Структурно-функциональная организация аденилатциклазной сигнальной системы инфузорий Dileptus anser и Tetrahymena pyriformis тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Деркач, Кира Викторовна

• Деркач, Кира Викторовна
• кандидат биологических наук
• 2003

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Деркач, Кира Викторовна

Список принятых сокращений

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1. Гормончувствительная аденилатциклазная сигнальная система высших эукариот

1.1.1. Рецепторы, функционально сопряженные с аденилатциклазой

1.1.2. Гетеротримерные ГТФ-связывающие белки

1.1.3. Аденилатциклаза

1.1.4. цАМФ-зависимая протеинкиназа

1.2. Гормональные сигнальные системы низших эукариот

1.2.1. Обнаружение у низших эукариот гормонов, сходных

Ф с таковыми высших эукариот

1.2.2. Рецепторы 27 Рецепторы серпантинного типа.

Рецепторы, родственные рецепторам тирозинкиназного типа высших эукариот

1.2.3. в-белки 32 а-Субъединицы С-белков

3- и у-Субъединицы С-белков

1.2.4. Аденилатциклаза и гуанилатциклаза - ферменты-генераторы вторичных посредников

1.2.5. цАМФ-зависимая протеинкиназа 47 1.3. Заключение

ГЛАВА 2. МЕТОДИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ

2.1. Экспериментальные животные

2.2. Химические реактивы

2.3. Получение гомогенатов и грубых мембранных фракций клеточных культур инфузорий

2.4. Получение фракций плазматических мембран с использованием ультрацентрифугирования в градиенте сахарозы

2.4.1. Получение фракции сарколеммальных мембран гладких мышц ноги моллюска А поЛоШа cygnea

2.4.2. Получение фракций плазматических мембран сердца куриных эмбрионов

2.4.3. Получение фракций сарколеммальных мембран скелетных мышц крыс

2.4.4. Получение фракции плазматических мембран мембран стриатума мозга крысы

2.5. Определение активности 1У^2+-зависимой аденилатциклазы 56 2.5:1. Метод с использованием [а-32Р/А ТФ в качестве субстрата

2.5.2. Метод с использованием [№ЩАТФ в качестве субстрата

2.6. Определение активности цАМФ-зависимой протеинкиназы

2.7. Определение связывающих мест с помощью меченого 13Н]-дигидроальпренолола

2.8. Определение ГТФ-связывающей активности в-белков

2.9. Определение ростовой активности инфузорий

2.10. Проведение экотоксикологических опытов с моллюсками

2.11. Определение белка по методу Лоури

2.12. Статистическая обработка полученных результатов

2.13. Теоретические исследования первичной структуры белков

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Описание объектов исследования и обоснование их выбора

3.2. Обнаружение и функциональная характеристика активности аденилатциклазы в гомогенатах инфузорий

3.2.1. Dileptus unser

3.2.2. Tetrahymena pyriformis

3.2.3. Сравнительная характеристика функциональной активности АЦ в тканях высших эу кар йот

3.3. Регуляция функциональной активности аденилатциклазы в гомогенатах клеточных культур инфузорий биогенными аминами ^ в сравнении с таковой в тканях высших эукариот

3.3.1. Dileptus ans er

3.3.2. Tetrahymena pyriformis

3.3.3. Сравнительное исследование чувствительности к биогенным аминам активности ЛЦ во фракциях плазматических мембран тканей моллюска и крысы

3.4. Идентификация и характеристика адренергических рецепторов в клеточных культурах инфузорий, а также регуляторного влияния биогенных аминов на ГТФ-связывающую активность G-белков f 3.4.1. Выявление и характеристика адренергических рецепторов в клеточных культурах инфузорий

3.4.2. Исследование влияния антагонистов адренергических рецепторов на активность АЦ с целью функциональной характеристики адренергических рецепторов в клетках инфузорий

3.4.3. Регуляция серотонином и адренергическими агонистами ГТФ-связывающей активности гетеротримерных G-белков в клетках инфузорий.

3.5. Регуляция функциональной активности АЦ инфузорий глюкагоном в сравнении с таковой в сердце куриных эмбрионов

3.5. /. Dileptus anser

3.5.2. Tetrahymena pyriformis

3.5.3. Регуляция активности АЦ во фракции плазматических мембран куриных эмбрионов глюкагоном в сравнении с таковой Tetrahymena pyriformis

3.6. Обнаружение активности цАМФ-зависимой протеинкиназы в гомогенатах инфузорий и ее регуляция гормонами в сравнении с таковой высших эукариот

3.6. 1. Dileptus unser и Tetrahymena pyriformis 3.6.2. Высшие эукариоты

3.7. Влияние двухвалентных катионов тяжелых металлов на функциональную активность АЦ инфузорий и моллюсков

3.7.1. Dileptus unser

3.7.2. Tetruhymenu pyriformis

3.7.3. Влияние китионов тяжелых металлов на функциональную активность аденилатциклазной сигнальной системы высших эукариот

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ 102 ВЫВОДЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Структурно-функциональная организация аденилатциклазной сигнальной системы инфузорий Dileptus anser и Tetrahymena pyriformis»

Актуальность проблемы.

Одной из актуальных задач современной молекулярной эндокринологии является сравнительное исследование структурно-функциональной организации гормональных сигнальных систем у животных различного филогенетического уровня. Решение этой задачи позволит выявить основные закономерности эволюции эндокринных систем и механизмов их действия в филогенезе и на этой основе разработать новые подходы для регуляции функциональной активности компонентов сигнальных систем, что имеет первостепенное значение для практической медицины.

В настоящее время молекулярные механизмы функционирования гормональных сигнальных систем высших эукариот и, в первую очередь, высших позвоночных животных хорошо изучены. В то же время информация о гормональных сигнальных системах одноклеточных организмов (низших эукариот) крайне 'Скудна и противоречива. Отсутствие понимания того, каким образом функционируют сигнальные системы у низших эукариот, не позволяет проследить пути эволюции эндокринной системы на ранних этапах развития многоклеточных организмов и выявить ключевые этапы формирования гормонокомпетентности эукариотической клетки.

Одной из наиболее важных и широко распространенных сигнальных систем, опосредующих регуляторное действие различных по своей химической природе гормонов, является аденилатциклазная сигнальная система (АЦС), включающая три основных компонента, ассоциированных с плазматической мембраной клетки. Первый из них представляет собой рецептор серпантинного типа, семь раз г пронизывающий плазматическую мембрану, который специфически опознает сигнальную молекулу (гормон). Вторым, сопрягающим, компонентом является гетеротримерный ГТФ-связывающий белок (в-белок) стимулирующего или ингибирующего типа, передающий сигнал на третий, каталитический, компонент АЦС - фермент аденилатциклазу (АЦ). В свою очередь, АЦ, осуществляя синтез вторичного посредника цАМФ, регулирует, таким образом, функциональную активность эффекторного белка - фермента цАМФ-зависимой протеинкинзы (ПКА).

К настоящему времени значительный прогресс достигнут в изучении структурно-функциональной организации АЦС, а также молекулярных механизмов функционального сопряжения компонентов этой системы у высших позвоночных и. в меньшей степени, многоклеточных беспозвоночных животных. Так, показано, каким образом осуществляется функциональное сопряжение между сигнальными белками - компонентами АЦС, как регулируется функциональная активность этих белков. .Клонированы гены, кодирующие белки - компоненты АЦС, известны аминокислотные последовательности (АКП) этих белков, что позволяет выявить в их молекулах функционально активные сайты, определить пространственную структуру доменов, ответственных за их функциональную активность, создать модели белок-белковых комплексов, которые определяют процесс векторной передачи сигнала с активированного лигандом рецептора на эффекторные звенья АЦС.

Большой вклад в изучение молекулярных механизмов функционирования гормоночувствительной АЦС у позвоночных и беспозвоночных животных внесли и исследования, проводимые в лаборатории молекулярной эндокринологии Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН. Эти исследования, начатые еще в конце 70-х годов и обобщенные в монографии М.Н. Перцевой (1989), направлены на сравнительное изучение АЦС животных различного филогенетического уровня и имеют своей целью выяснение путей эволюции этой системы. На основе обобщения полученных в лаборатории экспериментальных данных и сведений литературы, а также их всестороннего анализа и выявления ряда закономерностей в эволюции АЦС Перцевой М.Н. была выдвинута гипотеза о формировании гормональных сигнальных систем на самом раннем этапе развития эукариотической клетки - на уровне одноклеточных организмов (Реггзеуа е1 а1., 1991). Подтверждение этой гипотезы, в значительной мере меняющей существующие представления в современной молекулярной эндокринологии и эволюционной биохимии, стало основной целью предпринятой нами работы.

Детальный анализ современного состояния проблемы структурно-функциональной организации сигнальных систем низших эукариот указывает на то, что роль АЦС в реализации регуляторного влияния гормонов и сигналов негормональной природы в клетках низших эукариот до сих пор практически не исследована (Шпаков и др., 2003а). В то же время в последние годы в геноме ряда представителей низших эукариот обнаружены гены, кодирующие белки -компоненты АЦС. В клетках инфузории Те(гаИутепа ругфэгти выявлены гормоны, характерные для высших эукариот, которые способны регулировать пищевое поведение инфузорий и метаболизм. Эти данные позволяют предположить наличие функционально активной АЦС у таких сравнительно примитивных организмов, как низшие эукариоты.

Цель и задачи исследования.

Цель работы состояла в обнаружении и структурно-функциональной характеристике гормоночувствительной АЦС в клетках представителей низших эукариот - инфузорий ВИерШя атег и Те1гаЪутепа руп/огтм. Молекулярные механизмы функционирования АЦС инфузорий изучали в сравнении с таковой представителей позвоночных и беспозвоночных животных (высших эукариот), используя эволюционный подход.

Основные задачи работы состояли в следующем:

1. Функционально охарактеризовать АЦС инфузорий О.атег и Т.руг{]огт1.ч с использованием веществ негормональной природы в сравнении с АЦС беспозвоночных (моллюск Апорта cygnea) и позвоночных животных (крыса, куриные эмбрионы).

2. Исследовать чувствительность АЦС инфузорий к пептидному гормону высших эукариот глюкагону и биогенным аминам, выявить черты сходства и различия в их регуляторном действии на АЦС инфузорий и высших эукариот.

3. Исследовать включение рецепторов и гетеротримерных О-белков в процесс передачи гормонального сигнала через АЦС инфузорий.

4. Выявить активность цАМФ-зависимой протеинкиназы в клетках инфузорий и изучить ее регуляцию веществами гормональной природы.

5. В аспекте практического применения полученных данных, исследовать чувствительность АЦС инфузорий к действию таких неблагоприятных факторов внешней среды, как катионы тяжелых металлов, и разработать на этой основе экотоксикологический тест.

Положения выносимые на защиту.

1. В клеточных культурах инфузорий D.unser и T.pyriformis присутствует аденилатциклазная сигнальная система, функциональная активность которой регулируется как агентами негормональной природы (фторид натрия, катионы марганца, гуаниновые нуклеотиды, форсколин), так и гормонами: биогенными аминами и пептидным гормоном высших эукариот - глюкагоном.

2. Чувствительность аденилатциклазной сигнальной системы к негормональным и гормональным воздействиям зависит от уровня базальной активности аденилатциклазы в клеточных культурах инфузорий.

3. В мембранной фракции обеих инфузорий присутствуют, рецепторы, специфически связывающиеся с адренергическими лигандами и функционально сопряженные с гетеротримерными G-белками.

4. Эффекторным звеном АЦС инфузорий, также как и в случае высших эукариот. является фермент цАМФ-зависимая протеинкиназа.

5. АЦС инфузорий D.anser и T.pyriformis может служить тест-объектом для оценки степени загрязнения водных бассейнов катионами тяжелых металлов.

Основные результаты, научная новизна работы.

В клеточных культурах представителей одноклеточных организмов инфузорий D.anser и T.pyriformis впервые выявлена и охарактеризована АЦС. Показано, что фактором, определяющим уровень базальной активности АЦ T.pyriformis, является доля делящихся инфузорий (стадия развития культуры). Обнаружено, что АЦ инфузорий стимулируется такими активаторами фермента, как Mn2+, NaF, гуаниновые нуклеотиды (ГН), форсколин, причем величина их стимулирующего эффекта определяется уровнем базальной активности фермента.

Впервые показано, что гормоны высших эукариот 'глкжагон и серотонин (у D.anser также адреналин и изопротеренол), действующие через рецепторы серпантинного типа, способны стимулировать активность АЦ в культурах D.anser и T.pyriformis. Свое максимальное стимулирующее влияние на активность АЦ эти гормоны оказывают в концентрациях, которые наиболее эффективны в тканях высших эукариот. Выявлено также ингибирование адреналином АЦС T.pyriformis.

Величина и направленность гормонального эффекта определяются уровнем базальной активности АЦ: чем она выше, тем менее;' выражена гормональная стимуляция и тем в большей степени проявляется ингибирующее влияние гормонов. Действие гормонов частично или полностью снимается антагонистами серотониновых и Р-адренергических рецепторов (р-АР). В клетках инфузорий впервые охарактеризованы рецепторы, специфично связывающие р-АР лиганды и сходные по ряду своих показателей с Р-АР высших эукариот. Показано, что биогенные амины стимулируют ГТФ-связывающую активность G-белков, что указывает на их участие в процессе передачи гормонального сигнала. В клеточных культурах D.anser и T.pyriformis впервые обнаружена активность ПКА и исследована ее регуляция гормонами. Действие гормонов на активность ПКА и АЦ было однонаправленным, что указывает на функциональную связь между этими ферментами подобно тому, как это наблюдается у высших эукариот. Таким образом, доказано, что в клетках инфузорий присутствует функционально активная гормоночувствительная АЦС, обладающая чертами сходства с таковой высших эукариот.

Показано, что катионы тяжелых металлов (КТМ) нарушают функционирование АЦС инфузорий в условиях in vitro и снижают их выживаемость в условиях in vivo. г3ти данные указывает на возможность использования АЦС D.anser и T.pyriformis в качестве высокочувствительного экотоксикологического тест-объекта для оценки состояния водных бассейнов.

Теоретическое и практическое значение работы.

Обнаружение гормональной регуляции АЦС инфузорий, как представителей низших эукариот, является очень важным для понимания эволюции гормоно^увствительных сигнальных систем эукариот в целом и формирования молекулярных механизмов функционирования цАМФ-зависимых сигнальных путей в частности. Полученные данные дают материал для дальнейших исследований регуляторной роли гормонов высших эукариот как у инфузорий, так и у других представителей низших эукариот (дрожжевых грибов, трипаносом и др.). Разработанная стратегия изучения АЦС инфузорий может быть использована для исследования регуляции гормональными и негормональными агентами жизненно важных функций паразитических форм одноклеточных, возбудителей многих заболеваний человека. Изучение чувствительности АЦС инфузорий к воздействию КТМ позволяет разработать новый экотоксикологический тест для мониторинга водных экосистем. В перспективе этот тест можно использовать для тестирования и других вредных химических веществ.

Апробация работы.

Обсуждение работы проходило на заседании секции молекулярных основ эволюции функций ИЭФиБ им.И.М.Сеченова РАН. Результаты работы были доложены на SEB Annual Meeting, Lancaster, England (1996), 22th Conference of

European comparative endocrinologists, Bonn, Germany (2002), FEBS Meeting on Signal transduction, Brussels, Belgium (2003), XI Всероссийском симпозиуме «Мембранный транспорт и функции клетки» (1994), Конференции молодых физиологов и биохимиков России «Биохимические и биофизические механизмы физиологических i функций» (1995), Международной конференции «Инфузории в биотестировании» (1997) и на научных семинарах Лаборатории молекулярной эндокринологии ИЭФБ им. И.М. Сеченова РАН.

Публикации. По материалам диссертации опубликована 21 работа, в том числе 11 статей в рецензируемых журналах.

Объем, структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методического раздела, результатов исследования и их обсуждения, выводов. Работа изложена на 133 страницах, включает 19 рисунков и 9 таблиц, список литературы составляет 167 источников.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Деркач, Кира Викторовна

ВЫВОДЫ

1. Впервые выявлена и охарактеризована аденилатциклазная сигнальная система (АЦС) в клеточных культурах представителей низших :>укариот - инфузорий Dileptas unser и Telrahymena pyriformis. Исследование культур T.pyriformis с различной плотностью клеток и различного возраста показало, что фактором, определяющим уровень базальной активности АЦ, является стадия развития культуры. Показано, что АЦ инфузорий, как и АЦ высших эукариот, стимулируется такими активаторами фермента, как катионы марганца, NaF, гуаниновые нуклеотиды, форсколин, причем величина их стимулирующего эффекта определяется уровнем базальной активности фермента.

2. Показано, что глюкагон и биогенные амины, действующие через рецепторы серпантинного типа, могут регулировать активность АЦ в культурах инфузорий. Величина и направленность их эффекта определяются уровнем базальной активности фермента. Специфичность действия биогенных аминов на АЦ доказывается блокированием эффектов гормонов антагонистами адренергических и серотониновых рецепторов.

3. В клеточных культурах инфузорий выявлены адренергические рецепторы, специфично связывающиеся с ß-адренергическими лигандами с аффинностью более низкой в сравнении с рецепторами высших эукариот. Показано, что ГТФсвязывающая активность гетерогримерных G-белков увеличивается под действием биогенных аминов. Полученные данные указывают на присутствие в клетках i инфузорий функционально активной гормоночувствительной АЦС, включающей адренергические рецепторы, гетеротримсрные G-белки и фермент АЦ.

4. В клеточных культурах D.anser и T.pyriformis впервые обнаружена активность протеинкиназы А (ПКА) и исследована ее регуляция гормонами. Действие гормонов на активность Г1КА и АЦ является однонаправленным, что указывает па функциональную связь между ними, как это наблюдается у высших эукариот.

5. Показано, что катионы тяжелых металлов нарушают функционирование АЦС инфузорий in vitro и снижают их выживаемость в условиях in vivo. Это указывает на возможность использования АЦС D.anser и T.pyriformis в качестве высокочувствительного экотоксикологического тест-объекта для оценки состояния водных бассейнов.

1.3. Заключение.

Суммируя представленные выше данные, можно прийти к заключению о том, что на уровне низших эукариот возникают и окончательно формируются многокомпонентные сигнальные системы, опосредующие регуляторное действие на клетку гормонов и нейромедиаторов различной химической природы. При этом разнообразие сигнальных систем и включенных в эти системы сигнальных блоков не уступает таковому, характерному для высших эукариот, а в ряде случаев даже превосходит его. Это в первую очередь справедливо для АЦС и ГЦС - сигнальных систем, включающих мембранносвязанные формы ферментов-циклаз - АЦ и ГЦ.

АЦ низших эукариот могут выполнять функции либо рецептора и эффектора одновременно (рецепторные формы), либо только эффектора (нерецепторные формы). Рецепторные формы АЦ представлены несколькими типами белков, общей чертой которых является способность один или два раза пронизывать плазматическую мембрану. Нерецепторные формы пронизывают мембрану 12 раз и сходны по своим структурно-функциональным характеристикам с мембранносвязанными формами АЦ позвоночных животных. У низших эукариот (.D. discoideum) также обнаружены молекулы мембранносвязанных форм АЦ, которые обращены своим циклазным доменом вовне клетки и синтезируют внеклеточный цАМФ. У позвоночных остались только те из перечисленных форм АЦ, которые 12 раз пронизывают мембрану (Hurley, 1999). Из двух линий мембранносвязанных форм ГЦ, присутствующих у низших эукариот, представители первой из которых один раз пронизывают мембрану, а представители второй имеют 12 трансмембранных доменов, у позвоночных сохранилась только линия ГЦ, пронизывающих мембрану один раз. Уже на уровне низших эукариот произошел отбор растворимых (цитозольных) форм АЦ и ГЦ, лишенных трансмембранных доменов. Цитозольные формы циклаз, широко представленные у прокариот, обнаружены у позвоночных животных, но отсутствуют у растений и некоторых типов беспозвоночных (насекомые, плоские черви). В отношении низших эукариот ситуация противоречивая. Растворимые АЦ и ГЦ обнаружены у амебы D. discoideum, но не выявлены у дрожжевых грибов (Roelofs et al., 2001а).

У низших эукариот в полной мере представлены такие ключевые блоки гормональных систем высших эукариот, как рецепторы серпантинного типа и сфу-гетеротримерные О-белки. Рецепторы низших эукариот эволюционировали от бактериальных родопсинов. а-Субьединицы О-белков, в свою очередь, произошли от малых О-белков и ГТФ-связывающих факторов элонгации прокариот, в то время как р-субъединицы, вероятно, берут свое начало от \VD-coдержащих белков бактерий (НлэЬе^иез а1., 2001). Следует однако отметить, что у дрожжевых а-, Р- и у-субъединиц О-белков имеются характерные особенности, отличающие их от таковых высших эукариот (при достаточно высоком общем уровне гомологии первичных структур). Такие отличия в основном выражаются в присутствии в их молекулах дополнительных участков АКП, функции которых пока не выяснены. Можно предположить, что эти участки являются адапторными и необходимы для более эффективного связывания субъединиц как между собой, так и с другими сигнальными белками. На это указывают возможность формирования этими участками спираль-спиральных структур и регулярность их АКП. В дальнейшем надобность в таких участках могла отпасть вследствие приобретения О-белками высших эукариот специальных приспособлений, позволяющих им более эффективно образовывать межмолекулярные комплексы. Среди таких приспособлений оптимизация пространственной структуры Ы-концевых спиралей в субъединицах О-белков, а также обретение ими способности заякориваться в мембране вследствие модификации различными по своей природе гидрофобными радикалами. Важно подчеркнуть, что эволюция сигнальных молекул шла согласованно, поскольку участки-вставки с регулярной структурой обнаруживаются не только в субъединицах О-белков, но также и в рецепторах серпантинного типа низших эукариот (рецепторы цАМФ Д (Л\$со1с1еит) и эффекторных белках (молекулы АЦ и ГЦ). Например, молекула АЦ (СУШ) 5.сегеушае имеет АКП 674-1300, сплошь состоящую из повторов, обогащенных остатками лейцина. В процессе эволюции молекул рецепторов и эффекторов эти участки-вставки в большинстве случаев исчезают из их первичной структуры.

Несмотря на достигнутые в последние годы успехи в исследовании сигнальных систем низших эукариот, позволяющие говорить об основных путях их эволюции, в этой области биохимии и молекулярной биологии остается еще много невыясненных вопросов и проблем. Так остается неизученным механизм возникновения мембранносвязанных форм АЦ и ГЦ из их цитозольных форм, а также дальнейшая судьба тех из указанных форм ферментов, которые отсутствуют у позвоночных животных. До сих пор нет единого мнения в отношении формирования гетеротримерных й-белков, которые на уровне низших эукариот предстают уже практически в сформированном виде (даже у сравнительно примитивных дрожжевых грибов). Требует дальнейшего анализа такая важнейшая проблема, как функциональное значение гормонов и гормоноподобных веществ у одноклеточных организмов. Однако имеющиеся данные позволяют высказать предположение о том, что именно на уровне низших эукариот из множества вариантов сигнальных систем в результате естественного отбора были отобраны те функциональные блоки, которые послужили необходимым материалом для построения более совершенных сигнальных систем высших животных.

Основываясь на результатах проведенного нами анализа данных литературы, касающихся сигнальных систем низших эукариот, мы предприняли экспериментальное исследование с целью подтвердить присутствие функционально активной АЦС, чувствительной к гормональным стимулам, в клетках представителей низших эукариот - инфузорий Т.руп/огт1$ и Б.атег, а также сравнить молекулярные механизмы функционирования АЦС инфузорий с таковыми АЦС высших эукариот. Актуальность этой задачи во многом объясняется еще и тем, что мы не располагаем какой-либо генетической информацией о присутствии компонентов АЦС у инфузорий. Это связано с очень плохой изученностью генома инфузорий в отличие, например, от таких организмов, как дрожжи 8.сегеу1и1ае и 5\pombe, амеба 0.сИ$со1с1еит, геномы которых расшифрованы практически полностью. Кроме того, ранее не проводилось направленных исследований по выявлению каких-либо компонентов АЦС у инфузорий, как это было сделанд в случае трипаносом в отношении различных форм АЦ. Возникает противоречие. С одной стороны, получено много доказательств в пользу участия гормонов в регуляции широкого спектра жизненно важных процессов у инфузорий (достаточно вспомнить работы группы Чабы). С другой стороны, во-первых, полностью отсутствует какая-либо молекулярно-биологическая информация в отношении сигнальных белков, через посредство которых может реализовываться регуляторное влияние этих гормонов на клетки инфузорий, и, во-вторых, практически нет данных по структурно-функциональной организации этих белков и молекулярным механизмам их действия. В настоящей работе предпринята попытка, используя методы молекулярной эндокринологии и биохимии, в определенной степени восполнить этот пробел, по крайней мере, во второй его части.

ГЛАВА 2. МЕТОДИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ

2.1, Экспериментальные животные

В опытах использовали следующих животных:

1. Инфузорий Tetrahymena pyriformis, условия культивирования которых приведены в статье (Ирлина, Меркулова, 1975). Безбактериальные культуры клеток инфузории Т.pyriformis получали из Института цитологии РАН. Культуры имели различную плотность клеток (от 25000 до 300000 клеток/мл) и возраст.(14, 24 и 42 ч).

2. Инфузорий Dilepîus anser, которых культивировали в солевой среде Prescott при 25°С (в качестве корма использовали инфузорий T.pyriformis). Культуры клеток инфузории D. anser получали из Института цитологии РАН.

3. Пресноводных двустворчатых моллюсков анодонт (Anodonta cygnea), которых собирали в мае-сентябре в водоемах Ленинградской области и содержали в хорошо аэрируемых ваннах при температуре 6-15 °С, без специального кормления.

4. Пресноводных брюхоногих моллюсков катушек (Corelus corneus) и живородок (Viviparus contectus), которых, так же как и анодонт, собирали в водоемах Ленинградской области и содержали в хорошо аэрируемых ваннах.

5. 11- и 16-ти-дневных эмбрионов кур породы Леггорн кросс-288.

6. Белых самцов крыс Ratlus norvegicus линии Wis tar весом 100-150 г, которых содержали в виварии на стандартном рационе.

2.2. Химические реактивы

Для опытов использовали следующие реактивы: динатриевую соль креатинфосфата, креатинфосфокиназу из мышц кролика (НФ 2.7.3.2), 5'-гуанилилимидодифосфата натриевую соль (Gpp[NH]p). имидазол. форсколин, дитиотреитол, гистон 2В, АТФ, цАМФ, ГТФ, Tris-OH, HEPES-Na, Lubrol-PX, ЭДТА, сурамин, бычий сывороточный альбумин (Sigma, США). В экспериментах использовали следующие гормоны и антагонисты: серотонин, (-)-изопротеренол, адреналин, глюкагон (Serva, Германия), ципрогептадин, атенолол, йохимбин. пропранолол, идазоксан (Sigma, США). Для колоночной хроматографии использовали нейтральную окись алюминия II по Брокману (Reanal, Венгрия), для фильтрования - фильтры GF/B (для рецепторного связывания) и нитроцеллюлозные фильтры тип НА, 0.45 мкм (Millipore, США) (для ГТФ-связывания).

Для радиоизотопных экспериментов использовали: [у-32Р]АТФ (4 Ки/мМ) (для определения активности ПКА), [а-32Р]АТФ (4 Ки/мМ) и [8-3Н]АТФ (Ки/мМ) (для определения активности АЦ) производства фирмы "Изотоп" (Санкт-Петербург, Россия). р,у-имидо[8-3Н]-гуанозин-5'-трифосфата аммонийную соль ([8-3H]Gpp|NHJp) (5 Ки/мМ) (для ГТФ-связывания) и [пропил-2,3-3Н]-дигидроальпренолол (30 Ки/мМ) (для рецепторного связывания) производства фирмы Amersham (Англия). Перед экспериментами радиоактивные препараты проверяли на наличие радиохимических примесей методами ТСХ в двух системах растворителей и колоночной хроматографии, которые должны были составлять не более 2 % от общей активности препарата.

2.3. Получение гомогенатов и грубых мембранных фракций клеточных культур инфузорий

Гомогенаты клеток D.anser получали из массовой культуры одного клона инфузорий объемом до 3-4 л. Плотность культуры составляла 140-150 кл/мл. Клетки осаждали центрифугированием (600 g в течение 3 мин) и трижды отмывали 20 мМ Tris-HCl-буфером (рН 7.5). Гомогенат получали растиранием клеток в ручном гомогенизаторе с тефлоновым пестиком (60-70 ударов). Количество разрушенных клеток составляло не менее 95% от их общего количества.

Гомогенат клеток инфузории T.pyriformis получали следующим образом. Сначала'клетки инфузорий осаждали центрифугированием (600 g в течение 3 мин), после чего их трижды отмывали 20 мМ Tris-HCl-буфером (рН 7.5). Гомогенизирование проводили путем обработки клеток ультразвуком на приборе

УЗДН-2Т при частоте 20 кГц в течение 1 мин при охлаждении. Количество разрушенных клеток составляло не менее 95% от их общего количества.

Для получения грубой мембранной фракции супернатант, полученный после центрифугирования гомогената клеточной культуры инфузорий (600 g в течение 3 мин), центрифугировали (15000 g в течение 15 мйн), полученный осадок ресуспендировали в 10 мМ НЕРЕБ-Ка буфере, рН 7.5, содержащем 5 мМ М§С12, и переосаждали в том же режиме.

2.4. Получение фракций плазматических мембран с использованием ультрацентрифугирования в градиенте сахарозы

2.4.1. Получение фракции сарколеммальных мембран гладких мышц ноги моллюска АпойоМа суцпеа

Гладкие мышцы ноги анодонт промывали в дистиллированной воде и измельчали ножницами на льду до кашеобразного состояния, после чего гомогенизировали, используя ручной гомогенизатор Политрон (30 сек, 3-4 раза) при соотношении 1:10 объемов ткани и буфера А (10 шМ Тт-НС1, рН 7.5, 5 мМ 1^С12, 0.25 М сахарозы). Для получения одной фракции брали по 25-35 моллюсков. Разливали образовавшийся гомогенат в пластиковые пробирки для ультрацентрифугирования и подслаивали 0.8 М сахарозу. Центрифугировали на ультрацентрифуге Вескшап (ротор SW-27) - 110000 g, 60 мин. После окончания центрифугирования фракция ПМ, расположенная на границе градиента сахарозы (0.25-0.8 М), была собрана и разведена в 3-4 раза ТпБ-НСГбуфером (А) без сахарозы. Осаждение мембран осуществляли на ультрацентрифуге Весктап (ротор 8^/-27) -110000 75 мин. Супернатант отбрасывали, а мембраны промывали повторно свободным от сахарозы буфером А. Затем мембраны ресуспендировали в сходном буфере, определяли белок и использовали для экспериментов (К1с1\уа1, 1973).

2.4.2. Получение фракций плазматических мембран сердца куриных эмбрионов

Желудочки сердца 11- или 16-ти-дневных куриных эмбрионов тщательно измельчали ножницами и затем смешивали с буфером А (10 шМ имидазол-HCl, pH 7.5, 5 мМ MgCl2, 0.25 М сахарозы) в соотношении 1:5 - 1:10. Для получения одной фракции брали желудочки сердца от 80-100 эмбрионов. В опыте использовали материал, который был расположен на границе 0.25 и 0.8 М сахарозы после ультрацентрифугирования (100000 g, 60 мин). Фракцию отмывали от сахарозы с помощью повторного центрифугирования в указанном режиме в 10 мМ имидазол-HCl буфере (pH 7.5) и использовали для опыта в тот же день.

2.43. Получение фракций сарколеммальных мембран скелетных мышц крыс

Скелетные мышцы ноги крыс тщательно измельчали ножницами и затем смешивали с буфером А (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 5 мМ MgCl2, 0.25 М сахарозы) в соотношении 1:5 - 1:10. Для получения одной фракции брали 4-6 крыс. Гомогенизировали, используя ручной гомогенизатор Политрон - 30 сек, 4-5 раз. Все дальнейшие операции проводили так же, как описано в пункте 2.4.1.

2.4.4. Получение фракции синаптосомальных мембран стриатума мозга крысы

Выделение фракции синаптосом из стриатума мозга крысы проводили по методу Hajos (1975). Отделяли правое и левое полушария, измельчали ткань ножницами, гомогенизировали на холоду в 40 mM Tris-HCl, pH 7.4, содержащем

0.32М сахарозу (соотношение ткани и буфера 1:10). Гомогенат центрифугировали при 1000g (1500 об/мин на К-23) в течение 10 мин, после чего осадок f ресуспендировали в том же буфере и повторно центрифугировали в том же режиме. Объединенный супернатант центрифугировали при 20000g (12500 об/мин на К-24) в течение 20 мин. Полученный осадок ресуспендировали примерно в 10 мл того же буфера, после чего проводили ультрацентрифугирование в градиенте концентраций сахарозы на ультрацентрифуге Beckman (ротор SW-27) - 110000 g, 60 мин. После окончания ультрацентрифугирования фракцию синаптосом, расположенную на границе градиента сахарозы 0.8-1.2 М, собирали, дважды промывали ее 40 mM Tris-НС1, pH 7.4 (без сахарозы), каждый раз осаждая синаптобомы центрифугированием при 20000g (12500 об/мин на К-24) в течение 20 мин. Промытый осадок фракции синаптосом стриатума мозга крысы ресуспендировали в том же буфере (40 шМ Tris-НС1, pH 7.4) и использовали для экспериментов.

2.5. Определение активности Mg2+-3aBHCHMoif аденилатциклазы

2.5.1. Метод с использованием [а-32Р]АТФ в качестве субстрата

Определение активности магний-зависимой АЦ (АТФ-пирофосфатлиаза циклизующая, НФ 4.6.1.1) проводили при 30 °С (инфузории, моллюски) или 37 °С (крысы, куриные эмбрионы) и времени инкубации 10 мин по модифицированному методу Соломона и соавт. (Salomon et al., 1974) в инкубационной среде следующего состава: 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.1 мМ АТФ, 1 мМ цАМФ, 20 мМ креатинфосфата, 0.2-0.5 мг/мл креатинфосфокиназы, 5 мМ MgCl2, [а-32Р]АТФ добавляли из расчета 12 мкКи на пробу. Общий объем пробы составлял 50 или 100 мкл. Реакцию начинали добавлением белка (15-50 мкг), а останавливали внесением в пробу 200 мкл 0.5 N HCl, после чего образцы помещали на 7 минут в кипящую водяную баню, а затем в каждую пробу вносили по 200 мкл 1.5 М имидазола и наносили образцы на колонку с окисью алюминия. Образовавшийся в ходе ферментативной реакции цАМФ элюировали с помощью 8 мл 10 мМ имидазол-HCl буфера, pH 7.4, в соответствии с методом White (1974). Элюат помещали в сцинтилляционные флаконы и в них измеряли радиоактивность по методу Черенкова на счетчике Rackbeta (LKB, Швеция). Активность АЦ выражали в пмоль цАМФ за 1 мин на 1 мг белка.

2.5.2. Метод с использованием [8-3Н]АТФ в качестве субстрата

Реакционная смесь (конечный объем 100 мкл) содержала 50 мМ Tris-HCl, pH 7.5, 5 мМ MgCl2, 1 мМ ЭДТА, 100 мкМ АТФ, 1 мМ цАМФ, 20 мМ креатинфосфата, 0.2 мг/мл креатинфосфокиназы, 0.5-1 мкКи [8-3Н]АТФ (по Ткачук, Балденков, 1978). Реакцию начинали добавлением в пробу 30-40 мг белка и инкубировали при 30 °С (инфузории, моллюски) или 37 °С (крысы, куриные эмбрионы) в течение 10 минут. Реакцию образования цАМФ останавливали добавлением смеси 50 мкл этанола и 100 мкл хлороформа. Денатурированный белок осаждали центрифугированием (4000 об/мин, 10 мин). Аликвоту супернатанта (10 или 20 мкл) наносили на ТСХ пластину с силикагелевым покрытием - Silufol-254 (Reanal,Венгрия). Для разделения цАМФ и других нуклеотидов использовали ТСХ. Пятна, соответствующие цАМФ, вырезали и помещали в виалы со сцинтилляционной смесью, содержащей 0.4 % 2.5-дифенилоксазола и 0.02 % 1-4бис2-5-фенилоксазолилбензола. Радиоактивность измеряли на счетчике Rackbeta (LKB, Швеция). Активность АЦ выражали в пмоль цАМФ за 1 мин на 1 мг белка.

2.6. Определение активности цАМФ-зависимой протеинкиназы

Определение активности цАМФ-зависимой протеинкиназы (КФ 2.7.1.37) проводили по модифицированному методу (Gill, Walton, 1979). Для исследования активности ПКА использовали гомогенаты клеточных культур инфузорий, а также гомогенаты мышц моллюска и крысы, для получения, которых брали по 8-10 моллюсков и 4-5 крыс соответственно. Стандартная реакционная смесь содержала (конечные концентрации): 30 мМ калий-фосфатный буфер, pH 6.8, 2 мМ дитиотреитол, 10 мМ MgCl2. Гистон 2В добавляли в конечной концентрации 1 мг/мл, цАМФ - 0.1 мкМ. В каждую пробу вносили по 100-200 мкг белка. Реакцию начинали добавлением смеси «холодного» АТФ (конечная концентрация 0.5 мМ) и меченого у-32Р]АТФ (1-2 мкКи на пробу). Общий объем каждой пробы составлял 50 мкл. После инкубации в течение 10 мин при 30 °С ферментативную реакцию останавливали нанесением реакционной смеси на фильтр (Whatman ЗММ, 2.4 см), который быстро помещали в охлажденную 10%-ную трихлоруксусную кислоту (5-10 мл/фильтр) и промывали в ней в течение 15 мин при интенсивном перемешивании. В дальнейшем фильтры промывали еще трижды (по 15 мин) 5%-ной трихлоруксусной кислотой, после чего их помещали в виалы и измеряли радиоактивность по методу Черенкова на (3-счетчике "Rackbeta" (LKB, Швеция). Общую активность ПКА выражали в пмоль радиоактивного [32Р]-фосфата, включенного в субстратные белки, за 1 мин на 1 мг белка, добавляемого в пробу, в отсутствие и в присутствии цАМФ. Для характеристики степени активации или ингибирования фермента гормонами использовали отношение активности ПКА, определяемой в отсутствие цАМФ, к активности фермента, определяемой в присутствии цАМФ.

2.7. Определение связывающих мест с помощью меченого [3Н]-дигидроальпренолола

Определение p-адренергических рецепторов в клеточных культурах инфузорий проводили по модифицированному методу (Pertseva et al., 1992). Мембранный белок (100-200 мкг) инкубировали в течение 30 мин при 30 °С в 500 мкл инкубационной среды, содержащей 2.0-100 нМ [3Н]-дигидроальпренолола, 10 мМ HEPES-Na буфер, рН 7.5, 5 мМ MgCl2. Связывание останавливали добавлением 5 мл холодного 10 мМ калий-фосфатного буфера, рН 8.0, и затем фильтровали пробы через фильтры Whatman GF/C, трижды промывая их фосфатным буфером (по 5 мл). Фильтры высушивали и помещали в виалы со сцинтилляционной смесью, содержащей 0.4 % 2.5-дифенилоксазола и 0.02 % 1-4бис2-5-фенилоксазолилбензола. Радиоактивность измеряли на счетчике Rackbeta (LKB, Швеция). Значения специфического связывания [3Н]-дигидроальпренолола рассчитывали вычитанием неспецифического связывания [3Н]-дигидроальпренолола (измерено в присутствии 10"4 М немеченого альпренолола) из общего связывания [3Н]-дигидроальпренолола с мембранами. Для определения аффинности к различным лигандам сайтов, связывающих [3Н]-дигидроальпренолол, измеряли специфическое связывание 50 нМ

3Н]-дигидроальпренолола в присутствии возрастающих концентраций (Ю-10-Ю-4 М) немеченого лиганда. Математическая обработка данных; проводилась с помощью программы GraphPad InPlot. Кривые насыщения преобразовывали по методу Скэтчарда (Scatchard, 1949), что позволяло судить о сродстве рецепторов (Кд) к [3Н]-дигидроальпренололу. Значения 1С50 представляли собой концентрацию немеченого лиганда, вызывающего 50 %-ное замещение [3Н]-дигидроальпренолола. Значения Кинг. для лигандов рассчитывали по формуле 1С5о/(1+[8]/Кд), где [S] -концентрация [3Н]-дигидроальпренолола.

2.8. Определение ГТФ-связывающей активности G-белков.

Определение ГТФ-связывающей активности G-белков проводили по модифицированному методу (Panchenko et al., 1987) в гомогенатах клеточных культур инфузорий, а также во фракциях плазматических мембран мышц моллюска и крысы, для получения которых брали по 8-10 моллюсков и 4-5 крыс соответственно.

Стандартная реакционная смесь содержала (конечные концентрации): 50 мМ Трис

НС1 буфер, рН 8.0, 1 мМ ЭДТА, 50 мМ MgCl2, 100 мМ NaCl, 1 мМ ДТТ, 0,01%

Lubrol-PX 1 мкМ Gpp[NH]p, 0.5-1 мкКи [8-3H]Gpp[NH]p. Реакцию начинали внесением в каждую пробу 100-200 мкг (в случае гомогената) или 50-80 мкг (в случае мембранной фракции) белка. Общий объем каждой пробы составлял 50 мкл. После инкубации в течение 45 мин при 30 (инфузории, моллюски) и 37 °С (крысы) ферментативную реакцию останавливали добавлением к реакционной смеси 100 мкл

0.1 %-ного раствора Lubrol-PX в 20 мМ K/Na-фосфатном буфере, рН 8.0. Пробы фильтровали через фильтры Millipore (США) с использованием водоструйного насоса, фильтры дважды промывали 2 мл 20 мМ K/Na-фосфатного буфера, рН 8.0, помещали в виалы со сцинтилляционной смесью, содержащей 0.4 % 2.5дифенилоксазола и 0.02 % 1-4бис2-5-фенилоксазолилбензола. Радиоактивность измеряли на счетчике Rackbeta (LKB, Швеция). Специфическую ГТФ-связывающую f активность определяли как разность между связыванием радиоактивного Gpp[NH]p в пробе в отсутствие ГТФ и таковым в присутствии 10 мМ ГТФ.

2.9. Определение ростовой активности инфузорий

Ростовую активность инфузорий оценивали по изменению плотности культуры клеток после 24-часовой и более их обработки катионами тяжелых металлов по сравнению с контролем. Для инфузорий D.anser исходная плотность клеток в контроле и в опытных образцах составляла 32±5 клеток/мл. Для инфузорий T.pyriformis исходная плотность клеток в контроле и опытных образцах составляла 27000 клеток/мл.

2.10. Проведение экотоксикологических опытов с моллюсками

Условия проведения экспериментов in vivo были следующими. Моллюсков помещали в хорошо аэрируемые ванны (температура воды 15 °С). Одну группу составляли контрольные животные, две других - моллюски, помещенные в воду, содержащую 2x10"6 М хлорида меди (И) или хлорида кадмия соответственно. Через 15 дней исследовали активность АЦ в тканях всех трех групп моллюсков. При исследовании активности ферментов in vitro CuCl2 и CdCl2 в концентрациях 10"4 или 10"6 М добавляли непосредственно в инкубационную среду.

2.11. Определение белка по методу Лоури

Содержание белка определяли в соответствии с методом Лоури и соавт. (Lowry et al., 1951), используя в качестве стандарта бычий сывороточный альбумин. i

2.12. Статистическая обработка полученных результатов

Экспериментальные данные подвергали статистической обработке и представляли в виде значений: х ± Sx , где х - среднее арифметическое, Sx - средняя квадратичная ошибка.

Метод парных сравнений применяли для обработки результатов, полученных в опытах in vitro, когда контрольные и опытные пробы ставились в одной и той же фракции плазматических мембран или гомогенате. Достоверность различий оценивали с помощью критерия Стьюдента-Фишера. Различия считались достоверными при Р < 0.05 (Урбах, 1975).

2.13. Теоретические исследования первичной структуры белков

Аминокислотные последовательности белков получали из GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Для поиска гомологичных АКП и их выравнивания использовали программы BLASTp и BLASTx (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Деркач, Кира Викторовна, 2003 год

1. Деркач К.В., Шпаков А.О., Успенская З.И. Ингибирование активности аденилатциклазы и роста культуры инфузорий Dileptus anser под влиянием катионов тяжелых металлов // Цитология. 1995а. - Т. 37. N 4. - С. 370.

2. Деркач К.В., Шпаков А.О., Кузнецова JI.A., Плеснева С.А., Успенская З.И., Перцева М.Н. Гормоночувствительная аденилатциклазная система инфузории Dileplus unser II Цитология. 2002. - T. 44. N 11. - С. 1129-1134.

3. Деркач К.В., Шпаков А.О., Успенская З.И., Голикова М.Н. Влияние катионов тяжелых металлов на активность аденилатциклазы и на рост культуры инфузорий Tetrahymena pyriformis и Dileptus anser И Журн. эволюц. биохим. физиол. 19956. - Т. 31. N 1. - С. 44-51.

4. Ирлина И.С., Меркулова H.H. Выращивание больших масс Tetrahymena pyriformis, пригодных для биохимических исследований и синхронизации деления инфузорий // Цитология. 1975. - Т. 17. - С. 1208-1215.

5. Кузнецова Л.А. Успехи в изучении серотониновых рецепторов, сопряженных с аденилатциклазной системой, в тканях позвоночных и беспозвоночных животных // Ж. эвол. биохим. и физиол. 1998. - Т. 34. - С. 256-266.

6. Кузнецова JI.A., Плеснева С.А. Влияние биогенных аминов и полипептидных гормонов на активность протеинкиназы "А" и аденилатциклазы в мышцах моллюска Anodonta cygnea II Журн. эволюц. биохим. физиол. 2001. Т. 37. N 5. - С. 395-400.

7. Кузнецова Л.А., Шпаков А.О. Рецепторы серотонина, участвующие в модуляции аденилатциклазиой системы, в тканях позвоночных и беспозвоночных // Ж. эвол. биохим. и физиол. 1994. - Т. 30. N 4. - С. 293-309.

8. Перцева М.Н. Молекулярные основы развития гормонокомпетентности. Л., Наука, 1989. 256 с.

9. Перцева М.Н. Существует ли эволюционное родство между хемосигнальными системами эукариот и прокариот // Журн. эволюц. биохим. физиол. 1990. - Т. 26. N4.- С: 505-513.

10. Перцева М.Н., Плеснева С.А., Шпаков А.О., Русаков Ю.И., Кузнецова Л.А.

11. Новые данные, свидетельствующие об участии аденилатциклазиой системы в механизме действия инсулина и родственных пептидов // Доклады Академии наук. -1995.-Т. 342. N3,- С. 410-412.

12. Перцева М.Н., Шпаков А.О. Хемосигнальные системы одноклеточных эукариот и бактерий как предшественники гормонокомпетентных систем высших животных // Журн. эволюц. биохим. физиол. 1993. Т. 29. N 4. - С. 454-474.

13. Перцева М.Н., Шпаков А.О. Консервативность инсулиновой сигнальной системы в эволюции беспозвоночных и позвоночных животных // Журн. эволюц. биохимии и физиологии. 2002. Т. 38. N 5. С. 430-441.

14. Перцева М.Н., Шпаков А.О., Плеснева С.А. Современные достижения в изучениисигнальных механизмов действия инсулина и родственных ему пептидов // Журн.эволюц. биохимии и физиологии. 1996. - Т. 32. N 3. - С. 318-340.

15. Шпаков А.О. Молекулярные детерминанты рецепторов и ГТФ-связывающихбелков, определяющие специфичность взаимодействий между ними // Журн.эволюц. биохимии и физиологии. 1996. - Т. 32. N 4. - С. 488-511.

16. Шпаков А.О. Структурные элементы молекул ГТФ-связывающих белков иэффекторов, опосредующие сопряжение между ними // Укр. биохим. журнал. 1997.-Т. 69. N 1. С. 3-20.

17. Шпаков А.О, Роль онкогенных в-белков в развитии опухолей эндокринной системы // Вопр. онкологии. 2001. - Т. 47. N 2. - С. 160-167.

18. Шпаков А.О. Молекулярные детерминанты в рецепторах серпантинного типа, ответственные за их функциональное сопряжение с гетеротримерными в-белками // Цитология. 2002а. - Т. 44. N 3. - С. 242-258.

19. Шпаков А.О. Роль сульфгидрильных групп в функционированииаденилатциклазиой сигнальной системы // Журн. эволюц. биохимии и физиологии. -20026. Т. 38. N 1,-С. 97-107.

20. Шпаков А.О. Участие заряженных аминокислот в процессе передачи гормонального сигнала через рецепторы серпантинного типа // Журн. эволюц. биохимии и физиологии. 2003. - Т. 39. N 3. - С. 205-217.

21. Шпаков А.О., Деркач К.В. Влияние катионов тяжелых металлов на активность аденилатциклазной системы гладких мышц и гепатопанкреаса некоторых двустворчатых и брюхоногих моллюсков //Журн. эволюц. биохимии и физиологии. -1994а. Т. 30. N 4. - С. 516-524.

22. Шпаков А.О., Деркач К.В., Перцева М.Н. Гормональные системы низших эукариот // Цитология. 2003а. - Т. 45. N 3. - С. 223-234.

23. Шпаков А.О., Корольков В.И., Власова E.H., Афонина М.П., Власов Г.П.

24. Влияние синтетических катионных пептидов на активацию аденилатциклазной сигнальйой системы биогенными аминами в мышечных тканях моллюсков и крыс // Цитология.-2001.-Т. 43. N 5. С. 483-490.

25. Шпаков А.О., Кузнецова JI.A., Плеснева С.А. Влияние тиолов и блокаторов сульфгидрильных групп на негативную регуляцию аденилатциклазной сигнальной системы биогенными аминами // Журн. эволюц. биохимии и физиологии. 2000. - Т. 36. N 4. - С. 293-297.

26. Шпаков А.О., Перцева М.Н. Структурно-функциональная характеристика ГТФ-связывающих белков беспозвоночных животных И Журн. эволюц. биохимии и физиологии. 1993. - Т. 29. N 5-6. - С. 635-653.

27. Шпаков А.О., Перцева М.Н. Молекулярные основы функционального сопряжения белков компонентов инсулиновой сигнальной системы// Успехи биологической химии. - 1999. - Т. 39. - С. 141-186.

28. Успенская З.И. Серотипы у низшей инфузории Dileptus anser // Цитология. 2002. -Т.44. - С. 305-313.

29. Alexandre S., Paindavoine P., Hanocq-Quertier J., Paturiaux-Hanocq F., Tebabi P.,

30. Pays E. Families of adenylate cyclase genes in Trypanosoma brucei // Mol. Biochem. Parasitai.' 1996.-V. 77. - P. 173-182.

31. Amiard J.C., Berthet В., Metayer C. Comparative importance of analytical, biologicaland ecological fluctations in determining sampling procedures adapted to metalaccumulation studies // J. Rech. Oceanogr. 1989. -V. 14. - P. 53-57.

32. Aubry L., Firtel R. Integration of signaling networks that regulate Dictyosteliumdevelopment // Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 1999. - V.15. - P. 469-517.

33. Berelovitz M., Le Roith D., von Schenk H., Newgaard C., Szabo M., Frohmann M.,

34. Shiloach J., Roth J. Somatostatin-like immunoreactivity and bioactivity is native to

35. Tetrahymenapyriformis//Endocrinology. 1982. - V. 110. - P. 1939-1944.

36. Bieger В., Essen L.O. Crystallization and preliminary X-ray analysis of the catalyticdomain of the adenylate cyclase GRESAG4.1 from Trypanosoma brucei 11 Acta

37. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 2000. - V. 56. - P. 359-362.

38. Bieger B., Essen L.O. Structural analysis of adenylate cyclases from Trypanosoma brucei in their monomeric state // EMBO J. 2001. - V. 20. - P. 433-445.

39. Blum J.J. An adrenergic control system in Tetrahymena // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1967.-V. 51.-P. 81-88.

40. Bourret R.B., Borkovich K.A., Simon M.J. Signal transduction pathways involving protein phosphorylation in prokaryotes // Ann. Rev. Biochem. 1991. - V. 60. - P. 401 -441.

41. Chidiac P. Rethinking receptor-G protein-effector interactions // Biochem. Pharmacol. -1998.-V. 55. P. 549-556.

42. Csaba G., Inczefi-Gonda A., Feher T. Induction of steroid binding sites (receptors) and presence of steroid hormones in the unicellular Tetrahymena 11 Comp. Biochem. Physiol. -1985,- V. 82.-P. 567-570.

43. Csaba G., Kovacs P. Insulin uptake, localization and production in previously insulin treated and untreated Tetrahymena. Data on the mechanism of hormonal imprinting // Cell. Biochem. Funct. 2000. - V. 18. - P. 161-167.

44. Csaba G., Kovacs P., Falus A. Human cytokines interleukin (IL)-3 and IL-6 affect the growth and insulin binding of the unicellular organism Tetrahymena // Cytokine. 1995. -V. 7.-P. 771-774.

45. Derkach K.V., Shpakov A.O., Uspenskaya Z.I. The regulation of adenylyl cyclase and protein kinase A in the cell cultures of ciliata Dileptus anser and Tetrahymena pyriformis by peptide hormones // FEBS J. 2003. - V. 270. Suppl. 1. - P. 57.

46. Eisenschlos C., Flawia M.M., Torruella M., Torres H.N. Interaction of Trypanosoma cruzi adenylate cyclase with liver regulatory factors // Biocherp. J. 1986a. - V. 236. - P. 185-191.

47. Eisenschlos C., Paladini A.A., Molina Y., Vedia L., Torres H.N., Flawia M.M.

48. Flawia M.M., Torres H.N. Adenylate cyclase activity in Neurospora crassa. III. Modulation by glucagon and insulin // J. Biol. Chem. 1973. - V. 248. - P. 4517-4520.

49. Galperin M.Y., Nikolskaya A.N., Koonin E.V. Novel domains of the prokaryotic two-component signal transduction systems // FEMS Microbiol. Lett. 2001. - V. 203. - P. 1121.

50. Gill G.N., Walton G.M. Assay of cyclic nucleotide-dependent protein kinase // Adv. Cycl. Nucl. Res. 1979. - V. 10,- P. 93-106.

51. Gonzales-Perdomo M., Romero P., Goldenberg S. Cyclic AMP and adenylate cyclase activators stimulate Trypanosoma cruzi differentiation // Exp. Parasitol. 1988. - V. 66. -P. 205-212.

52. Hadwiger J.A., Srinivasan J. Folic acid stimulation of the Galpha4 G protein-mediated signal transduction pathway inhibits anterior prestalk cell development in Dictyostelium II Differentiation. 1999. - V. 64. - P. 195-204.

53. Haesungcharern A., Chulavatnatol M. Inhibitors of adeny/ate cyclase from ejaculated human spermatozoa// J. Reprod. Fertil. 1978. - V. 53. - P. 59-61.

54. Hajos F. An improved method for the preparation of synaptosomal fractions in high purity // Brain Res. 1975. - V. 93. - P. 485-489.

55. Hamm H.E. The many faces of G protein signaling // J. Biol. Chem. 1998. - V. 273. - P. 669-672.

56. Hatanaka M., Shimoda C. The cyclic AMP/PKA signal pathway is required for initiation of spore germination in Schizosaccharomyces pombe II Yeast. 2001. - V. 18. - P. 207217.

57. Janetopoulos C., Jin T., Devreotes P. Receptor-mediated activation of heterotrimeric G-proteins in living cells // Science. 2001. - V. 291. - P. 2408-2411.

58. Kariya K., Saito K., Iwata H. Adrenergic mechanism in Tetrahymena. III. cAMP and cell proliferation // Jap. J. Pharmacol. 1974. - V. 24. - P. 129-134.

59. Kasahara M., Unno T., Yashiro K., Ohmori M. CyaG, a npvel cyanobacterial adenylyl cyclase and a possible ancestor of mammalian guanylyl cyclases // J. Biol. Chem. 2001. -V. 276. - P. 10564-10569.

60. Krupinski J., Lehman T.C., Frankenfield C.D., Zwaagstra J.C., Watson P.A.

61. Molecular diversity of the adenylyl cyclase // J. Biol. Chem. -,1992. V. 267. - P. 2485824862.

62. Kudo S., Muto Y., Nosawa Y. Regulation by calcium of hormone-sensitive adenylate cyclase and calmodulin-dependent guanylate cyclase in Telrahymena plasma membrane // Comp. Biochem. Physiol. 1985. - V. 80. - P. 813-816.

63. Diclyoslelium development // Genes. Dev. 1993. - V. 7. - P. 986-995.

64. Roith D., Liotta A.S., Roth J., Shiloach J., Lewis M.E., Pert C.B., Krieger D.T.

65. ACTII and p-endorphin like molecules are native to unicellular organisms // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1982. - V. 79. - P. 2080-2090.

66. Roith D., Shiloach J., Berelowitz M., Frohmann L.A., Liotta A.S., Krieger D.T., Roth J. Are messenger molecules in microbes the ancestors of the vertebrate hormones and tissue factors? // Fed. Proc. 1983. - V. 42. - P. 2602-2607.

67. Folin phenol reagent // J. Biol. Chem. 1951. - V. 193. - P. 265-275.

68. Malmquist J., Israelsson B., Ljungqvist U. Inhibition of human liver membraneadenylate cyclase by zinc ions // Horm. Metab. Res. 1979a. - V. 7. - P. 530-531.

69. Malmquist J., Israelsson B., Ljungqvist U. Zinc inhibition of adenylate cyclase in humanliver membranes // IRCS Med. Sci.: Libr. Compend. 1979b. - V. 7. - P. 233.

70. Mance G. Pollution Threat of Heavy Metals in Aquatic Environments, Elsevier, London1. New York. 1987.

71. Meima M.E., Schaap P. Fingerprinting of adenylyl cyclase activities during Dictyostelium development indicates a dominant role for adenylyl cyclase B in terminal differentiation // Dev. Biol. 1999. - V. 212. - P. 182-190.

72. Moe G.R., Bollag G.E., Koshlund D.E. Transmembrane signaling by a chimera of the Escherichia coli aspartate receptor and the human insulin receptor // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989.-V. 86.-P. 5683-5687.

73. Neer E.J., Smith T.F. G protein heterodimers: new structures propel new questions // Cell.- 1996.-V. 84.-P. 175-178.

74. Dictyostelium G subunit Ga2 produce dominant negative phenotypes and inhibit the activation of adenylyl cyclase, guanylate cyclase, and phospholipase C // Mol. Biol. Cell. -1992. -V. 3. -P. 735-747.

75. Oliveira' M.M., Antunes A., De Mello F.G. Growth of Trypanosoma cruzi epimastigotes controlled by shifts in cyclic AMP mediated by adrenergic ligands // Mol. Biochem. Parasitol. 1984. - V. 11. - P. 283-292.

76. Oz H.S., Huang H., Wittner M., Tanowitz H.B., Bilezikian J.P., Morris S.A. Evidence for guanosine triphosphate-binding proteins in Trypanosoma cruzi // Am. J. Trop. Med. Hyg.- 1994. -V. 50. -P. 620-631.

77. Paez-Osuna F., Zazueta-Padilla H.M., Izaguirre-Fierro G. Trace metals in bivalve from

78. Navachiste Lageon, Mexico//Mar. Pollut. Bull. 1991. - V. 22. - P. 305-307. Panchenko M.P., Hoffenberg S.I., Tkachuk V.A. Purification and some properties of

79. GTP-binding proteins from pig heart plasma membranes // Biochim. Biophys. Acta.1987.-V. 46.-P. 452-455.

80. Pertseva M.N., Kuznetsova L.A., Plesneva S.A., Grishin A.V., Panchenko M.P. (3

81. Agonist-induced inhibitory-guanine-nucleotide-binding regulatory protein coupling to adenylate cyclase in mollusk Anodonta cygnea foot muscle sarcolemma // Eur. J. Biochem.- 1992. V. 210.-P. 279-286.A

82. Pieroni J.P., Harry A., Chen J., Jacobowitz O., Magnusson R.P., Iyengar R. Distinct characteristics of the basal activities of adenylyl cyclases 2 and 6 // J. Biol. Chem. 1995. -V. 270.-P. 21368-21373.

83. Pitt G.S., Milona N., Borleis J., Lin K.C., Reed R.R., Devreotes P.N. Structurally distinct and stage-specific adenylyl cyclase genes play different roles in Dictyostelium development // Cell. 1992. - V. 69. - P. 305-315.

84. Roelofs J., Snippe H., Kleineidam R.G., Van Haastert P.J. Guanylate cyclase in Dictyostelium discoideum with the topology of mammalian adenylate cyclase // Biochem. J. 2001b. - V. 354.-P. 697-706.-f

85. Root P.A., Prince A., Gunderson R.E. Aggregation of Dictyostelium discoideum is dependent on myristoylation and membrane localization of the G protein a-subunit, Ga2 // J. Cell. Biochem. 1999. - V. 74. - P. 301 -311.

86. Ross D.T., Raibaud A., Florent I.C., Sather S., Gross M.K., Storm D.R., Eisen H. Thetrypanosome VSG expression site encodes adenylate cyclase5 and a leucine-rich putative regulatory gene // EMBO J. 1991. - V. 10. - P. 2047-2053.

87. Saito T., Small L., Goodenough U.W. Activation of adenylate cyclase in Chlamydomonas reinhardtii by adhesion and by heat // J. Cell. Biol. — 1993. V. 122. - P. 137-147.

88. Salomon Y., Londos C., Rodbell M.A. Highly sensitive adenylate cyclase assay // Anal. Biochem. 1974.-V. 58. - P. 541-548.

89. Savinon-Tejeda A.L., Ongay-Larios L., Ramirez J., Coria R. Isolation of a gene encoding a G protein alpha subunit involved in the regulation of cAMP levels in the yeast Kluyveromyces lactis // Yeast. 1996. - V. 12. - P. 1125-1133.

90. Simon M.I., Strathmann M.P., Gautam N. Diversity of G proteins in signal transduction !! Science. 1 991. - V. 252. - P. 802-808.

91. Srinivasan J., Gundersen R.E., Hadwiger J.A. Activated G subunits can inhibit multiple signal transduction pathways during Dictyostelium development // Dev. Biol. 1999. - V. 215.-P. 443-452.

92. Strader C.D., Fong T.M., Tota M.R., Underwood D., Dixon R.A.F. Structure and function of G protein-coupled receptors // Annu. Rev. Biochem. 1994. - V. 63. - P. 101132.

93. Sweet M.T., Allis C.D. Phosphorylation of linker histones by cAMP-dependent protein kinase in mitotic mieronuclei of Tetrahymena // Chromosomal- 1993. V.102. - P. 637647.

94. Sweet M.T., Carlson G., Cook R.G., Nelson D., Allis C.D. Phosphorylation of linker histones by a protein kinase A-like activity in mitotic nuclei // J. Biol. Chem. 1997. - V. 272.-P. 916-923.

95. Taussig R., Gilman A.G. Mammalian membrane-bound adenylyl cyclases // J.Biol.Chem. 1995,-V. 270.-P. 1-4.

96. Taylor M.C., Muhia D.K., Baker D.A., Mondragon A., Schaap P.B., Kelly J.M.

97. Trypanosoma cruzi adenylyl cyclase is encoded by a complex multigene family // Mol. Biochem. Parasitol. 1999. -V. 104. - P. 205-217.

98. Tesmer J.J.G., Sunahara R.K., Gilman A.G., Sprang S.R. Crystal structure of the catalytic domains of adenylyl cyclase in a complex with Gsa-GTPyS // Science. 1997. -V. 278. - P. 1907-1916.

99. Thevelein J.M., de Winde J.H. Novel sensing mechanisms and targets for the cAMPprotein kinase A pathway in the yeast Saccharomyces cerevisiae // Mol. Microbiol. -1999.-V. 33.-P. 904-918.

100. Wess J. G protein-coupled receptors: molecular mechanisms involved in receptor activation and selectivity of G protein recognition // FASEB J. 1997. - V. 11. - P. 346354.

101. Wess J. Molecular basis of receptor/G protein-coupling selectivity // Pharmacol. Ther. -1998.-V. 80.-P. 231-264.

102. Xia Z., Storm D.R. Regulatory properties of the mammalian adenylyl cyclases // In: Molecular biology intelligence unit. Heidelberg, Germany: Springer-Verlag. 1996. - 175 P

103. Zhang C.C. Bacterial signalling involving eukaryotic-type protein kinases // Mol. Microbiol. 1996.-V. 20.-P. 9-15.