Новая ациламидаза из Rhodococcus erythropolis - свойства, гетерологичная экспрессия и практическое применение тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.07, кандидат биологических наук Лавров, Константин Валерьевич

• Лавров, Константин Валерьевич
• кандидат биологических наук
• 2010

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Лавров, Константин Валерьевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Амидазы: распространённость и свойства

2.1.1. Субстратная специфичность амидаз

2.1.1.1. Алифатические амидазы

2.1.1.2. Стереоселективные амидазы

2.1.2. Гидролиз амидазами Ы-замещённых амидов

2.1.3. Аминокислотные последовательности амидаз

2.1.3.1. Алифатические амидазы

2.1.3.2. Стереоселективные амидазы

2.1.4. Особенности биосинтеза амидаз микроорганизмов

2.2. Гидролитические ферменты, катализирующие ацилирование аминов

2.2.1. Амидазы

2.2.2. Пенициллин-ацилазы

2.2.3. Протеиназы

2.2.4. Липазы 30 2.3.1Ч-замещённые акриламиды: применение и способы получения

2.3.1. Свойства и применение К-изопропилакридамида

2.3.2. Химические методы получения М-замещённых акриламидов

2.3.3. Перспективы биокаталитических способов получения ]М-замещённых акриламидов

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1. Материалы

3.2. Коллекция природных микроорганизмов

3.3. Почвенные образцы, использованные для выделения штаммов

3.4. Среды для культивирования

3.5. Штаммы, плазмиды

3.6. Спектрофотометрические измерения

3.7. Выделение культур бактерий из образцов почвы

3.8. Трансформация ИПАА нерастущими клетками бактерий

3.9. Определение ИПАА и продуктов его трансформации

3.10. Синтез ИПАА из акриламида и изопропиламина нерастущими клетками бактерий

3.11. Измерение ациламидазной активности клеток с 4'-нитроацетанилидом

3.12. Измерение активности бесклеточных экстрактов и очищенной ациламидазы с 4-нитроацетанилидом

3.13. Определение субстратной специфичности ациламидазы

3.14. Определение аминокислотной последовательности

3.15. Анализ последовательностей

3.16. Коныогационное скрещивание Rhodococcus erythropolis ТА37 и Е. coli S17

3.17. Методики работы с ДНК

3.18. Методики работы с белками

3.19. Гетерологичная экспрессия в Е. coli 48 4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 49 .4.1. Скрининг микроорганизмов, способных гидролизовать амидную связь в N-изопропилакриламиде.

4.1.1. Скрининг микроорганизмов по росту на изопропилакриламиде.

4.1.2. Способность штаммов, растущих на ИПАА, трансформировать изопропилакриламид до и-пропиламина и акриловой кислоты.

4.2. Выбор лучшего штамма, катализирующего синтез N-изопропилакриламида.

4.2.1. Динамика синтеза ИПАА лучшими штаммами — гидролитиками ИПАА

4.2.2. Идентификация штамма ТА37, проявляющего максимальную активность ациламидазы

4.3. Изучение особенностей биосинтеза ациламидазы и оптимизация условий, обеспечивающих максимальную активность клеток R. erythropolis ТА37.

4.3.1. Индукторы ациламидазы

4.3.2. Локализация ациламидазы в клетке.

4.3.3. Электрофоретическое исследование белков штамма R. erythropolis ТА

4.3.4. Условия, обеспечивающие максимальную активность клеток R. erythropolis ТА37.

4.4. Выделение новой ациламидазы и изучение её каталитических свойств.

4.4.1. Методика контроля активности ациламидазы по гидролизу 4"нитроацетанилида.

4.4.2. Выделение и очистка ациламидазы.

4.4.3. Влияние температуры на активность и стабильность ациламидазы.

4.4.4. Влияние рН на активность и стабильность ациламидазы.

4.4.5. Влияние реагентов и ионов металлов на активность ациламидазы.

4.4.6. Субстратная специфичность ациламидазы.

4.5. Клонирование гена, кодирующего ацил амид азу, секвенирование и анализ последовательности.

4.5.1. Определение частичной аминокислотной последовательности.

4.5.2. Клонирование ациламидазы и характеристика последовательности

4.5.2.1. Клонирование ациламидазы на векторе рТЕ57Ы/Т

4.5.2.2. Анализ последовательности ациламидазы. 72 Общая гомология аминокислотной последовательности 72 Общая гомология нуклеотидной последовательности 73 Множественное выравнивание аминокислотной последовательности

4.6. Интегративная инактивация гена ациламидазы в Я. егуЛгороИз ТА37 и проверка фенотипа мутантов.

4.6.1. Интегративная инактивация

4.6.2. Рост штамма с инактивированной ациламидазой на И-замещённых и незамещённых амидах

4.7. Гетерологичная экспрессия гена, кодирующего ациламидазу, в Е. соИ

4.7.1. Экспрессия под лактозным промотором

4.7.2. Экспрессия под промотором фага Т

4.7.3. Спектр гидролитической активности рекомбинантной ациламидазы

4.8. Разработка процесса биокаталитического синтеза ]Ч-замещённых акриламидов с использованием новой ациламидазы.

4.8.1. Оптимизация условий биокаталитического синтеза

4.8.2. Получение кристаллически чистого М-изопропилакриламида

5. ВЫВОДЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Новая ациламидаза из Rhodococcus erythropolis - свойства, гетерологичная экспрессия и практическое применение»

Использование микроорганизмов и их ферментов для устойчивого и экологически безопасного получения разнообразных химических соединений является одним из приоритетных направлений развития биотехнологии. По оценкам экспертов в течение текущего десятилетия доля биотехнологических продуктов в общем объеме химической продукции возрастет в 10 раз. Особенно быстрыми темпами (более чем в 15 раз) будет увеличиваться производство полимеров из мономеров, получаемых с помощью биотехнологий. Сегодня в промышленных масштабах с помощью биотехнологий уже производится 3 мономера: акриламид, молочная кислота и 1,3 - пропандиол. Реализованные проекты продемонстрировали значительные преимущества биотехнологий в сравнении с традиционными химическими технологиями: биокатализаторы позволяют осуществлять процессы при мягких условиях (низкие температуры, нейтральная водная среда) и с высокой селективностью. Однако главное преимущество биокаталитических процессов состоит в том, что они, в целом, экологически безопаснее традиционных химических процессов и приводят к снижению выбросов и отходов (ионов металлов, различных солей, растворителей и пр.). Несмотря на явные преимущества биокаталитических систем, масштабы их использования в современной химической индустрии и, в частности, для получения мономеров, все еще ограничены. Для расширения спектра получаемых мономеров требуются новые биокаталитические системы с уникальными свойствами, которые позволят разработать экономически эффективные технологии, способные составить конкуренцию существующим технологиям. Синтез акриловых мономеров с использованием биокаталитических систем микроорганизмов является одной из немногих областей промышленной биотехнологии, где у России имеются приоритетные достижения в практической области. Данная работа направлена на решение проблемы экологически-безопасного и конкурентоспособного получения новой группы мономеров полимерного качества - N-замещенных акриламидов, продуктами сополимеризации которых с акриламидом являются катионные флокулянты для очистки воды, повышения нефтеотдачи, добычи полезных ископаемых, а также полимеры с температуро-зависимой растворимостью, т.н. «smart» полимеры. Решение этой проблемы связывается с обнаружением новых ферментов, способных синтезировать М-замещенные акриламиды путём ацилирования аминов ацильным остатком акриламида в водной среде.

Цель и задачи работы.

Целью данной работы являлось обнаружение и характеристика нового фермента, способного синтезировать N-замещенные акриламиды путём ацилирования аминов ацильным остатком акриламида в водной среде, изучение гена кодирующего этот фермент, а также оценка биокаталитического потенциала нового фермента в области органического синтеза.

В процессе работы решались следующие задачи:

1. Скрининг микроорганизмов, способных гидролизовать амидную связь в N-изопропилакриламиде.

2. Выбор лучшего штамма, катализирующего синтез N-изопропилакриламида.

3. Изучение особенностей биосинтеза ациламидазы и оптимизация условий, обеспечивающих максимальную активность клеток выбранного штамма.

4. Выделение ациламидазы и изучение её каталитических свойств.

5. Клонирование гена, кодирующего ациламидазу, секвенирование и анализ последовательности.

6. Интегративная инактивация гена ациламидазы в выбранном штамме и проверка фенотипа мутантов.

7. Гетерологичная экспрессия гена, кодирующего ациламидазу, в Escherichia coli.

8. Разработка процесса биокаталитического синтеза N-замещённых акриламидов с использованием новой ациламидазы.

Научная новизна и практическая значимость.

Обнаружен новый бактериальный фермент ациламидаза в клетках Rhodococcus erythropolis ТА37, способный гидролизовать N-замещённые амиды и осуществлять перенос ацильного остатка акриламида на алифатические амины в водной среде. Аминокислотная последовательность ациламидазы значительно отличается от последовательностей всех известных белков (уровень гомологии с известными белками не превышает 37%). Уникальные свойства обнаруженного фермента и созданного на его основе катализатора позволили впервые в мировой практике использовать биокаталитические системы для синтеза М-замещенных акриламидов путем непосредственного взаимодействия акриламида и аминов в водной среде при температуре 20-30°С.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Генетика», Лавров, Константин Валерьевич

5. ВЫВОДЫ

1. Обнаружен новый бактериальный фермент ациламидаза в клетках Rhodococcus erythropolis ТА37, обладающий двумя активностями: гидролитической активностью в отношении N-замещенных амидов и ацилтрансферазной активностью переноса ацильного остатка акриламида на алифатические амины в водной среде.

2. Получен хроматографически и электрофоретически гомогенный препарат фермента ациламидазы с помощью жидкостной хроматографии на сорбенте MonoQ Hitrap.

3. Клонирован ген, кодирующий ациламидазу и определена его нуклеотидная последовательность. На основании компьютерного анализа гена и кодируемого им продукта установлено, что ациламидаза принадлежит к семейству стереоселективных амидаз, обладающих каталитической триадой Ser-Ser-Lys. Уровень гомологии амиламидазы с другими амидазами этого семейства не превышает 37%.

4. Инактивация гена ациламидазы в штамме Rhodococcus erythropolis ТА37 приводит к одновременной утрате клетками гидролитической и ацилтрансферазной активностей, характерных для ациламидазы.

5. Ген ациламидазы из Rhodococcus erythropolis ТА37 экспрессирован в клетках Е. coli, под промотором фага Т7. Клетки E.coli, продуцирующие ациламидазу, приобретают гидролитическую и ацилтрансферазную активности.

6. Впервые разработан биокаталитический способ синтеза N-замещенных акриламидов путем непосредственного взаимодействия акриламида и аминов в водной среде при 20-30°С с помощью катализатора - клеток R. erythropolis ТА37, содержащих ациламидазу.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Лавров, Константин Валерьевич, 2010 год

1. Гуранда Д. Т. (2000) Специфичность и стереоспецифичность пенициллинацилаз из Escherichia coli и Alcaligenes faecalis. Дисс. канд. хим. наук, Москва, МГУ им. М.В. Ломоносова.

2. Семёнов А.Н., Мартинек К., Швядае В.-Ю.К., Марголин A.JL, Березин И.В. (1981) Ферментативный синтез антибиотика (бензилпенидиллина) в двухфазной водноорганической системе. ДАН. 258(5). 1124-1126.

3. Степанов В.М. Структура и функции белков. Молекулярная биология. (1996) Под ред. Спирина А.С. Москва. Высшая школа.

4. Филлипова И.Ю. (2002) Протеиназы как катализаторы реакций сегментной конденсации пептидов. Дисс. Д.б.н. МГУ, Москва.

5. Яненко А.С. (2001) Катаболизм нитрильных соединений у Rhodococcus rhodochrous: генетический контроль, механизмы регуляции и промышленное использование. Дисс. д.б.н. Москва.

6. Ambler, R. P., Auffret, A. D. and Clarke, P. Н. (1987) The amino acid sequence of the aliphatic anúdase from Pseudomonas aeruginosa. FEBS Lett. 215, 285±290.

7. Boosten W.H.J., Svedas V.K. (2004) Penicillin acylase-catalyzed synthesis of p-lactam antibiotics in highly condensed aqueous systems. Beneficial impact of kinetic substrate supersaturation. Biotechnol. Bioeng.,85 (3), 323-329.

8. Ciskanik LM, Wilczek JM, Fallon RD. (1995) Purification and Characterization of an Enantioselective Amidase from Pseudomonas chlororaphis B23. Appl Environ Microbiol. Mar;61(3):998-1003.

9. Clarke PH. (1972) Biochemical and immunological comparison of aliphatic amidases produced by Pseudomonas species. J Gen Microbiol. Jul;71(2):241-57.

10. Cole M. (1969) Deacylation of acylamino compounds other than penicillins by the cell-bound penicillin acylase of Escherichia coli. Biochem J. Dec;l 15(4):741-5.

11. Cole M. (1969) Hydrolysis of penicillins and related compounds by the cell-bound penicillin acylase of Escherichia coli. Biochem J. Dec;l 15(4):733-9.

12. Cole M. (1964) PROPERTIES OF THE PENICILLIN DEACYLASE ENZYME OF ESCHERICHIA COLI. Nature. Aug l;203:519-20.

13. Didziapetris R, Drabnig B, Schellenberger V, Jakubke HD, Svedas V. (1991) Penicillin acylase-catalyzed protection and deprotection of amino groups as a promising approach in enzymatic peptide synthesis. FEBS Lett. Aug 5;287(l-2):31-3.

14. Finn R., Mistry J., Tate J., Coggill P., et al. (2010) The Pfam protein families database. // Nucleic Acids Research. V. 38. P. D211-D222.

15. Fournand D, Arnaud A. Aliphatic and enantioselective amidases: from hydrolysis to acyl transfer activity. J Appl Microbiol. 2001 Sep;91(3):381-93.

16. Fournand D, Bigey F, Arnaud A. (1998 ) Acyl transfer activity of an amidase from Rhodococcus sp. strain R312: formation of a wide range of hydroxamic acids. Appl Environ Microbiol. Aug;64(8):2844-52.

17. Fuganti C., Rosella C., Servi S., Tagliani A. and Terreni M. (1992) Enantioselective recognition of the phenacetyl moiety in the Pen G acylase catalysed hydrolysis of phenylacetate esters Tetrahedron: Asymmetry Volume 3, Issue 3, Pages 383-386.

18. Gololobov M., Morozova IP., Vojushina TL., Timokhina EA., Stepanov VM. (1992) Subtilisin from Bacillus subtilis strain 72. The influence of substrate structure, temperature and pH on catalytic properties. Biochim Biophys Acta. Feb 1;1118(3):267-76.

19. Goossens B., Kuster E., Dahmen K., Barthell E. (1985). Polymers of.alpha.,.beta.-unsaturated N-substituted carboxylic acid amides. United States Patent 4,528,350.

20. Gopalakrishna KN, Stewart BH, Rneen MM, Andricopulo AD, Kenyon GL, McLeish MJ. (2004) Mandelamide hydrolase from Pseudomonas putida: characterization of a new member of the amidase signature family. Biochemistry. Jun 22;43(24):7725-35.

21. Guranda D.T., van Langen L.M., van Rantwijk F., Sheldon R.A., Svedas V.K. (2001) Highly efficient and enantioselective enzymatic acylation of amines in aqueous medium. Tetrahedron: Asymmetry. V. 12. P. 1645—1650.

22. Hacking, M.A.P.J., van Rantwijk, F., Sheldon, R.A. (2001) Lipase catalysed acylation of hydroxylamine and hydrazine derivatives Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 11 (4-6), p.315.

23. Hayatsu M, Mizutani A, Hashimoto M, Sato K, Hayano K. (2001) Purification and characterization of carbaryl hydrolase from Arthrobacter sp. RC100. FEMS Microbiol Lett. Jul 10;201(1):99-103.

24. Hirrlinger B, Stolz A, Knackmuss HJ. (1996) Purification and properties of an amidase from Rhodococcus erythropolis MP50 which enantioselectively hydrolyzes 2-arylpropionamides. J Bacteriol. 178(12):3501-7.

25. Holt J. G. ed. (1994) Bergey's Manual of Determinative Bacteriology 9th Edition Williams & Wilkins, Baltimore.

26. Hoshino K., Taniguchi M., Marumoto H., Fujii M. (1989) Repeated Batch Conversion of Raw Starch to Ethanol Using Amylase Immobilized on a Reversible Soluble-autoprecipitating Carrier and Flocculating Yeast Cells Agric. Biol. Chem., 53, 1961.

27. Huang H. T., Seto T. A., and Shull G. M. (1963) Distribution and Substrate Specificity of Benzylpenicillin Acylase Appl Microbiol. January; 11(1): 1-6.

28. Kazlauskas R.J., Bornscheuer. (1998) Biotransformations with lipases, in Biotechnology, ed. H.-J. Rehm and G.Reed. Wiley-VCH.

29. Kelly M, Clarke PH. (1962) An inducible amidase produced by a strain of Pseudomonas aeruginosa. J Gen Microbiol. Feb;27:305-16.

30. Kim M.G., Lee S.B., (1996) Penicillin acylase-catalyzed synthesis of B-lactam antibiotics in water-methanol system: effect of cosolvent content and chemical nature of substrate on reaction rates and yields. J. Mol. Catalysis B:enzymatic, 1, 201-211.

31. Kobayashi M, Goda M, Shimizu S. (1999) Hydrazide synthesis: novel substrate specificity of amidase. Biochem Biophys Res Commun. Mar 16;256(2):415-8.

32. Krieg L, Slusarczyk H, Verseck S, Kula MR. (2005) Identification and characterization of a novel D-amidase gene from Variovorax paradoxus and its expression in Escherichia coli. Appl Microbiol Biotechnol. 66(5):542-50.

33. Ma Y, Yu H, Pan W, Liu C, Zhang S, Shen Z. (2010) Identification of nitrile hydratase-producing Rhodococcus ruber TH and characterization of an amiE-negative mutant. Bioresour Technol. Jan;101(l):285-91.

34. MacWilliams D.S. (1973) Functional monomers. Their preparation, polymerization, and application. New York: M.Decker.

35. Martín L., Prieto M., Cortés E., García J. (1995) Cloning and sequencing of the pac gene encoding the penicillin G acylase of Bacillus megaterium ATCC 14945 FEMS Microbiology Letters Volume 125, Issue 2-3, pages 287-292.

36. Neu D, Lehmann T, Elleuche S, Pollmann S. (2007) Arabidopsis amidase 1, a member of the amidase signature family. FEBS J. Jul;274(13):3440-51.

37. Oh SJ, Kim YC, Park YW, Min SY, Kim IS, Kang HS. (1987) Complete nucleotide sequence of the penicillin G acylase gene and the flanking regions, and its expression in Escherichia coli. Gene. 56(l):87-97.

38. Patricelli MP, Cravatt BF. (2000) Clarifying the catalytic roles of conserved residues in the amidase signature family. J Biol Chem. Jun 23;275(25): 19177-84.

39. Rosenberg AH, Lade BN, Chui DS, Lin SW, Dunn JJ, Studier FW. (1987) Vectors for selectiveexpression of cloned DNAs by T7 RNA polymerase. Gene. 56(1): 125-35.

40. Sambrook J., Russell D.W. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring1. Harbor.

41. Schmaljohann D. (2006) Thermo- and pH-responsive polymers in drug delivery. Adv Drug Deliv Rev. Dec 30;58(15): 1655-70.

42. Shrestha R, Dixon RA, Chapman KD. (2003) Molecular identification of a functional homologue of the mammalian fatty acid amide hydrolase in Arabidopsis thaliana. J Biol Chem. 278(37):34990-7.

43. Siezen RJ., Leunissen JA. (1997) Subtilases: the superfamily of subtilisin-like serine proteases. Protein Science. Mar;6(3):501-23.

44. Sio Ch.F., Quax W.J. (2004) Improved ß-lactam acylases and their use as industrial biocatalysts / Curr. Opin. Biotechnol. V. 15. P. 349—355.

45. Skouloubris S, Labigne A, De Reuse H. (2001) The AmiE aliphatic amidase and AmiF formamidase of Helicobacter pylori: natural evolution of two enzyme paralogues. Mol Microbiol. 40(3):596-609.

46. Studier FW, Moffatt BA. (1986) Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J Mol Biol. 189(1): 113-30.

47. Thiery A, Maestracci M., Arnaud A., Galzy P. (1986) Acyltransferase Activity of the Wide Spectrum Amidase of Brevibacterium sp. R312. Journal of General Microbiology, 132, 22052208.

48. Van der Mey M., and De Vroom E. (1994) Substrate specificity of immobilized penicillin-G acylase. Bioorg. Med. Chem. Lett. 4(2). 345-348.

49. Verhaert RM, Riemens AM, van der Laan JM, van Duin J, Quax WJ. (1997) Molecular cloning and analysis of the gene encoding the thermostable penicillin G acylase from Alcaligenes faecalis. Appl Environ Microbiol. 63(9):3412-8.

50. Vliet AH, Stoof J, Poppelaars SW, Bereswill S, Homuth G, Kist M, Kuipers EJ, Kusters JG. (2003) Differential regulation of amidase- and formamidase-mediated ammonia production by the Helicobacter pylori fur repressor. J Biol Chem. 278(11):9052-7.

51. Voeykova T. Tabakov T., Ryabchenko L., Mkrtumyan N. and Yanenko A. (1994) Conjugative transfer of plasmid pTOl from Escherichia coli to Rhodococcus spp. Biotechnology Letters Volume 16, Number 6, Pages 555-560.

52. Wei BQ, Mikkelsen TS, McKinney MK, Lander ES, Cravatt BF. (2006) A second fatty acid amide hydrolase with variable distribution among placental mammals. J Biol Chem. 281(48):36569-78.