Орфанные наследственные нервно-мышечные болезни: принципы дифференцированной терапии тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.01.11, доктор наук Соколова Мария Георгиевна

• Соколова Мария Георгиевна
• доктор наук
• 2018

Оглавление диссертации доктор наук Соколова Мария Георгиевна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ПРОБЛЕМЫ ОРФАННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ НЕРВНОЙ СИСТЕМЫ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

1.1. Орфанные заболевания

1.2. Орфанные заболевания нервной системы

1.2.1. Орфанные заболевания нервной системы с поражением структур головного мозга

1.2.2. Орфанные заболевания нервной системы с поражением нервно-мышечной системы

1.2.2.1. Спинальные мышечные атрофии

1.2.2.2.Мышечная дистрофия Дюшенна

1.2.2.3. Наследственные моторные и сенсорные невропатии

1.3. Лечение орфанных болезней нервной системы

1.3.1. Основные научные направления в лечении мышечной дистрофии Дюшенна

1.3.2. Основные научные направления в лечении спинальной мышечной атрофии

1.3.3. Разработки генной и клеточной терапии для лечения орфанных нервно-мышечных болезней

1.4. Изучение факторов, поддерживающих развитие нейродегенерации

при орфанных болезнях нервно-мышечной системы

1.5. Эндогенные антиапоптотические механизмы

1.5.1. Реиннервация - компенсаторно-приспособительный механизм

1.5.2. Электронейромиография и денервационно-реиннервационный

процесс

1.6. Общая характеристика нейротрофинов

1.6.1. Клинические аспекты изучения нейротрофинов

1.6.2. Терапевтическое применение нейротрофинов

ГЛАВА 2. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА СОБСТВЕННЫХ

НАБЛЮДЕНИЙ И МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Характеристика обследованных больных

2.2. Методы исследования

2.2.1. Клинико-неврологическое исследование

2.2.2. Молекулярно-генетическое исследование

2.2.3. Нейрофизиологическое исследование

2.2.4. Лабораторное исследование

2.2.5. Экспериментальное исследование

2.2.6. Статистическая обработка данных

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Клинико-неврологическая характеристика больных

3.1.1. Клинико-неврологическая и лабораторная характеристика больных первой группы

3.1.2. Клинико-неврологическая и лабораторная характеристика больных второй группы

3.1.3. Клинико-неврологическая и лабораторная характеристика больных третьей группы

3.1.3.1. Данные молекулярно-генетического исследования больных третьей группы

3.1.4. Клинико-неврологическая и лабораторная характеристика больных группы сравнения

3.2. Сопоставление результатов комплексного обследования больных исследуемых групп

3.2.1. Сравнительный анализ клинико-неврологического исследования

3.2.2. Сопоставление результатов лабораторного исследования

нейротрофинов и белков регулирующих апоптоз в исследуемых группах

ГЛАВА 4. РЕЗУЛЬТАТЫ НЕЙРОФИЗИОЛОГИЧЕСКОГО

ИССЛЕДОВАНИЯ БОЛЬНЫХ

4.1. Результаты электроэнцефалографического исследования у больных первой группы

4.2. Электрофизиологическое исследование пациентов второй группы

4.3. Электрофизиологическое исследование пациентов с мышечными

дистрофиями Дюшенна и первичными миопатиями

ГЛАВА 5. РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ИССЛЕДОВАНИЯ

5.1. Результаты изучения влияния плазмы крови больных в органотипической культуре ткани

5.2. Сопоставление экспериментальных и лабораторных данных больных исследуемых групп

5.3. Оценка влияния реагентов (фактора роста нерва и протеинкиназы С)

на рост нейритов в органотипической культуре ткани

ГЛАВА 6. ОСНОВНЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ ДИФФЕРЕНЦИРОВАННОЙ ПАТОГЕНЕТИЧЕСКОЙ ТЕРАПИИ ОРФАННЫХ НАСЛЕДСТВЕННЫХ

НЕРВНО-МЫШЕЧНЫХ БОЛЕЗНЕЙ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

СПИСОК ТЕРМИНОВ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Орфанные наследственные нервно-мышечные болезни: принципы дифференцированной терапии»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования. По данным Всемирной организации здравоохранения, общее количество больных с наследственной патологией составляет 2,5-4% от всего населения планеты. Среди них особое место занимают заболевания нервной системы, отличающиеся по типам мутаций, с выраженной генетической детерминацией, приводящей к быстрой инвалидизации и летальности больных. Большая часть из них относится к так называемым редким болезням с частотой встречаемости от 0,003 до 10 больных на 100 000 населения [Баранов А.А. и др., 2010]. В 2012 году было принято Постановление Правительства Российской Федерации № 403, в котором определен перечень редких (орфанных) наследственных заболеваний. К наиболее распространенным формам орфанных болезней нервной системы относятся наследственные лейкодистрофии, прогрессирующие амиотрофии (спинальная мышечная атрофия и наследственная моторная и сенсорная невропатия) и прогрессирующие миодистрофии (мышечная дистрофия Дюшенна, Беккерра, врожденные миопатии) [Гусев Е.И. и др., 2009; Бочкова Н.П. и др., 2012; Гузева В.И. и др., 2016].

Эффективных методов лечения орфанных наследственных заболеваний нервной системы нет. Исследования последних лет позволяют говорить о возможности замедления прогрессирования мышечной дистрофии Дюшенна (МДД) с примением методики пропуска экзонов [Bushby K. et al., 2014], супрессии мутантных стоп-кодонов [Bushby K. et al., 2014] или замещения дистрофина атрофином [Janghra N. et al., 2016]. Предложенные препараты, к сожалению, не имеют официальной регистрации и разработаны только для больных с МДД, имеющих мутации в 52 экзоне Х-хромосомы [Kim M.J. et al., 2016], или при нонсенс-мутации, встречающейся чрезвычайно редко [Milic R.V. et al., 2015; Huard J. et al., 2016].

Подобная ситуация наблюдается и с лекарственными препаратами, разрабатываемыми для лечения спинальной мышечной атрофии (СМА) [Aartsma-

Rus A. et al., 2017; Scoto M. et al., 2017]. Одни препараты не показывают клинических улучшений у больных (комбинация левокарнитина и вальпроевой кислоты) [Brichta L. et al., 2003; Kissel J.T. et al., 2011; 2013], другие являются токсичными: ингибитор деацетилаз гистонов [Riessland M. et al., 2006; Butchbach M.E.R. et al., 2010], фенилбутират [Andreassi C. et al., 2004], салбутамол [Tiziano F.D. et al., 2010] и не разрешены к применению. По мнению многих ученых, перспективным направлением является использование «малых молекул», корректирующих сплайсинг пре-мРНК гена SMN2 [HuaY. et al., 2010]. Однако препарат RG7800 в высоких дозах при долгосрочном применении пациентами вызывает атрофию сетчатки глаза [Liang W. et al., 2016], а препарат Нусинерсен должен вводиться непосредственно в ликворную систему спинного мозга новорожденных со СМА [Hache M. et al., 2016; Finkel, R.S. et al., 2017; Bishop K.M. et al., 2018], и, к сожалению, не представлено ретроспективных данных, подтверждающих клинический эффект. Лечение наследственных лейкодистрофий и сенсомоторных полиневропатий носит симптоматический характер с использованием препаратов, направленных на улучшение миелинизации [Петрухин А.С., 2012; Гузева В.И. и др., 2016].

Степень разработанности темы исследования. Новые подходы к лечению орфанных наследственных нервно-мышечных болезней (ОННМБ) как фундаментальные, так и клинические в настоящее время представлены генной и клеточной терапией. Но ряд нерешенных этических вопросов и большое количество осложнений, возможных при данных видах терапии, не позволяют рассчитывать на активное внедрение этих методов в клиническую практику [Olivan S. et al., 2015; Ramos J. et al., 2016].

Общей чертой орфанных нервно-мышечных заболеваний является механизм гибели клетки (нейрона или миоцита) путем апоптоза и запуск внутриклеточных и внутриорганных молекулярных патологических каскадов, поддерживающих развитие нейродегенерации: оксидативный стресс, нейрональное воспаление, метаболические расстройства в нейроне, активация микроглии и т.д.

Таким образом, актуальным направлением может быть изучение факторов, способствующих прогрессированию нейродегенерации, и поиск препаратов, стабилизирующих патологические молекулярные каскады. Действие может быть направлено как на снижение активности процесса апоптоза, так и на стимуляцию нейротрофической функции нервной ткани больного. Данные механизмы в большей степени изучены при болезни Альцгеймера [Sopova K. et al., 2013; Shin M.K. et al., 2014; Florencia I.M. et al., 2017], болезни Паркинсона [Коновалова Е.В. и др., 2015; Литвиненко И.В. и др., 2017; Angelucci F. et al., 2015] и при боковом амиотрофическом склерозе [He Y.Y. et al., 2013]. У детей с наследственными заболеваниями нервной системы изучение тонких физиологических механизмов, поддерживающих процесс нейродегенерации, носит единичный и несистематичный характер. Так установлено, что препарат Олесоксим снижает выход цитохрома С, уменьшает активность каспаз 3 и 8 [Bordet T. et al., 2010], но в тоже время снижается контроль за неопластическим ростом клеток, что не позволяет применять его у детей. Апоптотические и антиапоптотические белки наиболее изучены при онкологических заболеваниях [Callagy G. et al., 2006; Bedner E.X. et al., 2008; D'Orsi B. et al., 2015; Frenzel А. et al., 2015]. Эти знания могут быть использованы и при выборе методов лечения нейродегенеративных заболеваний.

Исследование физиологических механизмов нейротрофической регуляции и антиапоптотической защиты у пациентов с редкими наследственными заболеваниями нервной системы может расширить возможности патогенетической терапии, создавая оптимальные условия для восстановления нервной ткани, способствуя замедлению прогрессирования заболевания и, как следствие, повышению качества жизни больного. В настоящее время нейротрофическая гипотеза развития наследственных нервно-мышечных заболеваний у детей не сформулирована. В то же время доказано участие нейротрофических факторов (НТФ) в регуляции нейропластичности и нейрогенеза [Cai J. et al., 2014]. Эти адаптационные механизмы запускаются как в

физиологических, так и в патологических состояниях для противостояния прогрессирующей гибели популяции нейронов [ЛПюпеШ С. е1 а1., 2002; Егапе1ае1а1 М. е1 а1., 2004]. Все вышеизложенное определяет необходимость поиска новых подходов к патогенетической терапии ОННМБ с позиции изучения тонких физиологических механизмов нейрогенеза и процесса нейродегенерации.

Цель исследования. Изучить возможность патогенетической терапии орфанных наследственных нервно-мышечных болезней на основе клинико-экспериментального исследования роли нейротрофических механизмов в процессе прогресирующей дегенерации нервной системы.

Задачи исследования:

1. Провести клинико-неврологическое и нейрофизиологическое обследование больных с орфанными наследственными нервно-мышечными заболеваниями для уточнения характера денервационного и реиннервационного процессов.

2. Определить качественный состав и концентрацию белков семейства нейротрофинов: цилиарного нейротрофического фактора, фактора роста головного мозга, фактора роста нерва плазмы крови у здоровых людей и у больных с орфанными наследственными нервно-мышечными болезнями.

3. Исследовать содержание белков, регулирующих апоптоз (р53, каспаза 8, цитохром С) и участвующих в антиапототической защите (белок Вс12), в плазме крови здоровых людей и больных орфанными наследственными нервно-мышечными заболеваниями.

4. Провести сопоставления клинико-лабораторных данных концентрации белков семейства нейротрофинов (цилиарного нейротрофического фактора, фактора роста нерва, фактора роста головного мозга), белков, регулирующих апоптоз (р53, каспаза 8, цитохром С) и участвующих в антиапототической защите (белок Вс12), у больных с орфанными наследственными нервно-мышечными заболеваниями в зависимости от топического уровня поражения нервной системы.

5. Разработать тест-систему по изучению влияния плазмы крови человека в норме и при наличии установленного диагноза на рост нейритов спинальных ганглиев in vitro.

6. Оценить степень компенсаторной реиннервации у больных с орфанными наследственными нервно-мышечными болезнями, исследуя влияние плазмы крови пациентов на рост нейритов в органотипической культуре ткани.

7. Изучить роль протеинкиназы С, эндотелиальной NO-синтазы, гамма-аминомасляной кислоты и натрий калиевой аденозинтрифосфатазы (Na+/K+-АТФаза) в денервационном и реиннервационном процессах у больных с орфанными наследственными нервно-мышечными заболеваниями в экспериментальном исследовании с использованием органотипической культуры ткани.

8. На основании полученных данных обосновать патогенетическую стратегию и тактику патогенетического лечения орфанных наследственных нервно-мышечных болезней.

Научная новизна исследования. Проведенные исследования позволили обнаружить, что больные с орфанными наследственными нервно-мышечными заболеваниями имеют особенности нейротрофической регуляции. Впервые зарегистрировано повышенное содержание нейротрофинов - фактора роста головного мозга и фактора роста нерва - в плазме крови у больных с прогрессирующими амиотрофиями и снижение фактора роста головного мозга у больных с прогрессирующими миодистрофиями. Комплексный анализ данных показал, что в плазме крови больных с орфанными наследственными нервно-мышечными заболеваниями концентрация фактора роста головного мозга и фактора роста нерва выше у больных детского возраста. Это может быть объяснено гипотезой нейротрофического нервно-мышечного взаимодействия в процессе онтогенеза, которая была сформулирована в процессе научного исследования.

Разработана методологическая система изучения тонких физиологических механизмов денервационного и реиннервационного процессов у больных с орфанными нервно-мышечными заболеваниями с использованием экспериментального метода органотипического культивирования в сочетании с лазерной сканирующей микроскопией, позволяющая оценить активность компенсаторной реиннервации при изучении влияния плазмы крови больных на рост нейритов спиномозговых ганглиев 10-12-дневных куриных эмбрионов.

Впервые установлено, что плазма крови больных прогрессирующими амиотрофиями оказывает дозозависимое нейрит-ингибирующее действие на спинальные ганглии через активацию высокоаффинных тирозинкиназных рецепторов в связи с повышенным содержанием фактора роста нерва в плазме крови. Впервые определено, что одним из факторов, препятствующих компенсаторной реиннервации, является повышенное содержание нейротрофина (фактора роста нерва) в плазме крови.

Сформулирована гипотеза о том, что одним из факторов в патогенезе когнитивных расстройств у больных прогрессирующими миодистрофиями является снижение концентрации нейротрофина (фактора роста головного мозга).

Установлено высокое содержание белков (р53, каспаза 8, цитохром С, белок Вс12) в плазме крови у больных с орфанными наследственными нервно-мышечными заболеваниями, что указывает на участие в процессе дегенерации нервно-мышечной ткани как внешнего (рецепторного), так и внутреннего (митохондриального) путей апоптоза.

Фармакологический анализ в условиях органотипического культивированиия спинальных ганглиев 10-12-дневных куриных эмбрионов в присутствии плазмы крови больных прогрессирующми амиотрофиями позволил обнаружить участие эндотелиальной NO-синтазы, протеинкиназы С, гамма-аминомасляной кислоты и Ка+/К+-АТФазы в механизмах, противодействующих нейротоксическому эффекту (ингибирующему рост нейритов) плазмы крови.

Теоретическая значимость исследования. Результаты собственных исследований позволили выявить особенности нейротрофической регуляции у больных с орфанными наследственными нервно-мышечными болезнями, уточнен механизм апоптоза и изучены патологические каскады, участвующие в денервационно-реиннервационном процессе. Определена роль нейротрофина -фактора роста головного мозга - как предиктора развития когнитивных расстройств у больных прогрессирующими миодистрофиями. Теоретически и экспериментально обоснован новый подход к индивидуализации патогенетической фармакоррекции у больных с орфанными наследственными нервно-мышечными заболеваниями.

Практическая значимость исследования. Разработана методологическая система изучения физиологических механизмов нейропластичности у больных с орфанными нервно-мышечными заболеваниями с использованием экспериментального метода органотипического культивирования, позволяющая оценить активность процесса компенсаторной реиннервации и проводить тестирование фармакологических препаратов для осуществления подбора медикаментозной терапии в условиях in vitro.

Выявлено участие эндотелиальной NO-синтазы, протеинкиназы С, гамма-аминомасляной кислоты и сигнальной функции Na+/K+-АТФазы в механизмах, противодействующих нейротоксическому эффекту (ингибирующему рост нейритов) плазмы крови, которое уточняет патогенез орфанных наследственных нервно-мышечных болезней и может расширить терапевтические возможности за счет применения больными с орфанными наследственными нервно-мышечными заболеваниями лекарственных препаратов, ранее не использовавшихся в терапии этих болезней. Установлено, что коменовая кислота, РГПУ-260 (композиция мефебута и L-аргинина) и гамма-аминомасляная кислота нивелируют нейротоксическое действие плазмы крови больных прогрессирующими амиотрофиями в терапевтических дозах в модельных опытах in vitro.

Сформулирован новый оригинальный подход к лечению орфанных наследственных нервно-мышечных болезней, который заключается в использовании разработанного комплекса мероприятий: клинико-неврологический анализ, молекулярно-генетический анализ, иммуноферментный анализ, электронейромиография, опыты с использованием тест-системы на основе органотипической культуры спинальных ганглиев и фармакологический анализ, оценка когнитивных функций, разработка персонифицированной схемы приема препарата, повторная электронейромиография. Предложенный комплекс мероприятий позволяет оценить компенсаторные механизмы, запускаемые своевременным лечением, что дает возможность стабилизировать картину заболевания.

Определен алгоритм ведения пациентов с орфанными наследственными нервно-мышечными заболеваниями с учетом возрастных особенностей нейротрофической регуляции у больных и в зависимости от первичного поражения нервной или мышечной систем. Предлагаемый подход позволяет индивидуализировать лечение, повысить качество жизни пациента, сократить время от установления диагноза до начала лечения, поскольку доза препарата, действующая на пациента, подбирается в условиях in vitro. Стимуляция приспособительных механизмов, направленных на усиление компенсаторной реиннервации, запускаемых своевременным лечением, позволит снизить экономические затраты на лечение больного, поскольку сократит время подбора корректной индивидуальной фармакотерапии.

Методология и методы исследования. Проведенное исследование основано на системном структурно-функциональном и экспериментальном подходе, целью которого явилось изучение механизмов, направленных на активизацию компенсаторно-приспособительных процессов в нервно-мышечной системе у больных с орфанными наследственными нервно-мышечными болезнями. Первый этап включал анализ литературы. Второй этап - отбор больных; на третьем этапе выполнялось клинико-неврологическое, молекулярно-

генетическое и нейрофизиологическое исследования больных с орфанными наследственными нервно-мышечными болезнями. На четвертом этапе больным проводилось исследование нейротрофической регуляции и активности апоптотических и антиапоптотических белков лабораторным методом с помощью иммуноферментного анализа крови больных, с последующим анализом данных с учетом топического поражения нервной системы. На пятом этапе осуществлялась разработка методики изучения компенсаторной реиннервации с использованием органотипической культуры ткани. Шестой этап включал в себя изучение влияния плазмы крови больных с орфанными наследственными нервно-мышечными болезнями в тест-системе для оценки компенсаторной реиннервации. На седьмом этапе проводилось изучение механизмов, препятствующих компенсаторной реиннервации в тест-системе, основанной на использовании органотипической культуры ткани с применением фармакологического анализа и лазерной сканирующей микроскопии. На восьмом этапе полученные результаты были проанализированы, определены закономерности процесса дегенерации нервно-мышечной системы у больных с орфанными наследственными нервно-мышечными заболеваниями. Анализ позволил сформулировать стратегию и тактику патогенетического лечения.

Положения, выносимые на защиту.

1. Состояние нейротрофической регуляции у больных с орфанными нервно-мышечными заболеваниями имеет различия, связанные как с первичным патологическим объектом (нейрон или миоцит), так и с онтогенетическими особенностями роста и развития организма.

2. Тест-система с использованием органотипической культуры ткани позволяет индивидуализировать подход к лечению пациентов и оценить степень компенсаторной реиннервации у больных с орфанными нервно-мышечными заболеваниями в процессе изучения роста нейритов спинальных ганглиев 10-12-дневных куриных эмбрионов в присутствии плазмы крови пациентов.

3. Компенсаторная реиннервация у больных прогрессирующими амиотрофиями снижена вследствие высоких концентраций фактора роста головного мозга и фактора роста нерва, оказывающих дозозависимое ингибирующее действие на рост нейритов спинальных ганглиев в условиях органотипического культивирования.

4. В механизм, препятствующий развитию компенсаторной реиннервации, у больных прогрессирующими амиотрофиями вовлечены молекулярные процессы, связанные с функциональной активностью эндотелиальной N0-синтазы, протеинкиназы С, Ка+/К+-АТФазы и ГАМК-эргической системы.

5. Снижение концентрации нейротрофина - фактора роста головного мозга у больных прогрессирующими миодистрофиями - является предиктором развития когнитивных расстройств.

6. Совокупность клинических и экспериментальных данных определяет необходимость комплексного дифференцированного подхода к фармакокоррекции механизма апоптоза клетки у больных с орфанными наследственными нервно-мышечными заболеваниями, включающего в себя молекулярно-генетическое исследование, иммуноферментный анализ и тест-систему, разработанную на основе органотипической культуры ткани.

Степень достоверности результатов. Результаты, полученные в процессе диссертационного исследования, являются достоверными и обоснованными вследствие использования репрезентативных выборок с современными математическими и статистическими методами обработки данных.

Внедрение результатов работы в практику. Основные положения диссертации используются в лечебной работе ГАУЗ «Хоспис (детский)» Санкт-Петербурга, в научно-исследовательской и педагогической работе кафедры неврологии имени академика С.Н. Давиденкова ФГБОУ ВО СЗГМУ имени И.И. Мечникова Минздрава России.

Апробация результатов исследования. Материалы исследований представлены на научных мероприятиях всероссийского, регионального и

международного уровня: на Конгрессе неврологов России с международным участием «Спинной мозг» (Санкт-Петербург, Россия, 2013); IX, X, XI, XII Всероссийских научно-практических конференциях с международным участием «Здоровье - основа человеческого потенциала: проблемы и пути их решения» (Санкт-Петербург, Россия, 2014, 2015, 2016, 2017); XIII, XIV Всероссийских научно-практических конференциях с международным участием «Поленовские чтения» (Санкт-Петербург, Россия, 2014, 2015, 2016); VII, VIII международных научно-практических конференция «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине» (Санкт-Петербург, Россия, 2014, 2015); VIII Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, Россия, 2015); международной научной конференции «Механизмы функционирования нервной, эндокринной и висцеральных систем в процессе онтогенеза» (Майкоп, Россия, 2015); III Российском конгрессе с международным участием «Молекулярные основы клинической медицины — возможное и реальное» (Санкт-Петербург, Россия, 2015); научно-практической конференции общества специалистов по нервно-мышечным болезням «Новые технологии в диагностике и лечении болезней нервно-мышечной системы» (Москва, Россия, 2015); Всероссийской конференции с международным участием, посвященной 90-летию со дня основания Института физиологии им. И. П. Павлова РАН «Современные проблемы физиологии высшей нервной деятельности, сенсорных и висцеральных систем» (Санкт-Петербург, Россия, 2015); 20-й Межрегиональной научно-практической конференции с международным участием «Актуальные вопросы неврологии», посвященной смежным вопросам неврологии и клинической фармакологии (г. Томск, 2016); XI Международном междисциплинарном конгрессе «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, Крым, Россия, 2015); XII Международном междисциплинарном конгрессе «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, Крым, Россия, 2016); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Ежегодные Давиденковские чтения» (Санкт-

Петербург, Россия, 2013, 2014, 2015, 2016); II Всероссийской конференции с международным участием «Фундаментальные и прикладные проблемы нейронаук: функциональная асимметрия, нейропластичность и нейродегенерация» (Москва, Россия, 2016); I Международном неврологическом конгрессе (EAN) (Берлин, Германия, 2015); II Международном неврологическом конгрессе (EAN) (Копенгаген, Дания, 2016); Международном конгрессе по миологии (MCO Congre Myology) (Лион, Франция, 2016); на IX Международном симпозиуме по нейропротекции и нейрорепарации (9th International Symposiumon Neuroprotection and Neurorepair) (Лейпциг, Германия, 2016); Второй Международной (русскоязычной) неврологической Школе в Судаке «Инновации в клинической неврологии» (Судак, Крым, Россия, 2016); на Санкт-Петербургском научном форуме, посвященном 100-летию Физиологического общества им. И. П. Павлова (Санкт-Петербург, Россия, 2017); III Международном неврологическом конгрессе (EAN) (Амстердам, Нидерланды, 2017); III конгрессе по регенеративной медицине (Москва, Россия, 2017); Международной научной конференции «Клиническая протеомика. Постгеномная медицина» (Москва, Россия, 2017); Международной 5-й конференции по редким болезням (Париж, Франция, 2017).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 84 научные работы, в том числе 20 статей в научных изданиях, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Министерства образования и науки РФ для опубликования результатов диссертаций на соискание ученой степени доктора медицинских наук. Диссертационное исследование выполнялось в рамках 2 плановых научно-исследовательских работ: № VMA.03.12.02.1618/0097 (ВМедА имени С.М. Кирова) и «Разработка и усовершенствование подходов к диагностике и лечению орфанных болезней нервной системы (гепато-лентикулярной дегенерации, миастении и других нервно-мышечных заболеваний)» (ФГБОУ ВО СЗГМУ им. И. И. Мечникова Минздрава России).

Личный вклад автора. Автор самостоятельно разработала план и программу работы, сформулировала цель и задачи, критерии отбора больных в проведенном исследовании. Лично производила клинико-неврологическое, нейрофизиологическое, нейропсихологическое обследование всех больных, участвовала в выполнении части экспериментальной работы, проводила оценку лабораторных и экспериментальных данных с последующей статистической обработкой и анализом полученных результатов. Личный вклад автора в проведенное исследование составляет более 90%. Автором написан текст диссертации и автореферата, подготовлены слайды для апробации и защиты.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 240 страницах машинописного текста, состоит из введения, шести глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, включающего в себя 52 отечественных и 169 иностранных источников, одно приложение. Работа содержит 29 таблиц и 96 рисунков.

ГЛАВА 1. СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ПРОБЛЕМЫ ОРФАННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ НЕРВНОЙ СИСТЕМЫ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

1.1. Орфанные заболевания

Орфанные (редкие) заболевания - это патологические состояния, встречающиеся в популяции с довольно низкой частотой, имеют хронический прогрессирующий характер, быстро приводят к инвалидизации больного и обладают высокой летальностью. В различных странах приняты критерии заболеваемости, которые определяют редкость встречаемости заболевания - от 1 : 1500 до 1 : 25000 населения страны [Бочков Н.П. и др., 2012]. В России принят частотный показатель распространенности 10 на 100 000 населения, который был закреплен в Федеральном законе от 23 ноября 2012 г. № 323 «Об охране здоровья граждан в Российской Федерации». В США заболеванием считается орфанным, если им страдает менее 100 тыс. человек, в Японии менее 50 тыс. человек, в Австралии менее 2 тыс. человек, в Европейском Союзе - реже 5 : 10 000, в Канаде реже 1 : 2000 населения. Таким образом, к числу редких (орфанных) заболеваний относятся те, которые имеют распространенность не более 10 случаев заболевания на 100 000 населения. В России зарегестрировано около 300 тыс. больных, страдающих орфанными (редкими) заболеваниями. В настоящее время выделено 216 групп редких болезней.

Список литературы диссертационного исследования доктор наук Соколова Мария Георгиевна, 2018 год

■— -

ЗР

Рисунок 8 - Схема эксплантатов ткани 10-12-дневного куриного эмбриона в органотипической культуре. Ц - центральная зона; ЗР - зона роста;

П - периферическая зона роста; К - коллагеновая подложка (3-е суток

культивирования)

Условной единицей площади был квадрат окуляр-сетки микроскопа (сторона квадрата при увеличении 3,5 х 10 равнялась 150 мкм). Контрольное значение индекса площади принималось равным 100%. Оборудование: влажный

л

СО -инкубатор, поддерживающий условия содержания в атмосфере 5% СО°, 70% влажности и температуре 37°С; ламинарно-потоковый шкаф II класса биологической безопасности эффективность фильтрации составляет 99,9997% для частиц размером 0,3 мкм; инвертированный микроскоп с «перевернутой» конструкцией, которая позволяет вести исследование объекта с его нижней стороны, и оснащенный системами фазового контраста (дополнительной функцией, которая позволяет изучать прозрачные объекты без предварительного окрашивания); центрифуга с числом оборотов от 200 до 2000 - 4000 об/мин; холодильник, поддерживающий температурные режимы от +2° до +80°С и -200°С, предназначен для хранения основных растворов и реактивов.

Для уточнения биохимических механизмов, участвующих в патологических каскадах при орфанных наследственных нервно-мышечных заболеваниях, была разработана тест-система, которая включала в себя последовательное изучение

ПК больного в органотипической культуре нервной ткани в разведении 1 : 70 с последующим добавлением в среду реагентов (Рисунок 9).

Рисунок 9 - Схема эксперимента в ОТКТ для определения роли ФРН и ПКЦ

В качестве реагентов использовали синтетические вещества: ФРН и протеинкиназы С (ПКС) в следующих концентрациях соответственно - 100 пг/мл и ингибитора ПКС (Тамоксифена 10-5) с последующим культивированием в течение 3 суток и вычислением ИП (Рисунок 10).

ОТКТ ▼ 3 суток

ПК 170 Гапоксифен

Параметрический анализ ип

Рисунок 10 - Схема эксперимента в ОТКТ для определения роли ФРН и ПКС

В ходе серии экспериментов было проведено тестирование фармакологических средств в органотипической культуре ткани [Еропкин М.Ю., 2003]. Используемая ранее методика была модифицирована на основании полученных данных и разработана тест-система для подбора персонофицированного патогенетического лечения больным с ОННМБ в органотипической культуре ткани.

Схема последовательности проведения исследования ПК больного в тест-системе представлена на Рисунке 11. Протокол экспериментального исследования влияния фармакологических препаратов включал в себя 4 этапа, которые поочередно проводились с образцом плазмы крови одного пациента, по результатам заполнялась форма (Приложение А).

1-й этап - изучение плазмы крови больного в органотипической культуре ткани с последовательным разведением от 1: 2 до 1 : 100 (1 : 2; 1 : 10; 1 : 50; 1 : 70; 1 : 100).

2-й этап - изучение роста нейритов экспериментальных эксплантатов в присутствии ПК больного в разведении 1 : 70 с добавлением синтетического ФРН.

3-й этап - изучение роста нейритов экспериментальных эксплантатов в присутствии ПК больного в разведении 1 : 70 с добавлением ингибитора ПКС.

4-й этап - изучение роста нейритов экспериментальных эксплантатов в присутствии ПК больного в разведении 1 : 70 с добавлением следующих веществ:

5 8

гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК) (10- ), коменовой кислоты (КК) (10-), РГПУ-260 (10-5).

РГПУ 260 (мефебут : Ь-аргинина гидрохлорид, 1 : 1) любезно предоставлен д.м.н., профессором чл.-кор. РАН. заведующим кафедрой фармакологии и биофармации ФУВ Волгоградского государственного медицинского университета Тюренковым И.Н. Коменовая кислота предоставлена лабораторией физиологии возбудимых мембран Института физиологии им. И.П. Павлова РАН.

Мсуфометрическиш анализ И-1

ПК 170 дщ греда стандартного Б-най 1 содержания

А - ГАМК на рост нейритов в ОТКТ в присутствии ПК больного

♦ 0Ш1 ^ .

ПК ПО РГПУ-260 110 м]

Б-най 1 КупьтиСироСание Мор(шелричЕскии

3 С^ток анализ ИП

ПК 170 сррОп стп^йаргпнаго

Б-най 1 ~ соАержания

Б - РГПУ-260 на рост нейритов в ОТКТ в присутствии ПК больного

ПК 170 Б-нои 1

ПК 170 дщ, среЗа стандартного Б-нои 1 содержания

В - Коменовой кислоты на рост нейритов в ОТКТ в присутствии ПК Рисунок 11 (А, Б, В) - Схемы экспериментов по оценке влияния фармакологических препаратов на ИП эксплантата в ОТКТ

ГАМК и РГПУ-260 были исследованы в диапазоне концентраций от 10-5 до 10-11 М (10-5, 10-7, 10-9, 10-11). Было обнаружено, что препараты в указанных концентрациях практически не влияют на процессы роста и пролиферации клеток

ПК 170 ГАМК 110 м!

Б-нои 1 К^пыииЬшзоВониЕ

3 суто*

исследуемых тканей в контрольной группе. Полученные данные свидетельствуют о том, что у изучаемых соединений нейротоксический эффект отсутствует.

Для визуализации цитоскелета нейронов спинномозговых ганглиев и их отростков (нейритов) использовали непрямой иммуногистохимический метод. Основным компонентом цитоскелета нейронов являются нейрофиламенты.

Для приготовления препаратов эксплантаты спинальных ганглиев фиксировали 4%-м раствором формалина (ЛенРеактив, Россия) непосредственно в чашках Петри в течение 3-х минут. Зафиксированный материал трижды промывали 0,01 г/моль раствором фосфатного буфера с pH 7,4. Рабочий раствор фосфатного буфера приготавливали из таблеток фосфатно-солевого буфера (БиолоТ, Россия) из расчета 1 таблетка PBS/100 мл дистиллированной воды. Затем препараты обрабатывали 0,3%-м раствором ТритонаХ-100 (Panreac, Испания). Время экспозиции - 15 минут. ТритонХ-100 трижды отмывали 0,01 М PBS (БиолоТ, Россия).

Следующий этап приготовления препаратов заключался в обработке 100%-й сывороткой эмбриональной телячьей, для культур клеток HyClone (БиолоТ, Россия) в течение 60 минут при 37°С для блокирования неспецифического связывания антител. Снова трижды промывали 0,01 М PBS.

Далее препараты спинальных ганглиев инкубировали с немаркированными первичными антителами к нейрофиламентам (1 : 360) (Anti-Neurofilament 200 antibody produced in rabbit, Sigma, США). Время экспозиции составляло 60 минут при 37°С.

После отмывки первичных антител 0,01 (г/моль) раствором фосфатного буфера добавляли вторичные антитела к IgG кролика (1 : 300), меченные флуоресцентным красителем TRITC (Anti-Rabbit IgG (whole molecule) -TRITC antibody produced in goat, Sigma, США) или FITC (Anti-Rabbit IgG (whole molecule) - FITC antibody produced in goat, Sigma, США), и инкубировали 40 минут при 37°С в темноте.

Не связавшиеся молекулы метки отмывали трижды PBS и оценивали флуоресценцию с помощью лазерного сканирующего микроскопа LSM-710 (Carl Zeiss, Германия). TRITC флуоресцирует в желтой области видимого спектра (X = 576 нм), возбуждали свечение аргоновым лазером с X = 488 нм. FITC флуоресцирует в зеленой области видимого спектра (X = 520 нм), возбуждали свечение аргоновым лазером с X = 488 нм.

Для получения прижизненной информации о состоянии клеток, формирующих зону роста эксплантатов спинальных ганглиев, использовали аппаратно-программный комплекс для визуализации, обработки и анализа изображений ZEN_2009 и ZEN_2014 лазерного сканирующего микроскопа LSM-710 (Carl Zeiss, Германия). Применение конфокального микроскопа позволяет не только осуществить 3D-реконструкцию эксплантатов исследуемых тканей, а также оптически послойно зарегистрировать формирование слоев клеток на различном уровне, измерить толщину формирующейся зоны роста, сравнить данные, полученные при фармакологическом воздействии с данными контрольных экспериментов.

Для анализа полученных данных нами был использован специальный критерий - толщина зоны роста, измеряемый в микронах и метод реконструкции оптических срезов.

Иные подходы для оценки синтетических процессов, происходящих в формирующейся послойно зоне роста не возможны. Необходимо отметить, что до последнего времени считалось, что клетки зоны роста представляют собой монослой [Лопатина и др., 2015].

В ходе эксперимента использовались различные реактивы, питательные среды и химические соединения для поддержания жизнедеятельности эксплантатов, проведения опытов по выявлению роли патогенных факторов; красители, стабилизаторы, фармакологические препараты; производители и дозировки представлены в Таблице 4.

Таблица 4 - Реагенты, используемые в эксперименте, единицы измерения, дозировки

Реагент Производитель

Раствор антибиотиков (10000 ед/мл ПанЭко, Россия

пенициллин и 10000 мкг/мл стрептомицин)

Фосфатно - солевой буфер (ФБ) ПанЭко, Россия

Раствор трипсин-ЭДТА 0,05% ПанЭко, Россия

Коллагеназа IV типа (Abcam, США)

Диспаза Sigma, США

Трипановый синий ПанЭко, Россия

Дексаметазон ПанЭко, Россия

Диметилсульфоксид (ДМСО) Sigma, США

Среда для культивирования а-МЕМ ICN, США

Среда для культивирования RPMI 1640 Sigma, США

Среда для культивирования 199 Gibco, США

Hepes Реахим, Россия

Пируват натрия HyClone, США

Гепарин Реахим, Россия

Фетальная телячья сыворотка Merk, Германия

Параформальдегид Реахим, Россия

Глютар Invitrogen, США

Желатин Реахим, Россия

Глицерин Реахим, Россия

Ализариновый красный Реахим, Россия

Oil Red Sigma, США

ФРН (100 пг/мл) Milipore, США

Ингибитор ПКЦ (10-5) Milipore, США

ГАМК (10-5) Sigma, США

Коменовая кислота (10-8) ПанЭко, Россия

РГПУ-260 (10-7; 10 -5) Субстанция предоставлена Волгоградским

Государственным медицинским

университетом

Микроскопические исследования выполнены на оборудовании Центра коллективного пользования «Конфокальная микроскопия» Института физиологии

им. И.П. Павлова РАН. Для визуализации объектов использовали микроскоп «Axiostar Plus» («Carl Zeiss», Германия) согласно методике ультрамикроскопии живых объектов [Свищев Г.М., 2011]. Полученные изображения анализировали с помощью программы ImageJ.

Клинико-неврологическое, лабораторное и экспериментальное исследования проводились как в группе обследованных больных, так и в контрольной группе. Молекулярно-генетическое и нейрофизиологическое исследования проводились в группе больных.

Объем и характер проводимых исследований представлен в Таблице 5.

Таблица 5 - Объем и характер проведенных исследований

Характер исследования Число обследованных Число обследований Контроль

Клинико-неврологическое 320 1020 40

Молекулярно-генетическое 51 61 —

Нейрофизиологическое - ЭЭГ - ЭНМГ 147 97 220 132 —

Лабораторное 320 2240 40

Экспериментальное 140 1800 480

Эксплантаты 53000 1800 11000

2.2.6. Статистическая обработка данных

На основании собственных результатов исследований формировалась электронная база данных. Обследуемые пациенты имели формализованные карты обследования: анамнез, жалобы, данные клинико-неврологического, нейропсихологического и молекулярно-генетического исследования, результаты лабораторных и инструментальных методов, результаты экспериментов.

Статистический анализ осуществлялся в соответствии с рекомендациями по обработке результатов медико-биологических исследований [Юнкеров В.И., Григорьев С.Г., Резванцев М.В., 2011] с использованием пакета STATISTICA 8.0 (StatSoft®, Inc., USA, 2012).

Использовались методы статистического анализа: оценка влияния качественного фактора на дисперсию количественного показателя с использованием дисперсионного анализа, оценка силы и направления линейной связи между количественными показателями с использованием параметрического коэффициента корреляции Пирсона, нелинейной связи - с использованием коэффициента корреляции Спирмена, оценка соответствия по критерию Шапиро-Уилка; определение числовых характеристик переменных.

В случае отклонения нулевой гипотезы при проверке соответствия эмпирического закона распределения случайной величины теоретическому закону нормального распределения для её описания использовались медиана, верхний и нижний квартиль, Me [Q25; Q75]. Описание количественных признаков выполнено с использованием среднего арифметического значения и стандартного отклонения. Нулевая статистическая гипотеза отвергалась при уровне значимости p < 0,05.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Клинико-неврологическая характеристика больных

Клинико-неврологическое обследование выявило у всех больных выраженные двигательные нарушения. Больные были разделены на 3 группы по морфо-патологическому признаку.

Первую группу составили больные с поражением головного мозга наследственного характера: лейкодистрофии (болезнь Канавана, Х-сцепленная форма лейкодистрофии, лейкодистрофия с гипомиелинизацией 2-го типа, болезнь Пелицеуса-Мерцбахера), синдром Ундины, нейродегенерация с отложением железа в мозге, синдром Ретта, синдром Альперса. Целесообразность объединения данных нозологических форм в единую группу была продиктована общностью поражения ЦНС, при котором страдает центральный двигательный нейрон и развивается центральный парез, в ряде случаев сочетающийся с симптоматической эпилепсией, экстрапирамидным и псевдобульбарным или бульбарным синдромом.

Вторую группу составили больные с поражением периферического двигательного нейрона. Больные с прогрессирующими амиотрофиями были представлены спинальной мышечной атрофией и наследственной моторной и сенсорной невропатией.

В третью группу были объединены заболевания с поражением мышечной системы - прогрессирующие миодистрофии: мышечная дистрофия Дюшенна и Штейнерта, митохондриальная и структурная миопатии (Таблица 6).

Группа сравнения составляла четвертую группу и была представлена детьми, больными тяжелыми формами детского церебрального паралича (п = 200). Пятая группа - группа контроля (п = 40).

Таблица 6 - Характеристика больных по возрасту и полу

Группа Возраст Пол Количество абс (%)

жен. абс. (%) муж. абс. (%)

1 группа 3 мес. - 17 лет 12 (10%) 11 (9%) 23 (19%)

2 группа 9 мес. - 43 года 13 (11%) 29 (24%) 42 (35%)

3 группа 6 мес. - 36 лет 12 (10%) 43 (36%) 55 (46%)

Итого 37 (31%) 83 (69%) 120 (100%)

3.1.1. Клинико-неврологическая и лабораторная характеристика больных первой группы

Среди больных 1-й группы составляли дети с орфанными наследственными заболеваниями ЦНС (п = 23). По типу наследования 57% детей имели аутосомно-рецессивный тип и 43% - Х-сцепленное наследование (Таблица 7).

Таблица 7 - Характеристика больных 1-й группы по нозологии и полу

Заболевание Пол Количество

жен. абс. муж. абс. больных абс. (%)

Нозологические формы прогрессирующих нейродегенеративных заболеваний головного мозга (п = 23)

Х-сцепленная лейкодистрофия - 5 5 (22,0%)

болезнь Канаван 1 2 3 (12,5%)

Нейродегенерация с отложением железа в мозге 2 1 3 (12,5%)

синдром Альперса 1 1 2 (9,0%)

синдром Ундины 1 - 1 (4,0%)

Синдром Ретта 5 - 5 (22,0%)

Болезнь Пелицеуса-Мерцбахера - 2 2 (9,0%)

Лейкодистрофия с гипомиелинизацией 2-го типа ОГС-ассоциированная лейкодистрофия 1 1 2 (9,0%)

Итого 11 (48%) 12 (52%) 23 (100%)

При неврологическом осмотре у детей 1-й группы были выявлены симптомы поражения черепных нервов: частичная атрофия зрительных нервов (78%), внутренняя офтальмоплегия (23%), наружная офтальмоплегия (18%), анизокория (21%), миоз (14%), нистагм (36%), слабость жевательной мускулатуры (21%), анартрия (41%), дизартрия (25%), дисфагия (77%). Наблюдались симптомы поражения центрального двигательного нейрона в виде тетрапареза, который сочетался у 26% с гиперкинетическим синдромом, у 58% детей с псевдобульбарным синдромом и у 22% с гипертензионно-гидроцефальным синдромом, 15% детей были шунтированы. У 87% детей имел место синдром локально обусловленной эпилепсии, подтвержденной ЭЭГ исследованием, больные находились на противосудорожной терапии. Чувствительные расстройства и мозжечковые симптомы оценить было невозможно из-за тяжелого состояния больных. Были выявлены контрактуры крупных суставов различной степени выраженности и костные деформации: эквиноварусная установка стоп (72%), сколиоз (58%), кифо-сколиоз (25%). Отмечены вегетативные расстройства у 34% детей в виде дистального гипергидроза на ногах и руках, мраморного рисунка на коже, вазомоторных нарушений.

В 92% случаев имели место нарушения функций тазовых органов по центральному типу. Все дети в 1 -й группе имели выраженную задержку речевого и психомоторного развития. По шкале (EDSS) 93% больных имели высокую степень инвалидизации (9,5 баллов). У 23% детей была установлена трахеостома, в 8% использовалась ИВЛ. Провести нейропсихологическое исследование у больных данной группы было невозможно вследствие того, что в 88% случаев продуктивный контакт с ребенком носил сомнительный характер.

Клиническое наблюдение № 1. Больная В., 2 года. Родители предъявляют жалобы на задержку психического и двигательного развития ребенка. Известно, что родители здоровы (матери 26 лет, отцу 28 лет, оба по национальности евреи, первый ребенок 4-х лет, сын, здоров), от второй беременности, протекавшей с

токсикозом в 1-м триместре, дважды за беременность мать болела ОРВИ, была выявлена анемия. Роды 2-е срочные, без осложнений. По шкале Апгар 8/9 баллов, м = 3150 г, длина 51 см. Новорожденная закричала сразу, к груди приложили на 1-е сутки. Мать и ребенок были выписаны из роддома домой в срок. С периода новорожденности родители отмечали у ребенка общее беспокойство, частые срыгивания, нарушение сна, плохую прибавку массы тела.

С раннего возраста ребенок наблюдался по месту жительства у невролога с диагнозом: синдром мышечной дистонии, задержка психо-моторного развития. Учитывая данные, что в семье по линии отца есть случай заболевания Gм2-ганглиозидом, ребенок был направлен на медико-генетическое консультирование. В 6 месяцев было проведено инструментальное обследование: МРТ головного мозга, ультразвуковое исследование внутренних органов, офтальмоскопия, компьютерная электроэнцефалография. Данные офтальмологического исследования: подвижность глазных яблок полная, нистагм в крайних отведениях. Глазное дно имеет бледные диски зрительных нервов с четкими контурами, вены нормального калибра, артерии узкие. Макулярная и периферическая зона без особенностей, частичная атрофия зрительных нервов. УЗИ внутренних органов -без патологических изменений.

Видео-ЭЭГ-мониторинг: альфа-ритм представлен единичными редуцированными элементами, регистрируемыми в сочетании с бета и тета-волнами. Отмечается преобладание амплитудных значений тета-волн в затылочных отведениях. В затылочных отведениях регистрировались высокоамплитудные патологические формы активности. В передне-, средне-лобных отведениях отмечались высокоамплитудные группы синхронных тета-волн. Данные ЭЭГ указывают на умеренные диффузные изменения с элементами судорожной активности в левом полушарии и вовлечение в патологический процесс подкорковых образований и ствола головного мозга на диэнцефальном уровне.

МРТ головного мозга в стандартных импульсных последовательностях SE, FSE и FLAIR в T1 и T2 взвешенном изображении показало тотальное поражение белого вещества обеих гемисфер, мозжечка и ствола. Обследование в медико-генетическом научном центре в лаборатории наследственных болезней обмена веществ (Москва) выявило наследственное нейро-дегенеративное заболевание (лейкодистрофия Канавана) - мутация А305Е в 6-м экзоне гена (ASPA) аспартоацилазы в гетерозиготном состоянии.

Было проведено клинико-неврологическое обследование в возрасте 2-х лет.

В неврологическом статусе: ребенок в сознании, на осмотр реагирует спокойно. Со стороны черепной иннервации: глазные щели OD = OS, зрачки OD = OS, фотореакция ослаблена, взор кратковременно фиксирует при приближении предмета, прослеживает фрагментарно, лицо симметричное, слух снижен, глотание не нарушено. В рефлекторно-двигательной сфере отмечается снижение двигательной активности: голову не держит, поднимает ее кратковременно, при положении на животе опора на предплечья, не поворачивается на бок, не ходит, не сидит, кисти сжаты в кулачках. Опора на руки не сформирована. При вертикализации - опора на эквиноварусный стопы, выноса ноги нет. Мышечный тонус - гипертонус по спастическому типу. Сухожильные рефлексы высокие D = S, с расширенной рефлексогенной зоной D = S, клонус стоп D = S. Патологические кистевые (рефлекс Гоффмана, рефлекс Россолимо верхний, рефлекс Бехтерева) D = S, стопные рефлексы (рефлекс Бабинского, рефлекс Гордона, рефлекс Шеффера) D = S. Имеются «стартл-рефлексы» на неожиданный звук. Отмечается резкое вздрагивание на прикосновение. Отмечено грубое нарушение психического развития -эмоциональные реакции мало дифференцированы, контакт формальный, мало интересуется окружающим, вложенную в руку игрушку держит кратковременно, к игрушкам не тянется, сохранен ритм сна и бодрствования, редко гуление. Ребенок находится на симптоматической терапии (ноотропная, вазоактивная, жирорастворимые витамины и витамины группы В, антиэпилептическая).

Провести у ребенка нейропсихологического тестирования было невозможно вследствие тяжести состояния и выраженной задержки психомоторного и речевого развития.

Проведенное лабораторное исследование плазмы крови больных 1-й группы выявило, что уровень содержания ФРГМ у обследуемых детей не имел достоверных различий в сравнение с контрольной группой (группа 5) (Рисунок 12).

50000

Б 45000

40000

5 35000

30000

25000

■е 20000

15000

3 10000

5000

Ме^ап 25%-75% I М1п-Маж

Группа

Рисунок 12 - Концентрация ФРГМ (пг/мл) в плазме крови у больных 1-й группы

Однако диапазон значений находился в более широких границах (Таблица 8).

5

Таблица 8 - Концентрация нейротрофинов (ФРГМ, ФРН, ЦНТФ) в плазме крови у больных 1-й группы, Me[Q25; Q75]

Нейротрофин Больные 1 группа, (n = 23) Группа контроля, (n = 20) Уровень значимости различия показателей*, р

ФРН, пг/мл 4355 [2845; 5975] 689 [365; 987] < 0,001

ФРГМ, пг/мл 22200 [16120; 27240] 24454 [20380; 29640]

ЦНТФ, пг/мл 28,9 [23,6; 42,8] 14,9 [11,6; 21,5] < 0,001

* оценивалась значимость различия показателя в независимых группах по критерию Mann-Whitney U Test

Уровень содержания нейротрофинов (ФРН, ЦНТФ) в плазме крови имел достоверные различия у больных 1-й группы в сравнении с контрольной группой (р = 0,03) (Рисунок 13, Рисунок 14). При сопоставлении данных уровня нейротрофинов (ФРГМ, ФРН, ЦНТФ) внутри группы по гендерному признаку достоверных различий не выявлено (р = 0,50).

Median 25%-75% X Min-Max

Рисунок 13 - Концентрация ЦНТФ (пг/мл) в плазме крови у больных 1-й группы

60

50

40

30

о 20

10

0

-10

5

7000

6000

5000

4000

3000

2000

1000

-1000

Median 25%-75% I Min-Max

Группа

Рисунок 14 - Концентрация ФРН (пг/мл) в плазме крови у больных 1-й группы

0

5

Данные лабораторного исследования плазмы крови больных 1-й группы на содержание белков, регулирующих и участвующих в процессе апоптоза, выявили, что уровень белка р53, белка Bcl2, цитохрома С и каспазы 8 имел достоверные различия в концентрациях исследуемых веществ в сравнении с контрольной группой (группа 5) (р = 0,001) (Таблица 9).

Таблица 9 - Концентрация белков, регулирующих и участвующих в процессе апоптоза в плазме крови больных 1-й группы, Me[Q25; Q75]

Белки, регулирующие и участвующие в процессе апоптоза Больные 1 группа, (n = 23) Группа контроля, (n = 20) Уровень значимости различия показателей*, р

р53, Е/мл 14,0 [8,0; 68,6] 0,0 [0,0; 0,4] < 0,001

Bcl2, нг/мл 114 [24,5; 133,0] 0,85 [0,0; 2,1] < 0,001

Каспаза 8, нг/мл 0,24 [0,14; 0,33] 0,0 [0,0; 0,0] < 0,001

Цитохром С, нг/мл 1,3 [0,0; 2,4] 0,0 [0,0; 0,0] < 0,001

* оценивалась значимость различия показателя в независимых группах по критерию Mann-Whitney U Test

Было отмечено, что концентрации исследуемых веществ (цитохром С, белок Вс12, белок р53, каспаза 8) значительно превышают показатели нормы (Рисунок

15, Рисунок 16, Рисунок 17, Рисунок 18).

6-.-.-

5

4

3

2

МеС1ап

25%-75%

М1п-Маж

Группа

Рисунок 15 - Концентрация цитохрома С (нг/мл) в плазме крови

у больных 1-й группы

180

160

140

£ 120

100

80

60

40

20

□ МесНап 25%-75% Мт-Мах

Группа

0

5

0

5

Рисунок 16 - Концентрация белка Вс12 (нг/мл) в плазме крови у больных

1-й группы

160

140

120

vi 100

&■ 60

40

20

Median

25%-75%

Min-Max

Группа

Рисунок 17 - Концентрация белка р53 (Е/мл) в плазме крови у больных 1-й

группы

0,9 0,8 0,7

с

-5 0,6

3 0,5

о оз с о

S 0,4

сц s J

03

ф

0,3 0,2 0,1 0,0 -0,1

Median

25%-75%

Min-Max

Группа

Рисунок 18 - Концентрация каспазы 8 (нг/мл) в плазме крови

у больных 1-й группы

S3 80

0

5

5

3.1.2. Клинико-неврологическая и лабораторная характеристика больных второй группы

Клинико-неврологическая картина 2-й группы больных была представлена симптомами поражения периферического двигательного нейрона, который проявлялся периферическим тетрапарезом различной степени выраженности с атрофиями, утратой сухожильных рефлексов и гипотонией. В 77% случаев преобладали атрофические парезы проксимальных отделов рук и ног, в 14% в дистальных отделах и в 9% имело место поражение и дистальных, и проксимальных отделов. Симптомы поражения черепной иннервации были выявлены у 3 больных в виде анизокории и мелкоразмашистого горизонтального нистагма в крайних отведениях. Расстройства чувствительности имели 17% детей, сенсорная атаксия была выявлена у 3% детей, интенционный тремор - у 9%. При осмотре были выявлены контрактуры суставов различной степени выраженности (77%), костные деформации стоп (67%) и позвоночника: сколиоз (46%), кифосколиоз (33%). Вегетативные расстройства имели место у 15% больных, нарушения функции тазовых органов у 3%. По шкале EDSS 41% имел высокую степень инвалидизации (9,5 баллов): больные были прикованы к постели, в связи с дыхательной недостаточностью находились на ИВЛ (16%) и требовали полного обслуживания. 25% больных имели от 8,0 до 9,0 баллов по шкале EDSS -перемещались в инвалидном кресле (моторизованном), некоторые функции самообслуживания с использованием рук; жевание, глотание, дыхание было самостоятельным. 24% больных имели по шкале EDSS от 7,0 до 7,5 баллов, 10% имели 6,0-5,5 баллов. Нейропсихологическое исследование выявило у 2 детей умеренные когнитивные расстройства, которые были расценены как задержка психического развития. Среди обследованных 42 больных 35 (83%) человек были больны СМА, у 7 (17%) больных была наследственная моторная и сенсорная невропатия (НМСН). В структуре СМА преобладали формы, имеющие проксимальный тип заболевания 29 (83%) больных, в 2-х (6%) случаях

наблюдался дистальный тип болезни и у 3-х (9%) больных была бульбо-спинальная форма СМА (Таблица 10).

Таблица 10 - Характеристика больных 2-й группы по нозологии, полу и возрасту

Нозологические формы прогрессирующих амиотрофий Количество больных абс. (%) Жен абс. Муж абс. Возраст

Спинальная мышечная атрофия (п=35; 83%)

СМА I тип 7 (17%) 3 4 9 мес - 5 лет

СМА II тип 12 (29%) 4 8 2 года - 12 лет

СМА III тип 10 (24%) 4 6 7 лет - 28 лет

дистальный тип СМА 2 (5%) - 2 30 - 32 года

бульбо-спинальная форма СМА 4 (9%) 4 28 - 46 года

Наследственная моторная и сенсорная невропатия (п=7; 17%)

НМСН I типа 4 (9%) 1 3 5 - 16 лет

НМСН III типа 2 (5%) - 2 7 - 12 лет

НМСН IV типа (болезнь Рефсума) 1 (2%) 1 10 лет

Итого 42 (100%) 13 (31%) 29 (69%)

Под наблюдением с I типом СМА было 7 больных в возрасте от 9 месяцев до 5 лет (девочки (п = 3); мальчики (п = 4)). В 5 случаях заболевание было диагносцировано интранатально. У всех детей наблюдалась сниженная двигательная активность, проявляющаяся «синдромом вялого ребенка» с характерной позой - с отведением и наружной ротацией бедер «поза лягушки». На момент обследования все дети имели выраженные двигательные нарушения в виде периферического тетрапареза с преобладанием нарушений в проксимальных отделах ног и рук, арефлексии сухожильных и периостальных рефлексов, диффузной мышечной гипотонии. Дети не могли вставать и садиться, не брали в руки предметы, не держали голову, пятеро находились на ИВЛ. В 2 случаях определялся мелкий тремор пальцев рук. Чувствительных расстройств не было

выявлено. У 2 детей была выявлена задержка психического развития. Вегетативные нарушения выявлялись в виде умеренного дистального гипергидроза у 1 ребенка.

Клиническое наблюдение № 2. Больная М., 2 года 2 мес. Родители предъявляют жалобы на задержку психического и двигательного развития ребенка. Ребенок от естественной 2-й беременности, наблюдалась угроза прерывания на ранних сроках, анемия, гестоз. Роды на 40-41-й неделе путем операции экстренное кесарево сечение, околоплодные воды с меконием. Масса при рождении 4 120 г., рост 56 см, Апгар 7/8, к груди приложили на 3-и сутки. С рождения отмечался диффузный гипотонус мышц, плохо сосала, наблюдалась низкая двигательная активность, слабый крик. Мать и ребенок были выписаны из роддома домой в срок. Наблюдалась неврологом по месту жительства с диагнозом: синдром «вялого ребенка», задержка психо-моторного развития. Дебют заболевания с 3 месяцев - постепенно ребенок стал утрачивать двигательные навыки. Диагноз установлен в 6 месяцев, подтвержден генетически-молекулярным исследованием: спинальная мышечная атрофия I типа. Обследование родителей выявило, что оба являются гетерозиготными носителями мутантного гена СМА I типа. В течение последующего года жизни заболевание прогрессировало: в возрасте 1 года 8 мес. ребенок переведен на ИВЛ, в 2 года была наложена трахеостома.

Состояние ребенка тяжелое, себя не обслуживает, самостоятельно не двигается (слабые движения в пальцах правой кисти), не говорит, интеллект соответствует возрасту, обращенную речь понимает, общается мимикой, контактна, нормального питания, эмоционально лабильна, улыбается. Периодически самостоятельно дышит, находится на аппарате ИВЛ.

В неврологическом статусе. Сознание у ребенка ясное. Рвоты, тошноты нет. Со стороны черепных нервов: движения глазных яблок не ограничены, взгляд фиксирует хорошо, конвергенция - норма. Зрачки ровные, правильной формы. Фотореакции средней живости D = S. Лицо симметричное, пареза мимической

мускулатуры нет. Слух в норме. Язык по средней линии. Питание через трахеостому.

В двигательной сфере: выраженная атрофия мышечной ткани, объем пассивных движений в верхних и нижних конечностях сохранен, формируются контрактуры на руках и ногах (Рисунок 19). Движения сохранены в дистальных отделах рук до 0,5 баллов, активных движений в ногах не было. Состояние мышечного тонуса - гипотонус на руках и на ногах симметричный. Гиперкинезы отсутствуют. С рук рефлексы очень низкие D = S, с ног рефлексы (коленные, ахиловые) отсутствуют D = S. Патологические знаки, защитные рефлексы и симптомы орального автоматизма не выявляются. Нарушений функций тазовых органов нет. Менингиальных симптомов нет. Координаторные пробы проверить невозможно. Чувствительность сохранена.

Рисунок 19 - Больная М., 2 года 2 мес., СМА I тип, контрактуры в дистальных

отделах рук

Результаты ЭНМГ исследования: СПИ моторная при стимуляции локтевого и большеберцового нервов в возрастной норме 38-58 м/с. Средняя длительность ПДЕ 18,4 м/с, потенциалов амплитудой более 1 мВ - 71,4%, полифазные - 28,6%, псевдополифазные - 57,1%, полифазия - 85,7% (Рисунок 20).

Рисунок 20 - Больная М., 2 года 2 мес., СМА I тип, параметры ПДЕ

При поверхностной ЭМГ мышц рук и ног в покое биоэлектрическая активность отсутствует (Рисунок 21).

Рисунок 21 - Больная М., 2 года 2 мес., СМА I тип, поверхностная ЭМГ, интерференционная кривая, m. deltoideus, m. axillaris, С5-С6

При игольчатой ЭМГ в покое денервационная активность (положительные острые волны, потенциалы фибриляций) (Рисунок 22).

Рисунок 22 - Больная М., 2 года 2 мес., СМА I тип, игольчатая ЭМГ, интерференционная кривая с m. biceps brachii, m. musculocutaneus, C5-C6

Амплитуда М-ответов при стимуляции локтевого нерва умеренно снижена 1,61 мВ, большеберцового нерва значительно снижена 1,58 мВ. Терминальные латентности в норме, блоков проведения не выявлено. Значения М-ответов с m. brachii умеренно снижены 0,81 мВ. СПИ сенсорная при стимуляции срединного нерва в норме.

Заключение: имеют место электромиографические признаки выраженного поражения а-мотонейронов передних рогов на шейном и поясничном утолщении спинного мозга. Выраженная активность денервационного процесса на уровне рук и ног на момент обследования. Резко снижены амплитуды вызванной активности с мышц рук и ног.

Провести у ребенка нейропсихологическое тестирование было не возможно вследствие тяжести состояния, отсутствия речевых навыков и установленной трахеостомы.

СМА II типа - 12 больных (девочки (n = 4); мальчики (n = 8)) от 2-х до 12 лет. В 2-х случаях заболевание носило семейный характер, в остальных 10-и случаях - спорадический характер. Двигательный дефект проявлялся с рождения. Заболевание характеризовалось вялым периферическим тетрапарезом с

200 400 600 800 1200 1S00 2000 2400 2800

......... 200 мс.1 мВ

преобладанием двигательных расстройств в проксимальных отделах ног и рук, движения сохранялись в мимической мускулатуре, в пальцах рук, мышцах шеи и дыхательной мускулатуре. Отмечались фасцикуляции мышц и выраженная диффузная мышечная гипотония. Имели место выраженные контрактуры крупных суставов рук и ног и кифосколиоз. Функции тазовых органов сохранны. Нарушений чувствительности и интеллекта не отмечалось.

Больных со СМА III типа было 10 человек в возрасте от 7 до 28 лет, (женщин (n = 4); мужчин (n = 6)). 8 случаев носили спорадический характер, в 2-х подтвердился аутосомно-рецессивный тип наследования (болели брат и сестра). Начало болезни происходило между двумя и 10-ю годами жизни. Двигательные нарушения имели проксимальную локализацию, симптомы периферического паралича были более выражены в мышцах тазового пояса и ног с отсутствием или снижением коленного, пяточного и ахилового рефлексов. Двигательные нарушения имели различную степень выраженности: у 4 больных сохранялась самостоятельная ходьба, но больные не могли бегать и испытывали трудности при подъеме по лестнице, 3 больных могли вставать и ходить с поддержкой, но уже пользовались инвалидным креслом. У 3 больных произвольные движения сохранились в пальцах рук. Контрактуры крупных суставов имели различную степень выраженности: легкие (15%), умеренные (40%), выраженные (35%). У 4 больных были выявлены гипертрофии икроножных и ягодичных мышц, симптом «осиновой талии» (Рисунок 23). 8 больных предъявляли жалобы на фасцикуляции различной степени выраженности в ногах и руках. Пирамидных знаков и бульбарных нарушений не было выявлено. В одном случае имела место офтальмоплегия, в 6 случаях были выявлены признаки кардиомиопатии.

Рисунок 23 - Больной А., 23 года. Диагноз СМА III типа

С дистальным типом СМА наблюдалось 2 больных мужчин (болезнь Арана-Дюшенна), оба носили спорадический характер с началом заболевания в возрасте 30 и 32 лет. Клинические проявления были представлены дистальным парезами рук, сопровождающимися фасцикуляциями, с формированием сгибательных контрактур в пальцах кистей. Бульбарно-спинальная форма СМА (болезнь Кеннеди) была выявлена у 4 мужчин в возрасте от 28 до 46 лет. Клиническая картина была представлена бульбарными симптомами: атрофия мышц языка с фасцикуляциями, парез мягкого неба со снижением глоточного рефлекса, затруднение глотания, арефлексия, фасцикуляции в области лица. Пирамидные знаки, чувствительные и мозжечковые симптомы отсутствовали.

Среди больных наследственной моторной и сенсорной невропатией (n = 7) под нашим наблюдением были следующие формы: НМСН I типа (n = 4), НМСН III типа (n = 2) и невропатия IV типа (болезнь Рефсума) (n = 1). Наследование во всех случаях имело аутосомно-рецессивный тип. Преобладали больные мужского пола (85%) в возрасте от 5 до 16 лет. У 6 детей заболевание дебютировало в

возрасте 3-5 лет, в одном случае на первом году жизни. При обследовании были выявлены: слабость и атрофия мышц дистальных отделов рук и ног с гипорефлексией (33%), с арефлексией (67%), с расстройствами глубокой чувствительности (100%), с вазомоторными нарушениями в виде цианоза, мраморного рисунка на руках и ногах (36%). У 2 больных с НМСН было отмечено нарушение походки («степаж») и сенситивная атаксия. В остальных случаях были выявлены выраженные ортопедические деформации: деформации стоп «полая стопа», «молоточкообразная» форма пальцев, скелетные деформации - сколиоз, кифосколиоз, усиленный лордоз. У больных с НМСН III типа кроме описанных симптомов был выявлен дистальный тип нарушения всех видов чувствительности, слабость мускулатуры и глазные симптомы (нистагм, анизокория). У больного с болезнью Рефссума в клинической картине сочетались признаки мозжечковой атаксии и полиневропатии с пигментным ретинитом, гемералопией, аносмией, анакузией и врожденным ихтиозом. Проведенное лабораторное исследование плазмы крови больных 2-й группы выявило, что концентрация ФРН и ФРГМ статистически значимо выше, чем в контрольной группе (Рисунок 24, Рисунок 25, Рисунок 26).

6000

5000

4000

£ 3000

га

га 2000

1000

Median J 25%-75% Min-Max

Группа

0

2

5

Рисунок 24 - Концентрация ФРН (пг/мл) в плазме крови у больных 2-й группы

70000

60000

50000

40000

а. 30000

20000

10000

Ме(Лап

25%-75%

М1п-Маж

Группа

Рисунок 25 - Концентрация ФРГМ (пг/мл) в плазме крови у больных 2-й группы

45

40

§ 35

« 30

25

^ 20

и 15

10

% 5

МеЛап

25%-75%

М|п-Мах

Группа

Рисунок 26 - Концентрация ЦНТФ (пг/мл) в плазме крови у больных 2-й группы

Анализ содержания нейротрофина ЦНТФ в плазме крови не обнаружил наличия статистически значимого различия между контрольной и исследуемой группой (Таблица 11). При сопоставлении данных уровня нейротрофинов (ФРГМ, ФРН, ЦНТФ) внутри группы по гендерному признаку достоверных различий не выявлено (р = 0,50).

0

2

5

0

2

5

Таблица 11 - Концентрация нейротрофинов в плазме крови больных 2-й группы, Me[Q25; Q75]

Нейротрофин Больные 2-й группы (n = 42) Группа контроля, (n = 40) Уровень значимости различия показателей*, р

ФРН, пг/мл 2780 [1875; 3953] 689 [365; 987] < 0,001

ФРГМ, пг/мл 30065 [23789; 36815] 24454 [20380; 29640] < 0,001

ЦНТФ, пг/мл 18,6 [13,0; 25,1] 14,9 [11,6; 21,5] < 0,05

* оценивалась значимость различия показателя в независимых группах по критерию Mann-Whitney U Test

Данные лабораторного исследования плазмы крови больных 2-й группы на содержание белков, регулирующих и участвующих в процессе апоптоза, выявили, что уровень белка р53, белка Вс12, цитохрома С и каспазы 8 имел достоверные различия в концентрациях исследуемых веществ в сравнении с контрольной группой (группа 5) (р = 0,001) (Таблица 12).

Таблица 12 - Концентрация белков, участвующих в процессе апоптоза, в плазме крови больных 2-й группы, Ме[025; 075]

Белки, участвующие в процессе апоптоза Больные 2 группа, (n = 42) Группа контроля, (n = 40) Уровень значимости различия показателей* р

р53, Е/мл 9,9 [2,3; 23,6] 0,0 [0,0; 0,4] < 0,001

Bcl2, нг/мл 18,0 [12,1; 43,8] 0,85 [0,0; 2,1] < 0,001

Каспаза 8, нг/мл 0,20 [0,14; 0,32] 0,0 [0,0; 0,0] < 0,001

Цитохром С, нг/мл 1,4 [0,0; 2,7] 0,0 [0,0; 0,0] < 0,001

* оценивалась значимость различия показателя в независимых группах по критерию Mann-Whitney U Test

Было отмечено, что концентрации исследуемых веществ (цитохром С, белок Вс12, белок р53, каспаза 8) значительно превышают показатели нормы (р < 0,001) (Рисунок 27, Рисунок 28, Рисунок 29, Рисунок 30).

1,0

0,8

0,6

^ 0,4

0,2

0,0

Ме(Лап

25%-75%

Мт-Мах

Группа

Рисунок 27 - Концентрация каспазы 8 (нг/мл) в плазме крови у больных 2-й

группы

160 140 120

с 2 Ш

(О 100

ю а,

га

5 80

ю

о:

I 60

ь

X

ф

^

I 40

20

Ме^ап

25%-75%

М1п-Мах

Группа

Рисунок 28 - Концентрация р53 (Е/мл) в плазме крови у больных 2-й

группы

2

5

0

2

5