«Содержание матричной РНК генов, вовлеченных в клеточный гомеостаз человека, в отдаленные сроки после хронического облучения» тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.01, кандидат наук Никифоров Владислав Сергеевич

• Никифоров Владислав Сергеевич
• кандидат наук
• 2021

Оглавление диссертации кандидат наук Никифоров Владислав Сергеевич

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ВЛИЯНИЕ ИОНИЗИУЮЩЕГО ИЗЛУЧЕНИЯ НА ЭКСПРЕССИЮ ГЕНОВ

1.1 Механизмы регуляции экспрессии генов после облучения

1.2 Влияние ионизирующего излучения на экспрессию генов, вовлеченных в клеточные и иммунные ответы в отдаленные сроки после облучения

1.3 Р53-зависимая система генетического гомеостаза клетки в условиях радиационного воздействия

1.4 Роль белка p53 в радиационно-индуцированном мутагенезе соматических клеток

1.5 Роль белка p53 в индукции радиационно-индуцированного апоптоза

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Условия облучения обследуемых людей

2.2 Характеристика обследуемых групп лиц

2.3 Лабораторные методы исследования

2.4 Статистическая обработка результатов

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1 Оценка содержания мРНК генов TP53, MDM2, ATM, BAX,, CDKN1A, BCL-2, hOGGl и XPC у лиц, подвергшихся хроническому радиационному воздействию в широком диапазоне доз

3.1.1 Анализ содержания мРНК исследуемых генов в отдаленные сроки у хронически облученных жителей прибрежных сел реки Течи

3.1.2 Корреляционный анализ комбинированных связей относительного содержания мРНК исследуемых генов в группе сравнения и в группе лиц, подвергшихся хроническому радиационному воздействию

3.2 Влияние радиационных факторов на содержание мРНК генов TP53, MDM2, ATM, BAX,, BCL-2, CDKN1A, hOGGl и XPC

3.3 Влияние факторов нерадиационной природы на содержание мРНК исследуемых генов TP53, MDM2, ATM, BAX, BCL-2, CDKN1A, hOGGl и XPC

3.3.1 Влияние возраста на содержание мРНК исследуемых генов у обследуемых лиц

3.3.2 Оценка содержания мРНК исследуемых генов в клетках периферической крови обследуемых лиц в зависимости от пола и этнической принадлежности

3.3.3 Влияние курения на содержание мРНК исследуемых генов у обследуемых лиц

3.3.4 Анализ сочетанного влияния факторов радиационной и нерадиационной природы на относительное содержание мРНК исследуемых генов

3.4 Относительное содержание мРНК генов TP53, MDM2, ATM, BAX, BCL-2, CDKN1A, hOGGl, XPC, PADI4, MAPK8, NFkBl, STAT3 и GATA3 у хронически облученных людей с

повышенной частотой TCR-мутантных лимфоцитов в отдаленные сроки

3.5 Относительное содержание мРНК генов TP53, MDM2, ATM, BAX, BCL-2, CDKN1A, hOGGl, XPC, PADI4, MAPK8, NFkBl, STAT3 и GATA3 у хронически облученных лиц с различной интенсивностью апоптоза ЛПК в отдаленные сроки

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫЙ ОБОЗНАЧЕНИЙ

СПИСОК ТЕРМИНОВ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему ««Содержание матричной РНК генов, вовлеченных в клеточный гомеостаз человека, в отдаленные сроки после хронического облучения»»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования. Ионизирующее излучение (ИИ) является фактором риска развития ряда заболеваний у человека, вследствие мутагенного и эпигенетического действия на клетки. В дополнение к повреждению ДНК, облучение инициирует множество каскадов сигнальной трансдукции, ответственных за поддержание клеточного гомеостаза и взаимодействие с соседними клетками [1]. Технологический прорыв в биомедицинских методах способствовал крупномасштабным исследованиям по оценке транскрипционной активности генов после облучения [2]. Однако современные работы в основном базируются на экспериментах по облучению клеточных культур (ex vivo) и на описание клинической реакции на лучевую терапию (острое однократное и фракционированное облучение) [3]. При этом остается открытым вопрос о биологическом ответе на длительное, хроническое радиационное воздействие, которое может быть результатом попадания радионуклидов в окружающую среду, например, при авариях на предприятиях топливно-ядерного цикла.

Оказание медицинской помощи населению, прогнозирование и предупреждение отдаленных последствий облучения в таких ситуациях должны основываться на достоверном знании процессов, происходящих в облученном организме, его тканях и клетках. В настоящее время эти вопросы, как правило, обсуждаются в рамках эпидемиологических или экспериментальных работ [4], тогда как клинико-лабораторные исследования поздних эффектов радиационного облучения человека немногочисленны. Кроме того, большинство современных научных трудов сосредоточено на группах практически здоровых сотрудников атомной энергетики. Из-за эффекта «здорового работника», такие данные следует с осторожностью использовать для медицинского прогнозирования в случае облучения населения, неоднородного по возрасту, полу и состоянию здоровья, поскольку индивидуальные особенности организма могут иметь ведущее значение в развитии отдаленных эффектов, возникающих в результате хронического облучения [5, 6].

На сегодняшний день показано, что ИИ способно модулировать экспрессию генов, продукты которых координируют общий клеточный ответ на стресс, включая контроль клеточного цикла в сверочных точках, индукцию апоптоза, репарацию ДНК, иммунные ответы, старение и др. [14, 15, 16]. В свою очередь аберрантная активность генов, продукты которых направлены на поддержание клеточного гомеостаза, служит

первостепенной причиной развития как ранних, так и отдаленных эффектов облучения

[17].

При изучении отдаленных последствий действия ИИ весьма перспективным является метод оценки частоты мутантных по Т-клеточному рецептору лимфоцитов периферической крови (ЛКП). При обследовании ликвидаторов последствий аварии на Чернобыльской атомной электростанции (АЭС) и людей, проживавших в населенных пунктах вдоль течения реки Течи, показано, что в отдаленные сроки у облученных людей наблюдается повышенная частота соматических мутаций как фактор риска онкологических заболеваний. При этом показано, что повышенная частота TCR (T-cell receptor)-мутантных лимфоцитов не зависит от иных заболеваний (за исключением редких наследственных аномалий). Поскольку Т-клеточный рецептор принимает участие в идентификации антигенных детерминант, индуцированные радиацией структурные изменения в генах, кодирующих этот рецептор, могут приводить к нарушению важных функций клеток иммунной системы [229]. В связи с этим, вопрос об ассоциативной связи TCR-мутаций и транскрипционной активности генов остается открытым.

Кроме того, результаты ряда научных работ, выполенных в отдаленные сроки (спустя более 40-50 лет) у хронически облученных людей, говорят о повышенной интенсивности апоптоза ЛПК [10]. Программируемая гибель клеток направлена на поддержание постоянства генома и осуществляет защиту организма от генотоксического действия радиации. Анализ экспрессии генов, принимающих участие в этом процессе, является одной из актуальных задач радиационной биологии, поскольку в отдаленные сроки у хронически облученных людей регистрируется увеличение частоты возникновения целого ряда заболеваний, связанных с апоптозом [12, 13]. Из этого следует, что лица, которые отличаются нарушением механизма элиминации клеток, требуют более тщательного медицинского обследования, поскольку могут принадлежать к группе повышенного радиогенного риска.

Таким образом, работы, посвященные изучению механизмов пострадиационных изменений, являются крайне важными и перспективными для оценки риска развития стохастических эффектов облучения. Исследование хронически облученных людей вследствие радиоактивного загрязнения реки Течи, предоставляет возможность получить картину долгосрочных изменений транскрипционной активности генов, регулирующих гомеостаз клетки и генов иммунного ответа при хроническом облучении человека.

Целью исследования являлось: изучение относительного содержания матричной РНК (мРНК) генов репарации, клеточного цикла, апоптоза, иммунного ответа в

отдаленные сроки у жителей прибрежных сел реки Течи, подвергшихся хроническому радиационному воздействию.

Для достижения поставленной цели были решены следующие задачи:

1. Анализ относительного содержания мРНК генов апоптоза (BCL-2, BAX), клеточного цикла (ТР53, MDM2, CDKN1A) и репарации (ATM, hOGGl, XPC) в отдаленные сроки у лиц с накопленными дозами облучения красного костного мозга (ККМ) от 77 до 3510 мГр.

2. Исследование влияния радиационных факторов (дозы и мощности дозы в период максимального воздействия на ККМ, тимус и периферические органы иммунной системы) и нерадиационной природы (пола, этнической принадлежности, возраста на время обследования и возраста на начало облучения, фактора курения) на относительное содержание мРНК генов апоптоза, клеточного цикла и репарации.

3. Оценка относительного содержания мРНК исследуемых генов, в том числе генов иммунного ответа (NFkBl, STAT3, GATA3, MAPK8, PADI4) в отдаленные сроки у лиц, подвергшихся хроническому радиационному воздействию c повышенной частотой TCR-мутантных ЛПК.

4. Оценка относительного содержания мРНК исследуемых генов, включая гены иммунного ответа (NFkBl, STAT3, GATA3, MAPK8, PADI4) в отдаленные сроки у облученных лиц с повышенной интенсивностью раннего и позднего апоптоза ЛПК.

Научная новизна исследования:

Впервые изучено относительное содержание мРНК набора генов репарации (ATM, XPC, OGGl), клеточного цикла (TP53, MDM2, CDKNlA) и апоптоза (BAX, BCL-2) у людей, проживающих на прибрежных территориях реки Течи, ранее подвергшихся хроническому низкоинтенсивному радиационному воздействию. Спустя более 60 лет после начала хронического облучения ККМ обнаружены: а) изменения со стороны экспрессии мРНК генов BCL-2 у лиц с накопленными дозами, превышающими 77 мГр; б) изменение содержания мРНК генов ATM и CDKNlA у лиц с накопленными дозами более 1044 мГр; в) увеличение содержания мРНК гена BAX у лиц с накопленными дозами > 522 мГр.

Впервые изучены корреляционные связи между относительным содержанием мРНК исследуемых генов с дозой и мощностью дозы в период максимального воздействия на ККМ, тимус и периферические органы иммунной системы. Установлена достоверная слабая отрицательная корреляция относительного содержания мРНК гена CDKNlA с дозой и мощностью дозы в период максимального воздействия на ККМ.

Впервые проведен анализ влияния факторов нерадиационной природы (пола, этнической принадлежности, возраста на момент взятия крови, возраста на начало облучения, фактора курения) на экспрессию мРНК исследуемых генов. Показано влияние курения на относительное содержание мРНК генов BAX и BCL-2 у обследуемой группы.

Впервые проведена оценка относительного содержания мРНК исследуемых генов, в том числе генов иммунного ответа STAT3, GATA3, MAPK8, NFkBl, PADI4 у хронически облученных лиц с разной частотой TCR-мутантных ЛПК. Зафиксировано статистически значимое низкое относительное содержания мРНК генов STAT3, BCL-2 и hOGGl в отдаленные сроки у хронически облученных людей, с повышенной частотой клеток, несущих мутации по генам Т-клеточного рецептора по сравнению с группой сравнения.

Впервые изучено содержание мРНК исследуемых генов, включая гены иммунного ответа STAT3, GATA3, MAPK8, NFkBl, PADI4 в отдаленные сроки у облученных жителей прибрежных сел реки Течи с различной интенсивностью апоптоза ЛПК. Отмечено статистически значимое низкое относительное содержание мРНК BCL-2 и STAT3, а также высокие уровни мРНК гена PADI4 у людей с повышенной интенсивностью раннего апоптоза ЛПК по сравнению с группой сравнения.

Теоретическая и практическая значимость:

Результаты исследования дополняют имеющиеся данные о состоянии таких защитных механизмов клеток, как апоптоз, и вносят вклад в понимание молекулярных механизмов развития отдаленных эффектов облучения у людей, подвергшихся хроническому низкоинтенсивному неравномерному радиационному воздействию на реке Тече в диапазоне накопленных доз облучения ККМ от 77 до 3510 мГр. Материалы диссертационной работы могут быть использованы в учебно-методическом процессе подготовки студентов - радиобиологов биологического факультета ФГБОУ ВО Челябинского государственного университета.

Методология и методы исследования. Объект исследования - мононуклеарные клетки периферической крови жителей прибрежной зоны реки Течи, подвергшихся хроническому низкоинтенсивному радиационному облучению. В качестве дозиметрических величин были использованы индивидуальные накопленные поглощенные дозы и мощности дозы в период максимального воздействия на ККМ, тимус и периферические органы иммунной системы. Предмет исследования - транскрипционная активность (относительное содержание мРНК) генов регуляции клеточного гомеостаза и генов иммунного ответа, частота лимфоцитов, мутантных по локусу Т-клеточного рецептора, интенсивность спонтанного апоптоза ЛПК.

Методом ПЦР-РВ проведен анализ относительного содержания мРНК исследуемых генов для 309 жителей прибрежных территорий реки Течи. Методом проточной цитофлюорометрии были оценены частоты TCR-мутантных ЛПК у 63 человек и интенсивность раннего и позднего апоптоза ЛПК у 119 и 156 человек соответственно.

Положения, выносимые на защиту:

1. В отдаленные сроки (спустя более 60 лет) после хронического радиационного воздействия у жителей прибрежных сел реки Течи, облученных в диапазоне накопленных доз на красный костный мозг 77-3510 мГр, в мононуклеарных клетках периферической крови наблюдаются изменения в относительном содержании мРНК генов BCL-2 и BAX.

2. Факторы нерадиационной природы, такие как возраст и курение способны модифицировать транскрипционную активность генов MDM2, BCL-2 и BAX в мононуклеарных клетках периферической крови.

3. В отдаленные сроки у людей, подвергшихся хроническому радиационному воздействию, с повышенной частотой лимфоцитов периферической крови с мутациями в генах T-клеточного рецептора наблюдается пониженное содержание мРНК генов BCL-2, STAT3 и hOGGl.

4. Изменение относительного содержания мРНК генов BCL-2, BAX и STAT3 свидетельствует об индукции апоптоза в мононуклеарных клетках периферической крови в отдаленные сроки у лиц, подвергшихся хроническому радиационному воздействию.

Личный вклад автора. Личный вклад автора заключается в планировании и организации научных экспериментов, обработке, анализе и интерпретации полученных данных, а также подготовке научных статей и докладов по результатам работы. Исследование по оценке относительного содержания мРНК генов проводились автором лично. Материалы диссертации доложены автором в виде устных докладов на конференциях.

Степень достоверности и апробация результатов. Основные положения диссертационной работы были доложены на III Всероссийской научно-практической конференции «Экология в средней и высшей школе: синтез науки и образования» (Челябинск, 2016 г.), Международной конференции «The 62rd Annual Meeting of the Health Physics Society» (США, г. Роли, Северная Каролина, 2017 г.), XI Научной конференция «Генетика человека и патология» (Томск, 2017 г.), Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Академические чтения: фундаментальные науки и клиническая медицина» (Челябинск, 2018 г.), Международной конференции «The 63rd Annual Meeting of the Health Physics Society» (США, г. Кливленд, Огайо, 2018 г.),

Международной конференции «Достижения радиобиологии - медицине» (Челябинск, 2018 г.), V Международной конференции «"Постгеном 2018" в поисках моделей персонализированной медицины» (Казань, 2018 г.), Российской конференции с международным участием «Современные вопросы радиационной генетики» (Дубна, 2019

г.), Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Радиобиология. От клетки до биосферы» (Челябинск, 2019). По материалам диссертации опубликовано 5 статьи в российских изданиях, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 138 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, выводов, а также списка литературы. Работа содержит 28 таблиц, 19 рисунков. Список литературы включает 290 источник, из них 29 отечественных и 261 зарубежных.

Благодарности. Автор выражает искреннюю благодарность научному руководителю

д. м. н., профессору А. В. Аклееву за помощь в подготовке диссертационного исследования, а также сотрудникам лаборатории молекулярно-клеточной радиобиологии, специалистам биофизической и эпидемиологической лабораторий, отдела «База данных «Человек»» Уральского научно-практического центра радиационной медицины за неоценимую помощь в выполнении исследований.

Глава 1. ВЛИЯНИЕ ИОНИЗИУЮЩЕГО ИЗЛУЧЕНИЯ НА ЭКСПРЕССИЮ ГЕНОВ

1.1 Механизмы регуляции экспрессии генов после облучения

Согласно литературным данным, эпигенетический статус генома после облучения клетки, в силу высокой лабильности, изменяется достаточно динамично [18]. При этом некоторые из этих модификаций являются митотически стабильными и могут сохраняться в ряду клеточных поколений, приводя к возникновению как ранних, так и отдаленных эффектов у облученного организма [16]. На сегодняшний день к эпигенетическому ландшафту, регулирующему экспрессию генов в ответ на действие ИИ, принято относить метилирование ДНК, модификацию гистонов и экспрессию микроРНК [19, 20].

Результаты проведенных исследований демонстрируют, что ИИ может приводить к стойкому гипометилированию ДНК в широком диапазоне доз в клетках млекопитающих. Так, Kalinich J.F. с соавт. (1989) показали дозозависимое снижение уровня 5-метилцитозина после у-облучения в диапазоне доз от 0,5 до 10 Гр через 72 часа в клеточной линии нейробластомы мыши [21]. Позже, Tawa R. с соавт. (1998) обнаружили резкое гипометилирование ДНК спустя 8 часов после рентгеновского облучения в дозах 4 и 7 Гр в клетках печени мыши [22]. Аналогичные результаты были получены в работе [23], в которой описано дозозависимое гипометилирование ДНК в клетках печени и селезенке самок мышей линии C57B1 после их облучения в дозах от 0,5 до 5 Гр. Одновременно с этим, Giotopoulos G. с коллегами (2006) подтвердили наличие аберрантного метилирование ДНК в костном мозге и селезенке мышей линий CBA/H и C57BL/6 после их рентгеновского облучения в дозе 3 Гр [24].

Метилирование ДНК у млекопитающих играет критическую роль в контроле транскрипционной активности генов [25]. Одна из главных причин модификации профиля экспрессии генов, заключается в изменении метилирования в их промоторных регионах. Jaenisch R. и Bird A. (2003) подробно описали механизм, при котором гиперметилированные промоторы определяют «выключенное» состояние гена, тогда как менее метилированные считаются «включенными» [18]. CpG-островки обычно расположены внутри или в непосредственной близости от сайтов начала транскрипции многих генов, что обычно приводит к репрессии синтеза их мРНК.

Вопрос о том, как происходит активация генов после облучения и какие временные диапазоны она затрагивает, остается открытым. Bibikova M. с соавт. (2011) пришли к выводу, что после облучения в диапазоне малых (до 100 мГр) и больших доз (более 1 Гр)

гены метилируются по-разному, в соответствии с их биологической реакцией [26]. Они показали, что гены, продукты которых ответственны за контроль клеточного цикла и апоптоз были гипометилированы через 24 часа после облучения в дозе 2 Гр. Примечательно, что эти же гены спустя равный промежуток времени были гиперметилированы после воздействия дозы в 6 Гр. В своем исследовании Herman J.G. и Baylin M.D. (2003) пришли к выводу, что некоторые гены (CDKN2A, E-cadherin, VHL, BRCA1 и hMLHl), которые эпигенетически перепрограммированы посредством гиперметилирования, имеют классические функции онкосупрессоров [27]. К аналогичному выводу пришли Kumar A. c соавт. (2011), которые описали аберрантное метилирование промоторных участков генов ATM и CDKN2A после облучения в диапазоне доз от 1 до 8 Гр (при мощности 1 Гр/мин.) линии радиочувствительных (SaOS2 и WM115) раковых клеток [28]. Аномальное метилирование промотора гена опухолевого супрессора CDKN2A через 2 часа после хронического облучения в дозе 5 сГр/сут в течение 10 дней в клетках печени у линии мышей C57/B1 было также зафиксировано в работе [29]. Учитывая, что белковые продукты вышеописанных генов играют важную роль в системе репарации ДНК, а также в организации контроля продвижения по клеточному циклу, нарушение их функции, вероятно, может являться одной из причин повышенного риска развития радиогенных заболеваний.

Некоторые исследователи убедительно доказывают, что эпигенетические модификации способны сохраняться достаточно долгое время после хронического облучения. Так, Kaup S. с коллегами (2006) показали наследование дисрегуляции метилирования ДНК в облученных кератиноцитах человека in vitro, которое сохранялось в течение 20 удвоений популяции после воздействия [30]. Аналогично, у мышей спустя 1 месяц после хронического радиационного воздействия в 0,5 Гр/сут., Wang J. с коллегами (2014) описали более 800 генов, статус метилирования которых был заметно изменен. Высокими показателями обогащения отличались гены фокальной адгезии и сигнального пути PI3K/AKT/mTOR, принимающего участие в апоптотических реакциях клеток [31]. В дополнение, Кузьмина Н. С. с соавт. (2014) указали на наличие радиационно-индуцированного аберрантного метилирования промоторных участков генов, в отдаленные сроки после облучения у ликвидаторов аварии на Чернобыльской АЭС [32]. Они выявили несколько генов (GSTP1, CDKN2A, ARF и RASSF1A), участвующих в основных защитных функциях клетки, с аномально метилированным профилем СрG-островков.

Эпигенетические метки, возникшие в период внутриутробного облучения, могут опосредовать как краткосрочные, так и долгосрочные эффекты во взрослом возрасте у человека и животных [33]. Эффекты малых доз на эпигенетическую модуляцию во время развития плода хорошо продемонстрированы в работах, использующих метастабильные эпиаллели у мышей линии Agouti Yellow Viable (A v/y). Bernal A. J. с коллегами (2013) показали, что у потомства облученных мышей этой линии происходило гипометилирование гена Agouti, которое сопровождалось повышенной частотой рожденных здоровых мышей коричневого цвета, что свидетельствовало о положительном адаптивном ответе за счет изменения эпигенетического ландшафта новорожденных животных [34]. Примечательно, что дозы облучения находились в диапазоне малых доз 7-76 мГр, где максимальные эффекты авторы регистрировали после облучения в дозах 14-30 мГр.

Предполагается, что эпигенетические адаптации в ответ на внутриутробное облучение играют важную роль в развитии пластичности и восприимчивости к заболеваниям опухолевого и неопухолевого генеза [35]. Так, спустя 2 года после облучения 11-дневных эмбрионов мышей в дозе 0,1 Гр Bakshi M. V. с коллегами (2016) наблюдали изменения в экспрессии генов митохондриального комплекса и генов теплового шока [36]. Они показали, что уровень активной формы MAP4K4, необходимой для нормального развития сердечной мышцы, был достоверно сниженным, тем самым впервые дали представление о молекулярных механизмах сердечной недостаточности, вызванной воздействием ИИ во время антенатального периода развития.

Lumniczky K. с соавт. (1998) в своей работе показали, что онкозаболеваемость увеличивается на 35 % у мышей, которые были облучены в дозе 2 Гр на 18 день внутриутробного развития [37]. Они описали снижение экспрессии гена TP53 до 5 раз в более чем 60 % выявленных опухолей легких и увеличение экспрессии гена Myc в 25 % от всех лимфом. Одновременно с этим, было показано, что внутриутробное облучение в диапазоне малых доз (10, 20 и 40 сГр) может являться причиной активации апоптоза нейронов, на фоне увеличения экспрессии гена TP53 в клетках развивающегося мозга крыс [38], что согласуется с результатами исследований Ferrer I. (1996), который продемонстрировал повышенное содержание мРНК протоонкогенов у внутриутробно облученных крыс в неокортексе и гиппокампе в течение первой недели после рождения [39].

Изменение профиля метилирования ДНК тесно связано с компонентами структуры хроматина-модификациями гистонов [18]. В качестве меры накопления двунитевых

разрывов (ДР) ДНК в облученных клетках принято использовать радиационно-индуцированное фосфорилирование гистона yH2AX [40]. Фосфорилирование этого белка происходит почти сразу (в течение нескольких минут) после облучения и инициирует миграцию некоторых сенсорных молекул репарации: ATM, MRE/NBS1/RAD50, 53BP1 к месту повреждения ДНК, где они колокализуются и взаимодействуют с yH2AX [41]. Показано, что у индивидов с низким спонтанным количеством фокусов yH2AX репарационные системы работают менее эффективно и значимое число повреждений сохраняется, что является причиной не только нарушения клеточного деления, но и приводит к потере фрагментов хромосом в виде центромеро-негативных микроядер и увеличению частоты хромосомных аберраций (ХА) [42].

Другими модификациями гистонов, которые оказывают прямое влияние на регуляцию экспресии гена, являются ацетилирование и метилирование аминокислот (АК). Так, с самых ранних экспериментов показано, что повышенные уровни ацетилирования гистонов в облученных лимфоцитах часто связаны с повышенной экспрессией мРНК [43, 44, 45]. Полагают, что малые дозы ИИ с низкой мощностью дозы приводят к активации транскрипции генов адаптивного ответа, в том числе опухолевого супрессора TP53 посредством ацетилирования некоторых гистоновых белков [46]. Эти механизмы хорошо описаны в работе [47]. Например, авторы показываю, что ацетилирование гистона H3 на лизине 119 приводит к изменению конформации нуклеосом, что в свою очередь увеличивает доступ транскрипционных факторов к матрицам хроматина и усиливают экспрессию гена - мишени. В дополнение, Pollack B. P. с коллегами (2009) указали на радиационно-индуцированное ацетилирование гистона H3K9/14 на промоторных областях генов CXCL8 и SOD, выполняющих антиоксидантную функцию [48].

Обращает на себя внимание, что вышеуказанные эффекты могут осуществляться не только за счет функционирования специфических белков - ферментов (ДНК-метилтрансферазы, ацетилтрансферазы, гистон-метилтрансферазы и др.), но и за счет различных низкомолекулярных некодирующих РНК. МикроРНК обычно связываются с 3'-UTR (нетранслируемой) областью своих мишеней и репрессируют продукцию белка путем дестабилизации мРНК (трансляционного сайленсинга) [18].

ИИ приводит к значительным изменениям в паттерне экспрессии микроРНК. Так, последние исследования демонстрируют более 150 потенциальных микроРНК, чувствительных к действию радиации [49, 50, 51]. Одно из первых сообщений о функциональной значимости микроРНК в радиационных реакциях поступило из исследований, проведенных на дрозофилах [52]. Было показано, что облучение вызывало

избыточную экспрессию miR-Bantam, которая, связываясь с З'-ИТЯ-регионом мРНК проапоптотических протеинкиназ, ингибировала процесс апоптоза, тем самым повышала выживаемость облученных клеток. Анализ активации микроРНК в семенниках мышей после однократного облучения всего тела показал усиление экспрессии miR-709 [53]. Данная микроРНК нацелена на эпигенетическую регуляцию импринтированных генов, в частности их метилирования во время дифференцировки сперматозоидов. Таким образом, было высказано предположение, что радиационно-индуцированное увеличение уровней miR-709 в экспонированных клетках может служить защитным механизмом, направленным на предотвращение глобального аберрантного метилирования ДНК. Облучение лимфобластоидных клеток человека линии Jurkat в дозе 2 Гр от источника у-излучения 137Cs приводило к повышенной регуляции членов семейства let-7, которые функционально ингибировали мРНК онкогенов семейства Ras [54]. В другом исследовании было показано, что экспрессия miR-24, индуцированная у-облучением в диапазоне средних доз 0,375 и 0,75 Гр, опосредовала снижение уровня yH2AX в терминально дифференцированных клетках крови человека, что служило причиной дефицита репарации ДНК и повышенной частотой дицентрических хромосом [55]. МикроРНК были сильно дисрегулированы в фибробластах человека, после острого облучения в диапазоне высоких доз 1 и 10 Гр. Число микроРНК, показывающих достоверное изменение более чем в 2 раза, составило 73 и 33 при дозах в 1 и 10 Гр, соответственно. Анализ целевого генного обогащения среди предполагаемых мишеней показал, участие этих генов в индукции апоптоза и аресте клеточного цикла [56].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Никифоров Владислав Сергеевич, 2021 год

/ ■

■ . ■

»-Л —

...........

■ ■. ■

■

I 8

е_

Я с.

о Ч о О

100 200 300 400 500 600

Максимальная мощность дозы облучения ККМ, мГр/год

Б

Рисунок 7 - Зависимость изменения относительного содержания мРНК гена СВКЫ1Л от максимальной мощности дозы облучения ККМ, проведенная методом регрессионного анализа (А) и методом наименьших квадратов (Б).

700

Медианные значения относительного содержания мРНК исследуемых генов в подгруппах облученных лиц, рассчитанные в зависимости от мощности дозы облучения ККМ в период максимального воздействия (1951 г.), представлены в таблице 15.

Таблица 15 - Относительное содержание мРНК (отн. ед.) исследуемых генов в группах

лиц, подвергшихся хроническому облучению с разной мощностью дозы облучения ККМ (1951 г.)

Относительное содержание мРНК, отн. ед.: Me ^1^3)

Подгруппы облученных лиц с разной мощностью дозы облучения ККМ в

Ген период максимального воздействия

<49 мГр/год N=45 50-99 мГр/год N=27 100-499 мГр/год N=79 >500 мГр/год N=12

ТР53 1,13 1,04 1,05 1,13

(1,05-1,20) (0,92-1,30) (0,76-1,30) (0,98-1,24)

МБМ2 1,01 1,04 0,92 0,93

(0,84-0,84) (0,81-1,31) (0,74-1,19) (0,81-1,31)

БСЬ-2 0,87 0,92 0,91 1,00

(0,59-0,93) (0,64-1,08) (0,69-1,15) (0,83-1,41)

И0001 0,89 0,84 0,91 0,84

(0,67-1,09) (0,67-1,11) (0,71-1,20) (0,73-1,01)

АТМ 0,95 0,94 0,96 0,97

(0,84-1,07) (0,83-1,09) (0,84-1,14) (0,89-1,07)

БАХ 1,17 1,15 1,27 1,22

(1,01-1,29) (0,95-1,38) (1,07-1,38) (1,11-1,53)

ХРС 1,06 1,04 1,07 1,12

(0,87-1,18) (0,91-1,15) (0,95-1,18) (0,99-1,21)

СБШМ 0,98 (0,86-1,20) 1,06 (0,95-1,18) 0,81 (0,70-1,13) 0,87 (0,75-1,07)

Из таблицы 15 видно, что не было установлено статистически значимых различий между группами лиц с разными показателями мощности дозы облучения ККМ в период максимального воздействия.

Данные таблицы 16 демонстрируют относительное содержание мРНК исследуемых генов в подгруппах обследованных людей, сформированных в зависимости от накопленной дозы облучения тимуса и периферических органов иммунной системы.

Таблица 1 6 - Относительное содержание мРНК исследуемых генов в подгруппах лиц, имеющих разные накопленные дозы облучения тимуса и периферических органов

иммунной системы

Ген Относительное содержание мРНК, отн. ед.: Me ^1^3)

Подгруппы облученных лиц с разной накопленной дозой облучения тимуса и периферических органов иммунной системы

<49 мГр N=69 50-99 мГр N=38 >100 мГр N=56

АТМ 0,94 (0,86-1,16) 0,99 (0,87-1,12) 0,92 (0,83-1,07)

ТР53 1,13 0,98 1,07

(0,95-1,30) (0,78-1,18) (0,76-1,25)

МБМ2 1,01 0,97 0,88

(0,79-1,26) (0,81-1,18) (0,73-1,25)

СБШМ 1,05 0,97 0,98

(0,81-1,21) (0,74-1,18) (0,83-1,24)

БАХ 1,17 1,22 1,23

(0,93-1,36) (1,08-1,36) (1,06-1,30)

БСЬ-2 0,94 0,83 0,85

(0,67-1,11) (0,69-1,06) (0,66-1,15)

ХРС 1,05 1,09 1,08

(0,91-1,16) (0,97-1,23) (0,97-1,19)

И0001 0,93 0,85 0,88

(0,70-1,18) (0,66-1,13) (0,72-1,16)

На основании данных, представленных в таблице 16, можно сделать заключение об отсутсвии существенного влияния дозы облучения тимуса и периферических органов иммунной сиситемы на относительное содержание мРНК исследуемых генов.

Как и в случае с мощностью дозы облучения ККМ в период максимального воздействия, не было обнаружено достоверных различий в относительном содержании мРНК исследуемых генов у лиц, облучение которых происходило при разной мощности дозы облучения тимуса и периферических органов иммунной системы в период максимального радиационного воздействия (таблица 1 7).

Таблица 1 7 - Относительное содержание мРНК исследуемых генов в подгруппах облученных лиц, с разной мощностью дозы облучения тимуса и периферических органов

иммунной системы в период максимального воздействия

Относительное содержание мРНК, отн. ед.: Me ^1^3)

Подгруппы облученных лиц с разной мощностью дозы облучения тимуса и

Ген периферических органов иммунной системы в период максимального

воздействия

<49 мГр/год N=107 50-99 мГр/год N=43 >100 мГр/год N=13

АТМ 0,96 0,93 0,89

(0,84-1,12) (0,86-1,11) (0,81-1,00)

ТР53 1,07 1,07 1,01

(0,86-1,29) (0,66-1,27) (0,77-1,20)

МБМ2 0,97 0,90 0,87

(0,81-1,21) (0,72-1,20) (0,86-1,02)

СБШМ 1,00 0,81 0,78

(0,76-1,18) (0,74-0,99) (0,70-1,01)

БАХ 1,22 1,28 1,09

(1,02-1,37) (1,10-1,40) (1,06-1,26)

BCL-2 0,91 0,87 0,81

(0,72-1,20) (0,65-1,16) (0,64-1,17)

XPC 1,05 1,04 1,14

(0,92-1,18) (0,97-1,14) (0,95-1,22)

hOGGl 0,89 0,88 0,74

(0,69-1,15) (0,70-1,19) (0,66-1,01)

Таким образом, в отдаленные сроки у хронически облучённых жителей прибрежных сел реки Течи не обнаружено статистически значимых особенностей изменения транскрипционной активности исследуемых генов от дозы и мощности дозы облучения тимуса и периферических органов иммунной системы в период максимального воздействия

Обращает на себя внимание, что накопленная доза ККМ может приводить к более выраженным изменениям в транскриптоме. Полученные данные позволили обнаружить аналогичные особенности в содержании мРНК генов контроля клеточного цикла A TM и CDKN1A и апоптоза BCL-2 и BAX у лиц, подвергшихся хроническому облучению, в частности работников атомной промышленности [60] и ликвидаторов последствий аварии на ЧАЭС [61].

3.3 Влияние факторов нерадиационной природы на содержание мРНК исследуемых генов TP53, MDM2, ATM, BAX, BCL-2, CDKN1A, hOGGl и XPC

При исследовании медико-биологических последствий действия ИИ в отдаленные сроки возникает острая необходимость всестороннего анализа факторов нерадиационной природы. Ответ организма на радиационное воздействие зависит не только от индивидуальных особенностей, таких как возраст, пол и др., но и от дополнительного стрессового воздействиия со стороны неблагоприятных факторов (профессиональная вредность, вредные привычки и др.) [213]. Проблема установления влияния таких факторов на экспрессию генов является важной, т.к. данный параметр, как правило, определяется их сочетанным действием.

3.3.1 Влияние возраста на время облучения и на момент проведения обследования на относительное содержание мРНК исследуемых генов у обследуемых лиц

Поскольку радиационно-индуцированные эффекты развиваются в течение значительного промежутка времени, физиологические изменения в организме, в частности инволюционные процессы, могут оказывать существенную роль в их развитии [ 214]. Современные молекулярно-генетические методы измерения активности определенных генов в соматических клетках, наравне с недавно разработанной концепцией эпигенетического старения, демонстрируют модификацию экспрессии некоторых генов с возрастом. При этом, по мнению некоторых авторов, эти изменения незначительные, однако, широко распространены во всем транскриптоме и, как правило, включают в себя модуляцию активности генов иммунного ответа, медиаторов воспаления и онкогенов [215, 216]. Поскольку возраст является одним из основных факторов риска развития многих заболеваний, исследования связи между процессом старения и закономерностями изменения паттерна экспрессии генов являются актуальными.

Задача данного этапа работы состояла в определении генов, демонстрирующих изменение своей транскрипционной активности, у людей в возрасте от 56 до 87 лет. Поскольку эпигенетические метки могут стабильно наследоваться и приводить к фенотипическим изменениям в отдаленные сроки, также была оценена зависимость относительного содержания мРНК генов от возраста на время начала облучения. Методом непараметрической корреляции Спирмена были рассчитаны коэффициенты корреляции и уровни статистической значимости (р), которые представлены в таблице 18.

Таблица 18 - Коэффициенты ранговой корреляции Спирмена относительного содержания мРНК исследуемых генов от возраста обследуемых лиц на время проведения обследования и возраста на начало облучения

Группа сравнения Облученные люди

Ген Возраст на время Возраст на Возраст на время Возраст на

проведения обследования, лет начало облучения, лет проведения обследования, лет начало облучения, лет

АТМ 0,02 -0,03 -0,08 -0,09

(0,84) (0,71) (0,30) (0,30)

ТР53 0,06 -0,06 -0,08 -0,18

(0,49) (0,44) (0,29) (0,04)

MDM2 0,08 -0,08 -0,20 -0,15

(0,36) (0,37) (0,02) (0,09)

CDKN1A 0,32 0,12 0,14 -0,03

(<0,01) (0,10) (0,07) (0,74)

BAX -0,22 -0,14 -0,01 -0,02

(<0,01) (0,09) (0,98) (0,82)

BCL-2 0,07 0,01 -0,08 -0,13

(0,42) (0,87) (0,28) (0,14)

XPC -0,14 -0,10 -0,07 -0,04

(0,10) (0,23) (0,35) (0,62)

hOGG1 0,10 0,11 -0,07 -0,09

(0,24) (0,20) (0,36) (0,31)

Примечание - в скобках приведен уровень статистической значимой корреляции (p).

Согласно данным, представленным в таблице 1 8, не было отмечено достоверных корреляционных связей относительных содержаний мРНК генов ATM, OGG1, XPC и BCL-2 от возраста обследуемых лиц обеих групп на время начала облучения и возраста на время проведения обследования. В группе сравнения отмечена слабая положительная зависимость относительного содержания мРНК гена CDKN1A (S=0,32, p<0,01) и слабая отрицательная зависимость относительного содержания мРНК гена BAX (S= -0,22, p<0,01) от возраста людей на время проведения обследования.

В группе облученных лиц отмечены статистически значимые слабые отрицательные корреляционные связи относительного содержания мРНК гена MDM2 от возраста лиц на время проведения обследования (S= -0,20; p=0,02) и относительного содержания мРНК гена TP53 от возраста людей на начало хронического радиационного воздействия (S= -0,18, p=0,04).

Вид зависимости изменения содержания мРНК оценивали при помощи линейного регрессионного анализа, который подтвердил, что зависимость относительных содержаний мРНК генов BAX (рисунок 8 (А)) и CDKN1A (рисунок 9 (А)) от возраста на время проведения обследования в группе сравнения имела слабый характер. Зависимость содержания мРНК гена BAX от возраста на время проведения обследования описывалась линейным уравнением y=1,80-0,01x (R2=0,04; p=0,02); зависимость содержания мРНК гена CDKN1A от возраста на время проведения обследования лиц, составляющих группу сравнения, описывалась линейным уравнением y=1,30+0,01x (R2=0,1; p<0,01).

Для подтверждения полученных зависимостей был проведен анализ данных методом скользящей средней (путем усреднения значений для 10-15 последовательных показателей), представленный на рисунках 8 (Б) и 9 (Б)), который свидетельствовал о

^ 1.6 я Я и

й'■« I

11,2 *

£ 1.0

и V

о

3 0.8

г

Ё

3 0.6

н

О

0,4

монотонном снижении содержания мРНК гена БАХ и увеличении относительного содержания мРНК гена СБКЫ1А с увеличением возраста обследуемых людей.

. ■ ■ р=0.02 Я—0,20

; 1^=0,04

! . : ■ ■

■ 1 ; —__1 ......■ ■ ■

. " ■ ;

1 ■ ■ 1 1 1 ■

■ ■ .

55 60 65 70 75

Возраст на время проведения обследования, лет

А Б

Рисунок 8 - Зависимость относительного содержания мРНК гена БАХ от возраста на время проведения обследования в группе сравнения, исследованная методом регрессионного анализа (А) и методом скользящей средней (Б).

Рисунок 9 - Зависимость относительного содержания мРНК гена СВК№1А от возраста на время проведения обследования в группе сравнения, исследованная методом регрессионного анализа (А) и методом скользящей средней (Б).

На рисунке 10 (А) проиллюстрирована зависимость относительного содержания мРНК гена МОМ2 от возраста облученных лиц на время проведения обследования. Уравнение линейной регрессии имеет вид: y=1,80-0,01*x ^2=0,03; р=0,04). Методом

скользящей средней также была проведена аппроксимация данных (рисунок 10 (Б)), где каждая точка является усредненным значением для 10-15 показателей. Среднепопулляционные данные свидетельствуют о монотонном снижении относительного содержания мРНК гена МОМ2 с увеличением возраста лиц, составляющих группу облученных людей.

Р С 04 11=-0,16 112=0,03

■ ■

■ 1 ■

1 ■ 1 ■ ■

;; ! •; • | ---------...л ■ ■

• ; ■ | —---- —_________

■" ; ; ■ . ■ '

■

60 66 70 76 80 86

Возраст на время проведения обследования, лет

А Б

Рисунок 10 - Зависимость относительного содержания мРНК гена МОМ2 от возраста на время проведения обследования в группе облученных людей, исследованная методом регрессионного анализа (А) и методом скользящей средней (Б).

Регрессионный анализ относительного содержания мРНК гена ТР53 от возраста на начало облучения не позволил обнаружить статистически значимой зависимости (коэффициент детерминации (Я2)=0,03; уровень статистической значимости (р)=0,07).

В связи с тем, что процесс старения рассматривается как механистических износ и накопление ошибок, дополнительный стресс, вызванный действием неблагоприятных экологических факторов, в том числе ИИ, может приводить к нарушению метаболизма и повреждению макромолекул в клетках и тканях. На основании результатов корреляционного и регрессионного анализа, было зафиксировано изменение экспрессии мРНК генов ВАХ и СБКМ1А от возраста на время проведения обследования людей, составляющих группу сравнения. При этом, зависимости относительного содержания мРНК этих генов от возраста на время проведения обследования в группе облученных лиц отсутствовали. Однако отмечено снижение экспрессии мРНК гена МОМ2, коррелирующее с возрастом облученных лиц на время проведения обследования. Поскольку продукты генов СВКЫ1А, ВАХ и МОМ2 являются главными регуляторами контроля клеточных

программ, изменение содержания их мРНК может иметь прямое отношение к инволюционным процессам, происходящим в организме человека.

3.3.2 Оценка относительного содержания мРНК исследуемых генов в клетках периферической крови обследуемых лиц в зависимости от пола и этнической

принадлежности

С развитием молекулярно-клеточных технологий появились убедительный данные, указывающие на то, что организмы, в зависимости от их половой принадлежности, имеют принципиальные отличия в ответе на генотоксическое действие ИИ [217]. Так, результаты недавно проведенных исследований демонстрируют существенную разницу между самцами и самками млекопитающих в уровне экспрессии транскрипционных факторов и некоторых гомеостатических генов. В частности, описаны половые различия в экспрессии генов, кодирующих рецепторы, связанные с G-белками, обнаружена различная индукция генов РКСд, РКСв и РКС^ и членов сигнального пути РКС у мышей линии С57/БЬ после их хронического облучения (накопленная доза равна 50 сГр). При этом среди самок и самцов отмечена выраженная разница в экспрессии фактора ШКТ5А, принимающего важную роль в канцерогенезе и регенерации мышц [218]. Такие результаты определяют перспективы радиобиологических исследований, поскольку углубленное изучение гендерных различий в ответе клетки на действие ИИ на молекулярном уровне в будущем поможет объяснить различия в риске развития заболеваний у мужчин и женщин. Результаты исследования относительного содержания мРНК у мужчин и женщин продемонстрированы в таблице 19.

Таблица 19 - Относительное содержание мРНК исследуемых генов в зависимости от пола обследованных лиц

Ген Относительное содержание мРНК, отн. ед.: Ме (01-03)

Группа сравнения Облученные лица

Мужчины N=45 Женщины N=101 Мужчины N=63 Женщины N=100

АТМ 0,98 (0,85-1,23) 0,98 (0,88-1,19) 1,00 (0,86-1,15) 0,95 (0,85-1,10)

ТР53 1,02 (0,84-1,23) 1,10 (0,93-1,31) 1,05 (0,79-1,25) 1,09 (0,85-1,27)

МБМ2 0,92 (0,72-1,30) 1,07 (0,80-1,42) 0,94 (0,68-1,15) 0,97 (0,80-1,32)

CDKN1A 0,90 0,87 0,96 0,90

(0,79-1,05) (0,76-1,00) (0,80-1,17) (0,73-1,09)

1,34 1,05 1,31 1,19

BAX (0,95-1,60) р1<0,01 (0,85-1,25) (1,07-1,57) р2=0,01 (1,02-1,34)

BCL-2 0,97 (0,66-1,23) 1,08 (0,75-1,44) 0,80 (0,62-1,00) р2=0,02 0,97 (0,70-1,18)

XPC 1,07 1,01 1,06 1,07

(0,95-1,35) (0,85-1,23) (0,94-1,18) (0,96-1,22)

hOGG1 0,89 0,88 0,81 0,93

(0,75-1,11) (0,76-1,11) (0,65-1,15) (0,73-1,15)

Примечания:

1- р1-уровень статистической значимости различий показателей между мужчинами и женщинами группы сравнения;

2- р2-уровень статистической значимости различий показателей между мужчинами и женщинами группы облученных лиц.

В данном исследовании половая принадлежность людей не влияла на относительное содержание мРНК всех генов, кроме апоптотических BAX и BCL-2. Как и в контрольной группе (р<0,01), так и в группе облученных лиц (р=0,01) были отмечены достоверно высокие уровни мРНК гена BAX у мужчин по сравнению с женщинами. Изменение экспрессии гена BCL-2 у мужчин относительно женщин имело противоположный характер. Относительное содержание мРНК гена BCL-2 у облученных мужчин было существенно ниже (р=0,01), чем у женщин.

При анализе сопоставления спонтанного уровня мРНК генов между славянами и тюрками внутри группы облученных лиц и группы сравнения статистически значимых различий выявлено не было (таблица 20).

Таблица 20 - Относительное содержание мРНК исследуемых генов в зависимости от

этнической принадлежности обследованных лиц

Ген Относительное содержание мРНК, отн. ед.: Ме (01-03)

Группа с равнения Облученные лица

Славяне N=97 Тюрки N=49 Славяне N=86 Тюрки N=77

ATM 0,97 (0,88-1,16) 1,00 (0,85-1,20) 0,97 (0,84-1,17) 0,96 (0,86-1,09)

ТР53 1,07 (0,89-1,26) 1,14 (0,83-1,36) 1,11 (0,86-1,30) 1,02 (0,79-1,23)

MDM2 1,05 (0,73-1,38) 1,07 (0,84-1,41) 0,94 (0,77-1,20) 1,00 (0,77-1,26)

CDKN1A 0,88 (0,76-0,99) 0,89 (0,76-1,06) 0,99 (0,75-1,18) 0,86 (0,74-1,03)

BAX 1,09 (0,84-1,44) 1,14 (0,89-1,44) 1,17 (0,99-1,41) 1,26 (1,12-1,38)

BCL-2 0,99 (0,75-1,33) 1,03 (0,63-1,44) 0,92 (0,68-1,11) 0,84 (0,64-1,15)

XPC 1,02 (0,85-1,27) 1,06 (0,90-1,26) 1,05 (0,91-1,16) 1,08 (0,98-1,21)

hOGG1 0,87 (0,76-1,07) 0,91 (0,75-1,17) 0,89 (0,68-1,15) 0,88 (0,71-1,16)

Таким образом, по результатам текущего анализа, была отмечена модуляция экспрессии мРНК апоптотических генов BCL-2 и BAX у мужчин по сравнению с женщинами в двух обследуемых выборках, в свою очередь влияния этнической принадлежности на относительное содержание мРНК всех исследуемых генов зафиксировано не было.

3.3.3 Влияние курения на содержание мРНК исследуемых генов у обследуемых лиц

Механизм действия компонентов сигаретного дыма, подобно действию ИИ, сводится к повреждению ДНК, включая структурные изменения азотистых оснований, образование апуриновых/апиримидиновых сайтов, одно и двунитевых повреждения ДНК. В связи с длительным воздействием канцерогенов и других повреждающих веществ, курение приводит к окислительному стрессу и к генным мутациям [219, 220]. Кроме того, результаты некоторых исследований демонстрируют достоверные ассоциации между влиянием этого фактора и изменением паттерна метилирования ДНК отдельных СрО локусов в клетках периферической крови [221]. Гены, ассоциированные с курением, относятся к множеству разнообразных биологических процессов, при этом показано, что их аберрантная экспрессия приводит к широкому спектру сердечно-сосудистых заболеваний и хронических обструктивных заболеваний легких, наряду с различными видами ЗНО [222, 223]. Поскольку курящие люди находятся в группе наибольшего риска развития злокачественных новообразований, было важно оценить уровень экспрессии исследуемых генов в выборках обследованных диц, сгруппированных по фактору курения.

Процесс образования опухоли часто сопровождается мутациями в гене TP53 совместно с изменением регуляции процесса апоптотической гибели клеток [ 76]. В данной работе не было выявлено статистически значимых изменений содержания мРНК гена TP53 и ключевых генов репарации (ATM, OGG1, XPC) и контроля клеточного цикла (MDM2, CDKN1A), однако отмечено, что у курящих лиц наблюдается более выраженная модуляция экспрессии апоптотических генов BCL-2 и BAX (таблица 21).

Таблица 21 - Относительное содержание мРНК исследуемых генов в зависимости от

фактора курения в группе облученных людей и в группе сравнения

Ген Относительное содержание мРНК, отн. ед.: Me (Q1-Q3)

Группа сравнения Облученные лица

Некурящие N=127 Курящие N=24 Некурящие N=131 Курящие N=34

ATM 0,98 (0,86-1,44) 0,98 (0,84-1,14) 0,98 (0,86-1,16) 0,92 (0,82-1,07)

TP53 1,09 (0,88-1,31) 1,07 (0,80-1,15) 1,05 (0,80-1,25) 1,18 (0,97-1,33)

MDM2 1,05 (0,79-1,40) 1,07 (0,72-1,33) 0,97 (0,80-1,25) 0,92 (0,77-1,19)

CDKN1A 0,88 (0,76-1,00) 0,88 (0,75-1,09) 0,92 (0,75-1,14) 0,91 (0,98-1,23)

BAX 1,05 (0,83-1,27) 1,51 (1,09-1,69) p1<0,01 1,19 (1,02-1,34) p2<0,01 1,46 (1,28-1,64) p3<0,01

BCL-2 1,11 (0,75-1,56) 0,72 (0,64-0,92) p1<0,01 0,91 (0,67-1,14) p2<0,01 0,78 (0,61-0,93) p3=0,01

XPC 1,08 (0,94-1,40) 1,02 (0,86-1,27) 1,07 (0,94-1,18) 1,09 (0,98-1,23)

hOGGl 0,88 (0,76-1,11) 0,91 (0,75-1,13) 0,87 (0,75-1,14) 0,94 (0,70-1,22)

Примечания:

1- р1 - уровень статистической значимости различий показателей между курящими и некурящими лицами группы сравнения;

2- р2 - уровень статистической значимости различий показателей у некурящих людей среди облученных и необлученных лиц;

3- р3 - уровень статистической значимости различий показателей между курящими и некурящими облученными лицами.

Как в группе сравнения, так и в группе облученных людей, в подгруппе курящих лиц относительное содержание мРНК гена BAX находилось на более высоком уровне (р<0,01),

в то время как относительное содержание мРНК гена BCL-2 была статистически значимо ниже ^<0,01).

Процесс гибели клеток, соприкасающихся с сигаретным дымом, и изменение содержания белков, регулирующих пути апоптоза, являются одним из уровней защиты клеток от негативных воздействий курения. На основании полученных данных, можно сделать заключение, что частота апоптотической гибели клеток у курильщиков может находиться на более высоком уровне по сравнению с некурящими лицами, и быть зафиксирована в клетках периферической крови, что согласуется с результатами других исследований [224].

3.3.4 Анализ сочетанного влияния факторов радиационной и нерадиационной природы на относительное содержание мРНК исследуемых генов

Накопленные экспериментальные данные отечественных и зарубежных исследователей убедительно доказывают, что при сочетанном действии ИИ и факторов нерадиационной природы регистрируется значимый вклад синергических и антагонистических эффектов в ответную реакцию биологических систем на разных уровнях организации - от молекулярного и клеточного до организменного [225]. Эффекты, рассматриваемые как результат облучения, варьируют не только в силу модифицирующего действия радиации, но также могут быть обусловлены индивидуальными особенностями облучаемого индивидуума, такими как пол, возраст, наличием соматических заболеваний, временем облучения, вредными привычками и др. В конечном итоге, при сочетанном действии излучения с другими агентами, биологические последствия могут проявляться суммацией эффектов каждого из действующих агентов [213].

Оценка влияния факторов радиационной (доза облучения ККМ, мощность дозы на ККМ в период максимального воздействия, доза облучения тимуса и периферических органов иммунной системы, мощность дозы на тимус и периферические органы иммунной сиситемы в период максимального воздействия) и нерадиационной природы (возраст, пол, этническая принадлежность и курение) была осуществлен при помощи факторного дисперсионного анализа. Результаты исследования представлены в таблице 22.

Таблица 22. Анализ влияния возможных радиационных и нерадиационных факторов на относительное содержание мРНК исследуемых генов с использованием коэффициентов дисперсии Фишера

Ген Фактор

Доза облучения ККМ Мощность дозы облучения ККМ в период максимального воздействия Доза облучения тимуса и периферических органов иммунной системы Мощность дозы облучения тимуса и периферических органов иммунной системы в период максимального воздействия тс л о С Этническая принадлежность Возраст на время проведения обследования Возраст на начало облучения е и н ш а у К

TP53 0,61 (0,55) 0,17 (0,85) 1,57 (0,21) 0,48 (0,64) 0,46 (0,50) 2,19 (0,14) 0,44 (0,64) 0,06 (0,81) 0,42 (0,52)

MDM2 0,75 (0,47) 0,21 (0,30) 0,94 (0,39) 0,38 (0,69) 1,58 (0,21) 0,01 (0,95) 3,03 (0,06) 0,90 (0,34) 0,02 (0,89)

БСЬ-2 0,89 (0,41) 2,20 (0,12) 0,21 (0,81) 0,24 (0,79) 4,99 (0,03) 0,05 (0,83) 1,07 (0,34) 0,03 (0,85) 6,35 (<0,01)

hOGG1 0,08 (0,93) 0,23 (0,80) 2,55 (0,08) 0,31 (0,74) 0,40 (0,53) 0,01 (0,91) 1,74 (0,18) 0,07 (0,78) 0,10 (0,75)

АТМ 1,40 (0,25) 0,01 (0,99) 0,76 (0,47) 1,06 (0,35) 0,02 (0,89) 1,97 (0,16) 0,22 (0,80) 0,10 (0,75) 0,01 (0,99)

БАХ 2,11 (0,12) 1,27 (0,29) 2,15 (0,10) 0,42 (0,66) 6,13 (<0,01) 2,13 (0,09) 0,14 (0,87) 0,01 (0,98) 23,54 (<0,01)

ХРС 0,61 (0,55) 0,19 (0,83) 1,97 (0,14) 0,47 (0,63) 0,78 (0,38) 1,49 (0,15) 1,48 (0,16) 1,12 (0,29) 1,41 (0,24)

CDKN1A 3,09 (0,04) 5,50 (<0,01) 1,31 (0,27) 2,36 (0,10) 2,40 (0,12) 1,38 (0,22) 1,26 (0,29) 0,33 (0,57) 0,24 (0,62)

Примечания:

1- значения представлены в виде коэффициентов дисперсии Фишера (Б)

2- в скобках приведен уровень статистической значимости корреляции (р).

Наибольшее влияние на относительное содержание мРНК оказывал фактор курения для гена BCL-2 (Б=6,35; р<0,01) и для гена BAX (Б=23,54; р<0,01). Менее выраженный эффект был получен от половой принадлежности для BCL-2 (Б=4,99; р=0,03) и для BAX (Б=6,13; p<0,01). Следует отметить, что подобный эффект может быть обусловлен особенностями обследуемой выборки, так как среди курящих лиц подавляющее большинство было представлено мужчинами (таблица 5). Влияние дозы облучения ККМ (Б=3,09; p=0,04) и мощности дозы облучения ККМ в период

максимального воздействия (5,50; p<0,01) было зафиксировано только для гена CDKN1A. Не было отмечено влияния дозы и мощности дозы облучения тимуса и периферических органов иммунной системы в периот максимального радиационного воздействия. Влияние возраста на время проведения обследования было продемонстрировано в случае с относительным содержанием мРНК генаMDM2 на уровне тенденции (F=3,03;p=0,06).

Таким образом, на основании полученных данных, можно сделать заключение, о том, что в отдаленные сроки после хронического облучения человека, наблюдаемые изменения относительного содержания мРНК генов могут быть обусловлены комплексным влиянием ИИ и нерадиационных факторов, в частности курения.

3.4 Относительное содержание мРНК генов TP53, MDM2, ATM, BAX, BCL-2, CDKN1A, hOGG1, XPC, PADI4, MAPK8, NFkB1, STAT3 и GATA3 у хронически облученных людей с повышенной частотой TCR-мутантных лимфоцитов в отдаленные сроки

После облучения на клеточном уровне отмечено несколько хорошо изученных радиационно-индуцированных изменений, в частности повышение частоты генных мутаций [226]. В рамках данного исследования был использован метод оценки соматических мутаций в генахТ-клеточного рецептора в ЛПК. Выбор данного индикатора мутагенеза был обусловлен некоторыми особенностями TCR. Во-первых, согласно литературным данным, частота TCR-мутантных лимфоцитов остается достоверно повышенной даже в отдаленные сроки у части лиц, ранее подвергшихся хроническому радиационному воздействию [227, 228]. Во-вторых, комплекс TCR/CD3 является связующим звеном в ряде иммунных реакций клетки, поэтому аберрантная экспрессия генов Т-клеточного рецептора может являться причиной радиационно-индуцированного нарушения иммунного статуса облученного человека [229]. В-третьих, на основании выводов некоторых отечественных и зарубежных авторов, принято считать, что повышенная частота TCR-мутантных ЛПК может рассматриваться как потенциальный критерий при формировании групп повышенного канцерогенного риска в отдаленные сроки у части облученных людей [230].

В виду того, что доля лиц из исследуемой выборки также отличалась повышенной частотой лимфоцитов, попадающих в область, негативных по экспрессии CD3-комплекса, облучённые лица были разделены по принципу превышения критического значения TCR-мутантных Т-лимфоцитов в периферической крови. В качестве критерия повышения частоты TCR мутаций принималось значение, равное сумме среднего значения показателя

в группе сравнения и двухкратной величине стандартного отклонения для данного показателя [9].

В исследовании было включено 63 жителя прибрежных сел реки Течи (таблица 23).

Таблица 23 - Характеристика обследуемых лиц с различной частотой TCR-мутантных ЛПК

Показатели Группа сравнения N=17 Основная группа

Облученные лица с нормальной частотой TCR-мутантных ЛПК N=27 Облученные лица с повышенной частотой TCR-мутантных ЛПК N=19

Частота TCR-мутантных клеток, %: М ± ББ (шт-шах) 0,16 ± 0,02 (0,02-0,27) 0,15 ± 0,02 (0,01-0,31) 0,72 ± 0,10 (0,32-1,75)

Возраст на время проведения обследования, лет: Ме (01-03) 65,0 (60,0-75,0) 70,0 (66,0-75,0) 70,0 (65,0-75,0)

Дозовые характеристики М ± ББ (шт-шах)

Мощность дозы на ККМ в период максимального воздействия, мГр/год 0,65 ± 0,4 (0-5) 174 ± 30 (5-560) 175 ± 25 (21-420)

Накопленная доза облучения ККМ, мГр 16 ± 0,4 (0-50) 705 ± 94 (90-1867) 755 ± 111 (103-1764)

Мощность дозы на тимус и периферические органы иммунной системы в перид максимального воздействия мГр/год 0,28 ± 0,2 (0-2) 38 ± 5 (3-99) 55 ± 13 (5-239)

Накопленная доза облучения тимуса и периферических органов иммунной системы, мГр 6,5 ± 0,2 (0-33) 90 ± 14 (5-278) 128 ± 31 (9-489)

Примечания:

1- Ме (01-03) - медиана (25-75 процентили);

2- М ± ББ (шт-шах) - среднее±ошибка среднего (минимальное-максимальное значения)

Группа хронически облученных людей, отличающаяся повышенной частотой ТСЯ-мутантных ЛПК, состояла из 19 человек. Средний возраст составил 71,6 ± 1,3 лет (диапазон от 63 до 81 года). Второй исследуемой группой являлась группа облученных лиц с нормальной частотой ТСЯ-мутантных ЛПК (не превышающей значения спонтанного уровня для жителей Уральского региона), состоящей из 27 человек в возрасте от 62 до 87 лет (средний возраст составил 72,5 ± 1,3 года). Группа сравнения включала 17

человек, проживающих в сходных социально-экономических условиях, на тех же территориях, но с накопленной дозой облучения ККМ менее 70 мГр за весь период своей жизни и частотой ТСЯ-мутаций в CD3+ лимфоцитах, не превышающей значения спонтанного уровня для жителей Уральского региона.

Как видно из таблицы 23, частота ТСЯ-мутантных клеток в основной группе находилась на уровне 0,72 ± 0,10 % (с диапазоном индивидуальных значений от 0,32 до 1,75 %). В группе облученных лиц с нормальной частотой мутаций в генах ТСЯ и в группе сравнения этот показатель достоверно не отличался и находился на уровне 0,15 ± 0,02 % (диапазон - 0,01 - 0,31 %) и 0,16 ± 0,02% (диапазон 0,02-0,27 %), соответственно.

Стоит отметить, что средние значения доз и мощностей доз ККМ в период максимального воздействия у облученных лиц с нормальной и повышенной частотой ТСЯ-мутантных клеток не различались и существенно превышали таковые на тимус и периферические органы иммунной системы. Так, диапазон индивидуальных значений мощности дозы на ККМ в период максимального воздействия в группе лиц с нормальной частотой ТСЯ-мутаций составил от 5,до 560 мГр/год (среднее значение - 174±30 мГр/год), в группе облученных людей с повышенной частотой ТСЯ-мутантных ЛПК диапазон составил от 21 до 420 мГр/год (среднее значение - 175±25 мГр/год). Диапазоны индивидуальных значений поглощённых доз облучения ККМ составляли от 90 до 1867 мГр (среднее значение - 705±94 мГр) в группе лиц с нормальной частотой TCR-мутаций и от 103 до 1764 мГр (среднее значение - 755±111 мГр) в группе лиц с повышенной частотой TCR-мутантных лимфоцитов. Что касается мощности дозы облучения тимуса и периферических органов иммунной системы, в группе облученных людей с нормальной частотой TCR-мутаций диапазон индивидуальный значений составил 3-99 мГр/год (среднее значение - 38±5 мГр/год). В группе облученных лиц с повышенной частотой ТСЯ-мутантных ЛПК средняя мощность дозы на тимус и периферические орагны иммунной системы, полученная в период максимального воздействия, была равна 55 ± 13 мГр/год (диапазон индивидуальных значений показателя составил от 5 до 239 мГр/год). Диапазоны индивидуальных значений накопленной поглощённой дозы облучения тимуса и периферических органов иммунной системы составляли 5-278 мГр (среднее значение -90 ± 14 мГр) в подгруппе облученных лиц с нормальной частотой TCR-мутаций и 9-489 мГр (среднее значение -128 ±31 мГр) в подгруппе облученных лиц с повышенной частотой TCR-мутантных лимфоцитов. Накопленные поглощенные дозы облучения группы сравнения были существенно меньше и не превышали 50 мГр для ККМ и 33 мГр для тимуса и периферических органов иммунной системы.

Результаты сравнения относительного содержания мРНК исследуемых генов в группе сравнения и подгруппах облученных лиц с нормальной и повышенной частотой ТСЯ-мутантных лимфоцитов продемонстрированы в таблице 24.

Таблица 24 — Относительное содержание мРНК генов в группе сравнения и у

обследованных лиц основной группы с разной частотой ТСЯ-мутантных лимфоцитов

Относительное содержание мРНК, отн. ед.: Ме (01-03)

Облученные лица с Облученные лица с

Ген Группа сравнения N=17 нормальной частотой ТСЯ-мутантных лимфоцитов N=27 повышенной частотой ТСЯ-мутантных лимфоцитов N=19

АТМ 0,91 0,95 0,88

(0,83-1,16) (0,86-1,06) (0,81-1,03)

ТР53 1,16 1,00 1,10

(0,93-1,41) (0,72-1,19) (0,66-1,27)

MDM2 1,04 0,95 0,81

(0,86-1,39) (0,77-1,25) (0,60-1,00)

CDKN1A 0,85 0,98 0,90

(0,73-0,97) (0,81-1,09) (0,69-1,20)

БАХ 1,15 1,24 1,28

(1,03-1,36) (1,09-1,28) (1,08-1,49)

0,67

БС1-2 0,88 (0,67-1,16) 0,91 (0,59-0,99) (0,58-0,83) р2=0,02 р3=0,06

ХРС 1,10 (0,96-1,39) 1,02 (0,92-1,15) 1,08 (1,00-1,21)

1,02 (0,83-1,11) 0,87 (0,66-1,13) 0,74

И0001 (0,64-0,93) р2=0,03

PADI4 0,93 0,76 0,76

(0,58-1,37) (0,62-1,21) (0,53-1,75)

МАРК8 0,88 0,96 1,02

(0,63-1,11) (0,72-1,54) (0,61-1,39)

ШкБ1 0,99 0,81 1,06

(0,51-1,38) (0,46-1,38) (0,64-1,65)

1,37 (1,07-1,73) 0,83 0,84

$>ТАТ3 (0,50-1,38) р1=0,01 (0,71-0,99) р2=0,0009

ОАТА3 0,67 0,93 0,86

(0,44-0,88) (0,57-1,49) (0,71-1,58)

Примечания:

1- р1-уровень статистической значимости различий показателей между группой сравнений и облученными людьми с нормальной частотой ТСЯ-мутантных лимфоцитов;

2- р2-уровень статистической значимости различий показателей между группой сравнения и облученными людьми с повышенной частотой ТСЯ-мутантных лимфоцитов;

3- р3-уровень статистической значимости различий показателей между облученными людьми с нормальной и повышенной частотой ТСЯ-мутантных лимфоцитов.

Обращает на себя внимание, что в отдаленные сроки после начала хронического радиационного воздействия у облученных людей, независимо от частоты ТСЯ-мутантных ЛПК отмечалось статистически значимо низкое относительное содержание мРНК гена 8ТЛТ3 по сравнению с показателями, полученными в группе сравнения. При этом если уровень статистической значимости различий показателей между группой сравнений и облученными людьми с нормальной частотой ТСЯ-мутантных лимфоцитов р=0,01, то при сопоставлении показателей группы сравнения и группы облученных лиц с повышенной частотой ТСЯ мутаций уровень значимости р=0,0009. В виду того, что степень активации экспрессии 8ТЛТ3 напрямую зависит от функционального состояния комплекса ТСЯ/СВ3 [270], полученные данные могут свидетельствовать о нарушении регуляции передачи этого сигнала, что в конечном итоге является причиной более выраженного снижения экспрессии 8ТЛТ3 у облученных людей с повышенной частотой ТСЯ-мутантных лимфоцитов (рисунок 11).

Рисунок 11 - Распределение относительного содержания мРНК гена STA T3 в отдаленные сроки у облученных лиц с разной частотой TCR-мутантных лимфоцитов

У облученных лиц с повышенной частотой TCR-мутантных клеток наблюдалось достоверно статистически значимо более низкое относительное содержание мРНК гена И0001 (р=0,03), чем в группе сравнения (рисунок 12). Поскольку продукт этого гена принимает участие в системе эксцизионной репарации оснований ДНК и направлен на удаление повреждений клеточных структур, возникших в результаты действия АФК [146], полученные в данном исследовании результаты, могут свидетельствовать о функциональной несостоятельности этого гена, как одной из причин повышенной частоты генных мутаций.

Рисунок 12 - Распределение относительного содержания мРНК гена 0001 в отдаленные сроки у облученных лиц с разной частотой ТСЯ-мутантных лимфоцитов

В дополнение, у облученных лиц с повышенной частотой TCR-мутантных лимфоцитов отмечено достоверно низкое относительное содержание мРНК гена Б^-2 по отношению к группе сравнения (р=0,02) и группе облученных лиц с нормальной частотой ТСЯ-мутантных ЛПК (на уровне тенденции р=0,06), что указывает на более выраженную активацию апоптоза у лиц с повышенной частотой клеток, мутантных по генам Т-клеточного рецептора (рисунок 13).

Рисунок 13 - Распределение относительного содержания мРНК гена БСЬ-2 в отдаленные сроки у облученных лиц с разной частотой ТСЯ-мутантных лимфоцитов

Результаты исследования косвенно свидетельствуют, что в отдаленные сроки после начала хронического облучения у лиц с повышенной частотой TCR-мутантных ЛПК происходит нарушение передачи сигнала ТСК/СВ3/8ТЛТ3. Это наблюдение является важным, поскольку одной из главных функций БТЛТ3 является активация механизмов пролиферации и дифференцировки Т-лимфоцитов [232]. Таким образом, нарушение экспрессии 8ТЛТ3 у лиц с повышенной частотой мутаций в генах Т-клеточного рецептора может являться одной из причин изменения системного иммунитета в отдалённые сроки после хронического радиационного воздействия. Снижение экспрессии мРНК гена 0001 может занимать первостепенное место в реализации повышенной частоты радиационно -индуцированного соматического мутагенеза, поскольку клетки с его пониженной регуляцией отличаются нарушением механизма репарации повреждения клеточных структур, в том числе ДНК [233]. В свою очередь низкие уровни мРНК антиапоптотического гена БСЬ-2 косвенно свидетельствует о запуске механизма элиминации потенциально опасных для организма клеток со структурными нарушениями ДНК, в частности клеток с мутациями в генах Т-клеточного рецептора.

3.5 Относительное содержание мРНК генов TP53, MDM2, ATM, BAX, BCL-2, CDKN1A, hOGG1, XPC, PADI4, MAPK8, NFkB1, STAT3 и GATA3 у хронически облученных лиц с различной интенсивностью апоптоза ЛПК в отдаленные сроки

На сегодняшний день доказано, что процесс апоптоза занимает одно из главных мест в реализации как ранних, так и отдаленных эффектов действия ИИ [234, 235]. Изменение течения этого процесса при возникновении генетических и эпигенетических нарушений может приводить к развитию патологических состояний, которые сопровождаются сохранением в облученном организме клеток с неограниченным пролиферативным потенциалом [236], и/или развитием дистрофических процессов, связанных с повышенной гибелью клеток [237].

Важно отметить, что полученные в настоящей работе результаты показывают изменение относительного содержания мРНК апоптотических генов BCL-2 и BAX спустя более 60 лет после начала хронического облучения у лиц, проживающих в прибрежных селах реки Течи, с накопленными дозами облучения ККМ от 77 до 3510 мГр по отношению к группе сравнения.

Согласно современным представлениям, апоптотические изменения в клетке характеризуются определенной фазовостью течения и включают два основных этапа активации этой программы (ранний и поздний) [238]. Ранний этап — фаза обратимых изменений, во время которой процесс гибели клетки может быть приостановлен, если повреждения клеточных структур будут успешно репарированы. Поздний этап — необратимая фаза, при которой происходит активное разрушение клеточных структур с образованием апототических телец. Результаты ранее проведенных исследований демонстрируют повышенную частоту ЛПК, находящихся только на ранней стадии активации апоптоза у представителей когорты реки Течи, и не показывают существенных изменений при исследовании поздней фазы апоптоза у этих лиц в отдаленные сроки [10]. Это наталкивает на мысль, что молекулярные механизмы реализации таких эффектов могут иметь принципиальные различия и, в первую очередь, зависеть от работы внутриклеточных систем клетки.

Биохимические изменения, которые возникают в процессе активации механизма программированной гибели клетки, включают миграцию фосфолипида фосфатидилсерина (PS) с внутренней на внешнюю сторону плазматической мембраны [209]. Согласно современным данным, локализация PS на поверхности мембраны является маркером

активации апоптоза и регистрируется до начала фрагментации ДНК и полной деградации клетки.

В настоящем исследовании облучённые лица были разделены по принципу превышения критического значения интенсивности апоптоза ЛПК на ранней стадии. В качестве критерия повышения частоты раннего апоптоза принималось значение, равное сумме среднего значения показателя в группе сравнения и двухкратной величине стандартного отклонения для данного показателя. Среднее значение частоты клеток, находящихся на ранней стадии гибели в группе сравнения, равнялось 3,05%, стандартное отклонение составило 4,52. Таким образом, критическое значение для формирования группы лиц с повышенной интенсивностью раннего апоптоза лимфоцитов составило: 3,05+2*4,52=12,09 %. Лица, у которых наблюдалось значение превышающие 12,09%, попадали в группу людей с повышенной частотой апоптоза ЛПК на ранней стадии.

В исследовании было включено 119 жителей прибрежных сел реки Течи (таблица 25).

Таблица 25 — Характеристика группы облученных лиц с нормальной и повышенной

интенсивностью раннего апоптоза ЛПК

Основная группа

Облученные лица с Облученные лица с

Группа нормальной повышенной

Показатели сравнения интенсивностью интенсивностью

N=47 апоптоза ЛПК на ранней стадии N=55 апоптоза ЛПК на ранней стадии N=17

Частота апоптотических 3,05 ± 0,49 (0,01-11,7) 3,00 ± 0,40 (0,01-11,7) 15,9 ± 0,62 (13,1-21,8)

клеток, %: М ± ББ (шт-шах)

Возраст на время проведения обследования, 62,0 70,0 70,0

лет: Ме (01-03) (57,0-69,0) (64,0-74,0) (65,0-75,0)

Дозовые характеристики М ± ББ (шт-шах)

Мощность дозы на ККМ в период максимального воздействия, мГр/год 0,72 ± 0,3 (0-9) 163 ± 20 (11-663) 191 ± 42 (21-560)

Накопленная доза 19 ± 2 642 ± 61 577 ± 84

облучения ККМ, мГр (0-67) (77-1867) (111-1226)

Мощность дозы на тимус и периферические органы иммунной системы в период максимального 0,32 ± 0,1 (0-3) 45 ± 6 (2-239) 22 ± 5 (1-92)

воздействия, мГр/год

Накопленная доза

облучения тимуса и 8 ± 1 103 ± 14 52 ± 14

периферических органов (0-33) (2-488) (9-252)

иммунной системы, мГр

Примечания:

1- Ме (01-03) - медиана (25-75 процентили);

2- М±БЕ (шт-шах) - среднее±ошибка среднего (минимальное-максимальное значения)

Основная группа состояла из облученных людей с повышенной интенсивностью раннего апоптоза лимфоцитов и включала 17 человек в возрасте от 63 до 85 лет (средний возраст составлял 70,2 ± 1,5 годам). Второй исследуемой группой являлась группа облученных лиц с нормальной интенсивностью раннего апоптоза ЛПК (не превышающей значения спонтанного уровня, равной 12,09 %), состоящей из 55 человек в возрасте от 62 до 87 лет (средний возраст составил 71,9 ± 0,8 года). Группа сравнения включала 47 человек, проживающих в сходных хозяйственно-бытовых условиях, на тех же территориях, но с накопленной дозой облучения ККМ менее 70 мГр за весь период своей жизни, и интенсивностью раннего апоптоза ЛПК, не превышающей значения спонтанного уровня, равного 12,09 %.

Группы облученных лиц с нормальной и повышенной интенсивностью раннего апоптоза были сопоставимы по дозе и мощности дозы облучения ККМ в период максимального воздействия. Диапазон индивидуальных значений мощности дозы на ККМ в период максимального воздействия в группе лиц с нормальной интенсивностью раннего апоптоза составил от 11 до 663 мГр/год (среднее значение - 163 ± 20 мГр/год), в группе облученных людей с повышенной интенсивностью раннего апоптоза ЛПК диапазон доз облучения ККМ составил от 21 до 560 мГр/год (среднее значение - 191 ± 42 мГр/год). Диапазоны индивидуальных значений поглощённых доз облучения ККМ составляли от 77 до 1867 мГр (среднее значение - 642 ± 61 мГр) в группе лиц с нормальной интенсивностью раннего апоптоза лимфоцитов и от 111 до 1226 мГр (среднее значение -577±84 мГр) в группе лиц с повышенной интенсивностью апоптоза ЛПК. Обращает на себя внимание, что средние значения доз и мощностей доз на ККМ в период максимального воздействия у облученных лиц с нормальной и повышенной интенсивностью апоптоза ЛПК существенно превышали таковые на тимус и периферические органы иммунной системы. Так, диапазон индивидуальных значений мощности дозы облучения тимуса и периферических органов иммунной системы в период максимального воздействия в группе облученных людей с нормальной интенсивностью

раннего апоптоза ЛПК составил 2-239 мГр/год (среднее значение - 45±6 мГр/год). В группе облученных лиц с повышенной интенсивностью раннего апоптоза лимфоцитов средняя мощность дозы на тимус, полученная в период максимального воздействия, была равна 22±5 мГр/год (диапазон индивидуальных значений показателя составил от 1 до 92 мГр/год). Диапазоны индивидуальных значений поглощённых дозы облучения тимуса и периферических органов иммунной системы составляли от 2 до 448 мГр (среднее значение - 103 ± 14 мГр) в группе лиц с нормальной интенсивностью раннего апоптоза ЛПК и от 9 до 252 мГр (среднее значение -52 ±14 мГр) в группе облученных лиц с повышенной частотой интенсивностью раннего апоптоза лимфоцитов. Поглощенные дозы облучения группы сравнения были достоверно меньше и не превышали 67 мГр для ККМ, и 33 мГр для тимуса и периферических органов иммунной системы.

Показатели относительного содержания мРНК исследуемых генов у облученных лиц с разной интенсивностью раннего апоптоза ЛПК и группы сравнения представлены в таблице 26.

Таблица 26. Относительное содержание мРНК генов в группах обследованных лиц с

разной интенсивностью раннего апоптоза ЛПК

Относительное содержание мРНК, отн. ед:-Ме (01-03)

Облученные лица с Облученные лица с

Ген Группа сравнения N=47 нормальной повышенной

интенсивностью раннего апоптоза ЛПК N=55 интенсивностью раннего апоптоза ЛПК N=17

ЛТМ 0,97 0,90 0,99

(0,85-1,19) (0,82-1,06) (0,91-1,24)

ТР53 1,27 1,07 1,07

(0,85-1,28) (0,73-1,29) (0,97-1,27)

1,07 (0,80-1,51) 0,85 1,05

МБМ2 (0,67-1,21) р1=0,006 (0,94-1,30) р3=0,05

СБШМ 0,86 0,96 0,97

(0,74-1,00) (0,78-1,31) (0,73-1,15)

БЛХ 1,07 1,15 1,26

(0,80-1,33) (1,01-1,28) (1,12-1,46)

1,08 (0,75-1,31) 0,91 0,87

БСЬ-2 (0,68-1,12) р1=0,04 (0,61-1,02) р2=0,08

ХРС 1,02 1,08 1,04

(0,86-1,29) (0,95-1,21) (0,96-1,16)

И0001 0,94 0,93 0,87

(0,78-1,09) (0,68-1,22) (0,68-0,94)

1,57

РАЫ4 0,68 (0,42-0,94) 0,72 (0,45-1,69) (0,72-2,18) p2=0,001 p3=0,05

МАРК8 0,86 0,95 1,26

(0,62-1,47) (0,54-1,46) (0,70-1,81)

ШкБ1 0,85 0,79 0,69

(0,51-1,60) (0,47-1,22) (0,46-1,20)

1,07 (0,79-1,37) 0,84 (0,69-1,43) 0,64

$>ТАТ3 (0,39-0,85) p2=0,05

0АТА3 0,77 (0,60-1,18) 0,87 (0,65-1,48) 0,80 (0,56-1,05)

Примечание:

1- р1 - уровень статистической значимости различий показателей между группой сравнений и облученными людьми с нормальной интенсивностью раннего апоптоза;

2- р2 - уровень статистической значимости различий показателей между группой сравнения и облученными людьми с повышенной интенсивностью раннего апоптоза;

3- р3 - уровень статистической значимости различий показателей между облученными людьми с нормальной и повышенной интенсивностью раннего апоптоза.

Процессы обнаружения повреждений клеточных структур неразрывно связаны с апоптозом клетки, однако, в рамках текущего исследования, не было отмечено существенных изменений в содержании мРНК генов репарации ДНК А ТМ, ХРС и 0001 у облученных жителей прибрежных сел реки Течи с повышенной частотой раннего апоптоза ЛПК в отдаленные сроки. Так же как и не было отмечено изменений экспрессии мРНК генов контроля клеточного цикла ТР53 и СВКЫ1А. Согласно данным, представленным в таблице 26, в отдаленные сроки у облученных людей с нормальной интенсивностью раннего апоптоза ЛПК отмечено статистически значимо более низкое относительное содержание мРНК гена МБМ2 по сравнению с группой сравнения (р<0,01) и группой облученных людей с повышенной интенсивностью раннего апоптоза (р=0,05) (рисунок 14).

Рисунок 14 - Распределение относительного содержания мРНК гена МОМ2 в отдаленные сроки у облученных лиц с разной интенсивностью раннего апоптоза ЛПК

Важно отметить, что полученные данные в очередной раз подтверждают информацию об изменении экспрессии мРНК гена БСЬ-2 в отдаленные сроки у облученных лиц, что соответствуют текущим представлениям молекулярной основы радиационно-индуцированной гибели клетки. На рисунке 15 видно, что по отношению к группе сравнения (медиана - 1,08 отн. ед.) относительное содержание мРНК гена БСЬ-2 в крови у облучённых лиц как с нормальной интенсивностью раннего апоптоза (медиана -0,91 отн. ед., р=0,04), так и с повышенной интенсивностью раннего апоптоза (медиана -0,87 отн. ед., р=0,08 (на уровне тенденции)) было низким.

К 2.5-

<ч

ей

К

О)

1.5-

ш

«и ЕС О

О

•

• •

• V

• • •

• •

•

•

-V-• • V Г н I* • г .