с улучшенной устойчивостью к абиотическим стрессам», Шимла (Индия), 2008;

научной конференции «Достижения современной физиологии растений: теоретические и прикладные аспекты», Душанбе, 2008; республиканском семинаре «Гузориши сектори тухмпарварии Точикистон ба муносибатхри бозоргонй», Душанбе, 2008; конференции молодых ученых Таджикского национального университета, Душанбе 2006-2009 гг.;

международном семинаре «Улучшение продовольствия и безопасности доходов в Юго-Западной и Центральной Азии через сорта картофеля с улучшенной устойчивостью к абиотическим стрессам», Ташкент (Узбекистан), 2009

научной конференции, посвященной 80-летию со дня рождения академика АН Республики Таджикистан Ю.С.Насырова «Фотосинтез и проблемы повышения продуктивности растений», Душанбе, 2012г.

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 1.1. Механизмы устойчивости растений к стрессовым факторам среды

В природных условиях произрастания или возделывания растения, в процессе своего роста и развития, часто испытывают воздействие неблагоприятных факторов внешней среды, к которым относят температурные колебания, засуху, избыточное увлажнение, засоленность почвы и т. д. Каждое растение обладает способностью к адаптации в меняющихся условиях внешней среды в пределах, обусловленных его генотипом. Чем выше способность растения изменять метаболизм в соответствии с окружающей средой, тем шире норма реакции данного растения и лучше способность к адаптации. Это свойство отличает устойчивые сорта сельскохозяйственных культур. Как правило, несильные и кратковременные изменения факторов внешней среды не приводят к существенным нарушениям физиологических функций растений, что обусловлено их способностью сохранять, относительно стабильное состояние при изменяющихся условиях внешней среды, т. е. поддерживать гомеостаз. Однако резкие и длительные воздействия приводят к нарушению многих функций растения, а часто и к его гибели. При действии неблагоприятных условий снижение физиолого-биохимических процессов и функций может достигать критических уровней, не обеспечивающих реализацию генетической программы онтогенеза, нарушаются энергетический обмен, системы регуляции, белковый обмен и другие, жизненно важные функции растительного организма (Жибоедов, 1991; Кузнецов Вл., Дмитриева, 2006). При воздействии на растение неблагоприятных факторов (стрессоров) в нем возникает напряженное состояние. Стресс - общая неспецифическая адаптационная реакция организма на действие любых неблагоприятных факторов. Выделяют три основные группы факторов, вызывающих стресс у растений: физические - недостаточная или избыточная влажность, освещенность, температура, радиоактивное излучение, механические

воздействия; химические - соли, газы, ксенобиотики (гербициды, инсектициды, фунгициды, промышленные отходы и др.); биологические - поражение возбудителями болезней или вредителями, конкуренция с другими растениями, влияние животных, цветение, созревание плодов. Сила стресса зависит от скорости развития неблагоприятной для растения ситуации и уровня стрессирующего фактора (Веселовский и др., 1993).

На клеточном уровне метаболизм растений изменяется таким образом, чтобы предотвратить негативные последствия повреждающего действия стресс-факторов Это достигается за счет реализации двух существующих одновременно (или последовательно) путей адаптации живых организмов к экстремальным факторам среды: 1) индукции синтеза отсутствующих ранее макромолекул с новыми свойствами, обеспечивающих "нормальное" протекание клеточного метаболизма при стрессе и 2) оптимизации внутриклеточной среды функционирования ферментных систем за счет аккумуляции низкомолекулярных органических соединений, обладающих протекторными свойствами (Narayanan et al., 1989; Freytag et al., 1990; Belowaly, Bouharmont, 1992; Долгих, 1994; Ларина, 1995; Bajji, Kinet, 1995)

Оба пути адаптации направлены на решение одних и тех же задач: на обеспечение организма энергией, восстановителями, предшественниками нуклеиновых кислот и белков, а также на поддержание функционирования клеточных регуляторных систем в условиях стресса (Кузнецов, Шевякова, 1999, Кузнецов Вл., Дмитриева, 2006).

Эти задачи решаютсяУ ходе "реализ!ции адаптационного процесса,-который условно может быть разбит на две основные стадии: стресс-реакцию й специализированную адаптацию. В первой стадии имеет место мобилизация или формирование ^защитных ¿систем, обеспечивающих кратковременное выживание организма в условиях повреждающего действия стрессора! На второй стадии происходит формирование специализированных адаптационных механизмов, ответственных за протекание онтогенеза_;в условйях^цлйтельного

действия стрессорного фактора (Кузнецов Вл., Кимпел, Гокджиян, 1987; Кузнецов, Шевякова, 1999; Якубова, 2011).

Генная и гормональная регуляции, будучи важнейшими эндогенными составляющими саморегуляции в живом организме, являются центральной частью регуляторных механизмов клетки как целостной системы (Шевелуха, 1992). По-видимому, запуск стрессовой реакции различными факторами связан с их воздействием на активность генов, ответственных за общую неспецифическую устойчивость растительного организма. В частности, были получены аргументы в пользу существования неспецифических элементов в первичной реакции генома растений на воздействие как пониженных, так и повышенных температур (Кузнецов, Пустовойтова, 1992). В работах Шакировой (2000, 2001) рассмотрены в сравнительном плане неспецифические защитные механизмы природных и синтетических регуляторов роста. В работах Титова с соавторами (2006), Талановой (2009) и Веселова (2001) отражена роль фитогормонов в первичной реакции растений на стресс. К числу таких реакций относятся сдвиги в гормонально-ингибиторном балансе в сторону образования стрессовых гормонов, а также изменения в соотношении антиоксиданты/оксиданты, ингибирование процессов роста и фотосинтеза (генерация АФК, накопление абсцизовой кислоты, изменение спектра индуцируемых защитных белков). В работах Колупаева и Карпеца (2007, 2009, 2010) анализируются общие сигнальные интермедиаты, участвующие в формировании адаптивных реакций растений при действии ряда стрессоров. К таким интермедиатам относятся Н202, Са и ряд других.

Учеными было показано, что стрессоры не однозначны по механизму ингибирующего и повреждающего действия, и при выборе достаточно эффективных протекторов, необходимо учитывать тип стрессора. Существующие универсальные стресс-протекторы способны повышать неспецифическую устойчивость растений. Однако максимально защитить растительный организм от определенного типа стрессового фактора, можно только зная механизм действия стрессора.

Общие (неспецифические) ответные реакции на развитие стресса широко распространены среди различных организмов. Одним из типичных примеров является кросс-устойчивость, когда, например, в результате тепловой обработки растений, формируется повышенная устойчивость не только ко вторичному тепловому стрессу, но и к другим стрессовым факторам (Александров, Кислюк, 1994; Sabehat et al., 1998). Самые разнообразные повреждающие воздействия приводят к торможению роста осевых органов и снижению митотической активности тканей. Неспецифические реакции проявляются и на биохимическом уровне. При самых разнообразных воздействиях активируется антиоксидантная система, часто возрастает дыхание, изменяется гормонально-ингибиторный баланс и активность ферментов (Пахомова, Чернов, 1996; Бабаджанова, 1990; Шакирова, 2001; Титов и др., 2006; Таланова, 2009). Еще одним, мало исследованным вопросом является участие фитогормонов и антиоксидантов в формировании повышенной устойчивости растений в начальный период ' действия неблагоприятных факторов, хотя результаты ряда исследований указывают на то, что именно в этот период в клетках и тканях растительного организма могут происходить ключевые события, во многом предопределяющие весь последующий ход формирования устойчивости (Pastori, Foyer, 2002: Титов и др., 2006).

Тип стратегии биохимической адаптации при изменении окружающей среды зависит от времени, которым располагает организм для адаптивной реакции. По длительности адаптивного процесса различают три типа адаптации к внешним условиям: эволюционная адаптация - длительная, происходящая на протяжении жизни многих поколений; акклимация или акклиматизация -осуществляющаяся на протяжении жизни организма и немедленная -происходящая мгновенно, т.е. изменения среды сопровождаются почти мгновенной адаптивной реакцией (Кузнецов Вл., Дмитриева, 2006; Бабаджанова и др., 2009; Бабаджанова и др., 2011).

1.2. Влияние солевого стресса на растения

Изучение адаптационного процесса растений к засолению весьма актуально, оно имеет не только чисто теоретическое, но и большое социальное значение. Последнее связано с неблагоприятными глобальными изменениями климата, которые характеризуются усилением аридизации, повышением температуры воздуха на планете, увеличением продолжительности засушливого периода в ранее благоприятных для произрастания растений регионах, появлением пустынных и засоленных территорий.

Вредное действие засоления имеет комплексный характер и обусловлено как нарушением осмотического баланса клетки, что негативно сказывается на водном режиме растений, так и прямым токсическим влиянием ионов (Ыа+, 80Л С1, СОз )

на физиологические и биохимические процессы в клетке. Результатом такого действия может быть уменьшение тургора клетки, ингибирование функции мембран и активности ферментов, подавление фотосинтеза, нехватка отдельных ионов из-за нарушения селективного транспорта ионов, использование значительного количества энергии для поддержания толерантности (Строганов, 1973).

Механизмы выносливости, благодаря которым растения адаптируются к условиям засоления, могут быть разными и до конца не изучены. Многие растения обладают механизмами, которые позволяют им избегать токсическое действие ионов. Сюда можно отнести предотвращение проникновения токсических ионов в корневую систему, их абсорбция паренхимными клетками ксилемы и специфический обмен между ксилемой и флоэмой, образование ионного градиента между растущими и не растущими частями растений и, в случае галофитов, изоляция ионов в солевых железах или трихомах. Первичные механизмы выносливости, позволяющие клеткам справиться с высоким содержанием ионов, включают пассивное исключение ионов благодаря полупроницаемости мембраны, их активное выведение ионными насосами или

их разведение при быстром росте, сопровождающемся увеличением содержания воды (Сидоров, 1990).

Солевой стресс сопровождается осмотическим стрессом и ведет к утрате клеткой тургора. Осморегуляция может осуществляться благодаря компартментализации ионов (Na+, К+ и др.) или образованию растениями собственных органических осмотиков, что может обеспечивать соответствующую внутриклеточную концентрацию осмотически активных веществ, необходимых для поддержания транспорта воды в растении (Сидоров, 1990). Компартментализация ионов в вакуоли, приводящая к нормальному осмотическому давлению в цитоплазме, принята в качестве модели клеточного ответа на солевой стресс. Компартментализация соли в вакуоли сопровождается аккумуляцией осмотически активных органических веществ в цитозоле.

Для изучения токсического влияния соли и клеточных механизмов толерантности было предложено использовать клеточные культуры (Бабаева и др., 1968; Кулаева и др., 1997). При изучении механизмов устойчивости у выделенных in vitro солеустойчивых клеточных линий показано, что у ряда клонов не нарушалась способность к проникновению ионов соли и вместе с тем поддерживается осмотический градиент, необходимый для функционирования клетки. Эти линии аккумулировали значительно более высокие концентрации ионов, чем чувствительные линии и, более того, для нормального роста нуждались в повышенном содержании соли в среде.

Другой механизм устойчивости выявлен у выделенной клеточной линии Citrus sinensis, в клетки которой проникновение ионов Na+ и СГ исключалось, они практически не подвергались солевому стрессу. Очевидно, что в культивируемых in vitro клетках благодаря синтезу определенных веществ происходит осморегуляция, сходная с целым растением. Доказательством того, что накопление пролина является не только ответом на стресс, но и защитной реакцией клетки, является клеточная линия моркови, обладающая

сверхсинтезом пролина, проявляющая повышенную устойчивость к NaCl (Бабаева и др., 1968; Кулаева и др., 1975).

Работы по клеточной селекции растений на устойчивость к ионным стрессам начаты недавно. Во всех экспериментах был использован метод прямой селекции, при котором в качестве селективного агента применяли токсические концентрации солей. Однако, создание стрессовых селективных условий in vitro, идентичных таковым в природе, крайне затруднительно. В природных условиях помимо токсического действия ионов накладываются другие факторы, в частности, наличие различных веществ, кислые значения рН среды и т.д. Для селекции на клеточном уровне были предложены среды, которые хотя не полностью соответствовали естественным стрессовым условиям, все же обеспечивали экспрессию признака устойчивости и давали возможность отбирать нужные варианты.

Таким образом, клеточные механизмы выносливости к засолению являются сходными для культивируемых in vitro клеток и целых растений, поэтому селекция на клеточном уровне представляет реальную перспективу получения устойчивых к засолению форм растений.

1.3. Типы засоления почв

Существенное увеличение урожая сельскохозяйственных культур за последние десятилетия в значительной степени достигнуто за счет химизации, механизации и мелиорации сельского хозяйства, что привело к возникновению экологических проблем, связанных с истощением энергетических ресурсов, возрастанием затрат на единицу продукции и с загрязнением окружающей среды. Около 9*108 га всех земель планеты имеют повышенное содержание солей, количество засоленных почв с каждым годом возрастает.

Увеличение содержания солей в почвах постепенно снижает их плодородие. Решение данной проблемы во многом зависит от разработки рациональных агротехнических мероприятий и использования, толерантных к засолению сельскохозяйственных культур.

Согласно Б.П.Строганову (1973), по степени засоления почв различают практически незасоленные, слабозасоленные, среднезасоленные почвы и солончаки. Тип засоления определяется по содержанию анионов в почве: хлоридное, сульфатное, сульфатно-хлоридное, хлоридно-сульфатное и карбонатное. Преобладающим катионом в таких почвах является натрий (поваренная соль (Ъ1аС1), сода (ТЧа2С03), глауберова соль (КагБОД но встречаются также карбонатно-магниевое (кальциевое) и хлоридно-магниевое (кальциевое) засоление (Полевой, 1989). Наиболее вредное влияние оказывает содовое засоление, поскольку в почве сода распадается, образуя сильную щелочь (гидроксид натрия). Все эти соли хорошо растворимы в воде, так что во влажном климате обычно вымываются из почвы атмосферными осадками и сохраняются в ней в ничтожных количествах. В сухом же и жарком климате не только не происходит промывания почвы дождем, но, наоборот, растворы солей поднимаются с восходящим током почвенной воды из глубин. Вода испаряется, а соли остаются в верхних слоях почвы. Накапливаясь, они вызывают образование солончаков и солонцов. Неумелое искусственное орошение в пустынной зоне вызывает засоление почвы.

Солончаки весной увлажнены грунтовыми водами, их называют мокрыми. Концентрация солей в почвенном растворе достигает нескольких десятков процентов, причем наибольшая засоленность почвы наблюдалась в сухие периоды года, когда солончаки высыхали. В это время поверхность почвы покрывалась налетом соли, сверкающей на солнце. Солончаки имеются и в Таджикистане. Они встречаются как мелкими пятнами, так и большими массивами.

Солонцы отличаются от солончаков тем, что поверхностные слои их почвы не засолены, а соли, вредные для растений, накапливаются в более глубоких горизонтах. Поверхностный слой солонца бесструктурный, сильно выщелоченный; ниже его расположен уплотненный слой почвы, насыщенный натриевыми солями. В сухое время года эти слои растрескиваются на глыбы,

столбцы. Ниже этих слоев располагается почва, засоленная растворимыми солями.

Весной плотные слои солонца долго задерживают воду на его поверхности. Летом же, когда уплотненные слои высыхают и растрескиваются, выпадающие атмосферные осадки по трещинам устремляются вглубь субстрата, не увлажняя поверхности (Михайловская, 1977).

1.4. Причины и последствия влияния засоления на растения

Засоление приводит к созданию в почве низкого водного потенциала, поэтому поступление воды в растение сильно затруднено. Важнейшей стороной вредного влияния солей является также нарушение процессов обмена. Работами физиолога Б.П.Строганова было показано, что под влиянием солей в растениях нарушается азотный обмен, а это приводит к интенсивному распаду белков, в результате происходит накопление промежуточных продуктов обмена веществ, токсически действующих на растение, таких как аммиак и другие резко ядовитые продукты. В условиях засоления отмечено образование таких токсичных продуктов, как кадаверин и путресцин, являющихся аналогами трупного яда (Лосева, 1983). На фоне сульфатного засоления накапливаются продукты окисления серосодержащих аминокислот (сульфоксиды и сульфоны), которые также являются ядовитыми для растений. Повышенная концентрация солей, особенно хлористых, может действовать как разобщитель процессов окисления и фосфорилирования и тем самым нарушать снабжение растений макроэргическими фосфорными соединениями. Под влиянием солей происходят нарушения ультраструктуры клеток, в частности, изменения в структуре хлоропластов, происходит набухание гранул и ламелл у хлоропластов (Клышев, 1989).

Наиболее устойчивыми к солям являются митохондрии. Однако солевой стресс может способствовать их набуханию, что сопровождается разобщением окислительного фосфорилирования и нарушением проницаемости мембран. Нарушение сопряженности окисления с фосфорилированием, в свою очередь,

лишает растительный организм механизма аккумулирования энергии. При этом опасным для растительной клетки является то, что при снижении АТФ-азной активности митохондрии превращаются из поставщика АТФ в его потребителя. Таким образом, в растительном организме наступает «энергетический голод» (Аббасова и др., 1993). Особенно это проявляется при хлоридном засолении.

Луценко (1987) было обнаружено неблагоприятное влияние ионов в повышенных концентрациях на число делящихся клеток в меристеме и их размеры, а также увеличение времени митотического цикла и метафазы.

Аббасовой с соавт. (1993), а также Строгановым с соавторами (1970) было установлено вредное влияние высокой концентрации солей, которое связано с повреждением поверхностных слоев цитоплазмы, вследствие чего возрастала ее проницаемость, терялась способность к избирательному накоплению веществ. Соли поступают в клетки пассивно вместе с транспирационнным током воды. Поскольку в большинстве случаев засоленные почвы располагаются в районах, характеризующихся высокой летней температурой, интенсивность транспирации у растений очень высокая. В результате солей поступает много, и это усиливает повреждение растений.

Следует учесть также, что на засоленных почвах большая концентрация натрия препятствует накоплению других катионов, в том числе и таких необходимых для жизни растения, как калий и кальций.

Снижение продуктивности растений в условиях хлоридного засоления обусловлено угнетением их роста, который является интегральной характеристикой реакции растений на изменение окружающей среды. Степень угнетения растений и снижения биомассы находится в прямой коррелятивной зависимости от концентрации соли в субстрате и продолжительности засоления (Федяева. 1988). Однако прямая зависимость между накоплением ионов в растениях и уровнем их солеустойчивости до сих пор не выявлена. Неясен вопрос о косвенном влиянии солей на рост растений. Некоторые авторы утверждают, что главной причиной замедления роста растений в условиях засоления след>ет считать не прямое влияние избытка солей в их тканях, а

ослабление способности корней поставлять в побеги необходимые для их роста продукты метаболизма, т. е. замедление поступления питательных элементов из субстрата, угнетение их метаболизации в корнях и транспорта в побеги. В частности, подчеркивается, что угнетение роста растений в начале онтогенеза является следствием торможения поступления и превращения отдельных элементов минерального питания (Строганов, 1973; Бгеу1а§ е1;. а1., 1990).

Органы растений различаются разной степенью солеустойчивости. Отрицательное действие высокой концентрации солей сказывается раньше всего на корневой системе растений. При этом в корнях страдают наружные клетки, непосредственно соприкасающиеся с раствором соли. Характерной особенностью корневых систем на почвогрунтах с глубинным засолением является их поверхностное распространение. Внезапное увеличение концентраций №С1 в среде приводит к скачкообразному увеличению ионной проницаемости корневой системы (Балконин, 1989). Корни растений при избытке солей теряют тургор, отмирают и, ослизняясь, приобретают темную окраску.

Исследования Федяевой (1988) показали, что корни более чувствительны к засолению, чем надземные органы. Однако, известны и факты положительного влияния засоления субстрата на накопление массы корней при замедленном росте побегов (Раз1:огу, 2002).

Повреждающее действие засоления усиливается при недостаточной обеспеченности растений основными элементами минерального питания, что, по-видимому, обусловлено угнетением корней. В то же время исследования поглощающей функции корней показали, что при засолении уменьшается их общая и рабочая адсорбирующая поверхность. Однако, при этом возрастало отношение рабочей поглощающей поверхности к недеятельной (Федяева, 1988). Формирование целостной корневой системы растений при засолении изучено недостаточно и на ограниченном числе культур. К тому же полученные данные носят противоречивый характер. В частности, у ячменя установлено уменьшение количества боковых корней и их длины, общего числа корневых

волосков, тогда как у проростков кукурузы и ответ на угнетение главного корня увеличивались число придаточных корней и их суммарной длины при значительном снижении сухой массы (Минаев и др., 1992; Pastory, 2002).

В стебле наиболее подвержены действию солей клетки проводящей системы, по которым раствор солей поднимается к надземным органам (Якушкина, 1980). При натриево-хлоридном засолении побеги короткие, быстро заканчивают свой рост.

Листья также в значительной мере чувствительны к засолению. Общей реакцией для многих сельскохозяйственных культур является отмирание нижних листьев (особенно у кукурузы), подсыхание кончиков листьев. Для томата характерно изменение окраски листьев от темно-зеленой к светло-зеленой с желтым оттенком - явный признак солевого повреждения.

Огромное значение для жизнедеятельности растений в условиях засоления имеет изменение водно-осмотического режима, особенно степень осморегуляции растений. У растений, выращенных на засоленном субстрате, во всех органах увеличивается осмотический потенциал клеточного сока, а осмотический градиент между листьями и корнями по мере увеличения засоления возрастает. В основном это обусловлено накоплением в клетках повышенных количеств осмотически активных гидрофильных ионов солей. Как считают исследователи (Шевякова, 1983; Клышев, 1989 Достанова, 1994), причиной увеличения осмотического потенциала клеточного сока является также повышение концентрации в клетке низкомолекулярных органических соединений, обусловленное изменениями реакций метаболизма. Многие авторы придерживаются мнения, что повышение осмотического потенциала клеточного сока растений является защитно-приспособительной реакцией в

условиях засоления.

С увеличением концентрации соли наблюдается тенденция к снижению суккулентности растений, что свидетельствует о подавлении способности к осморегуляции. То есть с увеличением концентрации хлорида натрия растения теряют способность сохранять оводненность органов и это отрицательно

сказывается на их солеустойчивости. Но в то же время разные виды растений обладают различной способностью регулировать содержание воды в своих тканях. Так Сз-растения регулирует содержание воды в своих органах хуже, чем С4 (Кидрей, 1999).

У культурных растений при произрастании на засоленной почве заметным изменениям подвержено также и микроскопическое строение вегетативных органов. Исследования, проведенные Чухлебовой и Беловоловой (1993), показали, что на засоленной почве диаметр корней кукурузы уменьшился в 1-2 раза. Клетки экзодермы и мезодермы первичной коры обнаруживали мелкоклеточность в сравнении с корнями контрольных растений. При этом количество клеток первичной коры не изменялось, а сокращение диаметра происходило за счет мелкоклеточности. Заметно было изменение строения центрального цилиндра: изменился его диаметр, сократилось количество лучей ксилемы и пропускных клеток в эндодерме.

У опытных растений, испытывавших недостаток влаги в силу высокого осмотического потенциала засоленной почвы, наблюдалось увеличение количества волосков в зоне всасывания почти в 2 раза._

Фактор засоленности почвы обуславливал уменьшение листовой пластинки в 1.4 раза, увеличение количества проводящих пучков и снижение числа обкладочных клеток. В клетках мезофилла растений засоленного фона обнаруживалось увеличение количества хлоропластов, а также отмечалось большее количество моторных клеток, характеризующих изменение структур листа в сторону ксерофитности. Размеры моторных клеток уменьшились в 2-3 раза. В зоне расположения моторных клеток у растений, испытывающих засоление, уменьшилось число обкладочных клеток, являющихся местом локализации фотосинтеза.

Засоление привело к изменениям устьичного аппарата. При этом уменьшились размеры устьиц, а их количество на единицу площади увеличивалось.

Приведенные данные свидетельствуют о том, что на фоне засоления реакция корневой системы кукурузы направлена на приспособление к затрудненному водному режиму, ассимиляционная поверхность проявляла тенденцию к изменениям в сторону ксерофитности и снижению интенсивности фотосинтеза (Чухлебова, 1993).

В результате обобщения данных о влиянии засоления среды выделены

к*

следующие факторы угнетения растений при засолении (Ионева, 1985):

1) Затруднено водоснабжение целого растения вследствие чего нарушаются механизмы осморегуляции;

2) Дисбаланс минерального состава среды, в результате которого происходят нарушения минерального питания растений;

3) Стресс на сильное засоление;

4) Интоксикация.

1.5. Механизмы адаптации к засолению

Приспособление растений к условиям засоления осуществляется многими путями. Наиболее важные среди них - осморегуляция и специализация, или модификация транспортных процессов. Поэтому для получения солеуетойчивых форм растений необходимо тщательно изучить транспорт ионов в зависимости от ионного состава среды и генотипа растений. Солеустойчивые виды обладают способностью накапливать в вакуолях, абсорбировать его из ксилемы и транспортировать в среду. Особенности К-№ обмена на плазм ал емме и накопление Иа+ и СГ в вакуолях клеток и в клеточных стенках отмечены в некоторых исследованиях, где высказано предположение о существовании высокоэффективного механизма для откачивания ионов Ыа у солеустойчивых растений. В исследованиях детально изучен баланс ионов и связь его с солеустойчивостью растений.

Показано, что повышенная солеустойчивость растений обусловлена, во-первых. выведением и С1" из молодых листьев, во-вторых,

преимущественно базипетальным передвижением из листьев и выведением

его в субстраты, в-третьих, ограничением передвижения СГ из корня в стебель (Йонева, 1985).

Первостепенную роль в росте устойчивости растений последовательному воздействию факторов стресса ряд ученых отводит повышению содержания пролина. У растений аккумуляция пролина распространяется на относительно небольшую, но метаболически значимую цитоплазматическую фракцию клетки, которая составляет от 5 до 10% от общего клеточного объема; Он оказывает протекторное действие на стерическую структуру клеточных биополимеров и поддерживает их интактную гидрационную сферу. Пролин обладает высокой растворимостью в воде. Гидрофильное поведение пролина необычно, так как молекулы его имеют не только гидрофильную, но и гидрофобную части. На основе изучения свойств пролина физико-химическими методами сделан вывод, что высокая растворимость иминокислоты проистекает из способности ее молекулы благодаря наличию гидрофильных и гидрофобных групп образовывать агрегаты. Образовавшиеся полимеры ведут себя как гидрофильные коллоиды. Поэтому пролин не действует на белки. Подобно детергентам пролин не вмешивается в интермолекулярные гидрофобные взаимодействия белков, что вызвало бы их денатурацию, а связывается только с поверхностными гидрофобными остатками. Высокая растворимость пролина в сочетании с его очень низкой способностью ингибировать ферменты может увеличивать растворяющий объем клетки, тем самым, снижая концентрацию солей в цитозоле. Необычный характер взаимодействия агрегатов молекул параллельно с белками повышает растворимость последних и защищает их от денатурации. Шевяковой высказана гипотеза о действии пролина как осморегулятора (Шевякова, 1983).

Известно, что высокие концентрации солей прямо или косвенно подавляют синтез белка, разрушают структуру и ингибируют активность ферментов первичной ассимиляции азота (Строганов, 1958; Клышев, 1989). Это приводит к накоплению в тканях растений аминокислот, резкое повышение некоторых из них - тирозина, лейцина, фенилаланина неблагоприятно

действует на жизнедеятельность растений. Наряду с этим в тканях растений при засолении усиливается гликолиз и пентозофосфатный цикл (Удовенко, 1977). Образующиеся при гликолизе и в пентозофосфатном цикле трех- и четырех- углеродные фрагменты (ФЕП, эритрозо-4-фосфат) служат исходными предшественниками в биосинтезе фенольных соединений (ФС). Увеличение размера пула эндогенных предшественников ФС, доступных ферментам их биосинтеза, активируют процесс образования и накопления полифенолов у растений при засолении среды. В ответ на действие солевого стресса в растении образуются и накапливаются низкомолекулярные соединения типа пролина, бетаина, полиаминов, органических кислот, Сахаров, пептидов (Строганов, 1970; Шевякова, 1983; Клышев, 1989). Достановой (1994) установлено важное значение в механизме солеустойчивости растений обмена ФС, показана особая роль лигнина в адаптации, который может быть биохимическим маркером старения клеток и засоленности среды, а также выявлена специфика ответной реакции на воздействие качественного состава солей и их концентраций (Достанова, 1994).

В активно метаболизирующей клетке ФС находятся в виде гликозидов или простых и сложных эфиров с низкой метаболической активностью. Поэтому повышенный уровень свободных форм ФС у растений на фоне засоления будет способствовать усилению их функциональной активности. Менее полярные свободные формы ФС в пределах физиологических концентраций, стабилизируют клеточные мембраны за счет водородных и гидрофобных связей, а их высокая антирадикальная и антиокислительная активность повышает устойчивость мембран к повреждению. Кроме того, ФС могут быть использованы в качестве запасных дыхательных субстратов, что особенно важно в стрессовых ситуациях. Опыты, проведенные в модельных схемах и in vitro, подчеркивают важность ФС в регуляции ростовых процессов и активности оксидоредуктаз у растений при засолении среды (пероксидазы, полифенолоксидазы, глютаматдегидрогеназы, ИУК-оксидазы). Функциональный вклад ФС оказывается существенным для солеустойчивости, о чем

свидетельствует повышение пропорции ФС к фракции белка, скоординированность дозовых кривых накопления ФС, белка и активности ферментов в корнях растений при действии различных концентраций засоляющих ионов. Есть основание полагать, что ФС в клетках солеустойчивых растений оказывают регуляторное действие на некоторые обменные процессы, тесно связанные с адаптацией и способствуют реализации шунтовых путей метаболизма, в частности, в ассимиляции азота.

Характер участия ФС в адаптации многопланово, что расширяет круг приспособительных реакций, направленных на выживание растений в экстремальных условиях.

1.6. Метод борьбы с засолением почвы и повышение солеустойчивости растений

В сельскохозяйственном производстве основным методом борьбы с засолением является мелиорация засоленных почв, создание надежного дренажа и промывка почв после сбора урожая. На солонцах (почвы, содержащие много натрия) мелиорацию осуществляют с помощью гипсования, которое приводит к вытеснению натрия из почвенного поглощающего комплекса и замещению его кальцием.

Внесение в почву микроэлементов улучшает ионный обмен растений в условиях засоления. Солеустойчивость растений увеличивается после применения предпосевного закаливания семян. Для семян хлопчатника, пшеницы, сахарной свеклы достаточна обработка в течение часа 3%-ным раствором ЫаС1 с последующим промыванием водой (1.5 ч). При такой «закалке» снижается проницаемость протоплазмы для солей, повышается порог её коагуляции солями, меняется характер обмена веществ - растения, выросшие из таких семян, характеризуются более низкой интенсивностью обмена, но являются более устойчивыми к хлоридному засолению (Строганов, 1959).

Все приспособительные особенности галофитов, хотя и заложены в их наследственной основе, проявляются в процессе их роста на засоленных

почвах. В настоящее время наряду с выведением солеустойчивых сортов культурных растений интенсивно развиваются методы генной инженерии, которые позволяют повысить устойчивость растений к неблагоприятным факторам. Задача заключается в том, чтобы найти комплекс генов, ответственный, в частности, за солеустойчивость, и научиться вводить их в клетки неустойчивых растений.

1.7. Основные принципы биотехнологии и методы оздоровления

картофеля

Биотехнологические методы культуры клеток и тканей способствует

л

ускоренному решению фундаментальных и прикладных проблем экспериментальной биологии растений. Исследования по клеточной биотехнологии высших растений начались на модельных объектах, представленных в основном видами семейства пасленовых, представителем которых является картофель (Бутенко, 1964; Глеба, Сытник, 1985).

Картофель является первым среди основных продовольственных культур, который служит объектом в манипуляции клеток и тканей in vitro. Образно говоря, картофель является культурой, революционизировавшей технику in vitro.

Одним из наглядных примеров применения методов биотехнологии в практике сельского хозяйства является оздоровление картофеля с использованием культуры клеток каллусов и тканей. На настоящий момент все большее распространение получает оздоровление картофеля методом культуры апикальных меристем in vitro:

Известно более 40 фитопатогенных вирусов, идентифицированных на картофеле (Khurana et al., 2001).

Вирусы, вироиды и фитоплазмы на картофеле вызывают большую группу поражений, проявляющихся в виде разнообразных мозаик, деформаций, хлороза, угнетения роста, отмирания отдельных частей или участков тканей. Эти возбудители заболеваний - субмикроскопические инфекционные агенты,

широко распространенные в живой природе. Кроме инфекционности, их объединяют малые размеры частиц, делающие их недоступными для наблюдения в обычном световом микроскопе.

Вирусы, вироиды и фитоплазмы существенно различаются между собой по биологии и характеру воздействия на растение картофеля. Вместе с тем они имеют и много общего: передача инфекции последующим вегетативным репродукциям клубнями (за исключением отдельных фитоплазмозов), перенос большинства возбудителей насекомыми. Поэтому при рассмотрении многих практических вопросов целесообразно объединять вирусные, вироидные и фитоплазменные болезни в, одну группу, по отношению к которой разрабатывается единая система борьбы. Эту группу нередко обозначают сокращенно «ВВМ - болезни».

Для оздоровления исходного материала сильно пораженного вирусными болезнями, необходимо использовать методы культуры клеток. Основным приемом оздоровления картофеля является метод культуры апикальной меристемы в сочетании с хемо - и термообработкой исходного материала, а также использование РНК-азы для обработки. В случае со 100%-ной инфицированностью гибридов, линий сортов и, следовательно, невозможности отбора здоровых клонов среди полевого материала этот метод является практически единственным, и получил широкое распространение.

Впервые безвирусные растения картофеля из верхушечной меристемы получены в 1952г. (Morel, Martin, 1952). Термин «верхушечная меристема» применим к кусочку ткани, включающему меристемный купол с первой парой листовых зачатков (примордиев). Минимальный размер апикального участка меристемы, из которого еще можно вырастить целое растение картофеля (регенерант) - 100 мкм.

Возможность оздоровления основана на существовании градиента концентрации вируса в растущих тканях растений, при этом концентрация вируса уменьшается по направлению к верхушке и клетке конуса нарастания (Limasset, Cornuet, 1949; Kassanis, 1957). Величина безвирусной зоны зависит

как от сорта картофеля, так и от вида (и даже штамма) вируса и наличия смешанной инфекции. Меристемы большего размера свободны от вирусов Р1ПУ, РУУ, РУА, меньшего - от РУМ, РУХ, РУ8. Оздоровить сорта от последних наиболее трудно. Оптимальный для большинства сортов картофеля размер меристемного экспланта в 100-250 мкм является компромиссной величиной, учитывающей, с одной стороны, более высокую вероятность получения здоровых линий при вычленении меристем небольшой величины, а с другой - уменьшение жизнеспособности экспланта при уменьшении его размера (Трофимец, 1989), а также повышение вероятности генетических изменений.

Исследование количества вирусных частиц в меристемах разного размера растений картофеля, инфицированных Х-вирусом, показало, что если в препаратах меристем размером 500 мкм число вирусных частиц, обнаруженных при наблюдении под электронным микроскопом 100 полей зрения, составляло 450, то в препаратах меристем размером 100 мкм - только 1-8 (Крылова, Степаненко, 1971).

Среди вирусов картофеля наиболее глубокое проникновение вглубь меристемной зоны отмечено для 8 - вируса картофеля: частицы РУ8 встречаются в меристемах размером 60-90 мкм (Шалабай, Жук, 1975). Наличие градиента концентрации вируса коррелирует с вероятностью получения здоровых линий при вычленении меристем разной величины. Так, при увеличении размера вычленяемого участка меристемной ткани со 125 до 375 мкм доля получаемых безвирусных растений при оздоровлении от мозаичных вирусов уменьшается с 80% до нуля, однако с 42 до 83% увеличивается жизнеспособность эксплантов (Трофимец и др., 1977), что связано с наличием у меристем большего размера листовых примордиев и их меньшей повреждаемостью (КазБашБ, 1957).

Применение только метода верхушечных меристем при оздоровлении картофеля от вирусных и других болезней не всегда эффективно. Успех оздоровления зависит от размеров вычлененных меристем, однако получение

регенерантов из меристем минимального размера (100 мкм) очень сложно. Поэтому с целью увеличения безвирусной зоны апикальной меристемы и повышения эффективности оздоровления применяют сочетание методов верхушечной меристемы с термо- и химиотерапией, ингибиторами синтеза вирусных м-РНК.

Культуру меристемы сочетают с термотерапией (исходные клубни или растения подвергают воздействию температуры 37°С в течение 4-6 недель до вычленения меристем) и/или с химиотерапией (выращивая меристемы на среде с добавлением виразола, 5-дигидроазаурацила, диацетил-5-дигидроазаурацила, 8-азагуанина, 5-флюороурацила, 2-тиоурацила, парафлюорофенилаланина и других вирусингибирующих веществ), чтобы увеличить вероятность получения безвирусных регенерантных растений из меристем большего размера, обладающих большей выживаемостью и генетической стабильностью (Муминджанов, 1997; Khurana, Sane, 1998). Следует обратить внимание на то, что многие из этих ингибиторов обладают мутационным эффектом.

Все же ростки клубней являются более подходящим материалом для вычленения меристем при оздоровлении. При этом клубни легко могут быть обработаны антивирусными веществами, а затем проращиваться при более высокой температуре. Обычно термотерапия проводится до вычленения меристем, а химиотерапию можно применять как до вычленения меристем, так и при регенерации растений в культуре ткани (Муминджанов, 2003; Алиев, Назарова, и др., 2011).

Поскольк) получение регенерантов из меристем на питательной среде одного состава (Murashige, Scoog, 1962) связано с большими затратами труда и времени, была разработана технология поэтапного морфогенеза меристем (Трофимец и др., 1990). На первом этапе необходима регуляция начального морфогенеза в культуре апикальной меристемы - быстрейшего образования зачаточных листьев и стебля. Второй этап касается регуляции1 дальнейшего морфогенеза и сводится к индуцированию корнеобразования, дальнейшему росту стеблей и листьев.

В ряде работ исследователи изучали действие антивирусных препаратов на процесс инфицирования и репродукцию ВВКК (Diener, Smith, 1975; Можаева, Васильева, 1981; Леонтьева, Соколова, 1981). Установлено ингибирующее действие на репродукцию ВВКК ингибиторов синтеза м-РНК -актиномицина Д и альфа-аманитина. Отмечено значительное уменьшение числа заразившихся растений томатов (на 40-100%) при инокуляции ВВКК в смеси с рибонуклеазой А и гуанил-специфической РНК-азой (РВ-1), а также дефосфорилированными олигоизоаденилатами.

Культура меристем в сочетании с холодотерапией была с успехом использована для оздоровления цитрусовых от вироида экзокортиса (Navarro, 1981), а также хмеля от вироида карликовости (Momma, Takahaki, 1983; Adams et al., 1996).

Вместе с тем, несмотря на положительные результаты в ряде случаев сочетание холодотерапии с культурой меристемы и оздоровление картофеля от ВВКК остается во многом проблематичным. Зараженные ростки клона картофеля, выращенные в течение 3-6 месяцев при температуре не дали положительной реакции на содержание ВВКК, в сравнении с контролем (+24°С и +36°С). Однако, выращенные растения из ростков, выдержанных при +5°С, в условиях повышенной температуры (+25°С) показали положительную реакцию на наличие ВВКК. Это свидетельствует, что вироид не полностью искоренялся из материала под влиянием низкой температуры, а очевидно, находился в такой низкой концентрации, что его обнаружение было невозможно. Но в опытах с использованием холодотерапии в сочетании с культурой меристемы получен положительный эффект: оздоровленные от вироида регенерантные растения составляли в этом случае от 30% до 53% (Lizarraga et al., 1980).

При формировании банка здоровых сортов картофеля важнейшее значение приобретают чувствительность и специфичность методов диагностики контролируемых болезней. В последние годы, в связи с повышением чувствительности инструментальных методов детекции патогенов на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР), даже в генбанках здоровых

сортов in vitro все чаще начали выявлять остаточные количества вирусных инфекций. Как показали исследования Дедича с соавторами, сделанные в Генном банке Института картофеля (Чехия), коллекция in vitro здоровых сортов этого селекционно-генетического учреждения содержала 7% линий, зараженных вирусом картофеля PVS. При высаживании в грунт пробирочных растений по отдельным сортам процент зараженных линий достигал 9-69% (Dedic etal., 1996).

Как полагают, имеющиеся наборы иммуноферментного анализа (ИФА), на различные вирусы картофеля, имеют определенный порог чувствительности, концентрации вирусов ниже этих порогов остаются недоступными для детекции этим методом. Скрытая зараженность вирусами картофеля пробирочных растений может не проявляться в течение долгого промежутка времени. По данным Давояна с соавторами, многократное тестирование в течение 3 лет клонов различных сортов картофеля, оздоровленных методом апикальной меристемы, не выявляло наличие каких-либо вирусов в пробирочных растениях. Однако, при высадке в грунт, у 7 клонов из 35 были обнаружены высокие концентрации вирусов (Давоян и др., 1993).

В связи с тем, что метод ИФА имеет недостаточную чувствительность, для выявления скрытой зараженности вирусами картофеля пробирочных растений, необходимо применение более чувствительных методов на основе полимеразной ценной реакции (ПЦР). Различные модификации метода ПЦР успешно применяются для детекции вирусов картофеля PVY, PVA, PVM, PVX, а также бактериальных, грибных и других возбудителей опасных болезней картофеля (De Griogri et al., 1994; Karjalainen et al., 1996; Niepold, 1996; Singh, Singh, 1997; Singh et al, 1998; Hu et al, 1998).

В культуре in vitro зараженные вироидом пробирочные растения также ничем от здоровых визуально не отличаются. Феномен длительного сосуществования вироида в латентной форме с пробирочными растениями без видимых проявлений болезни пока трудно поддается объяснению. Известно устойчивое сохранение высокой концентрации вироида в зараженных

пробирочных растениях двух сортов картофеля в течение 1-4 лет субкультивирования последовательными микрочеренкованиями (Singh et al., 1996). Более того, было показано, что инфицированная вироидом суспензионная культура клеток томата растет значительно энергичнее и обладает большей толерантностью к повышенным концентрациям арабинозы и ксилозы (Duran-Vila et al., 1995).

На основе всестороннего изучения и составления научно-теоретического обоснования многие исследователи рекомендуют на каждом этапе работы по формированию безвирусного семенного картофеля использовать системы диагностических методов (ИФА), а также молекулярной гибридизации и полимеразной цепной реакции (ПНР).

Таким образом, все образцы «чистых» клонов сортов и оздоровленных меристемных растений должны испытываться на сортовую типичность и генетическую стабильность в полевых условиях с использованием молекулярно-генетических маркеров, а также физиолого-биохимических параметров адаптации растений к условиям выращивания.

ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ УСЛОВИЯ, ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Краткая характеристика картофеля

Картофель относится к семейству пасленовых (Solanaceae), к роду Solanum. В состав этого рода входит около 200 культурных и диких видов картофеля. Полное ботаническое название выращиваемого у нас картофеля Solamim tuberosum L. К этому виду относится большинство европейских сортов. В Америке некоторые сорта принадлежат к виду Andigenum.

Картофель - многолетнее травянистое растение, размножаемое вегетативно-клубнями, ростками и черенками. В сельскохозяйственной практике картофель культивируется как однолетнее растение с размножением в основном клубнями. Семенами его размножают редко, преимущественно в селекции при выведении новых сортов. При размножении семенами растения ■ получаются слабыми и дают обычно небольшое количество мелких клубней. Кроме того, семена картофеля, являясь гетерозиготными (содержащими в клетках гены с разными признаками), не могут обеспечить однородность потомства, давая самые разнообразные отклонения как по форме и окраске клубней, так и по урожаю и его качеству - содержанию крахмала и белка.

При размножении картофеля клубнями или их частями как бы продолжается жизнь одного и того же растения, так как клубни являются частью растения.

Клубни картофеля образуются на подземных побегах - столонах, концы которых по мере роста растений утолщаются. По достижении растением высоты 10-20 см столоны имеют длину 5-15 см, толщину - 2-3 мм. Столоны не содержат хлорофилла, имеют белую окраску. После прекращения роста столона в длину его верхушка утолщается и превращается в клубень. По форме клубни могут быть округлыми, округло-овальными, удлиненно-овальными, длинными и реповидными; по цвету - белыми, светло-желтыми, розовыми, красными и сине-фиолетовыми различных оттенков.

Химический состав картофеля меняется в зависимости от сорта, почве н но климатических условий и удобрений. Примерный химический состав клубней и ботвы следующий:

Клубни содержат воды - 75%, крахмала - 20%, сахара - 0.3%, белка - 2%, жира - 0.15%), клетчатки -1%, золы -1.1%

Свежая ботва содержит воды - 84%, крахмала - 6%, сахара - 0.5%, белка - 3%, жира - 0.7%, клетчатки - 3%, золы - 2.5%

Кроме того, в состав клубней входит небольшое количество гликоалкалоида соланина. В нормальных здоровых клубнях соланина содержится 2-10 мг на 100 г сырого картофеля. В таком количестве соланин не оказывает вредного действия на организм человека и животных. На свету клубни зеленеют, содержание соланина в них повышается, они приобретают неприятный горький привкус. Из-за этого пищевые качества картофеля ухудшаются. Если в продовольственном картофеле будут обнаружены отдельные клубни с зеленой мякотью, то их следует варить очищенными от кожуры. Соланин при этом полностью разрушается.

Обычно картофель с более высоким содержанием сухого вещества и крахмала является и более вкусным. Большое содержание сахара в клубнях понижает столовые качества картофеля. Так, содержание сахара выше 2%, что нередко бывает зимой при охлаждении клубней, делает картофель неприятно сладким. Для того, чтобы устранить сладкий привкус клубней, необходимо их подержать при комнатной температуре в течение 7-10 дней. В этом случае сахар превращается обратно в крахмал.

2.2. Оптимальные условия для произрастания картофеля

Температура. Картофель - растение прохладного климата. Клубни обычно начинают интенсивно прорастать при температуре почвы 7-12°С, а почки глазков пробуждаются при температуре 3-6°С. Наиболее быстро клубни прорастают при температуре почвы около 18-20°С. Корни у картофеля образуются при температуре не ниже поэтому, как правило, картофель

сажают только тогда, когда почва на глубине 10 см прогреется до 7-8°С. Средняя продолжительность периода от посадки до всходов составляет 25-30 дней. Пророщенные клубни дают всходы на 6-12 дней раньше.

Всходы картофеля лучше развиваются во время прохладной и влажной погоды. В этот период нежные молодые растения очень чувствительны к жаре и суховеям.

Ботва картофеля начинает расти при температуре воздуха около 5-6°С. Максимальные приросты ботвы бывают при умеренно влажной почве и температуре 17-22°С. При температуре выше 42-45°С рост надземной массы картофеля прекращается, так как на дыхание растений при высоких температурах тратится больше органического вещества, чем накапливается в процессе фотосинтеза. Ботва картофеля не выдерживает пониженных температур. При заморозках от до -1.5 С растения чернеют и погибают. Наиболее благоприятная температура почвы для клубнеобразования 15-19°С. При температуре около 6°С и выше 23°С прирост клубней задерживается, а при 26-29°С клубнеобразование обычно прекращается. Частые смены температуры на протяжении вегетации растений приводят к неравномерному росту клубней, последние приобретают уродливую форму.

Влажность. Картофель - требовательное к влажности почвы растение. В начале своего роста он меньше нуждается во влаге, а с наступлением бутонизации и цветения потребность во влаге резко возрастает. Недостаток ее во время цветения приводит к значительному снижению урожая клубней. Период о г начала цветения до прекращения роста ботвы является критическим, расход влаги достигает максимальной величины. Лучший рост растений и образование клубней наблюдаются при запасах влаги в пахотном слое в пределах 70-85% полевой влагоемкости.

Продолжительный период переувлажнения почвы нередко приводит к так называемому удушению и загниванию клубней от недостатка кислорода воздуха. Первый сигнал переувлажнения почвы и кислородного голодания -разрастание на поверхности клубней рыхлых белых чечевичек. В конце

развития, когда увядает ботва, картофелю требуется влаги меньше, чем в предыдущие периоды. При теплой, сухой погоде к концу вегетации растений на клубнях образуется толстая крепкая кожура, которая предохраняет их от механических повреждений во время комбайновой уборки и обеспечивает лучшую сохранность в зимний период. Дождливая погода затягивает созревание клубней, на них образуется очень нежная кожура.

Транспирационным коэффициентом называется количество воды, затрачиваемое растением на образование единицы сухого вещества. У картофеля он равен 400-500. При урожайности в 250-300 ц/га расход воды составляет 1500-3000 т на 1 га. Хорошие урожаи картофеля бывают в годы, когда за период вегетации растений выпадает 300 мм осадков с преобладанием их в июне-июле и первой половине августа.

Картофель хорошо использует и влагу, находящуюся в воздухе. Капельки росы или тумана, осевшие на листьях, картофель поглощает при помощи железистых волосков.

Аэрация почвы. Как и все живое, картофель дышит, расходуя на дыхание крахмал и сахар. Наиболее высокой дыхательной активностью отличаются корни, затем молодые клубни, которые за сутки выделяют от 8 до 16 мг углекислоты на каждый грамм сухого вещества. Чтобы иметь достаточное количество кислорода в почве, необходимо сохранять ее в рыхлом состоянии. При недостатке кислорода воздуха в уплотненных почвах клубни загнивают.

Свет. При недостатке света картофель образует мало клубней. В затененных местах при ослаблении освещения происходит вытягивание стеблей, пожелтение листьев и задержка образования молодых клубней. При сильном затенении растет лишь ботва, а в почве вместо клубней появляются длинные белые столоны с небольшим утолщением на конце. При проращивании клубней хорошее освещение способствует образованию коротких, толстых, зеленых или буро-зеленых ростков. При недостатке света

клубни картофеля прорастают белыми, длинными ростками, которые легко обламываются при весенней переборке и перевозке.

Изменяя способ размещения растений на поле, можно, не снижая количества растений на гектаре, улучшить их освещение и этим способствовать увеличению урожайности картофеля. Лучшая освещенность растений достигается при широкорядных посадках картофеля.

2.3. Материалы и методы исследований

В качестве объектов исследования использовались гибриды картофеля {Solanum tuberosum L.), полученные из Международного центра картофеля (CIP, Перу) в 2005 году. Всего было изучено 27 гибридов. Происхождение этих гибридов представлено в таблице 1. Из представленных гибридов нами были выбраны наиболее устойчивые (№1, 9, 24) и наиболее неустойчивые (№20'," 22) к NaCl гибриды.

Таблица 1

Некоторые характеристики CIP клонов-гибридов, полученных в _2006 году из Перу__

№ гибрида, Tj Гибриды, CIP № Происхождение

Материнская линия Отцовская линия

1 397077.16 LR93.221 С93.154

2 392781.1 В-71-74-49.12 385280.1=XY.13(LT)

3 390478.9 SERANA XY. 4

4 397030.31 93.003 92.187

5 397099.6 LR93.073 LR93.050

6 720149

7 397029.21 92.118 92.187

8 392780.1 SEDAFIN YY.3

9 397035.26 LR93.120 92.187

10 397065.28 С90.266 С93.154

11 388972.22 ХУ.20 377964.5

12 397099.4 LR.93.073 LR.93.050

13 388611.22 МЕХ -32 ХУ.9

14 720148

15 388615.22 В-71-240.2 ХУЛ 6

16 720088

17 720157

18 720090

19 388676.1 378015.18 РУУ-ВК

20 720188

21 397069.11 С92.140 С93.154

22 720189

23 392797.22 387521.3 АРЖСОТЕ

24 390663.8 БЕКАЫА ХУ.14

25 397073.16 Ы193.120 С93.154

26 391180.6 ХУ.9 ЬТ-7

07 ЙО ГКО гач 1

✓ / V 1 • Ч^ У • X ъ/ 1

2.4. Микроразмножение и поддержание клонов т уИго

Гибриды картофеля размножали микрочеренкованием в стерильных условиях с дальнейшей посадкой в среду Мурасиге-Скуга (МигаБЬ^е, 8коо§, 1962), содержащей сахарозу - 20г/л; агар - 6.0 г/л; витамины С, Вь Вб, ; а-нафтилуксусную кислоту (а- НУК) - 2 мг/л, индолил-3-масляная кислота (ИМК) -1 мг/л (рН 5.7-5.8) согласно рекомендации Института сельскохозяйственной биотехнологии Российской Академии

Сельскохозяйственных Наук (Россия). Пробирочные растения выращивали при температуре 22-23°С, в течении 4-5 недель, при освещенности 3000-3500 люкс и фотопериоде 16/8 ч. свет/темнота.

2.5. Скрининг in vitro в условиях солевого стресса

Для скрининга на солевой стресс использовали in vitro растения, которые пересаживали на питательную среду Мурасиге-Скуга с добавлением хлористого натрия, как селективного агента, в концентрациях: 0.5%, 1%, 1.5%. Количество пробирочных растений для каждого варианта составляла 10 штук, повторность 3-х кратная. Контролем служили растения, выращенные в среде без добавления хлористого натрия. После 5-6 недель выращивания определяли процент выживаемости, высоту растений, длину корней, количество корней на одно растение.

2.6. Микроклубнеобразование в условиях солевого стресса in vitro

Для микроклубнеобразования in vitro растения картофеля после очередного микрочеренкования помещали в среду Мурасиге-Скуга следующего состава: сахароза - 80 г/л; агар -7.0г/л; витамины С, Вь В6; кинетин - 1мг/л (рН среды 5.7-5.8) с добавлением NaCl в концентрациях 0.5%, 1% и 1.5%. Количество пробирочных растений для каждого варианта составляло 10 штук, повторность 3-х кратная. Контролем служили растения, выращенные в среде без добавления NaCl. После 5-6 недель выращивания определяли процент выживаемости, а также выход микроклубней на одно растение.

В первые две недели растения выращивали при температуре 20-23°С, а в последующие недели при температуре 12-15°С, освещенность 3000-3500 люкс, фотопериод 10/14 ч свет/темнота. J •

2.7. Определение содержания аскорбиновой кислоты

3-5 г пробирочных растений растирали в ступке в присутствии 2% НС1 и доводили объем до 100 мл дистиллированной водой. Добавляли 4 мл 2%-ного раствора соляной кислоты и титровали раствором 2.6 дихлорфенолиндофенола до появления розового окрашивания, не исчезающего в течение ЗОсек.

Расчет количества аскорбиновой кислоты в пробе производили по

формуле:

Т-АВ-100

Л. —-

Б-Г

где X - содержание аскорбиновой кислоты в миллиграмм-процентах; Т - титр раствора 2.6-дихлорфенола по аскорбиновой кислоте; А - количество раствора 2.6-дихлорфенола (мл), израсходованное на титрование;

Б - количество мл вытяжки, взятое для титрования; В - общее количество вытяжки (мл); Г - количество вещества в граммах, взятое для анализа; 100 - количество граммов исследуемого материала, взятое для вычисления процентного содержания.

2.8. Определение содержания крахмала в клубнях картофеля

Для определения крахмала используют 20% раствор хлорида натрия, перелитого в большой стакан, в который опускают 3-5 клубней картофеля и осторожно приливают воду, до тех пор, пока клубни не будут плавать, т.е. когда плотность клубней будет равна плотности раствора и находят величину содержания крахмала по таблице рекомендованной Европейским Союзом (табл.2).

2.9. Определение водного дефицита в листьях картофеля

Отбирают 10-12 дисков из листьев с помощью пробирочного сверла диаметром 16-18 мм. Для характеристики целого растения диски высекают из листьев разных ярусов. Диски немедленно взвешивают и опускают в стакан, содержащий 40-50 мл дистиллированной воды с температурой до 20°С. Перемешивают и стакан закрывают стеклом и оставляют в течении 90 мин. После этого каждый диск обильно сверху и снизу прижимают фильтровальной

бумагой для удаления капель воды. Затем диски взвешивают и вычисляют водный дефицит (Гончарик, 1962):

Расчет проводился по методу Гончарик, 1962

Х=100 (b-a)/b;

где:

X - водный дефицит листа (растений) в % к весу насыщенного водой при

90 мин. насыщения;

А - вес пробы до насыщения водой (г)

В - вес пробы после насыщения водой (г)

Использовали черенки из средней части побега. Для опытов брали по 2030 растений на вариант. В таблицах и рисунках даны средние значения каждого варианта опыта.

2.10. Определение фотосинтеза и дыхания

Фотосинтетическую активность и дыхание листьев определяли методом половинок по Саксу в полевых условиях (Иванова, 1946).

2.11. Определение количественного содержания малонового диальдегида

Содержание МДА определяли по методу, описанному в работе (Heath, Pusker, 1968), с применением тиобарбитуровой кислоты. Растительные ткани гомогенизировали в 20 мл 0.1% раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ). Затем гомогенат центрифугировали на центрифиге с охлаждением (BecmanJ-21) при 12 тыс. об./мин в течение 10 мин, при температуре 3°С. Затем к 1 мл супернатанта добавляли 4 мл 20% ТХУ, содержащего 0.5% тиобарбитуровой кислоты и 1 мл меркаптоэтанола. Смесь нагревали на водяной бане при температуре 95°С в течение 30 мин и сразу охлаждали на льду. Смесь вновь центрифугировали при тех же условиях (12 тыс. об./мин, в течении 10 мин). Оптическую плотность супернатанта измеряли при двух длинах волн - 532 и 600 нм на спектрофотометре «Ultraspec-П». Содержание МДА рассчитывали с

использованием коэффициента экстинкции 8=156 после вычисления неспецифического поглощения при 600 нм.

2.12. Определение активности супероксиддисмутазы

Активность СОД определяли с использованием нитросинего тетразоля методом, описанным в работе (Giannopulitis, Ries, 1977). При этом нитросиний тетразолий переходит в восстановленную форму - формазан, имеющую интенсивное сине-фиолетовое окрашивание. В присутствии СОД в реакционной системе замедляется образование формазана. 1г растительного материала растирали в ступке с K-Na-фосфатном буфере, рН=7.5, содержащем 4.0 мМ ЭДТА. Гомогенат отжимали через полотно и центрифугировали на центрифуге с охлаждением (Becman J-21) при 14 тыс. об/мин, в течение 20 мин при +4°С. Супернатант использовали в качестве ферментного препарата. Оптическую плотность измеряли при длине волны 560 нм на спектрофотометре (Ultraspec-II), используя кюветы с длиной оптического пути 0.5 см. Расчет производили по количеству препарата, способного подавить реакцию восстановления нитросинего тетразоля. За единицу активности принимали 50%-ное ингибирование образования формазана. Активность СОД выражали в единицах активности на 1г сырого веса в час. Контролем служили: а) полная реакционная среда без фермента, в которой наблюдалась максимальная окраска; б) полная реакционная среда, инкубированная в темноте, служила темновым контролем.

2.13. Определение активности каталазы

Активность каталазы измеряли по скорости деградации Н2О2 согласно Kumar и Knowles (1993) и выражали в мкмоль разложившейся перекиси/г сырой массы в мин.

2.14. Определение наличия вирусов в листьях картофеля

Наличие вирусов определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА) с помощью диагностических моновалентных тестов, согласно рекомендации Международного Центра Картофеля С1Р (Перу, Лима).

2.15. Полевые опыты

Полевые опыты проводили в Вахдатском районе, поселке Заргар, по схеме: 3 блока, на каждом из которых высаживали клоны по 10 клубней/ряд (70x2 5см); в 3 ряда по рандомизированному полноблочному методу в 3 повторностях. Наблюдения проводили по центральному ряду в каждой делянке.

Внесение удобрений проводили согласно рекомендации Международного центра картофеля (С1Р).

Эти же составы удобрений использовались для выращивания пробирочных растений и микроклубней в условиях марлевого изолятора.

2.16. Статистическая обработка данных

Полученные результаты обработаны статистически (Урбах, 1964) по

формулам, представленным в сборнике методов биохимического анализа

_ ?

растений под редакцией В.В Полевого и Г.Б.Максимова (1978), а также в книге Г.Ф.Лакина (1973).

Представленные данные достоверны при доверительной вероятности 9799%.

Таблица 2.

Содержание крахмала в картофеле различной плотности в соответствии с рекомендациями ЕС

(Европейский Союз)

Плотность, (г/см3) Содержание крахмала, (в %) Плотность, (г/см3) Содержа н крахмала (в %) не Плотность, (г/см3) Содержание крахмала, (в %) Плотность, (г/см3) Содержание крахмала, (в %)

1.1 17.83 1.089 15.66 1.078 13.49 1.067 11.33

1.099 17.63 1.088 15.46 1.077 13.30 1.066 11.23

1.098 17.43 1.087 15.27 1.076 13.10 1.065 11.13

1.097 17.24 1.086 15.07 1.075 12.90 1.064 11.03

1.096 17.04 1.085 14.87 1.074 12.71 1.063 10.93

1.095 16.84 1.084 14.68 1.073 12.51 1.062 10.84

1.094 16.65 1.083 14.48 1.072 12.31 1.061 10.74

1.093 16.45 1.082 14.28 1.071 12.12 1.06 10.64

1.092 16.25 1.081 14.09 1.07 11.92 1.059 10.54

1.091 16.06 1.08 13.89 1.069 11.72 1.058 10.44

1.09 15.86 1.079 13.69 1.068 11.52 1.057 10.34

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Азимов, Муродали Лакайевич

выводы

1. С целью отбора растений, толерантных к абиотическим стрессам, изучены 27 гибридов картофеля in vitro. Показано, что селективная система с использованием NaCl и ПЭГ является эффективной, так как обеспечили полную элиминацию чувствительных растений и сохранение жизнеспособных устойчивых регенерантов.

2. Выявленные путем скрининга in vitro толерантные к NaCl гибриды картофеля имели устойчивость и к засухе по таким показателям, как содержание воды, водоудерживающая способность и продуктивность, что свидетельствует о возможности использования селективной системы с NaCl для отбора на засухоустойчивость.

3. Установлено, что физиологические нарушения водообмена связаны с гормональным дисбалансом. Проведение гормональной коррекции на уровне целого растения восстановило нормальный водообмен у неустойчивых генотипов и, увеличило адаптационные возможности растения.

4. Обнаружено, что активация супероксиддисмутазы при солевом стрессе и засухе выше в 2-3 раза у устойчивого генотипа, чем у неустойчивого, а содержание малонового диальдегида (МДА) у устойчивого генотипа в 1.5-2 раза ниже, чем у солечувствительного.

5. Выявлен генотип (клон-гибрид №1), обладающий повышенной устойчивостью к засолению и засухе. Биохимический анализ клубней показал, что по содержанию крахмала, белков и витамина С этот гибрид превосходил стандартные сорта Кардинал, Пикассо и Жуковский ранний.

6. Клон-гибрид №1 передан в 2008 г. в Государственную комиссию по сортоиспытанию сельскохозяйственных культур и охране сорта при МСХ РТ, как новый сорт «Файзабад», который проходит испытание в разных регионах Республики Таджикистан.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

• Разработан ускоренный способ отбора устойчивых к стрессу клон-гибридов in vitro с использованием селективных агентов.

• Активность антиоксидантных ферментов можно использовать как биохимический тест для оценки устойчивости генотипов картофеля и других культурных растений в условиях стресса in vitro и in vivo.

• Клон-гибрид №1 передан в Государственную комиссию по сортоиспытанию сельскохозяйственных культур и охране сорта при Министерстве сельского хозяйства Республики Таджикистан как новый сорт под названием Файзабад, обладающий высокой урожайностью и устойчивостью к солевому стрессу и засухе.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Азимов, Муродали Лакайевич, 2013 год

ЛИТЕРАТУРА

1. Аббасова З.И., Алахвердиев С.Р., Зейналов Э.М., Гусейнова Н.Б. Конформацонные изменения митохондрий при солевом стрессе//Третий съезд Всероссийского общества физиологов растений: тезисы докладов, - Санкт-Петербург, 1993, - 464 с.

2. Александров В.Я., Кислюк И.М. Реакция клеток на тепловой шок: физиологический аспект//Цитология. - 1994. с.36-59.

3. Алиев К., Каримов Б.К. Возделывание оздоровленного картофеля в Таджикистане. Душанбе. Изд-во "Дониш", 1997, 43 с.

4. Бабаева Ж.А., Бутенко Р.Г., Строганов Б.П. Влияние засоления питательной среды на рост изолированных тканей моркови//Физиология растений.- 1968, Т. 15. Вып. 1, с. 93-109.

5. Бабаджанова М.А. Исследование процессов регенерации и карбоксилирования акцептора С02 в связи с фотосинтетической продуктивностью растений: Автореф. ... дис. докт. биол. наук.-Душанбе, 1990.-40 с.

6. Бабаджанова М.А., Эсаналиева Ш.А., Алиев К.А., Солиева Б.А. Онтогенетические изменения рибулозобисфосфат карбоксилазной активности мультиферментных комплексов цикла Кальвина в листьях различающихся по продуктивности форм хлопчатника -Докл. АН РТ, 2009, т.52,№10, с.806-811.

7. Бабаджанова М.А., Эсаналиева Ш.А., Алиев К.А. Влияние внешних факторов на рибулозобисфосфаткарбоксилазную активность свободных мультиферментных комплексов цикла Кальвина в листьях различных генотипов хлопчатника. - Материалы научной конференции. «Физиология растений и проблемы развития растениеводства в Таджикистане»: посвященной 60-летию образования Академии наук Республики Таджикистан. Тез. Докл. -Душанбе, 2011, с.31-33.

8. Бургутин А.Б, Бутенко Р.Г, Кауров Б.А, Ниссанка Иддигоды, Селекция картофеля in vitro на устойчивость к хлористому натрию//Физиология растений.- 1996, Т. 43, с.597-603.

9. Бутенко Р.Г. Технология in vitro в сельском хозяйстве//С.-х. биология. - 1983.№5, с. 3-7.

10. Бутенко, Р.Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений / Р.Г. Бутенко / М.: Наука. 1964. - 272 с.

11. Веселов А.П. Гормональная и антиоксидантная системы при ответе растения на тепловой шок: Автореф. ... дисс. докт. биол. наук, М. ИФР, 2001.40с.

12. Веселовский В.А, Веселова Т.В, Чернявский Д.С. Стресс растения. Биофизический подход//Физиология растений.1993.- Т.40, №4. С.553-557.

13. Генкель П.А. Физиология жаро- и засухоустойчивости растений. М: Наука. 1982.-280с.

14. Глеба Ю.Ю, Сытник K.M. Клеточная инженерия растений.-Киев: Наукова думка, 1985. 187 с.

15. Гончарик М.Н. Влияние экологических условий на физиологию культурных растений. Минск: Изд-во АН БССР, 1962.-247с.

16. Давоян Э.И, Еремеева Г.И, Еремеева Г.И, Ефремова H.H., Бычков М.А. Изучение скрытой зараженности вирусной инфекцией длительно поддерживаемой коллекции картофеля. II симп. «Новые методы биотехнол. раст.», тез. докл. Пущино, 1993, с. 129.

17. Долгих Ю.И, Ларина С.Н, Шамина 3.Б, Жданова Н.Е, Пустовойтова Т.Н. Засухоустойчивость растений кукурузы, полученных из устойчивых к осмотическому действию полиэтиленгликоля клеточных линий//Физиология растений, 1994, Т. 41, №6, с. 853-858.

18. Достанова Р.Х. Фенольный комплекс растений при засолении среды//Диссерт. д.б.н., в форме научного доклада, - Новосибирск, 1994.

19. ЖибоедовП.М. Флавоноиды растений в условиях Кольской Субарктики //Физиолого-биохимические аспекты адаптации растений на Кольском Севере. Апатиты, 1991. С. 13-23.

20. Иванов H.H. Методы физиологии растений и биохимии растений. Из-во ОГИС-Сельхозгиз, 1946. стр. 19-27.

21. Ионева Ж., Петров-Спиридонов А.Е. Биометрические показатели и осмотический потенциал органов растений в условиях хлоридного засоления//Известия ТСХА, выпуск 3, - 1985, с. 120-125.

22. Кидрей Т.А. Устойчивость С4 растений к засолению среды корнеобитания//Вопросы экологии Волжско-Окского междуречья: Межвузовский сборник научных трудов. - Ковров КГТА, - 1999, с.80-83.

23. Клышев JI.K. Биохимические и молекулярные аспекты исследования солеустойчивости растений//Проблемы солеустойчивости растений. М., - 1989. 195 с.

24. Крылова Н.В., Степаненко М.И. Проникают ли вирусы в апикальную меристему растений. Труды Биолого-почвенного Института. М.-1971. с.4.

25. Кузнецов Вл.В., Дмитриева Г.А. Физиология растений: Учеб. для вузов. Изд. 2-е перераб. и доп. - М.: Высшая шк., 2006, 742 с.

26. Кузнецов Вл. В. Физиология растений: Учеб. для вузов/Вл.В. Кузнецов, Г.А. Дмитриева: М.: Высш. шк., 2005. - 736 е.: ил.

27. Кузнецов В. В., Шевякова Н. И. Пролин при стрессе: биологическая роль, метаболизм, регуляция//Физиология растений. 1999, Т. 46, №2, с. 32-40.

28. Кузнецов В. В., Пустовойтова Т. Н., Яценко И. А., Борисова Н.

Н., Жолкевич В. Н. Стрессовые белки и фитогормоны при

92

адаптации растений Cucumis sativus к почвенной засухе//Докл. АН СССР, 1992, Т. 32, С. 204-207.

29. Кузнецов Вл. В., Кимпел Дж., Гокджиян Д., Ки Дж. Элементы неспецифичности реакции генома растений при холодовом и тепловом стрессе. Физиология растений. 1987, т.34б, с.859-868.

30. Кулаева О.Н. Гормональная регуляция физиологических процессов у растений на уровне синтеза РНК и белка. - М.: Наука. 1982. -82 с.

31. Кулаева О.Н. Белки теплового шока и устойчивость растений к стрессу //Статьи Соровского образовательного журнала. Биология, 1997.

32. Кулаева О.Н., Хохлова В.А., Фофанова Т.А. Цитокинин и абсцизовая кислота в регуляции роста и процессов внутриклеточной дифференцировки//Гормональная регуляция онтогенеза. -М.: Наука, 1984. С. 71-86.

33. Ларина С.Н., Долгих Ю.И., Шамина З.Б. Применение культуры тканей кукурузы для тестирования устойчивости к абиотическим стрессам. Матер, науч. конф. по с/х биотехнологии, Целиноград, 1991, С. 40-41.

34. Леонтьева Ю., Соколова Г., Влияние вакцинации и биологически-активных веществ на восприимчивость томатов к картофельному штамму ВВКК//науч. труды Латв. с.-х. академии, Елгава, 1981, № 191, с. 88-91.

35. Лосева A.C., Петров-Спиридонов А.Е. Устойчивость растений к неблагоприятным факторам среды. - М.: - изд-во МСХА, - 1983., -47 с.

36. Луценко Э.К., Федюкина Е.М. Функционирование меристем и накопление ионов у растений при разных уровнях засоления//Известия Северо-Кавказского научного центра высшей школы. Естественные науки, - 1987., - № 3, с. 17-18.

37. Мелик-Саркисов О.С., Овчинникова В.Н., Ульянов Р.П. Получение безвирусного посадочного материала микроклубнями индуцированными в культуре in vitro (метод, рекомендации). М: ВАСХНИЛ. 1985,17 стр.

38. Мерзляк М.Н. Активированный кислород и окислительные процессы в мембранах растительной клетки//Итоги науки и техники. Сер. Физиология растений. М.: ВИНИТИ. 1989. Т.6. С.1-168.

39. Минаев C.B., Солдатов С.Е., Таланова В.В., Титов А.Ф. Исследование реакции проростков огурца и пшеницы на хлоридное засоление//Биологические исследования растительных и животных систем. - Петрозаводск: Карельский научный центр РАН, - 1992, с. 17-23.

40. Мирзорахимов А.К. Регуляция активности свободных мультиферментных комплексов цикла Кальвина высших растений: Дисс. док. биол. наук.- Душанбе.- 2011.-211с.

41. Михайловская И.С. Строение растений в связи с условиями жизни: учеб. пособие для студентов-заочников биологических факультетов пединститутов. - изд. 2-е, перераб. и доп. - М.: Просвещение, 1977, с. 81-86.

42. Муминджанов Х.А. Физиолого-биотехнологический подход к селекции и семеноводству картофеля в Таджикистане. Душанбе, 2003. 144с.

43. Назарова H.H. Культура столонов и регуляция роста растений и клубнеобразования картофеля in у/'/Уо/УАвтореферат диссертации кандидат биологических наук. Душанбе. 2006. 23 с.

44. Назарова H.H., Давлятназарова З.Б., Шукурова М.Х., Сабоиев И.А., Бобохонов P.C., Алиев К.А. Влияние регулятора роста паклобутразола на морфофизиологические параметры у разных по

солеустойчивости генотипов картофеля in у/?го//Известия АН РТ, 2011, №3 с. 39-47.

45. Нематуллоев З.С., Азимов M.JL, Давлатназарова З.Б., Ашуров С., Шукурова М., Назаров H.H., Карло Карли, Алиев К.А. Некоторые особенности роста и микроклубнеобразования у гибридов картофеля в условиях in у/?го//Известия АН РТ, 2008, №2, стр. 5662.

46. Пахомова В.М., Чернов H.A. Некоторые особенности индуктивной фазы неспецифического адаптационного синдрома растений.//Докл. РАН. Сер. биол. №6: 1996. с. 705-715.

47. Пирузян Э.С., Голденкова И.В., Лепец A.A., Квикрова М., Махачкова И., Кобец., Метт В.Л., Масайчук К.А. Физиолого-биохимические особенности трансгенных растений табака, экспрессирующих бактериальную диоксигеназу//Физиология растений. 2002. Т. 49. с. 918-924.

48. Полевой В.В., Максимова Г.Б. Методы биохимического анализа растений.-Л.: изд-во ЛГУ, 1978.-163с.

49. Полевой В.В. Физиология растений: Учеб. для биол. спец. вузов. -М.: Высш. шк, 1989, - 430 с.

50. Пустовойтова Т.Н., Баверина Т.В.. Жданова Н.Е. Особенности засухоустойчивости трансгенных растений табака с генами iaa и iaaH биосинтеза ауксина//Физиология растений. 2000. Т. 47. с. 431436.

51. Романов Г.А. Генетическая инженерия растений и пути решения проблемы биобезопасности//Физиология растений, 2000. Т.47. с. 343-353.

52. Романов Г.А., Медведев С.С. Ауксины и цитокинины в развитии растений. Последние достижения в исследовании фитогормонов. Второй межд. симпозиум (Прага, Чехия, 7-12 июня

2005г.)//Физиология растений. 2006. Т. 53. с.309-319.

95

53. Салимов А.Ф. Биотехнологические основы получения качественного семенного материала картофеля в Таджикистане// Автореф. ... док. дисс. Душанбе. 2007. 48 с.

54. Сидоров В.А. Биотехнология растений. Клеточная селекция.: Киев, «Науково думка», 1990. 280с.

55. Строганов Б.П. Растения и засоление почвы. - Изд-во АНСССР. -М.:-1958., - 68 с.

56. Строганов Б.П., Кабанов В.В., Шевяков Н.И., Лапина Л.П., Комирезко Е.И., Попов Б.А., Достанова Р.Х., Приходько Л.С. Структура и функции клеток при засолении. - М.: Наука, - 1970., 318с.

57. Строганов Б.П. Метаболизм растений в условиях засоления//33-е Тимирязевское чтение. -М.: 1973, - 51 с.

58. Строганов Б.П. Физиологические основы солеустойчивости растений. М.: Изд-во АН СССР, 1962, 366с.

59. Строганов Б. П. Растения и засоленные почвы. Москва: Изд-во АН СССР 1958, 85с.

60. Таланова В.В. Фитогормоны как регуляторы устойчивости растений к неблагоприятным факторам среды. Автореф. ... дисс. докт. биол. наук, Петрозаводск, 2009. 45 с.

61. Титов А.Ф., Акимова Т.В., Таланова В.В., Топчиева JI.B. Устойчивость растений в начальный период действия неблагоприятных температур. М.: Наука, 2006. 143 с.

62. Трофимец Л.Н., Князев В.А., Хромова Л.М., Егорова Л.И. Применение метода верхушечной меристемы в сочетании с термообработкой клубней и ускоренное размножение безвирусных растений в пробирочной культуре//Науч. труды НИИКХ. вып-. 30, М., 1977,с.11-18.

63. Трофимец Л.Н. Биотехнология в картофелеводстве. М.: Агропром. НТО, 1989. 45 с.

64. Трофимец J1.H., Бойко В.В., Анисимов Б.В. и др. Безвирусное семеноводство картофеля (рекомендации) М., Агропромиздат, 1990, 33с.

65. Удовенко Г.В. Солеустойчивость культурных растений. Л., 1977, 216с.

66. Урбах В.Ю. Биометрические методы-М.: Наука. 1964. 415с.

67. Федяева Т.Ю., Петров-Спиридонов А.Е. Биометрические показатели у кукурузы при постоянном и прогрессирующем хлоридном засолении//Известия ТСХА, выпуск 3,- 1988, - с. 99-103.

68. Чухлебова Н.С., Беловолова A.A. Особенности микроскопического строения вегетативных органов кукурузы при засолении почвы//Применение удобрений, микроэлементов и регуляторов роста в сельском хозяйстве. - Сборник научных трудов. -Ставрополь, - 1993, с. 45-47.

69. Шакирова Ф.М. Салициловая кислота - индуктор устойчивости растений (Обзор). Агрохимия. 2000. 11: 87-95.

70. Шакирова Ф.М. Неспецифическая устойчивость растений к стрессовым факторам и ее регуляция. УФА. Гилем, 2001. 160 с.

71. Шалабай В.И., Жук И.П. Величина терминальной безвирусной зоны у растений картофеля//Современные методы получения безвирусного картофеля. Тез. докл. Всес. сем.-сов. (6-8 окт. 1975 г., г.Москва), - М., 1975, с.22.

72. Шевелуха B.C. Рост растений и его регуляция в онтогенезе. М.: Колос, 1992. 594 с.

73. Шевякова Н.И. Метаболизм и физиологическая роль пролина в растениях при водном и солевом стрессе//Физиология растений, -1983, т.30. вып. 4, - с. 768-783.

74. Якубова М.М. Экологические аспекты биохимической адаптации//Известия АН РТ, 2011, №1, С.77-89.

75. Якушкина Н.И. Физиология растений: Учеб. пособие для студентов биол. спец. пед. ин-тов. -М.: Просвещение, - 1980, - 303 с, ил.

76. Adams A.N, Barbara D.J, Morton A, Darby P. The experimental transmission of hop latent viroid and its elimination by low temperature treatment and meristem culture//Ann.Appl.Biot. 1996. V.128. p. 37-44.

77. Bajji M, Kinet J.M, Bouharmont J. Characterization of progenies issued from drought tolerant plants of durum wheat selected in vitro. Proc. Intern. Congr. "Integrated study on drought tolerance of higher plants". Montpellier. France. 1995.

78. Belowaly N, Bouharmont J. NaCl tolerant plants of Poncirus trifoliata regenerated from tolerant cell lines//Theor. Appl. Enet. 1992. V. 83. P. 509-514.

79. Dajic Z. Salt stress. Physiology and molecular biology of stress tolerance in plants// Eds Medhava Rao K.Y, Raghavendra A.S, Janardham Reddy K.Dordrecth: Springer - Verlag, 2006. P.41-101.

80. De Griogri C, Sialer M. Finetti, Di Viro M, Lamberti F. Identification of plant-parasitic nematodes by PCR amplification of DNA fragments//Bull.OEPP, 1994, v.24, n.2, p. 447-451.

81. Dedic P, Ptacek J, Pohorela M, Domdarova J. Detekce viru S bramboru (PVS) tusemskem a dovazenem sadbovem materialu//Ved. pr. Vyzk. ust. brambor. 1996, №12, p.27-35.

82. Diener Т.О., Smith D.R. Potato spindle tuber viroid, XIII. Inhibition of replication by actinomycin D//Virology, 1975, v.63, p.421-427.

83. Duran-Vila N, Carbonell E.A, Boada S.P, Sermancik J.S. Growth of healthy and viroid-infected tomato cells in vz'iro//Plant Sci, 1995, v.105, N 1, p.l 11-120.

84. Giannopulitis C.N, Ries S.K Superoxide dismutase. 1. Occurence in Higer plants//Plant Physiol. 1977. V. 59. P. 309-314.

85. Grasmick M.E., Slack S.A. Effect of potato spindle tuber viroid on sexual reproduction and viroid transmission in true potato seed//Can. J. Bot., 1986, v. 64, p.336-340.

86. Hu H., Trevors C., McLeod C. Development of dot-blot hybridization and RT-PCR methods for rapid detection of potato mop-top furovirus in potato leaf tissues//Can. J. Plant. Pathol., 1998, v.20, N.l, p.129.

87. Karjalainen R., Kangasniemi A., Hamalainen J., Tegel J. Application of PCR for the diagnosis of bacterial ring rot infections on potato//Diagn.crop.prod.proc. Symp., Coventry, 1-3 Fpr., 1996. Farnham, 1996, p.133-138.

88. Kassanis B. The use of tissue cultures to produce virus free clones from infected potato varieties//Ann. Appl. Biol. 1957. v.45. p.3.

89. Khurana S.M.P., Sane A. Apical meristem culture: a tool for virus elimination. In: Comprehensive Potato Boitechnology, (Eds S.M.P. Khurana, R.Chandra, M.D.Upadhya), 1998, pp. 207-232, Malhotra Publishing House, New Delhi.

90. Lisarraga R., Salazar L., Roca W. Elimination of potato spindle tuber viroid by low temperature and meristem culture//Phytopathol. 1980. v.40, N8. p.754-755

91. Limasset P., Cornuet P. Recherche du virus de la mosaique du tabac (Marmor tabaci holmes) dans les meristemes des plantes infectees//C.R.Acad. Sci. 1949. v. 228. p.1971-1972.

92. Momma T., Takahaski T., Development morphology of hop stunt viroid-infected hop plants and analysis of their cone yield//Phytopathol. Z., 1983.p. 359-364.

93. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco tissue cultures//Physiologia Plantarum. 1962. V.15. P.473-497.

94. Nabors M. W., Daniel A., Nadolny L., Brown C. Sodium chloride

tolerant lines of tobacco cells//Plant. Sci. Lett., 1975. № 4, P. 155-159.

99

95. Narayanan K.K., Kangasamy S.R. Inheritance of salt tolerance in progenies of tissue culture selected variants of rice//Curr. Sei. 1989. №21. P. 1204-1205.

96. Niepold F. Erfahungen bie der Anwendung der Polymerase Ketten Reaktion (PCR) zum Nachweis von Pseudomonas solanacearum in Kartoffelen. 50 D. Pflanzenschutztag., Munster, 23-26 Sept., 1996. Mitt, Boil. Bundesanst. Land-und Forswirt. Berlin-Dahlem, 1996. S. 158.

97. Pastori G.M., Foyer C.H. Common components, networks and pathways of cross-tolerance to stress. The central role of 'redox' and abscisic-acid-mediated controls//Plant Physiol. 2002. 129: 460-468. J

98. Sabbah S., Tal M. Development of callus and suspension cultures of potato resistant to NaCl and Mannitol and their response to stress//Plant, Tissue, Organ Culture. 1990. V.21, № 2, p. 119-128.

99. Sabehat A, Weiss D, Lurie S. 1998. Heat shock proteins and cross-tolerance in plants//Physiol. Plant. 103: 437-441.

100. Singh M., Singh R.P. Potato virus Y detection: sensivity of RT-PCR depends on the size of fragment amplified//Can. J. Plant Pathol., 1997, v.19, N 2, p. 149-155.