Селекция ДНК-аптамеров к бактериям S. enteritidis и S. typhimurium, их свойства и применение тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, кандидат наук Коловская, Ольга Сергеевна

• Коловская, Ольга Сергеевна
• кандидат наук
• 2014

Оглавление диссертации кандидат наук Коловская, Ольга Сергеевна

ОГЛАВЛЕНИЕ

Введение

1. Обзор литературы

1.1. Аптамеры

1.2. Мишени аптамеров

1.3. Афинность и специфичность аптамеров

1.4. Конформации аптамеров

1.5. Библиотеки, использующиеся для селекции аптамеров

1.6. Технологии получения аптамеров

1.7. Модификации аптамеров

1.8. Анализ аптамеров

1.9. Использование аптамеров в качестве диагностических средств

1.10. Идентификация новых биомаркеров в результате клеточной селекции аптамеров

1.11. Использование аптамеров в качестве средств терапии

1.12. Использование аптамеров в качестве средств для создания антибиотиков нового поколения

1.13. Использование аптаемров в качестве средств для создания антибиотиков нового поколения

2. Материалы и методы исследований

2.1 Материалы и оборудование

2.2. Объекты селекции

2.3 Селекция аптамеров к клеточным стенкам сальмонелл с различной лекарственной устойчивостью

2.4 Исследование афинности и специфичности связывания аптамеров с разными видами сальмонелл

2.5. Клонирование аптамеров

2.6. Амплификация аптамеров

2.7. Осаждение ДНК-аптамеров и определение концентрации ДНК

2.8. Определение кажущихся констант диссоциации аптамеров к S. typhimiiriwn и S. enteritidis

2.9. Исследование антибактериального эффекта аптамеров к S. typhimurium и

S. enteritidis

2.10. Определение чувстительности сальмонелл к антибактериальным препаратам с помощью аптамеров

2.11. Генотипирование сальмонелл S. enteritidis и S. typhimurium

2.12. Статистические методы исследования

3. Результаты исследований и их обсуждение

3.1. Селекция и определение аффинности и специфичности связывания полученных аптамеров к бактериям-мишеням

3.2. Клонирование и секвенирование пулов аптамеров

3.3. Определение кажущихся констант диссоциации аптамеров

3.4. Проверка антибактериального эффекта аптамеров к аптамеров к Я. ЬурЫтигшт и & егЛегШ&й

3.5. Определение чувствительности сальмонелл к антибактериальным препаратам с помощью аптамеров

3.6. Выявление Я. еШегШсИз и б1, фркгтигшт в клеточных суспензиях с

помощью аптамеров

Заключение

Выводы

Список цитируемой литературы

з

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

оцДНК - одноцепочечная дезоксирибонуклеиновая кислота

dNTP - дезокситрифосфаты

ИФА - иммуноферментный анализ

АТФ - аденозинтрифосфорная кислота

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РНК - рибонуклеиновая кислота

РПГА - реакция пассивной гемагглютинации

Kd - константа диссоциации

PBS - фосфатный буфер

SELEX - Системная Эволюция Лигандов Экспоненциальным Обогащением

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Селекция ДНК-аптамеров к бактериям S. enteritidis и S. typhimurium, их свойства и применение»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования

Разработка технологии создания новых средств диагностики и терапии - одно из наиболее актуальных направлений развития современной персонализированной медицины. В последнее время в качестве лекарственных препаратов стали использовать биофармацевтики, среди которых все более популярными становятся аптамеры, представляющие собой фрагменты однонитевой РНК или ДНК. При взаимодействии комплементарных участков цепи олигонуклеотиды образуют уникальные трехмерные структуры, способные к различного рода взаимодействиям и связям с функциональными группами молекулярных мишеней, что определяет их способность к специфическому связыванию (Кульбачинский A.B., 2006; Радько С.П. и др., 2007; Спиридонова В.А., 2010; Patel D.J., Suri А.К., 2000; Spiridonova V.A., Kopylov A.M., 2002; Iliuk A.B. et al., 2011). Благодаря своей уникальной конформации, аптамеры могут связываться с любыми биологическими мишенями, что создает основу для разработки на их основе эффективных диагностических и терапевтических препаратов.

Преимущества аптамеров заключаются в том, что их можно химически синтезировать, модифицировать красителями, метками, токсинами, что позволяет использовать их в различных целях. Кроме того, аптамеры термостабильны, а при потере аффинности их свойства могут быть легко восстановлены (Iliuk A.B. et al., 2010). И, наконец, аптамеры неиммунногенны и нетоксичны (Ulrich H., 2006).

Спектр применения аптамеров, обладающих высоким сродством к мишеням, достаточно широк - от визуализации и количественной детекции мишеней (Iliuk A. et al., 2011) до использования их в качестве терапевтических препаратов или для адресной доставки лекарственных средств (Давыдова A.C. и др., 2011; Ulrich H., 2006).

Одним из наиболее важных объектов для селекции аптамеров, наряду с

другими, являются бактериальные клетки, что вызвано необходимостью очень быстро и точно определять наличие патогенов в биологических жидкостях и пищевых продуктах, поскольку известно, что до 30% населения промышленно развитых стран ежегодно страдает болезнями пищевого происхождения. Из всех возбудителей кишечных инфекций наибольшую опасность представляют сальмонеллы вследствие того, что они вызывают генерализацию инфекционного процесса, часто заканчивающегося эндартериитом, циррозом печени, септическим артритом, менингитом, остеомиелитом, пневмонией и другими заболеваниямии (Pegues D.A. et al., 2005).

В связи с распространением кишечных инфекций остро стоит проблема определения их возбудителей, как в продуктах питания, так и в биологических жидкостях, поскольку успешный прогноз в лечении инфекционных заболеваний зависит от ранней идентификации микроорганизма, анализа его патогенности и лекарственной устойчивости.

Существующие методы детекции микроорганизмов существенно варьируют по времени исследования: от 30 минут до 24 часов (Дубинина И.Г. и др., Сакаль H.H., 1993) и, к тому же, по-прежнему существует проблема недостаточной чувствительности и специфичности этих методов, поскольку необходимо не просто определить наличие патогена, но и установить его жизнеспособность.

Кроме того, в настоящее время отмечается рост количества высокопатогенных штаммов возбудителей инфекционных заболеваний, эффективность лечения которых напрямую зависит от резистентности бактерий к применяемым в лечении антибиотикам. Инфекции, вызываемые резистентными микроорганизмами, чаще приводят к летальному исходу и затрудняют борьбу с инфекционными заболеваниями, поскольку пациенты остаются носителями заболевания на протяжении длительного времени, что способствует передаче устойчивых штаммов другим людям. В связи с постоянным повышением лекарственной устойчивости бактерий медицина

нуждается в быстрых, обладающих высокой точностью методиках определения степени резистентности микроорганизмов к антибактериальным препаратам.

Недостатки традиционных способов диагностики и терапии позволяют преодолеть методы с использованием аптамеров, хотя опыт их применения для детекции возбудителей кишечных инфекций ограничен (ДоэЫ Я., 2007; В\^уесН Н.Р., 2007).

Цель работы - получение аптамеров к двум серотипам сальмонелл - Я. еМегШсИя и & 1урЫтипит, обладающих разной патогенно стью и чувствительностью к антибиотикам, и исследование их диагностических и терапевтических свойств.

Задачи:

1. Подобрать уникальные последовательности ДНК-аптамеров к 5. еМегШсИя и & 1урМтигшт с помощью технологии се11-8ЕЬЕХ, определить их специфичность и аффинность и выбрать из них наиболее специфичные к & еМегШсИз и Я. 1урЫтипит.

2. Разработать на основе ДНК-аптамеров способ выявления возбудителей сальмонеллеза (£. еЫегШсИз и Я. ЬурЫтигтт) в биологических жидкостях.

3. Исследовать биологический эффект ДНК-аптамеров к Я. еЫегШ<Ив и & typЫmurium.

4. Разработать на основе ДНК-аптамеров способ определения антибиотикоустойчивости.

Научная новизна исследования

1. Впервые получены ДНК-аптамеры к 5". еЫегШсИз.

2. Впервые показано, что смесь синтетических ДНК-аптамеров к Б. еШегШсИБ и РурЫтипит подавляют бактериальный рост, что показывает

возможность создания на основе ДНК-аптамеров антибиотиков нового поколения.

3. Впервые аптамеры были использованы для создания метода определения чувствительности сальмонелл S. enteritidis и S. typhimurium к антибактериальным препаратам.

Теоретическая и практическая значимость работы

На основе полученных уникальных последовательностей аптамеров к бактериям S. enteritidis и S. typhimurium могут быть разработаны диагностические тест-системы для определения возбудителей сальмонеллеза и определения их антибиотикоустойчивости. Кроме того, ДНК-аптамеры могут стать основой для создания бактериостатических препаратов при лечении сальмонеллеза и средством адресной доставки антибактериальных препаратов.

Апробация результатов исследования

Результаты исследования представлялись на конференции с международным участием «Молекулярно-генетические методы диагностики инфекционных заболеваний», 2012 (г. Красноярск), X съезде научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов «Итоги и перспективы обеспечения эпидемиологического благополучия населения Российской Федерации, 2012 (г. Москва), семинарах ассоциированной Российско-Канадской лаборатории BioMeT, Международном Симпозиуме 13th Tetrahedron Symposium, 2012 (Тайбэй, Тайвань) и Международной конференции OTS, 2013 г. (Неаполь, Италия).

Основные положения, выносимые на защиту

1. С помощью технологии cell-SELEX получены высокоаффинные и специфичные пулы ДНК-аптамеров к живым бактериям - S. enteritidis и S. typhimurium.

2. ДНК-аптамеры 7-го раунда селекции являются наиболее аффинными и специфичными к S. enteritidis и S. typhimurium с кажущимися константами диссоциации 12 нМ и 7 нМ, соответственно.

3. С помощью бактериального клонирования и секвенирования определены уникальные последовательности ДНК-аптамеров, обладающие высокой степенью аффинности и специфичности к S. enteritidis и S. typhimurium.

4. ДНК-аптамеры связываются только с живыми сальмонеллами, что позволяет выявлять устойчивость бактерий к антибактериальным препаратам.

5. С помощью ДНК-аптамеров можно идентифицировать S. enteritidis и S. typhimurium в биологических жидкостях и смывах с пищевых продуктов.

6. Пул синтетических ДНК-аптамеровы к сальмонеллам S. enteritidis и S. typhimurium подавляет рост колоний бактерий S. enteritidis и S. typhimurium.

Внедрение результатов исследования

Методический материал по селекции аптамеров включен в курс лекций по биотехнологии для студентов 5 курса фармацевтического факультета КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Минздрава России.

Полученные ДНК-аптамеры и методики используются в научно-исследовательской работе лаборатории на базе НИИ Молекулярной медицины и патобиохимии КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Минздрава России для создания тест-систем для выявления возбудителей сальмонеллеза.

Публикации

Основные положения диссертации опубликованы в 6 рецензируемых статьях, в том числе, 3 - в зарубежной печати.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 116 страницах машинописного текста и состоит из списка сокращений, введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа иллюстрирована 40 рисунками, 8 таблицами. Список литературы состоит из 173 источников, из которых 12 - российских и 161 - зарубежный.

Личный вклад автора

Автором было принято непосредственное участие в планировании экспериментов, самостоятельно подобраны ДНК-аптамеры к ¿>. еШегШсИя и Я. IурМтипит, сформулирована гипотеза о бактериостатическом эффекте ДНК-аптамеров по отношению к возбудителям сальмонеллеза, лично проведены исследования и анализ полученных результатов.

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства здравоохранения Российской Федерации и Министерства образования и науки Российской Федерации в рамках Федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2013 годы» (Государственный контракт № 16.512.11.2107).

Глава 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Аптамеры

Нуклеиновые кислоты играют важную роль в сохранении и реализации генетической информации. Однако в последние десятилетия особое внимание стали уделять изучению функциональных нуклеиновых кислот,, к которым относят оцДНК или РНК со специфическими биологическими функциями, формирующие трехмерные структуры и способные связываться с различными мишенями. Среди функциональных нуклеиновых кислот выделяют две наиболее важные группы - рибозимы и аптамеры. Рибозимы и дезоксирибозимы - ферменты, катализирующие специфические химические реакции. Аптамеры — аналоги белковых антител, представляющие собой олигонуклеотиды, связывающиеся со специфическими лигандами (Кульбачинский A.B., 2006; Радько С.П. и др., 2007; Спиридонова В.А., 2010; Patel D.J., Suri А.К., 2000; Spiridonova V.A., Kopylov A.M., 2002; Iliuk A.B.. et al., 2011). Одной из основных причин, по которым нуклеиновые кислоты начали широко использоваться в научных исследованиях, является то, что их можно легко синтезировать, амплифицировать и модифицировать.

Аптамеры представляют собой новый класс синтетических аффинных реагентов на основе олигонуклеотидов, которые получают с помощью процедуры селекции in vitro или in vivo. Впервые они были получены тремя независимыми исследовательскими группами в 1990 году (Ellington A.D., Szostak J.W., 1990; Robertson D.L., Joyce G.F., 1990; Tuerk С., Gold L., 1990). Благодаря уникальным вторичным и третичным структурам, аптамеры обладают высокой селективностью и аффинностью к своим мишеням (Iliuk A.B. et al., 2011).

По своей химической природе аптамеры представляют собой короткие одноцепочечные фрагменты ДНК либо РНК длиной от 30 до 80 нуклеотидов, формирующие трехмерные структуры и связывающиеся с лигандами за счет

комплементарных взаимодействий. Каждый олигонуклеотид имеет константные области, необходимые для посадки праймеров при амплификации, состоящие из 20 нуклеотидов, и область случайных нуклеотидных последовательностей (Рис.1).

Константная Область случайных Константная

область последовательностей область

(-20 нк) (-40 нк) (-20 нк)

Рисунок 1 - Структура аптамера

Функционально аптамеры являются аналогами белковых антител, обладающих в силу своих физико-химических свойств и способа получения рядом преимуществ: высокой специфичностью, стабильностью, слабой иммуногенностью. Различия между аптамерами и антителами представлены в таблице 1.

Таблица 1. Различия между аптамерами и антителами

Аптамеры Антитела

ДНК/РНК олигонуклеотиды Белки

Длина (15-80 нуклеотидов, 5-25 кДа) Молекулярная масса (150 кДа)

Стабильны Нестабильны

Синтезируются химически Невозможно синтезировать. Для получения необходимы животные.

Легко модифицируются Не модифицируются

Слабо иммуногенны Иммуногенны

Высоко чувствительны к молекулярным мишеням Высоко чувствительны к молекулярным мишеням

1.2 Мишени аптамеров

В качестве мишеней при отборе аптамеров методом селекции in vitro используют рекомбинантные белки клеточной поверхности или целые клетки. Первые эксперименты по селекции аптамеров были проведены на небольших органических молекулах (Ellington A.D., Szostak J.W., 1990). После того как было выяснено, что аптамеры можно подбирать к белкам и целым клеткам, исследования были смещены в сторону более крупных объектов. Чем больше мишень, тем больше она имеет функциональных групп и структурных мотивов и тем больше она образует с аптамерами водородных связей, электростатических и гидрофобных взаимодействий, что приводит к увеличению аффинности и специфичности (Mascini М., 2009). Несмотря на то, что в настоящее время для селекции аптамеров стали чаще использовать белки и клетки, подбор аптамеров к небольшим молекулам остается актуален. Молекулы небольших размеров зачастую играют ключевую роль в биологических процессах, поскольку способны транспортироваться через клеточные мембраны (Cho M.J., Juliano R., 1996), но они могут быть и опасными для жизнеднеятельности клетки, например, токсины и канцерогены, или, наоборот, необходимы для восстановления гомеостаза, например, лекарства и метаболиты (Ashour M.L., Wink М., 2011). Вследствие этого, аптамеры к молекулам небольших размеров могут найти широкое применение в медицине, сельском хозяйстве, экологии.

В последнее время стали широко применять селекцию олигонуклеотидов к белкам и клеткам. И, несмотря на то, что наиболее часто используют селекцию к очищенным белкам, применение клеток в качестве мишеней обладает важными преимуществами и, в частности, возможностью идентификации новых биомаркеров (Давыдова A.C. и др., 2011; Berezovski М. et al., 2008).

Для увеличения селективности и специфичности аптамеров к конкретным клеткам из пула с помощью негативной селекции исключают

неспецифические аптамеры. Конкретные белковые мишени при селекции к целым клеткам и тканям остаются неизвестными и их идентификация затруднительна. В связи с этим большинство исследователей предпочитает подбирать аптамеры к уже известным рекомбинантным белкам, даже, несмотря на то, что их аффинность и селективность по отношению к целым клеткам будет снижена.

В настоящее время у исследователей сложилось следующее предпочтение в отношении выбора мишеней для селекции аптамеров: 71% — белки, 19% - маленькие молекулы, 7% - клетки, 3% - вирусы (Labib M., et al., 2012; Muharemagic D. et al, 2012). Несмотря на то, что аптамеры к небольшим молекулам сейчас составляют лишь малую часть, большинство их успешно и широко исследуется, в частности, аптамеры к АТР и тромбину, кокаину и теофиллину (Mascini M. et al., 2012). Такие низкомолекулярные молекулы, как АТР, кокаин и теофиллин, - идеальные мишени для олигонуклеотидов (Jayasena S.D., 1999; Michael F., 1999), поскольку аптамеры, связываясь с ними, достигают высокой степени селективности. В частности, высокая степень селективности аптамеров доказана на энантиомерах олигопептидов (Famulok M., 1994; Famulok M., Szostak J.W., 1992; Michaud M. et al., 2003) и других небольших молекулах (Mehta J. et al., 2012; Wang L. et al., 2012; Xu S. et al., 2012).

Таким образом, мишенями для аптамеров могут стать белки, небольшие молекулы, живые клетки, вирусы, твердые частицы и т.д.

1.3 Аффинность и специфичность аптамеров

Аптамеры могут обладать очень высокой аффинностью по отношению к своим мишеням. Наилучшими мишенями для отбора аптамеров являются белки, имеющие константы диссоциации (I<d) комплексов аптамеров с белковыми мишенями в наномолярном и пикомолярном диапазоне. В случае

(л П

различных низкомолекулярных мишеней Kj обычно составляют от 10 до 10"

М. Более высокое сродство аптамеров к белковым мишеням объясняется тем, что в таких комплексах больше площадь контакта аптамера с молекулой-мишенью.

Помимо этого, аптамеры обладают большой специфичностью к молекулярной мишени, что позволяет с высокой вероятностью ее идентифицировать (Yang L., Schepartz А., 2005). Это можно объяснить тем, что наиболее аффинные лиганды имеют большую площадь взаимодействий с мишенью и образуют с ней очень плотные "комплементарные" контакты.

Способность аптамеров различать похожие белки определяется местом связывания с белком-мишеныо (Кульбачинский A.B., 2006; Радько С.П. и др., 2007; Спиридонова В.А., 2010; Patel DJ., Suri А.К., 2000; Spiridonova V.A., Kopylov A.M., 2002; Iliuk A.B. et al., 2011). Если аптамер связывается с вариабельным районом белковой молекулы, то взаимодействие будет более специфичным, чем при связывании с консервативным районом, так как в первом случае узнаваемый эпитоп будет сильнее отличаться даже у родственных белков. Таким образом, уровень гомологии белков, определяющий специфичность аптамеров, может различаться. Аптамеры к белку Rev вируса HIV-1 узнают белок вируса HIV-2, хотя эти белки идентичны всего на 65% (Yamamoto R et al., 2000). Аптамеры к протеинкиназе С не взаимодействуют с близкородственной изоформой фермента, отличающейся всего на 4% (Conrad R. et al., 1994). Точечные мутации в аптамерах к тромбину (Tsiang М. et al., 1995), репликазе вируса гепатита С (Biroccio A. Et al., 2002) и обратной транскриптазе вируса ШУ-1 (Fisher T.S. et al., 2002) значительно ухудшали связывание аптамера с мишенью (Kj комплексов увеличивалась более чем в 100 раз). Таким образом, аптамеры способны различать белки, отличающиеся даже единственной аминокислотной заменой.

Специфичность аптамеров в процессе отбора к белку-мишени можно контролировать. Так, если требуется получить аптамер, обладающий очень высокой специфичностью, то в ходе селекции отбирают последовательности,

связывающиеся с белком-мишеныо, но не взаимодействующие с другим близкородственным белком. Наоборот, при получении аптамера, способного узнавать несколько родственных белков, отбирают последовательности, способные связываться с несколькими белками-мишенями (toggle-SELEX) (Спиридонова В.А., 2010; White R. et al., 2001).

Методы, использующиеся для определения аффинности и специфичности аптамеров, достаточно разнообразны и зависят от размеров мишени. Одним из наиболее популярных методов определения аффинности аптамеров к мишени является метод, основанный на определении интенсивности флуоресценции (Flinders J. et al., 2004.) меченых аптамеров, связавшихся с мишенью. Другой метод (также основанный на флуоресценции) оценивает изменение величины поляризации при связывании аптамеров с мишенью (Cruz-Aguado J.A., Penner G., 2008). Для определения Kd используют измерение величины флуоресценции (Labib М. et al., 2012), поглощение в области ультрафиолета (Guedin A. et al., 2010), методы кругового дихроизма (Lin Р. et al., 2011), ЯМР-спектроскопии (Lee J.H. et al., 2005), поверхностного плазмонного резонанса, высокоэффективной жидкостной хроматографии (Deng Q. et al., 2001), капиллярного электрофореза (Drabovich А.Р. et al., 2006; Bao J. et al., 2011) и некоторые другие.

1.4 Конформации аптамеров

Характерной особенностью аптамеров является способность к формированию выраженной вторичной структуры, которую изучают с использованием анализа консервативных мотивов, компьютерного моделирования и ферментативного пробинга.

Выяснено, что наиболее важными для специфического взаимодействия аптамеров с мишенями являются неспаренные участки олигонуклеотидов. Участки со стабильной вторичной структурой необходимы для поддержания

правильного взаиморасположения элементов узнавания (Patel D.J. et al., 1997; Patel D.J. et al., 2000; Ringquist S. et al., 1995). Это подтверждается тем, что многие участки аптамеров в свободном виде неструктурированы и приобретают стабильную конформацию только после связывания с мишенью (Convery М.А. et al., 1998; Hermann Т., Patel D. J. 2000). В основе аптамера, как правило, лежат один-два структурных мотива.

Специфичность аптамеров обусловлена огромным многообразием возможных конформаций (шпильки, псевдоузлы и G-квартеты) (рис.2), которые могут приобретать олигонуклеотиды, функциональные группы которых участвуют в образовании водородных связей, электростатических и ван-дер-ваальсовых взаимодействий с функциональными группами молекулярной мишени (Кульбачинский A.B., 2006; Радько С.П. и др., 2007; Спиридонова В.А., 2010; Bürge S. et al., 2006).

1

Рисунок 2 - Вторичные структуры, образуемые аптамерами: 1,4 - шпильки, 2

- псевдоузел, 3 - G-квартет

Аптамеры к белкам узнают специфические участки поверхности мишени - эпитопы (Petach Н., Gold L., 2002). Поскольку при отборе аптамеров в качестве мишени используют белки, находящиеся в нативном состоянии, то в состав эпитопа, узнаваемого аптамерами, могут входить несколько участков белка, сближенных в трехмерной структуре (Xu W.,

Ellington A. D. 1996) и денатурированные белки (Bianchini М. et al., 2001). Взаимодействие происходит с помощью индуцированного сродства и при связывании с пептидом аптамер приобретает нужную конформацию. В ходе отбора один эпитоп белка-мишени может стать доминантным при наличии многих других потенциальных сайтов связывания олигонуклеотидов. Даже при наличии существенных различий в нескольких экспериментах по отбору аптамер ов полученные лиганды часто имеют общую структуру и связываются с одним и тем же эпитопом белка-мишени (Fitter S., James R., 2005).

Большинство отобранных последовательностей формирует один и тот же класс аптамеров, имеющих структуру псевдоузла, и взаимодействующих в области природного РНК-связывающего центра фермента. В других исследованиях было обнаружено, что использование в качестве мишени для отбора аптамеров изолированного рибосомного белка S1, целой 30S-субчастицы рибосомы, а также репликазы фага приводит к выявлению одного и того же класса аптамеров, которые взаимодействуют с белком S1, входящим в состав всех трех мишеней (Brown D., Gold L. 1995).

Даже разные классы аптамеров, отличающиеся по последовательности и трехмерной структуре, связываются с одинаковыми или перекрывающимися эпитопами белка-мишени (Kulbachinskiy A. et al., 2004), т.е., один и тот же эпитоп белка способен связывать несколько аптамеров с различной последовательностью нуклеотидов и, следовательно, вторичной и третичной структурой, что объясняется асимметричным распределением зарядов по поверхности белков (Darst S.A., 2001).

Доминирование одного или нескольких эпитопов проявляется при отборе аптамеров к мишеням, содержащим большое количество разных белков, например, отбор аптамеров к вирусным частицам (Muharemagic D. et al., 2012), клеткам трипаносом (Homann М., Goringer H.U., 1999), мембранам эритроцитов (Morris K.N. et al., 1998), культурам клеток (Cerchia L. et al., 2005), плазме крови (Fitter S., James R., 2005), кровеносным сосудам (Blank

f

M. et al., 2001) и др. В результате селекции может быть получено только несколько классов аптамеров, несмотря на наличие многих тысяч различных белковых мишеней. Например, аптамеры к клеткам глиобластомы специфичны к белку внеклеточного матрикса TN-C (tenascin-C) (Hicke B.J. et al., 2001). При отборе аптамеров к белкам плазмы крови большая часть лигандов оказывается специфична к протромбину (Fitter S., James R., 2005), а при отборе аптамеров к активированным нейтрофилам лиганды узнают эластазу мембран нейтрофилов и имеют ту же структуру, что и аптамеры к изолированной эластазе (Charlton J. et al., 1997).

Доминирование при отборе ограниченного числа различных эпитопов объясняется техникой отбора in vitro, в ходе которого осуществляется амплификация небольшого числа последовательностей, которые с наибольшей эффективностью связываются с мишеныо, тогда как остальные постепенно исключаются из библиотеки. В частности, на начальных стадиях отбора аптамеров к белкам плазмы крови в обогащенной библиотеке присутствуют аптамеры ко многим белкам, а в следующих раундах селекции число разных классов аптамеров значительно сокращается (Fitter S., James R. 2005). Следовательно, сокращение числа раундов при отборе может приводить к выявлению большего числа разных классов аптамеров. С этой позиции наиболее перспективным методом отбора аптамеров является метод капиллярного электрофореза, предложенный М. Berezovski с соавторами, позволяющий получать высокоаффинные аптамеры в одну стадию без проведения амплификации библиотеки (Berezovski М. et al., 2005; Berezovski М. et al, 2006).

Исследования трехмерных структур комплексов аптамеров с белковыми мишенями немногочисленны. В частности, с помощью рентгеноструктурного анализа была определена структура комплексов аптамеров с тромбином (Yuminova A.V. et al., 2012; Varizhuk A.M. et al., 2013), белком оболочки фага MS2 (РНК-аптамеры), обратной транскриптазой вируса HIV-1 (РНК-

аптамер), транскрипционным фактором NF-кВ (РНК-аптамер) и РНКП II S. cerevisiae (РНК-аптамер).

Согласно некоторым исследованиям при формировании комплекса аптамера с белком он может сохранять ту же конформацию, которую он имел в растворе (Bock L.C. et al., 1992; Padmanabhan К. et al., 1993; Schultze P. et al., 1994). Специфичность узнавания аптамера определяется трехмерной структурой олигонуклеотида (Tasset D.M. et al., 1997). При изучении комплекса тромбина с аптамером выяснено, что лиганд связывается' с гепарин-связывающим сайтом с помощью плотных контактов, включающих стэкинг-взаимодействия адениновых оснований с остатками аргинина белка (Long S.B. et al., 2008).

При исследовании комплексов разных аптамеров с белком оболочки фага MS2 было обнаружено, что конформация белка при связывании аптамеров не меняется, а структура РНК претерпевает определенные изменения. При этом вирусная РНК и аптамеры содержат два неспаренных адениновых остатка, которые в свободной РНК уложены в стопку между двумя спиральными участками, а в комплексе с белком выпетливаются' и оказываются вне спирали. Для специфического узнавания аптамера важны всего три основания РНК: два аденина, образующих водородные связи внутри гидрофобных карманов белковой молекулы, и цитозин, участвующий в стэкинг-взаимодействии с одним из тирозинов. Кроме этого, во взаимодействии с белком MS2 участвуют остатки рибозы и фосфатные группы (Rowsell S. et al., 1998).

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Коловская, Ольга Сергеевна, 2014 год

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Давыдова, A.C., Воробьева, М.А., Веньяминова, А.Г. Эскорт-аптамеры: новые инструменты для направленной доставки лекарственных препаратов в клетки// Acta naturae. — 2011.-Т. 3. — С. 13-31.

Дубинина, И.Г., Щербо, С.Н., Макаров, В.Б. Методы полимеразной цепной реакции в лабораторной практике // Клиническая лабораторная диагностика. - 1997. — №7. — С. 4-6.

Егорова, С.А., Забровская, A.B., Матвеева, З.Н., Кафтырева, Л.А. Чувствительность сальмонелл, выделенных из различных источников на территориях Северо-западного федерального округа, к антимикробным препаратам // Журнал инфектологии. - 2010. - Т.2 -С. 63.

Иванов, A.C. Современные представления об антибиотикорезистентности и антибактериальной терапии сальмонеллезов // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. - 2009. - Т.11 - С.305-326.

Козлова, Н.С., Гладилин, Д.П., Липатова, Л.А., Зайцева, Т.К., Чибисов, A.B. Антибиотикорезистентность сальмонелл, выделенных в Санкт-Петербурге и Ленинградской области в 1992-2000 гг. // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. - 2001. -П. 1.-С. 20.

Коловская, О.С., Замай, Т.Н., Замай A.C., Глазырин, Ю.Е., Спивак, Е.А., Зубкова, O.A., Кадкина, A.A., Еркаев, E.H., Замай, Г.С., Савицкая, А.Г., Труфанова, Л.В., Петрова, Л.Л., Березовский, М.В. Взаимодействие ДНК-аптамер/белок как причина апоптоза и остановки пролиферации в асцитных клетках карциномы Эрлиха . // Биологические мембраны. - 2013. - Т.30. - С.398-411.

Кульбачинский, А.В. Методы отбора аптамеров к белковым мишеням // Успехи биологической химии. - 2006. - Т. 46. - С. 193-224;

Радько, С.П., Бодоев, С.Ю., Рахметова, Н.В., Арчаков, А.И. Аптамеры как перспективные аффинные реагенты для клинической протеомики // Биомедицинская химия. - 2007. - Т. 53. - С. 5-24.

Сакаль, Н.Н. Применение и оценка эффективности иммуноферментного анализа в ранней диагностике и прогнозировании течения дизентерии Зоне // Автореф. Дисс. канд. мед. наук. - 1993. - С. 21.

Семина, Н.А., Сидоренко, С.В., Резван, С.П. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам // Клиническая микробиология и антибактериальная химиотерапия. -2004. -Т.6. - С.306-359.

Спиридонова, В.А. Молекулярные узнающие элементы ДНК-/РНК-аптамеры к белкам // Биомедицинская химия. - 2010. -Т. 56. - С. 639-656.

Ющук, Н.Д., Бродов, JI.E. Острые кишечные инфекции: диагностика и лечение// Медицина. - 2001. - С. 50.

Ashour, M.L., Wink., М. Genus Bupleurum: a review of its phytochemistry, pharmacology and modes of action // J. Pharm. Pharmacol. - 2011.-V. 63.-P. 305-321.

Bao, J., Krylova, S. M., Reinstein, O., Johnson, P. E., Krylov, S. N. Label-free solution-based kinetic study of aptamersmallmolecule interactions by kinetic capillary electrophoresis with UV detection revealing how kinetics control equilibrium // Anal. Chem. -2011. - V. 83. - P. 83878390.

Boyle-Vavra, S., Darum, R.S. Community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus: the role of Panton-Valentine leukocidin // Lab.Invest. - 2007. - V. 87. - P.3-9.

Berezovski, M., Drabovich, A., Krylova, S. M., Musheev, M., Okhonin, V., Petrov, A., Krylov, S. N. Nonequilibrium capillary electrophoresis of equilibrium mixtures: a universal tool for development, of aptamers//J. Am. Chem. Soc. - 2005.-V. 127.-P. 3165-3171.

Berezovksi, M., Lechmann, M., Musheev, M.U., Mak, T.W., Krylov, S. N. Aptamer-facilitated biomarker discovery // J. Am. Chem. Soc. - 2008. -V.130.- P.9137-9143.

Berezovski, M., Musheev, M.U., Drabovich, A. P., Jitkova, J. V., Krylov, S. N. Non-SELEX: selection of aptamers without intermediate amplification of candidate oligonucleotides // Nat. Protoc. - 2006. - V.l. -P.1359-1369.

Berezovksi, M. Lechmann, M., Musheev, M.U., Mak, T.W., Krylov, S.N. Aptamer-facilitated biomarker discovery // J. Am. Chem. Soc. - 2008. -V.130. - P.9137-9143.

Berezovski, M., Musheev, M., Drabovich, A., Krylov, S.N. Non-SELEX Selection of Aptamers // J. Am. Chem. Soc. - 2006. - V.128. -P.1410-1411.

Bianchini, M., M.Radrizzani, Brocardo, M. G., Reyes, G. B., Gonzalez Solveyra, C., Santa-Coloma, T. A. Specific oligobodies against ERK-2 that recognize both the native and the denatured state of the protein // J. Immunol. Methods. - 2001.-V. 252.-P. 191-197.

Biroccio, A., Hamm, J., Incitti, I., De Francesco, R., Tomei, L. Selection of RNA aptamers that are specific and high-affinity ligands of the hepatitis C virus RNA-dependent RNA polymerase // J. Virol. - 2002. -V.76. -P.3688- 3696.

Blank, M. Weinschenk, T., Priemer, M., Schluesener, H. Systematic evolution of a DNA aptamer binding to rat brain tumor microvessels. Selective targeting of endothelial regulatory protein pigpen// J. Biol. Chem. - 2001.-V. 276.-P. 16464-16468.

Bock, L. C., Griffin, L. C., Latham, J. A., Vermaas, E. H., Toole, J. J. Selection of single-stranded DNA molecules that bind and inhibit human thrombin // Nature. - 1992. - V. 355. - P. 564-566.

Bouchard, P.R., Hutabarat, R.M., Thompson, K.M. Discovery and Development of Therapeutic Aptamers // Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. -2010.- V.50. - P.237-257.

Brown, D., Gold, L. Template recognition by an RNA-dependent RNA polymerase: identification and characterization of two RNA binding sites on Q beta replicase // Biochemistry. - 1995. - V. 34. - P. 14765-14774.

Bruno, J. Carrillo, M., Phillips, T., Andrews C. A Novel Screening Method for Competitive FRET-Aptamers Applied to E. coli Assay Development//J. Fluoresc. - 2010. - V. 20.-P. 1211-1223.

Bürge, S., Parkinson, G.N., Hazel, P., Todd, A.K., Neidle, .S. Quadruplex DNA: sequence, topology and structure // Nucleic Acids Res. -2006.-V.34. -P. 5402-5415.

Burke, D. H., Willis, J. H. Recombination, RNA evolution, and Afunctional RNA molecules isolated through chimeric SELEX // RNA. -1998. - V. 4. -P.1165-1175.

Cao, X., Li, S., Chen, L., Ding, H., Xu, H., Huang, Y., Li, J., Liu, N., Cao, W., Zhu Y. Combining use of a panel of ssDNA aptamers in the detection of Staphylococcus aureus // Nucleic Acid Res. - 2009. -V. 37. - P. 4621-4628.

Carrasquilo, K.G. Ricker, J. A., Rigas, I. K., Miller, J. W., Gragoudas, E. S., Adamis, A. P. Controlled delivery of the anti-VEGF aptamer EYE001 with poly(lactic-co-glycolic)acid microspheres // Invest. Ophthalmol. Vis. Sei. - 2003. - V. 44. - P.290-299.

Carattoli, A., Filetici, E., Villa, L., Dionisi, A. M., Ricci, A., Luzzi, I. Antibiotic resistance genes and Salmonella Genomic Island 1 in Salmonella enterica serovar Typhimurium isolated in Italy // Antimicrob. Agents Chemother.- 2002. - V. 46. - P. 2821-2828.

Cerchia, L. Duconge, F., Pestourie, C., Boulay, J., Aissouni, Y., Gombert, K., Libri, D. Neutralizing aptamers from whole-cell SELEX inhibit the RET receptor tyrosine kinase // PLOS Biol. - 2005. - V. 3. -P.123.

Chang, Y.-C., Yang, C. Y., Sun, R. L., Cheng, Y. F., Kao, W. C., Yang, P. C. Rapid single cell detection of Staphylococcus aureus by aptamer-conjugated gold nanoparticles // Sci. Rep. - 2013. - V.3. -Doi:10.1038/srep01863.

Charlton, J., Kirschenheuter, G. P., Smith D. Highly potent irreversible inhibitors of neutrophil elastase generated by selection from a randomized DNA-valine phosphonate library//Biochemistry. — 1997.— V. 36. - P.3018- 3026.

Chen, F. Zhou, J., Luo, F., Mohammed, A. B., Zhang, X. L. Aptamer from whole-bacterium SELEX as new therapeutic reagent against virulent Mycobacterium tuberculosis // Biochem. Biophys. Res. Commun — 2007. — V. 357. - P. 743-748.

Chen, F., Hu, Y., Li, D., Chen, H., Zhang, X. L. CS-SELEX generates high-affinity ssDNA aptamers as molecular probes for hepatitis C virus envelope glycoprotein E2 // PLOS One. -2009. -V. 4. - P. e8142.

Cho, M.J., Juliano, R. Macromolecular versus small molecule therapeutics: drug discovery, development and clinical considerations // Trends Biotechnol. - 1996. -V. 14. - P. 153-158.

Cho, E.J. Lee, J-W., Ellington A.D. Applications of aptamers as sensors //Annu. Rev. Anal. Chem. - 2009. - V.2. - P.241-264.

Conrad, R. Keranen, L. M., Ellington, A. D., Newton, A. C. Isozyme-specific inhibition of protein kinase C by RNA // J. Biol. Chem. - 1994. - V. 269.-P.32051-32054.

Convery, M. A. Crystal structure of an RNA aptamer-protein complex at 2.8 A resolution / M. A. Convery, S. Rowsell, N. J. Stonehouse, A. D.

Ellington, I. Hirao, J. B. Murray, D. S. Peabody, S. E. Phillips, P. G. Stockley //. Nature Structural and Molecular Biology. - 1998. -V. 5. - P.133-139.

on

Cramery, A. Stemmer Willem, P.C. 10 -Fold aptamer library amplification without gel purification // Nucleic Acid Res - 1993. - V. 21. -P.4410.

Cruz-Aguado, J. A., Penner G. Fluorescence polarization based displacement assay for the determination of smallmolecules with aptamers // Anal. Chem.- 2008.-V. 80. -P. 8853-8855.

Darst, S. A. Bacterial RNA polymerase // Curr. Opin. Struct. Biol. -2001. - V. 11.- P. 155-162.

Deng, Q., German, I., Buchanan, D., Kennedy, R. T. Retention and separation of adenosine and analogues by affinity chromatography with an aptamer stationary phase // Anal. Chem. - 2001. -V. -73. - № 22. -P. 54155421.

Donovan, M.J., Meng, L., Chen, T., Zhang, Y., Sefah, K., Tan, W. Aptamer-Drug Conjugation for Targeted Tumor Cell Therapy // Ther. Oligonucleotides. - 2011.-V. 764.- P. 141-152.

Drabovich, A. P. Berezovski, M., Okhonin, V., Krylov, S. N. Selection of smart aptamers by methods of kinetic capillary electrophoresis// Anal. Chem.-2006.- V. 78.- P. 3171-3178.

Duan, N., Wu, S., Chen, X., Huang, Y., Xia, Y., Ma, X., Wang, Z. Selection and Characterization of Aptamers against Salmonella typhimurium Using Whole-Bacterium Systemic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment (SELEX) // J. Agric. Food Chem. - 2013. - V. 61. - P. 32293234.

Dwivedi, H. Smiley, R., Jaykus, L.-A. Selection and characterization of DNA aptamers with binding selectivity to Campylobacter jejuni using whole-cell SELEX // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 2010. - V. 87. - P. 2323-2334.

Dwivedi, H.P., Smiley, R., Jaykus, L.-A. Selection of DNA aptamers for capture and detection of S. typhimurium using a whole-cell SELEX approach in conjunction with cell sorting // Appl Microbiol Biotechnol. -2013. - V.97. - P. 3677-3686.

Ellington, A.D., Szostak, J.W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands // Nature. -1990. - V. 346. - P.818-822.

Famulok, M. Molecular recognition of amino acids by RNA-aptamers: an L-citrulline binding RNA motif and its evolution into an L-arginine binder// J. Am. Chem. Soc. -1994. - V. 116.- P. 1698-1706.

Famulok, M., Szostak, J.W. Stereospecific recognition of tryptophan agarose by in vitro selected RNA // J. Am. Chem. Soc. - 1992. - V. 114.-P. 3990-991.

Farokhzad, O.C., Jon, S., Khademhosseini, A., Tran, T. N. T., LaVan, D. A., Langer, R. Nanoparticle-aptamer bioconjugates: a new approach for targeting prostate cancer cells // Cancer Res. - 2004. - V.64. - P.7668-7672.

Fisher,T. S. Joshi, P., Prasad, V. R. Mutations that confer resistance to template-analog inhibitors of human immunodeficiency virus (HIV) typé 1 reverse transcriptase lead to severe defects in HIV replication // J. Virol. -2002. - V.76. - P.4068-4072.

Fitter, S., James R. Deconvolution of a complex target using DNA aptamers //J. Biol. Chem. - 2005. - V.280. - P. 34193-34201.

Floege, J. Ostendorf, T., Janssen, U., Burg, M., Radeke, H. H., Vargeese, C., Janjic, N. Novel approach to specific growth factor inhibition in vivo antagonism of platelet-derived growth factor in glomerulonephrites by aptamers //Am. J. Pathol. - 1999. - V. 154. - P. 169-179.

Francischetti, I.M.B. Oliveira, C.J., Ostera, G.R. Defibrotide interferes with several steps of the coagulation-inflammation cycle and exhibits therapeutic potential to treat severe malaria // Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. - 2012. - V. 32. - P.786-798.

Golden, M.C., Collins, B. D., Willis, M. C., Koch, T. H. Potential of PhotoSELEX-Evolved ssDNA Aptamers // J. Biotechnol. - 2000. - V.81. -P.167-178.

Guedin, A., Lacroix, L., Mergny, J. L. Thermal melting studies of ligand DNA interactions // Methods Mol. Biol. - 2010. - V. 613. - P. 2535.

Hamula, C.L.A., Zhang, H., Guan, L. L., Li, X. F., Le, X. C. Selection of Aptamers against Live Bacterial Cells // Anal. Chem. - 2008. -V. 80. -P. 7812-7819.

Hermann, T., Patel, D. J. Adaptive recognition by nucleic acid aptamers // Science. - 2000. -. V. 287. - P. 820-825.

Hicke, B. J., Marion, C., Chang, Y. F., Gould, T., Lynott, C. K., Parma, D., Warren, S. Tenascin-C aptamers are generated using tumor cells and purified protein // J. Biol. Chem. - 2001. - V. 276. - P.48644-48654.

Hicke, B.J., Stephens, A.W., Gould, T., Chang, Y.-F., Lynott, C.K., Heil, J., Borkowski, S., Hilger, C.-S., Cook, G., Warren, S., Schmidt, P.G. Tumor targeting by an aptamer// J. Nucl. Med. - 2006. - V. 47. - P.668-678.

Homann, M., Goringer, H. U. Combinatorial selection of high affinity RNA ligands to live African trypanosomes // Nucleic Acids Res. - 1999. -V. 27.-P. 2006-2014.

Huang, C. J., Lin, H. I., Shiesh, S. C., Lee, G. B. Integrated microfluidic system for rapid screening of CRP aptamers utilizing systematic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX) // Biosens. Bioelectron. - 2010. - V. 25. - P. 1761-1766.

Hyeona, J.-Y., Chon, J. W., Choi, I. S., Park, C., Kim, D. E., Seo, K. H. Development of RNA aptamers for detection of Salmonella Enteritidis // J. Microbiol. Methods. - 2012. - V. 89. - P.79-82.

Iliuk, A.B., Martin, V. A., Alicie, B. M., Geahlen, R. L., Tao, W. A. In-depth Analyses of Kinase-dependent Tyrosine Phosphoproteomes Based on

Metal Ion-functionalized Soluble Nanopolymers // Mol. Cell. Proteomics-. -2010.-V.9.-P.2162-2172.

Iliuk, A.B. Hu, L., Tao W.A. Aptamer in bioanalytical applications // Anal. Chem. - 2011. - V.83.- P.4440-4452.

Irvine, D. Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment with integrated optimization by non-linear analysis //J. Mol. Biol. - 1991. -V. 222. - P. 739-761.

Ikanovic, M. Rudzinski, W. E., Bruno, J. G., Allman, A., Carrillo, M. P., Dwarakanath, S., Andrews, C. J. Fluorescence Assay Based on Aptamer-Quantum Dot Binding to Bacillus thuringiensis Spores // J. Fluoresc. - 2007. -V. 17.- P. 193-199.

Jayasena, S.D. Aptamers: an emerging class of molecules that rival antibodies in diagnostics // Clin. Chem. - 1999. - V. 45. - P. 1628.-1650.

Jean, S.S., Wang, J.Y., Hsueh, P.R. Bacteremia caused by Salmonella enterica serotype Choleraesuis in Taiwan // J. Microbiol. Immunol. Infect. 2006. - V. 39. - P.358-365.

Jensen, K. B., Atkinson, B. L., Willis, M. C., Koch, T. H., Gold, L. Using in vitro selection to direct the covalent attachment of human immunodeficiency virus type 1 Rev protein to high-affinity RNA ligands // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.- 1995. - V. 92. - P. 12220-12224.

Jeon, S.H., Kayhan, B., Ben-Yedidia, T., Arnon, R. A. DNA aptamer prevents influenza infection by blocking the receptor binding region of the viral haemagglutinin // J. Biol. Chem. - 2004. -V. 279. -P.48410-48419.

Joshi, R. Janagama, H., Dwivedi, H. P., Senthil Kumar, T. M. A., Jaykus, L. A., Schefers, J., Sreevatsan, S. Selection, characterization, and application of DNA aptamers for the capture and detection of Salmonella enterica serovars // Mol. Cell. Probes. - 2009. - V.23. -P. 20-28.

Kaneda, S. Minamisawa, T., Shiba, K., Fujii, T. A peptide aptamer-coated surface for selective adhesion of cancer cells in blood cells

suspension // Proceedings of MicroTAS 2010 conference, Groningen,The Netherlands. - 2010. - P.935-937.

Keefe, A.D., Cload, S. T. SELEX with modified nucleotides // Curr. Opin. Chem. Biol. - 2008. - V. 12. - P. 448^156.

Keefe, A.D., Pai, S., Ellington, A. Aptamers as therapeutics // Nat. Rev. Drug Discov. - 2010. - V. 9. - P. 537-550.

Kim, Y., Liu, C., Tan, W. Aptamers generated by Cell SELEX for biomarker discovery // Biomark. Med. - 2009. - V. 3. - P. 193-202.

Kulbachinskiy, A., Feklistov, A., Krasheninnikov, I., Goldfarb, A., Nikiforov, V. Aptamers to Escherichia coli core RNA polymerase that sense its interaction with rifampicin, sigma-subunit and GreB // Eur. J. Biochejn. -2004. - V. 271. - P. 4921-4931.

Labib, M., Zamay, A. S., Muharemagic, D., Chechik, A. V., Bell, J. C., Berezovski, M. V. Aptamer-Based Viability Impedimetric Sensor for Viruses //Anal. Chem. - 2012.- V. 84.-P.1813-1816.

Labib, M., Zamay, A. S., Muharemagic, D., Chechik, A. V., Bell, J. C., Berezovski, M. V. Electrochemical differentiation of epitope-specific aptamers //Anal. Chem. - 2012. -V. 84. - P. 2548-2556.

Lawson, A.J., Dassama, M.U., Ward, L.R., Threlfall, EJ. Multiple resistant (MR) Salmonella enterica serotype typhimurium DT 12 and PT 120: a case of MR DT 104 in disguise // Emerg. Infect. Dis. - 2002. - V.8 -P.434-436.

Lee, J.-O., So, H. M., Jeon, E. K., Chang, H., Won, K., Kim, Y. H. Aptamers as molecular recognition elements for electrical nanobiosensors // Anal. Bioanal. Chem.- 2008. - V. 390. - №4. - P. 1023-1032.

Lee, J.H., Canny, M.A., De Erkenez, D. A. therapeutic aptamer inhibits angiogenesis by specifically targeting the heparin binding domain of VEGF165 // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.- 2005. - V.102.-P. 1890218907.

Li H., Ding, X., Peng, Z. Aptamer selection for the detection of Escherichia coli K88 // Can. J. Microbiol. - 2011. -V. 57. -P. 453-459.

Lin, P., Chen, R. H., Lee, C. H., Chang, Y., Chen, C. S., Chen, W. Y. Studies of the binding mechanism between aptamers and thrombin by circular dichroism, surface plasmon resonance and isothermal titration calorimetry // Colloids Surf., B. - 2011. - V. 88. - P. 552-558.

Liu, G., Yu, X., Xue, F., Chen, W, Ye, Y., Yang, X., Lian, Y., Yan, Y., Zong, K. Screening and preliminary application of a DNA aptamer for rapid detection of Salmonella 08 // Microchim. Acta. - 2012. - V.178. - P.237-244.

Long, S. B., Long, M. B., White, R. R., Sullenger, B. A. Crystal structure of an RNA aptamer bound to thrombin // RNA. - 2008. - V. 14. -P. 2504-2512.

Lopez-Amoros, R. Comas, J., Vives-Rego, J. Flow cytometric assessment of Escherichia coli and S. typhimurium starvationsurvival in seawater using rhodamine 123, propidium iodide, and oxonol // Appl. Environ. Microbiol. - 1995. - V.61.-P. 2521-2526.

Lou, X. H., Qian, J., Xiao, Y., Viel, L., Gerdon, A. E., Lagally, E. T., Atzberger, P., Tarasow, T.M., Heeger, A.J., Soh, H. T. Micromagnetic selection of aptamers in microfluidic channels // Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A.- V. 106. - 2009. - № 9. - p. 2989-2994.

Maeng, J.-S., Kim, N., Kim, C. T., Han, S. R., Lee, Y. J., Lee, S. W., Lee, M.-H.,Cho, Y. J. Rapid Detection of Food Pathogens Using RNA Aptamers-immobilized Slide // J. of Nanosci. Nanotechnol. - 2012. -V. 12. -P. 5138-5142.

Mahlknecht, G., Maron, R., Mancini, M., Schechter, B., Sela, M., Yarden, Y. Aptamer to ErbB-2/HER2 enhances degradation of the target and inhibits tumorigenic growth // Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. - 2013. -V.110. -P.8170-8175.

Mascini, M. Aptamers in Bioanalysis // John Wiley & Sons, Hoboken. - 2009.

Mascini, M. Palchetti, I., Tombelli, S. Nucleic acid and peptide aptamers: fundamentals and bioanalytical aspects// Angew. Chem. — 2012. — V. 51.-P. 1316-1332.

Mayer, G. The Chemical Biology of Aptamers // Angew. Chem. Int. Ed. - 2009. -V. 48. - P. 2672-2689.

Mayer, G., Ahmed, M. S. L., Dolf, A., Endl, E., Knolle, P. A., Famulok, M. Fluorescence-activated cell sorting for aptamer SELEX with cellmixtures // Nat. Protoc. - 2010. - V. 5. -P. 1993-2004.

Mehta, J., Rouah-Martin, E., Van Dorst, B. Selection and characterization of PCB-binding DNA aptamers // Anal. Chem. - 2012. — V. 84.-P. 1669-1676.

Mi, J., Liu, Y., Rabbani, Z. N., Yang, Z., Urban, J. H., Sullenger, B. A., Clary, B.M. In vivo selection of tumor-targeting RNA motifs // Nat. Chem. Biol. - 2010.-V. 6.- P.22-24.

Michaud, M. A., Jourdan, E., Villet, A., Ravel, A., Grosset, C., Peyrin, E. DNA aptamer as a new target-specific chiral selector for HPLC // J. Am. Chem. Soc. - 2003. - V. 125. - P. 8672-8679.

Michael, F. Oligonucleotide aptamers that recognize small molecules, // Curr. Opin. Struc. Biol. - 1999. - V. 9. - P. 324-329.

Micklefield, J. Backbone modification of nucleic acids: synthesis, structure and therapeutic applications // Curr. Med. Chem. - 2001. - V.8. -P. 1157-117.

Miles, A.A. Misra, S.S., Irwin, J.O. The estimation of the bactericidal power of the blood// ]J. Hyg. - 1938. - V. 38. -P. 732-749.

Miyachi, Y. Shimizu, C., Kondo, A. Selection of DNA aptamers using atomic force microscopy // Nucleic Acids Res. - 2010. - V. 38. - P. 21.

Morris, К. N. Jensen, К. В., Julin, С. М. Weil, L., Gold M. High affinity ligands from in vitro selection: complex targets // Proc. Natl. Ac. Sci. U.S.A. - 1998. -V. 95. - P. 2902-2907.

Muharemagic, D., Labib, M., Ghobadloo, S. M., Zamay, A. S., Bell, J. C., Berezovski, M. V. Anti-Fab Aptamers for Shielding Virus from Neutralizing Antibodies // J. Am. Chem. Soc. - 2012. - V.134. - P.17168-17177.

National Resistance Alert 3 ADDENDUM. Carbapenemase-producing Enterobacteriaceae in the UK: NDM (New Delhi Metallo-)b -lactamase: repeated importation from Indian subcontinent. (Электронный ресурс): Официальный сайт Министерства Здравоохранения Великобритании. URL:

http://www.hpa.org.uk/webc/HPAwebFile/HPAweb_C/1248854045473 (дата обращения 18.09.2013).

Nataro, J.P. Escherihia, Shigella and Salmonella // In: Murray P.R., e.a, eds Manual of Clinical Microbiology 9th ed. Washington DC: ASM Press. - 2007. - P. 670-687.

Ng, E.W. Adamis, A.P. Anti-VEGF aptamer (pegaptanib) therapy for ocular vascular diseases //Ann. N. Y. Acad. Sci. -2007. - V.14. - P.283-291.

O'Brien, T.F. The global epidemic nature of antimicrobial resistance and the need to monitor and mang it locally // Clin. Infect. Dis. - 1997. - V. 1.- P. 2-8.

Orava, E.W., Abdul-Wahid, A., Huang, E.H.B., Mallick, A.I., Gariepy, J. Blocking the attachment of cancer cells in vivo with DNA aptamers displaying anti-adhesive properties against the carcinoembryonic antigen // Mol. Oncol. -2013.-V.7.-P. 799-811.

Ozalp, V.C., Bilecen, K., Oktem, H.A. Antimicrobial aptamers for detection and inhibition of microbial pathogen growth // Future Microbiol. -2013.-V. 8.-P. 387-401.

Padmanabhan, K., Ferrara, J. D., Sadler, J., Tulinsky E. A. The structure of alpha-thrombin inhibited by a 15-mer single-stranded DNA aptamer // J. Biol. Chem. - 1993. -V. 268. -P. 17651-17654.

Pan, W., Craven, R. C., Qiu, Q., Wilson, C. B., Wills, J. W., Golovine, S., Wang, J. F. Isolation of virus-neutralizing RNAs from a large pool of random sequences // Proc. Nat. Ac. Sci. U.S.A. - 1995. - V.92. - P. 1150911513.

Patel, D.J., Suri, A.K. Structure, recognition and discrimination in RNA aptamer complexes with cofactors, amino acids, drugs and aminoglycoside antibiotics // J. Biotechnol. - 2000. - V.74. - P. 39-60.

Patel, D. J. Suri, A. K., Jiang, F., Jiang, L., Fan, P., Kumar, R. A., Nonin S. Structure, recognition and adaptive binding in RNA aptamer complexes// J. Mol. Biol. - 1997. - V. 272. - P. 645-664.

Parkhill, J. Dougan, G., James, K.D. Complete genome sequence of a multiple drug resistant Salmonella enterica serovar Typhi CT 18 // Nature. -2001.- V.413.-P. 848-852.

Partha, R., Rebekah R., Ray, P. Aptamers for Targeted Drug Delivery// Pharmaceuticals. -2010. -V. 3. - P. 1761-1778.

Pegues, D.A., Ohl, M.E., Miller, S.I. Salmonella species, including Salmonella typhi // Principles Practices Infect. Diseases. - 2005. - V.5. - P. 2344-2363.

Petach, H., Gold, L. Dimensionality is the issue: use of photoaptamers in protein microarrays // Curr. Opin. Biotechnol. - 2002. - V.13. - P. 309314.

Pessoa Silva, C.L., Toscano, C.M., Moreira, B.M. Infection due" to extendedspectrum blactamaseproducing Salmonella enterica subsp enterica serotype infantis in a neonatal unit // J. Pediatric. - 2002. -V. 141. - P. 3817.

Pestourie, C., Tavitian, B., Duconge, F. Aptamers against extracellular targets for in vivo application // Biochemie. - 2005. -V.87. -P. 921-930.

Proske, D., Blank, M., Buhmann, R., Resch, A. Aptamers - basic research, drug development, and clinical applications // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 2005. -V. 69. - P. 367-374.

Ridley, A. Threlfall, E.J. Molecular epidemiology of antibiotic resistasnce genes in multire-sistant S. typhimurium DTI04 // Microb. Drug Resist.- 1998.-V.2.-P. 113-118.

Ringquist, S. Jones, T., Snyder, E. E., Gibson, T., Boni, I., Gold, L. High-affinity RNA ligands to Escherichia coli ribosomes and ribosoraal protein SI: comparison of natural and unnatural binding sites // Biochemistry. -1995. - V.34. - P. 3640-3648.

Robertson, D. L., Joyce, G. F. Selection in vitro of an RNA enzyme that specifically cleaves single-stranded DNA // Nature. -1990. -V.344. - P. 467-468.

Rowsell, S., Stonehouse, N. J., Convery, M. A., Adams, C. J., Ellington, A. D., Hirao, I., Peabody, D. S., Stockley, P. G., Phillips, S. E. Crystal structures of a series of RNA aptamers complexed to the same protein target // 1998. - Nat. Struct. Biol. - V. 5. - P. 970-975.

Ruckman, J., Green, L.S., Beeson, J., Waugh, S., Gillette, W.L., Henninger, D.D. 2'-Fluoropyrimidine RNA-based aptamers to the 165-amino acid form of vascular endothelial growth factor (VEGF165). Inhibition of receptor binding and VEGF-induced vascular permeability through interactions requiring the exon 7-encoded domain // J. Biol. Chem. - 1998. -V. 273. -P.20556-20567.

Saito, T., Tomida, M. Generation of Inhibitory DNA Aptamers Against Human Hepatocyte Growth Factor // DNA Cell Biol. -2005. - V. 24. - P. 624-633.

Schultze, P., Macaya, R., Feigon, F. J. Three-dimensional solution structure of the thrombin-binding DNA aptamer d(GGTTGGTGTGGTTGG) // J. Mol. Biol. -1994. -V. 235. - P. 1532-1547.

Schlesinger, S.R., Lahousse, M.J., Foster, T.O., Kim, S.R. Metallo-b-lactamases and aptamer-based inhibition // Pharmaceuticals. -2011. -V.4. -P. 419^128.

Schmidt, K.S., Borowski, S., Kurreck, J., Stephens, A.W., Bald R., Hecht, M. Application of nucleic acids to improve aptamer in vivo stability and targeting function // Nucleic Acids Res. - 2004. - V.32. - P. 5757-5765.

Shanahan, P.M.A., Karamat, K.A., Thomson, C.J., Amyes S.G.B. Characterization of multi-drug resistant Salmonella Typhi isolated from Pakistan//Epidemiol. Infect. - 2000. - V. 124.-P. 9-16.

Shangguan, D., Tang, Z., Mallikaratchy, P., Xiao, Z., Tan,W. Optimization and Modifications of Aptamers Selected from Live Cancer Cell Lines // Eur. J. Chem. Biol. - 2007. - V.8. - P. 603-606.

Shum, K.T., Hui, L.E.L., Wong, S.C.K. Aptamer-mediated inhibition of Mycobacterium tuberculosis polyphosphate kinase // Biochemistry. -2011.-V.50.-P. 3261-3271.

So, H.-M., Park, D. W., Jeon, E. K., Kim, Y. H., Kim, B. S., Lee, C. K., Choi, S.Y., Lee, C. K., Chang, S.C. H., Lee, J. O. Detection and Titer Estimation of Escherichia coli Using Aptamer-Functionalized Single-Walled Carbon-Nanotube Field-Effect Transistors // Small. 2008. - V. 4. - P. 197201.

Soundararajan, S., Chen, W.W., Spicer, E.K., Courtenay-Luck, N., Fernandes, D.J. The nucleolin targeting aptamer AS 1411 destabilizes bcl-2 messenger RNA in human breast cancer cells // Cancer Res. - 2008. - V.68. -P. 2358-2365.

Spiridonova, V.A., Kopylov, A.M. DNA aptamers as radically new recognition elements for biosensors // Biochemistry - Moscow. - 2002. - V. 67.-P. 706-709.

Stanlis, K.K.H., J.R. Mcintosh Single-strand DNA Aptamers as Probes for Protein Localization in Cells // J. Histochem. Cytochem. -2003. -V. 51.-P. 797-808.

Stoltenburg, R., Reinemann, C., Strehlitz, B. FluMag-SELEX as an advantageous method for DNA aptamer selection// Anal. Bioanal. Chem! -2005.-V. 383.-P. 83-91

Stoltenburg R., Reinemann, C., Strehlitz, B. SELEX—A (r)evolutionary method to generate high-affinity nucleic acid ligands // Biomol. Eng. -2007. -V. 24. - P. 381-403.

Su, L.H., Wu, T.L., Chia, J.H. Increasing ceftiaxone resistance in Salmonella isolaties from university hospital in Taiwan // J. Antimicrob. Chemother. - 2005. -V. 55. - P. 846-852.

Tasset, D. M., Kubik, M. F., Steiner W. Oligonucleotide inhibitors of human thrombin that bind distinct epitopes // J. Mol. Biol. - 1997. - V. 272. -P. 688-698.

Tsiang, M., Jain, A. K., Dunn, K. E., Rojas, M. E., Leung, L. L., Gibbs, C. S. Functional mapping of the surface residues of human thrombin //J. Biol. Chem. - 1995. -V. 270. - P. 16854-16863

Tombelli, S., Minnuni, M., Mascini, M. Biosensors and Biodetection: Methods and Protocols: Electrochemical and Mechanical Detectors, Lateral Flow and Ligands for Biosensors // Methods Mol. Biol. - 2008. - V. 504. -P. 23-36.

Tok, J., Lai, J., Leung, T., Fong, S., Li, Y. Selection of aptamers for signal transduction proteins by capillary electrophoresis // Electrophoresis. -2010. -V.31. - P.2055-2062.

Torres-Chavolla, E., Alocilja, E.C. Aptasensors for detection of microbial and viral pathogens // Biosens. Bioelectron. - 2009. - V. 24. - P. 3175-3182.

Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase // Science. -1990.-V.249.-P. 505-510.

Ulrich, H. RNA aptamers: from basic science towards therapy// Handb Exp Pharmacol. -2006. -V. 173. - P. 305-326.

Varizhuk, A., M., Tsvetkov, V. B., Tatarinova, O. N., Kaluzhny, D.N., Florentiev, V. L., Timofeev, E.N., Shchyolkina, A. K., Borisova, O. F., Smirnov, I.P., Grokhovsky, S. L., Aseychev, A. V., Pozmogova, G. E. DNA aptamers with triazole internucleotide linkages// Eur. J. Med. Chem. - 2013. -V.67.-P. 90-97

Vater, A., Jarosch, K., Buchner, F., Klussmann S. Short bioactive Spiegelmers to migraine-associated calcitonin gene-related peptide rapidly identified by a novel approach: tailored-SELEX // Nucleic acids res. - 2003. -V.31.- P. 130.

Villa, L., Mammina, C., Miriagou, V. Multidrug and broad spectrum cephalosporin resistance among Salmonella enterica serotype enteritidis clinical isolates in southern Italy // J. Clin. Microbiol. - 2002. - V.40. - P. 2662-2665.

Wang, J., Cao, Z., Jiang Y., Zhou, C., Fang, X., Tan, W. Molecular Signaling Aptamers for Real-time Fluorescence Analysis of Protein // IUBMB Life. -2005. - V.57. -P. 123-128.

Wang, L., Liu, X., Zhang, Q. Selection of DNA aptamers that bind to four organophosphorous pesticides // Biotechnol. Lett. - 2012. - V. 34. - P. 869-874.

Weigand, J.E., Suess, B. Aptamers and riboswitches: perspectives in biotechnology //Appl. Microbiol. Biotechnol. - 2009. - V. 85. - P.229-236.

White, R., Rusconi, C., Scardino, E., Wolberg, A., Lawson, J., Hoffman, M., Sullenger, B. Generation of species cross-reactive aptamers using "toggle" SELEX // Mol. Ther. - 2001. -V. 4. - P. 567-573.

Winnard, P.T., Pathak, A.P., Dhara, S., Cho, S.Y., Raman, V., Pomper, M.G. Molecular Imaging of Metastatic Potential // J. Nucl. Med. - 2008. -V. 49.-P. 96S-112S

Wlotzka, B., Leva, S., Eschgfaller, B., Burmeister, J., Kleinjung, F., Kaduk, C., Muhn, P., Hess-Stumpp, H., Klussmann, S. In vivo properties of an anti-GnRH Spiegelmer: an example of an oligonucleotide-based

therapeutic substance class // Proc. Natl. Ac. Sei. U.S.A. - 2002. - V.99. -P. 8898-8902.

Wu, L.H., Curran, J.F. An allosteric synthetic DNA // Nucleic Acids Res. - 1999. - V.27. -P. 1512-1516.

Wu, W., Li, M., Wang, Y., Ouyang, H. X., Wang, L., Li, C. X., Cao, C., Meng, Q., Lu, J. X. Aptasensors for rapid detection of Escherichia coli 0157:H7 and Salmonella typhimurium // Nanoscale Res. Lett. - 2012. - V.7. -P. 658-665.

Xu, W., Ellington, A. D. Anti-peptide aptamers recognize amino acid sequence and bind a protein epitope // Proc. Natl. Ac. Sei. U.S.A. - 1996. -V. 93.-P. 7475-7480.

Xu, S., Yuan, H., Chen, S., Xu, A., Wang, J., Wu, L. Selection of DNA aptamers against polychlorinated biphenyls as potential biorecognition elements for environmental analysis // Anal. Biochem. - 2012. -V. 423. - P. 195-201.

Yamamoto, R., Katahira, M., Nishikawa, S., Baba, T., Taira, K., Kumar, P. K. A novel RNA motif that binds efficiently and specifically to the Ttat protein of HIV and inhibits the trans-activation by Tat of transcription in vitro and in vivo // Genes Cells. - 2000. - V.5. - P. 371— 388.

Yang, X.B., Li, X., Prow, T. W., Reece, L. M., Bassett, S. E., Luxon, B. A., Herzog, N.K., Aronson, J., Shope, R.E., Leary, J.F., Gorenstein, D.G. Immunofluorescence assay and flow-cytometry selection of bead-bound aptamers // Nucleic Acids Res. - 2003. - V.31. - P. 8.

Yong, D., Toleman, M. A., Giske, C. G., Cho, H. S., Sundman, K., Lee, K., Walsh, T. R. Characterization of new metallo-beta-lactamase gene, bla (NDM-1), and a novel erythromycin esterase gene carried on a unique genetic structure in Klebsiella pneumoniae sequence type 14 from India // Antimicrob. Agents Chemother. - 2009. - Vol. 53. - P. 5046-5054.

G b

Yang, L., Schepartz, A. Relationship between Folding and Function in a Sequence-Specific Miniature DNA-Binding Protein // Biochemistry. -2005. - V.44. - P. 7469-7478.

Yang, M., Peng, Z., Ning, Y., Chen, Y., Zhou, Q., Deng, L. Highly Specific and Cost-Efficient Detection of Salmonella Paratyphi A Combining Aptamers with Single-Walled Carbon Nanotubes // Sensors. - 2013. -V.13. -P. 6865-6881.

Yang, D.R., Meng, X., Yu, Q., Xu, L., Long, Y., Liu, B., Fang, X.H., Zhu, H. Inhibition of hepatitis C virus infection by DNA aptamer against envelope protein // Antimicrob. Agents Chemother. - 2013. - V. 57. — P. 4937-4944.

Yuana, J., Taoa, Z., Yub, Y., Maa, X., Xiaa, Y., Wanga, L., Wanga Z. A visual detection method for Salmonella Typhimurium based on aptamer recognition and nanogold labeling // Food Control. - 2014. - V. 37. - P. 188192.

Yuminova, A. V., Spiridonova, V. A., Arutyunyan, A. M., Kopylov, A. M. Structural study of thrombin binding DNA aptamers by the circular dichroism // Dokl Biochem Biophys. - 2012. - V. 442. - P. 36-38.

Zamay, T.N., Kolovskaya, O.S., Glazyrin, Y.E., Zamay, G. S., Kuznetsova, S. A., Spivak, E. A., Wehbe, M., Savitskaya, A.G., Zubkova, O.A. Wang, X., Muharemagic, D., Dubynina, A., Sheina, Y., Salmina, A.B., Berezovski, M.V., Zamay, A. S DNA-Aptamer Targeting Vimentin for Tumor Therapy in Vivo // Nucleic Acid Ther. - 2013. - V. 24. - P. 160-170.

Zamay, A.S., Zamay, G.S., Glazyrin, Y.E., Zamay, T.N., Krat, A.V., Modestov, A.A., Zubkova, O.A., Spivak, E.A., Sukhovolskaia, M.A., Kuznetsova, S.A., Salmina, A.B., Gargaun, A.A., Berezovski, M.V., Kolovskaya, O.S. DNA aptamers to human lung cancer adenocarcinoma shows antitumor effect // Chimica Oggi /Chemistry Today. - 2014. - V. 32. - P. 18-22.