Получение мутантных (ПО-ТК- ) и внутривидовых гибридных культур клеток овцы (ПО-ТК- х ЛО и ПО-ТК- х СО), их культурно-морфологические и кариологические свойства, чувствительность к вирусам и агенту скрепи тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, кандидат биологических наук Симонова, Алла Сергеевна

• Симонова, Алла Сергеевна
• кандидат биологических наук
• 2002

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Симонова, Алла Сергеевна

1. Список сокращений

2. ВВЕДЕНИЕ

3. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

3.1. Гибридизация соматических клеток животных, перспективы использования гибридных клеток в биотехнологии и вирусологии

3.2. Цитопатогенное действие вирусов в культурах клеток

3.2.1. Вирус инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота (ИРТ-ИПВ)

3.2.2. Вирус парагриппа ПГ

3.2.3. Вирус ринопневмонии лошадей (РПЛ)

3.2.4. Вирус диареи

3.3. Прионные болезни и культуры клеток для изучения агента скрепи

4.СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

4.1. Материалы и методы

4.2. Результаты исследований

4.2.1. Культурально - морфологические и кариологические свойства клеточной линии ПО

4.2.2. Получение и изучение культурально-морфологических свойств мутантных штаммов клеток ПО-ТК"

4.2.3.Получение гибридных культур ПО-ТК"хСО (почка овцы х спленоциты овцы) и ПО-ТК"хЛО (почка овцы х лимфоциты овцы)

4.2.4. Культурально-морфологические и кариологические свойства гибридных культур

4.3. Изучение чувствительности культур клеток к вирусам

4.4. Изучение взаимодействия гибридных и мутантных линий клеток с агентом скрепи

4.4.1. Иммуноцитохимический анализ с использованием специфических первичных антител и вторичных антивидовых антител меченых щелочной фосфатазой и пероксидазой хрена

4.4.2. Электронно-микроскопическое изучение мутантных и гибридных клеток инфицированных агентом скрепи

PrPsc

5. ОБСУЖДЕНИЕ

6. ВЫВОДЫ

7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Получение мутантных (ПО-ТК- ) и внутривидовых гибридных культур клеток овцы (ПО-ТК- х ЛО и ПО-ТК- х СО), их культурно-морфологические и кариологические свойства, чувствительность к вирусам и агенту скрепи»

Актуальность темы:

Решение многих теоретических проблем и практических задач патологии сельскохозяйственных животных с различной этиологией требует использования современных достижений биологической науки. Одним из перспективных направлений биотехнологии является гибридизация и генетическая трансформация клеток (Littlefield J.W., 1964-1969; Rasmusson В., Montell J., 1980; Lukash L., Boldt J. et all991; Зеленин A.B., Кущ А.А., Прудовский И.А.,1982; Баев A.A.,1982; Эрнст Л.К., 1995; Дьяконов Л.П., 1994,1998; Коромыслов Г.Ф.,1999; Савченкова И.П., 1999 и др.).

Гибридизация и генетическая трансформация клеток - это приемы биоинженерии, позволяющие получить клеточные системы, обладающие уникальными свойствами.

Методы гибридизации соматических клеток в настоящее время широко применяются при решении различных теоретических проблем биологии и многих практических задач медицины и ветеринарии.

Гибридные клетки используются при исследовании действия генов и их регуляции, механизмов клеточной дифференцировки, взаимодействия ядра и цитоплазмы, проблем злокачественного роста, а также для изучения взаимодействия между вирусами и клетками хозяина. С помощью гибридных штаммов полученных слиянием пермиссивных и непермиссивных клеток, взятых в разных количествах, изучаются закономерности проявлений чувствительности клеток к вирусам (Варшавер Н.Б., 1969; Pollack et al.,1971; Дьяконов Л.П., Кущ А.А., Тугизов Ш.М., (1985-2000); Майджи Е.В, Юров К.П., Кумекбаева Ж.Ж. и др., 1987-1990).

Примером успешного применения клеточной инженерии может служить выведение гибридов соматических клеток, так называемых гибридомпродуцентов моноклональных антител (Kohler G. a. Milshtein С., 1975) и использование их для целей диагностики заболеваний, изучения антигенной структуры возбудителей, иммунитета (Новохатский А.С., 1983; Глебов O.K., Абрамян Д.С.,1984; Куликова И. Л., 1989; Булашев А.К., Боровиков С.Н., 1991 ;Мусиенко М.И.,1992; Байтубаев Н.Г.,1992; Ездакова И.Ю.,1994; Федоров Ю.Н., Верховский О.А.,1998; Верховский О.А.,1998).

Необходимым условием получения гибридных культур клеток является наличие мутантных клеток, что позволяет использовать селективную систему ГАТ для выделения и дальнейшего культивирования гибридных штаммов (Н.Рингерц, Р.Сэвидж,1979).

Количество генетически измененных, дефектных по гену тимидинкиназы (ТК) или гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазе (ГФРТ) клеток в культурах, полученных от сельскохозяйственных животных из немалигнизирован-ных тканей невелико, поэтому для выделения из общей популяции мутантных клеток и получения штаммов клеток несущих дефект по указанным генам предложен метод многошаговой селекции с использованием антиметаболитов - 5-бром-2-дезоксиуридина (5-БДУ) или 8-азогуанина (8-АГ), при постепенном наращивании концентрации антиметаболита (Тугизов Ш.М., 1985). Этим методом были получены мутантные культуры СПЭВ ТК" и TP (FBT) ГФРТ' и на этой основе внутривидовые и межвидовые гибридные культуры клеток с/х животных (Дьяконов Л.П., Кущ А.А., Тугизов Ш.М., 1985; Майджи Е.В., 1987; Дудар Л.П., 1990; Дьяконов Л.П., 1994,1998).

Для культивирования вирусов животных широко используются первичные культуры клеток, диплоидные штаммы, а также постоянные линии клеток, чувствительность которых к вирусам не одинакова. Поэтому создание новых клеточных систем обладающих высокой чувствительностью к вирусам и изучение их цитопатогенного действия остается актуальным. (Сергеев В.А.,1976; Сюрин В.Н., Белоусова Р.В.1982; Поздняков А.А.,1976; Данишевский Д.А.,

1981; Дьяконов Л.П., Лобунцова Д.В., Аспанидзе Б.П.,1988; Третьякова И.А., 1988). Реальность использования мутантных и гибридных клеток для решения проблем клеточной биологии, биотехнологии и инфекционной патологии ставит клеточную технологию в первые ряды претендентов на быстрейшее внедрение разработанных приемов и методов исследований в практику.

Одной из актуальных проблем биологии и ветеринарной медицины являются прионные инфекции (скрепи, губкообразная энцефалопатия крупного рогатого скота, и др.). Для изучения прионов предложены культуры клеток нервной ткани (Mellon et al., 1990; Borchelt et al.,1990; Brown et al.,1994; Ройхель B.M.,1997 и др.), микроглии (Williams et al.,1994; Guiroy et al.,1994; Combs et al.,1999), макрофагов человека и мыши (Дагданова А.В.,2000-2002), генетически трансформированные клетки моноцитов со сверхэкспрессией РгРс (Дагданова А.В., 2002), трехмерная суспензионная культура многоклеточных сфероидов предстательной железы человека (Sauer J., Dagdanova А.В.,1999). Создание культур клеток сельскохозяйственных животных для изучения приона скрепи (PrPSc), взаимодействия прионов с клеткой, разработки методов прижизненной доклинической диагностики прионных инфекций, а также детекции приона скрепи в культурах клеток, имеет научное и практическое значение.

Цель исследований:

Целью настоящей работы являлось получение клеточных штаммов, дефектных по ферменту тимидинкиназе, из культуры клеток почки овцы (ПО-2), и внутривидовых гибридных культур клеток овцы, изучение их биологических свойств и определение чувствительности к некоторым вирусам и агенту скрепи (PrPSc).

В связи с этим были определены следующие задачи:

1. Выделить мутантные по гену тимидинкиназе (ТК") штаммы клеток из постоянной культуры клеток почки овцы (ПО-2) и изучить их биологические свойства.

2. Получить внутривидовые гибридные культуры клеток овцы путем слияния дефектных по ТК клеток - ПО-ТК" с лимфоцитами и спленоцитами овцы и изучить их биологические свойства.

3. Изучить культурально-морфологические свойства и стабильность ка-риотипа мутантных и гибридных культур в динамике культивирования.

4. Изучить чувствительность полученных культур клеток к некоторым вирусам и агенту скрепи, а также цитопатогенное действие указанных патогенов.

Научная новизна:

Изучены культурально-морфологические и кариологические свойства перевиваемой клеточной линии ПО-2 из криобанка ВИЭВ, использованной для селекции мутантных по ТК" клеток и получения гибридных культур. Определена, пролиферативная и митотическая активность и динамика размножения клеток в культуре.

Впервые, методом многошаговой селекции получены дефектные по ТК клеточные штаммы из перевиваемой линии клеток почки овцы (ПО-2) и изучены их биологические свойства. Показана пригодность мутантных штаммов ПО ТК" для внутривидовой гибридизации соматических клеток овцы.

Впервые получены гибридные штаммы клеток с лимфоцитами (ПО-ТК" хЛО) и спленоцитами (ПО-ТК"хСО) овцы и изучены их культурально-морфологические и кариологические свойства.

Установлена чувствительность мутантных штаммов клеток (ПО-ТК") к вирусам: ринопневмонии лошадей - титр вируса составил Ю6'0 ТЦЦ 50/ мл. и инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота - титр вируса достигал

106'5-107'° ТЦД 50/мл. Гибридные линии клеток ПО-ТК'хЛО и ПО-ТК"хСО чувствительны к вирусу инфекционного ринотрахеита 105'5 и 106'0 ТЦД 50/Мл (соответственно) и к возбудителю ринопневмонии лошадей, титр вируса 105'5 ТЦД 5о/Мл в обеих культурах. К вирусу диареи-болезни слизистых мутантные (ПО-ТК") и гибридные (ПО-ТК"хСО) штаммы клеток овцы оказались нечувствительными, культура ПО-2 и гибридный штамм ПО-ТК"хЛО малочувствительны. Гибридные культуры клеток ПО-ТК"хЛО и ПО-ТК"хСО оказались чувствительны к латентному герпесвирусу, штамм "Movar" крупного рогатого скота - титр вируса составил 104'5 и Ю5'0 ТЦД 5о/мл.

Установлена чувствительность мутантных и внутривидовых гибридных культур клеток к агенту скрепи (PrPSc), выявлено цитопатогенное действие возбудителя скрепи в культурах.

Практическая значимость работы.

Полученные новые мутантные линии клеток почки овцы (ПО-ТК") и внутривидовые гибридные культуры клеток с лимфоцитами (ПО-ТК"хЛО) и спле-ноцитами (ПО-ТК"хСО) овцы, пригодные для вирусологических и биотехнологических исследований.

Новый мутантный (№56) и гибридный штамм (№57) депонированы в Специализированной Коллекции перевиваемых соматических культур клеток сельскохозяйственных и промысловых животных (ВИЭВ) СХЖ РАСХН, входящей в состав Всероссийской коллекции клеточных культур.

Получено положительное решение Федерального института промышленной собственности (ФИПС) (№ 2000131303/13(033369) от15.12.2000, форм.экс.23.12.2001) на изобретение "Мутантная линия клеток почки овцы

Ovis Arie L., дефектная по тимидинкиназе ПО-100 ТК "для гибридизации клеток животных in vitro".

Получено уведомление о положительном результате формальной экспертизы 27.02.2002, по заявке на изобретение "Штамм внутривидовых гибридных клеток почки овцы с спленоцитами овцы Ovis aries для вирусологии и биотехнологии", под № 2001134138, 2001.

На основе полученных результатов в соавторстве разработаны "Методические рекомендации по выявлению прионов в культурах клеток с использованием моноклональных анти-РгРс/8с антител". Изд. РАСХН. М., 2002, 10 стр. Авторы: Дьяконов Л.П., Дагданова А.В., Куликова И.Л., Гальнбек Т.В., Симонова А.С., Шубин В.А., Санджаев Д.Д.

Апробация результатов исследований.

Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на научной конференции "Научные основы производства ветеринарных биопрепаратов" М., 2000; на 15-й Международной научно-практической конференции "Консервация генетических ресурсов", г.Пущино, 2000; на 43-м конгрессе Европейского общества тканевых культур, Гранада, Испания, 2001; на Международной научно-производственной конференции "Биология клетки в культуре", Санкт-Петербург, 2001; на Ученом Совете ВИЭВ, 2001; на межлабораторном совещании ВИЭВ, апрель, 2002 г.

Публикации результатов исследований.

По материалам диссертации опубликовано 7 работ.

Основные положения выносимые на защиту:

1. Получение, культурально-морфологическая и кариологическая характеристика мутантных по гену тимидинкиназы (ТК) и внутривидовых гибридных культур клеток с лимфоцитами и спленоцитами овцы.

2. Изучение чувствительности мутантных и гибридных культур к вирусам инфекционного ринотрахеита, латентного герпесвируса штамм "Movar",

12 парагриппа-3, диареи-болезни слизистых крупного рогатого скота, ринопнев монии лошадей и их цитопатогенного действия.

3. Изучение чувствительности к агенту CKpenn-PrPsc мутантных и гибридных культур клеток овцы и цитопатологии, вызываемой прионами.

Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 137 страницах машинописного текста и включает: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы и практические предложения.

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Симонова, Алла Сергеевна

6. выводы

1. Изучены культурально-морфологические и кариологические свойства исходной постоянной культуры клеток ПО-2 после длительного хранения в жидком азоте (-196°С). Культура представлена преимущественно клетками эпителиоподобного типа и небольшим количеством фибробластоподобных клеток. Ядра округлой, овальной, вытянутой формы, ядрышки крупные, разнородные от одного до пяти-шести. Встречаются 2-4 ядерные клетки Сроки формирования монослоя 4- 6 суток при коэффициенте пересева 1:2 - 1:3, индекс пролиферации 2,0-2,6; митотическая активность на 24 ч. составляет 6-13%о, 48ч. - 2О-24%0, 72ч. - 31-35 %0, 96ч. - 6-15%0. Модальный класс представлен 54 хромосомами - 24% от общего числа. Интервал изменчивости от 18 до 76 хромосом.

2. Экспериментально методом многошаговой селекции под действием 5-бром 2-дезоксиуридина получены новые штаммы клеток почки овцы (ПО-2), дефектные по гену тимидинкиназы (ПО-ТК-). Полученные штаммы клеток устойчивы к действию 5-БДУ в дозах от 10 до 150 мкг/мл ПО-Ю-ТК", П0-20-ТКи ПО-ЗО-ТК; ПО-40-ТК-, ПО-50-ТК- и ПО-ЮО-ТК", Ш)-150-ТК\ Мутантные культуры клеток представлены клетками эпителиоподобного типа. Количество ядрышек 2-7. Сроки формирования монослоя 3-5 сутки культивирования, коэффициент пересева 1:3 - 1:5, индекс пролиферации ПО-ТК"-40 2,4 -3,8, ПО-ТК"150 3,3 - 4,3. Модальный класс хромосом представлен 2-мя пиками 52 и 45 хромосом, по 12% от их общего числа. Интервал изменчивости от 13 до 76 хромосом.

Мутантные штаммы сохраняют культурально-морфологические свойства в процессе длительного культивирования и после хранения в жидком азоте (-196С).

3. Отработаны методические приемы и получены новые внутривидовые гибридные культуры ПО-ТК" х лимфоциты овцы (ПО-ТК"хЛО) и ПО-ТК" х спленоциты овцы (ПО-ТК"хСО). а) Изучены культурально-морфологические и кариологические свойства новых гибридных культур. Сроки формирования монослоя 3-4 сутки культивирования, коэффициент пересева 1:3 - 1:4, индекс пролиферации ПО-ТК" х ЛО составляет 3,2 - 4,2; ПО-ТК х СО 3,2 - 3,9. б) Гибридные культуры представлены клетками 2-х типов эпителиоподобными до 80-90% и лимфоцитоподобными до 10-20% клеточной популяции. Ядра эпителиоподобных клеток крупные, неправильной формы, ядерная мембрана утолщена, количество ядрышек 1.3. Лимфоцитоподобные клетки имеют округлую форму, лежат группами, с плотным ядром и узким ободком цитоплазмы. Модальный класс представлен 48 хромосомами, что составляет 18 % от их общего числа. Интервал изменчивости от 13 до 83 хромосом.

4. Исходная культура ПО-2, мутантные и гибридные штаммы клеток сохраняли чувствительность к вирусам животных. а) Титр герпесвирусов (РПЛ и ИРТ) достигал Ю6,0-107,0 ТЦД 50/мл, в мутантной культуре ПО-ТК"; и 105'5-106'° ТЦД 50/мл в гибридных культурах клеток ПО-ТК"хЛО и ПО-ТК"хСО. б) Гибридные культуры были чувствительны к латентному герпесвирусу к.р.с. штамм "Movar", титр которого достигал 104'5-105'°ТЦД 50/мл. в) Чувствительность исследованных культур клеток к вирусу парагриппа-3 составлялаЮ5'5-106,0 ТЦД 50/мл. г) К вирусу диареи исходная культура ПО-2 и гибридная культура ПО-ТК" хЛО были малочувствительны, в то время как мутантный ПО-ТК" и гибридный ПО-ТК"хСО штаммы оказались нечувствительными.

5. Цитологически в культурах клеток окрашенных гематоксилин-эозином и по Романовскому-Гимзе ПО-ТК", ПО-ТК"хЛО и ПО-ТК"хСО, инфицированных

113 агентом скрепи, выявлена множественная вакуолизация, апоптоз, уплотнение ядерного матрикса, утолщение цитоплазматической мембраны клеток и ее складчатость после фиксации формалином и автоклавирования, а также более интенсивное окрашивание цитоплазмы в околоядерной зоне.

6. Иммуногистохимически с использованием МКА и вторичных антивидовых антител, меченых щелочной фосфатазой и пероксидазой хрена, выявлено специфическое окрашивание прионового протеина в инфицированных мутантной и гибридных культурах клеток на 1-15 пассажах. Электронномикроскопически в цитоплазме клеток, выявлены мембранные ср структуры, свойственные для патологии вызываемой агентом скрепи (РгР ).

7. Новые мутантные и гибридные культуры клеток могут быть рекомендованы для вирусологических исследований и использования в биотехнологии.

114

7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

1. Новые мутантные культуры клеток почки овцы (ПО-ТК") и внутривидовые гибридные линии клеток ПО-ТК" х лимфоциты и ПО-ТК" х спленоциты овцы), рекомендуются для культивирования вирусов, диагностической работы и использования в биотехнологии.

2. "Методические рекомендации по выявлению прионов в культурах клеток иммуноцитохимическим методом с использованием моноклональных анти-РгР антител". Авторы: Л.П. Дьяконов, А.В. Дагданова, И. Л. Куликова, Т.В. Гальнбек, А.С. Симонова, В.А. Шубин, Д.Д. Санджаев.

Методические рекомендации рассмотрены и рекомендованы для издания на секции "Ветеринарная биотехнология" Отделения ветеринарии РАСХН 21 декабря 2000 года. Протокол № 4. Изданы РАСХН., М., 16.01.2002г., Юс.

115

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Симонова, Алла Сергеевна, 2002 год

1. Аспанидзе Б.П. - Первичные и диплоидные культуры клеток легкого плода коровы для вирусологических исследований. Дисс. Канд. биологических наук., 1987.

2. Алексанян Ю.Т., Давтян Т.К. О проблеме получения человеческих моноклональных антител. Иммунологияю1991№3, с.10-13.

3. Антитела. Методы. Под редакцией Д.Кетти. М. Мир., 1991, 287с.

4. Байтубаев Н.Г. Получение моноклональных антител для диагностики гриппа лошадей. Автор, канд. дисс. М., 1992.

5. Баринский И.Ф., Шубладзе А.К. Лейкоцитарные культуры в вирусологических исследованиях. М., Медицина, 1980.

6. Башкиров О.Г., Авилов B.C. Активность моноклональных антител к ротавирусу в иммуноферментном анализе. Бюлл. ВИЭВ., вып. 66., М., с. 1416, 1988.

7. Белкина Н.М. Сравнительное изучение морфологических изменений в культуре клеток под действием вирусов группы герпеса. Бюлл. ВИЭВ, в. 14., 1972, с.25-28.

8. Боровиков С.Н. Методы иммунодиагностики бруцеллеза на основе моноклональных антител. М., Автор, канд. дисс., 1993.

9. Биотехнология. Наука, М.,1984, 318с. (отв. ред. Баев А.А).

10. Ю.Булашев А.К., Боровиков С.Н., Ескендирова С.З. Моноклональные антитела в диагностике бруцеллеза животных. Материалы Конференции по с/х биотехнологии, Целиноград, 1991, с.124-126.

11. П.Будулов Н.Р., Гальнбек Т.В., Такташев Ш.С. Чувствительность диплоидной культуры клеток щитовидной железы свиньи к вирусу герпеса лошадей 1. М., Труды ВИЭВ., вып. 64, с. 34-36, 1987.

12. Варшавер Н.Б., Лусс Е.В., Шапиро Н.И. Получение маркированных линий и частота возникновения мутаций, изменяющих углеводный обмен в клетках китайского хомячка in vitro. Генетика, 1969, 5, 11, 67-78.

13. Верховский О.А. Иммуноферментный метод тестирования гибридом, проуцирующих моноклнальные антитела к IgM свиньи. Тезис.докл., Бюлл. ВИЭВ., вып .№69, М, 1989, с.3-6.

14. Верховский О.А. Моноклональные антитела в ветеринарии. Труды ВИЭВ "Иммунитет с/х животных", вып. № 67, с.11-22 , М.1989.

15. Верховский О. А. Поли- и моноклональные антитела в анализе гуморального иммунного ответа, структуры и функциональных свойств иммуноглобулинов животных. Дисс. докт. биолог, наук., М., 1998.

16. Генноинженерные сельскохозяйственные животные. Сборник научных трудов, М., 1995, 404 с. (составитель Гольдман И.).

17. Герхард В., Франкель Е.М. Моноклональные антитела к вирусу гриппа. В кн.: Моноклональные антитела, М., 1983, 323-341.

18. Глебов O.K., Абрамян Д.С. Природа фенотипической изменчивости соматических клеток в культуре: нестабильные фенотипические изменения. -Цитология, 1984, т.24., стр.236-251.

19. Гуненков В.В., Белоусова Р.В., Сюрин В.Н. Основные направления изучения вирусных пневмоэнтеритов телят. Ветеринария, №4, 1982, с.65-66.

20. Данишевский Д.А. Цитопатогенное действие вирусов инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота и парагриппа-3 в культуре клеток. Дисс. канд. ветерин. наук, М., 1981.

21. Дьяконов JI.П.- Проблемы культивирования клеток животных и некоторые вопросы цитологии. Бюлл. ВИЭВ, М., 1983, №49.

22. Дьяконов Л.П, Кущ А.А, Тугизов Ш.М. Методические рекомендации по получению мутантных штаммов перевиваемых линий клеток с/х животных, пригодных для гибридизации. М. 1984, 16с.

23. Дьяконов Л.П., Кущ А.А, Тугизов Ш.М.- Гибридизация соматических клеток и перспективы использования клеточных гибридов в решении проблем инфекционной патологии сельскохозяйственных животных. С/х биология , 1, 1985, 2-8.

24. Дьяконов Л.П., Лобунцова Д.В., Гоголев М.М., Аспанидзе Б.П., Зудилина З.Ф., Вечеркин А.С., Матюгина Н.И., Будулов Н.Р. Штамм культивируемых клеток легкого плода коровы для культивирования вирусов. Авторское свидетельство №1306121, от 22 декабря 1986.

25. Дьяконов Л.П., Кущ А.А., Тугизов М.Ш., Майджи Е.В., Жданов В.М. -Штамм мутантных клеток трахеи эмбриона коровы № 10 для гибридизации клеток животных in vitro. Авторское свидетельство, от 1 ноября 1986.

26. Дьяконов Л.П., Кущ А.К., Тугизов Ш.М., Майджи Е.В. Методические рекомендации по гибридизации соматических клеток сельскохозяйственных животных. М., 1988.

27. Дьяконов Л.П., Расулев О.Ш., Тугизов М.Ш., Майджи Е.В. Способ деконтаминации от микоплазм тимидинкиназодефектных перевиваемых клеточных линий СПЭВ ТК". Авторское свидетельство № 1611929, от 8.08.90.

28. Дьяконов Л.П. Гибридные и генетически трансформированные клетки животных в биотехнологии физиологически активных веществ. Тез. докл. 3-го Всесоюзного совещания. "Культивирование клеток животных и человека", Пущино, 1990, 65-66.

29. Дьяконов Л.П. Гибридные и генетически трансформированные культуры клеток в биотехнологии и ветеринарной медицине. С/х биология . 4, 1994, 26-31.

30. Дьяконов Л.П.- Основные достижения и перспективы развития клеточной биотехнологии. Труды ВИЭВ, 1998, т.71, с.149-161.

31. Дьяконов Л.П., Гальнбек Т.В., Щекалева И.В., Антипова Т.А., Ярных Е.В. -Внутривидовая гибридная культура клеток СПЭВ ТК"х лимфоциты свиньи (А4хС) как модельная система для культивирования герпесвирусов лошадей. Ж. с/х. биология, 1996, № 2, с. 25-30.

32. Дьяконов Л.П., Гальнбек Т.В., Щекалева И.В., Майджи Е.В. Гибридные культуры клеток с/х животных, получение, чувствительность к вирусам и вирусная цитопатология. Тезис, докл. научн. конф., Москва, 1996.

33. Дьяконов Л.П., Миронова Л.Л., Конюшко О.И. Методические указания по контролю перевиваемых культур клеток из органов и тканей овец на отсутствие агента скрепи. Утверждены Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода РФ, 23 августа 1996.

34. Дьяконов Л.П., Эрнст Л.К., Дагданова А.В. Чувствительность к вирусам и компетентность к восприятию чужеродной генетической информациикультур клеток и эмбрионов с/х и промысловых животных. С/х биология, 1998, №2, 37-45.

35. Дьяконов Л.П., Ситьков Л.И. (ред.)- Животная клетка в культуре, М., 2000, 400 е., илл.

36. Дудар Л.Н. Внутривидовые гибриды клеток свиньи и их способность к интеферонооразоанию. Ж. Ветеринария, 1990, №4, стр. 29-31.

37. Ездакова Н.Ю. Получение и характеристика моноклональных антител к иммуноглобулину класса М рогатого скота. Дисс. канд. биол. наук., М., 1994.

38. Жестерев В.И. Каламина Т.В., Кушнир С.Д.- Характеристика клеточных линий, используемых в биотехнологии. Цитология, 1996, т.38.

39. Жидков С.А. Вирусная диарея - болезнь слизистых оболочек крупного рогатого скота. Диссертация доктора ветерин. наук., М., 1994.

40. Зеленин А.В., Кущ А.А., Ниязматов А.А., Прудовский И.А.- Быстрое вступление в S-период ядер лимфоцитов лимфоузлов в гетерокарионах и реконструированных клетках. ДАН СССР, 1979, т. 246, с. 1489-1492.

41. Конюшко О.И. Получение и характеристика линий перевиваемых клеток почки овец. Автор, дисс. канд.биолог. наук., М. 1996.

42. Конюшко О.И., Гардашьян A.M., Тюфанов А.В., Дьяконов Л.П. Контроль культур клеток овец на наличие возбудителя скрепи. Ветеринария, 1996, №7, 27-29.

43. Конюшко О.И., Миронова Л.Л., Дьяконов Л.П. Метод контроля клеточных субстратов на присутствие агента скрепи «Прионные и ретровирусные инфекции животных», Бюлл. ВИЭВ, М., № 77, 1996, 31-33.

44. Копровский X., Виктор Т. Моноклональные антитела к вирусу бешенства. В кн.: Моноклональные антитела. М., Мир, 1983, 341-357.

45. Коромыслов Г.Ф., Газдаров А.К., Дьяконов Л.П., Федоров Ю.Н., Гоголев М.М. Перспективные направления исследований в ветеринарной биотехнологии. Труды ВИЭВ, том 66, с.4-10, М., 1988.

46. Коромыслов Г.Ф., Караваев Ю.Д., Шуляк А.Ф. Медленные инфекции овец. Распространение, этиология, клиническое проявление и патоморфологические изменения. Труды ВИЭВ, том.64, М., 1987, с.4-13.

47. Кеннет Р.Г., Мак-Керн Т.Д., Бехтол К.Б.- Моноклональные антитела. Гибридомы: новый уровень биологии. М., Медицина, 1983, 416 с.

48. Колбасова О.Л., Юрков В.В. Получение и характеристика клональной сублинии клеток почки поросенка для целей биотехнологии, Тез. докл., Научн.-практ. Конф. ВНИТИБП, Щелково, 2000, с. 109-110.

49. Колбасова О.Л. Кариологическая и цитохимическая характеристика перевиваемых линий клеток пермиссивных и непермиссивных (резистентных) к вирусу чумы свиней. Автор, канд. дисс. Покров, 2000.

50. Крюков Н.Н., Козыренко Т. И., Надточей Г.А., Поздняков А.А.- Выделение вируса инфекционного ринотрахеита на культуре перевиваемых клеток. Ветеринария, М., 1977, №9, с.46-48.

51. Кумекбаева Ж.Ж., Будулов Н.Р. Чувствительность и динамика репродукции вируса ринопневмонии лошадей в различных клеточных культурах. Бюлл. ВИЭВ., вып.61, с. 54-57, М., 1987.

52. Куликова И.Л. Диагностика и видовая идентификаци микоплазм в культурах клеток животных методами иммуноферментного анализа с поли-и моноклональными антителами и ДНК-ДНК гибридизация. Дисс. канд. биол. наук., М., 1989.

53. Куликова И.Л., Дьяконов Л.П., Жидков С.А. Культура клеток сосудов теленка и чувствительность этой культуры к вирусу диареи крупного рогатого скота. Цитология, 1992, 34, №9, с.75.

54. Куликова И.Л., Жидков С.А. Культуральные, морфологические и биологические свойства культуры клеток эмбриона коровы (КСТ). Тез. докл. НПК "Культура клеток животных в ветеринарии и биотехнологии", М., 1993.

55. Липосомы в биологических системах. (Ред. Грегориадис Г., Аллисон А.), М., "Медицина", 1983, 384 с.

56. Макаров В.В. Вирусная диарея крупного рогатого скота. В сб. Карантинные и малоизвестные болезни животных. М. Колос, 1983. С.85-90.

57. Майджи Е.В., Дудар Л.П. Гибридизация мутантных клеток почки эмбриона свиньи со спленоцитами свиньи. Бюлл. ВИЭВ., вып.68, М., 1988, с.27-29.

58. Макаревич В.Г. -Вирусная диарея крупного рогатого скота. Малоизвестные заразные болезни животных. М., Колос. 1973, с.73-91.

59. Майджи Е.В. Гибриды соматических клеток сельскохозяйственных животных и их чувствительность к некоторым вирусам. Дисс. канд. биолог, наук., М., 1987.

60. Майджи Е.В., Дудар Л.Н. Гибридизация мутантных клеток почки эмбриона свиньи со спленоцитами свиньи. Бюлл. ВИЭВ., вып. 68, с.27-29, 1988.

61. Майджи Е.В., Тугизов Ш.М., Дьяконов Л.П. Количественный хромосомный анализ сублиний гибридных клеток некоторых сельскохозяйственных животных в связи с чувствительностью к различным вирусам. Ж.С/х. биология, № 6, 1990, с.52-57.

62. Майджи Е.В., Тугизов Ш.М., Дьяконов Л.П. и др. Оптимизация условий гибридизации мутантных клеток свиньи и лимфоцитов лошади. С.х. биология, 1990, №2, с.182-187.

63. Малоголовская С.А., Васильев Д.А., Макаров В.В. Моноклональные антитела. (Учебное пособие), Ульяновск, 1998, 30с.

64. Маршак М.И., Варшавер Н.Б. Спонтанный темп возникновения мутаций резистентности к 8-азагуанину в диплоидных и анеуплоидных клетках человека. Генетика, 1970, т.7, с. 130-138.

65. Методы культивирования клеток. Сборник научных трудов. Л., Наука, 1988, 319 с. (отв. редакор Пинаев Г.П.).

66. Монкс О., Костелло А., Вивере Э., Авилов В.М., Рыбаков С.С.- Контроль губкообразной энцефалопатии крупного рогатого скота в Ирландии. Ветеринария, 1998, 1, 16-22.

67. Моноклональные антитела в микробиологии. Аннотированный указ. литературы. (Сост. Гильмундинов Р.Я.), Казань, 1991,с.96.7 7. Моноклональные антитела в вирусологии. Аннотированный указ.литературы.,(сост.Гильмундинов Р.Я.) Казань, 1991,с. 130.

68. Мусиенко М.И. Культуры клеток трансгенных животных и тестирование физиологически активных веществ (соматотопин, интерферон) иммуноферментным методом. Дисс. канд. биол. наук. М., 1992.

69. Мустафина А.Н., Лашкевич В.А., Королева Г.А. Характеристики энтеровирусной инфекции в культурах гибридных клеток человека и мыши. Вопр. Вирусологии, 1984, т.29, №4, с.476-480.

70. Новохатский А.С. Моноклональные антитела в микробиологии. Итоги науки и техники. Сер. Микробиология. ВИНИТИ, М., 1983, с. 12.

71. Поздняков А.А., Хорьков И.А. Методы культивирования клеток животных. Бюлл. ВИЭВ, 1983, №49.

72. Поздняков А.А., Майборода А.Д., Гололобова М.Т. Получение перевиваемых культур клеток из лимфоидной ткани. Ветеринария, 1975. №7,с.37.

73. Прудовский И.А., Зеленин А.В.- Влияние энуклеации на структурно-функциональное состояние цитоплазмы L-клеток. Цитология, 1978, т. 20, с. 952-956.

74. Рингерц Н., Сэвидж Р. Гибридные клетки. М., Мир, 1979, 416 с.

75. Ройхель В.М. Патогенез и диагностика некоторых медленных прионовых инфекций. Дисс., доктора медиц. наук, М., 1997.

76. Спиер Р.Е., Гриффите Дж. Б. Биотехнология клеток животных. Агропромиздат, М., 1989.

77. Сюрин В.Н., Фомина Н.В. Частная ветеринарная вирусология. М. Колос, 1979, 472 с.

78. Сюрин В.Н., Фомина Н.В., Белоусова P.P. Ветеринарная вирусология. М., Колос., 1984. 376 с.

79. Трофимова М.Н., Новиков В.В., О.М.Сандова и др. Наработка моноклональных антител в асцитной форме и методы их очистки. Биотехнология, 1987, 3, 6, с.735-737.

80. Третьякова И.А. Чувствительность культур клеток к парвовирусу крупного рогатого скота. Бюлл. ВИЭВ., вып. 68, М., 1988, с.43-44.

81. Тугизов Ш.М. Мутантные и гибридные клетки крупного рогатого скота и свиньи для вирусологических исследований. Дисс. канд. биол. наук. М., 1985.

82. Тугизов М.Ш., Кущ А.А., Дьяконов Л.П., Расулов О.Ш., Жданов В.М. -Штамм клеточного клона почки эмбриона свиньи для гибридизации клеток животных. Авторское свидетельство, заявка от 13.06.1985.

83. Тугизов Ш.М. Использование электрического пробоя мембран для гибридизации и трансфекции эукариотических клеток. В кн. Молекулярная биология и генетическая инженерия вирусов. М., 1989, с.93-98.

84. Тугизов Ш.М. Структурно-функциональный анализ мембранных белков вирусов в генетически трансформированных клетках. Автореф. дисс. докт. биол. наук, М., 1996.

85. Тутов И.К., Ситьков В.И. Основы биотехнологии ветеринарных препаратов. Ставрополь, 1997.

86. Феоктистова Т.А., Федоров Ю.Н., Ездакова И.Ю. Количественный метод определения IgM рогатого скота в биологических жидкостях с использованием моноклональных антител. Бюлл. ВИЭВ, вып.68, с.3-5., М., 1988.

87. Федоров Ю.Н., Верховский О.А. Достижения и перспективы развития ветеринарной иммунологии. Труды ВИЭВ., 1998, т.71., с. 114-124.

88. Федоров Ю.Н., Сологуб В.К., Феоктистова Т.А., Ездакова И.Ю., Буларгина Т.В., Катруха А.Г. Получение и характеристика моноклональных антител к иммуноглобулинам класса М рогатого скота. Труды ВИЭВ, том.66, М., с. 13-17, 1988.

89. Чевелев С.Ф., Пичугин JI.M., Архипов Н.И. Цитологические изменения в культуре клеток почки телят, зараженных вирусом инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота. Вопросы ветер, вирусол., микробиологии., эпизотологии. Покров, 1973, с.40.

90. Шапиро Н.И., Варшавер Н.Б. О темпе спонтанного мутационного процесса в соматических клетках млекопитающих и о некоторых вопросах с ним связанных. Генетика, 1976, т. 12, с. 132-149.

91. Шей Дж.В. Методы генетики соматических клеток (пер. с англ), изд. Мир, 1985. t.I, 312 е., т.2, 313-630 с.

92. Щекалева И.В. Внутривидовая гибридная культура клеток А4ХС (СПЭВ ТК" х спленоциты свиньи) биологическая система для вирусологических исследований. Тезисы докладов научной конференции, Махачкала, 1997.

93. Эрнст Л.К., М. И. Прокофьев, Дьяконов Л.П, Дагданова А.В., Сураева Л.М. Микроинъекция чужеродных генов, ответственных за устойчивостьорганизма к инфекционным заболеваниям. Вестник Росс. Акад. с/х наук, 1995. №1, с.56-58.

94. Aycardi E., Savaras J., Cortes J.M. Infections bovine rhinotracheitis survey in range cattle. XX World Vet. Congress, Summaries., 1975, 1, p.573.

95. Barry R.A. & Prusiner S.B. Monoclonal antibodies to the cellular and scrapie prion proteins. J. Inf. Dis., 1986, 3, 518-521.

96. Basilico C. and Wand R. Susceptibility to superinfection of hybrids between polyoma "transformed" BHK and normal 3T3 cells.-Nature (Londen), New Biol., 1971,230, 105-107.

97. Baker R.M, Bovine viral diarhea vims: a review. J. Am. vet. med. Ass., 1987, 190, 1449-1458.

98. Brandler S., Isenmann S., Raeber A. et al. Normal host prion protein necessary for scrapie-induced neurotoxicity. Nature, 1996, 379, 339-343.

99. Borchelt D.R., Koliatsos V., Guarneri M. et al. Rapid anterograde axonal transport of the cellular prion glicoprotein in the peripheral and CNS. J. Biol. Chem., 1994, 269, 14711-14714.

100. Borchelt D.R., Scott M., Taraboulos A. et al.- Scrapie and cellular prion protein differ in their kinetics of synthesis and topology in cultured cells. J. Cell. Biol., 1990, 110, 743-752.

101. Brown D.R., Herms J. and Kretzschmar H.A.- Mouse cortical cells lacking cellular PrP survive in culture with a neurotoxic PrP fragment. Neuroreport, 1994,5,2057-2060.

102. Brown D.R. PrPSc-like prion protein peptide inhibits the function of cellular prion protein. Biochem., 2000, 352, 511-518.

103. Beekes M., Baldauf E., Cassens S, Diringer H., Keyes P., Scott A.C., Wells

104. Bruck C., Mathot S., Portetelle D. et.al.- Monoclonal antibodies define eight independent antigens regions on the bovine leukemia virus (BLV) envelope glycoprotein . gp.51,Virology, 1982, 122, 342-352.

105. Booman P. Application of monoclonal antibodies in animal production: Pregnancy diagnosis in cattle. - In: Hubridoma Technology in Agriculture and Veterinary Research, N.J. Stern and H.R. Gamble, Eds, 1984, 316.

106. Buonavoglia C., Cavalli A., et al. Bovine herpesvirus 1 in sheep, restriction enzyme analysis of the viral genome. Obirttivi - e-Documenti-Veterinari , 1996, 17, 10., 79-83, 27 pef.

107. Garnett H.M. Fusion of citomegalivirus infected fibroblasts to from multinucleasa giant cells . - J. Med. Virol., 1979.V.3., N 4, p.271-274.

108. Gajdusek D.C. Unconventional viruses and the origin and disappearance of kuru. Science, 1977, 197, 943-960.

109. Call K., Thilly W. 5-azacytidine inhibits the induction of transient TK-deficient cells by 5-bromodeoxyuridine. Mutat. Res., 1991, Vol.248., p. 101-114.

110. Clarke P. Developmental cell death: morphological diversity and multiple mechanisms. Anat. Embryol., 1990, 181, 195-213.

111. Granthwohl-KUD, Horiuchi-M., Ishiguro-N., Shinigawa-M. Sensitive enzyme-linked immunosorbent assay for detection of PrPSc in crude tissue extracts from scrapie-infected mice. Journal-of-Virological-Methods.-1997,V.64, №2, P.205-216.

112. Combs C., Johnson D., Cannady S. et al. Identification of microglial signal transduction pathways mediating a neurotoxic response to amyloidogenic fragments of J3-amyloid and prion protein. J. Neurosci., 1999, 19, 928-939.

113. Giese A., Groschup M.H., Hess B. and Kretzschmar H.A. Neuronal cell death in scrapie-infected mice is due to apoptosis. Brain Pathol., 1995, 5, 213221.

114. Giulian D., Li J., Leara B. and Keenen C. Phagocytic microglia release cytokines and cytotoxins that regulate the survival of astrocytes and neurons in culture. Neurochem. Int. 1994,25,227-233.

115. Chia W.K., Savan M. Pathogenesis of infections bovine rhinotracheitis (IBL) virus infection in bovine fetal tracheal organ cultures.- Can. J. Microbiol. 1974, 20, p.839.

116. Harris M. and Collier K. Phenotypic evolution of cells resistant to bromodeoxiuridine. - Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1980, Vol. 77, p. 4206-4210.

117. Hess R.G., Coulibaly C.O.Z., Liess B. Et al. Identification of hog cholera viral isolattes by use of monoclonal antibodies to pestiviruses. Vet.Microbiol., 1988, 16,315-321.

118. Hoglund S., Morein B. A morphological study of outfolded and released parainfluenza tyre 3 virus. J. Gen.Virol., 1973,21, p.359.

119. Kascsak R.J., Rubenstein R., Merz P.A. et al. Mouse polyclonal and monoclonal antibodies to scrapie-associated fibril proteins. J. Virol., 1987, 12, 3688-3693.

120. Katz J.B., Pedersen J.C., Jenny A.L., Taylor W. Assessment of western immunoblotting for the confirmatory diagnosis of ovine scrapie and bovine spongiform encephalopathy (BSE). J. Vet. Diagn. Invest. 1992, V.4, №4, p.447-449.

121. Krasemann S., Groschup M.H., Harmeyer S. et al.- Generation of monoclonal antibodies against human prion protein in PrP0/0 mice. Mol. Med., 1996, 6, 725734.

122. Kretzschmar H.A., Prusiner S.B., Stowring L.E. and DeArmond S.J. Scrapie prion protein are synthesized in neurons. Am. J. Pathol., 1986, 122, 1-5.

123. Knowles B.B., Koprowski H. et al. Sisceptibility of primate-mouse hubrid cells to SV40. - J. Cell. Physiol., 1971, 78, 1-8.

124. Krivi G.G., Rowold E.J. Monoclonal antibodies to bovine somatotropin. Preparation and characterization.- In: Hybridoma Technology in Agriculture and Veterinary Research, N.J. Stern and Gamble H.R., 1984, 322.

125. Kohler G., Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody predefined specificity. Nature,1975, 256,55, 17,495-497.

126. Lane H.C. Human monoclonal antikeyhole limpet hemocyanin antibody -secreting hybridomas produced from peripheral blood В lymphocytes of a keyhole limpet hemocyanin immune individual. J. Exp. Med. 1982. 133. 155.

127. Littlefield J.W. Selection of hybrids from mating of fibroblasts in vitro and their presumed recombinants. - Science, 1964, Vol. 41, p. 190-196.

128. Littlefield J.W. The use of drug resistant markers to study the hybridization of mouse fibroblasts. - Exp. cell res., 1966, Vol. 41, p. 88-95.

129. Littlefield J.W.- Hybridization of hamster cells with high and low folate-reductase activity. -Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1969, Vol. 62, p. 88-95.

130. Matsuya Y., Yamane I. Cell hybridization and cell agglutination. I. Enhancement of cell hybridization by lectins., J. Cell Sci. 1985. V.78. p. 236271.

131. Madin S.H., York C.J., et al. Isolation of infections bovine rhinotracheitis virus. Science. 1956. 124. p.721-722.

132. Mackenzie A. Immunohistochemical demonstration of glial fibrillary acid protein in scrapie. J. Сотр. Pathol., 1983, 93, 251-259.

133. Mellon P.L., Windle J.J., Goldsmith P.C. et al. Immortalization of hypothalamic GnRH neurons by genetically targeted tumorigenesis. Neurons, 1990, 5, 1-10.

134. Merz P.A., Sommerville R.A., Wisniewski H.M., Igbal K. Abnormal flbris from scrapie-infected brain.- ActaNeuropathol., 1981., v.54., p.63-74.

135. Moser M., Colello R.J., Pott U., Oesch В.- Developmental expression of the prion protein gene in glial cells. Neuron, 1995, 14, 509-517.

136. Mueller W., Ushijima H., Schroder H. et al. Cytoprotective effect of NMD A receptor antagonists on prion protein (PrPSc)-induced toxicity in rat cortical cell cultures. Eur. J. Pharmacol, 1993, 246, 261-267.

137. Nabholz M.et al. Hybridoma technology special reference to parasitic disease. UNDP, World Banc. WHO, 1979.

138. Neari K., Caughey В., Ernst D. Protease Sensitivity and Nuclease Resistance of the Scrapie Agent Propagated in vitro in Neuroblastoma cells. J.Virologi. 1991, vol.65, N2, p. 1031-1034.

139. Nowinski R.S., Lostrom M.E., Tam M.R et al.- The isolation of hybrid cell lines producting monoclonal antibodies against the pl5 (E) protein of murine leukemia viruses. Virology, 1979, 93, 111.

140. David G.S., Fresent W., Martinis I., Wans R., et al. Monoclonal antibodies in the detection of hepatitis infection .- Medical Laboratory Science, 1983, 38, 341-348.

141. David W.X. et al. Monoclonal antibodies specific for cell culture mycoplasmas. In vitro. 1982., 18,4, 377-381.

142. Davidson R., Broeker P., Ashman C. DNA base sequence changes specificity of bromodeoxyuridine induced mutations in mammalian cells. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1988, vol. 85, p. 4406-4410.

143. DeArmond S.J., Mobley W.C., DeMott D.L. et al. Changes in the localization of brain prion protein during scrapie infection. Neurology, 1987, 37, 1271-1280.

144. Earley E.M., Osterling M.C. Fusion of mouse-mouse cells to produce hibridomas secreting monoclonal antibody. J. Tussue Cult. Meth.,1985, v.9., n3., p.141-146.

145. ECACC Cell Line Catalogue, 5-Edition, Salisbury, UK, 1997.

146. Forloni G., Angeretti N., Chiesa R. et al. Neurotoxicity of prion protein fragment. Nature, 1993, 362, 543-546.

147. Forloni G., Del Bo K., Angeretti N. et al.- A neurotoxic prion protein fragment induces rat astroglial proliferation and hypertrophy. Eur. J. Neurosci., 1994, 6, 1415-1422.th

148. Hague B.A. A library of monoclonal bovine antibodies. In 66 Annual Meeting of the Conference of Research Workers in Animal Diseases, Chicago, 1985,63.

149. Haritani M., Spencer Y.I., Wells G.- Hydrated autoclave pretreatment enhancement of prion protein immunoreactivity in formalin-fixed bovine spongiform encephalopathy-affected brain. Acta Neuropathol., 1994, V.87, №1, p.86-90.

150. Harris M., Collier K. Phenotypic evolution of cells resistant to bromodeoxiuridine. - Proc.Nat.Acad. Sci. USA, 1980, vol. 77, p. 4206-4210.

151. Harris M., Wise T. Deletion of hypermethylation of thymidine kinase gene in V79 Chinese hamster cells resistant to bromodeoxyuridine . Somat. Cell Mol. Genet., 1988, vol.14, p. 567-581.

152. Harris D.A.- Cellular biology of prion diseases. Clinical Microbiol. Rev, 1999, 12, 427-444.

153. Hope J, Shearman M.S., Baxter H.C. et al. Cytotoxicity of prion protein peptide (РгРЮб-126) differs in mechanism from the cytotoxic activity of the Alzheimer's disease amyloid peptide A25-55. Neurodegeneration, 1996, 5, 1- 11.

154. Huang Z, Prusiner S.B. and Cohen F.E.- Structures of prion proteins and conformational models for prion diseases. Curr. Top. Microbiol. Immunol, 1996, 207, 49-67.

155. Taraboulos A, Scott M, Semenov A. et al.- Cholesterol depletion and modification of COO-terminal targeting sequence of the prion protein inhibit formation of the scrapie isoform. J. Cell. Biol, 1995, 129, 121-125.

156. Oesch B, Westaway D, Walchli M. et al. A cellular gene encodes scrapie PrP 27-30 protein. Cell, 1985, 40, 735-746.

157. Okada Y., Murayama F.- Fusion of cells by HVI: Requirement of concentration of virus particles at the site of contact of two cells for fusion. Exp. cell res., 1968, Vol. 52, p. 34-42.

158. Olafson P., Fox F.H. et al. An apparently new transmissible disease of cattle. Cornell Vet. 1946.,36, 205-213.

159. O'Rourke K.I., Baszler T.V., Miller J.M. et al. Monoclonal antibody F89/160.1.5 defines a conserved epitope on the ruminant prion protein. J. Clin. Microbiol., 1998a, 36, 1750-1755.

160. O'Rourke K.I., Baszler T.V., Parish S.M. and Knowles D.P. Preclinical detection of PrPSc in nictitating membrane lymphoid tissue of sheep. Vet. Rec., 1998b, 142, 486-491.

161. Rayboulg T.J.G., Willson P.J., McDougall L.J. et al. A porcine-murinethhybridoma that secrets porcine monoclonal antibody of defined specificity. 65 Annimal Meeting of the Conference of Research Workers in Animal Disease, Chicago. 1984, 57.

162. Rayboulg T.J.G., Crough C.F., McDougall L.S. Bovine-murine hybridoma that secrets bovine monoclonal antibody of defined specificity. Am. J. Vet. Res. 1985.46.2.426-427.

163. Rubenstein R., Deng H., Scalici C.L. et al. Alterations in neurotransmitter-related enzyme activity in scrapie-infected PC12 cells. J. Gen. Virol., 1991, 72, 1279-1285.

164. Rubenstein R., Kascsak R., Merz P. et al.- Detection of scrapie-associated fibrils proteins using anti-SAF antibody in non-purified tissue preparations. J. Cen. Virol., 1986, 67, 671-681.

165. Ruth G.R. Bovine viral diarrhea: a difficult infection to diagnose. Vet. Med., 1986, 81, 870-874.

166. Pan K.-M., Baldwin M., Nguyen J. et al. Conversion of a-helices into sheets features in the formation of the scrapie prion protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90, 10962-10966.

167. Pontecorvo G. Production of indefinitely multiplying mammalian somatic cell hybrids by polyethyleneglycol (PEG) treatment. - Somat. Cell Genet., 1976, Vol. l,p. 397-400.

168. Pollack R.E., Salas J., Wand R., Kusano T. Human-mouse hybrid cell lines and sisceptibility to species-specific viruses. J. Cell. Physiol.,1971,77,117-119.

169. Polin R.A., Kennet Ph.D. Use of monoclonal antibodies in an enzymelinked inhibition assay for rapid detection of streptococcal antigen. Pediatrics, 1982, 97, 540-544.

170. Prusiner S.B. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science, 1982,216,136-144.

171. Prusiner S.B., Groth D., Bolton D.C., Kent S.B., Hood L.E. Purification and structural studies of major screpie prion protein. - Cell. - 1994., v.38., p.127-134.

172. Prusiner S.B. Molecular biology of prion diseases. Science, 1991, 252, 1515-1522.

173. Prusiner S.B.- Genetic and infectious prion diseases. Arch. Neurol., 1993, 50, 1129-1153.

174. Prusiner S.B., Groth D., Serban A. et al. Ablation of the prion protein gene in mice prevents scrapie and facilitates of anti-PrP antibodies. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993,90, 10608-10612.

175. Prusiner-S.B. Prions. Encyclopedia-of-molecular-biology-and-molecular-medicine Volume-5: Plasmids to synthetic peptide and nonpeptide combinatorial libraries. 1996, p. 57-73.

176. Yarmush M.L. Identification and characterization of rabbit-mouse hybridomas secreting rabbit immunoglobulin chains. Proc. Nat. Acad. Shi. USA. 1980. 77. p. 2899.

177. Yokoyama Т.- The immuno detection of theabnormal isoform of prion protein. Histochem J., 1999,V.31, P.209-212.

178. Yokoyama Т., Itohara S, Yuasa-N.- Detection of species specific epitopes of mouse and hamster prion proteins (PrPs) by anti-peptide antibodies. Archives of

179. Virology. 1996,V. 141, №3-4, P.763-769.

180. Yokoyama Т., Momotani E., Kimura K., Yuasa N.- Immunoreactivity of specific epitopes of PrPSc is enhanced by pretreatment in a hydrated autoclave. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 1996, V.3, №4, P.470-471.

181. Yolken R.H. Use of monoclonal antibodies for viral diagnosis. Nev Develop. Diagn. Virol., 1983, p.177-195.

182. Yerganian G., Nell M.B. Hybridization of dart hamster cells by UV-inactivated Sendai virus. Proc. Nat. Acad. Sci. USA., 1966, 55, 1066-1073.

183. Sauer H., Dagdanova A., Hescheler J. and Wartenberg M. Redox-regulation of intrinsic prion expression in multicellular prostate tumor spheroids. Free Radical Biology & Medicine, 1999, 27, 1276-1283.

184. Somerville R.A., Birkett C.R., Farquhar C.P., Hunter N. Immunodetection of PrPSc in spleens of some scrapie-infected sheep but not BSE-infected cows. J. Gen. Virol, 1997, V.78, № 9, p. 2389-2396.

185. Schaetzl H.M, Laszlo L, Holtzmann D.M. et al. A hypothalamic neuronal cell line persistently infected with scrapie prions exhibits apoptosis. J. Virology, 1997,71,8821-8831.

186. Schonderr O.T, Roelofs H.W.M, Houwink E.H. Development, screening and guality specifications of hybridomas synthesizing antipolypeptide hormone antibodies to be used for diagnostic tests and in-process control. Dev. Biol. Stand. 1984. 55. 163-171.

187. Schreuder B.E, Keulen L.J, Vromans M.E. et al.- Preclinical test for prion diseases. Nature, 1996, 381, 563.

188. Schulz-Schaeffer W.J., Tschoeke S., Kranefuss N. et al.- The paraffin-embedded tissue blot detects PrPSc early in the incubation time in prion diseases. Am. J. Pathol., 2000, 156, 51-56.

189. Srelnivasa B.P., Rasool I. J., Natarajan C. Direct detection of bovine herpes vims - 1 DNA from cell culture fluids using polymerase chain reaction. Jndian-Journal of Exp. Biology ,1996, 34, 11, p.l 169-1171.

190. Scott M.R., Butler D.A. Prion protein gene expression in cultured cells -Bibliogr. P.76 vol. 2 1988 № 2.

191. Spurzem J.R., Raz M., Bovine herpesvirus 1, infection reduces herpesvirus 1 infection reduces bronchial epithelial cell migration to extracellular matrix proteins - American Journal of Physiology, 1995, 268, 2, L 214-220, 39 ref.

192. Srikumaran S., Guidry A.J., Goldsby R.A. Interspecific hybrids for the production of Immunoglobuline of veterinary interest. In: Hybridoma Technology in Agricultural and Veterinary Research, N.J. Stern and H.R. Gamble, 1984, p.202-215.

193. Taraboulos A., Raeber A.J., Borchelt D.R. et al. Synthesis and trafficking of prion proteins in cultured cells. Mol. Biol. Cell., 1992, 3, 851-863.

194. Tam M.R., Buchhanan T.M., Sandstrom E.G. Serological classification of Neisseria gonorrhea with monoclonal antibodies. Infection and Immunity, 1982, 36p. 1042-1053.136

195. Van Zaane D., Hulst M.M. Monoclonal antibodies against porcine immunoglobulin isotypes. Vet. Immunol. And Immunopathol., 1987. 16. 23-36.

196. Wakanara M. Polyethylene glycol- and lysolecithin-induced cell fusion between follicle cell and very small oocyte in Xenopus laevis. - Exp. Cell res., 1980, Vol. 128, p. 9-14.

197. White J. Viral and cellular membrane fusion proteins. - Ann. Rev. Physiol., 1990, Vol. 52, p. 675-697.

198. ПРОМЫШЛЕННОЙ СОБСТВЕННОСТИ

199. Бережковская наб., 30, корп. 1, Москва, Г-59, ГСП-5, 123995 Телефон [phone]. Телекс 114818 ПДЧ. Факс [phone]. На № 1. ОТДЕЛ ДР13(74)

200. Го9472, Москва, Кузьминки, ВИЭВ1. Форма Ха 01 ИЗ.ПМ-2001от L

201. При переписке просим ссыпаться па помер заявки и сооби/шнь оату полу чения Оанной корреспонОенции1. РЕШЕНИЕ О ВЫДАЧЕ

202. БО ПАТЕНТА НА ИЗОБРЕТЕНИЕ □ СВИДЕТЕЛЬСТВА НА ПОЛЕЗНУЮ МОДЕЛк более ранней

203. Заявка № 2000131303/13(033 3 69) (22) Дата поступления заявки 15.12.2000

204. Дата начала отсчета срока действия патента (свидетельства) 15.12.2000 (85) Дата перевода международной заявки на национальную фазу

205. I) Номер приоритетной заявки (32) Дата подучи приоритетной заявки (33) Код страны1.ю которой даннаязаявка выделена , из которой данная заявка выделена86. Заявка №РСТ/ Заявка № ЕЛ

206. Номер публикации и дата публикации заявки РСТ

207. Заявитель(и) Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко. RU .ъ ►

208. Автор(ы) Куликова И.Л., Гальнбек Т.В., Дяконов Л.П., Симонова А.С., Шуляк-А.Ф., Ярных Е.В., RU

209. Патентообладатель(и) Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Конплсико, RUуказать код стрит51. мпк 7 С 12 N 5/06

210. Название Мутантная линия клеток почкиоицы О vis arie L, дефектная по тимидинкиназе ПО-ЮО-ТК~'<для гибридизации клеток жниотнмх in vitro101 1 1 ,11 1362012

211. Адрес для переписки с патентообладателем □ обладателем свидетельства или егопредставителем, который будет опубликован в официальном бюллетенеГуказан на лицевой стороне бланка решения

212. Адрес Х1Я отправки J2) патента на изобретение □ свидетельства на полезную модель2 указан на лицевой стороне бланка решенияуказан в графе «Адрес для переписки с патентообладателем.»

213. ВСЕРОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК

214. ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ВЕТЕРИНАРИИ имени Я.Р. КОВАЛЕНКО1. Утверждаю

215. Академик-секретарь ^^^^деления ветеринарнойi. Россельхозакадемии1. A.M. Смирнов2002 Г

216. МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКО\1ЕНДАЦИИН«=ВЬ0геЛЕНИЮ ПРИОНОВ В КУЛЬТУРАХ КЛЕТОК С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИ-РгР0^ АНТИТЕЛ1. МОСКВА-2002 V

217. Методические рекомендации рассмотрены и рекомендованы для издания секцией "Ветеринарная биотехйология" Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии 21 декабря 2000г., протокол № 4.

218. Рецензент: зав. лабораторией биофизических методов исследований и биотехнологии ВИЭВ, к.б.н. ГА.Надточей;

219. Методические рекомендации предназначены для научно-исследовательских ветеринарных учреждений, осуществляющих диагностику болезней животных, и научных сотрудников, занимающихся изучением прионных инфекций.

220. Ответственный за выпуск зав. сектором Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии, к.б.н. Л.В.Бабышова

221. Российская академия сельскохозяйственных наук, 20021. ВВЕДЕНИЕ

222. HBS-буфер: 0,02 М HEPES, 0,15 NaCl.

223. PBS: 0,1 М NaCl; 0,02 М Na2HP04 х 12 Н20; 0,02 М NaH2P04 х 2 Н20; рН 7,2

224. Ацетатный буфер: 0,05 М ацетата Na, 0,05 М ледяной уксусной кислоты, рН 5,5

225. Приготовление раствора Tris-Cl: 10 шМ, рН 7,8.

226. Блокирующий буфер: 10% (w/v) обезжиренного сухого молока растворить в HBS или PBS

227. Приготовление раствора для разбавления антител: 0,2% (w/v) БСА растворить в HBS-буфере или PBS.

228. Приготовление АР-буфера (АР; alkaline phosphatase; щелочная фосфатаза): 100 шМ NaCl, 50 mM MgCl2, 100 шМ Tris-HCl,pH 9,5.

229. Приготовление концентрированного раствора BCIP: 50 mg ВС!Р растворить в 1 ml 100% диметилформамида (хранить при 4"С).

230. Приготовление концентрированного раствора NBT: 75 mg NBT растворить в 1 ml 70% водного раствора диметилформамида (хранить при 4'С).

231. Приготовление раствора гуаншшна изотиацианата: 3 М гуанидина изотиацианата растворить в 10 гаМ растворе Tris-HCl.

232. Приготовление раствора для колориметрического выявления щелочной фосфатазы: в 5 ml АР-буфера добавляют 33 (iL NBT и 17 ц! BCIP.

233. Приготовление раствора для колориметрического выявления пероксидазы хрена: одну таблетку АЕС растворяют в 2,5 ml DMF. К полученному раствору добавляют 47,5 ml ацетатного буфера (рН 5,5), 25 свежего 30% раствора Hj02.б

234. ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПРЕПАРАТОВ КЛЕТОК ДЛЯ ИММУНОЦИТОХИ-МИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ

235. ВЫПОЛНЕНИЕ ИММУНОЦИТОХИМИЧЕСКОГО АНАЛИЗА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СПЕЦИФИЧЕСКИХ ПЕРВИЧНЫХ АНТИ-РгР05* АНТИТЕЛ И ВТОРИЧНЫХ АНТИВИДОВЫХ АНТИТЕЛ, МЕЧЕНЫХ ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗОЙ.

236. Препараты отмывают в растворе Хэнкса.

237. Препараты, приготовленные для определения агента скрепи, подвергают гидратирован-ному автоклавированию при 121°С в течение 30 мин. "

238. Препараты (для определения агента скрепи) инкубируют в 3 М растворе гуанидина изо-тиадианата в течений 10-15 мин. при комнатной температуре. Эту процедуру и все последующие выполняют при слабом покачивании на шуттеле.

239. Отмывают трижды в дистиллированной воде.

240. Препараты инкубируют с первичными антителами, разведенными в HBS с 0,2% БСА при комнатной температуре в течение 1-2 часов или в течение ночи при 4°С. Разведение антител производят согласно инструкции.

241. Затем препараты клеток трижды (по 15 мин.) отмывают в HBS.

242. Препараты инкубируют со вторичными антителами, разведенными в HBS с 2% BSA при комнатной температуре в течение 30-60 мин.

243. Отмывают три раза в HBS по 15 мин.

244. Инкубируют в АР-буфере в течение 5-10 мин.

245. Затем препараты инкубируют в АР-буфере с NBT и BCIP в течение 15-20 мин.

246. Реакцию останавливают отмывкой препаратов в HBS.

247. Затем препараты отмывают в дистиллированной воде, тщательно высушивают, покровные стекла с монослоем исследуемых;,, клеток приклеивают при помощи кедрового бальзама к предметным стеклам. . .

248. Оценку колориметрической реакции проводят в световом микроскопе. Молекулы РгРс н РгР5® в результате иммуноокрашивания выявляются в виде синих субстанций.

249. ВЫПОЛНЕНИЕ ИММУНОЦИТОХИМИЧЕСКОГО АНАЛИЗА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СПЕЦИФИЧЕСКИХ ПЕРВИЧНЫХ АНТИ-РгР05* АНТИТЕЛ И ВТОРИЧНЫХ АНТИВИДОВЫХ АНТИТЕЛ, МЕЧЕНЫХ ПЕРОКСИДАЗОЙ ХРЕНА.

250. Препараты клеток, предназанченные для эксперимента, готовят в соответствии свышеописанной методикой (см. 5 раздел)

251. Препараты, зафиксированные для определения агента скрепи, подвергают гидратнро-ванному автоклавнрованию при 121 °С в течение 30 мин.

252. Препараты (для определения агента скрепи) инкубнруют в 3 М растворе гуаниднна изотнацианата в, течение 10-15 мин. при комнатной температуре. Эту процедуру и все последующие выполняют при слабом покачивании на шуттеле.

253. Отмывают трижды в дистиллированной воде.

254. Для блокировки неспецнфнческого связывания антител препараты инкубируют в течение 1 часа при комнатной температуре в PBS с 10% (w/v) сухого обезжиренного молока.

255. Затем препараты инкубируют с первичными антителами, разведенными в PBS с 0,2% БСА и 0,2% MaN3 при комнатной температуре в течение 1-2 часов или в течение ночи при 4°С. Разведение антител производят согласно инструкции.

256. Препараты отмывают в PBS три раза по 15 мин.

257. Затем препараты инкубируют со вторичными антитела, растворенными в PBS, содержащем 0,2% BSA в течение 30-60 мин.

258. Отмывают в PBS три раза по 15 мин.

259. Затем препараты помещают в хромогенный раствор для визуализации реакции, который готовят непосредственно перед использованием. Реакцию проводят в темном месте в течение 10-15 мин.