СОЗДАНИЕ ЛИПОСОМАЛЬНОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ФОРМЫ ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОРА НА ОСНОВЕ БОРИРОВАННОГО ХЛОРИНА Е6 тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.04.01, кандидат наук Дмитриева Мария Вячеславовна

• Дмитриева Мария Вячеславовна
• кандидат наук
• 2016

Оглавление диссертации кандидат наук Дмитриева Мария Вячеславовна

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

СПИСОК ТЕРМИНОВ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Фотодинамическая терапия

1.1.1. Фотодинамическая терапия в онкологии

1.1.2. Сущность метода ФДТ

1.1.3. Типы фотореакций и механизмы гибели опухолевой клетки

1.1.4. Источники света для ФДТ

1.1.5. Фотосенсибилизаторы

• ФС I поколения

• ФС II поколения. Хлорины

• ФС III поколения. Липосомальные ФС

• Борхлорин - борированное производное хлорина е6

1.2. Липосомы

1.2.1. Свойства липосом

1.2.2. Состав и структура липосом

1.2.3. Включение лекарственных веществ в липосомы

1.2.4. Классификация липосом

1.2.5. Методы получения липосом

1.2.6. Стерилизация липосом

1.2.7. Лиофилизация липосом

1.2.8. Контроль качества ЛЛФ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования

2.1. Материалы и реактивы

2.2. Оборудование

2.3. Методы исследования

2.3.1. Методы получения липосом

А. Метод получения многослойных липосом борхлорина

Б. Методы получения однослойных липосом борхлорина

В. Метод получения «пустых» липосом

2.3.2. Стерилизация липосом борхлорина

2.3.3. Лиофилизация ЛЛФ борхлорина

Методика лиофилизации ЛЛФ борхлорина

2.3.4. Методы анализа ЛЛФ и ЛЛФ-лио борхлорина

• Качественный хроматографический анализ ЛЛФ и ЛЛФ-лио борхлорина

• Количественный спектрофотометрический анализ борхлорина в ЛЛФ и

ЛЛФ-лио

Валидация методики спектрофотометрического анализа борхлорина

• Определение эффективности включения борхлорина в липосомы

• Определение рН липосомальной дисперсии борхлорина

Методика определения значения рН ЛЛФ и ЛЛФ-лио борхлорина

• Определение диаметра липосом борхлорина

Методика определения размера липосом борхлорина

• Определение формы липосом борхлорина с помощью электронной микроскопии (негативное контрастирование)

• Методика определения потери в массе при высушивании

2.3.5. Статистическая обработка данных

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

ГЛАВА 3. Разработка состава и технологии получения ЛЛФ-лио борхлорина

3.1. Разработка состава ЛЛФ борхлорина

3.2. Разработка технологии получения ЛЛФ-лио борхлорина

3.2.1. Получение липидной пленки

3.2.2. Выбор дисперсионной среды для гидратации липидной пленки

3.2.3. Получение однослойных липосом борхлорина

• Метод экструзии

• Метод озвучивания

• Метод гомогенизации

3.2.4. Разработка технологии лиофилизации ЛЛФ борхлорина

• Выбор криопротектора для лиофилизации ЛЛФ борхлорина

• Изучение влияния концентрации сахарозы в качестве криопротектора для лиофилизации ЛЛФ борхлорина

• Выбор режима лиофилизации ЛЛФ борхлорина

3.2.5. Сравнение технологий получения ЛЛФ-лио борхлорина

3.2.6. Технологическая схема получения и состав ЛЛФ-лио борхлорина

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ГЛАВА 4. Разработка методик контроля качества ЛЛФ и ЛЛФ-лио борхлорина

4.1. Разработка методики ТСХ для качественного анализа ЛЛФ и ЛЛФ-лио борхлорина

4.1.1. Методика ТСХ-анализа борхлорина и липидных компонентов ЛФ

4.1.2. Выбор подвижной фазы для ТСХ-анализа борхлорина и липидных компонентов ЛФ

4.1.3. Выбор подвижной фазы для ТСХ-анализа ФХ, входящего в состав ЛФ борхлорина

4.1.4. ТСХ-анализ сахарозы, входящей в состав ЛЛФ-лио борхлорина

4.1.5. Оценка пригодности хроматографической системы

4.2. Разработка методики спектрофотометрического анализа борхлорина в ЛЛФ и ЛЛФ-лио

4.2.1. Изучение спектральных характеристик борхлорина и его идентификация (определение подлинности) в ЛФ

4.2.2. Изучение влияния вспомогательных веществ на спектрофотометрическое определение борхлорина в ЛФ (оценка специфичности)

4.2.3. Определение максимума поглощения для количественного

спектрофотометрического анализа борхлорина в ЛФ

4.2.4. Оценка соблюдения закона Бугера-Ламберта-Бера

4.2.5. Количественное определение борхлорина в липосомальной дисперсии до и

после лиофилизации

А. Методика спектрофотометрического определения борхлорина в ЛЛФ

Б. Методика спектрофотометрического определения борхлорина в лиофилизате

4.2.6. Валидация методики спектрофотометрического анализа борхлорина

• Специфичность

• Диапазон применения

• Линейность

• Правильность (точность)

• Прецизионность

А. Повторяемость (сходимость)

Б. Внутрилабораторная (промежуточная) прецизионность

• Робастность

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Глава 5. Стандартизация и изучение стабильности в процессе хранения ЛЛФ-лио

борхлорина

5.1. Показатели для стандартизации ЛЛФ-лио борхлорина

5.2. Изучение стабильности ЛЛФ-лио борхлорина в процессе хранения

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЯ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

БМВ - большие моноламеллярные везикулы

ВВО - внутренний водный объем

Кр - коэффициент распределения

ЛВ - лекарственное вещество

ЛЛФ - липосомальная лекарственная форма

ЛЛФ-лио - лиофилизированная липосомальная лекарственная форма

ЛП - лекарственный препарат

ЛФ - лекарственная форма

М - молекулярная масса

МКА - моноклональное антитело

МЛВ - мультиламеллярные везикулы

МСЛ - многослойные липосомы

ММВ - малые моноламеллярные везикулы

ОВЛ - олиговезикулярные липосомы

ОЛВ - олиноламеллярные везикулы

ОСЛ - однослойные липосомы

ПВП - поливинилпирролидон

ПЭГ - полиэтиленгликоль

ПЭГ-ДГФА - 1,2-дистеароил-.от-глицеро-3-фосфоэтаноламин-Ы-[метокси

(полиэтиленгликоль)-2000] аммониевая соль, пэгелированный фосфолипид

РЭС - ретикулоэндотелиальная система

СДЛВ - система доставки лекарственного вещества

СК - синглетный кислород

СО - стандартный образец

СОВС - стандартный образец вещества-свидетеля

ТСХ - тонкослойная хроматография

Тэ - температура эвтектики

Тф.п. - температура фазового перехода

ФЛ - фосфолипид

ФД - флюоресцентная диагностика

ФДТ - фотодинамическая терапия

ФС - фотосенсибилизатор

ФХ - фосфатидилхолин

ЭВ - эффективность включения

Нр - гематопорфирин

НрБ - производное гематопорфирина

СПИСОК ТЕРМИНОВ

Активная загрузка: загрузка лекарственных веществ в липосомы с использованием специальных физико-химических методов.

Гидратация липидной пленки: процесс, следующий после стадии формирования липидной пленки и заключающийся в добавлении к ней воды или водных растворов с целью смывания и получения липосомальной дисперсии.

Гомогенизация липосом: гомогенизация представляет собой процесс уменьшения размера и диспергирования везикул в результате воздействия высокого давления на дисперсию многослойных липосом, пропускаемую через специальный клапан.

Инкапсулирование (инкапсуляция): процесс включения гидрофильного лекарственного вещества во внутрилипосомальное пространство.

Криопротектор: вещество, защищающее липосомы от повреждения в процессе лиофилизации.

Лиофилизация/сублимационная сушка: способ сушки влагосодержащих материалов, продуктов, культур микроорганизмов при низкой температуре (из замороженного состояния) в вакууме. Лиофилизированные материалы восстанавливают свои исходные свойства при добавлении к ним воды.

Липидный/фосфолипидный бислой: двойной молекулярный слой, формируемый полярными липидами в водной среде.

Липосомы: самообразующиеся в водной среде фосфолипидные везикулы сферической формы.

Липосомальная лекарственная форма: лекарственная форма, содержащая лекарственный препарат, включенный в состав липосом, и необходимые вспомогательные вещества.

Многослойные (мультиламеллярные) липосомы/везикулы: везикулы, имеющие размеры более 500 нм и состоящие из нескольких десятков-сотен липидных бислоев.

Наноразмерные системы доставки лекарственных веществ: носители лекарственных веществ, имеющие размер от одного до нескольких сотен нм.

Невключенное вещество: лекарственное вещество, которое не удалось ввести в липосомы в результате технологических операций.

Однослойные (моноламеллярные) липосомы/везикулы: везикулы, имеющие размеры от 20-100 нм (малые) до 1000 нм (большие) и состоящие из одного липидного бислоя.

Озвучивание/обработка УЗ липосом: метод получения липосом, заключающийся в обработке дисперсии многослойных везикул пульсирующими звуковыми волнами высокой частоты, в результате которой происходит разрыв везикул с образованием дисперсии однослойных липосом.

Пассивная загрузка: загрузка лекарственных веществ в липосомы без использования специальных физико-химических методов.

Пэгилированные липосомы: липосомы, содержащие в своем составе фосфолипиды, конъюгированные с полиэтиленгликолем/ПЭГом.

«Пустые» липосомы: липосомы, не содержащие лекарственного вещества.

Регидратация: процесс восстановления структуры липосом после смешивания лиофилизата с водой.

Слияние липосом: формирование новых липосом большего размера путем слияния малых липосом.

Температура фазового перехода липида: температура, при которой липид переходит из одного фазового состояния в другое.

Фосфолипиды: сложные эфиры многоатомных спиртов и высших жирных кислот, являющиеся основным компонентом липосом.

Фотодинамическая терапия рака: метод лечения онкологических заболеваний, который основан на способности фотосенсибилизаторов избирательно накапливаться в опухолевой ткани и при воздействии светового излучения генерировать образование цитотоксичных продуктов, приводящих к разрушению жизненноважных структур раковых клеток и их гибели.

Фотосенсибилизатор: природное или искусственно синтезированное вещество, способное к фотосенсибилизации биологических тканей, то есть увеличению их чувствительности к воздействию света.

Экструзия липосом: метод получения однослойных липосом посредством продавливания дисперсии многослойных везикул через поры мембранных фильтров под давлением в специальных устройствах - экструдерах. Средний размер получаемых липосом определяется диаметром пор фильтра.

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «СОЗДАНИЕ ЛИПОСОМАЛЬНОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ФОРМЫ ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОРА НА ОСНОВЕ БОРИРОВАННОГО ХЛОРИНА Е6»

Актуальность темы

Фотодинамическая терапия (ФДТ) является одним из наиболее динамично развивающихся методов лечения злокачественных новообразований. ФДТ выгодно отличается от традиционных методов лечения злокачественных опухолей высокой избирательностью поражения, отсутствием риска хирургического вмешательства, тяжелых местных и системных осложнений лечения, возможностью многократного повторения при необходимости и сочетанием в одной процедуре диагностики и лечебного воздействия.

ФДТ - двухкомпонентный метод. Одним компонентом является светочувствительное вещество - фотосенсибилизатор (ФС), вторым -световое излучение низкой интенсивности и определенной длины волны, соответствующей пику поглощения ФС. Поглощение энергии света ФС приводит к фотохимической реакции с образованием цитотоксичных продуктов: активных форм кислорода и свободных радикалов, действие которых на опухолевые клетки ведет к их гибели путем апоптоза или некроза благодаря сосудистому механизму действия. Тромбоз сосудов стромы новообразования под действием ФДТ приводит к нарушению кровоснабжения и геморрагическому некрозу опухоли с постепенной резорбцией в последующие две-три недели и замещением ее соединительной тканью. Селективность повреждения опухоли достигается за счет преимущественного накопления ФС в раковых клетках с последующим прицельным облучением новообразования. Поэтому при ФДТ онкологических заболеваний ФС вводятся в организм в основном внутривенно, реже - внутрь полости и перорально, а также в виде наружной аппликации.

В настоящее время в клинической практике при ФДТ применяется целый ряд ФС («Фотофрин», «Фотогем», «Визудин», «Левулан», «Аласенс»,

«Фотодитазин», «Фотолон», «Фотосенс» и др.), созданных на основе соединений различных химических классов. Однако наряду с ныне используемыми препаратами продолжаются активные поиски и исследования новых, более эффективных ФС. В течение последних двух десятилетий особый интерес в качестве ФС представляют производные природных хлорофиллов - хлорины. Установлено, что ФС хлоринового ряда быстро накапливаются в опухолевой ткани с высоким градиентом контрастности опухоль/здоровая ткань, обладают высокой фотодинамической активностью и терапевтической эффективностью. Кроме того, хлорины быстро выводятся из организма, что полностью решает проблему длительной кожной фототоксичности, являющейся основным недостатком почти всех применяющихся в клинике ФС.

Одним из перспективных отечественных ФС хлоринового ряда, является борхлорин - оригинальное борированное производное хлорина е6 с максимумом поглощения при длине волны (662±2) нм. Данные, полученные в результате проведения ФДТ с внутрибрюшинным введением субстанции борхлорина (в виде 2% раствора в ДМСО) на штаммах опухолей саркомы М-1, меланомы В-16, карциномы Эрлиха и карциномы Льюиса, свидетельствуют о его высокой фотодинамической активности и противоопухолевой эффективности. Поскольку данный ФС является гидрофобным веществом, предложена инкапсуляция борхлорина в липосомы и создание стерически стабилизированной липосомальной лекарственной формы (ЛЛФ), позволяющей вводить препарат внутривенно. Степень разработанности темы исследования

В рамках Федеральной целевой программы «Развитие фармацевтической и медицинской промышленности Российской Федерации на период до 2020 года и дальнейшую перспективу» в Институте элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова РАН (г. Москва) синтезирована и отобрана для проведения комплекса исследований

субстанция нового оригинального ФС на основе борированного хлорина е6. Согласно результатам доклинических исследований, проведенным в ФГБУ «Медицинский радиологический научный центр» МЗ РФ, борхлорин обладает высокими фотоактивными свойствами, что позволяет рассматривать его в качестве перспективного препарата для ФДТ злокачественных новообразований.

Целью настоящего исследования являлось создание лиофилизированной стерически стабилизированной ЛЛФ борхлорина для внутривенного введения.

Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие задачи:

1. На основании технологических и химико-фармацевтических исследований установить оптимальный состав ЛЛФ борхлорина.

2. Разработать технологию получения устойчивой при хранении лиофилизированной ЛЛФ (ЛЛФ-лио) борхлорина для внутривенного введения.

3. Разработать методику качественного анализа для контроля качества ЛЛФ и ЛЛФ-лио борхлорина.

4. Разработать методику количественного анализа для контроля качества ЛЛФ и ЛЛФ-лио борхлорина.

5. Выбрать химико-фармацевтические показатели качества для стандартизации ЛЛФ-лио борхлорина и изучить ее стабильность в процессе хранения.

6. Составить проект НД на ЛЛФ-лио борхлорина.

Научная новизна работы

В результате проведенных исследований впервые создана стабильная при хранении ЛЛФ-лио оригинального отечественного ФС на основе борированного хлорина е6 для внутривенного введения. Установлен оптимальный состав ЛЛФ борхлорина и разработана технология получения

ЛЛФ-лио борхлорина, имеющие ряд особенностей, связанных с наличием у ФС гидрофобных свойств. Предложены методики качественного и количественного анализа лекарственной формы (ЛФ) борхлорина. Определены показатели оценки качества и проведена стандартизация разработанного препарата «Борхлорин липосомальный, лиофилизат для приготовления дисперсии для инъекций 1,0 мг». Теоретическая значимость работы

Теоретическая значимость работы заключается в обосновании выбора состава и способа получения стерически стабилизированной ЛЛФ борхлорина, являющегося гидрофобным соединением. Также доказано и экспериментально обосновано применение лиофилизации в технологии получения ЛЛФ-лио борхлорина с целью повышения ее стабильности в процессе хранения. Представленный в работе экспериментально-практический материал может служить теоретической базой для создания лиофилизированных ЛЛФ гидрофобных субстанций.

Практическая значимость исследований

В результате проведенных исследований разработан препарат «Борхлорин липосомальный, лиофилизат для приготовления дисперсии для инъекций 1,0 мг», что позволило провести комплекс доклинических исследований ЛФ нового ФС и рекомендовать ее для клинических испытаний. На основании выбранных показателей качества составлен проект НД на препарат «Борхлорин липосомальный, лиофилизат для приготовления дисперсии для инъекций 1,0 мг». Результаты исследований по разработке состава, технологии получения и методик анализа ЛЛФ-лио борхлорина внедрены в работу лаборатории разработки лекарственных форм НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей (ЭДиТО) ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» Минздрава России и научно-производственной фирмы ООО «ВЕТА-ГРАНД» (Россия) (Акты внедрения - Приложения 6 и 7).

Методология и методы исследования

Методологическую основу исследования составили труды российских ученых в области разработки технологии получения липосомальных форм диагностических и лекарственных препаратов Н.А. Оборотовой, Е.Л. Водовозовой, А.П. Каплуна, Ю.М. Краснопольского и др. При проведении исследования использованы:

• методы сравнительного документированного анализа;

• технологические методы: получение липидной пленки, экструзия, гомогенизация, УЗ обработка, сублимационная сушка;

• химико-фармацевтические методы: хроматография в тонком слое сорбента, спектрофотометрия, лазерная спектроскопия рассеяния, потенциометрия;

• математические методы анализа и обработки результатов, полученных в ходе экспериментальной работы.

Степень достоверности результатов

При проведении экспериментальной работы использовано сертифицированное современное оборудование. Методами статистической обработки установлена прецизионность и правильность результатов исследований, что позволяет считать их достоверными.

Апробация работы

Материалы научных исследований по теме диссертации были представлены на конференциях: Белорусско-Российской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты» (23-25 мая 2013 г., Минск), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Противоопухолевая терапия: от эксперимента к клинике» (20-21 марта 2014 г., Москва), V Научно-практической конференции «Актуальные проблемы оценки безопасности лекарственных средств» (20 марта 2014 г., Москва), XII Всероссийской научно-практической конференции с

международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты» (31 марта - 1 апреля 2015 г., Москва). Апробация диссертационной работы прошла 28 октября 2015 г. на межлабораторной научной конференции НИИ ЭДиТО ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» Минздрава России. Личный вклад автора

Автор принимал непосредственное участие в постановке целей и задач настоящего исследования, их экспериментальной реализации, анализе и обобщении данных, изложении полученных результатов в виде научных публикаций. В работах, выполненных в соавторстве, автором проведена аналитическая и статистическая обработка, научное обоснование и обобщение полученных результатов. Автором лично проанализирована научная литература по данной теме, выбран состав и разработана технология получения ЛФ борхлорина, а также предложены методики качественного и количественного анализа разработанного препарата. Разработан проект НД на «Борхлорин липосомальный, лиофилизат для приготовления дисперсии для инъекций 1,0 мг».

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтической науки

Диссертация выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ НИИ ЭДиТО ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» Минздрава России по темам «Наноструктурированные лекарственные формы гидрофобных субстанций» (2009-2013 гг.) и «Инъекционные лекарственные формы гидрофобных субстанций» (2013-2017 гг.), а также в рамках Федеральной целевой программы «Развитие фармацевтической и медицинской промышленности Российской Федерации на период до 2020 года и дальнейшую перспективу» по теме «Доклинические исследования мембраноактивного фотосенсибилизатора на основе борированного хлорина е6 для терапии опухолей».

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Состав ЛЛФ борхлорина.

2. Технология получения ЛЛФ-лио борхлорина.

3. Методики химико-фармацевтического анализа ЛЛФ и ЛЛФ-лио борхлорина: качественный хроматографический анализ компонентов ЛФ и количественное спектрофотометрическое определение борхлорина в ЛФ.

4. Результаты контроля качества экспериментальных серий ЛЛФ-лио борхлорина и изучения их стабильности в процессе хранения. Соответствие диссертации паспорту научной специальности

Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.04.01 - технология получения лекарств. Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пунктам 1, 3 и 4 паспорта специальности технология получения лекарств. Публикации

По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ, из которых 4 являются статьями в журналах, включенных в перечень ведущих периодических изданий ВАК РФ. Структура и объем диссертации

Структура диссертационной работы включает введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследований, три главы собственных исследований, общее заключение, общие выводы, список литературы и приложения. Объем работы составляет 193 листа машинописного текста и содержит 50 рисунков, 29 таблиц. Список литературы состоит из 180 источников, в том числе 54 - на иностранном языке.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1.Фотодинамическая терапия. 1.1.1. Фотодинамическая терапия в онкологии

Борьба со злокачественными новообразованиями продолжает оставаться одной из приоритетных задач в медицине. По прогнозам ВОЗ за 1999-2020 гг. заболеваемость и смертность от онкологических заболеваний во всем мире возрастет в 2 раза, поэтому разработка и внедрение новых, высокотехнологических методов ранней диагностики и лечения рака является актуальной проблемой современной медицины [114].

Возможности современной онкологии значительно расширились с появлением ФДТ, которая по сравнению с традиционными методами лечения рака, обладает целым рядом преимуществ:

> высокая эффективность, позволяющая добиться 5-летних благоприятных отдаленных результатов;

> возможность применения ФДТ для лечения больных, у которых стандартные методы лечения оказались неэффективны или противопоказаны [39];

> избирательное разрушение опухоли при максимальном сохранении жизнеспособности окружающих опухоль нормальных тканей, обеспечение хорошего косметического и функционального результатов [23, 102, 105];

> отсутствие риска хирургического вмешательства, тяжелых местных и системных побочных реакций и осложнений, безопасность многократного повторения при необходимости лечебного сеанса;

> возможность использования для флюоресцентной диагностики (ФД) [103].

ФДТ является результатом комбинированного действия химиотерапевтических и физических методов воздействия: светочувствительного соединения - ФС, локального светового воздействия и кислорода. Противоопухолевые эффекты данного вида лечения обусловлены

комбинацией прямого фотоповреждения клеток, разрушения сосудистой сети опухоли и активации иммунного ответа [118].

ФС применяются как инициаторы химической реакции в биологической ткани. Первое детальное описание «химической фотосенсибилизации» биоткани относится к началу XX века. В 1900 г. О. Рааб установил, что низкие концентрации акридинового и других красителей, химически инертных в темноте, приводят к быстрой гибели парамеции при облучении их солнечным светом. В 1903-1905 гг. Г. Таппинер и А. Джесионек опубликовали результаты клинического применения эозина и флуоресцеина в качестве ФС при лечении герпеса, псориаза и рака кожи [122].

В 20-е гг. XX столетия было обнаружено, что раковая клетка обладает одним чрезвычайно интересным свойством: она может селективно накапливать и удерживать окрашенные вещества, как находящиеся в организме (эндогенные порфирины), так и вводимые в него извне (экзогенные порфирины). Наблюдение А. Поликарда в 1924 г. о том, что накопившиеся в опухоли животного эндогенные порфирины обладают способностью флуоресцировать при облучении светом видимой части спектра, явилось важным шагом на пути к созданию метода ФДТ рака [69].

Современная эпоха применения ФДТ в онкологии началась в начале 60-х гг. XX века с публикаций Р. Липсона, в которых было показано, что введенное внутривенно производное гематопорфирина (ИрЭ) накапливается в опухоли и при облучении синим светом флуоресцирует в красной области спектра. В 1966 г. появилось первое сообщение о применении ИрЭ для ФД и лечения пациентки с раком молочной железы, а спустя десять лет ИрЭ был успешно применен для лечения рака мочевого пузыря [24]. Началом широкого клинического применения ФДТ в онкологии считается 1978 г., когда американский профессор Т. Догерти сообщил об успешном лечении методом ФДТ 25 больных с опухолями кожи [114]. В дальнейшем метод

ФДТ получил развитие в Великобритании, Франции, Германии, Италии, Японии, Китае, Южной Корее и ряде других стран. Несмотря на многолетние исследования, в России ФДТ получила развитие только с 1992 г., когда в Московском институте тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова под руководством профессора А.Ф. Миронова был создан первый отечественный ФС - фотогем, относящийся к группе порфиринов [100].

В настоящее время ФДТ применяется при опухолях наружных и висцеральных локализаций, ранних и распространенных стадиях процесса, как компонент комбинированного и комплексного лечения рака различных локализаций [25]. Кроме того, ФДТ нашла широкое применение при целом ряде неопухолевых заболеваний в офтальмологии, оториноларингологии, гинекологии, дерматологии и других областях медицины. 1.1.2. Сущность метода ФДТ

Процесс ФДТ можно разделить на четыре основных этапа (Рисунок 1)

[69].

Рисунок 1. Этапы процедуры ФДТ [124]

На первом этапе в организм больного вводится ФС. В онкологии применяют в основном внутривенное введение ФС, реже - реже - внутрь полости и перорально, а также в виде наружной аппликации [101].

На втором этапе, который имеет продолжительность от нескольких часов до нескольких суток, происходит распределение и накопление ФС в

патологической ткани [69]. При этом препарат, обладающий тропностью к опухолевым клеткам, концентрируется в опухоли и повышает ее чувствительность к свету в спектральных диапазонах, соответствующих полосам поглощения ФС [101].

Полностью не ясен механизм проникновения и селективного удерживания ФС в опухолевых клетках, однако существует несколько гипотез:

• более длительная задержка опухолью и более быстрое выведение ФС из окружающей нормальной ткани, обусловленные аномальным строением кровеносных и лимфатических сосудов опухоли, их повышенной проницаемостью и связыванием ФС с альбуминами;

• низкий рН внеклеточной жидкости в опухолях способствует связыванию ФС клетками, так как при снижении рН повышается липофильность порфиринов и облегчается проникновение их в клетки;

• особенности липидного обмена биомембран опухолевых клеток. В опухоли много рецепторов липопротеинов низкой плотности, связывающих большое количество гидрофобных молекул ФС [137]. Фармакокинетика ФС, в особенности уровень накопления в тканях,

проникновение в клетки и характер его внутритканевого и внутриклеточного распределения (Рисунок 2) зависит не только от свойств органов или тканей, но и в значительной степени от физико-химических характеристик самого ФС [88].

Гидрофильные ФС локализуются преимущественно в кровеносных сосудах. Проникновению в клетку полярных ФС препятствует липидный бислой клеточной мембраны. Для анионных красителей дополнительным барьером служит отрицательный заряд клеточной поверхности. Поэтому гидрофильные анионные ФС, такие как К-аспартил-хлорин е6 и фотосенс, попадают в цитоплазму, а затем в эндосомы и лизосомы путем эндоцитоза. При освещении лизосомальные мембраны разрушаются, а ФС может

перераспределяться внутри клетки и неспецифически окрашивать внутриклеточные структуры [113, 146]. Катионные красители, например, некоторые производные порфирина, селективно локализуются в митохондриях, матрикс которых имеет высокий отрицательный потенциал порядка 200 мВ относительно цитозоля [140].

Аииомны* гидрофильны« ФС

Гидрофобии* ФС

Рисунок 2. Внутриклеточная локализация ФС [26]

Гидрофобные ФС, например фоскан, локализуются преимущественно в перинуклеарной области, богатой митохондриями, цистернами эндоплазматического ретикулума, комплексами Гольджи, лизосомами и многочисленными везикулами, а также в плазматической мембране [172]. Они легко проникают в липидную фазу мембран, но выход из нее в водную среду затруднен. С доставкой гидрофобных ФС могут возникать определенные трудности, т.к. они не растворимы в воде и при внутривенном

введении могут агрегировать или связываться с белками и клетками крови и других тканей. Амфифильные вещества с ассиметричным распределением полярных и неполярных групп в молекуле лучше проникают в клетки и более эффективно фотосенсибилизируют их. Они одновременно и водо-, и жирорастворимы. Встретив биомембрану, они встраиваются в нее с помощью своей липофильной части, а затем легко выходят в цитозоль, диффундируют с последующим включением в мембраны цитоплазматических органелл. Липофильные вещества связываются с естественными переносчиками - липопротеинами, альбуминами и др., накапливаются в опухолевой ткани и хорошо проникают в клетки, распределяясь в различных клеточных мембранах, и поэтому считаются более эффективными [26, 163].

Достигнув максимальной концентрации в опухоли, ФС начинает постепенно выводиться из организма. Это дает возможность определить время, когда отношение концентрации ФС в опухоли к его концентрации в окружающих тканях максимально. В этом случае достигается наибольшая селективность воздействия, позволяющая полностью разрушить опухоль и не вызвать необратимых метаболических изменений в окружающих опухоль и подлежащих нормальных тканях [112].

На третьем этапе производят селективное облучение пораженного участка источником света с длиной волны, соответствующей пику поглощения ФС, в течение 15-20 минут. При определении возможности проведения ФДТ и выборе подходящего ФС одним из важнейших факторов является глубина терапевтического воздействия на биоткань.

Глубина проникновения света в сенсибилизированную биоткань определяется суммой поглощения ФС и собственного поглощения биоткани, обусловленного наличием в ней эндогенных флюорохромов (меланина, гемоглобина и т.д.). Эффективность использования терапевтического излучения при ФДТ глубоко расположенных слоев опухолей повышается при

снижении собственного поглощения биоткани и может быть достигнута в спектральном диапазоне максимальной прозрачности («окно прозрачности» биоткани). Оптимальное соотношение между поглощением ФС и собственным поглощением биоткани составляет примерно 3-4 при высокой прозрачности биоткани и спадает до значений 1,5-2 при увеличении ее поглощения. Поэтому повышение селективности накопления ФС может существенно увеличить эффективность использования терапевтического излучения при ФДТ глубоко расположенных опухолей [64].

Поглощение энергии света препаратом приводит к фотохимической реакции с образованием цитотоксичных продуктов, главным из которых является синглетный кислород. Действие этих продуктов на опухолевые клетки ведет к их прямому повреждению с последующим частичным или полным восстановлением пораженных участков в течение 2-4 недель. Этот процесс представляет заключительный четвертый этап метода ФДТ [69]. 1.1.3. Типы фотореакций и механизмы гибели опухолевой клетки

В 1904 г. Г. Таппинер ввел термин «фотодинамическое действие» для описания специфической фотохимической реакции, которая приводит к гибели биологических систем в присутствии света, поглощающего световое излучение красителя и кислорода [24].

При поглощении кванта видимого света молекула ФС переходит из

основного электронного состояния Б0 в короткоживущее синглетное

1 *

возбужденное состояние Б , которое в результате флуоресценции или внутренней конверсии релаксирует в основное состояние, а также путем интеркомбинационной конверсии заселяет относительно долгоживущее

3 *

триплетное возбужденное состояние Б . ФС в триплетном возбужденном состоянии может реагировать с молекулами окружающей среды, в том числе с кислородом в основном (триплетном) состоянии О2. Первичной стадией этих реакций обычно является фотоперенос электрона или атома водорода. Механизм деградации клеточных структур, инициированных этими

превращениями, относят к типу I (Рисунок 3). При взаимодействии ФС в возбужденном триплетном состоянии с молекулярным кислородом возможен также перенос энергии к кислороду, при этом образуется синглетный кислород (СК), а ФС переходит в основное состояние:

V + 3О2 ^ Бо + !О2.

Рисунок 3. Типы фотореакций [52]

В отличие от механизма I, по которому активные формы кислорода (ОН и О2-) генерируются в процессах, инициируемых первичными фотохимическими реакциями переноса электрона или протона, СК образуется в фотофизических процессах переноса энергии, и механизм ФДТ в этом случае классифицируют как механизм типа II (Рисунок 3) [52].

Фотодинамический эффект всегда протекает по двум основным типам фотореакций, но в реальности за счет насыщения тканей кислородом преобладают реакции II типа. Преобладание того или иного типа реакций также контролируется количеством и скоростью диффузии кислорода в ткани, но в любом случае путь через образование СК имеет преимущественное значение и в отличие от всех остальных надежно продемонстрирован в экспериментах [1].

После разрушения опухолевых клеток в результате ФДТ в тканях происходят все те процессы, которые сопровождают гибель клеток, независимо от причины, к ней приведшей. Фотодинамическое воздействие может индуцировать как некроз, так и апоптоз в зависимости от силы и интенсивности воздействия, а также от того, какие клеточные структуры повреждаются в первую очередь. Например, после кратковременной инкубации (1 ч) фотофрин прежде всего накапливался в плазматической мембране и последующее освещение вызывало преимущественно некроз. А после продолжительной инкубации (24 ч), когда краситель распределялся по всей клетке и сосредотачивался в митохондриях, доминировал апоптоз [137]. Предполагается, что для ФДТ воздействие на митохондрии оптимально, так как оно эффективно индуцирует апоптоз, предпочтительный с медицинской точки зрения [147]. Однако основной тип клеточной гибели при ФДТ опухолей, когда для большей надежности применяют максимальные воздействия, - некроз [112].

При лизисе погибающих клеток происходит высвобождение продуктов распада, стимулирующих как гибель соседних клеток, так и фагоцитоз клеточных обломков соседними клетками или лейкоцитами крови. Фагоцитоз продуктов распада больших опухолей представляет серьезную проблему для организма, поэтому лучшие результаты достигаются при лечении небольших новообразований. В случае массивной некротической гибели клеток под влиянием интенсивного фотодинамического воздействия формируется рубцовая ткань, а при преимущественном развитии апоптоза продукты распада клеток успевают перевариваться соседними клетками и макрофагами, заживление раны происходит быстрее, рубец не формируется и достигается лучший косметический эффект [24, 102, 127].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Дмитриева Мария Вячеславовна, 2016 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Алексеев Ю.В., Захаров С.Д., Иванов А.В. Фотодинамический и светокислородный эффекты: общность и различия// Лазерная медицина. -

2012. - Т.16, вып. 4. - С. 4-15.

2. Алексеев Ю.В., Николаева Е.В., Макарова Ю.Б. и др. Применение фотодинамической терапии с тетрапирролами хлоринового ряда в дерматологической практике// Лазерная медицина. - 2005. - Т.9, вып. 4. - С. 4-8.

3. Арчинова Т.Ю., Манджиголадзе Т.Ю. Изучение состава и анализ яичного лецитина химическими и физико-химическими методами// Современные проблемы науки и образования. - 2013. - №2; URL:www.science-education.ru/108-9130 (дата обращения: 01.03.2015).

4. Аршинова О.Ю., Оборотова Н.А., Санарова Е.В. Вспомогательные вещества в технологии лиофилизации лекарственных препаратов// Разработка и регистрация лекарственных средств. - 2013. - №1(2). - С. 20-24.

5. Аршинова О.Ю., Санарова Е.В., Ланцова А.А., Оборотова Н.А. Особенности лиофилизации липосомальных лекарственных препаратов// Химико-фармацевтический журнал. - 2012. - Т.46, №4. - С. 29-34.

6. Баллюзек Ф.В., Куркаев А.С., Сенте Л. Нанотехнологии для медицины. -Спб.: Сезам-Принт, 2008. - С. 44-46.

7. Барсуков Л.И. Липосомы// Соросовский образовательный журнал. - 1998.

- №10. - С. 2-9.

8. Барышников А.Ю. Наноструктурированные липосомальные системы как средство доставки противоопухолевых препаратов// Вестник РАМН. - 2012.

- №3. - С. 23-30.

9. Барышникова М.А., Зангиева М.Т., Барышников А.Ю. Взаимодействие липидных нанокапсул с клеткой// Российский биотерапевтический журнал. -

2013. - Т. 12, №1. - С. 11-15.

10. Безруков Д.А., Балантидин Т.Г., Деев С.М. и др. Возможные подходы к конструированию сложных липосомных систем доставки лекарственных препаратов// Вестник МИТХТ. - 2006. - №1. - С. 14-18.

11. Беккер Ю. Спектроскопия/ Пер. с нем. Л.Н. Казанцевой под ред. А.А. Пупышева. - М.: Техносфера, 2009. - 528 с.

12. Беккер Ю. Хроматография. Инструментальная аналитика: методы хроматографии и капиллярного электрофореза/ Пер. с нем. В.С. Куровой под ред. А.А. Курганова. - М.: Техносфера, 2009. - 472 с.

13. Бикбов, Э.Н. Особенности деструкции опухоли на модели экспериментальной аденокарциномы Эрлиха при фотодинамической терапии с сенсибилизатором второго поколения группы хлоринов : автореф. дис. ...канд. мед. наук : 14.01.12, 14.03.02 / Бикбов Эльмир Надирович. - Уфа, 2010. - 28 с.

14. Бриттон Г. Биохимия природных пигментов: Пер. с англ. - М.: Мир, 1986.

- 422 с.: ил.

15. Бугаенко Л.Т., Трофимов В.И., Бяков В.М. Проблемы гомо-гетерогенной конкурентной кинетики в дисперсных системах на примере липидных мембран// Вестник Московского университета. Сер. 2. Химия. - 1998. - Т.39, №1. - С. 60-63.

16. Бунятян Н.Д., Раменская Г.В., Пахомов В.П., Горошко О.А. Методические рекомендации. Тонкослойная (планарная) хроматография. Практические рекомендации по проведению хроматографических исследований в фармацевтическом анализе. - М., 2008. - 52 с.

17. Вакуловская Е.Г., Решетников А.В., Залевский И.Д., Кемов Ю.В. Фотодинамическая терапия и флюоресцентная диагностика с фотосннсибилизатором радахлорин у больных раком кожи// Российский биотерапевтический журнал. - 2004. - Т.3, №1. - С. 77-82.

18. Валидация аналитических методик для производителей лекарств: Типовое руководство предприятия по производству лекарственных средств/ Под редакцией Береговых В.В. - М.: Литтерра, 2008. - 132 с.

19. Василенко И.А., Краснопольский Ю.М., Степанов А.Е., Швец В.И. Проблемы и перспективы производства фосфолипидов// Химико-фармацевтический журнал. - 1998. - Т. 32, №5. - С. 9-15.

20. Васьковский В.Е. Липиды// Соросовский образовательный журнал. - 1997.

- №3. - С. 32-37.

21. Водовозова Е.Л., Кузнецова Н.Р., Кадыков В.А. и др. Липосомы как наноносители липидных конъюгатов противоопухолевых агентов мелфалана и метотрексата// Российские нанотехнологии. - 2008. - Т.3, №3 - 4. - С. 162172.

22. Волгин В.Н., Странадко Е.Ф. Изучение фармакокинетики фотодитазина при базально-клеточном раке кожи// Лазерная медицина. - 2011. - Т.15, вып. 1. - С. 33-37.

23. Гейниц А.В., Баум Р.Ф., Зарецкий А.М. Фотодинамическая терапия в лечебной практике// Лечащий врач. - 2005. - №2. - С. 74.

24. Гейниц А.В., Сорокатый А.Е., Ягудаев Д.М., Трухманов Р.С. Фотодинамическая терапия. История создания метода и ее механизмы// Лазерная медицина. - 2007. - Т.11, вып. 3. - С. 42-46.

25. Гельфонд М.Л., Арсеньев А.И., Левченко Е.В. и др. Фотодинамическая терапия в комбинированном лечении злокачественных новообразований: настоящее и будущее// Лазерная медицина. - 2012. - Т.16, вып.2. - С. 25-31.

26. Генина Э.А. Методы биофотоники: Фототерапия. - Саратов: Новый ветер, 2012. - 119 с.: ил.

27. Геннис Р. Биомембраны: Молекулярная структура и функции: Пер. с англ. Л.И. Барсукова и др. - М.: Мир, 1997. - 624 с., ил.

28. Государственная фармакопея РФ. 13-ое издание. Том 1. // Федеральная электронная медицинская библиотека. - 2015. URL:http://193.232.7.120/feml (дата обращения 05.11.15г.).

29. Государственная фармакопея РФ. 13-ое издание. Том 2. // Федеральная электронная медицинская библиотека. - 2015. URL:http://193.232.7.120/feml (дата обращения 05.11.15г.).

30. Грин М.А., Бриттал Д.И., Ципровский А.Г. и др. Борсодержащие производные природных хлорофиллов// Макрогетероциклы. - 2010. - №3 (4).

- С. 222-227.

31. Гуревич Д.Г., Меерович И.Г., Меерович Г.А. и др. Влияние размеров липосом на уровень и селективность накопления тиосенса в опухоли// Российский биотерапевтический журнал. - 2007. - №2(6). - С. 45-49.

32. Давиденко И.С., Пефти Е.Б., Фокин А.Н. Значение ангиогенеза в терапии метастатического рака молочной железы// Российский биотерапевтический журнал. - 2007. - Т.6, №4. - С. 8-12.

33. Дёмина Н.Б., Скатков С.А. Стратегии развития и биофармацевтические аспекты систем доставки лекарств// Российский химический журнал. - 2012.

- Т.56, №3 - 4. - С. 5-10.

34. Доклинические исследования мембраноактивного фотосенсибилизатора на основе борированного хлорина е6 для терапии опухолей: отчет о НИР/ Каплан М.А. - Обнинск: Медицинский радиологический научный центр, 2012. - 30 с.

35. Евгеньева И.И. Планарная хроматография и анализ органических веществ// Соросовский образовательный журнал. - 1999. - №11. - С. 50-55.

36. Ивков В.Г., Берестовский Г.Н. Липидный бислой биологических мембран.

- М.: Наука, 1982. - 224 с.

37. Кагава Я. Биомембраны. / Пер. с яп. А.А. Селищевой; Предисл. и общ. ред. В.Е. Кагана. - М.: Высш. шк., 1985. - 303 с., ил.

38. Капинус В.Н., Романко Ю.С., Каплан М.А. и др. Эффективность флюоресцентной диагностики и фотодинамической терапии с фотосенсибилизатором фотодитазин у больных раком кожи// Российский биотерапевтический журнал. - 2005. - Т.4, №3. - С. 69-75.

39. Каплан М.А. Четвертый элемент: О перспективах применения фотодинамической терапии при лечении онкологических заболеваний// Медицинская газета. - 2013. - №92. - С. 6.

40. Каплан М.А., Капинус В.Н., Романко Ю.С., Ярославцева-Исаева Е.В. Фотодитазин - эффективный фотосенсибилизатор для фотодинамической терапии// Материалы III Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты», Москва, 17-19 марта 2004 г. Российский биотерапевтический журнал. - 2004. - Т.3, №2. - С. 51.

41. Каплун А.П., Степанов А.Е., Швец В.И. Наночастицы как средство доставки лекарственных препаратов// Вестник МИТХТ. - 2006. - №1. - С. 513.

42. Копнин Б.П. Современные представления о механизмах злокачественного роста: сходства и различия солидных опухолей и лейкозов// Клиническая онкогематология. - 2012. - Т.5, №3. - С. 165-185.

43. Кортава М.А., Рябова Н.В., Игнатьева Е.В. и др. Изучение эффективности включения фотосенса в пространственно стабилизированные липосомы// Российский биотерапевтический журнал. - 2005. - №4. - С. 96-101.

44. Кортава М.А., Рябова Н.В., Полозкова А.П. и др. Совершенствование липосомальной лекарственной формы Фотосенса// Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты». Российский биотерапевтический журнал. -2005. - №1. - С. 36-37.

45. Костин К.В., Игнатьева Е.В., Тазина Е.В. и др. Технология получения и анализ липосомальной лекарственной формы лизомустина// Химико-фармацевтический журнал. - 2011. - №7(45). - С. 44-47.

46. Котова Е.А., Игнатьева Е.В., Орлова О.Л. и др. Разработка лиофилизированной липосомальной лекарственной формы цифелина// Химико-фармацевтический журнал. - 2012. - Т.46, №5. - С. 39-42.

47. Котова Е.А., Полозкова А.П., Денисова Т.В. и др. Оптимизация состава и технологии изготовления stealth липосом цифелина// Химико-фармацевтический журнал. - 2011. - Т.45, №12. - С. 37-40.

48. Кочнева Е.В., Привалов В.А. Фотодинамическая терапия в онкологической практике// Лазерная медицина. - 2005. - Т.9, вып.3. - С. 7-13.

49. Краснопольский Ю.М., Степанов А.Е., Швец В.И. Некоторые аспекты технологии получения липосомальных форм лекарственных препаратов// Химико-фармацевтический журнал. - 1999. - Т.33, №10. - С. 20-23.

50. Краснопольский Ю.М., Степанов А.Е., Швец В.И. Липидная технологическая платформа для создания новых лекарственных форм и транспорта активных фармацевтических субстанций// Биофармацевтический журнал. - 2011. - Т.3, №2. - С. 10-18.

51. Краснопольский Ю.М., Степанов А.Е., Швец В.И. Технологические аспекты получения липосомальных препаратов в условиях GMP// Биофармацевтический журнал. - 2009. - Т.1, №3. - С. 18-29.

52. Кузнецова Н.А., Калия О.Л. Фотокаталитическая генерация активных форм кислорода в биологических средах в методе фотодинамической терапии // Российский химический журнал. - 1998. - Т.42, №5. - С. 36-49.

53. Кузнецова С.А., Орецкая Т.С. Нанотранспортные системы адресной доставки нуклеиновых кислот в клетки// Российские нанотехнологии. - 2010. - Т.5, №9 - 10. - С. 40-51.

54. Кузякова Л.М. Конструирование трансдермальных липосомальных препаратов с заданными свойствами// Вестник Московского университета. Сер. 2. Химия. - 2005. - Т.46, №1. - С. 74-79.

55. Ланцова А.В., Полозкова А.П., Перетолчина Н.М. и др. Разработка и изучение стерически стабилизированной липосомальной формы лизомустина// Российский биотерапевтический журнал. - 2004. - Т.3, №4. -С.19-23.

56. Лепарская Н.Л., Сорокоумова Г.М., Сычева Ю.В. и др. Липосомы, содержащие дексаметазон: получение, характеристика и использование в офтальмологии// Вестник МИТХТ. - 2011. - Т.6, №2. - С. 37-42.

57. Лиманская Л.А., Юдинцев А.В., Куценко О.К. и др. Мультифункциональные липосомальные наносистемы для доставки новых противоопухолевых лекарственных препаратов на основе хелатов европия// Наносистемы, Наноматериалы, Нанотехнологии. - 2010. - Т.8, №4. - С. 764774.

58. Линьков К.Г., Березин А.Н., Лощенов В.Б. Аппаратура для флюоресцентной диагностики и фотодинамической терапии// Российский биотерапевтический журнал. - 2005. - Т.4, №4. - С. 114-119.

59. Лукьянец Е.А. Новые сенсибилизаторы для фотодинамической терапии// Российский химический журнал. - 1998. - Т.42, №5. - С. 9-16.

60. Лурье Ю.Ю. Справочник по аналитической химии: Справ. изд. - 6-е изд., перераб. и доп. - М.: Химия, 1989. - 448 с.: ил.

61. Макаров О.В., Хашукоева А.З, Отдельнова О.Б., Купеева Е.С. Опыт применения фотодинамической терапии в лечении гинекологических заболеваний// Лазерная медицина. - 2012. - Т.16, вып.2. - С. 40-44.

62. Малиновская Ю.А., Демина Н.Б. Разработка липосомальных форм симвастатина// Разработка и регистрация лекарственных средств. - 2013. -№5. - С. 46-53.

63. Маркичев Н.А., Елисеенко В.И., Алексеев Ю.В., Армичев А.А. Фотодинамическая терапия базальноклеточного рака кожи с применением фотосенсибилизатора хлоринового ряда// Лазерная медицина. - 2005. - Т.9, вып. 1. - С. 16-20.

64. Меерович И.Г., Меерович Г.А., Оборотова Н.А., Барышников А.Ю. Распределение света по глубине опухолевого очага и эффективность использования терапевтического излучения при фотодинамической терапии // Российский биотерапевтический журнал. - 2006. - Т.5, №3. - С. 93-97.

65. Меерович И.Г., Оборотова Н.А. Применение липосом в фотохимиотерапии: 1. Липосомы в ФДТ// Российский биотерапевтический журнал. - 2003. - Т.2, №4. - С. 3-8.

66. Мещерикова В.В., Тазина Е.В., Полозкова А.П. и др. Противоопухолевый эффект включенного в термолипосомы доксорубицина в условиях гипертермии// Медицинская радиология и радиационная безопасность. -2008. - №4 (53). - С. 7-12.

67. Минина С.А., Каухова И.Е. Химия и технология фитопрепаратов. - М.: ГЭОТАР-МЕД, 2004. - 560 с.: ил.

68. Миронов А.Ф. Разработка сенсибилизаторов второго поколения на основе природных хлорофиллов// Российский химический журнал. - 1998. - Т.42, №5. - С. 23-36.

69. Миронов А.Ф. Фотодинамическая терапия рака - новый эффективный метод диагностики и лечения злокачественных опухолей// Соросовский образовательный журнал. - 1996. - №8. - С. 32-40.

70. Михайлова Т.В., Барышникова М.А., Клименко О.В. и др. Разработка липосомальной формы противоопухолевой вакцины// Российский биотерапевтический журнал. - 2011. - №4. - С. 61-65.

71. Моисеева Е.В., Кузнецова Н.Р., Аронов Д.А. и др. Противоопухолевое действие липосом с липофильным пролекарством комбретастатина A4 на модели острого Т-лимфолейкоза мышей// Российский биотерапевтический журнал. - 2013. - Т.12, №1. - С. 41-46.

72. Научное издание. Молекулярные механизмы биологического действия оптического излучения. Отв. редактор Рубин А.Б. - М.: Наука, 1988. - С. 123131.

73. Оборотова H.A., Смирнова З.С., Полозкова А.П., Барышников А.Ю. Фармацевтические аспекты разработки липосомальных лекарственных форм для внутривенного введения гидрофобных цитостатиков // Вестник РАМН. -2002. - №1. - С. 42-45.

74. Ольшевская В.А., Савченко А.Н., Зайцев А.В. и др. Производные 13(1)-п-{2-[п-(клозо-монокарбадодекаборан-1-ил)-метил]аминоэтил}амид-15(2),17(3)-диметилового эфира хлорина e6, проявляющие свойства фотосенсибилизатора. Патент №2406726 от 27.04.2009 г.

75. Пальцев М.А. Нанотехнологии в медицине и фармации// Ремедиум. -2008. - №9. - С. 6-12.

76. Пархоц, М.В. Спектральные и фотофизические характеристики фотосенсибилизаторов на основе хлорина е6 в модельных средах, цельной крови и опухолевых тканях : автор. дис. ...канд. физ.-матем. наук : 01.04.01 / Пархоц Марина Викторовна. - Минск, 2010. - 26 с.

77. Пономарев И.В. Лазеры на парах меди и золота в медицине. Москва 1998.

78. Пономарев Г.В., Решетников A.B., Гусева-Донская Т.Н. и др. Способ получения водорастворимых хлоринов. Патент РФ №2144538 от 20.01.2000.

79. Пономарев Г.В., Решетников A.B., Иванов A.B. и др. Оценка биологической активности нового фотосенсибилизатора для клинического использования - комплекса хлорина е6 «фотодитазина»// Материалы III Всероссийского симпозиума, Москва. - 1999. - С. 133-141.

80. Пономарев Г.В., Тавровский Л.Д., Зарецкий AM. и др. Фотосенсибилизатор и способ его получения. Патент РФ №2276976 от 27.05.2006.

81. Пушкарев, ОА. Фотодинамическая терапия при лечении кариеса : автор. дис. ... канд. мед. наук : 14.01.14 / Пушкарев Олег Длександрович. - Санкт-Петербург,. 2012. - 20 с.

82. Рагулин ЮА., Капинус В.Н., Каплан МА. и др. Возможности фотодинамической терапии с фотосенсибилизатором фотодитазин в лечении

центрального рака легких// Российский биотерапевтический журнал. - 2005.

- Т.4, №3. - С. 58-61.

83. Решетников А.В. Фотоиммунотерапия (ФИТ) как направление фотодинамической терапии (ФДТ)// Материалы III Всероссийского конгресса «Практикующий врач». Успехи современного естествознания. - 2007. - №6.

- С. 93-98.

84. Решетников А.В. Фотосенсибилизаторы в современной клинической практике (обзор)// Материалы научно-практической конференции оториноларингологов ЦФО РФ «Лазерные технологии в оториноларингологии» под ред. В.Г. Зенгера и А.Н. Наседкина, Тула 26 - 28 сентября 2007 г.

85. Решетников А.В., Залевский И.Д., Кемов Ю.В. и др. Фотосенсибилизатор и способ его получения. Патент РФ №2183956 от 21.12.2001 г. Патент ЮАР 2003/8407 от 24.02.2005. Патент Великобритании GB2389531 от 13.03.2005. Патент США USA 6,969,765 от 29.11.2005. Патент КНР 258833 от 12.04.2006. Патент Республики Южная Корея 10-0628548 от 19.09.2006.

86. Руководство для предприятий фармацевтической промышленности. Методические рекомендации/ Под редакцией Юргеля Н.В., Младенцева А.Л., Бурдейна А.В. и др. - М.: Спорт и Культура - 2000, 2007. - 192 с.

87. Руководство по инструментальным методам исследований при разработке и экспертизе качества лекарственных препаратов. Под ред. Быковского С.Н. и др. - М.: Перо, 2014. - 656 с.: ил.

88. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть 1. - М.: Гриф и К., - 2012. - 944 с.

89. Санарова Е.В., Котова Е.А., Козеев С.Г. и др. Качество липосомальных фосфолипидов на этапах технологического процесса// Химико-фармацевтический журнал. - 2012. - Т.46, №3. - С. 50-53.

90. Санарова Е.В., Полозкова А.П., Оборотова Н.А. Лиофилизированная наноструктурированная лекарственная форма тиосенса// Всероссийский журнал научных публикаций. - 2011. - август - С. 74-76.

91. Санарова Е.В., Смирнова З.С., Полозкова А.П. и др. Биофармацевтические исследования новой липосомальной лекарственной формы тиосенса// Биофармацевтический журнал. - 2011. - Т.3, №6. - С. 33-36.

92. Сейфулла Р.Д. Фармакология липосомальных препаратов (в эксперименте и клинике). - М.: Глобус Континенталь, 2010. - 244 с.: ил.

93. Сикорская А.С, Назарова А.А., Селеменев В.Ф. Подбор оптимальных условий разделения фосфолипидных комплексов, полученных из семян

подсолнечника// Сорбционные и хроматографические процессы. - 2009. -Т.9, вып. 2. - С. 215-220.

94. Смирнова З.С., Кубасова И.Ю., Макарова О.А. и др. Доклиническое изучение эффективности липосомальной лекарственной формы фотосенса для фотодинамической терапии// Российский биотерапевтический журнал. -2003. - Т.2, №4. - С. 40-44.

95. Смирнова З.С., Оборотова Н.А., Макарова О.А. и др. Эффективность и фармакокинетика липосомальной лекарственной формы фотосенсибилизатора «Фотосенс» на основе сульфофталоцианина алюминия// Химико-фармацевтический журнал. - 2005. - Т.39, №7. - С. 3-7.

96. Смирнова З.С., Санарова Е.В., Борисова Л.М. и др. Противоопухолевая активность фотодинамической терапии с липосомальной лекарственной формой тиосенса на перевиваемых опухолях мышей// Российский биотерапевтический журнал. - 2011. - Т.10, №4. - С. 55-59.

97. Соколова Д.В., Тазина Е.В., Кортава М.А. и др. Анти-МиС-1 иммунолипосомальная конструкция доксорубицина для направленной доставки в опухоль// Российский биотерапевтический журнал. - 2011. - №3 (10). - С. 99-104.

98. Соловьева А.Б., Аксенова Н.А., Толстых П.И. и др. Комплексы фотосенсибилизаторов с полимерами - современные препараты для фотодинамической терапии// Лазерная медицина. - 2012. - Т.16, вып. 4. - С. 9-15.

99. Странадко Е.Ф. Исторический очерк развития фотодинамической терапии // Лазерная медицина. - 2002. - Т.6, вып. 1. - С. 4-8.

100. Странадко Е.Ф. Основные этапы развития и современное состояние фотодинамической терапии в России// Лазерная медицина. - 2012. - Т.16, вып. 2. - С. 4-14.

101. Странадко Е.Ф., Армичев А.В., Гейниц А.В. Источники света для фотодинамической терапии // Лазерная медицина. - 2011. - Т.15, вып. 3. - С. 63-69.

102. Странадко Е.Ф., Волгин В.Н., Ламоткин И.А., Рябов М.В. Фотодинамическая терапия базально-клеточного рака кожи с фотосенсибилизатором второго поколения фосканом// Российские медицинские вести. - 2009. - Т.Х1У, №1. - С. 62-68.

103. Странадко Е.Ф., Маркичев Н.А., Рябов М.В. Фотодинамическая терапия в лечении злокачественных новообразований различных локализаций/ Пособие для врачей. - Тверь: ООО «Губернская медицина», 2002. - 22 с.

104. Странадко Е.Ф., Рябов М.В. 5-летний опыт ФДТ с производными хлорина е6// Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты», Москва, 17 - 19 марта 2004 г. Российский биотерапевтический журнал. - 2004. - Т.3, №2. - С. 58.

105. Странадко Е.Ф., Рябов М.В. Двадцатилетний опыт фотодинамической терапии рака кожи// Лазерная медицина. - 2012. - Т.16, вып. 2. - С. 19-25.

106. Тазина Е.В., Костин К.В., Оборотова Н.А. Особенности инкапсулирования лекарственных препаратов в липосомы (обзор)// Химико-фармацевтический журнал. - 2011. - Т.45, № 8. - С. 30-40.

107. Тараховский Ю.С., Иваницкий Г.Р. Липосомы в генной терапии. Структурный полиморфизм липидов и эффективность доставки генетической информации// Биохимия. - 1998. - Т.63, вып.6. - С. 723-736.

108. Титеев Р.А., Бриттал Д.И., Улыбина О.В. и др. Синтез и изучение свойств конъюгатов природных хлорофиллов с борными полиэдрами// Сборник материалов 10-ой Международной конференции по физической и координационной химии порфиринов и их аналогов. Иваново, 1 - 4 июля 2009 г. - С. 75-76.

109. Трухачева Т.В., Шляхтин С.В., Исаков Г.А., Истомин Ю.П. Фотолон -новое средство для фотодинамической терапии. - Минск.: РУП «Белмедпрепараты», 2012. - 28 с., ил.

110. Туранская С.П., Туров В.В., Горбик П.П. Приготовление липосом для направленной доставки лекарственных препаратов// Сборник научных статей «Химия, физика и технология поверхности». - 2009. - №15. - С. 189-214.

111. Уайт А., Хендлер Ф., Смит Э. и др. Основы биохимии: в 3-х томах. Т.3.: Пер. с англ./ Перевод Гинодмана Л.М.; Под редакцией Овчинникова Ю.А. -М.: Мир, 1981. - 726 с.: ил.

112. Узденский А.Б. Клеточно-молекулярные механизмы фотодинамической терапии. - СПб.: Наука, 2010. - 327 с.: ил.

113. Феофанов А.В., Гришин А.И., Куделина И.А. и др. Исследования локализации и молекулярных взаимодействий биологически активных соединений в живых клетках и срезах тканей на основе метода конфокальной микроспектроскопии и реконструкции спектральных изображений// Биоорганическая химия. - 1999. - Т. 25, № 12. - С. 892-902.

114. Филоненко Е.В. История развития флюоресцентной диагностики и фотодинамической терапии и их возможности в онкологии// Российский химический журнал (Журнал Российского химического общества им. Д.И. Менделеева). - 2013. - Т. LVII, №2. - С. 5-10.

115. Фотодинамическая терапия с фотосенсибилизатором «Фотодитазин» в офтальмологии/ Под редакцией Х.П. Тахчиди. - Калуга, 2008. - 288 с., ил.

116. Холестерин. Значение слова «Холестерин»/ Энциклопедии на alkala.ru (электронный ресурс). URL:www.a1ca1a.ru/bse/izbranшe/s1ovar-Нк/Н11292^Ыт1 (дата обращения 07.10.15 г.).

117. Хоров А.О. Лазерные технологии в онкологической практике. Часть 1// Журнал ГрГМУ. - 2010. - №4. - С. 23-27.

118. Цыб А.Ф. Клинические аспекты фотодинамической терапии: монография/ А.Ф. Цыб, М.А. Каплан, Ю.С. Романко, В.В. Попучиев. - Калуга: Издательство научной литературы Н.Ф. Бочкаревой, 2009. - 204 с., 265 ил.

119. Чан Тхи Хай Иен, Игнатьева Е.В., Полозкова А.П. и др. Качественный и количественный анализ новой лиофилизированной липосомальной лекарственной формы фотодитазина// Химико-фармацевтический журнал. -2010. - Т. 44, №6. - С. 53-56.

120. Чан Тхи Хай Иен, Поздеев В.И., Меерович Г.А. и др. Липосомальная лекарственная форма фотодитазина// Российский биотерапевтический журнал. - 2010. - №2(9). - С. 105-107.

121. Чехонин В.П., Жирков Ю.А., Дмитриева Т.Б. Направленная доставка лекарственных средств в мозг// Вестник РАМН. - 2006. - №8. - С. 30-37.

122. Чиссов В.И., Соколов В.В., Филоненко Е.В. Фотодинамическая терапия злокачественных опухолей. Краткий очерк развития и опыт клинического применения в России// Российский химический журнал. - 1998. - Т.42, №5. -С. 5-9.

123. Швец В.И., Каплун А.П., Краснопольский Ю.М. и др. От липосом семидесятых к нанобиотехнологии XXI века// Российские нанотехнологии. -2008. - Т.3, №11 - 12. - С. 52-66.

124. Эффективность фотодинамической терапии в онкологии/ Медицина и здоровье - «Миз» (онлайн-издание). ики^^^^ёёЬеаНЬ.ги/Ьо^ш-ь 1есЬеше/опсо1о§1уа/1324 - Ю1:оётат1сЬе8ка1а - 1егарпа - гака (дата обращения 05.05.2015 г.).

125. Якубовская Р.И., Казачкина Н.И., Кармакова Т.А. и др. Скрининг и медико-биологическое изучение отечественных фотосенсибилизаторов// Российский химический журнал. - 1998. - Т.42, №5. - С. 17-23.

126. Ярмоненко С.П. Новая парадигма комбинированной антиангиогенно-цитотоксической терапии рака// Российский биотерапевтический журнал. -2005. -Т.4, №4. - С. 50-58.

127. Agostinis P., Berg K., Cengel K.A. et al. Photodynamic therapy of cancer: an update// CA Cancer J Clin. - 2011. - Vol.61, №4. - P. 250-281.

128. Andrejevic-Blant S., Hadjur Ch., Ballini J-P. et al. Photodynamic therapy of early scuamous cell carcinoma with tetra(m-hydroxyphenyl)chlorin: optimal drug-light interval// British Journal of Cancer. - 1997. - Vol.76, №8. - P. 1021-1028.

129. Bachor R., Shea C.R., Belmonte S.J., Hasan T. Free and conjugated chlorin e6 in the photodynamic therapy of human bladder carcinoma cells// J. Urol. - 1991. -Vol.146, № 6. - P. 1654-1658.

130. Berenbaum M.C., Bonnett R., Scourides P.A. In vivo biological activity of the components of haematoporphyrin derivative// British Journal of Cancer. - 1982. -Vol.45. - P. 571-581.

131. Bharali D.J., Khalil M., Gurbuz M. et al. Nanoparticles and cancer therapy: A concise review with emphasis on dendrimers// International Journal of Nanomedicine. - 2009. - №4. - P. 1-7.

132. Buchholz J., Kaser-Hotz B., Khan T. et al. Optimizing photodynamic therapy: in vivo pharmacokinetics of liposomal meta-(Tetrahydroxyphenyl)chlorine in feline squamous cell carcinoma// Clin Cancer Res. - 2005. - Vol.11, №20. - P. 7538-7544.

133. Carter K.A., Shao S., Hoopes M.I. et al. Porphyrin-phospholipid liposomes permeabilized by near-infrared light// Nature communications. - 2014. - Vol.5. -P. 35-46.

134. Carvalho Maroni L.D., Oliveira Silveira A.C.D., Leite E.A. et al. Antitumor effectiveness and toxicity of cisplatin-loaded long-circulating and pH-sensitive liposomes against Ehrlich ascitic tumor// Experimental Biology and Medicine. -2012. - Vol.237. - P. 973-984.

135. Chatterjee D.K., Fong L.S., Zhang Y. Nanoparticles in photodynamic therapy: an emerging paradigm// Adr. Drug Delivery. Rev. - 2008. - Vol.60. - P. 16271637.

136. Cukierman E., Khan R. The benefits and challenges associated with the use drug delivery systems in cancer therapy// Biochem Pharmacol. - 2010. - Vol.80, № 5. - P. 762-770.

137. Dellinger M. Apoptosis or necrosis following Photofrin photosensitization: influence of the incubation protocol// J. Photochem. Photobiol. B. Biol. - 1997. -Vol.66. - P. 479-483.

138. Dougherty T.J. Variability in hematoporphyrin derivative preparations// Cancer research. - 1982. - Vol.42. - P. 1988.

139. Drummond D.C., Meyer O., Hong K. et al. Optimizing liposomes for delivery of chemotherapeutic agents to solid tumours// Pharmacological Reviews. - 1999. -Vol.51, № 4. - P. 691-743.

140. Dummin H, Cernay T, Zimmerman HW. Selective photosensitization of mitochondria in HeLa cells by cationic Zn (II) phthalocyanines with lipophilic side-chains// Photochem photobiol B. - 1997. - Vol.37. - P. 219-299.

141. Ernsting M.J., Worthington A., May J.P. et al. Ultrasound drug targeting to tumors with thermosensitive liposomes// Manuscript. International Ultrasonics Symposium Proceedings. - 2011. - P. 1-4.

142. Falcao C.B. Multifunctional liposomes for enhanced anticancer therapy// Pharmaceutical Science Dissertations. - 2011. - P. 1-98.

143. Goyal G.C., Blum A., Grossweiner L.I. Photosensitization of liposomal membranes by hematoporphyrin derivative// Cancer research. - 1983. - Vol.43. -P. 5826-5830.

144. Henderson B.W., Dougherty T.J. How does photodynamic therapy work?// J. Photochem. Photobiol. B. Biol. - 1992. - Vol.55. - P. 145-157.

145. Jiang F., Lilge L., Logie B. et al. Photodynamic therapy of 9L gliosarcoma with liposome - delivered photofrin // Photochem. and Photobiol. - 1997. - Vol.65. - P. 701-706.

146. Kessel D. Determinants of photosensitization by mono-L-aspartyl chlorin e6// Photochemistry and Photobiology. - 1989. - Vol.49, №4. - P. 447-452.

147. Kessel D., Luo Y. Mitochondrial photodamage and PDT induced apoptosis// J. Photochem. Photobiol. B. Biol. - 1998. - Vol.42. - P. 89-95.

148. Knop K., Hoogenboom R., Fischer D., Schubert U.S. Poly(ethyleneglycol) in drug delivery: pros and cons as well as potential alternatives// Angew. Chem. Int. Ed. Engl. - 2010. - Vol.49. - P. 6288-6308.

149. Koshkaryev A., Thekkedath R., Torchilin V.P. Targeting of lysosomes by liposomes modified with octadecyl-rhodamine B// J Drug Target. - 2011. - Vol. 19, № 8. - P. 606-614.

150. Lammers T., Hennink W.E. and Storm G. Tumour-targeted nanomedicines: principles and practice// British Journal of Cancer. - 2008. - Vol.99, №3. - P. 392397.

151. Leanne B. Josefsen, Ross W. Boyle. Unique diagnostic and therapeutic roles of porphyrins and phthalocyanines in photodynamic therapy, imaging and theranostics // Theranostics. - 2012. - Vol.2, № 9. - P. 916-958.

152. Lu W-L., Qi X-R., Zhang Q. et al. A pegylated liposomal platform: pharmacokinetics, pharmacodynamics, and toxicity in mice using doxorubicin as a model drug// Journal of Pharmacological Sciences. - 2004. - Vol.95. - P. 381-389.

153. Manjappa A.S., Chaudhari K.R., Venkataraju M.P. et al. Antibody derivazation and conjugation strategies: application in preparation of stealth immunoliposome to target chemotherapeutics to tumor// Journal Control Release. - 2011. - Vol.150.

- P. 2-22.

154. MedKoo product information: Talaporfin sodium; URL: http: //medkoo. com/Anticancer-trials/Talaporfin.htm (дата обращения 09.01.15).

155. Meerovich I.G., Koshkaryev A.A., Torchilin V.P. Screening and optimization of ligand conjugates for lysosomal targeting// Bioconjug Chem. - 2011. - Vol.22.

- P. 2271-2282.

156. Mohammed A.R., Bramwell V.W., Coombes A.G.A., Perrie Y. Lyophilisation and sterilization of liposomal vaccines to produce stable and sterile products// Methods. 2006. - I.40. - P. 30-38.

157. Moisenovich M.M., Ol'shevskaya V.A., Rokitskaya Y.I. et al. Novel photosensitizers trigger rapid death of malignant human cells and rodent tumor transplants via lipid photodamage and membrane permeabilization// PLoS One. -2010. - Vol.5, I.9. - Р. е12717.

158. Morgan J., Oseroff A.R. Mitochondria-based photodynamic anti-cancer therapy// Adv. drug deliv. rev. - 2001. - Vol.49, № 1-2. - P. 71-86.

159. Nelson J.S., Roberts W.G., Berns M.W. In vivo studies on the utilization of mono-L-aspartyl chlorine (NPe6) for photodynamic therapy// Cancer research. -1987. - Vol.47. - P. 4681-4685.

160. Ponomarev G.V., Solovieva M.N., Dugin N.O. et al. Lipophilic derivatives of natural chlorins: Synthesis, mixed micelles with phospholipids, and uptake by cultured cells// Bioorganic & Medicinal Chemistry. - 2013. - Vol.21. - Р. 54205427.

161. Ranganathan R., Madanmohan S., Kesavan A. et al. Nanomedicine: towards development of patient-friendly drug-delivery systems for oncological applications// International Journal of Nanomedicine. - 2012. - №7. - Р. 10431060.

162. Riaz M. Liposomes preparation methods// Pakistan Journal of Pharmaceutical Sciences. - 1996. - Vol.19, №1. - P. 65-77.

163. Ruck A, Steiner R. Basic reaction mechanisms of hydrophilic and lipophilic photosensitisers in photodynamic tumour treatment// Minim invasiv ther allied tech. - 1998. - Vol.7. - Р. 503-509.

164. Savellano D.M., Pogue W.B., Hoopes P.J. et al. Multiepitope HER2 targeting enhancesphotoimmunotherapy of HER2 - overexpressing cancer cells with pyropheophorbide-a-immunoconjugates// Cancer Research. - 2005. - Vol.65, №14. - P. 6371-6376.

165. Sekkat N., Bergh H., Nyokong T., Lange N. Like a bolt the blue: phthalocyanines in biomedical optics// Molecules. - 2012. - Vol.17. - P. 98-144.

166. Serda R.E., Godin B., Blanco E. et al. Multi-stage delivery nano-particle systems for therapeutic applications// Biochim Biophys Acta. - 2011. - Vol.1810, № 3. - P. 317-329.

167. Sergupta S., Tyagi P., Velpandian T. et al. Etoposide encapsulated in positively charged liposomes: pharmacokinetic studies in mice and formulation stability studies// Pharmacological Research. - 2000. - №5. - P. 459-464.

168. Simon S.J., Andersen T.L., Davidsen J. et al. Secretory phospholipase A2 as a tumor-specific trigger for targeted delivery of a novel class of liposomal prodrug anticancer etherlipids// Molecular cancer therapeutics. - 2004. - №3. - P. 14511458.

169. Slepushkin V.A., Simoes S., Dazin P. et al. Sterically stabilized pH-sensitive liposomes. Intracellular delivery of aqueous contents and prolonged circulation in vivo// The Journal of Biological Chemistry. - 1997. - №4. - P. 2382-2388.

170. Sun W.Q., Carl Leopold A., Crowe L. M. et al. Stability of dry liposomes in sugar glasses// Biophysical journal. - Vol.70. - P. 1769-1776.

171. Tao Yang, Fu-De Cui, Min-Koo Choi et al. Enhanced solubility and stability of PEGylated liposomal pacltaxel: in vitro and in vivo evaluation// International Journal of Pharmaceutics. - 2007. - P. 317-326.

172. Teiten M-H., Bezdetnaya L., Morliere P. et al. Endoplasmic reticulum and Golgi apparatus are the preferential sites of Foscan® localization in cultured tumour cells// British Journal of Cancer. - 2003. - Vol.88, №1. - P. 146-152.

173. Terence T., Convertine A.J., Reyes C.R. et al. Thermosensitive liposomes modified with poly(N-isopropylacrylamide-co-propylacrylic acid) copolymers for triggered release of doxorubicin// Biomacromolecules. - 2010. - Vol.11. - P. 1915-1920.

174. Toh M.-R., Chiu G.N.C. Liposomes as sterile preparations and limitations of sterilization techniques in liposomal manufacturing// Asian journal of pharmaceutical sciences. - 2013. - Vol.8. - P. 88-95.

175. Vrounraets M.B., Visser G.V., Stigter M. et al. Targeting of aluminium (III) phthalocyanine tetrasulfonate by use of internalizing monoclonal antibodies:

improved efficacy in photodynamic therapy// Cancer Res. - 2001. - Vol.61, №5. -P. 1970-1975.

176. Yang F.Y., Teng M.C., Lu M. et al. Treating glioblastoma multiforme with selective high-dose liposomal doxorubicin chemotherapy induced by repeated focused ultrasound// International Journal of Nanomedicine. - 2012. - №7. - P. 965-974.

177. Yano T., Muto M., Yoshimura K. et al. Phase I study of photodynamic therapy using talaporfin sodium and diode laser for local failure after chemoradiotherapy for esophageal cancer// Radiation oncology. - 2012. - Vol.7. - P. 113.

178. Yokoyama H., Ebara M., Nakamura F. et al. Rapid and simple analysis of N-Aspartylchlorin e6 (Talaporfin) using fluorescence microtiterplate and its application for determination in cells, tissues and blood// Journal of Cancer Therapy. - 2012. - Vol.3. - P. 521-527.

179. Yoon Il, Jia Zhu Li, Young Key Shim. Advance in photosensitizers and light delivery for photodynamic therapy // Clin Endosc. - 2013. - №46. - P. 7-23.

180. Zhu G., Mock J.N., Aljuffali I. et al. Secretory phospholipase A2 responsive liposomes// Journal of Pharmaceutical Sciences. - 2011. - №8. - P. 3146-3159.

Приложения

Приложение 1 СПЕЦИФИКАЦИЯ

на «Борхлорин липосомальный, лиофилизат для приготовления дисперсии для инъекций 1,0 мг» ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» Минздрава России

ПОКАЗАТЕЛИ МЕТОДЫ НОРМА

Описание Визуальный Сухая пористая масса зеленого цвета

Растворимость (регидратация) Визуальный, ГФ XIII При добавлении к содержимому флакона 3,7 мл воды и перемешивании в течение 10 мин должна образовываться дисперсия зеленого цвета.

Подлинность Спектрофотометрия Электронный спектр поглощения испытуемого раствора в области от 300 до 800 нм должен иметь максимумы поглощения при длинах волн (400±2) нм, (499±2) нм, (662±2) нм.

Хроматографический, ТСХ На полученных хроматограммах пятна борхлорина идентифицируют по характерной зеленой окраске, пятна яичного фосфатидилхолина - по желтой или желто-коричневой окраске, пятна холестерина - по розово-фиолетовой окраске, пятна сахарозы - по сиреневой окраске.

Средняя масса и однородность по массе ГФ XIII 0,559 до 0,683 г Отклонение от средней массы ±10%

рН ГФ XIII, потенциометрически От 5,8 до 7,2 (дисперсия содержимого флакона в 10 мл воды)

Потеря в массе при высушивании ГФ XIII Не более 3%

Пирогенность ГФ XIII Препарат должен быть апирогенным

Аномальная токсичность ГФ XIII Препарат должен быть нетоксичным

Стерильность ГФ XIII, метод прямого посева Препарат должен быть стерильным

Количественное определение Спектрофотометрия От 0,85 до 1,15 мг

Размер везикул Спектроскопия динамического светорассеяния Не более 210 нм

Упаковка По 1 мг активного вещества во флаконах вместимостью 20 мл, укупоренных пробками из резины под обкатку алюминиевыми колпачком. По 10 флаконов вместе с инструкцией по применению укладывают в картонную пачку.

Маркировка В соответствии с ФСП

Хранение В защищенном от света месте при температуре -18 °С

Срок годности 2 г, исследования продолжаются

Приложение 2 Изучение цитотоксичности субстанции и липосомального борхлорина in vitro Место проведения исследования. МГУ им. М.В. Ломоносова Цель исследования. Изучение цитотоксичности субстанции и ЛЛФ борхлорина на клетках глиомы крысы С6.

Материал исследования. Препарат «Борхлорин липосомальный, лиофилизат для приготовления дисперсии для инъекций 1,0 мг». Результаты исследования.

Результаты изучения цитотоксической активности показывают, что «темновая» токсичность субстанции и липосомальной дисперсии борхлорина совпадают, а цитотоксическая активность отличается незначительно. Для «темновой» токсичности ИК50 составляет больше 50 мкМ, для световой токсичности - ИК50=0,15 мкМ, ИК90(субстанции борхлорина)=0,3 мкМ и ИК90(ЛЛФ борхлорина)=0,8 мкМ (Рисунок 1, 2).

Рисунок 1. «Темновая» токсичность субстанции и ЛЛФ борхлорина

Рисунок 2. Цитотоксичность при облучении субстанции и ЛЛФ борхлорина Заключение.

В результате проведенного исследования установлено, что ЛЛФ борхлорина имеет низкую «темновую» токсичность и обладает высокой цитотоксической активностью в отношении клеток глиомы крысы С6 .

Приложение 3 Изучение «острой» токсичности ЛЛФ борхлорина Место проведения исследования. Лаборатория фармакологии и токсикологии НИИ Экспериментальной диагностики и терапии опухолей ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» Минздрава России.

Целью настоящего исследования являлось изучение "острой" токсичности ЛЛФ борхлорина на мышах и крысах самках и самцах.

Материал исследования. Препарат «Борхлорин липосомальный, лиофилизат для приготовления дисперсии для инъекций 1,0 мг».

Животные. Работа проведена на 120 здоровых мышах самцах и самках линии Ба1Ь/е, полученных из питомника «Столбовая» и 110 здоровых неинбредных беспородных крысах-самцах, полученных из разведения ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» Минздрава России. Результаты исследования.

При изучении "острой" токсичности на мышах ЛЛФ борхлорина при внутривенном применении наблюдалась гибель животных на 1-3 и 8 сутки наблюдения после введения препарата в дозах 20,25 и 13,5 мг/кг. Препарат, введенный в дозе 6,75 мг/кг, гибели животных не вызывал. Через 10-15 минут после введения препарата в высоких дозах и перед гибелью у мышей отмечалось: пилоэрекция, учащенное дыхание, сужение глазных щелей. При аутопсии павших животных отмечено: головной мозг - сосуды инъецированы, кровоизлияние под твердую мозговую оболочку, остальные органы - без особенностей. Показано, что у животных, получавших препарат в дозах не вызывающих гибель животных, каких-либо клинических проявлений токсичности и изменений в поведенческих реакциях отмечено не было.

По величине расчетных токсических доз ЛЛФ борхлорина половых различий в количественной токсичности препарата у мышей практически не

обнаружено: для мышей-самок ЛД™ - 21,38 мг кг; для мышей самцов ЛД™ -22,50 мг/кг.

При изучении "острой" токсичности на крысах ЛЛФ борхлорина гибели животных не наблюдалось. Через 5-10 минут после введения препарата у животных отмечалась гиподинамия, продолжающаяся в течение 15-30 минут, других клинических проявлений токсичности и изменений поведенческих реакций не наблюдалось. При аутопсии умерщвленных в конце опыта животных внутренние органы - без особенностей.

Расчетные токсические и летальные дозы ЛЛФ борхлорина при максимально возможных концентрациях и максимально возможных объемах определены не были в связи с отсутствием гибели животных. Заключение.

Таким образом, изучена «острая» токсичность ЛЛФ борхлорина при однократном внутривенном применении в диапазоне доз на мышах и крысах самках и самцах.

• Установлено отсутствие половых различий для мелких лабораторных животных при применении ЛЛФ борхлорина.

• Установлено, что гибель мышей при применении ЛЛФ борхлорина наступает на 1, 2, 3 и 8 сутки после введения препарата на фоне ярко выраженных сосудистых нарушений.

• Получены расчетные токсические дозы ЛЛФ борхлорина при однократном внутривенном применении мышам: для мышей-самок ЛД50 -21,38 мг/кг; для мышей самцов ЛД50 - 22,50 мг/кг; для крыс расчетные токсические дозы не установлены в связи с отсутствием гибели животных при максимально возможной концентрации и максимально возможном объеме введенного препарата;

• Установлено, что у мышей - самок и у крыс - самцов, получавших ЛЛФ борхлорина в высоких дозах, на протяжении всего срока наблюдения отмечено статистически недостоверное колебание массы тела.

Приложение 4

Доклиническое изучение эффективности липосомальной лекарственной

формы борхлорина для ФДТ саркомы М-1 крыс Место проведения исследования. Лаборатория экспериментальной и фотодинамической терапии ФГБУ «Медицинский радиологический научный центр» МЗ РФ, Обнинск.

Цель исследования: провести оценку противоопухолевой активности доз борхлорина и липосомального борхлорина при проведении ФДТ саркомы М-1 беспородных крыс для определения ФС с наилучшими характеристиками. Задачи исследования:

• изучить динамику накопления липосомального борхлорина в опухоли и здоровой ткани;

• определить минимальную дозу ФС для достижения

противоопухолевого эффекта после ФДТ при плотности энергии

2 2 лазерного излучения 150 Дж/см и плотности мощности 0,25 Вт/см ;

• сравнить противоопухолевую активность свободного борхлорина и борхлорина, включенного в липосомы.

Материал исследования. Субстанция борхлорина, растворенная в растворе ДМСО и препарат «Борхлорин липосомальный, лиофилизат для приготовления дисперсии для инъекций 1,0 мг».

Животные. Исследования были проведены на 146 беспородных крысах. В качестве экспериментальной модели опухоли использовали саркому М-1 крыс. Новообразование перевивали под кожу в область бедра в виде кусочков опухоли донора. В опыт крыс брали на 7-9 день, когда пальпируемая опухоль достигала в диаметре 0,7-1,0 см. Результаты исследования

1. Исследование динамики накопления ФС в опухоли и здоровой ткани

После внутрибрюшинного введения ЛЛФ борхлорина в дозе 5,0 мг/кг максимальный уровень накопления ФС в опухоли наблюдался через 3-4 ч.

Затем интенсивность флюоресценции снижалась и на 10 сутки практически стала равна исходной величине - интенсивности флюоресценции до введения ФС. Заметной селективности накопления препарата в опухолевой ткани не наблюдалось - самый высокий индекс контрастности (отношение опухоль/здоровая ткань) 1,25 отмечен через 3,5 ч (Рисунок 1).

Рисунок 1. Уровень накопления и индекс контрастности липосомального борхлорина в опухолевой и здоровой тканях крыс с саркомой М-1

2. Изучение параметров максимально эффективной дозы ФС

Через 3,5 ч после внутрибрюшинного введения борхлорина в 2% растворе ДМСО в дозах 1,25; 2,5 и 5,0 мг/кг и липосомального борхлорина в дозах 0,75; 1,25; 2,5 и 5,0 мг/кг проводили ФДТ. Противоопухолевый эффект получен при всех исследуемых дозах ФС.

У большинства животных на месте облучения лазером на 3 сутки наблюдался отек и различной плотности корочки, под которыми шло образование грануляций. К 7 суткам у всех животных наблюдались корки разной степени выраженности и к 25 - 48 суткам у 100% животных язвы заживали, на их месте признаков опухоли визуально не обнаруживалось. Степень повреждения ткани в области облучения зависела от дозы ФС.

Минимально эффективная доза ФС липосомального борхлорина, приводящая к полной регрессии саркомы М-1 у 100% животных в течение 21 суток после ФДТ, составляет 1,25 мг/кг, а минимально эффективная доза свободного борхлорина - 5,0 мг/кг. Заключение.

1. Оптимальное время проведения лазерного излучения после внутрибрюшинного введения липосомального борхлорина наступает через 3,5 ч, когда индекс контрастности достигает своего максимального значения. Время полного выведения препарата из организма (остаточная фототоксичность) при дозе ФС 5,0 мг/кг составило 10 суток.

2. Минимальная доза ФС, приводящая к полной регрессии саркомы М-1 и полному излечению у 100% животных после ФДТ при

внутрибрюшинном введении - 2,5 мг/кг, при плотности энергии

22 лазерного излучения 150 Дж/см и плотности мощности 0,25 Вт/см .

3. Установлено, что максимальная эффективность ФДТ с ЛЛФ борхлорина в отношении саркомы М-1 наблюдается в дозе 1,25 мг/кг, которая в 4 раза ниже дозы свободного борхлорина 5,0 мг/кг, вызывающей равный противоопухолевый эффект, что снижает общетоксическое воздействие на организм и накопление ФС в коже.

Доклиническое изучение эффективности липосомальной лекарственной

формы борхлорина для ФДТ опухоли РС-1 крыс Место проведения исследования. Лаборатория экспериментальной и фотодинамической терапии ФГБУ «Медицинский радиологический научный центр» МЗ РФ, Обнинск.

Цель исследования: определить минимально эффективную дозу ФС для достижения полной регрессии опухоли РС-1 у 100% животных (срок наблюдения 21 сутки после ФДТ). Задачи исследования:

• изучить динамику накопления липосомального борхлорина в опухоли РС-1 и здоровой ткани;

• изучить противоопухолевую эффективность ФДТ РС-1 крыс с разными

дозами ФС и одинаковыми параметрами лазерного излучения

22 (плотность энергии 150 Дж/см , плотность мощности 0,25 Вт/см ).

Материал исследования. Препарат «Борхлорин липосомальный, лиофилизат

для приготовления дисперсии для инъекций 1,0 мг».

Животные. Исследования были проведены на 42 беспородных крысах. В качестве экспериментальной модели опухоли использовали культуру клеток РС-1 крыс. Крысам вводили подкожно в область бедра по 0,7-1,0 мл взвеси клеток. Затем 3 раза на крысах делали перепассаж опухолевым материалом. В опыт животных брали на 11 - 13 сутки, когда диаметр опухоли составлял 1,2 - 1,6 см.

Результаты исследования

1. Исследование динамики накопления ФС в опухоли и здоровой ткани

После внутрибрюшинного введения ЛЛФ борхлорина в дозе 2,5 мг/кг максимальный уровень накопления ФС в опухоли наблюдался через 4 ч (интенсивность флюоресценции в этот срок в опухолевой ткани - 3,3 у. ед.) и уже через 4,5 часа начиналось выведение ФС из опухолевой и здоровой

тканей. Интенсивность флюоресценции снижалась и через 2 суток интенсивность флюоресценции стала равна 2,3 у.ед. (при исходной интенсивности флуоресценции в опухоли - 1,8 у. ед.). Что касается индекса контрастности, то самый высокий наблюдался через 2,5 часа. Таким образом, оптимальное время проведения лазерного облучения после введения ФС наступает через 2,5 часа.

Рисунок 1. Уровень накопления и индекс контрастности липосомального борхлорина в опухолевой и здоровой тканях крыс с РС-1

2. Изучение противоопухолевой активности

Противоопухолевую активность ФС изучали на 2-х дозах: 2,5 и 5,0 мг/кг при одинаковых параметрах лазерного излучения.

В группе с дозой 2,5 мг/кг до 10 суток исследования наблюдалась полная регрессия опухоли у 100% животных. На 14 сутки после ФДТ наблюдался боковой рост у 2-х животных (14,3%). На конец наблюдения (21 сутки после ФДТ) процент полной регрессии опухоли составлял 78,4%, рост отмечался у 21,4%.

В группе с дозой 5,0 мг/кг на все сроки наблюдения отмечалась полная

регрессия опухоли у всех животных в группе.

Таким образом, не смотря на значительный первоначальный размер опухоли и ее агрессивность, невысокие параметры лазерного излучения при проведении ФДТ (плотность энергии 150 Дж/см , плотность мощности 0,25 Вт/см ), даже доза 2,5 мг/кг липосомального борхлорина оказалась эффективной для проведения ФДТ. Максимальный ингибирующий эффект получен с дозой ФС 5,0 мг/кг. Заключение.

1. Оптимальное время проведения лазерного облучения после внутрибрюшинного введения липосомального борхлорина наступает через 2,5 часа, когда индекс контрастности достигает своего максимального значения.

2. Значительный ингибирующий эффект (ПР - 78,4%) получен при

внутрибрюшинном введении ФС в дозе 2,5 мг/кг, при плотности

22 энергии 150 Дж/см и плотности мощности 0,25 Вт/см лазерного

излучения.

3. Максимально эффективная доза ФС, приводящая к полной регрессии опухоли РС-1 у 100% животных до 21 сутки исследования после ФДТ, при внутрибрюшинном введении липосомального борхлорина, составляла 5,0 мг/кг, при плотности энергии лазерного излучения 150 Дж/см2 и плотности мощности 0,25 Вт/см2.

>ектор НИИ ЭДиТО им. H.H. Б лох и на» инздрава России, .ф.н. Шпрах З.С.

¡s'

2015 г.

АКТ ВНЕДРЕНИЯ

результатов научных достижений Мы, члены комиссии в составе: вн.с. лаборатории разработки лекарственных форм НИИ ЭДиТО ФГБУ «РОНЦ им. H.H. Блохина» Минздрава России, к ф.н. О.Л. Орлова; ст.н.с. лаборатории разработки лекарственных форм НИИ ЭДиТО ФГБУ «РОНЦ им. H.H. Блохина» Минздрава России, к.ф.н. A.B. Ланцова; ст.н.с. лаборатории разработки лекарственных форм НИИ ЭДиТО ФГБУ «РОНЦ им H.H. Блохина» Минздрава России А П. Полозкова, составили настоящий акт, о том что

наше подразделение лаборатория разработки лекарственных форм НИИ ЭДиТО ФГБУ «РОНЦ им. H.H. Блохина» Минздрава России использует в повседневной работе

следующее предложение: использование результатов диссертационной работы М.В. Дмитриевой «Создание липосомальной лекарственной формы фотосенсибилизатора на основе борированного хлорина ей», в том числе технологию изготовления лекарственного препарата «Борхлорин липосомальный, лиофилизат для приготовления дисперсии для инъекций 1,0 мг».

Авторы предложения: зав. лабораторией разработки лекарственных форм НИИ ЭДиТО ФГБУ «РОНЦ им. Н Н. Блохина» Минздрава России доктор фармацевтических наук, профессор H.A. Оборотова, младший научный сотрудник лаборатории разработки лекарственных форм НИИ ЭДиТО ФГБУ «РОНЦ им. H.H. Блохина» Минздрава России, соискатель ученой степени кандидата фармацевтических наук М.В. Дмитриева.

В н е. лаборатории разработки лекарственных форм

НИИ ЭДиТО ФГБУ «РОНЦ им. H.H. Блохина» МЗ РФ, к.ф.н.

Ст.н.с. лаборатории разработки лекарственных форм НИИ ЭДиТО ФГБУ «РОНЦ им. H.H. Блохина» МЗ РФ, к.ф.н.

Ст.н.с. лаборатории разработки лекарственных форм НИИ ЭДиТО ФГБУ «РОНЦ им, Н Н Блохина» МЗ РФ,

Л

*

/L£l

О.Л. Орлова

A.B. Ланцова

L

АН.

Полозкова

ООО "ВЕТА-ГРАНД^

ИНН 7714172ЭЁ0. КПП 77030100) 123557. Россия, Москаа, ул. М.Грузинская 38 тел : [phone]. [phone] факс: +7(4ЭЭ) 250-16-12 е-ша11: infoiifotoditazin.com

АКТ

о внедрении результатов разработки технологии получения и проекта ИД на препарат

«Борхлорин липосомальный, лиофилизат для приготовления дисперсии для инъекций ] ,0 мг»

Мы, нижеподписавшиеся, составили настоящий акт о внедрении результатов разработки технологии получения и проекта НД на препарат «Борхлорин липосомальный, лиофилизат для приготовления дисперсии для инъекций КО мг». Опытная партия, наработанная в условиях лаборатории разработки лекарственных форм НИИ ЭДиТО ФГБУ «РОНЦ им. И.И. Блохина» Минздрава России соответствует требованиям разработанного проекта НД. Полученные данные могут быть использованы для создания опытно-промышленного регламента, а также для внедрения материалов разработки в производство после необходимой доработки с целью обеспечения проведения клинических испытаний препарата.

Генеральный директор

Малова Т.И.