Тейхоевые кислоты актиномицетов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.07, доктор биологических наук Потехина, Наталья Викторовна

• Потехина, Наталья Викторовна
• доктор биологических наук
• 2005

Оглавление диссертации доктор биологических наук Потехина, Наталья Викторовна

Список сокращений.

Введение.

I. Обзор литературы. Тейхоевые кислоты и другие анионные полимеры клеточных стенок грамположительных бактерий.

Глава 1. Тейхоевые кислоты актиномицетов и других грамположительных бактерий.

1.1. Тейхоевые кислоты клеточных стенок.

1.1.1. Тейхоевые кислоты I ипа.

1.1.2. Тейхоевые кислоты II типа.

1.1.3. Тейхоевые кислоты III типа.

1.1.4. Тейхоевые кислоты IV типа.

1.1.5. ТК актиномицето в.

1.1.6. Область связи ТК и пептидогликана.

1.2. Липотейхоевые кислоты.

1.2.1. ЛТК I типа.

1.2.2. ЛТК II типа.

1.2.3. Способность ЛТК образовывать в растворе мицеллы.

1.2.4. Локализация ЛТК.

Глава 2. Биосинтез тейхоевых кислот.

Глава 3. Локализация тейхоевых кислот.

Глава 4. Другие анионные полимеры клеточных стенок грамположительных бактерий.

4.1. Тейхуроновые кислоты.

4.2. Сахар-1-фосфатные полимеры.

4.3. Анионные полисахариды.

Глава 5. Свойства и функции тейхоевых кислот.

5.1. Участие ТК в катионном обмене.•.

5.2. Участие ТК в регуляции активтости автолитических ферментов.

5.2.1. Регуляция активности L-амидазы у пневмококков.

5.2.2. Регуляция активности автолизинов у Bacillus subtils.

5.3. Участие ТК в создании и регуляции плотности отрицательного заряда клеточной поверхности.

5.3.1. Поверхностный заряд микроорганизмов.

5.3.2. Роль отрицательного заряда в функциях тейхоевых кислот.

5.3.3. D-аланин - регулятор общего заряда клеточной поверхности.

5.4. Роль тейхоевых кислот в адгезии и вирулентности бактерий.

5.4.1. Связывание положительно заряженных пептидов.

5.4.2. Образование биопленок.

5.5. Иммунологические свойства ТК и ЛТК.

5.6. Рецепция фагов.

Глава 6. Тейхоевые кислоты как хемотаксономический признак в порядке Actinomycetales

6.1. Использование признака "наличие-отсутствие" тейхоевых кислот для дифференциации таксонов высших орядков.

6.2. Использование химической структуры и некоторых структурных элементов тейхоевых кислот для дифференциации актиномицетов на уровне вида.

6.2.1. Тейхоевые кислоты как маркер рода Nocardiopsis.

6.2.2. Тейхоевые кислоты в систематике рода Nocardioides.

6.2.3. Тейхоевые кислоты в систематике рода Streptomyces.

6.3. Гетерогенность рода Actinomadura. Необходимость поиска новых систематических подходов.

6.4. Род Brevibacterium. Первые попытки использования ТК в качестве хемотаксономических признаков.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

II. Материалы и методы

Глава 1. Материалы.

Глава 2. Методы исследования.

2.1. Общие методы. Хроматография и электорофорез на бумаге.

2.2. Аналитические методы.

2.3. Получение клеточной стенки.

2.4. Экстракция тейхоевых кислот.

2.5. Очистка тейхоевых кислот:.

2.5.1. Ионообменная хроматография.

2.5.2 Электрофорез на бумаге.

2.5.3. Дробное осаждение этанолом.

2.5.4. Разделение олигомеров и гликозидов.

2.6. Методы определение первичной структуры тейхоевых кислот.

2.6.1. Кислотный гидролиз.

2.6.2. Щелочной гидролиз.121.

2.6.3. Ферментативный гидролиз.

2.6.4. Определение О-ацильных групп.

2.6.4.1. Аммонолиз тейхоевых кислот.

2.6.4.2. Гидроксиламинолиз тейхоевых кислот.

2.6.5. Определение соотношения Р-пс и Рфмэ в тейхоевых кислотах.

2.6.6. Определение молекулярной массы.

2.6.7. Определение абсолютной конфигурации рамнозы.

2.6.8. Определение абсолютной конфигурации маннита.

2.6.9. Масспектроскопия MALDI-TOF.

2.6.10. Масспектроскопия с бомбардированием тяжелыми атомами.

2.6.11. ЯМР спектроскопия.

Глава 3. Оценка выбора методов, использованных в работе.

3.1. Экстракция тейхоевых кислот.

3.2. Установление первичной структуры тейхоевой кислоты.

3.2.1. Механизмы кислотного, щелочного и ферментативного гидролизов.

3.2.2. Идентификация полиола.

3.2.3. Разделение и изучение фосфорных эфиров.

3.2.4. Исследование гликозидов.

3.2.5. ЯМР спектроскопия.

III. Результаты исследований

Глава 1. Тейхоевые кислоты представителей родов Actinomadura и Nonomuraea.

1.1. Распространение тейхоевых кислот у представитетелей рода Actinomadura и Nonomuraea.

1.1 Тейхоевые кислоты Actinomadura cremea ИНА 292т.

1.2. Тейхоевые кислоты Actinomadura madura ВКМ Ас-809т.

1.3. Тейхоевые кислоты Actinomadura viridis ВКМ Ас-1315Т и Ас-631.

1.4. Тейхоевые кислоты Nonomuraea roseoviolacea subsp. carminata

ИНА4281.

1.5. Тейхоевые кислоты Nonomuraea recticatena BKM Ac-940.

Глава 2. Тейхоевые кислоты и другие анионные полимеры представителей рода

Brevibacterium.

2.1. Выделение трех новых видов рода Brevibacterium: Brevibacterium permense sp. nov. Brevibacterium antiquum sp. nov., Brevibacterium aurantiacum sp. nov.

2.2. Распространение TK у представителей рода Brevibacterium.

2.3. Тейхоевые кислоты Brevibacterium iodinum BKM Ac-2106T.

2.4. Тейхоевые кислоты Brevibacterium permense BKM Ac-2280T.

2.5. Тейхоевые кислоты Brevibacterium antiquum BKM Ac-2118T и BKM Ac-2281.

2.6. Анионные полимеры Brevibacterium aurantiacum BKM Ac-2111T.

2.7. Тейхоевые кислоты Brevibacterium linens BKM Ac-2119 и Gk-3.

2.8. Анионные полимеры Brevibacterium linens BKM Ac-2159.

Глава 3. Тейхоевые кислоты актиномицетов родов Glycomyces, Streptomyces и Nocardiopsis.

3.1. Тейхоевые кислоты Glycomyces tenuis BKM Ас-1250т.

3.2. Тейхоевые кислоты Streptomyces roseolus ISP 5174.

3.3. Тейхоевые кислоты Nocardiopsis dassonvillei subs, albirubida

BKM Ас-1882т и Ac-1454.

IV. Обсуждение результатов.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Тейхоевые кислоты актиномицетов»

Тейхоевые кислоты являются одними из основных полимеров клеточной стенки грам положительных бактерий. Значение их в жизнедеятельности клетки трудно переоценить. Ковалентно связанные с пептидогликаном, тейхоевые кислоты представляют неотъемлемую часть клеточной стенки и, таким образом, находятся в тесной связи со всеми процессами, происходящими при ее участии. Среди них - рост и деление, связывание и резервирование катионов, необходимых для функционирования мембранных ферментов, процессы межклеточного узнавания, рецепция фагов и патогенность.

Тейхоевые кислоты и другие анионные соединения, связанные с ПГ через толщу клеточной стенки, вносят значительный вклад в формирование структуры полиэлектролитного геля. Отталкивание сходных зарядов поддерживает ПГ в растянутом состоянии и способствует его пористости [Archibald et al., 1993].

Проблема изучения ТК имеет несколько аспектов. Фундаментальный аспект включает изучение структурного разнообразия биополимеров. Полученная информация о строении полимеров важна для понимания их свойств, функций в микробной клетке, выяснения механизмов взаимодействия бактерий внутри микробного сообщества и с внешней средой. Изучение ТК в значительной степени расширяет наши представления о биоразнообразии природных соединений.

Исследования тейхоевых кислот в последние десятилетия привели к открытию новых классов этих соединений - эритрит-, арабит- и 3-0-метилгалактит тейхоевых кислот, а также обнаружили различные вариации фосфодиэфирных связей в интегральной цепи, что позволило выделить четыре основных структурных типа тейхоевых кислот.

ТК в последние десятилетия являются объектами медицинских исследований. Исследование клеточных стенок патогенных микроорганизмов привело к пониманию таких важных явлений как адгезия, вирулентность, образование биопленок на имплантированных материалах [Rijnaarts et al., 1995; Hussain et al., 2001], а также природы некоторых аутоимунных заболеваний человека [Дерябин и Каральник, 1983]. Тейхоевые кислоты, наряду с другими компонентами клеточных стенок, ответственны за чувствительность клетки к ряду антибиотиков и иммуномодуляторные свойства бактерий [Wicken and Knox, 1975; Archibald, 1980; Glarketal., 2000].

Особое внимание во всем мире уделяется антигенным свойствам тейхоевых и липотейхоевых кислот, которые используют в серологической классификации стрептококков, лактобацилл, микрококков и стафилококков, а также для создания вакцин и средств, повышающих иммунитет человека.

Исследование анионных полимеров клеточных стенок представляет интерес также с точки зрения таксономии микроорганизмов. Возможность использования с этой целью тейхоевых кислот обсуждается с момента их открытия [Davison and Baddiley, 1963], и уже в настоящее время признак "наличие - отсутствие" тейхоевых кислот входит в обязательные характеристики при описании некоторых грамположительных кокков. В порядке Actinomycetales признак "наличие ТК" дифференцирует таксоны высших порядков, таких как подпорядок и семейство [Евтушенко, 2003], в то время как структура ТК может служить химическим маркером для дифференциации актиномицетов на уровне вида [Naumova et al., 2001].

В связи со всем вышесказанным изучение распространения и структур тейхоевых кислот являются весьма актуальными, как в свете решения одной из главных проблем современной систематики микроорганизмов - выявления новых относительно стабильных таксономических маркеров родов и видов и уточнения границ ранее описанных таксонов, - так и для расширения представлений о биоразнообразии, физиологических и экологических функциях этих уникальных природных соединений.

Состояние проблемы. Проблеме изучения стеночных тейхоевых кислот около пятидесяти лет. ТК, открытые впервые в клеточных стенках лактобацил и стафилококков, представляли собой глицерин- и рибитфосфатные полимеры, несущие в качестве гликозильных заместителей глюкозу или аминосахар [Armstrong et al., 1958]. Почти в это же время ТК были обнаружены проф. Наумовой И.Б. и акад. Белозерским А.Н. [Наумова и др., 1962] в клеточных стенках актиномицетов. С тех пор эти полимеры успешно изучают на кафедре микробиологии биологического факультета МГУ. За прошедшее время были исследованы около 250 штаммов, принадлежащих различным семействам и родам порядка Actinomycetales, в том числе и выделенным и описанным недавно. Изучение актиномицетов позволило открыть принципиально новые структуры, структурные типы и структурные элементы ТК.

Со временем представления о составе ТК расширялись: были открыты маннит- и арабитсодержащие полимеры, рибиттейхоевые кислоты с 3,5 типом фосфодиэфирной связи и тейхоевые кислоты, содержащие в интегральной цепи углеводный компонент. Во многом эти достижения стали возможными, благодаря применению новых методов изучения углеродсодержащих биополимеров: с конца 1970-х годов структуры ТК начали исследовать методами ЯМР-спектроскопии [De Boer et al., 1976, 1978; Shashkov et al., 1979].

Анализ экспериментальных данных по структурам тейхоевых кислот, описанных в литературе, позволил выделить 4 структурных типа этих полимеров на основании природы фосфодиэфирных связей в интегральной цепи: поли(полиолфосфаты) (I тип), поли(гликозилполиолфосфаты) (II тип) и полимеры смешанной структуры (III и IV типы) [Наумова и Шашков, 1997]. В зависимости от природы полиола и положения фосфодиэфирной связи, объединяющей элементы интегральной цепи, выделяют подтипы тейхоевых кислот [Naumova et al., 2001].

Цель и задачи исследования. Цель настоящего исследования - изучение структурного разнообразия тейхоевых кислот клеточных стенок актиномицетов (не исследованных ранее или перспективных в плане поиска новых структур), а также сравнительный анализ структур ТК для решения ряда таксономических задач.

В задачи исследования входило:

- изучение распространения ТК клеточных стенок представителей родов Actinomadura (24 штамма), Nonomuraeа (12 штаммов), Brevibacterium (12 штаммов) и некоторых других организмов (4 штамма, 3 вида);

- установление структур ТК ряда актиномицетов, представляющих интерес, как в структурном, так и в таксономическом отношении;

- анализ возможностей использования данных по структуре тейхоевых кислот в целях классификации и идентификации представителей родов Actinomadura, Nonomuraea. и Brevibacterium.

Диссертационная работа построена по следующему плану. Обзор литературы состоит из 6 глав и охватывает работы, опубликованные в мировой литературе, до 2005 г. включительно. Он содержит главы по структурам ТК и других анионных полимеров клеточной стенки грамположительных бактерий, а также биосинтезу, функциям, локализации, иммунологическим свойствам ТК и их роли в процессах адгезии, фаговой рецепции и вирулентности. Структурам липотейхоевых кислот цитоплазмотической мембраны посвящена отдельная глава, а некоторые их свойства и функции обсуждаются совместно с таковыми тейхоевых кислот клеточной стенки.

Особое внимание уделено работам, связанным с изучением структур анионных полимеров клеточных стенок грамположительных бактерий: тейхоевым и тейхуроновым" кислотам, сахар-1-фосфатным полимерам, кислым полисахаридам. В соответствующих

главах описаны практически все известные полимеры, структуры которых были полностью установлены.

Структуры ТК рассматриваются согласно их подразделению на четыре структурных типа, каждый из которых охватывает все известные вариации, касающиеся природы ацильных групп и а- и Р-связанных гликозильных заместителей. Таблица 1 [Naumova et al., 2001] дополнена данными последних лет.

В разделе "Методы исследования и их обсуждение" представлены ключевые методы исследований и приведены обоснования и порядок их применения: получение клеточной стенки, экстракция и очистка ТК, исследование первичной структуры ТК. Объяснены механизмы кислотного и щелочного гидролизов 1,3-поли(глицерофосфата), пути образования фосфорных эфиров, являющиеся общими для ТК и других типов.

Раздел "Результаты исследований" включает три главы: установление структур ТК представителей родов Actinomadura и Nonomuraea, - ТК представителей p. Brevibacterium и - ТК некоторых других актиномицетов, имеющих уникальные структуры.

В разделе "Обсуждение результатов" обсуждаются особенности ТК актиномицетов: присутствие нескольких различных по структуре ТК в одной клеточной стенке (гетерогенный состав ТК), физиологическая значимость ацильных и гликозильных остатков, структурное разнообразие тейхоевых кислот и его биологический смысл. Приводятся обоснования возможного применения ТК в качестве видоспецифического маркера в родах Actinomadura, Nonomuraea, Brevibacterium и Glycomyces.

Заканчивается изложение семью выводами.

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Потехина, Наталья Викторовна

выводы

1. У представителей родов Actinomadura, Nonomureae и Brevibacterium, Glycomyces, Streptomyces и Nocardiopsis (всего 53 организма) обнаружены тейхоевые кислоты и исследован их состав. Полимеры проявляют большое структурное разнообразие и относятся к трем основным структурным типам - поли(полиолфосфатам) (I тип, 4 подтипа), поли(гликозилполиолфосфатам) (II тип, 3 подтипа) и ТК смешанной структуры (IV тип, 1 подтип). Два подтипа ТК выделены на основании данной работы.

2. Установлены И новых структур тейхоевых кислот, в том числе уникальная тейхоевая кислота, содержащая в качестве полиола эритрит. Впервые обнаружены ТК, несущие остатки а-галактозамина, 3-0-метилгалактозы (мадурозы), З-Ометилрамнозы, глутаминовой и ортофосфорной кислот.

3. Клеточные стенки представителей рода Actinomadura содержат ТК поли(рибит-), поли(глицерин-) и поли(гликозилглицерофосфатной) природы. Последние широко распространены в клеточных стенках представителей рода. Полностью установлены структуры ТК трех видов актиномадур. Полимеры принадлежат к поли(гликозилглицерофосфатам) и имеют общие детали строения - галактопиранозу в интегральной цепи и Р-конфигурацию всех гликозидных связей. Отличия в структуре связаны с локализацией фосфодиэфирных и гликозидных связей, а также наличием и природой боковых остатков в интегральной цепи.

4. Клеточные стенки всех представителей рода Nonomuraea содержат глицеринтейхоевые кислоты. Полностью установлены структуры ТК двух видов нономурий. Полимеры принадлежат к 1,3-поли(глицерофосфатам) и отличаются комбинацией гликозильных заместителей.

5. Клеточные стенки всех представителей рода Brevibacterium содержат гетерогенный состав ТК. Обязательным полимером каждого вида является 1,3-поли(глицерофосфат). Обнаружены ТК поли(маннитфосфатной) природы, а также сахар-1-фосфатные полимеры и тейхуроновая кислота.

Полностью установлены химические структуры анионных полимеров клеточных стенок пяти видов бревибактерий. Полимеры имеют ярко выраженные анионные свойства за счет наличия остатков ортофосфорной, пировиноградной, янтарной и глутаминовой кислот.

6. Описаны три новых вида рода Brevibacterium: В. permense BKM Ас-2280т, В. antiquum BKM Ac-2118т и В. aurantiacum BKM Ac-2111т, выделенные из В. linens на основании филогенетических, фенетических и хемотаксономических данных, включая данные по составу ТК.

7. Изучение распространения и особенностей строения ТК представителей родов Actinomadura, Nonomuraea, Brevibacterium и Glycomyces показало:

- признак "наличие ТК" является характерным для исследованных родов;

- структура и набор стеночных анионных полимеров клеточных стенок, могут служить химическими маркерами видов;

- на примере Brevibacterium показано, что структурные компоненты ТК (сахара и полиолы и их сочетание) могут служить для дифференциации и идентификации видов рода.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Из клеточных стенок представителей нескольких родов актиномицетов выделены тейхоевые кислоты и установлены их структуры, большая часть которых описана впервые. Клеточные стенки некоторых организмов одновременно содержат несколько ТК или других анионных полимеров. Несмотря на то, что все изученные ТК построены по единому плану, наблюдалось поразительное разнообразие их структур. Однако это разнообразие не хаотично, а подчиняется определенным закономерностям, что позволило отнести эти структуры к нескольким типам и подтипам, некоторые из которых предложены нами.

Штаммы одного вида содержат идентичные, в то время как виды внутри рода -различные по структуре ТК, что, вероятно, отражает особенности метаболизма каждого вида.

Результаты, полученные на достаточно большом материале, позволяют констатировать видовую специфичность ТК актиномицетов и предложить использовать их в качестве важного видового таксономического признака.

Информация о структуре тейхоевых кислот расширяет рамки возможностей изучения метаболических процессов, связанных с биосинтезом тейхоевых кислот, физиологической роли структурных элементов этих полимеров, причин и роли гетерогенности ТК в жизнедеятельности бактериальной клетки и многое другое. Возможность использования ТК в качестве видоспецифических маркеров для некоторых родов порядке Actinomycetales уже продемонстрирована в настоящей работе.

Список литературы диссертационного исследования доктор биологических наук Потехина, Наталья Викторовна, 2005 год

1. Лгрс Н.С., Ефимова Т.П., Грузева JI.H. О гетерогенности рода Actinomadura Lech. Л. Lech. // Микробиология 1975. Т. 44. В. 2. с. 253-257.

2. Гаузе Г.Ф., Преображенская Т.П., Свешникова М.А., Терехова Л.П., Максимова

3. Т.С. Определитнль актиномицетов. Роды Streptomyces, Slreptoverlicillum, Chainia. М.: Наука, 1983. с.8.

4. Гладышев Б.Н. Определение амииосахаров в гидролизатах животных, растительных и бактериальных объектов // Биохимия 1959. Т. 24. с.789-793.

5. Гнилозуб В.А. Тейхоевые и лнпотсйхосвые кислоты актиномицетов // дис. на соиск. уч. степ. канд. биол. наук. Москва, 1994.

6. Гнилозуб В.А., Стрешинская Г.М., Евтушенко Л.И., Шашков А.С., Наумова И.Б. Липотейхоевые кислоты видов рода Agromyces II Микробиология 1994а. Т. 63. № 3. с. 495-502.

7. Гнилозуб В.А., Стрешинская Г.М., Наумова И.Б., Евтушенко Л.И., Шашков А.С.1,5-Поли(рибитфосфат) с тстрасахаридными заместителями в клеточной стенке Agromyces fucosus ssp. luppuratus II Биохимия 19946. Т. 59. № 12. с. 1892-1899.

8. Деревицкая В.А., Шашков А.С., Новиков О.С., Евстигнеев А.И. Синтез моно- и диметиловых эфиров метил-2-ацетамидо-2-дезокси-0-галактопирапозндов и их спектры 13С-ЯМР // Биооран. химия 1981. Т. 7. №3. с. 410-421.

9. Дерябин П.Н. и Каралышк В.В. Биологические свойства и использование тейхоевых кислот микроорганизмов // ЖМЭИ 1983. Т. 9. с. 26-29.

10. Дмитриева Н.Ф., Вылегжанина Е.С., Грабовская К.Б., Битко С.А., Наумова И.Б. Некоторые химические и биологические свойства ЛТК стрептококка группы А // Вестник АМН СССР 1986. № 7. с. 30-34

11. Дмитриева Н.Ф., Наумова И.Б., Стрешинская Г.М., Ланина Л.И. О клеточной стенке Actinomyces rimosus II Биоорган, химия 1976. Т. 2. № 6. с. 815-821.

12. Евтушенко Л.И. Актинобактерии: развитие систематики уа примере семейств порядка Actinomycetales//дис. на соиск. уч. степ. док. биол. наук. Пущино, 2003.

13. Евтушенко Л.И., Янушкене Н.А., Стрешинская Г.М., Наумова И.Б., Агре Н.С.

14. Распространение тейхоевых кислот в представителях порядка Actinomycetales // ДАН СССР 1984. Т. 278. с.237-240.17,18