Создание монолитных аффинных сорбентов для выделения активаторов плазминогена тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.06, кандидат химических наук Влах, Евгения Георгиевна

• Влах, Евгения Георгиевна
• кандидат химических наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат химических наук Влах, Евгения Георгиевна

Список сокращений.

Введение.

1. Обзор литературы.

1.1. Биосепарация - основной этап биотехнологии.

1.1.1. Использование аффинности в разделительных процессах. ц 1.1.2. Сущность аффинной хроматографии.

1.1.3. Аффинные лиганды.

1.1.4. Количественное определение параметров аффинного комплексообразования.

1.2. Монолитные сорбенты для биоспецифических (аффинных') межфазовых разделений биологических молекул.

1.2.1. Требования, предъявляемые к стационарным фазам для аффинной хроматографии.

1.2.2. Современные стационарные фазы: монолитные сорбенты.

1.2.3. Высокоэффективная монолитная хроматография на основе ультра-коротких ГМА-ЭДМА стационарных фаз.

1.2.4. Применение высокоэффективной монолитной дисковой хроматографии (ВЭМДХ) для аффинного выделения белков.

1.3. Способы создания аффинных матриц.

1.3.1. Нековалентная иммобилизация.

1.3.2. Ковалентная иммобилизация белков и пептидов.

1.3.2.1. Основные аспекты.

1.3.2.2. Методы химической иммобилизации аминосодержащих л лигандов.

1.3.3. Прямой твердофазный синтез пептидов на монолитных носителях.

1.3.3.1. Основная концепция твердофазного синтеза пептидов.

1.3.3.2. Монолитные носители и твердофазный синтез на их основе.

1.3.3.3. Проблема контроля пептидного синтеза на монолитных носителях.

1.3.4. Создание аффинных сорбентов полимеризацией предварительно модифицированных сомономеров.

1.4. Активаторы плазминогена.

1.4.1. In vivo взаимодействия белков крови при тромбозе и фибринолизе.

1.4.2. Стрептокиназа.

1.4.3. Урокиназа и про-урокиназа.

1.4.4. Тканевый активатор плазминогена.

1.4.5. Стафилокиназа.

1.4.6. Производство и выделение активаторов плазминогена.

2. Результаты и обсуждение.

2.1. Создание аффинных сорбентов на основе макропористых монолитных ГМА-ЭДМА дисков.

2.1.1. Ковалентная иммобилизация белковых лигандов на поверхности монолитных ГМА-ЭДМА сорбентов.

2.1.2. Ковалентная иммобилизация предварительно синтезированных пептидных лигандов.

2.1.2.1. Синтез и исследование пептидов.

2.1.2.2. Иммобилизация пептидных лигандов на поверхности монолитных носителей.

2.1.3. Прямой синтез пептидных лигандов на поверхности проточных ГМА-ЭДМА сорбентов (дисков).

2.1.3.1. Предварительная функционализация монолитного носителя.

2.1.3.2. Определение концентрации свободных аминогрупп на поверхности модифицированного полимерного сорбента.

2.1.3.3. Введение fi-аланина в структуру сополимера.

2.1.3.4. Выбор стратегии твердофазного синтеза и анализа продуктов, полученных на монолитных носителях. Синтез модельных пептидов.

2.1.3.5. Синтез целевых последовательностей.

2.1.3.6. Характеристика матриц, полученных для аффинной хроматографии.

2.2. Изучение аффинных свойств активаторов плазминогена методом ВЭМДХ с использованием полученных белок- и пептидсодержащих сорбентов.

2.2.1. Хроматографическая оценка аффинных характеристик комплексов активаторов плазминогена с природными и синтетическими комплементами.

2.2.1.2. Взаимодействие тканевого активатора плазминогена с природными биокомплементами.

2.2.1.2. Взаимодействие тканевого активатора плазминогена с иммобилизованными гомо- и гетеропептидными лигандами.

2.2.1.3. Взаимодействие стрептокиназы и про-урокиназы с иммобилизованными пептидными лигандами и плазимногеном.

2.2.2. Сравнение характеристик аффинного комплексообразования активаторов плазминогена с пептидными лигандами, иммобилизованными и впрямую синтезированными на поверхности ГМА-ЭДМА монолитов.

2.3. Скоростное аффинное выделение активаторов плазминогена из клеточных супернатантов и модельных смесей белков.

2.3.1. Исследование возможности неспецифического связывания различных белков полученными пептидсодержащими сорбентами.

2.3.2. Выделение тканевого активатора плазминогена из нативного клеточного супернатанта. Анализ чистоты выделенного продукта.

2.3.3. Выделение стрептокиназы и про-урокиназы из модельных белковых смесей. t 3. Экспериментальная часть.

3.1. Материалы.

3.2. Оборудование.

3.3. Методы.

3.3.1. Синтез вспомогательных веществ и производных аминокислот.

3.3.2. Твердофазный синтез пептидов на полистирольном носителе.

3.3.2.1. Общая схема твердофазного пептидного синтеза.

3.3.2.2. Качественные реакции, используемые в твердофазном пептидном синтезе.

3.3.2.3. Удаление пептидов с полимерного носителя.

3.3.2.4. Деблокирование и окисление сульфгидрильных групп остатков цистеина (циклизация декапепида KCPGRWGGC).

3.3.2.5. Очистка и ОФ ВЭЖХанализ синтезированных пептидов.

3.3.3. Твердофазный синтез пептидов на поверхности проточных монолитных ГМА-ЭДМА дисков.

3.3.3.1. Функционализация монолитного носителя.

3.3.3.2. ИК-спектроскопия.

3.3.3.3. Общая схема синтеза.

3.3.3.4. Циклизация пептида CGG WRGPCK-ß-A.

3.3.3.5. Выделение и предочистка пептидов для аналитических целей.

3.3.3.6. ОФ ВЭЖХанализ пептидов, синтезированных на ГМА-ЭДМА дисках.

3.3.4. Методы исследования пептидных продуктов.

3.3.4.1. Аминокислотный анализ.

3.3.4.2. Масс-спектрометрия.

3.3.4.3. Хроматографический анализ олиголизинов.

3.3.5. Иммобилизация аффинных лигандов на поверхности монолитных макропористых ГМА-ЭДМА сорбентов.

3.3.5.1. Характеристика и подготовка стационарных фаз.

3.3.5.2. Иммобилизация пептидных лигандов.

3.3.5.3. Иммобилизация белков.

3.3.5.4. Аналитические методы определения концентрации белок- и пептидсодержащих растворов.

3.3.6. Определение параметров аффинного взаимодействия.

3.3.6.1. Аффинная ВЭМДХ.

3.3.6.2. Определение количественных параметров аффинного комплексообразования.

3.3.7. Выделение активаторов плазминогена из клеточных супернатантов и модельных смесей белков.

3.3.7.1. Приготовление клеточных супернатантов.

3.3.7.2. Выделение тканевого активатора плазминогена из клеточных супернатантов.

3.3.7.3. Выделение стрептокиназы и про-урокиназы из модельных смесей белков.

3.3.7.4. Иммуноферментный анализ (метод конкурентного связывания).

3.3.7.5. Гель-электрофорез.

Выводы.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Создание монолитных аффинных сорбентов для выделения активаторов плазминогена»

Одной из наиболее острых проблем мирового здравоохранения является высокий процент смертности от острых сердечно-сосудистых заболеваний. Причиной данного заболевания является поражение кровеносных сосудов образующимися тромбами, наличие которых серьезно нарушает, а впоследствии может полностью блокировать нормальный кровоток. Природной альтернативой образованию тромбов в живом организме является обратный процесс, а именно, растворение тромбов, или фибринолиз, происходящий под действием фермента плазмина. Данный фермент является продуктом расщепления его предшественника - плазминогена, которое происходит при каталитическом участии так называемых активаторов плазминогена, таких как стрептокиназа (СК), про-урокиназа (про-УК) и тканевый активатор плазминогена (ТАП). Очевидно, что естественных количеств образующегося при нормальном фибринолизе плазмина хватает лишь для растворения небольшого количества тромбов, т.е. для поддержания природного баланса между тромбозом и фибринолизом, присущего здоровому организму. В случае же отклонения от нормы, усиленный тромболитический эффект может быть достигнут использованием терапевтических доз экзогенных активаторов плазминогена.

В настоящее время наиболее перспективными способами получения подобных лекарственных препаратов, как из-за отсутствия ограничений по источнику сырья (донорской крови), так и относительно низкой стоимости конечного продукта, являются генно-инженерные методы. При производстве терапевтических белков генно-инженерным способом возникают такие технологические проблемы как (1) анализ чистоты выделяемого продукта, и (2) его препаративное, желательно одностадийное, выделение непосредственно из клеточных лизатов или супернатантов. Одним из приоритетных методов для решения данных задач является аффинная хроматография, основанная на образовании высокоспецифических обратимо-диссоциирующих комплексов биологических макромолекул с комплементарными адсорбционными центрами, локализованными на поверхности неподвижной фазы.

Развитие идеологии современных аффинных разделений тесно связано с конструированием новых материалов-носителей и новых подходов к получению аффинных сорбентов. Одним из самых современных и перспективных сорбентов, удовлетворяющих всем требованиям, выдвигаемым к разделительным стационарным фазам, являются так называемые монолитные твердые фазы, в частности, макропористые сорбенты на основе сополимера глицидшметакрилата (2,3-эпоксипропилметакрилата) и этиленгликольдиме-такршата (ГМА-ЭДМА), выполненные в форме цельных дисков. Метод динамического

разделения веществ с использованием данных оригинальных сред получил название высокоэффективной монолитной дисковой хроматографии (ВЭМДХ).

Морфологические, стерические и гидродинамические свойства данных носителей позволяют проводить биосепарационные процессы с использованием высоких скоростей потока подвижной фазы. Осуществление скоростных разделений становится возможным, благодаря практически полному отсутствию диффузионных ограничений нормальному межфазовому переносу вещества. Именно это обстоятельство позволяет не только эффективно разделять вещества разных классов, но также исследовать неискаженную кинетику биоспецифических межмолекулярных взаимодействий. Кроме того, серьезным преимуществом ГМА-ЭДМА стационарных фаз является наличие собственных эпоксидных групп, позволяющих проводить одностадийную функционализацию сорбента биологически активными веществами (лигандами).

Важным этапом любого разделительного процесса, основанного на природной био-комплементарности, прежде всего, является выбор наиболее эффективного лиганда. В качестве аффинных лигандов для выделения активаторов плазминогена (АП), в большинстве случаев, используют моноклональные антитела, полученные в результате иммунного ответа организма при введении соответствующего АП. Однако, несмотря на высокую специфичность, природные биомолекулы имеют ряд недостатков, ограничивающих их практическое использование. Среди таких недостатков можно назвать, в первую очередь, их высокую стоимость, а, во-вторых, неустойчивость (лабильность) структуры белка, затрудняющую их эксплуатацию. Поэтому поиск более дешевых и устойчивых синтетических лигандов является одной из важнейших задач для разработки методов анализа и выделения АП. Из ранее опубликованных данных известно, что роль аффинных лигандов, способных образовывать высокоспецифичные комплексы с ТАП, могут выполнять различные производные лизина, а также пептид 01у-Рго-А^-Рго (ОРЯР). Однако систематических исследований с целью сравнения и выбора оптимального синтетического партнера для выделения ТАП и других активаторов плазминогена до сих пор не проводилось. В соответствии со всем вышесказанным, поиск новых аффинных партнеров и использование их для эффективного скоростного выделения таких ценных генно-инженерных лекарственных препаратов, как активаторы плазминогена, является, несомненно, актуальной проблемой.

Традиционно, аффинные сорбенты получают иммобилизацией предварительно синтезированных и очищенных пептидов. Однако альтернативным и более экономичным подходом представляется прямой синтез данных соединений на поверхности хроматогра-фических сорбентов. При этом матрица должна удовлетворять требованиям, предъявляемым как к твердым фазам для пептидного синтеза, так и к сорбентам для хроматографии. Другими словами, подобная стационарная фаза должна быть хорошо проницаемой, стабильной как в органических, так и в водных средах, содержать функциональные группы позволяющие осуществить ТФПС, а также должна обеспечивать высокую доступность для молекул выделяемого вещества. Во избежание денатурации биологических продуктов, аффинные сорбенты должны быть гидрофильны. В соответствии с перечисленными свойствами, макропористые монолитные ГМА-ЭДМА сорбенты идеально подходят для обоих видов использования. Это и определяет научную новизну работы, которая заключается в:

- разработке оригинального метода построения аффинных сепарационных систем на основе макропористых сорбентов монолитного типа с использованием метода прямого твердофазного синтеза пептидов, выполняющих функцию биоспецифических лигандов;

- хроматографическом моделировании и количественном сравнении биологических взаимодействий на примере одного из механизмов фибринолиза;

- разработке и оптимизации скоростного одностадийного метода выделения биологических продуктов (активаторов плазминогена) из многокомпонентных смесей. Таким образом, целью данной работы являлось создание аффинных сорбентов традиционным способом и посредством прямого ТФПС на поверхности монолитных ГМА-ЭДМА сорбентов, а также исследование и сравнение их специфических взаимодействий с интересующими объектами, а именно, активаторами плазминогена. Данное исследование определило выбор наиболее подходящего аффинного лиганда для решения практической задачи — скоростного и эффективного выделения активторов плазминогена методом ВЭМДХ.

В связи с этим, были поставлены и решались следующие задачи: выбор пептидов, комплементарных к интересующим белкам, на основе анализа природных биологических взаимодействий с участием данных белков;

- синтез выбранных пептидных лигандов традиционным твердофазным методом и их физико-химический анализ;

- получение аффинных сорбентов путем ковалентной иммобилизации биолигандов на поверхности ГМА-ЭДМА монолитных сорбентов;

- разработка оригинального метода твердофазного пептидного синтеза на поверхности монолитных сорбентов и детальный анализ качества получаемых пептидных соединений; использование данного метода для получения сорбентов с пептидными лигандами, необходимыми для выделения активаторов плазминогена;

- определение количественных параметров биокомплементарного взаимодействия активаторов плазминогена (СК, про-УК и ТАП) с различными лигандами с использованием метода скоростной аффинной ВЭМДХ;

- сравнение характеристик аффинных пар, образованных с участием лигандов, синтезированных и иммобилизованных на поровой поверхности монолитного сорбента; исследование процессов выделения ТАП, СК и про-УК из многокомпонентных смесей.

Работа выполнена в рамках научной кооперации между Институтом высокомолекулярных соединений РАН и Институтом технической химии Университета Ганновера (Германия) (гранты DFG KR 1076/6-1 и ННО-РАН 436 RUS 113/555/0); при участии лаборатории №4 ИВС РАН и Института прикладной микробиологии Университета сельскохозяйственных наук Вены (Австрия), а также при финансовой поддержке фирмы BIA Separations d. о. о. (Любляна, Словения).

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Биосепарация — основной этап биотехнологии

Современный уровень генной инженерии позволяет достаточно легко масштабировать производство природных биологически активных веществ различных классов, в частности, белков. При этом возникает необходимость создания эффективных методов, как аналитического производственного контроля, так и препаративного выделения чистого продукта непосредственно из клеточных лизатов и супернатантов. Таким образом, разработка стадии выделения и тонкой очистки, т.е. создание высокоэффективных и высокопроизводительных сепарационных методов, является одной из основных и важнейших задач в производстве биологически активных веществ медицинского назначения.

Для очистки целевой субстанции в условиях непрерывного биотехнологического процесса широко используются такие методы как осаждение, ультрацентрифугирование, ультрафильтрация, жидкостная хроматография и др. [1], однако только последняя может гарантировать степень очистки продукта до безопасного терапевтического уровня. По современному определению, хроматографический сепарационный процесс происходит в условиях динамического квазиравновесного распределения вещества между подвижной (жидкой) и неподвижной (твердой) фазой [2]. При этом разделяемые биологические молекулы взаимодействуют с поверхностью неподвижной, как правило, пористой фазы по механизму адсорбции («положительное» взаимодействие) или эксклюзии («отрицательное» взаимодействие или исключение из пор малого размера). Однако биомолекулы, такие, как белки, полисахариды и нуклеиновые кислоты, внутри своих индивидуальных групп отличаются по физико-химическим свойствам лишь незначительно; поэтому их выделение, основанное на различиях в этих свойствах, например, с помощью ионообменной хроматографии, гель-фильтрации или электрофореза сопряжено с известными трудностями и требует значительных временных затрат. Вследствие этого, в процессе выделения существенно падает биологическая активность продукта из-за его денатурации, расщепления, ферментативного гидролиза и т. п. [3].

Заключение диссертации по теме «Высокомолекулярные соединения», Влах, Евгения Георгиевна

ВЫВОДЫ

Перечисленные выше результаты могут служить основой для следующих выводов:

1. Разработан оригинальный метод создания аффинных носителей путем прямого твердофазного синтеза пептидов на поверхности макропористых монолитных по-лиметакрилатных сорбентов, позволяющий получать качественные сепарационные среды при незначительных затратах времени и реагентов.

2. Впервые, на примере одного из путей фибринолиза показано, что метод ВЭМДХ может быть использован для in vitro моделирования различных этапов метаболических процессов, происходящих через образование биоспецифических комплексов природных комплементарных молекул. Данный подход был использован для подтверждения различий механизмов взаимодействия с субстратом исследованных активаторов плазминогена, а также при поиске эффективных биоспецифических ли-гандов для их выделения.

3. Проведено количественное сравнение аффинных свойств носителей с иммобилизованными и непосредственно синтезированными на поверхности ГМА-ЭДМА монолитов лигандами. Показано, что в случае одноточечного связывания, способ прикрепления лиганда к поверхности носителя (через С- или N-концевую аминокислоту) не отражается на величинах констант диссоциации аффинных комплексов, тогда как многоточечное связывание лиганда с поверхностью сорбента ведет к ухудшению аффинных характеристик.

4. Впервые с использованием полученных аффинных матриц показана возможность скоростного и эффективного выделения активаторов плазминогена из многокомпонентных смесей белков, включая нативные клеточные супернатанты, содержащие рекомбинантный продукт.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Влах, Евгения Георгиевна, 2005 год

1. Д. Г. Кнорре, С. Д. Мызина. Биологическая химия. М.: Высшая школа, 1998.

2. Сборники научно-нормативной терминологии. Хроматография. Основные понятия. Терминология. Вып. 114 , Москва, 1997.

3. Я. Туркова. Аффинная хроматография, М.: Мир, 1980.

4. Y. D. Clonis. Matrix evaluation for preparative high-performance affinity chromatography. // J. Chromatogr. 1987. V. 407. P. 179-187.

5. И. Ю. Галаев. Новые методы очистки белков. Аффинная ультрафильтрация. // Биохимия. 1999. Т. 64. С. 1013-1021.

6. И. Ю. Галаев, Б. Маттиассон. Новые методы аффинной очистки белков. Аффинное осаждение. И Биохимия. 1997. Т. 62. С. 669-676.

7. J. Turkova. Bioaffinity Chromatography, in: Aboul-Enein H.Y. (Ed.) Analytical and Preparative Separation methods of Biomacromolecules. New-York: Marcel Dekker. 1999. C. 99-166.

8. Т. M. Phillips, J. M. Krum. Recycling Immunoaffinity Chromatography for Multiple Analyte Analysis in Biological Samples. //J. Chromatogr. B. 1998. V. 715. P. 55-63.

9. S. Katoh, M. Terashima, N. Shiomi. Utilization of Antipeptides Antibodies as Affinity1.gands in Immunoaffinity Purification. II J. Chromatogr. B. 1998. V. 715. P. 147-152.

10. K. Huse, H. J. Böhme, G. H. Scholz. Purification of Antibodies by Affinity Chromatography. II J. Biochem. Biophys. Methods. 2002. V. 51. P. 217-231.

11. N. B. Tulsani, A. Kumar, M. A. Vijayalakshmi. Purification of Muscle Enzymes by Pseu-doaffmity Chromatograpfy. // Prep. Biochem. Biotechnol. 1999. V. 29. P. 151-161.

12. A. W. Adamanson. Physical Chemistry of Surfaces. New-York: Wiley Interscience. 1976.1. P. 553-556.

13. E. C. Moreno, M. Kresak, D. H. Hay. Adsorption of two human parotid salivary macromolecules on hydroxy-, fluorhydroxy- and fluorapatites. // Arch. Oral. Biol. 1978. V. 23. P. 525-533.

14. E. C. Moreno, M. Kresak, D. H. Hay. Adsorption thermodynamics of acidic proline-rich human salivary proteins onto calcium apatites. // J. Biol. Chem. 1982. V. 257. P. 2981-2989.

15. R. Freitag. Utilization of Enzyme-Substrate Interactions in Analytical Chemistry. // J. Chromatogr. B. 1999. V. 722. P. 279-301.

16. S. Ohlson, M. Bergström, P. Pahlsson, A. Lundblad. Use of Monoclonal Antibodies for Weak Affinity Chromatography. II J. Chromatogr. A1997. V. 758. P. 199-208.

17. P. Y. Huang, R. G. Carbonell. Affinity Chromatographic Screening of Soluble Combianato-rial peptide Libraries. // Biotechnol. Bioeng. 1999. V. 63. P. 633-641.

18. R. Arshady. Beaded polymer supports and gels. Physico chemical criteria and functionali-zationv. // J. Chromatogr. 1991. V. 586. P. 199-219.

19. H. Chen, C Horvath. High-speed High-performance Liquid Chromatography of Peptides and Proteins. II J. Chromatogr. A. 1995. V. 705. P. 3-20.

20. R. Janzen, K. K. Unger, H. Giesche, J. N. Kinkel, M. T. W. Hearn. Evaluation of Advanced

21. D. D. Frey, X. Kang. Chromatofocusing Using Micropellicular Column Packings with

22. Computer-aided Design of the Elution Buffer Composition. II Anal. Chem. 2002. V. 74. P. 10381045.

23. N. B. Afeyan, S. P. Fulton, F. E. Regnier. Perfusion Chromatography Packing Materials for Proteins and Peptides. II J. Chromatogr. 1991. V. 544. P. 267-279.

24. H. Iwata, K. Saito, S. Furusaki, T. Sugo, J. Okamoto. Adsorption Characteristics of an Immobilized Metal Affinity Membrane. II Biotechnol. Prog. 1991. V. 7. P. 412-418.

25. J. Hradil, D. Horak, M. Benes, in: M. Potschka, P. Dubin (Eds.). Strategies in Size Exclu-p sion Chromatography. ACS Symposium Series 635. Washington, D.C. 1996. P. 212-245.

26. V. Saxena, A. E. Weil. Radial Flow Column: a New Approach to Scaling-up Biopurifications. // BioChromatography. 1987. V. 2. P. 90-97.

27. F. Svec, J. M. J. Frechet. Modified Poly(glycidyl methacrylate-co-ethylene dimethacrylate) Continuous Rod Columns for Preparative-scale Ion-exchange Chromatography of Proteins. H J. Chromatogr. 1995. V. 702. P. 89-97.

28. S. Hjerten, J. L. Liao, R. Zhang. High-performance Liquid Chromatography on Continuous Polymer Beds. H J. Chromatogr. 1989. V. 473. P. 273-275.

29. J. Mohhammad, S. Hjerten. Continuous Beds. Their Applicability for Immobilization of Proteins. //Biomed. Chromatogr. 1994. V. 8. P. 165-169.

30. T. B. Tennikova, M. Bleha, F. Svec, T. V. Almazova, B, G. Belenkii. High Performance Membrane Chromatography of Proteins: a Novel Method of Protein Separation. // J. Chromatogr. 1991. V. 555. P. 97-107.

31. T. B. Tennikova, F. Svec. High-performance Membrane Chromatography: Highly Efficient Separation Method for Proteins in Ion-exchange, Hydrophobic Interaction and Reversed-phase Modes. II J. Chromatogr. 1993. V. 646. P. 279-288.

32. H. Abou-Rebyeh, F. Korber, K. Schubert-Rehberg, J. Reusch, Dj. Josic. Carrier Membrane as a Stationary Phase for Affinity Chromatography and Kinetic Studies of Membrane-bound Proteins. II J. Chromatogr. B. 1991. V. 566. P. 341-350.

33. D. Josic, J. Reusch, K. Loster, O. Baum, W. Reutter. High Performance Membrane Chromatography of Serum and Plasma Membrane Proteins. // J. Chromatogr. 1992. V. 590. P. 59-76.

34. F. Svec, J. M. J. Frechet. Kinetic Control of Pore Formation in Macroporous Polymers. Formation of "Molded" Porous Materials with Flow Characteristics for Separation and Catalysis. II Chem. Mater. 1995. V. 7. P. 707-715.

35. F. Svec, T. Tennikova. Polymeric Separation Media for Chromatography of Biopolymers in a Novel Shape: Macroporous Membranes. // Bioact. Compat. Polym. 1991. V. 6. P. 394-406.

36. C. Kasper, L. Meringova, R. Freitag, T. Tennikova. Fast Isolation of Protein Receptors from

37. Streptococci G by Means of Macroporous Affinity Disks. // J. Chromatogr. B. 1998. V. 65. P. 65-72.

38. L. Berruex, R. Freitag, T. B. Tennikova. Comparison of Antibody Binding to Immobilized Group Specific Affinity Ligands in High Performance Monolith Affinity Chromatography. // J. Pharm. Biomed. Anal. 2000. V. 24. P. 95-104.

39. E. C. Peters, F. Svec, J. M. J. Frechet. Rigid Macroporous Polymer Monoliths. I I Adv. Mater. 1999. V. 11. P. 1169-1181.

40. A. Podgornik, M. Barut, I. Mihelic, A. Strancar. Tubes. In book: F. Svec, T. Tennikova, Z. Deyl (Eds.). Monolithic Materials: Preparation, Properties and Applications. Amsterdam: Elsevier. 2003. P. 77-102.

41. P. Gustavsson, P. Larsson. Monolithic Polysaccharide Materials. In book: F. Svec, T. Tennikova, Z. Deyl (Eds.). Monolithic Materials: Preparation, Properties and Applications. Amsterdam: Elsevier. 2003. P. 121-142.

42. E. Calleri, G. Massolini, D. Lubda, С. Temporini, F. С. Loiodice, G. Caccialanza. Evaluation of a monolithic epoxy silica support for penicillin G acylase immobilization. // J. Chro-manogrA. 2004. V. 1031. P. 93-100.

43. X. Huang, S. Zhang, G. A. Schultz, J. Henion. Surface-alkylated Polystyrene Monolithic Columns for Peptide Analysis in Capillary Liquid Chromatography-electrospray Ionization Mass Spectrometry. II Anal. Chem. 2002. V. 74. P. 2336-2344.

44. C. G. Huber. Biopolymer Chromatography, in book: R. A. Meyers (Ed.). Encyclopedia of Analytical Chemestry. Chichester: John Wiley & Sons Ltd. 2000. P. 11250-11278.

45. F. Svec, T. Tennikova, Z. Deyl (Eds.). Monolithic Materials: Preparation, Properties and Applications. Amsterdam: Elsevier. 2003.

46. Т. B. Tennikova, F. Svec. Theoretical Aspects of Separation Using Short Monolithic Beds. In book: F. Svec, T. Tennikova, Z. Deyl (Eds.). Monolithic Materials: Preparation, Properties and Applications. Amsterdam: Elsevier. 2003. P. 351-372.

47. A. Podgornik, M. Barut, J. Jancar, A. Strancar, T. Tennikova. High-performance Membrane Chromatography of Small Molecules. II Anal. Chem. 1999. V. 71. P. 2986-2991.

48. R. Giovannini, R. Freitag, Т. В. Tennikova. High-performance Membrane Chromatography of Supercoiled Plasmid DNA. II Anal. Chem. 1998. V. 70. P. 3348-3354.

49. Т. B. Tennikova, R. Freitag. An Introduction Disks as Stationary Phases for High Performance Biochromatography, И J. Resol. Chromatogr. 2000. V. 23. P. 27-38.

50. А. А. Демин, А. Д. Могилевская, Г. В. Самсонов. Особенности многокомпонентной сорбции белков катионитсодержащими композитами. И Журнал физической химии. 1996. Т. 70. С. 2059-2062.

51. А. Е. Rodrigues, V. G. Mata, М. Zabka, L. Pais. Flow and Mass Transfer. In book: F. Svec, T. Tennikova, Z. Deyl (Eds.). Monolithic Materials: Preparation, Properties and Applications. Amsterdam: Elsevier. 2003. P. 325-350.m

52. D. Josic, A. Buchacher, A. Jungbauer. Monoliths as Stationary Phases for Separation of Proteins and Polynucleotides and Enzymatic Conversion. II J. Chromatogr. B. 2001. V. 752. P. 191-205.

53. M. B. Tennikov, N. V. Gazdina, Т. B. Tennikova, F. Svec. Effect of Porous Structure of Macroporous Polymer Supports on Resolution in High-Performance Membrane Chromatography of Proteins. II J. Chromatogr. A. 1998. V. 798. P. 55-64.

54. A. Strancar, М. Barut, A. Podgornik, P. Koselj, H. Schwinn, P. Raspor, D. Josic. Application of Compact Porous Tubes for Preparative Isolation of Clotting Factor VIII from Human Plasma. II J. Chromatogr. A. 1997. V. 760. P. 117-123.

55. R. Freitag, J. Breier. Displacement Chromatography in Biotechnological Downstream Processing. II J. Chromatogr. 1995. V. 691. P. 101-109.

56. R. Freitag, S. Vogt. Comparison of Particulate and Continuous-bed Columns for Protein Displacement Chromatography. II J, Biotechnol. 2000. V. 78. P. 69-82.

57. D. Josic, F. Bai, H. Schwinn. Isolation of Plasma Proteins from the Clotting Cascade by Heparin Affinity Chromatography. II J. Chromatogr. 1993. V. 632. P. 1-10.

58. JI. Ф. Мерингова, Г. Ф. Леонтьева, Т. В. Гупалова, Т. Б. Тенникова, А. А. Тотолян. Выделение и исследование рекомбинантного IgG-связывающего рецептора стрептококка группы G с использованием макропористых дисков. // Биотехнология. 2000. Т. 4. С. 45-53.

59. G. A. Platonova, G. A. Pankova, I. Е. Il'ina, G. P. Vlasov, Т. В. Tennikova. Quantitative Fast Fractionation of Pool of Polyclonal Antybodies by Immunoaffinity Membrane Chromatography. II J. Chromatogr. A. 1999. V. 852. P. 129-140.

60. N. D. Ostryanina, О. V. Il'ina, Т. B. Tennikova. Effect of Experimental Conditions on Strong Biocomplementary Pairing in High-Performance Monolithic Disk Affinity Chromatography. II J. Chromatogr. B. 2002. V. 770. P. 35-43.

61. N. D. Ostryanina, G. P. Vlasov, Т. B. Tennikova. Multifunctional Fractionation of Polyclonal Antibodies by Immunoaffinity High-performance Monolithic Disk Chromatography. // J. Chromatogr. A. 2002. V. 949. P. 163-171.

62. J. Hagedorn, С. Kasper, R. Freitag, Т. Tennikova. High Performance Flow Injection Analysis of Recombinant Protein G. // J. Biotechnology. 1999. V. 69. P. 1-7.

63. R. Necina, K. Amatschek, E. Schallaun, H. Schwinn, D. Josic, A. Jungbauer. Peptide Affinity Chromatography of Human Clotting Factor VIII. Screening of the vWF-binding domain. // J. Chromatogr. B. 1998. V. 715. P. 191-201.

64. M. Nisnevitch, M. A. Firer. The Solid Phase in Affinity Chromatography: strategies for antibody attachment. И J. Biochem. Biophys. Methods. 2001. V. 49. P. 467-480.

65. А. V. Litvinchuk, A. A. Morozova, М. I. Savenkova, D. I. Metelitsa. Noncovalent immobilization of catalase on antibodies adsorbed on carbon fabric. // Prikl. Biokhim. Mikrobiol. 1994. V. 30. P. 572-581.

66. F. W. Autin, R. E. Corstvet. Purification of a Pasteurella Haemolitica Serotype I-specific Polysaccharide Epitope by Use of Monoclonal Antibody Immunoaffinity. // Am. J. Vet. Res. 1993. V. 54. P. 695-700.

67. R. F. Taylor. Protein Immobilization: Fundamentals and Application. New York: Marcel Dekker. 1991.

68. S. S. Wong. Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking. Boca Raton: CRC Press, 1993.

69. G. Fassina. Oriented Immobilization of Peptide Ligands on Solid Supports. // J. Chroma-togr. 1992. V. 591. P. 99-106.

70. B. Lu, M. R. Smith, R. O'Kennedy. Oriented Immobilization of Antibodies and its Applications in Immunoassays and Immunosensors. ¡/Analyst. 1996. V. 121. P. 29R-32R.

71. Z. Bilkova, J. Mazurova, J. Churacek, D. Horak, J. Turkova. Oriented Immobilization of Chymotrypsin by Use of Suitable Antibodies Coupled to a Nonporous Solid Support. // J. Chro-matogr. A. 1999. V. 852. P. 141-149.

72. J. Hale. Irreversible, Oriented Immobilization of Antibodies to Cobalt-intermediate Resin for Use as Immunoaffinity Media //Anal. Biochem. 1995. V. 231. P. 46-49.

73. G. T. Hermanson, A. K. Mallia, P. K. Smith. Immobilized Affinity Ligand Techniques. New York: Academic Press. 1992.

74. Т. Дэвени, Я. Гергей. Аминокислоты. Пептиды. Белки. М.: Мир. 1976.

75. Х.-Д. Якубке, X. Ешкайт. Аминокислоты. Пептиды. Белки. М.: Наука. 1985.

76. Merrifield R. В. Solid Phase Peptide Synthesis. 1. The Synthesys of a Tetrapeptide. // J. Am. Chem. Soc. 1963. V. 85. P. 2149-2154.

77. Дж. Стюарт, Дж. Янг. Твердофазный синтез пептидов. М.: Мир. 1971.

78. А. А. Гершкович, В. К. Кибарев. Синтез пептидов. Реагенты и методы. Киев: Нау-кова думка. 1987.

79. G. В. Fields, R. L. Noble. Solid Phase Peptide Synthesis utilizing 9-fluorenylmethoxycarbonyl Amino Acids. // Int. J. Peptide Protein Res. 1990. V. 35. P. 161-214.

80. Ред. В. Т. Иванов. Пептиды. Основные методы образования пептидных связей. М.: Наука. 1993.

81. Ред. Э. Гросс, И. Майенхофер. Пептиды. Основные методы образования пептидных связей. М.: Мир. 1965.

82. Д. Гринштейн, М. Виниц. Химия аминокислот и пептидов. М.: Мир. 1965.

83. Э. Шредер, К. Любке. Пептиды. М.: Мир. 1967.

84. A. Jungbauer, K. Pflegerl. Solid Phase Synthesis and Auxiliaries for Combinatorial Chemistry. In Book: F. Svec, T. Tennikova, Z. Deyl (Eds.). Monolithic Materials: Preparation, Properties and Applications. Amsterdam: Elsevier. 2003. P. 725-743.

85. Huang P. Y., Carbonell R. G. Affinity Chromatographic Screening of Soluble Combinatorial Peptide Libraries. // Biotech. Bioeng. 1999. V. 63. P. 633-641.

86. B. Blankemeyer-Menge, R. Frank. Simultaneous Multiple Synthesis of Peptide Fragments on "Allyl"-functionalized Cellulose Disc Supports. II Tetrahedron Lett. 1988. V. 29. P. 58715874.

87. R. Döring, R. Frank. Simultaneous Multiple Synthesis Under Continuous Flow Conditionson Cellulose Paper Discs as Segmental Solid Supports. // Tetrahedron. 1988. V. 44. P. 60316040.

88. R. Frank R. Spot-Synthesis: An Easy Technique for the Positionally Addressable, Parallel Chemical Synthesis on a Membrane Support. // Tetrahedron. 1992. V. 48. P. 9217-9232.

89. H. Wenschuh, R. Volkmer-Engert, M. Schmidt, M. Schulz, U. Reineke. Coherent Membrane for Parallel Microsynthesis and Screening of Bioactive Peptides. // Biopolymers. 2000. V. 55. P. 188-206.

90. S. B. Daniels, M. S. Bernatowicz, J. M. Coull, H. Köster. Membranes as Solid Supports for Peptide Synthesis. // Tetrahedron Lett. 1989. V. 30. P. 4345-4348.

91. R. Berg, K. Aldmal, W. B. Pedersen, A. Holm, J. P. Tarn, R. B. Merrifield. Long-Chain Polystyrene-Grafted Polyethylene Film Matrix: A New Support for Solid-Phase Peptide Synthesis. II J. Am. Chem. Soc. 1989. V. 111. P. 8024-8026.

92. A. M. Bray, N. J. Maejl, H. M. Geysen. The Simultaneous Multiple Production of Solution Phase Peptides; Assessment of the Geysen Method of Simultaneous Peptide Synthesis. // Tetrahedron Lett. 1990. V. 31. P. 5811-5814.

93. F. Rasoul, F. Ercole, Y. Pham, C. T. Bui, Z. Wu, S. N. James, R. W. Trainor, G. Wickham, N. J. Maeji. Grafted Supports in Solid-Phase Synthesis. II Biopolymers. 2000. V. 55. P. 207-216.

94. R. Li, X. Y. Xiao, W. Czarnik, R. B. Merrifield. Microtube™ Reactors for Solid Phase Synthesis. II Tetrahedron Lett. 1998. V. 39. P. 8581-8584.

95. A. R. Mitchell, S. B. Kent, B. W. Erickson, R. B. Merrifield. Preparation of Aminomethyl-polystyrene Resin by Direct Amidomethylation. // Tetrahedron Lett. 1976. V. 42. P. 3795-3798.

96. V. K. Sarin, S. B. Kent, J. P. Tam, R. B. Merrifield. Quantitative Monitoring of SolidPhase Peptide Synthesis by the Ninhydrin Reaction. II Anal. Biochem. 1981. V. 117. P. 147-157.

97. N. Hird, I. Hughes, D. Hunter, M. G. Morrison, D. C. Sherrington, L. Stevenson. Polymer Discs An Alternative Support Format for Solid Phase Synthesis. // Tetrahedron. 1999. V. 55. P. 9575-9584.

98. A. Papra, H. G. Hicke, D. Paul. Synthesis of Peptide onto the Surface of PoIy(Ethyleneterephthalate) Particle Track Membranes. // J. Appl. Polym. Sei. 1999. V. 74. P. 1669-1674.

99. V. I. Korol'kov, G. A. Platonova, V. V. Azanova, T. B. Tennikova, G. P. Vlasov. In situ Preparation of Peptidylated Polymers as Ready-to-use Adsorbents for Rapid Immunoaffinity Chromatography. II Lett. Pept. Sei. 2000. V. 7. P. 53-61.

100. K. Pflegerl, A. Podgornik, E. Berger, A. Jungbauer. Direct Synthesis of Peptides on Con-vective Interaction Media Monolithic Columns for Affinity Chromatography. // J. Comb. Chem. 2002. V. 4. P. 33-37.

101. K. Pflegerl, A. Podgornik, E. Berger, A. Jungbauer. Screening for Peptide Affinity Ligands on CIM Monoliths. // Biotech. Bioeng. 2002. V. 79. P. 733-740.

102. Z. Xu, Q. Liu, J. A. Finch. Silanation and Stability of 3-aminopropyl triethoxy silane on Nanosized Superparamagnetic Particles: 1. Direct Silanation. // Appl. Surf. Sei. 1997. V. 120. P. 269-278.

103. S. P. A. Fodor, J. L. Read, M. C. Pirrung, L. Stryer, A. T. Lu, D. Solas. Light-Directed, Spatially Addressable Parallel Chemical Synthesis. //Science. 1991. V. 251. P. 767-773.

104. M. Lebl. Solid-Phase Synthesis on Planar Supports. // Biopolymers. 1998. V. 47. P. 397404.

105. S. Moore, W. H. Stein. Photometric Ninhydrin Method for Use in the Chromatography of Amino Acids. II J. Biol. Chem. 1948. V. 176. P. 367-387.

106. E. Kaiser, R. L. Colescott, C. D. Bossinger, P. I. Cook. Color Test for Detection of Free Terminal Amino Groups in the Solid-phase Synthesis of Peptides. II Anal. Biochem. 1970. V. 34. P. 595-598.

107. V. K. Sarin, S. B. H. Kent, J. P. Tarn, R. B. Merrifield. Quantitative Monitoring of SolidPhase Synthesis by the Ninhydrin Reaction. II Anal. Biochem. 1981. V. 117. P. 147-157.

108. G. Losse, R. Ulbrich. Kontrolle des Umsatzgrades bei der Merrifield-Synthese. II Z. Chem. 1971. V. 11. P. 346-347.

109. V. Krchnak, J. Vagner, P. Safar, M. Lebl. Noninvasive Continuos Monitoring of Solidphase Peptide Synthsis by Acid-base Indicator. II Coll. Czechosl. Chem. Commun. 1988. V. 53. P. 2542-2548.

110. V. B. Ivanov, J. Behnish, A. Hollander, F. Mehdorn, H. Zimmermann. Determination of functional Groups on Polymer Surfaces Using Fluorescence Labelling. // Surf. Interface Analysis. 1996. V. 24. P. 257-262.

111. L. C. Dorman. A Non-destructive Method for the Determination of Completeness of Coupling Reactions in Solid Phase Peptide Synthesis. // Tetrahedron Lett. 1969. V. 10. P. 23192321.

112. B. F. Gisin. The monitoring of Reactions in Solid-phase Peptide Synthesis with Picric Acid. II Anal. Chem. Acta. 1972. V. 58. P. 248-249.

113. R. Hahn, A. Podgornik, M. Merhar, E. Schallaun, A. Jungbauer. Affinity Monoliths Generated by in situ Polymerization of the Ligand. // Anal. Chem. 2001. V. 73. P. 5126-5132.

114. Т. Devendrán. Das bahnbrechende Medikament t-PA. Der Lebensretter nach dem Herzinfarkt, Pharmazie. Bild der Wissenschaft. 1988. V. 3. P. 95-103.

115. А. В. Максименко. Тромбин: соотношение структура функция в биохимических взаимодействиях. // Биохимия. 1993. Т. 58. С. 1373-1382.

116. Э. В. Луговской, С. В. Комисаренко. Моноклональные антитела как инструмент исследования полимеризации фибрина. // Биоорг. Хим. 2000. Т. 26. С. 883-891.

117. А. В. Максименко. Активаторы плазминогена 3-го поколения. Новое направление изучения. // Биоорг. Хим. 1999. Т. 25. С. 563-571.

118. А. Б. Добровольский, Е. В. Титаева. Система фибринолиза: регуляция активности ифизиологические функции ее основных компонентов. // Биохимия. 2002. Т. 67. С. 116-126.

119. А. В. Максименко. Сочетанный тромболизис фармокинетическими активаторами плазминогена. // Биоорг. Хим. 1998. Т. 24. С. 376-380.

120. D. Collen. Fibrin-Selective Thrombolythic Therapy for Acute Myocardial Infraction. // Circulation. 1996. V. 93. P. 857-865.

121. А. В. Максименко. Молекулярные взаимодействия при фибринолизе. Поиск новых активаторов плазминогена. // Мол. Биол. 1995. Т. 29. С. 38-59.

122. K.-Ch. Young, G.-Yu. Shi, Yu.-F. Chang, B.-I. Chang, Li-Ch. Chang, M.-D. Lai, W.-J.

123. Chuang, H.-L. Wu. Interaction of Streptokinase and Plasminogen. // J. Biol. Chem. 1995. V. 270. P. 29601-29606.

124. X.-Ch. Wu, R. Ye, Ya. Duan, S.-L. Wong. Engineering of Plasmin-Resistant Forms of Streptokinase and Their Production in Bacillus subtilis: Streptokinase with Longer Functional Half-Life. // Apll. Environ. Microbiol. 1998. V. 64. P. 824-829.

125. S. A. Cederholm-Williams, F. De Cock, H. R. Lijnen, D. Collen. Kinetics of the Reaction between Streptokinase, Plasmin and alpha-2-antiplasmin. // Eur. J. Biochem. 1979. V. 100. P. 125-132.

126. Т. V. Hrynenko, le. M. Makohonenko, О. I. Yusova, S. A. Cederholm-Williams. Degradation of Streptokinase and the Catalytic Properties of the Plasmin-Streptokinase Complex. // Ukr. Biokhim. Zh. 2002. V. 74. P. 50-57.

127. G. E. Siefring, F. J. Castellino. Interaction of Streptokinase with Plasminogen. Isolation and Characterization of Streptokinase Degradation Products. // J. Biol. Chem. 1976. V. 251. P. 3913-3920.

128. P. Rodriguez, P. Fuentes, M. Barro, J. G. Alvarez, E. Muñoz, D. Collen, H. R. Lijnen. Structural Domains of Streptokinase involved in the Interaction with Plasminogen. // Appl. Environ. Microbiol. 1998. V. 64. P. 824-829.

129. D. Stump, M. Thienpont, D. Collen. Urokinase-realated Proteins in Human Urine. // J. Biol. Chem. 1986. V. 261. P. 1267-1273.

130. Y. Horiuchi, J. M. Marshall, S. A. Cederholm-Williams, T. J. Ryan. Secretion of Urokinase and Tissue-Plasminogen Activator by epidermal Cells in the Presence of Psoriatic Fi-broblast-Conditioned Medium. II Acta Derm. Venerol. 1992. V. 72. P. 401-402.

131. P. A. Andreasen, L. Kjoller, L. Christensen, M. J. Duffy. The Urokinase-type Plasminogen Activator System in Cancer Metastasis: a review. // Int. J. Cancer. 1997. V. 72. P. 1-22.

132. H. R. Lijnen, C. Zamarron, M. Blaber, M. E. Winkler, D. Collen. Activation of Plasminogen by Pro-urokinase: Mechanism. II J. Biol. Chem. 1986. V. 261. P. 1253-1258.

133. D. Collen, C. Zamarron, H. R. Lijnen, M. Hoylaerts. Activation of Plasminogen by Pro-urokinase: Kinetics. H J. Biol. Chem. 1986. V. 261. P. 1259-1266.

134. R. Pannell, V. Gurewich. Pro-urokinase: a Study of its Stability in Plasma and of a Mechanism for its Selective Fibrinolytic Effect. II J. Am. Soc. Hemat. 1986. V. 67. P. 1215-1223.

135. D. Stump, H. R. Lijnen D. Collen. Purification and Characterization of Single-chain Urokinase-type Plasminogen Activator from Human Cell Cultures. // J. Biol. Chem. 1986. V. 261. P. 1274-1278.

136. J. Loscalzo, T. P. Wharton, J. M. Kirshenbaum, H. J. Levine, J. T. Flaherty, E. J. Topol, K. Ramaswamy, B. D. Kosowsky, D. N. Salem, P. Ganz. Clot-selective Coronary Thrombolysis with Pro-urokinase. // Circulation. 1989. V. 79. P. 776-782.

137. L. Hansen, Y. Blue, K. Barone, D. Collen, G. R. Larsen. Functional Effects of Asparagine-linked Oligosacharide on Natural and Variant Human Tissue-type Plasminogen Activator. // J. Biol. Chem. 1988. V. 263. P. 15713-15719.

138. W. Asche. Gewinnung von t-pa aus E.coli. II BioEngineering. 1989. V. 6. P. 43-45.

139. M. Hoylaerts, D. C. Rijken, H. R. Lijnen, D. Collen. Kinetics of the Activation of Plasminogen by Human Tissue Plasminogen Activator. // J. Biol. Chem. 1982. V. 257. P. 29122919.

140. D. C. Rijken, M. Hoylaerts, D. Collen. Fibrinolytic Properties of One-chain and Two-chain Human Extrinsic (Tissue-type) Plasminogen Activator. II J. Biol. Chem. 1982. V. 257. P. 29202925.

141. G. Larsen, К. Henson, Y. Blue. Variants of Human Tissue-type Plasminogen Activator. // J. Biol. Chem. 1988. V. 263. P. 1023-1029.

142. A. Klausner. Researchers Probe Second-Generation t-PA. 11 Biotechnology. 1986. V. 4. P. 706-711.

143. V. Fleury, S. Loyau, H. R. Lijnen, W. Nieuwenhuizen, E. Angles-Cano. Molecular Assembly of Plasminogen and Tissue-type Plasminogen Activator on an Evolving Fibrin Surface. // Eur. J. Biochem. 1993. V. 216. P. 549-556.

144. E. Kaezmarek, M. H. Lee, J. McDonagh, Initial Interaction between Fibrin and Tissue Plasminogen Activator (t-PA). И J. Biol. Chem. 1993. V. 268. P. 2474-2479.

145. E. В. Парфенова, О. С. Плеханова, В. А. Ткачук. Система активаторов плазминогена в ремоделировании сосудов и ангиогенезе. // Биохимия. 2002. Т. 67. С. 139-156.

146. I. Y. Sazonova, А. К. Houng, S. A. Chowdhry, В. R. Robinson. The Mechanism of a Bacterial Plasminogen Activator Intermediate between Streptokinase and Staphylokinase. // J. Biol. Chem. 2001. V. 276. P. 12609-12613.

147. D. V. Sakharov, H. R. Lijnen, D. C. Rijken. Interactions between Staphylokinase, Plasminogen) and Fibrin. II J. Biol. Chem. 1996. V. 271. P. 27912-27918.

148. D. Collen, H. R. Lijnen. Staphylokinase, a Fibrin-specific Plasminogen Activator with Therapeutic Potential? // Blood. 1994. V. 84. P. 680-686.

149. F. Z. Li, X. Z. Li, H. Q. Zhang, B. C. Hu, W. Y. Yu, J. M. Fang, C. F. Huang. Expression of Pro-urokinase cDNA in Chinese Hamster Ovary Cell Line. // Chin. J. Biotechnol. 1991. V. 7. P.113-120.

150. D. Collen. Cloning and Expression of Human Tissue-type Plasminogen Activator cDNA in E. coli. II Nature. 1983. V. 301. P. 214-220.

151. С. Zhaolie, W. Benchuan, L. Hong, L. Shichong, H. Peitang. Study on rt-PA Production by Recombinant CHO-cells Immobilized with a Porous Microcarrier. // Chin. J. Biotechnol. 1999. V. 15. P. 239-244.

152. С. H. Fann, F. Guirgis, G. Chen, M. S. Lao, J. M. Piret. Limitations to the Amplification and Stability of Human Tissue-type Plasminogen Activator Expression by Chinese Hamster Ovary Cells. // Biotechnol Bioeng. 2000. V. 69. P. 204-212.

153. M. Einarson, J. Brandt, L. Kaplan. Large-scale Purification of Human Tissue Plasminogen Activator Using Monoclonal Antibodies. // Biochim. Biophys. Acta. 1985. V. 830. P. 1-10.

154. D. Lau, G. Kuzma, C.-M. Wei, D. J. Livingston, N. Hsiung. A modified Human tissue Plasminogen Activator With Extended Half-life in Vivo. // Biotechnology. 1987. V. 5. P. 953958.

155. G. A. Munk, M. P. Caspers, G. T. Chang, P. H. Pouwels, В. E. Enger-Valk, J. H. Verhei-jen. Binding of Tissue-tipe Plasminogen Activator to Lysine, Lysine Analogues and Fibrin Fragments. // Biochemistry. 1989. V. 28. P. 318-7325.

156. A. Petel, M. O'Hara, J. Callaway, D. Greene, J. Martin, A. Nishikawa. Affinity purification of tissue plasminogen activator using transition-state analogues. II J. Chromatogr. 1990. V. 510. P. 83-93.

157. B. J. Bergot, R. L. Noble, T. Geiser. Utility of Trifluoromethane Sulfonic Acid as a Cleavage Reagent in Solid Phase Peptide Synthesis. I I Applied Biosystems User Bulletin. 1986. P. 16.

158. К. Наканиси. Инфракрасные спектры и строение органических соединений. М.: Мир. 1965.

159. И. Дехант, Р. Данц, В. Киммер, Р. Шмольке. Инфракрасная спектроскопия полимеров. М.: Химия. 1976.

160. А. Ю. Билибин. Изучение синтеза пептидов с использованием Сефадексов в качестве полимерных носителей. Диссертация на соискание уч. степ, к.х.н. ИВС РАН. Ленинград. 1974.

161. U. Ragnarsson, S. Karlsson, В. Sandberg. Studies on the Coupling Step in Solid Phase Peptide Synthesis. Some Preliminary Results from Competition Experiments. // Acta Chem. Scand. 1971. V. 25. P. 1487-1489.

162. Е. В. Кудрявцева, М. В. Сидорова, А. С. Молокоедов, М. В. Овчинников, Ж. Д. Беспалова. Направленное и спонтанное замыкание дисульфидных связей с помощью перекиси водорода в синтезе эндотелионов-1 и -3. // Биоорг. Хим. 1999. Т. 25. С. 107-116.

163. Р. Досон, Д. Эллиот, У. Эллиот, К. Джонс. Справочник биохимика. М: Мир. 1991.